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Konzentriertes Hepatitis-B-Oberflächenantigen enthaltende
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Masse und Verfahren zu ihrer Herstellung Die Erfindung betrifft eine
konzentriertes Hepatitis-B-Oberflächenantigen enthaltende Masse in einem physiologisch
verträglichen Medium und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
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Von Prince wird in der Zeitschrift Proceedings of the National Academy
of Science USA, Bd. 60, Seiten 814-821 (1968), ein Antigen besprochen, das während
der Inkubationszeit und im klinischen Anfangsstadium der nach Bluttransfusionen
auftretenden Serumhepatitis beobachtet worden ist. Dieses Antigen scheint mit dem
sogenannten Australia-Antigen identisch zu sein (vgl. Prince, Lancet, Band 2, Seiten
462-463 (1968); Blumberg, Sutnick and London, J. Am. Med. Assoc. Band 207, Seiten
1895-1896 (1969); und Wright, McCollum and Klatskin, Lancet Band 2, Seiten 118-121
(1969)), und ein Austausch von Bezugsreagenzien ergab, daß zwischen diesem Antigen
und dem "Hepatitisantigen" von Gocke und Kavey, Lancet Band 1, Seiten 1055-1059
(1969) Identität besteht. Das Antigen wurde von Prince, Hargrove, Szmuness, Cherubin,
Fontana und Jeffries, N. Engl. J. Med., Band 282, Seiten 287-291 (1970), als spezifisch
für das Virus der Serumhepatitis beschrieben, ein
Virus, das die
Hauptursache der bei erwachsenen Städtern unabhängig von der parenteralen Einwirkung
von Blut oder Blutprodukten sporadisch auftretenden Hepatitis zu sein scheint.
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Das mit derartigen Serumhepatitis-Infektionen verbundene Antigen wird
mit einer Vielzahl von Namen bezeichnet, wie Australia-Antigen, SH-Antigen, Au/Sh-Antigen,
HAA usw., und jeder Name hat seine Befürworter. Jeder hat aber auch gewisse Mängel.
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Geographische Namen sagen Ärzten und Studenten wenig, und bei der
Bezeichnung HAA wird die spezifische Rolle dieses Antigens bei Infektionen mit dem
Hepatitisvirus B außer acht gelassen.
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Die Bezeichnung Sh hat den Nachteil, die Vorstellung hervorzurufen,
daß dieses Antigen zu einem Virus gehört, das nur durch "Serum" oder Blutprodukte
übertragbar ist; es gibt jedoch jetzt viele Beweise dafür, daß das Hepatitisvirus
B (Serumhepatitis-Virus) auch "infektiös" ist. Die weitere Verwendung des Begriffes
"Serumhepatitis" dürfte daher mehr Verwirrung stiften als Klärung bringen. Daher
wurde von dem National Research Council der U.S. National Academy of Science ein
besonderer Unterausschuß eingesetzt, der u.a. eine bessere Terminologie vorschlagen
sollte. Die empfohlene Terminologie kehrt zu den klassischen Begriffen Hepatitisvirus
A und Hepatitisvirus B zurück, die in den 40er und 50er Jahren benutzt wurden. Das
Antigen heißt daher logischerweise Hepatitis-B-Antigen (HB-A-g) und der gegen dieses
Antigen gerichtete Antikörper Hepatitis-B-Antikörper (HB-A-k). Diese Terminologie
wird in der folgenden Beschreibung verwendet.
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Im Jahre 1964 beschrieb Blumberg, Bulletin of the New York Academy
of Med., Band 40, Seiten 377-386 (1964), die Entdeckung einer anscheinend anderen
Polymorphie des menschlichen Serumproteins. Im Serum von Blutern, die mehrfache
Bluttransfusionen erhalten hatten, wurde ein Antikörper festgestellt, der bei der
Ouchterlony-Methode mit einem Antigen reagierte,
das kein ß-Lipoprotein
war und im Serum eines Teils bestimmter fremder Völker sowie im Serum einiger Leukämie-Patienten
gefunden wurde. Dieses Antigen wurde als Australia-Antigen bezeichnet, da es ursprünglich
in dem Serum eines australischen Ureinwohners festgestellt worden war. Familienuntersuchungen
scheinen die Hypothese zu stützen, daß dieses Antigen ein genetisch bestimmtes Isoantigen
ist. Später wurde festgestellt, daß das Australia-Antigen bei etwa 25% aller Anstaltspatienten
mit Down-Syndrom vorkommt.
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Eine zufällige Beobachtung von Blumberg schaffte die Grundlagen für
eine neue Deutung der vorstehend besprochenen Feststellungen.
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Von einem Kind mit Down-Syndrom wurden regelmäßig Blutproben entnommen.
Anfangs konnte bei dem Kind kein Antigen festgestellt werden; spätere Proben dagegen
waren positiv. Aus klinischen Berichten ging hervor, daß das Kind fast gleichzeitig
an Hepatitis erkrankt war. Dann wurde gefunden, daß das Antigen in fünf von 48 Serumproben
von Patienten mit Virushepatitis vorkam.
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Diese Untersuchungsergebnisse ließen sich mit mindestens drei Hypothesen
in Einklang bringen: 1. Das Antigen war ein genetisch bestimmtes Serum-Isoantigen,
dessen Gegenwart mit der Empfindlichkeit für eine Anzahl von Krankheiten oder Krankheitsstoffen,
z.B. Leukämie, Mongolismus, Hepatitis usw., in Zusammenhang steht; 2. das Antigen
war ein genetisch bestimmtes Isoantigen, dessen Erscheinen von der Gegenwart eines
"freisetzenden" Virus abhängig ist; und 3. das Antigen war spezifisch an ein Virus
gebunden und konnte einen oder mehrere dieser Zustände hervorrufen.
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Zunächst wurde die letzte Hypothese als die-am wenigsten wahrscheinliche
angesehen, da man sich nicht vorstellen konnte,
daß ein Virus-Antigen
im Blut gesunder Träger in Mengen zirkulieren könnte, die für die Feststellung durch
einen verhältnismäßig wenig empfindlichen Immundiffusionsversuch ausreicht.
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Die Ergebnisse einer Gemeinschaftsarbeit von Prince und Blumberg über
die physikalischen Eigenschaften des Antigens stützten jedoch die dritte Hypothese,
da gefunden wurde, daß das Antigen an Teilchen gebunden ist, die sich mit der Geschwindigkeit
kleiner virusartiger Teilchen sedimentieren lassen.
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Ein spezifischer Zusammenhang zwischen dem Australia-Antigen und der
Hepatitis wurde jedoch erst aufgefunden, als die Zusammensetzung des für den Immundiffusions-Test
verwendeten Agar-Agars geändert wurde. Nur dann wurden die Fällungslinien für eine
Identitätsprüfung hinreichend deutlich. Die mit dem neu entwickelten Immundiffusionssystem
erhaltenen Ergebnisse wurden von Prince in Proceedings of the National Academy of
Science Band 60, Seiten 814-821 (1968) beschrieben.
