Uprawniony z patentu: Merck and Co., Inc., ^ Rahway (Stany Zjednoczone Ameryki) Sposób wytwarzania szczepionki przeciw chorobie Mareka Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia szczepionki przeciw chorobJe Mareka, zwlasz¬ cza uodporniajacej kurczeta przeciw tej chorobie.Choroba Mareka jest zakazna choroba ukladu limfatycznego, w której stwierdza sie guzy limfa- tyczne narzadów wewnetrznych. Zostala ona po raz pierwszy opisana w roku 1907. Jest to choroba najbardziej destrukcyjnie wplywajaca na drób.Najwieksze straty siegajace ponad 150 milionów poniosly Stany Zjednoczone Ameryki na skutek „leukozy" typu chorobowego u kurczat, przy czym choroba Mareka miala w tym najwiekszy udzial.Straty powodowane choroba Mareka byly zasad¬ nicza przyczyna badan zmierzajacych do leczenia i zapobiegania tej chorobie. Jednakze próby kon¬ troli genetycznej, chemicznej, biologicznej oraz urzadzen higienicznych okazaly sie nieskuteczne.Wiele wysilków poswiecono na scharakteryzowa¬ nie choroby Mareka, miedzy innymi P. M. Biggs, Current Topics w Microbiology and Immunology 43, 93—125 (1968), Churchill i wspólpracownicy w Nature 215, 528—530 (1967), Salomon i wspólpra¬ cownicy w Proc. Exptl. Biol. Med. 127, 173—177 (1968), Nazerian i wspólpracownicy w Proc. Soc.Exptl, Biol. Med. 127, 177—182 (1968) wykazali, ze przyczyna tej choroby jest wirus z grupy herpes B.Kottaridis i wspólpracownicy w Nature 221, 1258—1259 (1969) stwierdzili, ze komórki wyhodo¬ wane z firboblastu zarodka kurczecia ze szpikiem kostnym kurczat zarazonych choroba Mareka, po 10 15 20 25 zaszczepieniu kilkudniowym zdrowym kurczetom dzialaly uodparniajaco przeciw tej chorobie.Churchill i wspólpracownicy w Nature 221, 744—747 (1969) przedstawili sposób wytwarzania szczepionki zawierajacej zywe atenuowane wirusy choroby Mareka HPRS16, który otrzymano w kon¬ cowym 33 pasazu hodowli komórek, przy czym wi¬ rus byl atenuowany, stracil swoje wlasciwosci pa¬ togeniczne, lecz równiez stracil calosc antygenu A.Hodowle komórek nerki kurczecia poddane dzia¬ laniu trypsyny szczepiono wirusem HPRS 16 i in- kubowano na plytkach Petriego w temperaturze 38,5°C, w wilgotnej atmosferze, zawierajacej 5% dwutlenku wegla, przy czym uzyskiwano efekt po¬ dobny do otrzymanego w przypadku nie szczepio¬ nej hodowli komórek nerki kurczecia chorych.Efekt cytopatyczny, podobny do efektu dzialania wirusa obserwowano po 7—10 dniach od zaszcze- N pienia. W warstwie komórek stwierdzono ogniska okraglych komórek, silnie zalamujacych swiatlo.Kazde ognisko rozrastalo sie w ciagu nastepnych 7—10 dni inkubacji, przy czym mialo miejsce albo wciaganie komórek do srodka lub ich odlaczanie, czego efektem byly widziane mikroskopowo lysin- ki. Okragle komórki z zakazonej hodowli po pod¬ daniu dzialaniu metanolem i zabarwieniu barwni¬ kiem May-Grunwalda-Giemsa okazaly sie jedno-, dwu- lub wielojadrowe. Cytoplazma tych komó¬ rek jest silnie bazofilna, jadra moga zawierac wtrety typu A Cowdry, barwiace sie na rózowo.76295 * * Komórki wielojadrowe moga byc zwiazane z lysin- kami. Rózna ilosc jader wewnatrz komórek wska¬ zuje na wtrety jadrowe, Cytochemiczne wtrety