DE2440926C3

DE2440926C3 - Injizierbarer inaktivierter Impfstoff gegen Hepatitis B und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE2440926C3
Application number: DE2440926A
Authority: DE
Inventors: Tsunekazu Kobe Fukushima; Satoshi Katano Funakoshi; Toshihiko Kyoto Tanaka
Original assignee: Green Cross Corp Japan
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1974-01-28
Filing date: 1974-08-27
Publication date: 1978-11-30
Also published as: FR2258864B1; DE2440926B2; DE2440926A1; GB1462298A; FR2258864A1; CA1023662A; JPS50105817A; CH617350A5; JPS5523254B2

Description

30

Es wird angenommen, daß HB-Ag (Hepatitis-B-Antigen) ein Virus oder ein virusähnliches Gebilde ist, das beim Menschen Serumhepatitis hervorruft Plasma-HB-Ag gehört elektrophoretisch zu den «- oder 0-Globulen und ist bei einer Plasmafraktionierung nach üblichen Verfahren in den meisten Fraktionen verteilt

Um die Infektiosität von HB-Ag zu beseitigen, wird HB-Ag enthaltendes humanes Plasmaprotein einer Hitzebehandlung unterworfen. Im allgemeinen wird ein Plasmaalbuminpräparat 10 Stunden auf 6O⁰C erhitzt Bei der Verabreichung derartiger Präparate läßt sich jedoch die Bildung von HB-Ag (Hepatitis-B-Antikörper) im Blut nicht beobachten. Offenbar bleibt auch die Antigenität nicht intakt Da Gewebekulturen von HB-Ag bisher nicht erfolgreich durchgeführt werden konnten, stand kein Verfahren zur Herstellung von konzentrierten Impfstoffen gegen Virushepatitis B zur Verfügung.

In der US-PS 37 37 004 ist die Herstellung eines inaktivierten Impfstoffs gegen Virushepatitis B durch 1-bis 3minütiges Erhitzen auf höchstens 98° C eines verdünnten Serums beschrieben, das an Hepatitis B erkrankten Patienten entnommen worden war. Durch intramuskuläre Verabfolgung dieses Impfstoffs soll das Auftreten von Virushepatitis B verhindert und bei bereits hervorgerufener Hepatitis der Krankheitsverlauf gemildert werden. Im allgemeinen wird jedoch auch die Antigenität bei der Hitzeinaktivierung herabgesetzt Zur besseren Prophylaxe und Therapie von Virushepatitis B besteht daher ein Bedarf an einem inaktivierten HB-Ag-Impfstoff mit hoher Antigenität und geringer oder fehlender Infektiosität, der Menschen in großen Dosen verabfolgt werden kann.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, einen durch Erhitzen einer wäßrigen Lösung von HB-Ag enthaltendem humanem Plasmaprotein erhaltenen inaktivierten HB-Ag-Impfstoff mit hoher Antigenität zu schaffen, der zur Prophylaxe und Therapie von Virushepatitis B beim Menschen eingesetzt werden kann. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem überraschenden Befund, daß beim Erhitzen der wäßrigen Lösung des Plasmaproteins in Gegenwart von Harnstoff oder Guanidin bzw. Guanidin-hydrochlorid die Antigenität von HB-Ag gesteigert wird, wodurch sich bei der Verabfolgung der Lösung an Menschen eine starke Antikörperbildung ergibt.

Die Erfindung betrifft somit den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Der Impfstoff kann intramuskulär, subcutan oder intracutan gegeben werden.

Eine wäßrige Pufferlösung mit 1% (Gewicht/Volumen) humanem Plasmaprotein und einem HB-Ag-Titer von 1 · 8, gemessen durch gekreuzte Immunelektrophorese (im folgenden als I ES-Verfahren bezeichnet; vgl. Shojiro Nakumura, Electrophoretic Experimental Methods, S. 287, verlegt bei Bunko-do, 1963), wird durch Lösen der λ- und jS-Globulinfraktionen von humanem Plasma in 0,06-m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,6 hergestellt Teile dieser Lösung werden bis zu einer Konzentration von 2-m bzw. 6-m mit Harnstoff und bis zu einer Konzentration von 2-m mit Guanidin versetzt Diese Lösungen werden jeweils auf Temperaturen von 60 bis 120°C erhitzt. Die Abhängigkeit des HB-Ag-Titers von der Erhitzungsdauer ist in Tabelle I angegeben.

