DE2120929B2

DE2120929B2 - Lagerbeständiger Lebendimpfstoff zum Immunisieren von Hühnerküken gegen die Marek'sche Hühnerlähme

Info

Publication number: DE2120929B2
Application number: DE2120929A
Authority: DE
Inventors: William East Lansing Okazaki; Harvey Graham Purchase; Richard Lawrence Witter
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1970-04-29
Filing date: 1971-04-28
Publication date: 1979-06-28
Also published as: AT317606B; BE766492A; IE35138B1; NL165217C; GB1317710A; PL76295B1; HU162835B; IL36329A; NL7100529A; FR2092112A1; BR7102066D0; DE2120929A1; CS191868B2; NL165217B; IL36329A0; DK133311C; GB1316168A; YU35785B; US3642574A; CA934295A

Description

Die Mareksche Hühnerlähme (im folgenden auch kurz MD = Marek disease), eine sich in Lymphwucherungen äußernde Hühnerkrankheit, wurde zuerst 1907 jo beschrieben und hat sich zu einer der destruktivsten Geflügelkrankheiten entwickelt. Auf »leukose«-artige Krankheiten, von denen MD die wichtigste Art ist, ist in den Vereinigten Staaten von Amerika ein jährlicher Verlust von über 550 Millionen DM zurückzuführen r, (vgl. »AAAP-Report, Avian Diseases«, Bd. 11 [1967]. Seiten 694 bis 702).

Man hat bedeutende Anstrengungen unternommen, die MD zu charakterisieren (vgl. P.M. Bi ggs. »Current Topics in Microbiology and Immunology«. Bd. 43, 1968. Seiten 93 bis 125), und es wurde gezeigt, daß die Krankheit durch ein Herpesvirus der Gruppe B verursacht wird (vgl. Churchill und Mitarb., »Nature«. Bd. 215 [1967J Seiten 528 bis 530; Solomon und Mitarb., »Proc. Soc. Exptl. Biol. Med.«. Bd. 127 j-, [1968], Seiten 173 bis 177; Nazerian und Mitarb.. »Proc. Soc. Exptl. Biol. Med.«. Bd. 127 [1968], Seiten 177 bis 182).

Die Probleme der MD haben zu beträchtlichen Forschungsarbeiten zur Entwicklung von Behandlungs- -,0 und Verhütungsmaßnahmen geführt. Bekämpfungsversuohi durch genetische, chemische, biologische Mittel und sanierende Isolation waren jedoch unwirksam (»AAAP-Report«, a.a.O., und Biggs und Mitarb., a.a.O.). Immunologische Untersuchungen waren dem- ■-,-, gegenüber erfolgversprechend. Kot ta rid is und Mitarb, haben in »Nature«. Bd. 221 (1969), Seiten 1258 bis 1259, gezeigt, daß auch Knochenmark von mit MD infizierten Hühnern gezüchtete Zellen von Hühnerembryo-Fibroblastcn zur Entwicklung von Immunität M) führen, wenn einen Tag alte Hühner damit geimpft werden. Churchill und Mitarb. (»Nature«, Bd. 221, 1969, Seiten 744 bis 747) stellten aus dem Stamm HPRS16 einen Impfstoff her. der aus einem lebenden, abgeschwächten MD-Virus bestand, wobei das Aus- h> gangsmaterial mindestens 33 Zellenkulturpassagen durchmachen mußte, bevor das Virus abgeschwächt war und seine Pathogenität verloren hatte; das Virus hatte dann aber auch alles Antigen A verloren. Der so erhaltene Impfstoff ist vollständig mit Zellen assoziiert.

Aufgabe der Erfindung ist es, einen lagerbeständigen zeilassoziierten oder zellfreien Impfstoff gegen die Mareksche Hühnerlähme mit einem Gehalt an einem lebenden, nicht abgeschwächten Virus, der sein Antigen A nicht verloren hat, zur Verfügung zu stellen. Dieser Impfstoff soll bei 1 bis 21 Tage allen Hühnern einen vollständigen Schutz gegen MD ergeben.

Diese Aufgabe wird durch die Impfstoffe der Ansprüche 1 und 2 gelöst. Die Herstellung dieser Impfstoffe ergibt sich aus dem Anspruch 3.

