DE2440927C3

DE2440927C3 - Injizierbarer inaktivierter Impfstoff gegen Hepatitis B

Info

Publication number: DE2440927C3
Application number: DE2440927A
Authority: DE
Inventors: Tsunekazu Kobe Fukushima; Satoshi Katano Funakoshi; Toshihiko Kyoto Tanaka
Original assignee: Green Cross Corp Japan
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1973-12-28
Filing date: 1974-08-27
Publication date: 1978-12-07
Also published as: CH611338A5; FR2256247B1; JPS5523253B2; CA1023663A; GB1442564A; DE2440927A1; JPS5095420A; DE2440927B2; FR2256247A1

Description

2. Verfahren zur Herstellung eines injizierbaren inaktivierten Impfstoffes gegen Hepatitis B nach Anspruch 1 durch Erhitzen einer wäßrigen Lösung von Hepatitis-B-Antigen enthaltendem humanen Plasmaprotein auf Temperaturen von 60 bis 120° C, dadurch gekennzeichnet, daß das Erhitzen der Lösung in Gegenwart von 5 bis 20% (Gew./Vol.) eines Monosaccharids, Disaccharids, Zuckeralkohols oder eines Gemisches dieser Verbindungen als Stabilisator in einem pH-Bereich von 5 bis 9 durchgeführt und anschließend der Stabilisator entfernt wird.

Es wird angenommen, daß HB-Ag (Hepatitis-B-Antigen) ein Virus oder ein virusähnliches Gebilde ist, das beim Menschen Serumhepatitis hervorruft. Plasma-HB-Ag gehört elektrophoretisch zu den x- oder r, jS-GlobuIinen und ist bei einer Plasmafraktionierung nach üblichen Verfahren in den meisten Fraktionen verteilt.

Um die Infektiosität von HB-Ag zu beseitigen, wird HB-Ag enthaltendes humanes Plasmaprotein einer κι Hitzebehandlung unterworfen. Im allgemeinen wird ein Plasmaalbuminpräparat 10 Stunden auf 60°C erhitzt. Bei der Verabreichung derartiger Präparate läßt sich jedoch die Bildung von HB-Ak (Hepatitis-B-Antikörper) im Blut nicht beobachten. Offenbar bleibt auch die π Antigenität nicht intakt. Da Gewebekulturen von HB-Ag bisher nicht erfolgreich durchgeführt werden konnten, stand kein Verfahren zur Herstellung von konzentrierten Impfstoffen gegen Virushepatitis B zur

Verfügung.

In der US-PS 37 35 004 ist die Herstellung eines inaktivierten Impfstoffs gegen Virushepatitis B durch 1 bis 3minütiges Erhitzen auf höchstens 98° C eines verdünnten Serums beschrieben, das an Virushepatitis B erkrankten Patienten entnommen worden war. Durch intramuskuläre Verabfolgung dieses Impfstoffs soll das Auftreten von Virushepatitis B verhindert und bei bereits hervorgerufener Hepatitis der Kxankheitsverlauf gemildert werden. Im allgemeinen wird jedoch auch die Antigenität bei der Hitzeinaktivierung herabgesetzt Zur besseren Prophylaxe und Therapie von Virushepatitis B besteht daher ein Bedarf an einem inaktivierten HB-Ag-Impfstoff mit hoher Antigenität und geringer oder fehlender Infektiosität, der Menschen in großen Dosen verabfolgt werden kann.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, einen durch Erhitzen einer wäßrigen Lösung von HB-Ag enthaltendem humanem Plasmaprotein erhaltenen inaktivierten HB-Ag-Impfstoff mit hoher Antigenität zu schaffen; der zur Prophylaxe und Therapie von Virushepatitis B beim Menschen eingesetzt werden kann. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem überraschenden Befund, daß beim Erhitzen der wäßrigen Lösung des Plasmaproteins in Gegenwart eines Monosaccharids, wie Glucose, eines Disaccharids, wie Saccharose, oder eines Zuckeralkohols, wie Mannit, oder eines Gemisches dieser Verbindungen, die Antigenität dieser Lösung stabilisiert werden kann.

Die Erfindung betrifft somit den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Der Impfstoff der Erfindung kann intramuskulär, subcutan oder intracutan gegeben werden.

