CH617350A5

CH617350A5 - Process for the preparation of HB-Ag vaccines with high-level antibody formation

Info

Publication number: CH617350A5
Application number: CH1636974A
Authority: CH
Inventors: Satoshi Funakoshi; Tsunekazu Fukushima; Toshihiko Tanaka
Original assignee: Green Cross Corp
Priority date: 1974-01-28
Filing date: 1974-12-10
Publication date: 1980-05-30
Also published as: JPS50105817A; CA1023662A; FR2258864A1; DE2440926B2; JPS5523254B2; GB1462298A; DE2440926C3; FR2258864B1; DE2440926A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von HB-Ag-(Hepatitis B-Antigen)-Vaccinen.

Es wird angenommen, dass HB-Ag ein Virus oder ein virusähnliches Gebilde ist, das beim Menschen Hepatitis hervorruft. Plasma-HB-Ag gehört elektrophoretisch zu den a- oder ^-Globulinen und ist bei einer Plasmafraktionierung nach üblichen Verfahren in den meisten Fraktionen verteilt.

Um dem HB-Ag seine Infektivität zu nehmen, wird eine Hitzebehandlung durchgeführt. Im allgemeinen wird ein Plasma-Albuminpräparat 10 Stunden bei 60° C einer Hitzebehandlung unterworfen, um nach Verabreichung an den Menschen das Auftreten von Hepatitis zu verhindern. Bei der Verabreichung derartiger Präparate lässt sich jedoch die Bildung von HB-Ab (Antikörper zu HB-Ag) im Blut nicht beobachten. Da Gewebekulturen von HB-Ag bisher nicht erfolgreich durchgeführt werden konnten, stand kein Verfahren zur Herstellung von konzentrierten Vaccinen zur Verfügung.

In der US-PS 3 735 004 wird die Herstellung eines inaktivierten Vaccins durch 1- bis 3minütiges Sieden (1- bis 3minü-tige Behandlung bei 98° C) eines von einem Hepatitispatienten entnommenen, verdünnten Serums beschrieben. Durch intramuskuläre Verabfolgung dieses Vaccins wird das Auftreten von Hepatitis verhindert, und auch bei bereits hervorgerufener Hepatitis wird der Krankheitsverlauf gemildert. Im allgemei-s nen wird jedoch die antigene Wirkung durch Erhitzen vermindert. Für eine bessere Prophylaxe und Therapie von Hepatitis besteht daher ein Bedarf nach inaktivierten Vaccinen mit einer stärkeren antigenen Wirkung und einer geringeren Infektivität, die in grossen Dosen verabfolgt werden können.

io Aufgabe der Erfindung ist es somit, HB-Ag-Vaccine mit starker Antikörperbildung zur Verfügung zu stellen, deren Infektivität durch Hitzebehandlung auf ein Minimum gesenkt ist.

Die Erfindung beruht auf dem überraschenden Befund, dass beim Erhitzen einer wässerigen Lösung von HB-Ag in 15 Gegenwart von Harnstoff oder Guanidin bzw. Guanidinhy-drochlorid infolge irreversibler Entfaltung des Eiweisses durch Spaltung von Disulfidbrücken die antigene Wirkung von HB-Ag gesteigert wird, wodurch sich bei Verabfolgung der Lösung an Menschen eine starke Antikörperbildung ergibt. 20 Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von entfalteten HB-Ag-Vaccinen mit starker Antikörperbildung, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine wässerige Lösung von HB-Ag enthaltendem Plasmaprotein in Gegenwart einer Verbindung, wie Harnstoff oder Guanidinhy-25 drochlorid, eine ausreichende Zeit auf Temperaturen von 60 bis 120° C erhitzt, wodurch die Disulfidbrücken des Eiweisses gespalten werden und dadurch die Infektivität des HB-Ag verlorengeht und dessen antigene Wirkung erhöht wird, die entfaltend wirkende Verbindung entfernt und die Lösung in eine 30 physiologisch verträgliche Form bringt.

Eine wässerige Pufferlösung mit 1 Prozent (Gewicht/Volumen) menschlichem Plasmaprotein und einem HB-Ag-Titer von 8x, gemässen durch gekreuzte Immunelektrophorese (im folgenden als IES-Verfahren bezeichnet; vgl. Shojiro Nakamu-35 ra: Electrophoretic Expérimental Method, [1963], S. 287, erschienen bei Bunko-do) wird durch Lösen der a- und/3-Globu-linfraktionen von menschlichem Plasma in 0,06 Mol/1 Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,6 hergestellt. Teile dieser Lösung werden bis zu einer Konzentration von 2 Mol/1 bzw. 6 Mol/1 40 mit Harnstoff und bis zu einer Konzentration von 2 Mol/1 mit Guanidin versetzt. Diese Lösungen werden jeweils auf Temperaturen von 60 bis 120° C erhitzt. Die Abhängigkeit des HB-Ag-Titers von der Erhitzungsdauer ist in Tabelle I angegeben.