ja¬ drowe poddane badaniu za pomoca zieleni mety¬ lowej z pironina, barwnika Feulgena i fluorescen¬ cyjnej pochodnej fosforowodoru wykazuja zawar¬ tosc DNA, to jest kwasu desoksyrybonukleihowego.Poddanie komórek dzialaniu 0,0i% roztworu kry¬ stalicznej desoksyrybonukleazy w buforze fosfora- ^ nowym o wartosci pH-=*7,2, zawierajacym 10-1 chlorku magnezu w temperaturze 37°C w ciagu 30 minut powoduje uwolnienie wtretów jedrowych z zainfekowanych komórek. Dodanie do podloza hodowli tkankowej w momencie zakazenia 5-jododezoksyurydyny w stezeniu 10 ^g/ml ha¬ muje rozwój mikrolysinek, co wskazuje, ze efekt cytopatyczny powodowany jest przez czynnik cho¬ roby wrazliwy na inhibitor syntezy DNA. Inoculum komórek nowotworowych w ilosci 104 powoduje po 10—14 dniach powstanie 10—100 ognisk.Zarówno we wczesnych, jak i dalszych pasazo- waniach nie nastepuje przechodzenie wirusa z ko¬ mórek lub uwalnianie sie plynu hodowlanego.Otrzymana szczepionka zawierala w calosci zwia¬ zana komórke. Wirus HPRS 16 szczepionkowy ate- nuowany. przebywajacy w ukladzie krazenia kur¬ czat w ciagu 14 dni nie rewetuje do typu wyjscio¬ wego, nie zawiera antygenu A, a jego obecnosc nie chroni kurczat przed zakazeniem wirusem zjadli¬ wym. Jednakze podanie wirusa atenuowanego po¬ woduje powstanie znacznej odpornosci nabytej.Celem wynalazku jest opracowanie sposobu wy¬ twarzania szczepionki zjadliwego wirusa, która w praktyce jest niepatogeniczna i wirulentna, a ponadto nie stracila antygenu A, szybko wytwa¬ rzanej w pieciu lub dziewieciu pasazach kultury komórkowe] i dziala uodparniajaco na chorobe Mareka, w przypadku podawania 1—21-dniowym kurczetom. Szczepionka otrzymana sposobem we¬ dlug wynalazku ewentualnie nie zawiera komórek i moze byc przechowywana w dogodny sposób.Sposób wytwarzania szczepionki przeciw choro¬ bie Mareka wedlug wynalazku polega na tym, ze jednowarstwowa hodowle komórek, wydzielona z tkanki zdolnej do rozwoju, takiej, jak nerka kur¬ czecia, embrion kurczecia, embrion kaczki szczepi sie drobnoustrojem Avian Herpesvirus IV ATCC nr VR 584. Nastepnie zaszczepiona hodowle ko¬ mórek inkubuje sie az do zakazenia wyzej wymie¬ nionym wirusem okolo T5% komórek. Po inkuba¬ cji z hodowli wydziela sie komórki za pomoca trypsyny. Wydzielone komórki zastepuje sie swie¬ zymi jednowarstwowymi hodowlami komórek i pa- sazuje przez hodowle komórek w sposób analogicz¬ ny do opisanego powyzej, az do uzyskania odpo¬ wiedniej ilosci zjadliwych komórek, które utrwala sie przez zdyspergowanie w koncowym pasazu z trypsyna, wydziela z cieklej czesci otrzymanej zawiesiny i dysperguje w odpowiedniej ilosci cie¬ czy hodowlanej zawierajacej okolo 10% dwume- tylosulfotlenku. W celu otrzymania szczepionki, zawierajacej zamrozone, zywe komórki wirusa, otrzymana zawiesine powoli zamraza sie. Komór¬ ki te w koncowym pasazowaniu rozpuszcza sie w trypsynie, oddziela z cieczy hodowlanej, powtór¬ nie rozpuszcza sie w cieczy hodowlanej, zawiera¬ jacej od 5—10% dwumetylosulfotlenku, i wytwa¬ rza koncentrat o stezeniu od okolo 105 do 107 PFU na miliiitr. Zaatakowane komórki wyodrebnia sie • z indyka, stosuje do zaszczepiania pierwszej