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Jokelainen, Krohn, Prince und Finlayson, Journal of Virology Band
6, Seiten 685-689 (1970), untersuchten die Struktur von Hepatitis-B-Antigen enthaltenden
Teilchen unter einem Elektronenmikroskop und bestätigten die Existenz großer kugelförmiger
Teilchen (ca. 43 nm) sowie kleinerer (ca. 20 nm) stab-und kugelförmiger Teilchen.
Die größeren Teilchen scheinen eine Außen- und eine Innenmembran sowie einen Kern
zu haben, die sich durch Anfärben sichtbar machen lassen. Die Außenmembran der großen
Teilchen scheint den Kugeln von 20 nm Durchmesser und den Stäbchen, von denen bekannt
ist, daß sie Hepatitis-B-Antigen aufweisen, ähnlich zu sein. Alle drei Teilchenarten
scheinen Hepatitis-B-Antigen zu enthalten, da sie sämtlich durch Hepatitis-B-Antiserum
verklumpt werden.
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Gelegentlich haben große Teilchen Vorsprünge mit einer Struktur,
die
mit derjenigen der Stäbchenformen identisch ist, und Einschnürungen an ihnen erteilen
ihnen in einigen Fällen ein Aussehen, das an eine Reihe kleiner Kugelteilchen erinnert.
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Diese Feststellungen scheinen mit denjenigen von Dane, Cameron und
Briggs, Lancet Band 1, Seiten 695-698 (1970), übereinzustimmen, wonach alle diese
Formen sich reproduzieren und die kleinen Kugeln und Stäbchen eine übermäßige Produktion
von Membranmaterial darstellen.
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Untersuchungen mit negativem Anfärben bestätigten das virusartige
Aussehen der großen kugelförmigen Teilchen. Untersuchungen mit positivem Anfärben
führten zu drei weiteren Erkenntnissen: 1. Die größeren Teilchen haben eine Doppelmembran-Struktur;
2. der zentrale Kern der nukleoidartigen Komponente enthält ein Material, das sich
mit Uranylacetat anfärben läßt; und 3. die kleinen Kugeln und Stäbchen enthalten
kein Kernmaterial. Obwohl Uranylacetat nicht als spezifisches Färbemittel für Nukleoprotein
angesehen werden kann, ist bekannt, daß es vorzugsweise von solchem Material aufgenommen
wird, und dies dürfte daher auch im Kern eines Virus vorkommen. Diese Feststellungen
stützen deshalb die Hypothese, daß von den drei beschriebenen Hepatitis-B-Antigen
enthaltenden Teilchen die größeren, etwa 40-45 nm großen Teilchen höchst wahrscheinlich
das wirkliche Hepatitis-B-Virus sind.
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Krugman und Mitarbeiter, J. Am. Med. Assoc., Band 217, Seite 41 (1971),
veröffentlichten vorläufige Untersuchungsergebnisse, die darauf schließen lassen,
daß HB-Ag enthaltendes Serum, das durch 1 Minute Kochen inaktiviert worden ist,
nicht infektiös und immunogen ist und zum Eintritt einer Schutzwirkung führt, wenn
es einer kleinen freiwilligen Gruppe von Kindern verabreicht wird.
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Prince, Szmuness, Hargrove, Jeffries, Cherubin und Kellner veröffentlichten
in
Perspectives in Virology, Band 7, Kapitel 14, Seiten 241-296 (Academic Press, 1971),
einen umfassenden Bericht über den Stand der Forschung zur Untersuchung des spezifischen
Antigens des Hepatitis-B-Virus.
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Es konnte somit gezeigt werden, daß während der Inkubationszeit einer
klassischen Serumhepatitis nach Bluttransfusion im Serum HB-Ag vorkommt. Antikörper
für dieses Antigen wurden bei Patienten gefunden, die mehrfache Bluttransfusionen
erhalten hatten, wie Patienten mit Hämophilie und Cooleyscher Anämie.
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In Seren von Patienten, die eine typische Virushepatitis durchgemacht
haben und wieder genesen sind, ist der Antikörper in der Regel nicht zu finden.
Es wurde gefunden, daß das Hepatitis-B-Antigen mit dem früher beschriebenen Australia-Antigen
und dem "Hepatiti s-Antigen " von Gocke identisch ist. Wie gezeigt wurde, ist das
Antigen mit virusartigen Teilchen von 20 bis 25 nm Durchmesser verbunden und hat
in Sucrose eine wäßrige Dichte von 1,17. Um festzustellen, ob eine Unterscheidung
zwischen den beiden Haupttypen der Virushepatitis möglich ist, wurden die Seren
von Patienten mit akuter Virushepatitis auf die Gegenwart von HB-Ag geprüft. In
keinem der vier untersuchten Fälle einer MS-1-Infektion mit kurzer Inkubationszeit
konnte das Antigen festgestellt werden, während in allen acht untersuchten Fällen
einer MS-2-Infektion mit langer Inkubationszeit das Antigen identifiziert wurde.
Ebenso wurde nur in einem von 74 Fällen aus vier Epedemien von infektiöser Hepatitis
und in keinem von 19 sporadisch aufgetretenen Fällen bei Kindern unter 14 Jahren
das Antigen festgestellt, während in 76 von 116 Fällen (66%), die nach dem Kontakt
mit verunreinigten Injektionsnadeln auftraten, und in 25 von 43 Fällen (58%) nach
Bluttransfusion ein positives Ergebnis erhalten wurde.
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Das HB-Ag wurde auch bei 71 von 129 Patienten (55%) mit Virushepatitis
festgestellt,
aus deren Krankengeschichte keine Anhaltspunkte für eine parenterale Infektion ersichtlich
waren.
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Diese Feststellungen legen den Schluß nahe, daß das Hepatitis-B-Virus
die Hauptursache der bei erwachsenen Städtern sporadisch und unabhängig von einer
parenteralen Einwirkung von Blut oder Blutprodukten auftretenden Hepatitis ist.
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Es wurde gefunden, daß das HB-Ag bei der Bevölkerung tropischer Länder
10 bis 100 mal häufiger als im Blut freiwilliger Spender in der Stadt New York vorkommt.
Diese Feststellungen bestätigen frühere Ergebnisse, die bei der Prüfung auf Australia-Antigen
erhalten wurden.
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Während bei etwa 90 bis 95% der Patienten mit akuter Serumhepatitis,
bei denen Antigen gefunden wurde, das HB-Ag im Blut nur kurze Zeit festzustellen
ist, entwickelt sich bei einigen Personen eine lang dauernde Hepatitis-B-Antigenämie.
Eine lang dauernde Persistenz des Antigens wurde auch bei klinisch gesunden Personen
aller untersuchten Bevölkerungskreise gefunden.
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Bei etwa 2 bis 3% von Patienten, die mit Arzneimitteln behandelt werden,
aber keine Anzeichen einer akuten Hepatitis zeigen, finden sich feststellbare Mengen
von HB-Ag. Demgegenüber kann das Antigen nur bei 0,18 der freiwilligen Blutspender
in der Stadt New York festgestellt werden. Bei bezahlten Blutspendern, die die Hepatitis
mindestens 10 mal häufiger als freiwillige Blutspender übertragen sollen, wurde
gefunden, daß die Wahrscheinlichkeit für das Vorkommen von HB-Ag im Blut 12,5 mal
größer als bei freiwilligen Blutspendern ist.