Aus der Tabelle geht hervor, dass sich durch Zusatz von 45 Harnstoff oder Guanidin ein Anstieg des HB-Ag-Titers der Lösung ergibt. Dies ist überraschend, da der HB-Ag-Titer in der Regel beim Erhitzen abnimmt, wie auch bei der Lösung zu ersehen ist, die nicht mit Harnstoff oder Guanidin versetzt ist. Beispielsweise ergibt sich bei der 6 Mol/1 Harnstofflösung ein so Anstieg des HB-Ag-Titers nach 10 Stunden bei 60° C, 30 Minuten bei 80° C, 10 Minuten bei 100° C bzw. 3 Minuten bei 120° C. Es besteht eine Tendenz, dass der auf diese Weise erhöhte HB-Ag-Titer lange Zeit erhalten bleibt und anschliessend abfällt. Da die Infektivität mit Zunahme der Erhitzungs-55 dauer abnimmt und da die zur Erhöhung des HB-Ag-Titers notwendige minimale Erhitzungszeit länger ist als die Zeit, die bisher zur Beseitigung der Infektivität angewendet wurde, ist es nach den erfindungsgemässen Verfahren möglich, ein Vaccin zu erhalten, das im Vergleich zu den Vaccinen her-60 kömmlicher Verfahren eine stärkere antigene Wirkung und eine geringere Infektivität aufweist.

Der Mechanismus für den Anstieg des HB-Ag-Titers, der sich beim erfindungsgemässen Verfahren erreichen lässt, wird dem Umstand zugeschrieben, dass das entfaltend wirkende 65 Mittel, wie Harnstoff oder Guanidin, mit dem HB-Ag reagiert und dessen Disulfid-Bindungen spaltet. Dadurch liegt das Protein ungefaltet vor, wodurch mehr antigenwirkende Zentren freigesetzt werden.

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Tabelle I

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Lösung Tempe- HB-Ag * HB-Ag-Titer ratur Titer vor Zeit

(°C) dem (Minuten) (Stunden)

Erhitzen 1 3 10 " 30 1 3 6 10 24

Phosphat

60

8x

4x

4x puffer

80

8x

4x

2x

100

8x

4x

2x

2x lx

0

120

8x

4x

2x lx

0

Lösung

60

8x

16x mit 2 Mol/1

80

8x

16x

Harnstoff

100

8x

16x

—

Lösung

60

8x

16x

8x mit 6 Mol/1

80

8x

16x

32x

16x

8x

Harnstoff

100

8x

16x

—

120

8x

16x

8x

0

Lösung

60

8x

16x

8x mit 2 Mol/1

80

8x

16x

8x

'8x

Guanidin

100

8x

16x

8x

16x

8x

0

Die zu untersuchenden Lösungen wurden nacheinander jeweils auf das doppelte Volumen verdünnt. * Als Mass des HB-Ag-Titers wird der Wert für die maximale Verdünnung der Lösung angegeben, bei der sich HB-Ag nach dem IES-Verfahren noch nachweisen lässt.

«—» bedeutet, dass keine Messung durchgeführt wurde. Die gestrichelte Linie gibt die Grenze für die Erhitzungszeiten und Erhitzungstemperaturen ab, bei denen sich der HB-Ag-Titer erhöht.

Als Denaturierungsmittel bzw. entfaltend wirkende Mittel werden erfindungsgemäss Verbindungen verwendet, die auf native Proteine, die aus Polypeptidketten bestehen, unter Einwirkung auf ionische oder andere schwache Bindungen entfaltend wirken. Besonders bevorzugt sind Harnstoff und Guani-dinhydrochlorid. Es ist bekannt, dass die Wirkung dieser entfaltend wirkenden Mittel eintritt, wenn sie in relativ hohen Konzentrationen eingesetzt werden. Im erfindungsgemässen Verfahren werden Konzentrationen von 2 bis 8 Mol/1 vorzugsweise 6 bis 8 Mol/1 eingesetzt. Bei relativ niedrigen Konzentrationen sind längere Zeiten bis zum Erreichen des erhöhten HB-Ag-Titers erforderlich, der dann aber länger anhält.