kul¬ tury komórkowej, przy czym obydwie znajduja sie w heparynizowanej nie uszkodzonej krwi lub tkan¬ ce nerkowej, która przemywano zbuforowana sola fosforowa i dyspergowano z trypsyna.Szczepionka otrzymana w sposób opisany powy¬ zej powoduje nastepnie zniszczenie komórki, za¬ infekowanej przez wirus, zdyspergowanej w cie¬ czy hodowlanej.Zniszczona komórke usuwa sie nastepnie z cie¬ czy, a uzyskana szczepionka charakteryzuje sie tym, ze zawiera glównie zywe, nieatenuowane wi¬ rusy wolne od komórki.Szczepionke, otrzymana sposobem opisanym po¬ wyzej, stosuje sie do zapobiegawczego uodpornia¬ nia kurczat przeciwko chorobie Mareka, podajac te szczepionke kurczetom w wieku od 1 dnia do 3 tygodni.Wirus typu Avian Herpesvirus IV (AHIV), z któ¬ rego produkuje sie gotowa do uzycia szczepionke, wyosabnia sie z krwi lub pojedynczej tkanki ner¬ kowej chorych kurczat lub indyków.Wyizolowanie oznacza sie jako FC 126 i byly one otrzymane z dwóch 23-tygodniowych indyków w stanie Indiana.Inne wyosobnienia otrzymano miedzy innymi z krwi 16-tygodniowych indyków w stanie Geor¬ gia i oznaczono jako A C 16, z tkanki nerkowej 18-tygodniowych indyków w stanie Indiana i ozna¬ czono je jako A C 18 oraz z tkanki nerkowej in¬ dyków w stanie Wisconsin i oznaczono je jako W T H VI.Przeprowadzone badania serologiczne za pomo¬ ca próby wytracajacej zel-agar {A G P), próby neu¬ tralizujacej wirus (VN) i próby fluoryzujacej wy¬ kazaly, ze cztery wyosobnienia wirusa typu A H IV sa antygenicznie nierozróznialne, lecz róznia sie od herpesvirusa typu HPRS, co przedstawiono w tablicy 1.Jedna z wlasciwosci herpesvirusa jest to, ze za¬ kazone hodowle komórek rozwijaja odosobnione ogniskowe zmiany patologiczne, które dojrzewaja, wytwarzajac dookola siebie skupiska zdegenero- wanych komórek. Te skupiska lub plytki wywo¬ lywane sa przez wszystkie cztery rodzaje wirusa AHIV, morfologicznie rózne od tych, które wzbu¬ dzone sa przez wirus typu HPRS.Inne metody otrzymywania wirusa z indyków przeprowadza sie w sposób analogiczny, lecz ko*- mórki krwi lub nerki sa najodpowiedniejsze i naj¬ latwiej otrzymac z nich szczepionke. Wzorcowe jednowarstwowe kultury komórkowe zdolne do rozwoju, takie jak komórki nerki kurczecia CK, zarodka kurczecia CEF i fibroblastu zarodka kacz¬ ki DEF, wedlug Witter'a i innych, opisane w Avian Diseares 13, 101—118 (1969), stosowane sa do roz¬ mnazania wirusa, poniewaz daja sie latwo zakazac i powoduja szybki wzrost wirusa.W warunkach laboratoryjnych, pierwszy pasaz otrzymuje sie przez zaszczepienie zainfekowanych 13 20 15 30 10 40 00 5576 295 Próba* Uodpornienie: FC126 (c) AC16 (c) AC18 (c) WTHVI (c) Normal celi (c) Ozdrowienia: FC126 (c) FC126 (t) MD—JM (c)5 MD—CA (c)5 MD—RPL-39 (c)5 MD—FC127 (c)5 Kontroina: Niezaszczepiona (c) 1 Niezaszczepiona (t) T AGP + + + + — . + + + + + + — — ' ablica 1 FC 126 VN4 + + ¦ + + — + — + + + — — — A \ FA ++ + + + ++ — + ND +. + +¦ ¦+¦ 1 — NP nttgeny* HPRS AGP — — ¦ — — - — + — + + + + + + + + . — — FA + + + ¦ + — + ¦ ND + + + + ++ + + — ND Kontrolne AGP i FA3 , — —. — — ¦ — — — — ¦ — — — — — 1 1 Próba identyfikujaca uodparniajacy antygen, u kurczat (c) lub