Der erfindungsgemäß verwendete Virusstamm wird nachstehend auch als Avian-Herpesvirus IV (AHIV), Truthahn-Herpesvirus (HVI) oder als FC 126 bezeichnet.

Die Konzentration der das Dimethylsulfoxid enthaltenden Suspension beträgt IO⁵ bis 10⁷ PFU (plaquebildende Einheiten; vgl. Erläuterung weiter unten).

Aus Witter, Purchase undBurgoyne, »Am. ). Vet. Res.«, Bd. 31 (1970), Seiten 525 bis 538, ist ein Isolat FC 126 von HVT bekannt. In dieser Druckschrift befinden sich jedoch keine Angaben darüber, wie der verwendete Virusstamm zugänglich ist. Insbesondere ist keine Hinterlegungsstelle für diesen Virus genannt. Somit ist die Lehre dieser Druckschrift nicht nacharbeitbar, so daß sie als Stand der Technik insoweit nicht berücksichtigt werden kann.

Die erfindungsgemäßen Impfstoffe werden zum Immunisieren gegen die Mareksche Krankheit verwendet, indem sie zum Impfen von 1 Tag bis 3 Wochen alten Hühnern verwendet werden. Das erfindungsgemäß eingesetzte Virus stammt aus Blut- oder Nierengewebeproben von 2 23 Wochen alten Truthähnen aus einer I !erde in Indiana.

Serologische Untersuchungen, der Agar-Gel-Precipitintest (AGPP), der Virusneutralisationstest (VN) und der Fluoreszenz-Antikörpertest (FA) zeigen, daß das erfindungsgemäß eingesetzte Virus sich vom Herpesvirus der Marekschen Krankheit (MDIIV) unterscheidet (vgl.Tabelle I).

Tabelle I

Seren¹)

Antigene²)
FC 126
AGP

VN⁴)

FA

MDHV
AGP

FA

Kontrolle
AGP und FA³)

Hyperimmun:
FC126 (c)
Normale Zelle (c)

Konvaleszent:
FC126 (C)
FC126 (t)
MD-JM (c)^s)
MD-GA (c)^s)
MD-RPL-39 (C)⁵)
MD-FC127 (cf>

Kontrolle:
nichtgeimpft (c)
nichtgeimpft (t)

NB⁶)

NB

Anmerkung zur Tabelle I:

') Seren durch immunisierendes Antigen identifiziert; die Buchstaben in Klammern bedeuten, daß das Serum vom Huhn (c)

bzw. vom Truthahn (t) gewonnen ist.

²) AGP- und FA-Rcaktionen nach der Intensität klassifiziert; ++ (intensiv), + (vorhanden, aber weniger intensiv), - (negativ). ') FA-Reaktioncn d.xh das Nichtauftrelen einer Anfärbung in den Zellen zwischen Virusplaques kontrolliert.

⁴) Virusneutralisation bezoger auf 50-'Tozentige Plaqueverminderung bei einer Serumverdünnung von 1:20.

⁵) Vier einzelne Stämme von MOHV.
^b) NB = nicht bestimmt.

Es ist eine der Eigenschaften des Herpesvirus, daß infizierte Zellenkulturen gesonderte fokale Läsionen entwickeln, die, wenn sie reif sind, aus Haufen von abgerundeten, lichtbrechenden, degenerierenden Zellen bestehen. Diese durch AHIV verursachten Haufen oder Plaques sind morphologisch von denjenigen verschieden, die durch MDHV verursacht sind.

Andere Methoden zur Gewinnung des Virus aus dem Truthahn sind möglich. Blut- und Nierenzellen werden aufgrund ihres hohen Virusgehalts und ihrer leichten Zugänglichkeit bevorzugt eingesetzt. Einschichtige Standard-Zellenkulturen aus Kükennieren (CK), Hühnerembryo-Fibroblasten (CEF) und Entenembryo-Fibroblasten (DEF) (Witter und Mitarb., »Avian Diseases«. Bd. 13, 1969, Seiten 101 bis 118) werden zur Vermehrung des Virus verwendet, weil sie sich leicht infizieren lassen und schnell wachsen.

