DE2049515C3 - Impfstoff gegen Vinishepatitis und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents

Description

a) einer Dichtegradientenzentrifugation in einer Cäsiumchloridlösung unterwirft, oder

b) enzymatisch abbaut, oder

c) zentrifugiert, dann enzymatisch abbaut, einer ²^ Säulengelfiltration unterwirft, in einer Saccharoselösung dichtegradientenzentrifugicrt, dialysiert, in Cäsiumchloridlösung einer Dichtegradientenzentrifugation unterzieht sowie erneut dialysiert, oder

d) enzymatisch abbaut, dann in einer Saccharoselösung dichtegradienten^entrifugiert, in Cäsiumchloridlnsung einer Dichtegradientenzentrifugation unterwirft und die jeweils erhaltenen Produkte mit einem physiologisch akzeptablen ^!) Trägerstoff versetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die jeweils erhaltenen Produkte abschwächt oder alteriert.

Australia-Antigen, das allgemein mit A<} bezeichnet wird, wurde erstmals im Serum eines australischen Eingeborenen entdeckt (Bull. N. Y. Acad. Med. 40, 377 (1964). Seine geographische Verbreitung ist groß, da es im Blut eines Großteils der Bevölkerung der Pazifischen Inseln, Südostasiens, Indiens und zahlreicher anderer tropischer Gebiete vorkommt. Es ist auch im Blut vieler in Anstalten befindlicher Mongoloider (Down's Syndrom) vorhanden. Au ist ferner im Blut von Patienten enthalten, die an Virushepatitis leiden. Die geographische Verteilung, die Vergesellschaftung mit Krankheiten, die Genetik und physikalische und chemische Eigenschaften von Au sind in Bull. N. Y. Acad. Med. 44, 1566 (1968) zusammengestellt. Das Vorkommen von Australia-Antigen bei akuter und chromiseher Hepatits wird auch in Ann. Int. Med. 66, 924 (1967); J. Am. Med. Assoc. 205, 670(1968); Am. J. Digest, Des. 14,189 (1969); J. Am. Med. Assoc. 207, 1895 (1969) und Ann. Int. Med. 70, 55 (1969) beschrieben. Erste Untersuchungen haben das Vorliegen von Teilchen mit einer Größe von 180 bis 210 Angström ergeben, die im Serum von Patienten mit Virushepatitis spezifisch agglutinieren (Nature 218,1057 [1968]). Die Anfärbbarkeit intranuklearer Granula in Leberzellen von Hepatitispatienten durch die gleichen mit Fluorescein gekuppelten Antiseren zeigt, daß diese Zellen ein gemeinsames Antigen mit Serumteilchen enthalten (Nature 222,181 [1969])

Das Virus, das Hepatitis verursacht, weist einige der ungewöhnlichen Eigenschaften auf, die auch Australic-Antigen zeigt Zum Beispiel haben beide einen Durchmesser von weniger als 260 Angstrom, beide überstehen 30 Minuten bei 56 Grad und beide halten ein Einfrieren bei —10 bis —20 Grad C für wenigstens ein Jahr aus (Kissling, »Transmission of Virus by the Water Route. Inter-science Publishers, John Wyley & Sons, 1965, 337). Der Erreger muß im Blut von befallenen Individuen in hoher Konzentration vorliegen oder hohe Infektivität haben, da kleine Mengen dieses Bluts bei Übertragung durch Nadelpunktur eine Infektion verursachen können. Das gleiche gilt für Australia-Antigen.

In Nature, 218, Seite 1057-1059 (1968), wird bereits ein Verfahren zur Grobreinigung von Australia-Antigen durch Dichtegradientenzentrifugation in beispielsweise 10 bis 30°/oiger Saccharoselösung beschrieben. Gegebenenfalls erfolgt hiernach eine weitere Aufarbeitung des dabei erhaltenen Produktes durch Dialyse gegen Wasser oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Zur groben Ermittlung seines Molekulargewichtes wird Australia-Antigen hierbei auch einer Gelfiltration unterzogen. Alle diese Maßnahmen dieneil jedoch in erster Linie der analytischen Untersuchung von Australia-Antigen-Proben. Sie sind zur Herstellung eines Impfstoffes, an den naturgemäß extreme Reinheitsforderungen gestellt werden müssen, als solche daher nicht geeignet. Das hiernach jeweils erhaltene Serum kann nämlich immer noch gefährliche infektiöse Stoffe einschließlich von Proteinen als Verinreinigungen enthalten, die durch Absorption entweder am Virus oder an der Schale des Virus haften. Hierdurch können gewisse Patienten so stark sensibilisiert werden, daß es zu einem anaphylaktischen Schock oder einer Seruinhepatitis kommen kann.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, durch geeignete Mittel zu einem Australia-Antigen-Produkt zu gelangen, welches höchstrein ist und somit ohne Gefährdung der Gesundheit als Impfstoff verwendet werden kann, und diese Aufgabe wird nun erfindungsgemäß in der aus den Ansprüchen hervorgehenden Weise gelöst.