indyków (t), 2 AGP i FA reakcje okreslajace intensywnosc wytracania zelu ++ (intensywne), + (mniej in¬ tensywne), — (negatywne), 3 FA reakcje kontrolowane przez brak zabarwie¬ nia komórek miedzy plytkami wirusów, 4 Zobojetnienie wirusa na bazie 50% zmniejsze¬ nia liczby plytek w koncowym serum rozcienczo¬ nym w stosunku 1 :20, 5 4 szczepy wydzielone z wirusa HPRS. komórek z heparynizowanej krwi lub tkanki ner¬ kowej, przemywa zbuforowana sola fosforowa, a nastepnie pojedyncze warstwy kultur CK, CEF i DEF traktuje trypsyna w czasie od 24—48 godzin, w ciagu kilku dni, w temperaturze 37°C, w wil¬ gotnej atmosferze zawierajacej od 3—4% dwutlen¬ ku wegla z okresowymi zmianami medium wzro¬ stu. 2 calosci nastepnych pasazy najbardziej ply¬ wajace medium komórkowe zlewa sie znad osadu lub oddziela pod zmniejszonym cisnieniem, po czym do oddzielonych komórek zdyspergowanych w malej ilosci cieczy hodowlanej dodaje sie tryp- syne, nastepnie powtórnie umieszcza sie i hoduje na swiezych jednowarstwowych hodowlach komó¬ rek w sposób opisany powyzej.Hodowle komórek pasazuje sie az do osiagniecia w co najmniej 75% cytopatologicznych zmian. Po czym oblicza sie ilosc komórek w preparacie i okre¬ sla wielkosc zakazenia komórek, np. komórki wi¬ rusa, po zdyspergowaniu komórek za pomoca tryp- c:"ny sa latwo widoczne i oblicza sie ich liczbe, biorac pod uwage ogólna, ilosc wzrostu komórek, lub tei znajac liczbe komórek z zakazonej hodowli stosuje sie obliczanie nie zakazonej jednowarstwy komórek CK, albo tez oblicza sie równoznacznie te komórki wirusa, które wyhodowano w okreslo¬ nym okresie czasu, zazwyczaj w czasie 4—5 dni, po czym ilosc plytek wywolanych przez ten wirus oblicz* sie, biorac pod uwage wskaznik wyraza¬ jacy wielkosc aktywnosci i podalac ten wskaznik w jednostkach utworzonych plytek (PFU).Odpowiednie komórki poddale sie nastepnym kolejnym pasazom w hodowli komórek az do uzy¬ skania calkowitego zakazenia. Od 5 do 11 poje¬ dynczych lub wielokrotnych pasazy wystarcza dla uzyskania nieatenuowanych wirusów. Nastepnie z pojedynczych pasazy okresla liczbe 10—100 za- 5 kazonych komórek, zazwyczaj wymagana do otrzy¬ mania odpowiedniej jakosci komórek wirusa dla wielokrotnych pasazy w celu otrzymania aktyw¬ nosci pasazowania, wynoszacej co najmniej 105 PFU, która jest odpowiednia do zaszczepiania in- 10 nych hodowli komórek w ilosci 10—100 wedlug podanego ponizej skalowania.Zadana jakosc i stezenie szczepionki w praktyce okresla sie za pomoca skali obrazujacej szczepienie programowe i objetosc dawki. W warunkach labo- 15 ratoryjnych okolo 10° komórek otrzymanych, od¬ dziela sie z cieczy hodowlanej, rozpuszcza w tryp- synie i powtórnie rozpuszcza w 100 ml cieczy ho¬ dowlanej zawierajacej 10% DMSO, otrzymujac ostatecznie szczepionke o stezeniu zainfekowanych w przez wirus komórek, wynoszacym okolo 5X107 lub 107 PFU/itl. Ta iloscia szczepionki mozna za¬ szczepic jeden milion kurczat, stosujac dawke, za¬ wierajaca okolo 5Y103 komórek wirusów lub 103 PFU, 100 ml szczepionki wlewa sie do stu 1 mlli- » litrowych ampulek, zamraza powoli w cieklym azo¬ cie i przechowuje w ten sposób, az do zaszczepie¬ nia.Dawke wynoszaca 103 PFU stosuje sie korzystnie dla uodpornienia, natomiast dawka wynoszaca okolo 30 7X10* PFU usuwa skutecznie zmiany patologiczne.Niepatogenicznosc wirusa typu AH IV jest natu¬ ralna cecha i nis jest wynikiem atenuowania. Po 11 kolejnych paiazowaniach wirus staje sie nie- atenuowany, co tznacza, ze antygen A jest jeszcze '*• obecny po koncowym pasazowaniu.Pojedyncze wirusy typu HPRS obejmuja odpo¬ wiedni herpesvirjs, który musi byc pasazowany co najmniej 33, w wyniku czego otrzymuje sie wi¬ rus atenuowany. 11-krotne pasazowanie nie wply- ^10 wa na wlasciwosci wirusa. 1 Grupa szczepionek oznaczonych nr 1 otrzyma z 0.2 ml dawki wynoszacej 7,0X10* PFU stosowa¬ na 1-dniowym kurczetom. 45 a Ptaki wykazujace w calej krwi wirus choroby1 76 295 8 -zczepionka1 AHIV I AHIV AHIV — '—- ¦ ~~ wirusa HPRS Tablica 2 Wprowadzenie2 Kontaktowe Zastrzyk dobrzuszny — Kontaktowe Zastrzyk dobrzuszny — "¦¦* % zmian*1 choro¬ bowych 0 0 0 75,0 62,5 0 57/1 Wyizolowany wirus4 | HPRS 4/8 5/7 0/6 1/3 1/3 0/6 1/2 AHIV 8/8 6/7 S/6 0/3 0/3 0/6 0/2 25 Mareka na skutek umieszczenia odpowiednio wy¬ hodowanych 5-tygodniowych ptaków razem z pta¬ kami zakazonymi wirusem powodujacym chorobe Mareka. 3 Okres doswiadczenia wynosi 20 tygodni, w tym 5 czasie wszystkie utrzymane przy zyciu ptaki pod¬ dano badaniu posmiertnemu.* Wirus wyodrebniano z nerki utrzymywanych przy zyciu ptaków przez wydzielenie nerki, przy czym okreslono stosunek utrzymywanych przy zy- 10 ciu ptaków zakazonych wirusem do ogólnej liczby utrzymanych przy zyciu ptaków.W tablicy 2 przedstawiono wyniki uodpornia¬ nia zywa szczepionka typu AHIV ptaków na wi¬ rusy choroby Mareka, Przedstawiono inna charak- u terystyke wirusa typu AH1V. Wirus szczepionki nie powodowal zahamowania rozwoju wirusa typu HPRS u inkubowanych ptaków.Obydwa wirusy typu AHIV i HPRS wyizolowa¬ no z kurczat 20-tygodniowych, przy czym pojedyn- 20 cze wirusy typu HPRS nie posiadaja wlasciwosci patogenicznych. Przedstawione kurczeta wykazuja pewne zmiany patologiczne okreslone za pomoca mikroskopu. Kazdy z przedstawionych ptaków wy¬ kazywal zmiany patologiczne obejmujace patoge¬ niczne zmiany mikroskopowe okreslone jako cha¬ rakterystyczne symptomy choroby Mareka.Charakterystyka wlasciwosci gotowej do uzycia szczepionki rózni sie tym, od zawierajacej atenuo- wany wirus typu HPRS, ze zawiera zywy nieate- nuowany wirus typu AHIV otrzymany z zywych komórek, a otrzymana szczepionka jest skutecznym czynnikiem uodporniajacym (porównaj przyklad VII). Calosc szczepionek moze byc ewentualnie lat¬ wo przechowywana w odpowiednich warunkach.W celu przechowywania szczepionek zniszczeniu komórek wirusa zapobiega sie, za pomoca odpo¬ wiednich sposobów, na przyklad dzialania ultra¬ dzwieków lub zamrazania-odmrazania. Dzialanie ultradzwiekami jest sposobem korzystnym, ponie- 40 waz polega na latwym i szybkim zabiegu. Po 20 se¬ kundach dzialania ultradzwieków na szczepionke wirus jest widoczny w szczepionce podczas bada¬ nia w hemocymetrze.Nastepujace przyklady omawiaja sposób wytwa- 45 rzania szczepionek wedlug wynalazku i zastoso¬ wanie tych szczepionek, nie ograniczajac