Tabelle I

Lösung

Tempe- HB-Ag- HB-Ag-Titer*) ratur Titer vor

dem Zeit (Minuten)

Erhitzen (⁰C) 1 3

10

Zeit (Stunden) 1 3 6

10

24

Phosphatpuffer 60 8x 8x 8x 8x 8x

80 8 χ 8x 8 χ 8 χ 8 χ

100 8x 8x 8x 8x 4x

120 8x 8x 8x 4x 2x

8x
8x
2x
Ix

8x
4x
2x
0

8x
4x
Ix
0

4x
2x
0
0

Lösung mit	60	8x	8x	8x	8x	8x	8x	8x	8 χ	8x'i	16x
2-m Harnstoff	80	8x	8x	8x	8x	8x	J16x	16x	16x	16 χ	16x
	100	8x	8x	8x	8x	! 16x I	16 χ	16x	16x	—	—

Fortsetzung

Lösung

Tempe- HB-Ag- HB-Ag-Titer*) ratur Titer vor

dem Zeit (Minuten)

Erhitzen (⁰C) 1 3

10

30

Zeit (Stunden) 1 3 6

10

24

Lösung mit
6-m Harnstoff

100

120

8x
8x
8x
8x

8x 8x _8x J16x"

8 χ 8 χ 8_x Jx^ 8.x J 16 χ 8 χ

'32x~~"l6x 16 χ 16 χ 8 χ

16x 16x 16x - -

16x 16x 16x 16x 8x O O

8_x_j^r16"x"

Lösung mit
2-m Guanidin

100

8x
8x
8x

8x 8x 8x 8x_ 8x! 16x 16x 8x

^8x _r J¹Jl-j^ri6 x " ίδχ ~Τβ"χ" 16 χ 8 χ 8 χ

8x il6x 16x

8x 16x 16x

8x

Die zu untersuchenden Lösungen wurden nacheinander jeweils auf das doppelte Volumen verdünnt

*) Als Maß des HB-Ag-Titers wird der Wert für die maximale Verdünnung der Lösung angegeben, bei der sich HB-Ag nach dem IES-Verfahren noch nachweisen IaBL

**) bedeutet, daß keine Messung durchgeführt wurde.

Die gestrichelte Linie gibt die Grenze für die Erhitzungszeiten und Erhitzungstemperaturen an, bei denen sich der HB-Ag-Titer erhöht

Aus der Tabelle geht hervor, daß bei Verwendung einer 2- bis 8molaren Harnstofflösung oder einer 2molaren Guanidinlösung ein Anstieg des HB-Ag-Titers der Lösung erhalten wird. Dies ist überraschend, da der HB-Ag-Titer in der Regel beim Erhitzen abnimmt, wie auch bei der Lösung zu ersehen ist, die nicht mit Harnstoff oder Guanidin versetzt ist Beispielsweise ergibt sich bei der 6-m Harnstofflösung ein Anstieg des HB-Ag-Titers nach 10 Stunden bei 6O⁰C, 30 Minuten bei 8O⁰C, 10 Minuten bei 100⁰C bzw. 3 Minuten bei 120⁰C Es besteht eine Tendenz, daß der auf diese Weise erhöhte HB-Ag-Titer lange Zeit erhalten bleibt und anschließend abfällt. Da die Infektiosität mit Zunahme der Erhitzungsdauer abnimmt und da die zur Erhöhung des HB-Ag-Titers notwendige minimale Erhitzungsdauer länger ist als die Zeit, dies bisher zur Beseitigung der Infektionsität angewendet wurde, ist es nach den erfindungsgemäßen Verfahren möglich, einen HB-Ag-Impfstoff zu erhalten, der im Vergleich zu den nach herkömmlichen Verfahren erhaltenen Impfstoffen eine stärkere Antigenität und eine geringere Infektiosität aufweist