Das erfindungsgemäß benötigte Australia-Antigen kommt zwar im Blut von einigen nicht-menschlichen Primaten vor, es wird jedoch am besten aus dem Blut eines Menschen gewonnen, in dem es vorkommt. Hierbei soll man sich jedoch nicht eines Patienten bedienen, der an aktiver Hepatitis leidet, sondern einen Patienten verwenden, der in seinem Blut Australia-Antigen enthält, es aber ohne ernste infektiöse Symptome verträgt. Ein großer Teil der Bevölkerung in tropischen Ländern und viele Personen, die an Down's Syndrom leiden, gehören zu dieser Klasse.

Als Quelle für Australia-Antigen statt Vollblut wird für das erfindungsgemäße Verfahren vorzugsweise Plasma verwendet, das man vom Vollblut durch Plasmapherese oder andere Methoden abtrennen kann.

Im einzelnen wird das vorliegende Verfahren beispielsweise wie folgt durchgeführt.

Sedimentation

Das durch Plasmaphoresc erhaltene Serum wird in einer Ultrazentrifuge hohen Zentrifugalkräften ausgesetzt. Zu diesem Zweck klärt man 100 ml Plasma durch einstündiges Zentrifugieren mit 2000 g in einer gekühl-

ten Zentrifuge (Sorvall-Zentrifuge), und dann wird erneut 18 Stunden mit 370 000 g in einer Winkelrotorultrazentrifuge (Spinco 65 Ti-Winkelrotorultrazentrifuge) zentrifugiert Nur das Sediment am Boden des Rohrs enthält Au(I). Die überstehende Flüssigkeit wird dekantiert, und das Sediment wird mit 10 ml einer 0,85%igen (Gewicht/Volumen) Lösung von Natriumchlorid in Wasser suspendiert.

Enzymatischer Abbau

10 ml der oben beschriebenen Au(l)-£uspension in einer 30 ml Stopfenflasche werden mit 400 Mikroliter Amylase mit einer Gewichtskonzentration von 10 mg/ml, 400 Mikroliter Lipase mit einer Gewichtskonzentration von 1 mg/ml und 200 Mikroliter Neuraminidase mit einer Gewichtskonzentration von 1 mg/ml versetzt Diese Mischung wird unter gelinder Bewegung la Minuten lang bei 37 Grad C inkubiert, und dann werden 100 Mikroliter Phospholipase C mit einer Gewichtskonzentration von 1 mg/ml zugesetzt. Das Inkubieren und Bewegen wird 20 Minuten fortgesetzt. Während dieser Zeit wird beobachtet, daß die Mischung geliert. Das Gel wird mit 2 ml Pronase mit einer Gewichtskonzentration von 10 mg/ml versetzt, und die Mischung wird 1 Stunde inkubiert und bewegt. Nach Ablauf dieser Zeit hat sich das Gel vollständig gelöst und werden weitere 2 ml Pronase uer gleichen Konzentration zugesetzt Das Inkubieren und Bewegen werden eine weitere Stunde fortgesetzt, und dann wird die Mischung in einem Eisbad gekühlt.

Diese besondere Arbeitsweise wird zwar bevorzugt, es können aber verschiedene Enzyme für diese Arbeitsweise verwendet werden. Zu den geeigneten Enzymen gehören beispielsweise Trypsin, Pronase, Lipase, Phospholipase, Ribonuclease, Desoxyribonuclease, Amylase, Neuraminidase, Weizenkeimlipase und alpha-Amylase. Gewünschtenfalls können auch andere Enzyme eingesetzt werden.

Gelfiltration

Mit aliquoten Proben der oben beschriebenen mit Enzym behandelten Suspension von 5 ml wird eine Gelfiltration durch eine Säule durchgeführt, die vorzugsweise mit einem dreidimensional vernetzten Polysaccharid auf Basis von Dextran (Sephadex G-200) gefüllt ist. Diese Säule hält die kleineren Einheiten zurück, läßt jedoch das schwerere Au rasch durch. Sie arbeitet in analoger Weise wie ein mechanisches Sieb. Salze und anorganische Stoffe werden ebenfalls verzögert. Das Au kommt in der ersten Bande heraus.

Die Säule hat eine Länge von 650 mm und einen Durchmesser von 32 mm und ist vorher mit einer 0,85gewichtsprozentigen Lösung von Natriumchlorid in Wasser äquiübriert worden. Die Elution wird mit der gleichen Lösung durchgeführt, und alles Au(l)-positive Material wird in der Bande 1 eluiert.

Die bei obiger Gelfiltration erhaltenen Ergebnisse gehen aus F i g. 1 hervor, in der die Durchlässigkeit in Prozent bei 280 Millimy gegen Fraktionsnummern aufgetragen ist.

Nach der Trennung durch Elektrophorese werden die jeweils erhaltenen Muster durch Zugabc von Pferde-Antihumanserum-Antiserum zu den Trögen entwickelt.

Die hierbei erhaltenen Ergebnisse können F i g. 2 entnommen werden. Diese zeigt immunoelekirophoretische Muster von Fraktionen mit verschiedenem Reinheitsgrad. Muster 1 ist das für Ausgangsplasma, Muster 2 für die Pellelsuspension, Muster 3 für die mit Enzym behandelte Sedimentsuspension und Muster 4 für die mit Enzym behandelte Sedimentsuspension, mit der die Gelfiltration durch Dextrangel (Sephadex G-200) durchgeführt worden ist. Li den Mustern 3 und 4 ist die Abnahme der Zahl und Intensität von Präcipitinbanden des Produkts zu beachten.