Unter Laboratoriumsbedingungen wird die erste Passage durchgeführt, indem 24 bis 48 Stunden alte einschichtige Kulturen von CK, CEF oder DEF mit infizierten Zellen aus mit Heparin versetztem Blut oder Nierengewebe beimpft werden, die mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen und dann trypsinisiert worden sind. Die Kulturen werden dann unter zeitweiligem Austausch des Kulturmediums mehrere Tage bei 37⁰C in einer feuchten Atmosphäre gehalten, die 3 bis 4% Kohlendioxid enthält. Bei allen folgenden Passagen wird das überstehende Zellenkulturmedium dekantiert oder abgesaugt, es wird Trypsin zugesetzt, um die Zellen abzutrennen, und die Zellen werden dann in einer geringen Menge des Mediums dispergiert und wieder auf frische einschichtige Zellenkulturen aufgepflanzt und gezüchtet, wie oben beschrieben.

Wenn 75% oder mehr der einschichtigen Kultur zytopathisch befallen sind, werden die Zellen übertragen. Die Zellen in einem Präparat werden gezählt, und das Ausmaß der Zelleninfekticn wiru bestimmt (d. h„ wenn die Zellen durch Trypsin dispergiert werden, lassen sie sich leicht unter dem Mikroskop beobachten und zählen, wodurch man ein quantitatives Maß für das Zellenwachstum erhält; oder eine bekannte Zahl von Zellen aus der infizierten Kultur kann verwendet

4-. werden, um eine nichtinfizierte einschichtige Kultur von CK-Zellen oder eine äquivalente Kultur zu beimpfen, die dann für eine bestimmte Zeitdauer, gewöhnlich 4 bis 7 Tage, inkubiert wirr¹, worauf man die durch das Virus verursachten Plaques zählt und so als hochgradig

in reproduzierbares quantitatives Maß für die Infektivität einen Titer erhält, der als plaquebildende Einheiten [PFU] angegeben wird).

So werden die virushaltigen Zellen mehreren Zellenkulturpassagen unterworfen, bis man eine brauch-

T) bare Menge von infizierten Zellen erhält. Insgesamt 5 bis 11 Einfach- oder Mehrfachpassagen genügen und führen nicht zur Schwächung des Virus. Gewöhnlich sind mehrere Einfachpassagen, in deren jeder die Anzahl der infizierten Zellen auf das 10- bis lOOfache

bo ansteigt, erforderlich, um die notwendige Menge für Mehrfachpassagen zur Verfügung zu stellen; z.B. hat eine Blut- oder Nierenzellenprobe mit einem Titer von weniger als 10 PFU nach sechs oder sieben Einfachpassagen einen Titer von mindestens 10⁵ PFU. der ausreicht, um mehrere weitere Zellenkulturcn zu beimpfen, von denen jede sich wiederum um das 10- bis lOOfache vermehren und dann geteilt werden kann.
Die gewünschte Menge und Konzentration des

Impfstoffes hängt offensichtlich vom Maßstab des Impfprogramms und der Dosisgröße ab. In der normalen Laboratoriumspraxis werden ungefähr 10⁹ Zellen erzeugt, aus dem Kulturmedium entfernt, trypsinisiert und dann in 100 ml Kulturmedium, das 10% Dimethylsulfoxid enthält, suspendiert, und man erhält schließlich eine Vaccine mit einer Konzentration von etwa 5 χ 10' virusinfizierten Zellen oder 10' PFU/ml.

Mit dieser Menge Impfstoff kann eine Million Hühner mit einer Dosis von etwa 5 χ 10³ Zellen oder 10³ PFU geimpft werden. Die 100 ml Impfstoff werden gewöhnlich auf 100 Ampullen zu je 1 ml verteilt, in flüssigem Stickstoff langsam gefroren und auf diese Weise gelagert, bis sie für die Immunisierung oder als Impfgut zur Erzeugung weiteren Impfstoffes benötigt werden.

Dosen von nur 10³ PFU haben bereits zur vollständigen Immunität geführt, und Dosen von 7 χ 10⁴PFU sind ohne Auftreten pathogener Effekte dargereicht worden. Die Nichtpathogenität von AHIV ist eine natürliche Eigenschaft und nicht etwa das Ergebnis einer Schwächung. Nach elf aufeinanderfolgenden Passagen bleibt das Virus ungeschwacht, was sich daraus ergibt, daß das A—Antigen nach der letzten Passage noch vorhanden ist. Da MDHV, ein eng damit verwandtes Herpesvirus, mindestens 33mal übertragen werden muß, um abgeschwächt zu werden, ist zu erwarten, daß bloße elf Passagen von AHIV keine Wirkung auf das Virus ausüben.