Der Mechanismus für den Anstieg des HB-Ag-Titers, der sich beim erfindungsgemäßen Verfahren erreichen läßt, ist noch nicht genau geklärt Es wird jedoch angenommen, daß Harnstoff oder Guanidin mit dem HB-Ag unter Modifikation der multidimensionalen Struktur des Proteinmoleküls reagieren, wobei mehr antigen wirkende Zentren freigesetzt werden.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Harnstofflösung einer Konzentration von 2- bis 8m, vorzugsweise 6- bis 8m, oder eine 2molare Guanidinlösung eingesetzt Bei relativ niedrigen Konzentrationen sind längere Zeiten bis zum Erreichen des erhöhten HB-Ag-Titers erforderlich, der dann aber länger anhält

Im erfindungsgemäßen Verfahren können nicht nur HB-Ag enthaltende humane Plasmaproteine verwendet werden, die beim Menschen Virushepatitis B hervorrufen, sondern auch alle anderen Proteine, in denen sich HB-Ag nach dem IES-Verfahren oder radioimmunologisch (im folgenden als RIA-Verfahren bezeichnet; vgl. ShigeshiToyoshimaetal,»PediatricClinic«[Japan], Bd. 24 [19711 S. 3044) nachweisen läßt Es können also Plasma, Serum und verschiedene durch übliche Verfahren zur Plasmafraktionierung erhaltene Proteinfraktionen von an Virushepatitis B erkrankten Spendern verwendet werden.

Wie elektronenmikroskopisch festgestellt wurde, ist HB-Ag von unterschiedlicher Gestalt und Größe. Ebenso hängt aus.h die Infektiosität spezifisch von der jeweiligen HB-Ag enthaltenden Plasmaproteinfraktion ab. Beispielsweise weist eine Fibrinogenfraktion trotz ihres geringen HB-Ag-Gehalts, gemessen nach dem RIA-Verfahren, eine deutlich höhere Hepatitis-B-Infektiosität auf als andere Plasmaproteinfraktionen. Dies ist vermutlich der Tatsache zuzuschreiben, daß die Fibrinogenfraktion stark infektiöse Teilchen enthält. Die nach dem RIA-Verfahren bestimmte HB-Ag-Men~ ge in einer Albuminfraktion entspricht zumindest der in der Fibrinogenfraktion enthaltenden Menge, während ihre Infektiosität so gering ist, daß sie kaum ausreicht, Virushepatitis B zu verursachen, wenn das Präparat 10 Stunden auf 60° C erhitzt wird. Andererseits enthalten ac- und 0-Globulinfraktionen mehr HB-Ag als die Albuminfraktion. Demgemäß ist die HB-Ag-Menge, die sich in aus diesen Fraktionen fraktionierten Transferrin- und Haptoglobulimpräparaten nachweisen läßt, höher als im Albuminpräparat Werden diese Transferrin- und Haptoglobulinpräparate jedoch der gleichen Hitzebehandlung wie das Albuminpräparat unterzogen, so verursachen sie beim Menschen keine Virushepatitis B. Es ist daher anzunehmen, daß das in diesen <x- und /?-Globulinfraktionen enthaltene HB-Ag nur eine geringe Infektiosität aufweist.

Im Verfahren der Erfindung werden als Ausgangsmaterialien vorzugsweise humanes Plasma und Serum eingesetzt, die große Mengen an HB-Ag enthalten, insbesondere «- und /3-Globulinfraktionen, die große HB-Ag-Mengen enthalten und eine niedrige Infektiosität aufweisen. Diese Fraktionen werden zweckmäßigerweise als Neben- und Unterfraktionen bei der Gewinnung anderer wertvoller Plasmaproteinfraktionen erhalten. Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Plasmaproteinfraktionen werden nach üblichen Verfahren zur Fraktionierung von Plasmaproteinen erhalten, beispielsweise durch Fällung mit Ammoniumsulfat oder durch Fraktionierung mit Äthanol in der Kälte nach C ο h η ; vgl. E. J. Cohn, L E Strong, W. L. Hughes, D. J. Mulford, J. N. Ashworth.M. Melin und H. L. T a y 1 ο r, Journal of

the American Chemical Society, Bd. 68 (1946), S. 459. Beispielsweise werden die <x- und /3-Globulinfraktionen als Fraktionen IV und IV-I nach der Cohnschen Fraktionierung oder durch Fällung mit Aiiimoniumsulfat bei 35- bis 50prozentiger Sättigung erhalten. Falls die wäßrigen Lösungen der Proteinfraktionen trübe sind, können sie zur Erleichterung der weiteren Verarbeitung geklärt werden. Die Klärung wird beispielsweise durch Zentrifugation oder durch Erhitzen der Lösung auf 60⁰C bei neutralem pH-Wert und anschließendes Abfiltrieren der entstandenen Niederschläge durchgeführt

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das HB-Ag enthaltende Ausgangsmaterial in einem wäßrigen Medium in Gegenwart von Harnstoff oder Guanidin erhitzt.