Eine wäßrige Lösung (pH-Wert 5) mit einem Gehalt an humanem Plasmaprotein von I Prozent (Gewicht/ Volumen) aus einem an Virushepatitis B erkrankten Spender und einem HB-Ag-Titer von 1 :8, gemessen durch gekreuzte Immunelektrophorese (im folgenden als IES-Verfahren bezeichnet; vgl. Shojiro N a k a m u r a, Electrophoretic Experimental Methods, S. 287, verlegt bei Bunko-do, 1963) wird durch Lösen von /x- und /3-Globulinfraktionen von humanem Plasma in destilliertem Wasser hergestellt. Ferner wird eine entsprechende Lösung hergestellt, die zusätzlich 20% (Gewicht/Volumen) Mannit enthält. Teile dieser Lösungen werden auf Temperaturen von 60 bis 120° C erhitzt. Die Abhängigkeit des HB-Ag-Titers von der Erhitzungsdauer ist in Tabelle I angegeben.

Tabelle I

Temperatur

HB-Ag-Titer
vor dem
Erhitzen 1

Minuten

10

Stunden
1 3

10 24 48

Wäßrige
Lösung

60	8x
70	8x
80	8x
90	8x
100	8x
120	lix

8x

4x 4x

4x

8x

4x 4x 4x 4x

8x i

4x 4x I 2x

8Ix 4x 2x 2x

8x j 4x 2x 1 χ

2x 1 χ

4x i 1x -

I χ 0

Fortsetzung

Temperatur

HB-Ag-Titer vor dem Erhitzen

Minuten I 3	—	10	30	Stunden 1 3	8x	6	10	24 48
—	8x 8x	—	—	8x	8x\| 4x	8x	ix	4x 4x
8x	8x	8x 8x	8x 8x	8x 8x	4x I	4x 4x	4x 4x	2x - 2x -
8x	8x	8x	8x	4x	2x	2x	2x	0 -
8x	8x \	8x	8x	4x	Ix	Ix	Ix	0 -
8x	4x	4x	2x	Ix	0	0 -

Mit Mannit 60 8 χ

versetzte

Lösung 70 8 χ

80 8 χ

90 8x

100 8x

120 8 χ

Die zu untersuchenden Lösungen wurden nacheinander jeweils auf das doppelte Volumen verdünnt Als Maß für den HB-Ag-Titer wird die maximale Verdünnung der Lösung angegeben, bei der sich HB-Ag mit dem I ES-Verfahren noch nachweisen läßt

»—« bedeutet, daß keine Messung durchgeführt wurde. Die strichpunktierte Linie gibt die Grenze für die Erhitzungszeiten an, innerhalb derer der HB-Ag-Titer kleiner wird als vor dem Erhitzen. Die gestrichelte Linie gibt die Grenze für die Erhitzungszeiten an, bei der der HB-Ag-Titer um die Hälfte bis ein Viertel kleiner wird als vor dem Erhitzen.

Aus Tabelle 1 geht hervor, daß Mannit eine starke Stabilisierung der Antigenität von HB-Ag hervorruft. Im Falle der wäßrigen Lösung ohne Mannitzusatz bleibt der vor dem Erhitzen bestehende HB-Ag-Titer nur bei relativ niedrigen Temperaturen im Bereich von 60 bis 80° C erhalten. Selbst bei diesen niedrigen Temperaturen dürfen die Erhitzungszeiten nur relativ kurz sein, so daß sie als nicht ausreichend zur Beseitigung der Infektiosität anzusehen sind. Beispielsweise beträgt beim Erhitzen der Lösung auf 60° C die maximal mögliche Erhitzungszeit, bei der der vor dem Erhitzen vorhandene HB-Ag-Titer erhalten bleibt, 3 Stunden; sie ist somit wesentlich kurzer als die bisher zur Beseitigung der Infektiosität notwendige Erhitzungsdauer von 10 Stunden. Durch den erfindungsgemäßen Mannitzusatz können nicht nur die Erhitzungszeiten über den ganzen in Tabelle I angegebenen Temperaturbereich unter Beibehaltung des H3-Ag-Titers ausgedehnt werden, sondern es können auch die maximalen Erhitzungszeiten so verlängert werden, wie sie zur Beseitigung der Infektiosität notwendig sind, d. h. man kann beispielsweise 10 Stunden auf 60°C bzw. 3 Minuten auf 100°C erhitzen.