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Darüber hinaus wurde das mit der Hepatitis B im Zusammenhang stehende
Antigen auch im Serum von 8 von 138 untersuchten
Schimpansen gefunden.
In 3 Tieren war das Antigen mindestens 5 Jahre vorhanden. Dagegen wurde das Antigen
nicht im Serum von 99 Pavianen und 11 Gibbonaffen gefunden. Antigenämische Schimpansen
zeigten histologische Anzeichen einer chronischen Hepatitis. HB-Ak wurden in 6 von
138 Schimpansen gefunden, davon in drei Tieren nur vorübergehend. Die Schimpansen-Antigenträger
sind nützliche Tiermodelle für die Untersuchung des Zustandes von Hepatitis-B-Virusträgern
und Methoden zum ihrer Therapie.
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Wahrscheinlich sind chronische HB-Ag-Träger auch Träger des Hepatitisvirus
B, da Blut, das dieses Antigen enthielt, bei mindestens 5 von 8 Empfängern in einer
Untersuchung und 9 von 12 Empfängern in einer zweiten Untersuchung zu Hepatitis
führte.
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Die Menge des HB-Ag und der HB-Ak kann quantitativ nach folgenden
Verfahren bestimmt werden: Durch Agar-Agar-Gel-Diffusion nach der Methode von Prince,
Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A., Band 60, Seiten 814-821 (1968); durch IEOP nach der
Methode von Prince und Burke, Science, Band 169, Seiten 593-595 (1970); durch passive
Hämagglutination (HA) und Hemmung der Hämagglutination (HAI) nach der Methode von
Vyas und Shulman, Science Band 170, Seiten 332-333 (1970); und neuerdings direkt
durch den Radioimmunversuch (RIA) von Ling und Overby unter Benutzung der Ausria-Ausrüstung
der Abbot Laboratories.
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Es wird geschätzt, daß das Plasma von Trägern des Hepatitisvirus B
etwa 0,1 bis 1,0 mag an Protein gebundenes Antigen je Milliliter Plasma enthält.
Das Plasma derartiger Träger kann daher als brauchbare Antigenquelle für die Herstellung
von Vakzinen benutzt werden.
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Von Prince wird in einer US-Patentanmeldung eine Vakzine zum
Schutz
gegen Hepatitis-B-Infektionen, ein Verfahren zur Herstellung einer derartigen Vakzine
und eine Vakzinationsmethode beschrieben, bei der diese Vakzine verwendet wird.
Die Vakzine von Prince enthält HB-Ag-Teilchen mit einem Durchmesser von etwa 16
bis etwa 30 nm in einem physiologisch verträglichen Träger. Die Vakzine ist im wesentlichen
frei von den wahrscheinlich infektiösen HB-Ag-Teilchen mit einem Durchmesser von
etwa 40 bis 45 nm.
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Zur Herstellung der Vakzine benutzt Prince ein Reinigungsverfahren,
das aus einer Extraktion mit Fluorkohlenwasserstoffen, Fällung mit Methanol und
Zonen-Ultrazentrifugation besteht.
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Die von Bond und Hall, J. Infect. Dis., Band 125, Seiten 263 bis 268
(1972), beschriebenen Methoden für die Zonen-Ultrazentrifugation sind nach Prince
für die Trennung und Reinigung von HB-Ag in seine morphologischen Formen geeignet.
Die Methoden sind jedoch gefährlich und erfordern besondere Sicherheitsvorkehrungen.
Darüber hinaus ist die Zonen-Ultrazentrifugation außerordentlich kostspielig, und
die bei dem in der Patentanmeldung beschriebenen Verfahren benötigten großen Gesamtmengen
an Material, das der Ultrazentrifuge je Einheit Produkt zugeführt werden muß, führen
zu außerordentlich hohen Produktionskosten für das gereinigte Antigen. Weniger kostspielige
Methoden für die Herstellung von HB-Ag sind daher wünschenswert, so daß die daraus
hergestellte Vakzine der Offentlichkeit zu einem Preis zur Verfügung gestellt werden
kann, der ohne unbillige Härten für den einzelnen oder die dffentlichkeit getragen
werden kann.
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In der US-PS 3 415 804 werden von Polson Methoden zum Fraktionieren
von Mischungen proteinhaltiger Substanzen unter Verwendung von Polyäthylenglykol
(PEG) als ein die Dispergierbarkeit herabsetzendes Mittel beschrieben, wobei man
eine flüssige Phase,
die eine Fraktion in Dispersion, und eine
feste Phase erhält, die die zweite Fraktion enthält. Bei der Polson-Methode, die
die Anwendung eines pH-Wertes von 7,0, eine Temperatur von 21 °C und eine Protein-Konzentration
von weniger als 0,4 g/100ml vorsieht, ist eine Polyäthylenglykol-Konzentration von
mehr als 12% erforderlich, um g -Globuline und Albumin zu fällen.
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Nach Polson ist die Uberlappung zwischen den Fraktionen um so größer,
je höher die Protein-Konzentration ist. Obwohl nach geltender Anschauung das HB-Ag
normalerweise an die r -Globulin-Fraktionen gebunden ist, gibt Polson keine geeignete
Methode zur Trennung des HB-Ag von den aus dem Plasma erhaltenen Fraktionen an.
Außerdem sind nach Polson sehr hohe PEG-Konzentrationen erforderlich, um die gewünschte
Fraktionierung zu erzielen.
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Von de Rizzo, Pandey, Wallis und Melnik, Infection and Immunology
Band 6, Seiten 335-338 (1972), ist eine zweistufige Methode zum Konzentrieren und
Reinigungen von HB-Ag unter Verwendung von PEG und dem Polyelektrolyten 60 (einem
vernetzten Copolymerisat von Isobutylen und Maleinsäureanhydrid) beschrieben worden.
In der ersten Stufe wird Plasma mit einer Protein-Konzentration von 79, 9 mg/ml
bei einem pH-Wert von 4,6 und einer Temperatur von 25 OC mit 8%igem PEG gefällt.
Es wird angegeben, daß der Niederschlag 100% des ursprünglichen HB-Ag und nur 12,5%
der ursprünglichen Proteine enthält. Die Proteine in dem Niederschlag bestehen aus
2 mg/ml Albumin, 3 mg/ml bL2-Globilin und 5 mg/ml Gamma-Globulin. Alle 1' ß- und
ß2-Globuline sollen in der flüssigen Phase verbleiben. Das in diesem durch PEG-Fällung
erhaltenen Niederschlag enthaltene HB-Ag wurde dann unter Verwendung des Polyelektrolyten
60 konzentriert und gereinigt. Nach den Angaben von de Rizzo und Mitarbeiter soll
dabei eine 8fache Reinigung des HB-Ag in dem PEG-Niederschlag erzielt werden; eine
Nacharbeitung des Verfahrens durch die Anmelder ergab jedoch nur eine zweifache
Reinigung.