Alle Fraktionen, die die erste Bande bilden, welche die gesamte Au(l)-Antigenaktivität enthält, werden vereinigt

Saccharosegradient

Die aus der Gelfiltration erhaltenen vereinigten Fraktionen von Bande 1 werden gegen eine 0,01 m Lösung von Kaliumchlorid in Wasser dialysiert, lyophilisiert (gefriergetrocknet) und mit Saccharosegradienten in einer Ultrazentrifuge sedimentiert Zur Durchführung dieser Operation wird das Rohr der Ultrazentrifuge mit Saccharoselösung zunehmender Konzentration gefüllt wobei sich der am stärksten konzentrierte Anteil am Boden und der am wenigsten konzentrierte oben befindet. Die Anteile mit wachsender Dichte werden oben mit der in destilliertem Wasser resuspendierten Probe überschichtet. Der Saccharosekonzentrationsbereich beträgt gewöhnlich etwa 30% (Gewicht/Volumen) in der Bodenschicht und etwa 10% (Gewicht/Volumen) in der obersten Schicht, es können aber auch andere Konzentrationsunterschiede angewandt werden. Gewünschtenfalls kann der Saccharosegradient mit einem auf diesem Gebiet allgemein bekannten automatischen Gerät erzeugt werden. Zu Testzwecken wurde dar Au(I) vor Beginn der Operation radioaktiv gemacht.

Aus F i g. 3 geht eine Analyse des Saccharosegradientenprofils für 32P-Markiening und Antigenität hervor, wobei die Cerenkov CM P-Aktivität gegen die Fraktionsnummer aufgetragen ist. Die Fraktionen 18 bis 23 mit höherer Radioaktivität und Antigenität werden vereinigt. Die Linie in dem Radioaktivitätsmaximum gibt dabei den durch Immunodiffusion bestimmten Au(I)-positiven Bereich an.

Die Erzeugung und Probenahme der Saccharosegradienten wird nach der in J. Biol. Chem. 236, 1372 (1961) beschriebenen Methode durchgeführt. 1 ;nl Material wird auf jeden der beiden 32,5 ml linearen Saccharosegradienten von 10 bis 30 Volumenprozent in 0,01 m Trismaleatp'iffer bei pH 7,4 aufgeschichtet. Die Gradienten werden 20 Stunden bei 57 000 g in einem entsprechenden Rotor (SW27-Spinco-Rotor) zentrifugiert. 40 Tropfen-Fraktionen werden durch Punktieren am Boden der Rohre entnommen, und Radioaktivität sowie Antigenität jeder Fraktion werden wie nachstehend beschrieben ermittelt.

Vorzugsweise wird hierzu und für andere Dichtegradienten-Zentrifugationen eine Zonenultrazentrifuge verwendet. Bei Bedarf kann jedoch auch eine übliche Ultrazentrifuge angewandt werden.

Die Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation ist für die erfindungsgemäßen Zwecke zur Reinigung des Impfstoffs zwar vorteilhaft, aber nicht wesentlich, und diese Stufe kann daher gewünschtenfalls weggelassen werden.

Die nach der Dichtegradienten-Zentrifugation in Saccharoselösung erhaltene aktive Fraktion wird zur Entfernung der Saccharose und zur Konzentrierung des Au dialysiert und lyophilisiert.

Zentrifugation in Cäsiumchlorid

Das Au aus der oben beschriebenen Dichtegradientcnzentrifug:ition wird anschließend an Cäsiumchlorid-

gradienten sedimentiert. Die vereinigten immunoreaktiven Fraktionen aus den Saccharosedichtegradientenrohren von F i g. 3 werden gegen 0,01 m Kaliumchloridlösung in Wasser bei 5 Grad C 18 Stunden dialysiert und lyophilisiert. Die getrocknete Au(l)-Fraktion wird dann in einer kleinen /lenge destilliertem Wasser resuspendiert und mit gesättigter Cäsiumchloridlösung zur Erzeugung einer mit einem Refractometer bestimmten Enddichte von 1,3 vermischt. Das Endvolumen der Mischung beträgt 5 ml.

Diese Mischung wird in einem Rotor mit 222 000 g (Spinco SW 50 Rotor) bis zur Gleichgewichtseinstellung in etwa 40 Stunden zentrifugiert. 10 Tropfenfraktionen werden durch Punktieren des Bodens des Rohrs gesammelt.

Statt dieser Technik kann auch ein vorgebildeter linearer Cäsiumchloriddichtegradient in einem Zentrifugenrohr oder einem Zonenrotor verwendet werden. Am Ende der Zentrifugation bildet das Au eine Bande in einer bestimmten Höhe, wie ein Nachweis zeigt. Die infektiösen Teilchen sind dichter und werden bei einem tieferen Niveau abgetrennt.