Tabelle II

Vaccin¹)	Infection²)	MD-Reaktion³)	Virus	AHIV
				8/8
		%	isolierung⁴)	6/7
AHIV	Kontakt	0	MD	6/6
AHIV	intraabdom.	0	4/8	0/3
AHIV	keine	0	5/7	0/3
Keines	Kontakt	75,0	0/6	0/6
Keines	intraabdom.	62,5	1/3	0/2
Keines	keine	0	1/3
MD-Virus		57,1	0/6
1/2

10

15

30

') Vatcinansatz Nr. 1 bei einem Alier von einem Tag in einer Dosis von 0.2 ml intraabdominal dargereicht. Jeder Vogel erhält 7,0 X 10⁴ PFU.

²) Die Tiere werden intraabdominal mit MD-Blut oder dadurch infiziert, da Ii geimpfte, mit MD infizierte, 5 Wochen -„ alle Tiere in den gleichen Isolierkäfig gesperrt werden.

¹J Die Versuchsdauer beträgt 20 Wochen; dann werden alle überlebenden Tiere seziert.

⁴) Das Virus wird aus den Nieren der überlebenden Tiere nach der indirekten Hühnernierenkulturmethode isoliert ö und als Verhältnis der mit Virus überlebenden Tiere zur Gesamtzahl der überlebenden Tiere angegeben.

Tabelle Il zeigt die Ergebnisse der Immunisierung mit AHIV-Vaccin nach der Infektion mit lebendem t,o M D-Virus. Sie zeigt ferner eine andere charakteristische Eigenschaft des AHIV. Das Vaccinvirus bringt die Vermehrung von MDHV in den geimpften Vögeln nicht zum Stillstand. Sowohl AHIV als auch MDHV werden noch aus 20 Wochen alten Hühnern isoliert, aber es sind tr, keinerlei Anzeichen von durch MD verursachter Pathogenität festzustellen. Hühner, die keine groben Läsionen zeigen, werden auf mikroskopische Läsionen untersucht Tiere, die eine durch MD verursachte Pathogenität, wenn auch nur mikroskopische Läsionen, zeigen, werden als MD-Reaktion angegeben.

Die charakteristische Eigenschaft des vorliegenden Impfstoffes, die ihn von abgeschwächten MDHV-Vaccinen unterscheidet, besteht darin, daß lebendes AHIV zellenfrei erzeugt wird und die erhaltene Vaccine trotzdem als immunologisches Mittel wirksam ist (vgl. Beispiel 7). Alle zellenfreien Vaccine lassen sich leicht lagern, ohne daß man strenge Lagerungsbedingungen anzuwenden braucht, wie sie bei den mit Zellen assoziierten Virusvaccinen erforderlich sind.

Das Zerbrechen der Zellen kann nach verschiedenen Methoden durchgeführt werden, z. B. durch Beschallung oder durch Gefrieren und Wiederauftauen. Die Beschallung wird bevorzugt, weil sie sich leicht und schnell anwenden läßt Nach 20 Sekunden langer Beschallung sind in dem Vaccin bei der Untersuchung im Hämocytometer keine heilen Zellen oder Zellenkcrne mehr sichtbar.

Beispiel 1

Zwei 23 Wochen alten Truthähnen (FC 126) werden Proben von Nierengewebe entnommen, in phosphatgepiirferter Salzlösung gewaschen, mit der Schere zerkleinert, nochmals gewaschen und in 0,025prozentiger Trypsinlösung bei 37° C dispergiert. Die so erhaltene Zellensuspension wird zu einer 24 Stunden alten einschichtigen CK-Kultur (Wi it er und Mitarb, a.a.O.) zugesetzt und bei 37°C einen Tag inkubieren gelassen. Nach diesem Zeitraum wird das Medium ausgewechselt und die Kultur noch weitere 15 Tage inkubieren gelassen. Für jede Platte werden 25 ml Standard-CK-Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung verwendet:

»Eagles basal medium« (BME)*) 80

Tryptosephosphatflüssigkeit (30 g/l)**) 10

2,8-prozentige wäßrige Natrium- 3

bicarbonatlösung

Rinderfetalserum 5

Penicillin (100 Einheiten/ml) 1
Streptomycin (0,1 mg/ml) > 6

Mycostatin (25 Einheiten/ml) J

*) »Biochemists" Handbook«, Verlag D. VanNostrand Co.,

Inc., Princeton, New Jersey, V.St.A., 1961, Seite 1064. **) Proteinhaltiges Wachstumsmedium.