Außerdem wurde gefunden, daß der Verfahren von de Rizzo und Mitarbeiter nicht in
der beschriebenen Weise reproduzierbar ist.
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In der US-PS 3 636 191 werden von Blumberg und Millman Verfahren zur
Herstellung einer Vakzine gegen Virushepatitis beschrieben, bei denen Antigen enthaltendes
Plasma einer Ultrazentrifugation, Enzymspaltung, Säulenfiltration durch ein Gel,
Differenzdichten-Zentrifugation in einer Sucroselösung, Dialyse, Differenzdichten-Zentrifugation
in einer Lösung von Cäsiumchlorid und einer Dialyse unterworfen wird. Das beschriebene
Verfahren ist sehr kostspielig und für die Reinigung von HB-Ag in großem Maßstab
nicht geeignet. Ferner wurde gefunden, daß das Antigen durch die proteolytische
Spaltung verändert werden kann. Darüber hinaus scheint es mit dem beschriebenen
Verfahren nicht möglich zu sein, die in dem Spenderblut vorkommenden an das HB-Ag
gebundenen größeren Teilchen abzutrennen.
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Es stellt sich somit die Aufgabe, ein zur Herstellung von Vakzine
in großem Maßstab geeignetes Hepatitis-B-Antigen sowie ein wirtschaftliches und
sicher reproduzierbares Verfahren zu seiner Herstellung zur Verfügung zu stellen.
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Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe bei einem Hepatitis-B-Oberflächenantigen
der eingangs genannten Art dadurch gelöst, daß entweder a) das Hepatitis-B-Antigen
hauptsächlich in Form von 27 bis 30nm großen Teilchen zugegen ist; b) die Masse
aus einem Gemisch von 27-30 nm großen Teilchen, Fäden und 40 nm großen Teilchen
von Hepatitis-B-Antigen besteht; oder c) die Masse hauptsächlich aus 20 nm großen
Teilchen von Hepatitis-B-Antigen besteht.
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Das Verfahren gemäß der Erfindung zur Herstellung von hochgereinigtem
Hepatitis-B-Antigen aus dieses Antigen enthaltendem flüssigem Blutmaterial durch
Entfernen praktisch aller Verunreinigungen aus diesem Material besteht darin, daß
der pH-Wert des Blutmaterials auf einen Wert im Bereich von etwa 4,4-4,7 eingestellt,
das Material sodann mit etwa 4,0 bis 4,5 Gew.-% Polyäthylenglykol, bezogen auf das
Gesamtgewicht der Mischung, vermischt, der gebildete, Hepatitis-B-Antigen enthaltende
Niederschlag abgetrennt und ihm eine solche Menge Wasser zugesetzt wird, daß ein
flüssiges Zwischenprodukt erhalten wird, dessen Hepatitis-B-Antigen-Konzentration
im wesentlichen die gleiche wie diejenige des ursprünglichen Blutmaterials ist,
der pH-Wert des flüssigen Zwischenproduktes auf einen Wert im Bereich von etwa 4,9-5,1
eingestellt und dadurch ein Niederschlag, der proteinhaltiges Material und Polyäthylenglykol
enthält, sowie eine flüssige Phase, die Hepatitis-B-Antigen enthält, gebildet, die
flüssige Phase abgetrennt, auf einen pH-Wert im Bereich von etwa 4,4-4,7 eingestellt,
mit etwa 4,0-4,5 Gew.-% Polyäthylenglykol, bezogen auf das Gesamtgewicht der Mischung,
vermischt und der gebildete Niederschlag, der gereinigtes Hepatitis-B-Antigen enthält,
abgetrennt wird.
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Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen
angegeben.
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Durch das Verfahren der Erfindung werden die Nachteile der vorstehend
gewürdigten bekannten Verfahren vermieden. Zweckmäßigerweise wird die Fällung mit
PEG bei einem ph-Wert im Bereich von 4,4 bis 4,7 bei einer Temperatur im Bereich
von 0-8 OC ausgeführt. Der das gereinigte HB-Ag enthaltende Niederschlag kann weiter
durch Adsorption der Protein-Verunreinigungen an Hydroxyapatit und isopyknische
Bandentrennung sowie durch Zonen-
Ultrazentrifugation zur Trennung
der morphologischen Formen des Antigens gereinigt werden. Die letztgenannten Verfahrensmaßnahmen
sind zwar, wie oben ausgeführt, recht kostspielig, doch ergibt die doppelte Fällung
mit Polyäthylenglykol ein schon weitgehend vorgereinigtes Material, so daß die der
Ultrazentrifuge zuzuführende Gesamtmenge an Material je Einheit der gewonnenen relativ
nicht infektiösen kugelförmigen Teilchen von 20 nm Durchmesser wesentlich geringer
als die bei dem von Prince beschriebenen Verfahren ist und infolgedessen auch die
Herstellungskosten erheblich geringer sind.
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Wie erfindungsgemäß gefunden wurde, kann das gereinigte HB-Ag in drei
verschiedene Fraktionen getrennt werden, von denen jede reich an einem der drei
verschiedenen morphologischen Formen der HB-Ag-Teilchen ist. Hierzu wird eine Menge
einer wäßrigen Flüssigkeit, die eine wesentliche Konzentration von gereinigtem HB-Ag
enthält, einer Hydroxyapatit-Chromatographiesäule aufgegeben, die Säule sodann mit
einem dreifach abgestuften Laufmittel eluiert und das aus der Säule ablaufende Eluat
in mindestens drei verschiedenen Portionen getrennt aufgefangen. Die Anforderungen
an die Zonen-Ultrazentrifugation werden dadurch wesentlich verringert, und sie kann
möglicherweise ganz weggelassen werden.
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Anhand der Zeichnungen wird eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung
näher beschrieben. Es zeigen: Fig. 1 eine graphische Darstellung der Ergebnisse
von mit Hilfe der Celluloseacetat-Elektrophorese ausgeführten Bestimmungen des Protein-Gehalts
von Materialien nach verschiedenen Stufen der Polyäthylenglykol-Fällung gemäß der
Erfindung; Fig. 2 eine graphische Darstellung der Ergebnisse der isopyknischen
Bandentrennung
gemäß der Erfindung; Fig. 3 eine graphische Darstellung der Ergebnisse der Zonen-Ultrazentrifugation
gemäß der Erfindung; Fig. 4, Mikroaufnahmen der nach der Zonen-Ultrazentrifugation
5 u. 6 erhaltenen Produkte; und Fig. 7 eine graphische Darstellung der Ergebnisse
der Säulenchromatographie.
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Gemäß der Erfindung wird gereinigtes HB-Ag quantitativ aus flüssigem
Blutmaterial, wie Blutplasma oder -serum, das das Antigen enthält, mit Hilfe eines
zweistufigen Fällungsverfahrens unter Verwendung von Polyäthylenglykol (PEG) gewonnen.
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Es wurde gefunden, daß PEG mit einem Molekulargewicht im Bereich von
300 bis 100.000 geeignet ist. Eine ausgeprägte Verbesserung läßt sich erreichen,
wenn das PEG ein Molekulargewicht von mindestens 600 und höchstens 20000 hat. Die
besten Ergebnisse werden mit einem PEG erhalten, dessen Molekulargewicht im Bereich
zwischen 1500 und 20000, beispielsweise um 6000, liegt.