F i g. 4 zeigt in einem zusammengesetzten Diagramm eine Analyse des Dichtegradienten der in Saccharose getrennten Au(l)-Fraktion in Cäsiumchlorid, wobei die Extinktion bei 280 Millimy als eine Ordinate und die Cerenkov CPM-Aktivität als andere Ordinate und die Dichte in Gramm pro Milliliter als eine Abszisse und die Fraktionsnummer als andere Abszisse aufgetragen ist. Die Antigenität (Gegenwart von Au(I)) ist auf die Fraktionen 15 bis 21 mit der größten Aktivität in Fraktion 16 verteilt. Die relative Aktivität jeder Fraktion wird durch zweifache Verdünnungstitration ermit'telt. Die Fraktion, die am meisten verdünnt werden kann und dann noch eine Präzipitinlinie erzeugt, wird als die Bandenmaximumfraktion angesehen. Fraktion 16 hat eine Dichte von 1,21 und liegt sowohl im 280 Millimy-Maximum als auch im Cerenkov-Maximum. Das 280 Millimy-Maximum von Fraktion 8 in F i g. 4 ist ein unbekanntes Protein, das mit dem Saccharosegradienten allein nicht abgetrennt wird und keine Au(I)-Antigenität enthält. Die Fraktionen 15 bis 18 werden vereinigt, gegen 0,01 m Lösung von Kaliumchlorid in Wasser dialysiert und lyophilisiert.

Die F i g. 5 und 6 zeigen die Ergebnisse einer Analyse der durch Dichtegradientenzentrifugation in Cäsiumchlorid erhaltenen vereinigten antigenhaltigen Fraktionen 15 bis 18 aus Fig.4. Offenbar befindet sich die Präcipitinbande in der gleichen Lage und hat die gleiche Gestalt wie die Bande, die von dem ungereinigten Au(I) erzeugt wird (nicht dargestellt). Dieses Ergebnis zeigt die Beständigkeit des Antigens gegen die vorhergehende Enzymbehandlung und Gradientenoperationen.

Im einzelnen geht aus F i g. 5 ein immunoelektrophoretisches Muster von gereinigten Au(l)-Fraktionen 15 bis 18 aus F i g. 4 hervor. Muster 1 zeigt die Au(l)-Bande (vergleiche Pfeil), die sich entwickelt, wenn in den Trog darunter Human-Anti-Au(l) gegeben wird. Muster 2 zeigt das Ergebnis der Reaktion von Au(I) mit Antitotalhumanserumprotein, das sich im Trog darunter befindet Muster 3 zeigt das Ergebnis der Reaktion von Vollplasma, das Au(I) enthält, mit Antüiumanserum-Antiserum im Trog darüber.

Aus Fig.6 ist im einzelnen zu ersehen, daß die gereinigten Au(l)-Fraktionen 15 bis 18 aus Fig.4 bei Prüfung durch Immunodiffusion keine Humankomponente enthalten, da die Vertiefungen 1 und 2 diese vereinigten Fraktionen (5 Mikroliter bzw. 20 Mikroliter) enthalten und keine Präcipitationslinie durch Reaktion mit der zentralen Vertiefung, die Pferde-Antihuman-Antiserum enthält, vorhanden ist. Die peripheren Vertiefungen 3 und 5 enthalten andere Au(l)-Fraktio- -, nen aus früheren Reinigungsstufen zum Vergleich.

Fig. 7 zeigt ein Immunodiffusionsmuster der Au(I)-Fraktion nach verschiedenen Behandlungen. Die zentrale Vertiefung enthält Human-Anti-Au(l)-Antiserum. Die Vertiefungen 2 und 3 enthalten die eine Stunde auf

ίο 100 Grad C erwärmte Au(I)-Fraktion (5 bzw. Mikroliter). Vertiefung 4 enthält mit Ether behandeltes Au(I), Vertiefung 5 mit Chloroform behandeltes Au(I), und die Vertiefungen 1 und 6 die eine Stunde aus 85 Grad C erwärmte Au(I)-Fraktion (5 bzw. 20 Mikroliter).

F i g. 8 zeigt Immunodiffusionsmuster der Au(1 )-Fraktion nach verschiedenen Behandlungen. Die Anordnung ist die gleiche wie in F i g. 7 mit der Ausnahme, daß die zentrale Vertiefung Kaninchen-Anti-Au(l)-Antiserum enthält.

F i g. 9 zeigt eine Mikrofotographie negativ gefärbter Teilchen der am besten gereinigten Fraktion von Australia-Antigen Au(I) in 300 000-facher Vergrößerung unter dem Elektronenmikroskop.
Eine Untersuchung des Absorptionsspektrums von gereinigtem Au(I) zeigt nur eine Andeutung von absorbierendem Material bei 260 Millimy. Eine Schulter erscheint bei 275 Millimy, und ausgeprägte Maxima treten bei 280 Millimy und 290 Millimy auf.

Wenn das in der oben beschriebenen Weise

jo gewonnene Produkt in einem geeigneten Medium, zum Beispiel in physiologischer Kochsalzlösung, suspendier! wird, ist es bereits ein wirksamer Impfstoff geger Virushepatitis.

Damit gewährleistet ist, daß der Impfstoff unschädlich

j5 ist, sollen Kontrollprüfungen durchgeführt werden zweckmäßig mit Gewebekulturtests oder anderen Test! zum Nachweis dafür, daß kein infektiöses Material mehl vorhanden ist. Die Infektivität soll sowohl vor als auch nach der Abschwächung und Modifizierung ermitteli werden. Als Prüftiere werden hierzu Krallenaffen Schimpansen, Meerkatzen oder Totenkopfäffchen ver wendet.