Nimmt man im erfindungsgemäßen Verfahren durch die Hitzebehandlung einen Verlust der Antigenität um die Hälfte in Kauf, so läßt sich eine weiter verlängerte Hitzebehandlung durchführen, um eine eventuell noch vorhandene Infektiosität möglichst vollständig zu beseitigen. Die Tatsache, daß nach dem erfindungsgemäßen Verfahren die Hitzebehandlung 48 Stunden bei 60°C oder I Stunde bei 100⁰C durchgeführt werden kann, bedeutet, daß der dadurch hergestellte HB-Ag-Impfstoff in seinem HB-Ag-Titer mit herkömmlich inaktiviertem HB-Ag-Impfstoff vergleichbar ist, jedoch eine geringere Infektiosität als dieser aufweist.

Die Stabilisierung der antigenen Wirkung von HB-Ag läßt sich erfindungsgemäß nicht nur durch Mannit erreichen, sondern auch durch Zuckeralkohole, wie Sorbit und Xylit, Monosaccharide, wie Glucose, Mannose, Galactose und Fructose, und Disaccharide, wie Saccharose, Maltose und Lactose, sowie durch Gemische der vorgenannten Verbindungen. Diese Stabilisatoren werden in Konzentrationen von mindestens 5% (Gewicht/Volumen) vorzugsweise 15 bis 20%, verwendet.

Im erfindungsgemäßen Verfahren können nicht nur HB-Ag enthaltende humane Plasmaproteine verwendet

jo werden, die beim Menschen Virushepatitis B verursachen, sondern auch alle anderen Proteine, in denen sich HB-Ag nach dem IES-Verfahren oder radioimmunologisch (im folgenden als RIA-Verfahren bezeichnet; vgl. Shigeshi Toyoshima et al., »Pediatric Clinic«,

J₅ [Japan], Bd. 24 [1971J S. 3044) nachweisen läßt. Es können also Plasma, Serum und verschiedene durch übliche Verfahren zur Plasmafraktionierung erhaltene Proteinfraktionen von an Virushepatitis B erkrankten Spendern verwendet werden.

Wie elektronenmikroskopisch festgestellt wurde, ist HB-Ag von unterschiedlicher Gestalt und Größe. Ebenso hängt auch die Infektiosität spezifisch von der jeweiligen HB-Ag enthaltenden Plasmaproteinfraktion ab. Beispielsweise weist eine Fibrinogenfraktion trotz ihres geringen HB-Ag-Gehalts, gemessen nach dem RIA-Verfahren, eine deutlich höhere Hepatitis-B-Infektiosität auf als andere Plasmaproteinfraktionen. Dies ist vermutlich der Tatsache zuzuschreiben, daß die Fibrinogenfraktion stark infektiöse Teilchen enthält.

so Die HB-Ag-Menge in einem Albuminpräparat ist, gemessen nach dem RIA-Verfahren, zumindest äquivalent der in der Fibrinogenfraktion enthaltenen Menge, jedoch ist ihre Infektiosität so gering, daß sie kaum Virushepatitis B verursacht, wenn das Präparat 10 Stunden auf 60° C erhitzt wird. Andererseits ist der HB-Ag-Gehalt von oc- und /3-Globulinfraktionen höher als der der Albuminfraktion. Demgemäß ist die in aus diesen Fraktionen fraktionierten Transferrin- und Haptoglobinpräparaten festgestellte HB-Ag-Menge

bo größer als im Albuminpräparat. Diese Transferring- und Haptoglobinpräparate verursachen jedoch beim Mischen keine Virushepatitis B, wenn sie nach einer unter den gleichen Bedingungen wie beim Albuminpräparat durchgeführten Hitzebehandlung verabfolgt werden. Es

hi ist daher anzunehmen, daß das in den α- und 0-Globulinfraktionen enthaltene HB-Ag nur eine geringe Infektiosität aufweist.