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In der Regel wird bevorzugt, das Verfahren mit einem PEG auszuführen,
dessen Molekulargewicht in einem eng begrenzten Bereich liegt, d.h. aus Molekülen
besteht, deren Molekulargewicht im Vergleich zu dem oben angegebenen Gesamtbereich
in einem eng begrenzten Bereich liegt. Manchmal ist es jedoch auch möglich, mit
PEG-Mischungen von ganz verschiedenem Molekulargewicht zu arbeiten.
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Eine weitere Reinigung läßt sich durch Adsorption der Protein-Verunreinigungen
an Hydroxyapatit erzielen, wobei man entweder chargenweise oder nach den Methoden
der Säulenchromatographie arbeitet. Bei der Säulenchromatographie werden die HB-Ag-Teilchen
in
drei verschiedene Grundgesamtheiten getrennt. Durch die PEG-Fällung mit nachfolgender
Adsorption an Hydroxyapatit kann eine Verringerung des Probenvolumens von 1:1000
erhalten werden.
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Schließlich können die restlichen Protein-Verunreinigungen mit Hilfe
konventioneller Methoden der isopyknischen Bandentrennung, Zonen-Ultrazentrifugation
und Ausschlußchromatographie an Sepharose 4B entfernt werden.
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Bei der PEG-Fällung des HB-Ag werden 96% der Plasmaproteinverunreinigungen
entfernt. Durch die (satzweise) Adsorption von Protein-Verunreinigungen an Hydroxyapatit
werden weitere 90% Protein-Verunreinigungen entfernt, wobei über 50% des ursprünglichen
HB-Ag in der überstehenden Flüssigkeit verbleiben. Nach der isopyknischen Bandentrennung
und der Zonen-Ultrazentrifugation ist das Produkt frei von allen Plasmaprotein-Verunreinigungen.
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Nach dem vorstehend angegebenen Verfahren wurde HB-Ag aus 8 1 Schimpansenplasma
sowie aus 2- und 5-Liter-Chargen Humanplasma abgetrennt und gereinigt, wobei die
Brauchbarkeit des Verfahrens sich bestätigte. Bei der Säulenchromatographie mit
Hydroxyapatit wurde gefunden, daß das HB-Ag in drei verschiedene Grundgesamtheiten
von Teilchen getrennt werden kann: 1. in eine Fraktion, die hauptsächlich 27 bis
30 nm große Teilchen enthält; 2. in eine Fraktion, die aus einem Gemisch von 27
bis 30 nm großen Teilchen, Fäden und 40nm großen Teilchen besteht; und 3. in eine
Fraktion, die hauptsächlich 20 nm große Teilchen enthält.
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REINIGUNG DES HEPATITIS-P-ANTIGENS DURCH FÄLLUNG MIT POLYÄTHYLEN-GLYKOL,
CHARGENWEISE ADSORPTION AN HYDROXYAPATIT, ISOPYKNISCHE BANDENTRENNUNG UND ZONEN-ULTRAZENTRIFUGATION
A. Fällung des Hepatitis-B-Antigens mit Polyäthylenglykol De Rizzo und Mitarbeiter,
a.a.o. haben ein Verfahren zur Reinigung
von HB-Ag beschrieben,
bei dem Polyäthylenglykol verwendet wird. Mehrfache Nacharbeitungen des von de Rizzo
und Mitarbeiter angegebenen Verfahrens ergaben nur eine zweifache Reinigung des
HB-Ag. Nach dem folgenden verbesserten Verfahren werden 96% der Plasmaproteine entfernt,
und es wird praktisch das gesamte HB-Ag quantitativ gewonnen.
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1. Als Ausgangsmaterial für die Reinigung wurde eine ganze Einheit
(240 ml) HB-Ag-enthaltendes Plasma verwendet.
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2. Das Plasma wurde bei Raumtemperatur durch Zusatz von 1,0-n Salzsäure
auf einen pH-Wert im Bereich von etwa 4,4 bis 4,7 (optimal 4,6) eingestellt, und
ein sich bildender Niederschlag wurde durch Zentrifugieren entfernt.
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3. Zu der überstehenden Flüssigkeit aus dem Schritt 2 wurde tropfenweise
eine 30%ige Lösung von PEG 6000 in destilliertem Wasser zugesetzt, bis eine 2%ige
Konzentration erreicht war; dann wurde das erhaltene Gemisch über Nacht im Kühlschrank
bei einer Temperatur von etwa 0 bis 8 OC stehengelassen, um die Protein-Verunreinigungen
einschließlich Fibrinogen auszufällen. Die überstehende Flüssigkeit wurde durch
Zentrifugieren geklärt. In diesem Zusammenhang sei darauf hingewiesen, daß der Zusatz
einer jeden wesentlichen Menge von PEG eine gewisse Menge Proteine einschließlich
Fibrinogen ausfällt. Infolgedessen gibt es im Grunde keine untere Grenze für die
zuzusetzende PEG-Menge. Da es andererseits Zweck der Erfindung ist, Verunreinigungen
von dem HB-Ag abzutrennen, muß die Gegenwart von Antigen in dem Niederschlag dieses
Verfahrensschrittes vermieden werden, und daher liegt die obere Grenze für die PEG-Konzentration
unmittelbar unterhalb der Konzentration, bei der wesentliche Mengen Antigen zusammen
mit der Fibrinogen-Fraktion
ausgefällt werden. In der Praxis wurde
gefunden, daß eine Konzentration von 3,0 Gew.-t PEG wesentliche Mengen Antigen zusammen
mit der unerwünschten Fibrinogen-Fraktion ausfällt, daß eine Konzentration von 2,5
Gew.-% PEG die höchste Konzentration ist, die toleriert werden kann, und daß eine
Konzentration von etwa 2,0 Gew.-% Polyäthylenglykol optimale Ergebnisse liefert.
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4. Der bei dem Verfahrensschritt 3 nach dem Zentrifugieren erhaltene
Niederschlag wurde verworfen, und die PEG-Konzentration der überstehenden Flüssigkeit
auf einen Wert im Bereich von etwa 4,0 bis 4,5 Gew.-% eingestellt. Danach wurde
die überstehende Flüssigkeit erneut über Nacht im Kühlschrank bei einer Temperatur
von etwa 0 bis 8 OC stehengelassen. In der Praxis kann es möglich sein, bei diesem
Verfahrens schritt PEG-Konzentrationen bis zu 8,0 Gew.-% anzuwenden, doch vergrößert
eine Erhöhung der PEG-Konzentration auch das Risiko, zusammen mit dem Antigen ß-
und ;-Globuline und Albumine auszufällen. In diesem Zusammenhang sei darauf hingewiesen,
daß bei Raumtemperatur höhere Konzentrationen von Polyäthylenglykol vorzuziehen
oder gar erforderlich sind, bei Temperaturen von 0 bis 8 OC aber eine Konzentration
von 4,0 bis 4,5 Gew.-% Polyäthylenglykol am zweckmäßigsten ist.