Für die Kontrollprüfung muß durch Biopsie ein« Probe aus der Leber genommen und das Vorliegen odei Fehlen einer Infektion entweder durch die ober beschriebene Fluoreszenztechnik oder durch irgendeine andere histologische Standardtechnik bestimmt werden Selbst wenn Kontrolltests das Fehlen infektiösei

Komponenten ergeben, kann als besondere Vorsichts

so maßnahme mit dem Impfstoff eine Abschwächuni durchgeführt werden, worunter hierin auch Maßnah men verstanden werden, die manchmal als Alterierunj bezeichnet werden. Jede bekannte Technik zur Ab Schwächung oder Alterierung eines Impfstoffes kam angewandt werden.

Abschwächung oder Alterierung

a) Formaldehydlösung wird in zunehmend höherei Mengen zugesetzt Diese Verfahrensweise wird bevor zugt Nach jeder Zugabe von Formaldehyd werdei Proben entnommen und mit einem Gewebekulturtes oder anderen Tests untersucht bis infektiöse Kompo nenten beseitigt sind. Die Formaldehydanfangskonzen tration kann 0,1 m betragen, und es können geeignet« Inkremente bis zu 0,7 m zugesetzt werden. Dii Kontaktdauer und der pH-Wert der Reaktion sin( wichtig und sollen für jeden Ansatz ermittelt werden, di

es sich bei diesen Faktoren um empirische Größen handelt. Statt dessen kann eine Lösung von Phenol (0,5%) oder Thimerosal (1 — 10 000) in Kombination mit einer Alterung bei Temperaturen von 2 bis 10 Grad C oder verschiedenen Zeitspannen angewandt werden, bis die infektiösen Komponenten beseitigt sind.

b) Der Impfstoff wird mit Ultraviolettlicht bestrahlt, und am Ende jeder Bestrahlung wird eine Probe zur Untersuchung entnommen, bis sich keine infektiösen Eigenschaften mehr zeigen. Die Bestrahlungszeit für jeden Ansatz ist empirisch zu ermitteln.

c) 0-Propiolacton kann in Inkrementen zugesetzt werden, wobei nach jeder Zugabe Proben zur Untersuchung entnommen werden, bis keine infektiösen Eigenschaften mehr vorhanden sind.

d) Mit den Impfstoff kann eine Wärmebehandlung mit allmählich ansteigender Temperatur durchgeführt werden, wobei nach jeder Temperaturerhöhung eine Probe zur Untersuchung entnommen wird. Wenn eine Probe keine infektiösen Eigenschaften mehr aufweist, wird die Wärmebehandlung beendet Tests zeigen, daB der Impfstoff seine Antigenaktivität nach einstündiger Behandlung bei 85 oder 100 Grad C verliert, bei 56 Grad C jedoch eine Stunde lang beständig ist Die Temperatur der Wärmebehandlung soll selbst für kurze Zeit 85 Grad C nicht überschreiten.

Die Aktivitätsprüfung des Impfstoffs kann in jedem geeigneten Wirt, zum Beispiel Kaninchen, Meerschweinchen, Mäusen oder Affen, durchgeführt werden. Der Test ist positiv, wenn Au(l)-Antikörper induziert werden.

Dosierung, Verabreichung und Anwendung

Es kann jede Dosierung und Verabreichungsmethode angewandt werden, mit der erreicht wird, daß der vorliegende Impfstoff in den Blutstrom eintritt und den Immunmechanismus des Körpers wirksam zur Bildung von Antikörpern veranlaßt

Der Impfstoff kann durch Einbringen von Adjuvantien wie Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat oder anderen für solche Zwecke üblichen Stoffen verbessert werden.

Der erfindungsgemäße Impfstoff kann intramuskulär oder subkutan oder in anderer geeigneter Weise verabreicht werden. Die intravenöse Verabreichung wird wegen der möglichen Anwesenheit von pyrogenen Stoffen in dem Impfstoff nicht bevorzugt Die intramuskuläre Verabreichung ist vorzuziehen.

Der Impfstoff kann allgemein an Menschen verabreicht werden, ist jedoch besonders für Personen zu empfehlen, bei denen ein hohes Risiko für Virushepatitis, einschließlich Transfusionshepatitis und infektiöser Hepatitis, besteht Zu diesen Personen gehören Soldaten, Seeleute und andere Personen, die in tropischen Gegenden oder anderen Gebieten leben, in denen die Hepatitis verbreitet ist Der Impfstoff ist besonders für Personen zu empfehlen, die in enger Gemeinschaft leben, zum Beispiel Gefangene, Patienten mit Down's Syndrom, Drogensüchtige, Patienten, die an Lepra leiden oder bei denen Lepragefahr besteht, Arzte und Pflegepersonal in Krankenhlusern und Anstalten, besonders für geistig zurückgebliebene Patienten, und Personen, die voraussichtlich zahlreiche Bluttransfusionen erhalten, zum Beispiel Personen, die an Himophilie oder Thalassämie leiden. Zur allgemeineren Anwendung wird der Impfstoff im Fall einer Virushepatitisepidemie empfohlen.