Als Ausgangsmaterialien werden im erfindungsgemä-

Ben Verfahren humane «- und /J-Globulinfraktionen, die große Mengen an HB-Ag enthalten und eine geringe Infektiosität aufweisen, besonders bevorzugt. Diese Fraktionen werden zweckmäßigerweise als Unterfraktionen bei der Gewinnung anderer wertvoller Plasmaproteinfraktionen erhalten. Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Plasmaproteinfraktionen werden nach herkömmlichen Verfahren zur Fraktionierung von Plasmaprotein gewonnen, beispielsweise durch Fällung mit Ammoniumsulfat oder durch Fällung mit Äthanol bei niedrigen Temperaturen nach C ο h η ; vgl. EJ. Cohn, LE. Strong, W.L Hughes, D.J. Mulford, J.N. Ashworth, M. Melin und H.L Taylor, Jornal of the American Chemical Society, Bd. 68 (1946), S. 459. Beispielsweise werden die α- und /J-Blobulinfraktionen als Fraktionen IV und IV-I gemäß der Cohnschen Fraktionierung oder als Niederschläge bei der Fällung mit Ammoniumsulfat bei 35- bis 50prozentiger Sättigung erhalten. Fa'ls die wäßrigen Lösungen der Proteinfraktionen trübe sind, können sie zur Erleichterung der weiteren Verarbeitung geklärt werden. Die Klärung wird beispielsweise durch Zentrifugieren oder durch Erhitzen der Lösung auf etwa 60⁰C bei neutralem pH-Wert und anschließendes Abfiltrieren der entstandenen Niederschläge durchgeführt.

Beispiele für wäßrige Medien, in denen das erfindungsgemäße Erhitzen des HB-Ag enthaltenden Ausgangsmaterials in Gegenwart des Stabilisators durchgeführt werden kann, sind Wasser und physiologisch verträgliche Salzlösungen. Die zu erhitzende Lösung weist vorzugsweise einen im wesentlichen neutralen pH-Wert auf und wird in einem pH-Bereich von 5 bis 9, vorzugsweise 6,5 bis 7,5 gehalten. Zur Aufrechterhaltung des pH-Werts wird vorzugsweise ein Puffer verwendet. Als Puffersubstanzen eignen sich anorganische Salze, wie Phosphate und Carbonate, oder organische Salze, wie Acetate, Trisaminomethan-hydrochlorid und Glykokoll-hydrochlorid.

Die Erhitzungstemperatur liegt im Bereich von 60 bis 120⁰C. Die Erhitzungszeit hängt von der Erhitzungstemperatur ab. In jedem Fall wird die Erhitzungszeit so gewählt, daß sie ausreicht, die Infektiosität ohne Verlust der Antigenität, wiedergegeben durch den HB-Ag-Titer, zu beseitigen. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich die bisher zur Hitzebehandlung von Albuminfraktionen und cn- und j3-Globulinfraktionen üblichen Hkzebehandlungen von 10 Stunden bei 60⁰C bzw. 3 Minuten bei 100° C auf 40 Stunden bzw. 1 Stunde ausdehnen. Ebenso lassen sich die Erhitzungszeiten bei anderen Temperaturen verlängern. Wenn von den verschiedenen verlängerten Erhitzungszeiten bei verschiedenen Temperaturen eine relativ kurze Zeit ausgewählt wird, bei der die Infektiosität, aber nicht die Antigenität beseitigt wird, läßt sich ein HB-Ag-Impfstoff erhalten, der gegenüber einem herkömmlichen Präparat eine geringere oder höchstens gleich große Infektiosität aufweist. Die Antigenität des erfindungsgemäß hergestellten HB-Ag-Impfstoffs, ausgedrückt durch den HB-Ag-Titer, entspricht der vor dem Erhitzen vorhandenen Wirkung. Werden andererseits unter den erfindungsgemäßen Bedingungen relativ lange Erhitzungszeiten ausgewählt, läßt sich inaktivierter HB-Ag-Impfstoff erhalten, dessen Antigenität zwar abgenommen hat, dessen Infektiosität aber wesentlich gesenkt oder vollkommen beseitigt ist. Durch Einengen des inaktivierten HB-Ag-Impfstoffs erhält man einen konzentrierten HB-Ag-Impfstoff, der in großen Dosen verabfolgt werden kann.