Unter menschlichen Plasmaproteinen, die im erfindungsgemässen Verfahren verwendet werden können, sind nicht nur solche zu verstehen, die HB-Ag enthalten, das tatsächlich Hepatitis beim Menschen hervorrufen kann, sondern auch alle anderen Proteine, in denen sich HB-Ag nach dem IES-Verfah-ren oder radioimmunologisch (im folgenden als RIA-Verfah-ren bezeichnet; vgl. Shigeshi Toyoshima et al., «Pediatrie Clinic», Bd. 24 [1971], S. 3044), nachweisen lässt. Es können also Plasma, Serum und verschiedene Proteinfraktionen, die sich durch übliche Fraktionierungsmethoden aus Plasmaprotein erhalten lassen, verwendet werden.

HB-Ag weist eine veränderliche Gestalt und Grösse auf, wie sich elektronenmikroskopisch feststellen liess. Die Infektivität von HB-Ag hängt spezifisch von der einzelnen Plasmaproteinfraktion ab, die HB-Ag enthält. Beispielsweise weist eine Fibrinogenfraktion trotz ihres geringen Gehalts an HB-Ag, bestimmt nach dem RIA-Verfahren, eine wesentlich höhere Hepatitis-Infektivität auf als andere Plasmaproteinfraktionen. Dies ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass die Fibrinogenfraktion stark infektiöse Teilchen enthält. Die nach dem RIA-Verfahren bestimmte HB-Ag-Menge in einer Albuminfraktion entspricht zumindest der in der Fibrinogenfraktion enthaltenen Menge, während ihre Infektivität so gering ist, dass sie kaum ausreicht, Hepatitis zu verursachen, wenn das Präparat 10 Stunden bei 60° C einer Hitzebehandlung unterzogen wird. Anderseits enthalten a- und /3-Globulinfrak-tionen mehr HB-Ag als die Albuminfraktion. Demgemäss ist die HB-Ag-Menge, die sich in aus diesen Fraktionen fraktionierten Transferrin- und Haptoglobinpräparaten nachweisen 30 lässt, höher als im Albuminpräparat. Werden diese Transferrin- und Haptoglobinpräparate jedoch der gleichen Hitzebehandlung wie das Albuminpräparat unterzogen, so verursachen sie beim Menschen keine Hepatitis. Es ist daher anzunehmen, dass das in diesen a- und ß-Globulinfraktionen enthaltene 35 HB-Ag eine niedrige Infektivität aufweist.

Im Verfahren der Erfindung werden als Ausgangsmaterialien vorzugsweise Plasma und Serum eingesetzt, die grosse Mengen an HB-Ag enthalten, insbesondere a- und /3-Globulinfraktionen, die grosse HB-Ag-Mengen enthalten und eine 40 niedrige Infektivität aufweisen. Diese Fraktionen werden zweckmässigerweise als Neben- und Unterfraktionen bei der Gewinnung anderer wertvoller Plasmaproteinfraktionen erhalten, Die im erfindungsgemässen Verfahren eingesetzten Plasmaproteinfraktionen werden nach üblichen Verfahren zur 45 Fraktionierung von Plasmaproteinen erhalten, beispielsweise durch Fällung mit Ammoniumsulfat oder durch Fraktionierung mit Äthanol in der Kälte nach Cohn; vgl. E. J. Cohn, L. E. Strong, W. L. Hughes, D. J. Mulford, J. N. Ashworth, M. Me-lin und H. L. Taylor, Journal of the American Chemical Socie-50 ty, Bd. 68 (1946), S. 459. Beispielsweise werden die a- und ß -Globulinfraktionen als Fraktionen IV und IV-1 nach der Cohnschen Fraktionierung oder durch Fällung mit Ammoniumsulfat zwischen 35 Prozent und 50 Prozent Sättigung erhalten. Falls eine wässerige Lösung der Proteinfraktion trüb 55 ist, kann sie zur Erleichterung der nachfolgenden Behandlung geklärt werden. Die Klärung wird beispielsweise durch Zentri-fugation oder durch Erhitzen der Lösung auf etwa 60° C bei neutralem pH-Wert und anschliessendem Abfiltrieren der gebildeten Niederschläge durchgeführt.