Am Ende der Inkubationszeit wird die ganze Zellenmasse π it phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen, mit 4 ml 0,05prozentiger Trypsinlösung dispergiert, in Zen'.rifugengläser eingebracht, die zu 10% ihres Volumens mit Kälberserum gefüllt sind, mit IGOOg zentrifugiert, von der überstehenden Flüssigkeit getrennt, wieder in 1 ml Kulturmedium suspendiert und wieder auf eine frische, 24 Stunden alte CK-Kultur aufgepflanzt, die man dann 5 Tage bei 37°C inkubieren läßt. In dieser Weise wird das isolierte FC-126-Virus in insgesamt sechs Passagen in CK-Kulturen propagiert. Die Zellen in eier letzten Passage werden, wie oben beschrieben, gewaschen, trypsinisiert und zentrifugiert und dann konserviert, indem man sie in insgesamt 1 ml Kulturmedium dispergiert, welches 15% Kälberserum

und 10% Dimethylsulfoxid enthalt. Die Suspension wird bis zur Temperatur des flüssigen Stickstoffes (-70⁰C) langsam refroren und dann für Impfkulturen verwendet, aus denen größere Ansätze des Impfstoffes hergestellt werden. Die letzte Suspension hat eine Zellenkonzentration von 3.8 χ IO⁶ Zellen/ml und einen Titer von 5 χ IfVPFU/ml.

Beispiel 2

Den gleichen beiden Truthähnen wie in Beispiel 1 werden Blutproben entnommen. Das Blut wird mit Heparin (20 F.inhciten/ml) versetzt und unmittelbar zum Beimpfen einer 24 Stunden alten einschichtigen DF.F-Kultur verwendet. Die Inkubation und sieben aufeinanderfolgende Passagen werden gemäß Beispiel I durchgeführt. Das DEF-Kulturmcdium ist folgendermaßen zusammengesetzt:

siehe
Tabelle III langsam gefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert. Man erhält 100 Ampullen zu je 1 ml, die I χ Ι0^; Gesamt/eilen und 1 χ 10* PFU je Ampulle enthalten.

Tabelle III

Zusammensetzung des Kulturmediums

Medium (199 X 10) 40

Nährmedium (FIOX 10) 50

Tryptosephosphatflüssigkeit*) 5

(30 g/l)

2.8-prozentige wäßrige 3

Natriumbicarbonatlösung

Kiilbcrserum 4

*) l'roleinhaltiges Wachstunismedium.

Nach der siebten Passage werden zwei Anteile Vaccin zu je 1 ml gemäß Beispiel I konserviert. Die lindkonzentration beträgt 6.9 χ 10* Gesamtzellen mit einem AHIV-Gehalt von 1.5 χ 10'PFU/ml.

Beispiel 3

In sechs 150 χ 25 mm großen Kulüirschalen aus Kunststoff wird je eine zusammenwachsende. 24 Stunden alte. einschichtige DEF-Kultur mit 3.3 χ ICr¹ PFU des gemäß Beispiel 2 gewonnenen AHIV beimpft. Das Kulturmedium (25 ml je Platte) ist das gleiche wie in Beispiel 2. Am Tage nach der Infektion wird das Medium ausgewechselt, und die Kulturen werden weitere zwei Tage unter den gleichen Bedingungen gehalten. Zu diesem Zeitpunkt sind mehr als 75% der einschichtigen DEF-Kultur cytophatisch befallen, und die Zellen sind reif zur Übertragung.