Enzymbeständigkeit von Au(I)

Eine nach der in Blood 27, 297 (1966) beschriebenen Methode gereinigte Serumfraktion, die Au(I) und Teilchen enthält, wird auf eine Konzentration standardisiert, die bei Prüfung mit der Immunodiffusionstechnik eine scharfe Präcipitinlinie ergibt Anteile dieser Fraktion von 25 Mikroliter läßt man mit einer Reihe von Enzymen unter jeweils optimalen Bedingungen reagieren. Zu den Enzymen gehören Trypsin, Weizenkeimlipase, Neuraminidase, alpha-Amylase, Phospholipase C, Ribonuclease und Desoxyribonuclease. Ferner wird von der Firma Calbiochemical Corporation erhaltene Pronase in destilliertem Wasser in einer Gewichtskonzentration von 2 rng/rn! gelöst 5 Mikroliter dieser Enzymlösung läßt man mit 25 Mikroliter Au(I) der Au(I)-Fraktion reagieren. Alle Enzymreaktionen werden 1 Stunde bei 37 Grad C durchgeführt
Im Gegensatz zu anderen Antigenen, die untersucht und durch diese Enzyme abgebaut wurden, schädigt diese Behandlung Au(I) nicht und ist als Reinigungsmethode geeignet

Beständigkeit gegen andere Behandlungen

Zur Bestimmung des Einflusses erhöhter Temperaturen auf Au(I) werden gleiche Volumenteile Au(I) und 0,1 m Trismaleat-Puffer bei pH 7,5 eine Stunde bei Temperaturen von 56 Grad C, 85 Grad C und 100 Grad C inkubiert Den Einfluß erhöhter Temperaturen zeigen die F i g. 7 und 8. Die Wärmebehandlung bei 85 Grad C und 100 Grad C zerstört jede nachweisbare Antigenität, während eine unbehandelte Kontrollprobe in V« der Menge (5 Mikroliter) eine Präcipitinbande ergibt Nach einstündigem Erwärmen auf 56 Grad C wird keine Wirkung festgestellt, und es wird eine mit der unbehandelten Kontrolle identische Linie (nicht dargestellt) beobachtet Die Wirkung von Ether und Chloroform auf Au(I) wird in der gleichen Weise, jedoch eine Stunde bei Raumtemperatur, ermittelt Die Lösungsmittel werden durch Verdampfen in einem Vakuumexsikkator entfernt Sowohl durch die Behandlung mit Äther als auch mit Chloroform können Antigengruppen freigelegt worden sein, da zwei Banden erscheinen, wo vorher in F i g. 7 und 8 eine aufgetreten ist Eine der Präcipitinbanden der mit Ether behandelten Au(l)-Fraktion ist offenbar von einer der zwei Banden verschieden, die nach der Chloroformbehandlung der Au(I)-Fraktionen in Fig.8 zu sehen ist, da sie sich kreuzen und keine Identitätslinie bilden. Es ist ersichtlich, daß auch andere organische Lösungsmittel oder oberflächenaktive Mittel für die Reinigung und/oder Abschwächung vorteilhaft sein können.

Phenolextraktion und Gradientenzentrifugation

Die kleine Menge an 32P in den am besten gereinigten Fraktionen scheint sich nicht in Nukleinsäuren mit hohem Molekulargewicht zu befinden. Die durch Dichtegradientenzentrifugation in CIsiumchlorid erhaltenen und vereinigten Fraktionen 15 bis 18 werden mit 2 mg Kalbsthymus-Desoxyribonukleinsiure als Träger versetzt Nach Extraktion mit Phenol nach der Methode von Thomas und Abelson »Procedures in Nucleic Acid Research«, Harper und Row, 1966, S. 557, und Zentrifugation in Cisiumchloridlöning mit Dichtegradienten wird in dem Dichtebereich für Nukleinsäuren keine Radioaktivität gefunden. Die fluorometrische Bestimmung der am meisten gereinigten Fraktionen ergibt weniger als 1% Desoxyribonukleinsäure. Die

Prüfung auf Ribonukleinsäure ergibt eine Menge, die unter der unteren Nachweisgrenze der Bestimmungsmethode liegt, was weniger als 10 Gewichtsprozent des Gesamtproteins entspricht.

Australia-Antigen wird also ersichtlich durch enzymatischen Abbau nicht angegriffen, wie sich sowohl aus immunologischen Bestimmungen als auch durch Untersuchung unter dem Elektronenmikroskop ergibt. Infolge der bemerkenswerten Stabilität von Au(I) gegen eine solche Behandlung ist es möglich, Humanplasmaprotein ι ο als Vorbehandlung zu entfernen. Die Abwesenheit von Serumproteinen in dem Impfstoff wurde durch das Fehlen von immunologischer Aktivität gegen Humanserum-Antiserum bei Prüfung durch Immunoelektrophorese und durch Immunodiffusionsanalyse nachgewiesen.

Das Aussehen der Teilchen in Cäsiumchloridgradientenfraktionen unter dem Elektronenmikroskop unterscheidet sich nicht von den in Nature, 218, 1057 (1968) gemachten Angaben.

Die Teilchen haben einen Durchmesser von 180 bis 210 Angström und gleichen in ihrer einheitlichen Größe Viren. Die Teilchen enthalten offenbar Untereinheiten und zentrale »Kerne«. Die Größe und Gestalt von Au(l)-Teilchen gleichen denen der adenoassoziierten (AAV) Parvo- und Picornavirus-Gruppen (L Fenner, »Biology of Animal Viruses«, Academic Preß, 1968,12).

In der am besten gereinigten Fraktion gibt es kein Anzeichen für die Gegenwart merklicher Nukleinsäuremengen. Kein antigenes Material oder Teilchen werden im Elektronenmikroskop in anderen Cäsiumchloridfraktionen gefunden.