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5. Der bei dem Verfahrensschritt 4 erhaltene Niederschlag wurde durch
Zentrifugieren verdichtet und dann erneut in etwa 200 ml destilliertem Wasser suspendiert,
um eine Mischung mit etwa dem gleichen Volumen- wie das Originalplasma zu erhalten.
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6. Aus der Suspension des Verfahrensschrittes 5 wurde die Hauptmenge
des PEG und eine kleine Menge Proteine nach dem Einstellen der Suspension durch
tropfenweisen Zusatz von 1 ,0-n Natronlauge auf einen pH-Wert im Bereich von etwa
4,9 bis 5,1
(optimal 5,0) durch Zentrifugieren entfernt. Bei dem
Einstellen des pH-Wertes erscheint in der Regel eine weiße Trübung.
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7. Die klare überstehende Flüssigkeit aus dem Verfahrensschritt 6
wurde durch tropfenweisen Zusatz von 1,0-n Salzsäure auf einen pH-Wert von etwa
4,4 bis 4,7 (optimal 4,6) eingestellt und mit PEG versetzt, bis eine Endkonzentration
von etwa 4,0 bis 4,5 Gew.-% erreicht war. Das Material wurde erneut über Nacht im
Kühlschrank bei etwa 0 bis 8 OC stehengelassen und dann zentrifugiert. Die Bemerkungen
im Zusammenhang mit dem Verfahrensschritt 4 gelten hier entsprechend.
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8. Der bei dem Verfahrensschritt 7 erhaltene Niederschlag, der das
Antigen enthielt, wurde zur Herstellung einer Mischung, die etwa das halbe Volumen
des ursprünglichen Plasmas hatte, erneut in 100 ml destilliertem Wasser suspendiert.
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Der Erfolg der vorstehend beschriebenen Reinigung kann in Fig.1 verfolgt
werden, die die Ergebnisse der Proteinverteilung bei der Celluloseacetat-Elektrophorese
nach jedem Reinigungsschritt wiedergibt.
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In Fig. 1 stellt die Linie 1 die Protein-Franktionen dar, die in dem
ursprünglichen, das HB-Ag enthaltenden Plasma, das ein typisches Plasmaprotein-Verteilungsbild
zeigt, vorkommen.
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Linie 2 bezieht sich auf die überstehende Flüssigkeit nach der Einstellung
des pH-Wertes auf 4,6 (Verfahrensschritt 2) und zeigt Verluste im Fibrinogen- und
g 1-Protein-Bereich. Die Linie 3 zeigt, daß eine weitere Verminderung der Verunreinigungen
(insbesondere Fibrinogen) durch die Fällung mit 2% PEG (Verfahrensschritt 3) erzielt
wird. Die Linie 4 läßt erkennen, daß aus der ersten überstehenden Flüssigkeit mit
4,0 bis 4,5% PEG (Verfahrensschritt 4) eine große Menge Protein entfernt
worden
ist. Die Linie 5 zeigt, daß der erneut suspendierte HB-Ag-Niederschlag (Verfahrensschritt
5) immer noch eine verhältnismäßig große Menge von Protein-Verunreinigungen enthält,
und Linie 6 macht deutlich, daß die Proteinverteilung sich nach der Ausfällung der
Hauptmenge des PEG bei einem pH-Wert von etwa 5,0 (Verfahrensschritt 6) sich nicht
wesentlich geändert hat. Bei der zweiten Fällung mit 4,0 bis 4,5% PEG (Verfahrensschritt
7) sind, wie aus der Linie 7 hervorgeht, erhebliche Mengen von Verunreinigungen
aus der überstehenden Flüssigkeit entfernt worden. Aus der Linie 8 ergibt sich,
daß der Endniederschlag von HB-Ag (bei zweifacher Konzentration) einen Hauptpeak
nur im OL 2-Bereich und zwei kleinere Peaks im Albumin- und Fibrinogen-Bereich aufweist
(Verfahrensschritt 8).
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Die Ergebnisse der vorstehend beschriebenen Reinigungsschritte sind
in Tabelle 1 zusammengefaßt, aus der folgendes ersichtlich ist: 1. In den Vorreinigungsstufen
(Verfahrensschritte 2, 3 und 4) werden 16% der verunreinigenden Proteine ohne HB-Ag-Verluste
entfernt; 2. die erste Fällung mit 4,0 bis 4,5 % PEG (Verfahrensschritt 5) ergibt
eine vierfache Reinigung; und 3. die zweite Fällung mit 4,0 bis 4,5 % PEG (Verfahrensschritt
8) ergibt eine mehr als 24-fache Gesamtreinigung des HB-Ag.
TABELLE
1 REINIGUNG DES HB-Ag MIT PEG 6000 VERFAHRENS- MATERIAL VOLUMEN PROTEIN %ORIGINAL-
HB-Ag-TITER (CEP) SCHRITT (ml) (g) PROTEIN 1 Plasma 240 14,2 100 256-512 2 Plasma
(pH 4,6) 140 13,2 93 256-512 3 2% PEG enthaltende 250 12,0 84 256-512 überstehende
Flüssigkeit 4 4,5% PEG 270 8,2 58 0 5 Niederschlag mit 200 3,6 25 256-512 4,5% PEG
6 Niederschag mit 200 3,4 24 256-512 4,5% PEG bei pH 5,0 7 4,5% PEG enthaltende
230 2,4 18 2-4 überstehende Flüssigkeit 8 Niederschlag mit 100 0,5 3,6 512-1024
4,5 PEG
Die Faktoren, die zu diesen verbesserten Ergebnissen beigetragen
haben, sind: 1. Die Anwendung von zwei aufeinanderfolgenden Fällungsstufen bei einer
PEG-Konzentration von etwa 4,0 bis 4,5 Gew.- und einer Zwischenstufe, bei der der
pH-Wert leicht auf etwa 5,0 erhöht wurde, um bestimmte Verunreinigungen auszufällen,
führte zu einer nahezu quantitativen Gewinnung des Antigens; 2. die Anwendung von
zwei Vorreinigungsschritten trug ebenfalls zur Entfernung störender Plasmaprotein-Verunreinigungen
bei; 3. die Titration mit konzentrierten PEG-Lösungen statt des Zusatzes von festem
PEG führte zur besseren Beherrschung der Reinigungsbedingungen; und 4. durch die
Erniedrigung der Temperatur nach jedem PEG-Zusatz waren für die selektive und quantitative
Fällung des HB-Ag niedrigere PEG-Konzentrationen ausreichend.
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B. Reinung des Hepatitis-B-Antigens mit Hydroxyapatit Das nach der
vorstehend beschriebenen Arbeitsweise durch Fällung mit PEG erhaltene Hepatitis-B-Antigen
wurde mit Hydroxyapatit weiter gereinigt. Da bei einer Säulenchromatographie über
Hydroxyapatit die Durchflußmengen sehr gering sind, wurde eine Chargenarbeitsweise
bevorzugt. Zu dem Produkt des vorstehend beschriebenen Verfahrensschrittes 8 wurden
weitere 100 ml destilliertes Wasser zugesetzt, so daß eine Charge erhalten wurde,
die aus etwa 200 ml Blutflüssigkeitsmaterial bestand, etwa 500 mg Protein enthielt
und einen HB-Ag-Titer von 256-512 (CEP) hatte. Der pH-Wert der Charge wurde durch
Zusatz von 10 ml eines 0,5-m Phosphatpuffer auf 6,8 eingestellt.