Beispiele für wäßrige Medien sind Wasser und physiologisch verträgliche wäßrige Salzlösungen, insbesondere physiologische Kochsalzlösung. Der pH-Wert der zu erhitzenden Lösung liegt vorzugsweise im Neutralbereich und wird auf einem Wert von 5 bis 9, vorzugsweise 6,5 bis 7,5, gehalten. Zur Aufrechterhaltung des pH-Werts wird vorzugsweise ein Puffer verwendet Als Puffersubstanzen eignen sich anorganische Salze, wie Phosphate und Carbonate, oder organische Salze, wie Acetate, Trisaminomethan-hydrochlorid und Glykoll-hydrochlorid.

Die Lösungen werden auf Temperaturen von 60 bis 120⁰C erhitzt Die Erhitzungszeit hängt von der Erhitzungstemperatur ab. In jedem Fall wird die Erhitzungszeit so gewählt, daß sie ausreicht um die Infektiosität zu beseitigen und die durch den HB-Ag-Titer wiedergegebene antigene Wirkung zu erhöhen. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Erhitzungsdauer gegenüber den bekannten Verfahren verlängert werden. Demgemäß kann bei Verwendung von Harnstoff oder Guanidin in niedrigen Konzentrationen die übliche Erhitzungsdauer von 10 Stunden bei 6O⁰C, die bisher beispielsweise bei der Hitzebehandlung von Albuminfraktionen und α- und /8-Globulinfraktionen angewendet wurden, auf mehr als 24 Stunden bei 100⁰C verlängert werden. Eine herkömmliche Erhitzungsdauer von 3 Minuten kann auf Zeiträume von 30 Minuten bis mehr als 6 Stunden ausgedehnt werden. Bei der Verwendung von Harnstoff oder Guanidin in hohen Konzentrationen können herkömmliche Erhitzungszeiten von 3 Minuten bei 100° C auf 10 Minuten bis mehr als 6 Stunden verlängert werden. Auch bei anderen Temperaturen lassen sich die herkömmlichen Erhitzungszeiten verlängern, so daß die Infektiosität gesenkt so und die Antigenität gesteigert wird. Wenn innerhalb des Bereichs der so verlängerten Erhitzungszeiten (bei verschiedenen Temperaturen) eine relativ kurze Erhitzungszeit gewählt wird, bei der die Infektiosität beseitigt und die Antigenität gesteigert wird, läßt sich ein HB-Ag-Impfstoff erhalten, dessen Infektiosität nicht höher liegt als die von herkömmlichen Präparaten, und dessen Antigenität, ausgedrückt durch den HB-Ag-Titer, höher als vor dem Erhitzen ist. Andererseits kann bei der Wahl relativ langer Erhitzungszeiten innerhalb des vorerwähnten Zeitraums ein inaktivierter HB-Ag-Impfstoff erhalten werden, dessen Antigenität gesteigert und dessen Infektiositäi wesentlich gesenkt oder vollkommen beseitigt ist.

Nach der Hitzebehandlung wird die Lösung gegebe- b5 nenfalls durch Filtrieren geklärt und anschließend gegen eine isotonische Lösung, beispielsweise eine isotonische Kochsalzlösung, dialysiert. um Stabilisatoren, Puffersalze und entstandene niedermolekulare Substanzen zu entfernen. Durch Dialyse unter vermindertem Druck gemäß einem üblichen Verfahren kann die Lösung gleichzeitig mit der Entfernung der vorgenannten Verbindungen eingeengt werden. Die so erhaltene Impfstofflösung wird auf eine geeignete Konzentration eingestellt und anschließend der Sterilfiltration unterworfen.