Die Dichte der Cäsiumchloridgradientenbande, die die höchste Radioaktivität und Australia-Antigen-Immunodiffusionsaktivität enthält, beträgt 1,21, was die in Blood 27, 297 (1966) enthaltenen Ergebnisse bestätigt Die niedrige Dichte von gereinigtem Au(I) kann durch das Fehlen von Nukleinsäuren und/oder die Gegenwart von Lipiden bedingt sein. Das Vorliegen von Lipiden in Australia-Antigen ist wegen der Färbereaktion von Australia-Antigen-Präcipitinbanden vermutet worden (Blood 27, 297 [1966]). Es wird angenommen, daß eine Behandlung des gereinigten Australia-Antigens mit organischen Lösungsmitteln oder oberflächenaktiven Mitteln die Dichte durch Entfernung /on Lipiden erhöhen kann.

Die chemischen und physikalischen Eigenschaften von Au(I), das Fehlen von Nukleinsäure und die hohen Konzentrationen, die im Serum von Patienten mit Virushepatitis gefunden werden, weisen darauf hin, daß der Hauptteil von Au(l)-Teilchen inkomplette Viren oder Capside sind.

Tabelle

10

Versuchsbericht

Ermittlung der Wirksamkeit des vorliegenden
Impfstoffs gegen Virus-B-Hepatitis (HBV)

Zur Ermittlung der Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Impfstoffes gegen Virus-B-Hepatitis verabreicht man folgende Inokular subkutan an Schimpansen:

a) Kein Inokulum (keines),

b) die als Verdünnungsmittel für die Vaccine verwendete Kochsalz-Serumalbumin-Lösung (Vaccin-Verdünnungsmittel),

c) Nicht inaktiviertes erfindungsgemäßes Vaccin, das aus Gesamtblut eines Trägers von Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HB₅Ag) hergestellt worden ist, mit der Unterzeichnung ayw-Vaccin (ayw-Vaccin — nicht inaktiviert),

d) mit Formalin inaktiviertes erfindungsgemäßes Vaccin, das aus Gesamtblut eines Trägers von Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAg) hergestellt worden ist, mit der Unterbezeichnung ayw-Vaccin (ayw-Vaccin — inaktiviert),

e) mit Formalin inaktiviertes erfindungsgemäßes Vaccin, das aus Plasma eines Trägers von Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HB₅Ag) hergestellt worden ist, mit der Unterbezeichnung adr-Vaccin (adr-Vaccin — inaktiviert),

f) Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HB₅Ag) positives Serum, aus dem das Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HB₅Ag) Vaccin hergestellt worden ist

Die Vaccine werden den Versuchstieren in Mengen von 1 ml, die 20 μg HB₅Ag enthalten, subkutan inokuliert Einen Monat nach dieser Vaccininokulation verabreicht man den Tieren eine weitere Verstärkungsinokulation. Eine identische Immunisierung führt man auch mit dem Vaccin-Verdünnungsmittel durch. Das ayw-enthaltende Serum wird ebenfalls in einer Menge von 1 ml intravenös gespritzt In wöchentlichen Abständen werden 24 Monate lang entsprechende Serumproben gesammelt und bezüglich ihrer Alanin-Aminotransferase-Aktivität (SGPT) untersucht Jede Serumprobe wird auch durch Festphasenradioimmunotest bezüglich ihrer Konzentration an HB₅ Ag und durch possive Hämagglutination (PHA) sowie durch Radioimmunoausfällung (RIP) bezüglich ihrer Konzentration an anti-HB₅ untersucht Die Antikörper für Hepatitiskernantigen (anti-HBc) werden ebenfalls durch Radioimmunoausfällung (RIP) ermittelt Die hierbei erhaltenen Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle hervor:

Schimpansen	Inokulum	Durch das	Inokulum hervorgerufene Wirkung	mit HBV
		Erhöhte	HB5Ag Antikörper- Wirkung	anti-HBc infiziert
		SGPT	anti-HBs	RIP
			PHA WP	—
HAFB 777	keines		.	— —
HAFB 778	Vaccin-Verdünnungs	—	— —
	mittel			— * —
HAFB 780	ayw-Vaccin	—	— + +
	(nicht inaktiviert)			— —
HAFB 782	ayw-Vaccin	—	— -:- +
	(inaktiviert)

Fortsetzung Schimpansen

HAFB 784 HAFB 781 Delta 1894

Inokulum

ayw-Vaccin

(inaktiviert)

adr-Vaccin

(inaktiviert)

ayw-Serum

Durch das Inokulum hervorgerufene Wirkung
Erhöhte HB_sAg Antikörper-Wirkung
^SGPT anti-HB_s

PHA RIP

mit HBV

anti-HBc infiziert
RIP

Tabelle (Fortsetzung) Schimpansen

Inokulum

Durch lebende HBV hervorgerufene Wirkung
Erhöhte HB₅Ag Antikörper-Wirkung

SGPT anti-HBs anti-HB_c

PHA RIP

mit HBV
infiziert

HAFB 777 HAFB 778

HAFB 780 HAFB 782 HAFB 784 HAFB 781 Delta 1894

keines

Vaccin-Verdünnungs-

mittel

ayw-Vaccin

(nicht inaktiviert)

ayw-Vaccin

(inaktiviert)

ayw-Vaccin

(inaktiviert)

adr-Vaccin

(inaktivien)

ayw-Serum

N.U.⁺

*) Nach Verschwinden von HB_bAg.