Nach der Hitzebehandlung wird die Lösung gegebenenfalls durch Filtrieren geklärt und anschließend gegen eine isotonische Lösung, wie isotonische Kochsalzlös sung, zur Entfernung von Stabilisator, Puffersalz und entstandenen niedermolekularen Substanzen dialysiert Durch Dialyse unter vermindertem Druck nach einem üblichen Verfahren läßt sich die Lösung gleichzeitig mit der Entfernung der vorgenannten Substanzen einengen, ίο Die so erhaltene Impfstoffiösung wird auf eine geeignete Konzentration eingestellt und anschließend der Sterilfiltration unterworfen.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Die HB-Ag-Titer sind nach dem I ES-Verfahren bestimmt.

Beispiel 1

Aus 1000 ml Sammelplasma (HB-Ag-Titer 1 :8), das aus 28 einzelnen Plasmaproben mit HB-Ag-Titern von 1 :4 bis 1 :32 besteht, werden die Fraktionen IV-I und IV-4 nach dem Cohnschen Verfahren durch Fällung mit Äthanol bei niedrigen Temperaturen gewonnen. Das Gemisch wird bei 4° C in destilliertem Wasser suspendiert Die erhaltene Suspension wird dialysiert und von unlöslichen Bestandteilen befreit. Man erhält 20OmI einer wäßrigen Lösung, die 1 Stunde auf 60° C erhitzt, vom entstandenen Niederschlag befreit und sodann gegen Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,6 dialysiert wird. Man erhält 180 ml Lösung. Diese Lösung wird bis zu einer Konzsntration von 20 Prozent

so (Gewicht/Volumen) mit Mannit versetzt und 1 Stunde in einem verschlossenen Gefäß auf 105° C erhitzt, um Niederschläge abzuscheiden. Anschließend wird die Lösung von den Niederschlägen abzentrifugiert und sodann unter vermindertem Druck gegen eine isotonisehe Kochsalzlösung dialysiert, wobei Mannit entfernt und gleichzeitig die Lösung eingeengt wird. Man erhält 30 ml einer Lösung mit einem HB-Ag-Titer von 1 :128. Diese Lösung ergibt nach Sterilfiltration 25 ml einer injizierbaren Lösung.

Beispiel 2

100 ml Sammelplasma aus 12 einzelnen Plasmaproben mit einem HB-Ag-Titer von 1 :4 werden in 100 ml destilliertem Wasser suspendiert. Die erhaltene Suspension wird durch Zugabe vonl n-HCl bzw. 1 n-NaOH auf den pH-Wert 7,0 eingestellt. Anschließend wird zur Ausfällung von Fibrinogen und y-Globulin Ammoniumsulfat bis zum Erreichen von 35 Prozent der Sättigungskonzentration zugesetzt. Nach dem Abzentrifugieren der entstandenen Niederschläge wird die Ammoniumsulfatkonzentration auf 50% der Sättigungskonzentration angehoben, und die entstandenen Niederschläge werden abzentrifugiert. Sodann werden die Niederschläge in 0,06-m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,2 gelöst und 24 Stunden gegen den gleichen Puffer dialysiert Man erhält 20 ml Lösung. Diese Lösung wird bis zu einer Konzentration von 20 Prozent (GewyVol.) mit Saccharose versetzt und anschließend 10 Minuten auf 120⁰C erhitzt. Der dabei entstandene Niederschlag wird anschließend abzentrifugiert. Der erhaltene Überstand wird 24 Stunden gegen einen 0,06-m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,2, der 0,14 m an Natriumchlorid ist, dialysiert. Nach Sterilfiltration erhält man 2 ml einer injizierbaren Lösung.

Beispiel 3

Aus Sammelplasma mit einem HB-Ag-Titer von 1 :8 wird gemäß dem Cohnschen Verfahren durch Fällung