Die Übertragung erfolgt durch Entfernen des Kulturmediums, einmaliges Waschen der Zellen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Zusatz von 4 ml 0,25prozentiger Trypsinlösung und 5 Minuten langes Reagierenlassen. Die gelockerten Zellen werden dann in Zentrifugengläser eingegeben, die zu 10% ihres Volumens mit Kälberserum gefüllt sind, um die Wirkung des Trypsins zu verlangsamen. Nach dem Absetzen durch 5 Minuten langes Zentrifugieren mit 1000 g werden die Zellen wieder in dem Kulturmedium suspendiert, und sämtliche Zellen von den sechs Platten werden auf 48 Platten (Größe 150 χ 25 mm) verteilt. die 24 Stunden alte einschichtige DEF-Kulturen enthalten.

Drei Tage später werden die Zellen, nachdem sie in der gleichen Weise behandelt worden sind wie in der Wuchsperiode, durch Trypsinisieren, wie oben beschrieben. geerntet, sobald der cytopathische Effekt sich gut entwickelt hat, und dann werden sie in einem 10% Dimethylsulfoxid enthaltenden Medium suspendiert.

Bestandteile

L-Arginin

L-Histidin

L-Lysin-HCI

DL-Tryptophan

DL-Phcnylalanin

DL-Mcihionin

DL-Serin

DL-Threonin

DL-Leucin

DL-Isole'icin

DL-Valin

DL-Glutaminsiiurc

(HCI) (HCl)

(L. wasserfrei) (L) (L)

g/l

I¹M)

0,070 0,020 0,070 0.020 0.050 0.030 0.050 0.060 0.120 0,040 0.050 0.150

0.060 0.050 0,040 0.010 0.050 0.100 0.020 0.040 0.0001

8,0

0.400

0.200

0.090

0.060

0.140

0.350

0.0001

1.000

0.020

DL-Aspai aginsäure

DL-ö-Ala"in

L-Prolin

L-Hydroxypyrolin

Glycin

L-Glutamin

L-Cystin

L-Tyrosin

L-Cystein-HCI (kein HCD

L-Asparagin

MgSO₄ 7Ii-O

Na^HPO₄ · 7 H-O

KH-PO₄

Cad- (2 H-O)

NaHCO-,

Fe(NOj);

Dextrose

Natriumpyruvat

Phenolrot

Liponsäure

FeSO₄ -7H-0

CuSO₄ -5H-O

ZnSO₄ · 7 H;O

Polyoxyäthylen(20)sorbiton- 5.0

mono oleat.

ATP 1,0

Adenylsäure 0,200

Deoxyribose 0.500

D-Ribose 0,500

Natriumacetat ■ 3 H₃O 0,050

Adenin 10,0

Guanin 0,300

Xanthin 0,300

Hypoxanthin 0,300

Uracil 0,300

Thymin 0,300

Thiamin (HCl) 0,010

Pyridüxiri-HCi 0,025

Riboflavin 0,010

Pyridoxal-HCl 0,025

Niacin 0,025

0.211

0.021

0.029

0.0006

0,005

0,004

0*011

0.004

0.013

0.003

0,004

0.015

0.013 0.009 0.012

0.008 0.146

0.002

0.025

0.013

7.4

0.285

0.153

0.290

0.083

0.044

1.2

1.100

0.110

0.0012

0.0002

2.0

0.004

0.05:

4,00

1,0

0,206

0,376

Fortsetzung
Bestandteile

mg/1 199

FlO

Ni.;inamid 0,025 0,615

Ca-pcintothenal (D) 0,010 0.715

i-Inosit 0,050 0,541

Ascorbinsäure 0.050

[•'ölsäure 0.010

p-Aminobenzoesäure 0.050

Biotin 0.010 0.024

Menadion (Methyl- 0.010

1.4-naphthachinon)

Ciluthion 0.050

Vitamin A 0.100

Calciferol 0.H)O

Cholesterin 0.200 Vitamin B,_?

Thymidin

Cholin-Cl 0,500 0.698

Nai-ff-T.>copherolpho\|>hat 0.010

10

Beispiel 4

Das Produkt des Beispiels I wird gemäß Beispiel J verarbeitet. Der so erhaltene Impfstoff wird in Ampullen zu je I ml gelagert, die 3,5 χ 10' PFU/ml Al HV enthalten.

Beispiel 5

Das Produkt des Beispiels I wird weitere fünf Male in CK-Kulturcn übertragen, und m«n erhält einen Impfstoff mit einer AHIV-Konzentration von (V) χ IO⁴ PFU/ml.