zakresu wynalazku.Przyklad I. Pojedyncza tkanke nerkowa wy¬ dzielona z dwóch 23-tygodniowych indyków w 35 (FC126), przemywa sie zbuforowana sola fosforowa, tnie nozyczkami, przemywa powtórnie i .dysper¬ guje z 0,025% roztworem trypsyny w temperatu¬ rze 37°C. Otrzymana komórkowa zawiesine dodaje sie w ciagu 24 godzin do jednowarstwowej kultu¬ ry CK i nastepnie inkubuje w temperaturze 37°C w ciagu 1 dnia. W tym czasie zmienia sie podloze i kulture inkubuje sie w ciagu 15 dni. Dwadzies¬ cia piec mililitrów wzorcowej cieczy hodowlanej CK wlewa sie na kazda plytke. Ciecz ta sklada sie z BME medium w ilosci 80%, brzeczki tryptozofos- foranowej (30 g/litr) w ilosci 10%, 2% wodnego roztworu dwuweglanu sodu w ilosci 3%, serum krwi wolu w ilosci 5%, penicyliny o mocy 100 jednostek/ml i streptomycyny (0,1 mg/ml) oraz my- kostatyny o mocy 25 jednostek/ml w ogólnej ilos¬ ci 6%, przy czym sklad medium BME okreslono w Biochemisty Handbook. D. Van Nostrand Co., Inc. Princeton, New Jersey, 1961, str, 1064.Pod koniec okresu inkubacyjnego calosc komó¬ rek przemywa sie zbuforowana sola fosforowa, dysperguje w 4 ml 0,05% roztworze trypsyny i umieszcza w probówce zawierajacej serum krwi cielecia w ilosci do 10% objetosci probówki, od¬ wirowuje w wirówce o obrotach wynoszacych 1000 na godzine, oddziela z najbardziej powierzch¬ niowej warstwy, powtórnie rozpuszcza w 1 ml cie¬ czy hodowlanej i umieszcza na swiezej 24-godzin- nej hodowli CK, która nastepnie inkubuje sie w ciagu 5 dni w temperaturze 37°C, Wyizolowany wirus typu FC 125 w hodowli CK jest oasazowany szesciokrotnie w sposób opisany powyzej. Komórki w ostatnim pasazowaniu przemywa sie, iysperguje w trypsynie i odwirowuje postepujac w sposób analogiczny do opisanego powyzej, a nastepnie utrwala, dyspergujac w 1 ml cieczy hodowlanej zawierajacej 15% serum krwi cielecia i 10% dwu- metylosulfotlenku. Otrzymana zawiesine, zamraza¬ na powoli w cieklym amoniaku o temperaturze —70°C, stosuje sie jako szczepionke, z której wy¬ twarza sie wieksza ilosc dawki. Gotowa szczepion¬ ka ma stezenie wynoszace 3,8X10fl komórek wiru* sa/ml i wskaznik wynoszacy 5X10* PFU/ml.Przyklad II. Próbki krwi otrzymuje sie z dwóch indyków w sposób analogiczny do opisa¬ nego w przykladzie I. Krew heparynizowano (20 jednostek/ml) i stosowano do zaszczepieniu 24-go- dzinnej jednowarstwowej hodowli komórek typu DEF, nastepnie postepujac w sposób anp^giczny do opisanego w przykladzie I, z ta róznica, ze ko-76 295 0 10 lejne pasaze przeprowadzono w ogólnej liczbie 7.Zawartosc cieczy hodowlanej typu DEF skladala-sie z (199ao) cieczy w ilosci 40% (porównaj tablice 3), cieczy azotowego (F 10X10) w ilosci 50% (porów¬ naj tablice 3), brzeczki tryptozo-fosforowej (30 g/litr) w ilosci 5%, 2,8% wodnego roztworu dwu¬ weglanu sodu w ilosci 3% i serum krwi cielecia w ilosci 4%. Po siedmiu pasazach, dwie porcje, kazda w ilosci 1 ml szczepionki, utrwala sie, po¬ stepujac w sposób analogiczny do opisanego w przykladzie I, przy czym otrzymuje sie zawiesine o stezeniu komórkowym wynoszacym 6,9X10fl ko¬ mórek/ml i wskazniku wynoszacym 1,5 X105 PFU/ /ml.Przyklad III. Otrzymana w przykladzie II