mil Äthanol bei niedriger. Temperaturen die Fraktion IV-I gewonnen. 10 Liier einer wäßrigen Suspension dieser Fraktion werden 48 Stuiulen gegen Wasser dialysiert und anschließend zur Entfernung der entstandenen Niederschläge zentrifugiert. Der Überstand wird 2 Stunden auf 60" C erhitzt. Die dabei entstandenen Niederschlage werden abzentrifugiert. Die erhaltene Lösung wird bis zu einer Konzentration von 0,05-m mit dibasischem Nr.riumphosphai (Na₂HPO₄ · 12 H₂O) und anschließend mil monobasischem Kaliumphosphat (KH₂PO₄ ■ 2 H₂O) bis zu einem pH-Wert von 7,2 "ersetzt. Die erhaltene, gepufferte Lösung wird bis zu einer Konzeniration von 20 Prozent (Gewicht/Volumen) Glucose versetzt, 10 Stunden auf 80⁰C erhitzt und anschließend gegen einen ü.06-m Phosphatpuffer, der 0.14-m an Natriumchlorid ist und einen pH-Wert von 7,2 aufweist, dialysiert. Man erhält 40 ml einer klaren Lösung. Diese Lösung ergibt nach Sterilfiltration eine injizierbare Lösung mit einem HB-Ag-Titer von 1 : 512.

Beispiel 4

Beispiel 3 wird wiederholt, mit der Abänderung, daß die Phosphatpufferlösung anstelle von Glucose mit 15 Prozent (Gewicht/Volumen) Xylit. Lactose bzw. Mannose versetzt wird. Man erhall Lösungen mit einen IIB-Ag-Ticr von 1 : 128, 1 : 128 bzw. 1 : 256.

Beispiel 5

Eine wäßrige Lösung (pH-Wert 5) mit einem Gehal an humanem Plasmaprotein von 1 Prozent (Gew./Vol. und einem HB-Ag-I iter von 1 :8, gemessen durcl gekrcu/ic Immunelektrophorese, wird mit Mannit ir solcher Menge versetzt, daß die erhaltene Lösung i Prozent bzw. 10 Prozent (Gcw./Vol.) Mannit enthält Teile dieser Lösungen werden auf Temperaturen von b( bis 12U"C erhitzt. Die Abhängigkeit des HB-Ag-Titen von der Erhitzungsdauer ist in Tabelle II angegeben.

» —« bedeutet, daß keine Messung durchgeführ wurde. Die strichpunktierte Linie gibt die Grenze für die Erhitzungszeiten an, innerhalb derer der HB-Ag-Titei kleiner wird als vordem Erhitzen. Die gestrichelte Linie gibt die Grenze für die Erhitzungszeiten an, bei der dei HB-Ag-Titcr um die Hälfte bis ein Viertel kleiner wire als vordem Erhitzen.

Aus Tabelle Il geht hervor, daß auch bei einei Mannitkonzentration von 5 bis 10% eine starke Stabilisierung des Anligcn-Präparats erreicht wird.

Tabelle II	Tempe ratur CC)	HB-Ag-Titer vor dem Erhitzen	Minuten 1	3	10	30	Stunden 1	3	6	10	24 48
	60 70 80	XXX 00 OO OO	8x	X X I oo co	8x 4x	X XiX 00 00 j Tf	X XiX oo oo ; Tf	8x 4x 2x	8x 4x 2x	X i X X Tf (N CN	4 χ 4x 2x - Ix Ix
5% Mannit konzen tration	90	8x	8x	8x	4x	4x	2x	2x	2x	1 χ	- -
	100	8x	8x ;	4x	4x	2 χ	2x	1 χ	1 χ	0	- -
	120	8x	4x	4x	2x	2x	2x	1 χ	0	0	- -
	60 70 80	XXX OO 00 OO	8x	8x 8x	8x 8x	8x 8x 4x	8x 8x i 4x	8x 4x 2x	8 χ 4x 2x	4x	4x 4x
10% Mannit- konzen- tration	90	8x	8x	8x	4x	4x	4x	2x	1 χ	2x Ix	2x - 1 χ -
	100	8x	8x	8x	4x	4x	i 2x	1 χ	1 χ	1 χ	- -
	120	8x	8x !	4x	4x	: 2x	1 χ	Ix	0	0	- -
										0	— —

Die Wirkung des Impfstoffs wird durch folgenden klinischen Versuch erläutert.