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Die Lösung wurde mit 150 ml verdichtetem Hydroxyapatit-Sediment vermischt
und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde dann 2 Minuten bei
2000 U/min (in einer Sorvall-Zentrifuge) zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit
wurde abgezogen. Das Sediment wurde zweimal mit 100 ml einer 0,02-m Phosphatpuffer-Lösung
mit einem pH-Wert von 6,8 gewaschen.
Die überstehende Flüssigkeit
und die Waschflüssigkeiten wurden vereinigt und durch Ultrafiltration konzentriert.
Das Volumen des Konzentrats wurde mit einer 0,02-m Phosphatpuffer-Lösung, die 0,02%
Natriumazid enthielt, auf 12 ml eingestellt.
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Das gewaschene Sediment des Hydroxyapatits wurde 2 mal mit 100 ml
einer O,1-m Phosphatpuffer-Lösung mit einem pH Wert von 6,8 und 2 mal mit 100 ml
einer 0,2-m Pufferlösung eluiert.
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Die Eluate wurden vereinigt und durch Ultrafiltration konzentriert.
Der Puffer wurde gegen eine 0,02-m Phosphatlösung mit einem pH-Wert von 6,8 ausgetauscht.
Abschließend wurde die Charge mit einer 0,02-m Pufferlösung, die 0,02% Natriumazid
enthielt, auf 12 ml eingestellt.
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Die Protein-Konzentration wurde durch Messung der optischen Dichte
bei 280 nm (E = 1,42) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben.
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TABELLE 2 Protein Gesamt-Probe Volumen O.D. 280 nm mg/ml Protein
Überstehende Flüssig- 12 ml 1662 4,7 56 mg keit und Waschflüs- (lOfache sigkeiten
Verd.) 0,1- bis 0,2-m 12 ml 2,455 17,3 208 mg Phosphat-Eluat (1 Ofache Verd.) Die
Antigen-Aktivität wurde in CEP gemessen und ist in Tabelle 3 wiedergegeben.
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TABELLE 3 Gesamt Probe Volumen Protein HB-Ag-Titer HB-Ag-enthaltendes
Ausgangsmaterial für die Hydroxyapatit-Adsorption 200 ml 500 mg 256- 512 Uberstehende
Flüssigkeit und Waschflüssigkeiten 12 ml 56 mg 1024-2048 0,1- bis 0,2-m Phosphat-Eluat
12 ml 208 mg 1024-2048 Die vorstehend wiedergegebenen Resultate zeigen, daß etwa
50% des HB-Ag und nur etwa 10% des Gesamtproteins von dem Hydroxyapatit ausgeschieden
wurden.
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C. Isopyknische Bandentrennung eines aus Hydroxyapatit ausgeschiedenen
HB-Ag-Präparates Eine Probe des durch PEG-Fällung und Adsorption von Protein-Verunreinigungen
an Hydroxyapatit (wie oben beschrieben) gereinigeen HB-Ag wurde durch isopyknische
Bandentrennung weiter gereinigt. Eine Probe von 12 ml, die 56 mg Protein enthielt
und einen HB-Ag-Titer (CEP) von 1024-2048 hatte, wurde durch Ultrafiltration auf
3,0 ml eingeengt. Die Lösung wurde zu gleichen Teilen auf 3 Röhrchen aufgeteilt,
die CsCl-Lösungen mit linearem Dichtegefälle enthielten, und 24 Stunden bei 35000
U/min in einer Spinco-Ultrazentrifuge mit einem Rotor SW 65 zentrifugiert. Von der
aus dem Boden abtropfenden Flüssigkeit wurden Fraktionen von je 10 Tropfen aufgefangen.
In den Fraktionen wurde nach Verdünnung mit 0,5 ml eines 0,05-m Tris-Puffers mit
einem pH-Wert von 7,5 der Proteingehalt bestimmt, in dem bei 280 nm die optische
Dichte und mit Hilfe
von CEP-Methoden die Antigen-Aktivität gemessen
wurden. Die Ergebnisse der Bestimmung des Proteingehalts (optische Dichte bei 280
nm) und der HB-Ag-Aktivität (CEP) sowie die CsCl-Dichte sind in Fig. 2 wiedergegeben.
Die Proben aus dem Spitzenbereich der Antigen-Aktivität (Fraktionen 18 bis 28) wurden
vereinigt, dialysiert und auf ein Volumen von 3 ml konzentriert.
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Aus den in Fig. 2 dargestellten Ergebnissen geht hervor, daß die meisten
Protein-Verunreinigungen mit hoher Dichte (erster Peak der optischen Dichten) durch
die Adsorption an Hydroxyapatit entfernt worden waren.
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D. Zonen-Ultrazentrifugation in Sucrose-Lösung mit Dichtegefälle Die
durch PEG-Fällung, Behandlung mit Hydroxyapatit und isopyknische Bandentrennung
erhaltene Probe wurde weiter durch Zonen-Ultrazentrifugation gereinigt. Eine Sucrose-Lösung
mit linearem Dichtegefälle wurde durch Mischen von je 14,5 ml von Lösungen hergestellt,
die 25 und 10 Gew.-% Sucrose in 0,02-m Phosphat-Lösung mit einem pH-Wert von 7,6
sowie 0,02 Gew.-% Natriumazid enthielten. Die Probe wurde auf drei aliquote Teile
von 1 ml aufgeteilt und 18 Stunden bei 23000 U/min zentrifugiert. Von der aus dem
Boden abtropfenden Flüssigkeit wurden Fraktionen von je etwa 0,5 ml aufgefangen.
In den Proben wurden die Proteine durch Messen der optischen Dichte bei 280 nm und
die Antigen-Aktivität nach der CEP- und RIA-Methode bestimmt.
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Die Ergebnisse der Bestimmungen sind in Fig. 3 wiedergegeben.
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Das der Fig. 3 zugrunde liegende Eluat wurde zu 7 Fraktionen vereinigt,
die dialysiert und konzentriert wurden. Es wurde nur eine kleine Menge niedermolekularer
Verunreinigungen (zwei kleine Peaks in der optischen Dichte) gefunden, die deutlich
von dem großen HB-Ag-Peak getrennt waren (Fig. 3).
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Die konzentrierten Fraktionen wurden weiter mit Hilfe der Immunelektrophorese
analysiert.
Die vereinigten Fraktionen I-IV ergaben keine Serumprotein-Verunreinigungen bei
der Prüfung mit Antiserum auf Humanserum-Proteine.