60 Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird das HB-Ag enthaltende Ausgangsmaterial in einem wässerigen Medium in Gegenwart des genannten entfaltend wirkenden Mittels erhitzt. Beispiele für wässerige Medien sind Wasser und physiologisch verträgliche wässerige Salzlösungen, 65 insbesondere physiologische Kochsalzlösung. Der pH-Wert der zu erhitzenden Lösung liegt zweckmässigerweise im Neutralbereich und wird auf einem Wert von 5 bis 9, vorzugsweise 6,5 bis 7,5, gehalten. Um die Lösung auf dem gewünschten pH-

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Wert zu halten, ist die Verwendung eines Puffers empfehlenswert. Es können anorganische Puffer, wie Phosphate und Carbonate, oder organische Puffer, wie Acetate, Trisaminome-thanhydrochlorid und Glycinhydrochlorid, verwendet werden.

Wie bereits erwähnt, werden die Lösungen auf Temperaturen von 60 bis 120° C erhitzt. Die Zeitdauer, während der die Lösung erhitzt wird, hängt von der Temperatur ab. Auf jeden Fall wird sie so gewählt, dass sie ausreicht, um die Infektivität zu beseitigen und die durch den HB-Ag-Titer wiedergegebene antigene Wirkung zu erhöhen. Nach dem erfindungsgemässen Verfahren kann die Erhitzungsdauer gegenüber den herkömmlichen Verfahren verlängert werden. Demgemäss kann bei Verwendung des entfaltend wirkenden Mittels in niedrigen Konzentrationen die übliche Erhitzungsdauer von 10 Stunden bei 60° C, die bisher beispielsweise bei der Hitzebehandlung von Albuminfraktionen und a- und ^-Globulinfraktionen angewendet wurde, auf mehr als 24 Stunden bei 100° C verlängert werden. Eine herkömmliche Erhitzungsdauer von 3 Minuten kann auf Zeiträume von 30 Minuten bis mehr als 6 Stunden ausgedehnt werden. Bei der Verwendung des entfaltend wirkenden Mittels in hohen Konzentrationen können herkömmliche Erhitzungszeiten von 3 Minuten bei 100° C auf 10 Minuten bis mehr als 6 Stunden verlängert werden. Auch bei anderen Temperaturen lassen sich die herkömmlichen Erhitzungszeiten verlängern, so dass die Infektivität gesenkt und die antigene Wirkung gesteigert wird. Wenn innerhalb des Bereichs der so verlängerten Erhitzungszeiten (bei verschiedenen Temperaturen) eine relativ kurze Erhitzungszeit gewählt wird, bei der die Infektivität beseitigt und die antigene Wirkung gesteigert wird, ist es möglich, ein Vaccin zu erhalten, dessen Infektivität nicht höher liegt als die von herkömmlichen Vaccinen und dessen antigene Wirkung, wiedergegeben durch den HB-Ag-Titer, höher als vor dem Erhitzen ist. Anderseits kann bei der Wahl relativ langer Erhitzungszeiten innerhalb des vorerwähnten Zeitraums inaktiviertes HB-Ag erhalten werden, dessen antigene Wirkung gesteigert und dessen Infektivität wesentlich gesenkt oder vollkommen beseitigt ist.

Nach der Hitzebehandlung wird die Lösung gegebenenfalls durch Filtrieren geklärt und anschliessend gegen eine isotonische Lösung, beispielsweise eine isotonische Kochsalzlösung, dialysiert, um Stabilisatoren, Puffersalze und gebildete niedermolekulare Substanzen zu entfernen, wodurch ein erfin-dungsgemässes Vaccin erhalten wird.

Durch Dialyse unter vermindertem Druck gemäss einem üblichen Verfahren kann die Lösung gleichzeitig mit der Entfernung der vorgenannten Verbindungen eingeengt werden. Das so erhaltene Vaccin wird auf eine geeignete Konzentration eingestellt. Nach Passieren eines Sterilfilters erhält man ein Vaccin, das zur Verabfolgung an Menschen geeignet ist.

Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten HB-Ag-Vaccine weisen im Vergleich zu herkömmlichen Vac-cinpräparaten die gleiche oder eine höhere HB-Ag-Antigen-kapazität auf und sind in ihrer Anwendung beim Menschen sicherer.