Beispiel 6

Die in den Beispielen 3. 4 und 5 erzeugten Impfstoffe werden verwendet, um einen Tag bis 3 Wochen alte

.^fs

die dii

e diinn üti Alier von ⁿin^p!Ti

) Wochen entweder durch intraabdominalc Injctioncn mit MDHV oder durch Kontakt mit anderen, mit MDHV infizierten Hühnern infiziert werden. Die Dosen an AHIV-Vaccin variieren von 48 bis 3x10* PFlJ in 0,2 ml (vgl. Tabelle IV).

Tabelle IV
Behandlung

Impfstoff

gemaU

Beispiel

Keiner

Impfstoffdosis, PFU

1 X 10 1 X 10* 480 48 520 690 480 3X10⁴ 3 X 10' I X 10⁴ 1 XlO⁴ I X 10⁴ 1 XlO⁴ keine keine keine keine keine keine

Alter hei der Impfung. Tage

7 14 21

Alter hei der Infektion. Wochen

Art der Infektion

(1 Tag)

(1 Tag) intraabdom.

Kontakt

intraabdom.

Kontakt

intraabdom.

intraabdorn.

intraabdom.

Kontakt

intraabdom.

Kontakt

intraabdom.

MD-Reaktion,

0,0

12.5

42,8

0,0

17,6

55,0

0,0

0.0

75,0

88,0

40,0

70,0

100,0

0,0

Beispiel 7

Aus dem Produkt des Beispiels 1 wird durch vier weitere Passagen in CK-Kulturen und drei Passagen in CEF-Kulturen ein Vaccinansatz mit 1 χ ΙΟ⁶ PFU/ml hergestellt. Ein Teil dieses Impfstoffes wird mit Hilfe eines Beschallungsgerätes mit einer Nadelsonde Sekunden mit einer Intensität von 70 beschallt Nach der Beschallung sind bei der Untersuchung im Hämocytometer keine heilen Zellen oder Zellkerne mehr sichtbar. Ein zweiter Anteil des Impfstoffes wird ohne Dimethylsulfoxid bei — 70°C schnellgefroren. Einen Tag alte Hühner werden durch Injektion von 0,2 ml des beschallten bzw. des schnellgefrorenen Impfstoffes mit einem Virusgehalt von je 500 PFU/0,2 ml immunisiert. Die Ergebnisse sind die folgenden:

ImpfslolT	Aller	MD-Reaktion,
	hei der	%
	Infektion
	mit MDIIV
	(intrn-
	iibdominal)
Beschallt	3 Wochen	0
Ohne Dimethylsulfoxid	3 Wochen	0
schncllgel'rnren
Keiner	.1 Wochen	7S

Claims

Patentansprüche:

1. Lagerbeständiger, mit Zellen assoziierter Lebendimpfstoff zum Immunisieren von Hühnerküken gegen die Mareksche Hühnerlähme, gekennzeichnet durch einen Gehalt an lebendem Truihahn-Herpes-Virus (ATCC-Nr. VR 584), eingefroren in einer Zellsuspension.

2. Lagerbes'"indiger, zellfreier Lebendimpfstoff in zum Immunisieren von Hühnerküken gegen die Mareksche Hühnerlähme, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Truthahn-Herpes-Virus (ATCC-N -. VR 584).

3. Verfahren zur Herstellung eines Lebendimpfstoffes nach Anspruch 1 oder 2 unter Vermehren von Truthahn-Herpes-Virus durch wiederholtes Überimpfen auf Gewebekulturen von Kükennieren, Hühnerembryo-Fibroblasten oder Entenembryo-Fibroblasten, Auftrennen der Zellschicht der letzten Kultur mit Trypsin und Versetzen der von Kulturmedium abgetrennten Zeilen mit einem frischen Kulturmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man Truthahn-Herpes-Virus mit der Hinterlegungsnummer (ATCC VR 584) verwendet und die erhaltene Suspension, die gegebenenfalls 5 bis 10 Vol.-% Dimethylsulfoxid enthält, zum Herstellen von zeilassoziiertem Lebendimpfstoff langsam auf — 70⁰C einfriert oder zum Herstellen von zellfreiem Lebendimpfstoff die Zellen üblicherweise zerbricht und die zerbrochenen Zellen aus dem. Medium entfernt.