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Bei einer Untersuchung der Fraktionen I-IV unter dem Elektronenmikroskop
wurden bei der Fraktion I (Fig. 4) hauptsächlich kurze Fäden, in der Fraktion II
(Fig. 5) hauptsächlich runde Teilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von
27 nm, in der Fraktion III (Fig. 6) hauptsächlich Teilchen mit einer Größe von 20
nm und in der Fraktion IV (nicht wiedergegeben) Teilchen mit einer Größe von 20
nm und kleiner gefunden.
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Das Ergebnis der Gesamtreinigung kann der Tabelle IV entnommen werden.
Aus ihr ist ersichtlich, daß die PEG-Fällung eine mehr als 24fache Reinigung des
HB-Ag bei einer Gewinnung von 83% der ursprünglichen Aktivität ergab. Durch die
Behandlung mit Hydroxyapatit wurde das HB-Ag in zwei Fraktionen getrennt. Die bei
der Adsorption an Hydroxyapatit überstehende Flüssigkeit, die 40% der ursprünglichen
HB-Ag-Aktivität enthielt, wurde weiter durch isopyknische Bandentrennung und Zonen-Ultrazentrifugation
gereinigt. Die bei dem letztgenannten Verfahrensschritt erhaltenen Fraktionen wurden,
wie in Fig. 3 angegeben, vereinigt und zu eingehenden analytischen Untersuchungen
herangezogen. Diese Fraktionen enthielten keine durch eine empfindliche Immunelektrophorese
feststellbare normale Serumprotein-Verunreinigungen. Ferner stellen sie eine 400-
bis 1200-fache Reinigung des HB-Ag dar und enthalten 43% der Ausgangsaktivität.
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Wie aus den Fig. 4 bis 6 ersichtlich, enthält die Fraktion I hauptsächlich
kurze Fäden, die Fraktion II hauptsächlich sphärische Teilchen von 27 nm Durchmesser
und die Fraktion III typische Kugeln von 20 nm Durchmesser.
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TABELLE 4 ERGEBNISSE DES REINIGUNGSVERFAHRENS VERFAHRENS- PROBE VOLUMEN
GESAMT TITER SPEZIFISCHE %AUSBEUTE SCHRITT PROTEIN (CEP) AKTIVITÄT EINHEITEN/MG
Original-Plasma 240 ml 14,2 g1) 256-512 4,3-8,6 I 1. PEG-Niederschlag 200 ml 3,6
g1) 256-512 14-28 II 2. PEG-Niederschlag 100 ml 0,5 g1) 512-1024 102-104 III Hydroxyapatit-
12 ml 56 mg²) 1024-2048 205-410 überstehende Flüssigkeit Hydroxyapatit-Eluat 12
ml 208 mg²) 1024-2048 51-102 IV Isopyknische Banden- 16,3 mg²) 225-450 trennung
der über- 3 ml 43,0 mg²) 3200-6400 600-1200 stehenden Flüssigkeit von der Hydroxyapatit-Behandlung
V Zonen-Ultrazentrifugation Fraktion I 3 ml 1,063) 640-1280 1800-3600 Fraktion II
2,5 ml 1,933) 1280 1600 Fraktion III 3 ml 6,843) 6400-12800 2800-5600 Fraktion IV
3 ml 0,453) 800 5300 1) nach Kjelldahl 2) E 1cm = 1,42 3) E 1 cm = 3,73 0,1% 0,1%
E.
Reinigung von Hepatitis-B-Antigen in großem Maßstab mit Hilfe der Hydroxyapatit-
Chromato graphie Hepatitis-B-Antigen aus 8 1 Schimpansenplasma (Typ ad), 5 1 Humanplasma
(Typ adx) und 2 1 Humanplasma (Typ ayx) wurde gereinigt. Das Reinigungsverfahren
bestand aus einer zweifachen Fällung mit Polyäthylenglykol gemäß dem vorstehend
beschriebenen Verfahren mit nachfolgender Säulenchromatographie über Hydroxyapatit.
Die Ergebnisse der Reinigung des Schimpansen-Antigens werden nachstehend als Beispiel
wiedergegeben.
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a. Polyäthylenglykol-Fällung 800 ml Blutplasma wurden gemäß dem vorstehend
beschriebenen Verfahren mit PEG gefällt. Alle Arbeitsbedingungen mit Ausnahme der
Materialmengen und der Herkunft des ursprünglichen Plasmas waren identisch. Die
Ergebnisse des Verfahrens sind in der nachstehenden Tabelle 5 aufgeführt.
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TABELLE 5 Beispiel Volumen HB-Ag-Titer Protein (CEP) (mg/ml) Original-Plasma
8000 ml 1:500 55 2. PEG-Fällung 250 ml 1:10.000 52 Es wurde also in bezug auf das
HB-Ag eine 20fache Reinigung erzielt.
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b. Säulenchromatographie Eine aliquote Probe (50 ml) des in Wasser
suspendierten 2.PEG-Niederschlages wurde einer 500-ml-Säule aus Hydroxyapatit aufgegeben,
die
dann jeweils mit 1 1 eines dreifach abgestuften Laufmittels aus 0,02-m, 0,05-m und
0,1-m Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert 6,8 eluiert wurde. Aufgefangen wurden
Fraktionen von 10 ml. In dem Eluat wurde das HB-Ag nach der CEP-Methode und das
Protein durch Messung der optischen Dichte bei 280 nm bestimmt. Die Ergebnisse sind
in Fig. 7 wiedergegeben.
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Die Peakfraktionen des Eluats nach Fig. 7 wurden vereinigt, durch
Ultrafiltration konzentriert und erneut analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle
6 zusammengestellt. Eine Elektronenmikroskopie der ersten Peakfraktion des HB-Ag
ergab hauptsächlich 25 bis 30 nm große Teilchen, während die Peakfraktion II Teilchen
unterschiedlicher Größe einschließlich langer Fäden sowie 40 nm großer Teilchen
und die Peakfraktion III hauptsächlich 20 nm große Teilchen enthielten.
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TABELLE 6 Optische Dichte Gesamtbei Protein Protein Probe Volumen
HB-Ag (CEP) Verdünnung 20 nm mg/ml mg Fraktion I (Röhrchen 1-85) 4 ml 10000 1:10
2,26 15,7 62,7 Fraktion II (Röhrchen 85-100) 6 ml 10000 1:10 2,079 14,6 87,8 Fraktion
III (Röhrchen 101-120) 5 ml 10000 1:100 0,526 37,0 185,2 Fraktion IV (Röhrchen 121-150)
6 ml 800 1:10 2,620 18,5 110,7 Fraktion V (Röhrchen 151-186) 6 ml 800 1:10 1,730
12,2 73,1 Fraktion VI (Röhrchen 187-210) 10 ml 50000 1:100 1,407 99,1 991,0 Fraktion
VII Röhrchen 211-240) 7 ml 12000 1:100 0,691 48,7 340,6
Aus vorstehendem
ist klar ersichtlich, daß die Säulenchromatographie über Hydroxyapatit einem zweifachen
Zweck dient: 1. Der Entfernung großer Mengen von Protein-Verunreinigungen; und 2.
der Abtrennung von drei verschiedenen Grundgesamtheiten von HB-Ag-Teilchen.
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L e e r s e i t e