Der erfindungsgemäße HB-Ag-Impfstoff weist im Vergleich zu herkömmlichen Präparaten die gleiche oder eine höhere HB-Ag-Antigenkapazität auf und ist bei seiner Anwendung beim Menschen sicherer.

Der Vorteil des erfindungsgemäßen HB-Ag-Präparates liegt nicht nur in seiner starken antigenen Wirkung, sonera auch in seiner starken Antikörperbildung nach Verabfolgung an den Menschen. Werden beispielsweise durch 1- bis 3minütiges Erhitzen des gleichen Ausgangsmaterials auf 98° C ein Präparat nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und ein Präparat nach einem herkömmlichen Verfahren hergestellt, die beide in bezug auf ihren HB-Ag-Titer identisch sind, und werden diese Präparate intramuskulär verabfolgt, so ist die Antikörpermenge, die sich im Serum des Patienten mit dem erfindungsgemäß hergestellten Präparat bildet erheblich größer als die Menge bei einem Patienten, der mit dem herkömmlichen Präparat behandelt worden ist Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich also ein HB-Ag-Impfstoff erhalten, der in seiner Antikörperbildung aktiviert ist Dies bedeutet im Zusammenhang mit der Steigerung des HB-Ag-Titers durch Erhitzen, daß es gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung des gleichen Ausgangsmaterials möglich ist ein Präparat herzustellen, das eine wesentlich höhere Antikörperbildung als ein herkömmlich hergestelltes Präparat aufweist

Die Beispiele erläutern die Erfindung. In den Beispielen ist der HB-Ag-Filter durch die maximale Verdünnung der zu untersuchenden Lösung, bei der sich HB-Ag nach dem I ES-Verfahren noch nachweisen läßt angegeben. Das HB-Ag enthaltende Serum wird jeweils auf das doppelte Volumen verdünnt Der HB-Ag-Titer wird als maximale Verdünnung des Serums angegeben, bei der sich HB-Ag nach dem I ES-Verfahren unter Verwendung eines Standardserums, dessen HB-Ag-Titer 1 χ ist noch nachweisen läßt.

Beispiel i

100 ml Sammelplasma mit einem HB-Ag-Titer von 1 :8 werden nach dem Chonschen Verfahren mit Äthanol fraktioniert Die Fraktion IV-I wird mit Phosphatpuffer auf den pH-Wert 7,6 eingestellt und anschließend 10 Minuten auf 100° C erhitzt Nach dem Entfernen des entstandenen Niederschlags erhält man eine klare Lösung mit einem HB-Ag-Titer von 1:16. 180 ml dieser Lösung werden mit Harnstoff bis zu einer Konzentration von 6-m versetzt und anschließend 1 Stunde auf 85°C erhitzt wobei sich der HB-Ag-Titer der Lösung auf 1 :32 erhöht. Anschließend wird die Lösung unter vermindertem Druck gegen eine isotonische Kochsalzlösung dialysiert wobei die Phosphate und der Harnstoff entfernt werden. Sodann wird die Lösung durch ein Sterilfilter filtriert. Man erhält 80 ml einer injizierbaren Lösung.

B e i s ρ i e ! 2

10 Liter Sammelplasma mit einem HB-Ag-Titer von 1 :4 werden einer üblichen Ammoniumsuifatfällung unterworfen. Die bei einer 30- bis 50prozentigen

Animoniumsulfatsättigung erhaltenen α- und /J-Globulinfraktionen werden gegen Wasser dialysiert. Nach dem Entfernen des entstandenen Niederschlags erhall man eine klare wäßrige Lösung mit einem HB-Ag-Titer von 1 :64. 500 ml dieser Lösung werden bis zu einer Konzentration von 2-m mit Harnstoff versetzt und anschließend 1 Stunde auf 105⁰C erhitzt, wobei sich der HB-Ag-Titer auf 1 : 128 erhöht. Anschließend wird die Lösung zur Entfernung des Harnstoffs gegen eine isotonische Kochsalzlösung dialysiert. Nach dem Abfiltrieren der entstandenen Niederschläge wird durch Ultrafiltration eine Konzentration bis zu einem HB-Ag-Titer von I : 2048 erreicht. Sodann wird die Lösung durch ein Sterilfilter filtriert. Man erhält 21 ml eines injizierbaren Präparats in isotonischer Kochsalzlösung.