⁺ Nicht untersucht.

¹ Diese Versuchstiere wurden ständige Träger von HB_sAg.

N.U.

N.U.

N.U.

Wie ersichtlich, ergeben sich bei keinem der mit Vaccin behandelten Versuchstiere Anzeichen für eine Infektion durch Virus-B-Hepatitis, da die SGPT-Aktivität nicht ansteigt und weder HB₅Ag noch anti-HBc gebildet wird. Die mit dem Serum, aus dem das ayw-Vaccin hergestellt worden ist, inokulierten Schimpansen bekommen dagegen Hepatitis vom Typ B, was sich durch abnormale Werte für SGPT und die Bildung von HBjAg unter nachfolgender Bildung von anti-HB_c und anti-HBs äußert Die mit ayw-Vaccin geimpften Versuchstiere entwickeln anti-HBs, wie die Bestimmung von PHA und RiP nach der Impfung ergibt Die mit adr-Vaccin geimpften Schimpansen entwickeln Antikörper, was sich durch RIP, jedoch nicht durch PHA zeigen läßt Die PHA-Antikörperwerte erreichen bei den mit ayw-Vaccin geimpften Tieren innerhalb von etwa einem Monat nach der Verstärkungsinokulation ein Maximum (1:32 bis 1:64), wobei diese Antikörperwerte zum Ende der sechsmonatigen Versuchsdauer hin abfallen(<l :2bis1 :8>

Zur Bestimmung, ob die Impfung mit gereinigtem HB₅Ag einen Schutz gegenüber einer HBV-Infektion ergibt, spritzt man den geimpften Schimpansen und entsprechenden Vergleichs-Schimpansen intravenös etwa ΙΟ³·⁵ infektiöse Dosen von HBV mit der Unterbezeichnung ayw (Stamm MS/2) 24 Stunden nach Vaccination. Sodann entnimmt man den Versuchstieren zweimal wöchentlich Blutproben, die man jeweils bezüglich SGPT, HB_sAg und anti-HB_s untersucht. Ausgewählte Proben werden ferner auch bezüglich anti-HBc untersucht. Wie aus der obigen Tabelle hervorgeht, entwickeln s beide nichtgeimpften Schimpansen Hepatitis vom Typ B, was sich durch einen Anstieg der SGPT-Aktivität, eine Entwicklung von andauerndem HB₅Ag und die Entwicklung von anti-HB₀ äußert. Im Gegensatz dazu läßt sich bei keinem der mit ayw-Vaccin geimpften Schimpansen irgendein biochemisches oder serologisches Anzeichen für eine HBV-Infektion feststellen. Die mit adr-Vaccin geimpften Tiefe ciiiwiekicii äiui-HB_c und zeigen eine Erhöhung an anti-HB_s etwa 11 Wochen nach der Behandlung mit lebendem Virus, was beweist, daß die Tiere infiziert worden sind, sie entwickeln jedoch weder HB₅ Ag noch eine erhöhte SGPT-Aktivität

Bei den mit ayw-Vaccin geimpften Schimpansen entwickeln sich demnach keinerlei Anzeichen einer Infektion mit homotypischem HBV. Eines der mit adr-Vaeein geimpften Tiere ist mit ayw-Virus infiziert, zeigt jedoch keinerlei Anzeichen einer Hepatitis. Dieses Tier, das über eine schlechte Immunreaktion gegenüber dem Impfstoff verfügte und mit einem Virusstamm behandelt worden war, der in zwei Unterbezeicbnungen heterotyp war, kann daher eine abgeschwächte Infektion gehabt haben. Beide nicht-geimpften Tiere entwickeln dagegen eine Hepatitis vom Typ B, so daß

sich hier ein ähnliches Ergebnis wie bei anderen Schimpansen ergibt, die dieses HBV in verschiedenen Verdünnungen erhalten haben.

Die obigen Versuchsergebnisse zeigen somit, daß eine Immunisienuig mit gereinigtem HB₅Ag einen Schutz gegenüber einer Infektion durch Virus-B-Hepatitis ergibt Der aus Blutmaterial gewonnene vorliegen Impfstoff eignet sich somit zum Schutz von Hepati vom Typ B. Weitere Einzelheiten in diesem Zusamme hang gehen aus The American Journal of the Medi Sciences, Seiten 395 bis 399 (1975) hervor.

Hierzu 9 Blatt Zeichnungen

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Aus Australia-Antigen enthaltendem Blutmaterial gewonnener Impfstoff gegen Virushepatitis, dadurch gekennzeichnet, daß er im wesentlichen Australia-Antigen, das Teilchen mit einem Größenbereich von 180 bis 210 Angström aufweist, die praktisch frei von Nukleinsäuren sind, im wesentlichen frei von infektiösen Teilchen ist und eine Dichte von etwa 1,21 hat, und ein mit Blut verträgliches Medium als Rest enthält

2. Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen abgeschwächt oder alteriert sind.

3. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes gepen Virushepatitis durch Reinigung von Australia-Antigen enthaltendem Blutmaterial, dadurch gekennzeichnet, daß man das Blutmaterial zur Entfernung von Verunreinigungen einschließlich infektiöser Komponenten im wesentlichen