Versuch 1

Jeweils 0,1 ml eines gemäß Beispiel 3 hergestellten Hepatitis-B-Impfstoffes mit einem HB-Ag-Titer von 1 :64. bestimmt nach der Methode der gekreuzten Immunelektrophorese (lES-Verfahren), werden subeutan sechs männlichen freiwilligen Probanden (25 bis 60 lahre all: Krankenhauspersonal einer Plasmafraktionier- und -Sammelabteilung) mit HB-Ag und HB-Ab negativem Serum injiziert. Der HB-Ag-Titer wird durcl den Radioimmuntest, der HB-Ab-Titer durch dei passiven Hämagglutinationstest bestimmt. 30 Tage nacl der Impfung werden von jedem Probanden Serumpro ben entnommen. Bei allen sechs Probanden ist da Serum HB-Ag negativ. Die HB-Ab im Serum sind ii einem Fall negativ und in den fünf anderen Fällei positiv. Der Titer beim passiven Hämagglutinationstes beträgt 1 :4096, 1 :1024, 1 :1024, 1 :512 und 1 :32. Di SGOT- und SGPT-Werte sind für sämtliche Probandei normal.

Versuch 2

Jeweils 0,1 ml des in Versuch ! verwendeten Hepatitis-B-Impfstoffes werden subcutan 12 männlichen Patienten (30 bis bO Jahre alt- Krankenhauspersonai einer Plasmafraktionierabteilung), die sich an einer Wunde mit Plasma konlaminiert haben, injiziert. Innerhalb 24 Stunden nach der Konlamination sind die Patienten HB-Ag und HB-Ab negativ. 30 Tage nach der Impfung werden von den Paiienien Serumproben entnommen. Keiner der Patienten ist HB-Ag positiv. 10 Patienten waren HB-Ab positiv und 2 Patienten HB-Ab negativ. Während eines Jahres nach der Kontamination wurde keine anormale Leberfunktion festgestellt. Bei 7 Patienten, die zur Zeit der Kontamination HB-Ab positiv waren, wurde bei einem Patienten, dessen Titer im passiven Hämagglutinationstest 1 :8 betrug, ein SGOT-Wert von 250 und ein SGPT-Wert von 120 gefunden. Diese Werte liegen höher als die Normalwerte. Bei den 6 andern Patienten, deren Titer im passiven Hämagglutinationstest zwischen 1 :8und 1 : 2048 lagen, wurden keine anormalen Werte gefunden.

Versuch 3
Von 5 Patienten gemäß Versuch 2, die zur Zeit der Kontamination der Wunde HB-Ag und HH-Ab negativ waren und die nicht geimpft wurden, zeigten 3 Patienten über einen Zeitiaum von b Monaten keine anormale I eberfunktion. Von diesen 3 Paiienien war ein Patient am 30. Tag HB-Ab positiv, ein anderer Patient wurde HB-Ag positiv, wahrend der dritte Patient HB-Ag und HB-Ab negativ war. Bei den anderen beiden Patienten wurde in einem KaII, der HB-Ag positiv wurde, eine Hepatitis diagnostiziert, während im anderen Fall ein Verdacht auf Hepatitis bestand, da der SGOT- und SGPT-Wert 500 b/.w. 280 betrug und der HB-Ag positiv war. Die SGOT- und SG PT-Werte fielen allmählich ab, doch war dieser Patient noch im b. Monat 1 IB-Ag positiv.

Die SGOT- und SGPT-Werte wtirden nach A. Karmenu. Mitarb., J. C I i n. Invest..., Bd. 34 (1955), S. 126 und Proc. Soc. Exp. Biol. Med., Bd. 91 (1956), S. 19b bestimmt.

Aus den Ergebnissen ergibt sich folgendes Bild:

Bei den geimpften Versuchspersonen wurde kein \ IB-Ag-Träger gefunden;

nach der impfung wurde ein relativ hoher Prozentsatz der Personen HB-Ab positiv.

Bei den HB-Ab positiven Personen war das Risiko des Auftretens einer Hepatitis signifikant geringer.

Claims

Patentansprüche:

1. Durch Erhitzen einer wäßrigen Lösung von Hepatitis-B-Antigen enthaltendem humanen Plasmaprotein auf Temperaturen von 60 bis 120° C hergestellter injizierbarer inaktivierter Impfstoff gegen Hepatitis B, dadurch gekennzeichnet, daß er durch Erhitzen der Lösung in Gegenwart von 5 bis 20% (Gew/Vol.) eines Monosaccharids, Disaccharids, Zuckeralkohols oder eines Gemisches dieser Verbindungen als Stabilisatoren in einem pH-Bereich von 5 bis 9 und anschließendes Entfernen des Stabilisators hergestellt worden ist.