Beispiel 3

1000 ml Sammelplasma mit einem HB-Ag-Titer von 1 :4 werden gemäß dem Cohnschen Verfahren fraktioniert. Die Fraktion IV-I wird gegen Wasser dialysiert und anschließend 1 Stunde zur Ausfällung unerwünschter Proteine auf 6O⁰C erhitzt. Nach dem Entfernen der entstandenen Niederschläge durch Zentrifugation wird zu dem erhaltenen Überstand von 100 ml Volumen eine konzentrierte Ammoniumsulfatlösung gegeben, bis eine 50prozentige Ammoniumsulfatsättigung erreicht ist. Anschließend wird 30 Minuten gerührt, wodurch die Fällung vervollständigt wird. Die entstandenen Niederschläge werden abzentrifugiert und anschließend in einer geringen Menge Wasser gelöst. Die erhaltene Lösung wird gegen einen Natriumchlorid enthaltenden isotonischen Phosphatpuffer vom pH-Wert 7.2 diaiysiert. Man erhält 20 ml einer Lösung mit einem HB-Ag-Titer von 1 : 125. Diese Lösung wird bis zu einer Konzentration von 2-m mit Guanidinhydrochlorid versetzt und anschließend 20 Minuten auf 100⁰C erhitzt, wodurch sich der HB-Ag-Titer auf 1 : 250 erhöht. Die in der Lösung entstandenen geringen Mengen eines Niederschlags werden ab7entrifugiert. Die Lösung wird durch ein Sterilfilter filtriert. Man erhält 20 m! einer injizierbaren Lösung.

Beispiel 4

Die in Beispiel 2 hergestellte klare wäßrige Lösung mit einem HB-Ag-Titer von 1 :64 wird 30 Minuten auf 100°C erhitzt. Die erhaltene Lösung mit einem HB-Ag-Titer von 1 :16 wird gemäß Beispiel 1 eingeengt. Man erhält eine Lösung mit einem HB-Ag-Titer von 1 :2048. Diese Lösung (im folgenden als »nicht aktivierter Impfstoff« bezeichnet) und die gemäß Beispiel 2 erhaltene Präparatlösung mit einem HB-Ag-Titer von 1 : 2048 (im folgenden als »aktivierter Impfstoff« bezeichnet) werden analog dem Anwendungsschema für Freundschen komplettes Adjuvans zur Immunisierung von Kaninchen durch Injektion verwendet. 3 Wochen lang werden jedem Kaninchen pro Woche 0,5 ml Impfstoff sub- und intrakutan verabfolgt. Sodann wird die Behandlung für einen Monat unterbrochen. Anschließend werden nochmals 3 Injektionen in der vorbeschriebenen Weise vorgenommen. 1 Woche nach der letzten Injektion wird Blut aus dem Herz der Kaninchen zur Gewinnung eines Antiserums entnommen. Das Antiserum wird mit humanem Normalserum, das kein HB-Ag enthält adsorbiert, um ein spezifisches Antiserum gegen HB-Ag herzustellen. Von den Antiseren. die aus 8 mit dem nicht aktivierten Impfstoff immunisierten Kaninchen stammen, weist eines einen HB-Ak-Titer von 1 : 8, drei einen Titer von 1 :4, drei einen Tiler von 1 :2 und eines keinen meßbaren Titer auf. Der Durchschnittswert beträgt 1 :3,3. Von den zehn mit dem aktivierten Impfstoff immunisierten Kaninchen zeigen fünf Antiseren einen HB-Ak-Titer von 1:16, drei einen Titer von 1 : 8, eines einen Titer von 1 :2 und eines einen Titer von 1. Der Durchschnittswert beträgt 1 : 10,7. Dies zeigt, daß bei

m Immunisierung von Kaninchen mit aktivierten bzw. nichtaktivierten Impfstoff, die in bezug auf ihren HB-Ag-Titer gleichwertig sind, der Antikörpertiter der mit dem aktivierten Impfstoff immunisierten Kaninchen etwa dreimal so groß ist wie der Antikörpertiter, der mit

r; dem nichtaktivierten Impfstoff immunisierten Kaninchen. Wird außerdem der zweifache Anstieg im HB-Ag-Titer des aktivierten Präparats berücksichtigt, der auf den Zusatz von Harnstoff oder Guanidin zurückzuführen ist, so ist die Antikörperbildung des aktivierten Impfstoffs etwa sechsmal größer als die des nicht aktivierten Impfstoffs.