szczepionke wirusa typu AHIV w ilosci 3,3Xl O4 PFU szczepi sie 24-godzinna jednowarstwowa ho¬ dowla komórek typu DEF, pasazuje w szesciu plyt¬ kach o wymiarach 150 mm X 25 mm. Z ciecza ho¬ dowlana w ilosci 25 ml/plytke, postepuje sie w sposób analogiczny do opisanego w przykladzie II.Jeden dzien po zakazeniu ciecz zmienia sie i ho¬ dowle prowadzi sie w ciagu 2 dodatkowych dni. w tym czasie wiecej niz 75% jednowarstwy typu 10 1S 20 DEF wykazywalo efekt cytopato logiczny, a komór¬ ki byly gotowe do'przeszczepu.Przeszczep ten dokonuje sie przez oddzielenie podloza wzrostu, przemywajac komórki zbuforo- wana sola fosforowa (PBS), dodajac 4 ml 0,25% roztworu trypsyny w ciagu 5 minut. Uwolnione komórki umieszcza sie w probówce zawierajacej okolo 10% objetosci serum krwi cielecej. Nastep¬ nie odwirowuje sie w ciagu 5 minut na wirówce o 1000 obrotach na godzine, po czym komórki mie¬ sza sie powtórnie z medium wzrostu, rozdziela z wymienionych szesciu plytek na 48 plytek o wy¬ miarach 150 mm X 25 mm, przy czym plytki za¬ wieraja 24-godzinne monowarstwy typu DEF.Po trzech dniach w cyklu wstepnego wzrostu, kiedy efekt cytopatologiczny jest dobrze zaawan¬ sowany, zbiera sie komórki przez trypsymizacje w sposób opisany powyzej, rozpuszcza sie w medium zawierajacym 10% dwumetylosulfotlenku, zamra¬ za powoli i przechowuje w cieklym azocie. Przy czym otrzymuje sie okolo 100 ampulek o pojem¬ nosci 1 ml, zawierajacych w kazdej ampulce okolo 1X107 ogólnej ilosci komórek i stezeniu wynosza¬ cym 1X10" PFU.Skladnik a-arginina (HCL) «-histydyna (HCL) ^lizyna (HCL) Delta-tryplofan (L) Delta-fenylo- alanina (L) Delta-metionina (L) | Delta-seryna (L) i Delta-treonina (L) Delta-leueyna (L) Delta-izoleucyna (L) Delta-walina (L) Kwas glutaminowy i (a, bezwodny) Kwas asparginowy 1 (L) I Alfa-alanina (L) a-prolina u-hydroksyprolina Glucyna a-glutamina t<-cystyna 1 a-tyrozyna u-cysteina HC1 (No HC1) «-asparugina I NaCl KC1 MgS04-7H,0 Na-,HP KH,P04 CaCl. (2U20)\ NaHCQ, Fe(NOa)3 Dekstroza Pirogionian Sodowy Fenol czerwony Kwas lipoinowy ¦ Tablica 3 Gramów/litr 199 0,070 0.020 0.O70 0,020 0,050 0,030 0,050 0,060 0.120 0.040 0,050 o.ico 0.060 0,050 0,040 0.010 0.050 0,100 0.020 0,040 0,0001 8,0 0,100 0,200 0,090 0.000 0,140 o.3fo 0,0001 1.000 0,020 FIO 0,211 0 021 0,0 .'9 0.0006 0,005 0,004 0.011 0,004 0.013 0,003 0,001 0,015 0,013 0 009 0,012 0,008 0,140 0,002 0,025 0,013 7,4 0.2S5 0.153 0.290 0,080 0,044 1,2 i 1,100 o.uo 0.0012 0,0002 Skladnik FeSO^ • 7H20 CuSO/, • 5H20 ZnSO* • 7H20 Tween 80 ATP Kwas adeny- lowy Dezoksyryboza D-ryboza Octan sodu 3H20 Adenina Guanina Ksantyna Hypoksantyna Uracyl Tymina Tiatnina (HC1) Firydoksyna HC1 Ryboflawina Pirydoksal HC1 Niacyna Nlacynoamid Weglan panto¬ tenowy (D) Inozytol Kwas askor¬ binowy Kwas foliowy Kwas p-amino- benzoesowy Biotyna Menadien Giution Witamina A Kalcyferol Cholesterol Witamina Bj2 Tymidyna Cholina Cl Sól fosforowa Na2-alfa- tokoferon Mg/litr | 199 5,0 1,0 0,200 0,500 0,600 0,050 10,0 0,300 0,300 0,300 0,300 0.300 0.010 0,025 0,010 0,025 0.025 0,025 0,010 0,050 0,050 0,010 0,050 0,010 0,010 0,050 0,100 0,100 0,200 0,500 0,010 no 2,0 0.004 0,051 4,00 1.0 