Die Wirkung des Impfstoffs wird durch folgenden klinischen Versuchsbericht erläutert.

Versuch 1

Jeweils 0,05 ml eines gemäß Beispiel 2 hergestellten Hepatitis-B-Impfstoffes mit einem HB-Ag-Titer von 1 :64, bestimmt nach der Methode der gekreuzten

in Immunelektrophorese (IES-Verfahren), werden subcutan 5 männlichen freiwilligen Probanden (25 bis 60 Jahre alt; Krankenhauspersonal einer Plasmafraktionier- und -Sammelabteilung) mit HB-Ag und HB-Ab negativem Serum injiziert. Der HB-Ag-Titer wird durch den

i) Radioimmuntest, der HB-Ab-Titer durch den passiven Hämagglutinationstest bestimmt. 30 Tage nach der Impfung werden von den Probanden Serumproben entnommen. Sämtliche 5 Probanden sind HB-Ag negativ, während sie in allen Fällen HB-Ab positiv sind.

4Ii Der Titer im passiven Hämagglutinationstest beträgt 1 :32, 1 :256, 1 :4096, 1 : 16 384 und 1 :32 768. Bei sämtlichen Probanden sind die SGOT- und SGPT-Werte normal.

Versuch 2

An 108 bis 165 männlichen Probanden aus Krankenhauspersonal einer Plasmafraktionier- und -sammelabteilung, die nicht geimpft wurden, wird während eines Zeitraumes von 3 Jahren der HB-Ag-Titer, der w HB-Ab-Titer und die Leberfunktion untersucht. Bei 5 bis 8% ist das Serum HB-Ag positiv, bei 20 bis 38% ist es HB-Ab positiv und bei 1 bis 4% der Fälle liegt der Wert für SGOT und/oder SGPT oberhalb 100.

Bei 3 Personen wurde während des Zeitraumes von 3 Jahren eine Hepatitis diagnostiziert. Von diesen 3 Patienten waren 2 Patienten HB-Ag positiv und ein Patient HB-Ag und HB-Ab negativ.

Die SGOT- und SGPT-Werte wurden nach Karin e η u. Mitarb, J. Clin. Invest., Bd. 34 (1955), S. 126 und bo Proc. Soc. Exp. Biol. Med, Bd. 91 (1956), S. 196 bestimmt Aus den Ergebnissen ergibt sich folgendes Bild:

Bei den geimpften Versuchspersonen wurde kein HB-Ag-Träger gefunden;

nach der Impfung wurde ein relativ hoher Prozentsaz der Personen HB-Ab positiv.

Bei den HB-Ab positiven Personen war das Risiko des Auftretens einer Hepatitis signifikant geringer.

Claims

Patentansprüche:

1. Durch Erhitzen einer wäßrigen Lösung von Hepatitis-B-Antigen enthaltendem humanen Piasmaprotein auf Temperataren von 60 bis 120⁰C hergestellter injizierbarer inaktivierter Impfstoff gegen Hepatitis B, dadurch gekennzeichnet, daß er durch Erhitzen der Lösung in Gegenwart von Harnstoff einer Konzentration von 2- bis 8molar oder Guanidin einer Konzentration von 2molar in einem pH-Bereich von etwa 5 bis 9 und anschließendes Entfernen des Harnstoffs bzw. Guanidins hergestellt worden ist

2. Verfahren zur Herstellung eines injizierbaren inaktivierten Impfstoffes gegen Hepatitis B nach Anspruch 1 durch Erhitzen einer wäßrigen Lösung von Hepatitis-B-Antigen enthaltendem humanen Plasmaprotein auf Temperaturen von 60 bis 120⁰C, dadurch gekennzeichnet, daß das Erhitzen der Lösung in Gegenwart von Harnstoff einer Konzentration von 2- bis 8molar oder Guanidin einer Konzentration von 2molar in einem pH-Bereich von etwa 5 bis 9 durchgeführt wird und anschließend Harnstoff bzw. Guanidin entfernt werden.