0,206 0,376 0,615 0,715 0,541 1.0 0.024 1 1,0 1,0 0,69876295 11 12 Przyklad IV. Z otrzymanym w przykladzie I produktem postepuje sie w sposób analogiczny do opisanego w przykladzie III. Otrzymana szczepion¬ ke przechowuje sie w MM) ampulkach o pojemnos¬ ci 1 ml, zawierajacych wirus typu AHIV, w ilosci 3,5^lO5 PFU/ml.Przyklad V. Produkt otrzymany w przykla¬ dzie I podaje sie 5-krotnemu pasazowaniu w kul¬ turach CK, otrzymujac szczepionke zawierajaca wirus typu AHIV o stezeniu 6,5X10* PFU/ml.Przyklad VI. Szczepionke otrzymana w przykladzie II, IV i V stosuje sie do szczepienia kurczat jednodniowych do trzytygodniowych, które wczesniej, to jest w wieku od 1 dnia do 5 tygodni byly zakazone wirusem wywolujacym chorobe Ma- reka, lub które zetknely sie z innymi kurczetami zakazonymi tym wirusem. Dawki szczepionki byly rózne od 48 do 3X10* PFU w 0,2 ml, wyniki przed¬ stawiono w tablicy 4.Tablica 5 10 15 Szczepionka poddana dzialaniu ultradzwieków Szybko zamrazana bez dodatku DMSO Nie poddano dzialaniu Czas dzialania szczepionki typa HPRS wstrzyknie¬ tej dobrzasznie 3 tygodnie 3 tygodnie 3 tygpdnie MD 0 0 78 wa hodowle komórek wydzielona korzystnie z tkan¬ ki zdolnej do rozwoju szczepi sie drobnoustrojem Avian Herpeswirusem IV ATCC nr. VR 584 i in- kubuje ja az do zakazenia okolo 75% komórek, po inkubacji z hodowli wydziela sie komórki za pomoca trypsyny i zastepuje je swiezymi jedno- Tablica 4 Stosowanie szczepionki otrzymanej wedlug przykladu nr 1 3 3 3 3 3 3 3 4 4 5 5 5 Nie stosowano Nie stosowano Nie stosowano Nie stosowano Nie stosowano | Nie stosowano Dzialanie Dawka szczepionki PFU 1 X 10* 1 X 10* 480 48 520 690 480 3x 10* 3X 10* 1 X 10* 1 X 10* 1 X 10* 1 X 10* Nie stosowano Nie stosowano Nie stosowano Nie stosowano Nie stosowano Nie stosowano Czas dzialania w dniach 14 21 Czas zetkniecia 'w tygodniach 3 3 3 3 1 dzien 1 dzien 1 dzien 5 5 2 3 4 5 5 1 5 3 3 1 dzien Sposób zakazania Zastrzyk dobrzuszny Kontaktowy Kontaktowy Kontaktowy Kontaktowy Kontaktowy Kontaktowy Zastrzyk dobrzuszny Kontaktowy Zastrzyk dobrzuszny Zastrzyk dobrzuszny Zastrzyk dobrzuszny Zastrzyk dobrzuszny Zastrzyk dobrzuszny Kontaktowe Zastrzyk dobrzuszny Kontaktowe Zastrzyk dobrzuszny % MD 0,0 1 0,0 12,5 42,8 0,0 17,6 55.0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 75,0 88,0 40,0 70,0 100,0 0,0 1 Przyklad VII. Partie szczepionki zawieraja¬ cej 1X106 PFU/ml, wytwarza sie z produktu otrzy¬ manego w przykladzie I i przez 4 dodatkowe pa¬ saze w kulturze CK i trzy pasaze w kulturze CEF.Jedna porcje tej szczepionki poddaje sie dzialaniu ultradzwieków w urzadzeniu typu Bronwill Bioso- nik stosujac sonde pod cisnieniem, o natezeniu dzwieku 70 na 20 sekund. Nie uszkodzone komór¬ ki lub jadra sa wyraznie widoczne w badaniu w homocytometrze. Druga porcje szczepionki zamra¬ za sie szybko w temperaturze —70°C bez dodatku dwumetylosulfotlenku (DMSO). W celu uodpornie¬ nia 1-dniowych kurczat stosuje sie 0,2 ml zastrzyki dobrzuszne poddawanej dzialaniu ultradzwieków i szybko zamrazanej szczepionki, przy czym kazda ze szczepionek zawierala 500 PFU/0,2 ml. Otrzy¬ mane wyniki przedstawiono w tablicy 5. PL PL PL PL