Der Vorteil der erfindungsgemäss hergestellten HB-Ag-Vaccine liegt nicht nur in ihrer starken antigenen Wirkung, sondern auch in ihrer starken Antikörperbildung nach Verabfolgung an den Menschen. Werden beispielsweise durch 1- bis 3minutiges Erhitzen des gleichen Ausgangsmaterials auf 98° C ein Vaccin nach dem erfindungsgemässen Verfahren und eine nach einem herkömmlichen Verfahren hergestellt, wobei beide Vaccine in bezug auf ihren HB-Ag-Titer identisch eingestellt sind, und werden diese Vaccine intramuskulär verabfolgt, so ist die Antikörpermenge, die sich im Serum des Patienten mit dem erfindungsgemäss hergestellten Vaccin einige Male grösser als die entsprechende Menge bei einem Patienten, der mit dem herkömmlichen Vaccin behandelt worden ist. Nach dem erfindungsgemässen Verfahren lassen sich also Vaccine erhalten, die in ihrer Antikörperbildung aktiviert sind. Dies bedeutet im Zusammenhang mit der Steigerung des HB-Ag-Titers durch Erhitzen, dass es gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren unter Verwendung des gleichen Aus-gangsmaterials möglich ist, ein Vaccin herzustellen, das eine wesentlich höhere Antikörperbildung als ein herkömmlich hergestelltes Vaccin aufweist.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. In den Beispielen ist der HB-Ag-Titer durch die maximale Verdünnung der zu untersuchenden Lösung, bei der sich HB-Ag nach dem IES-Ver-fahren noch nachweisen lässt, angegeben. Das HB-Ab enthaltende Serum wird jeweils auf das doppelte Volumen verdünnt. Der HB-Ab-Titer wird als maximale Verdünnung des Serums angegeben, bei der sich HB-Ab nach dem IES-Verfahren unter Verwendung eines Standardserums, dessen HB-Ag-Titer lx ist, noch nachweisen lässt.

Beispiel 1

100 ml gesammeltes Plasma mit einem HB-Ag-Titer von 8x werden nach dem Cohnschen Verfahren mit Äthanol fraktioniert. Die Fraktion IV-1 wird mit Phosphatpuffer auf den pH-Wert 7,6 gebracht und anschliessend 10 Minuten auf 100° C erhitzt. Nach dem Entfernen des gebildeten Niederschlags erhält man eine klare Lösung mit einem HB-Ag-Titer von 16x. 180 ml dieser Lösung werden mit Harnstoff bis zu einer Harnstoff-Konzentration von 6 Mol/1 versetzt und anschliessend 1 Stunde auf 85° C erhitzt, wobei sich der HB-Ag-Titer der Lösung auf 32x erhöht. Anschliessend wird die Lösung unter vermindertem Druck gegen eine isotonische Kochsalzlösung dialysiert, wobei die Phosphate und der Harnstoff entfernt werden. Sodann wird die Lösung durch ein Sterilfilter gegeben. Man erhält 80 ml einer injizierbaren Lösung.

Beispiel 2

10 Liter gesammeltes Plasma mit einem HB-Ag-Titer von 4x werden einer üblichen Ammoniumsulfatfällung unterworfen. Die zwischen einer 30- und 50prozentigen Ammoniumsulfatsättigung erhaltenen a- und/3-Globulinfraktionen werden gegen Wasser dialysiert. Nach dem Entfernen des gebildeten Niederschlags erhält man eine klare wässerige Lösung mit einem HB-Ag-Titer von 64x. 500 ml dieser Lösung werden bis zu einer Harnstoff-Konzentration von 2 Mol/1 mit Harnstoff versetzt und anschliessend 1 Stunde auf 105° C erhitzt, wobei sich der HB-Ag-Titer auf 128 x erhöht. Anschliessend wird die Lösung zur Entfernung des Harnstoffs gegen eine isotonische Kochsalzlösung dialysiert. Nach dem Abfiltrieren der gebildeten Niederschläge wird durch Ultrafiltration eine Konzentration bis zu einem HB-Ag-Titer von 2048 X erreicht. Sodann wird durch ein Sterilfilter gegeben. Man erhält 21 ml eines injizierbaren Vaccins in isotonischer Kochsalzlösung.

Beispiel 3

1000 ml gesammeltes Plasma mit einem HB-Ag-Titer von 4x werden gemäss dem Cohn'schen Verfahren fraktioniert. Die Fraktion IV-1 wird gegen Wasser dialysiert und anschliessend 1 Stunde zur Ausfällung unerwünschter Proteine auf 60° C erhitzt. Nach dem Entfernen der Niederschläge durch Zentrifugation wird zu dem erhaltenen Überstand von 100 ml Volumen eine konzentrierte Ammoniumsulfatlösung gegeben, bis eine 50prozentige Ammoniumsulfatsättigung erreicht ist. Anschliessend wird 30 Minuten gerührt, wodurch die Fällung vervollständigt wird. Die Niederschläge werden abzen-trifugiert und anschliessend in einer geringen Menge Wasser gelöst. Die erhaltene Lösung wird gegen einen Natriumchlorid enthaltenden isotonischen Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,2 dialysiert. Man erhält 20 ml einer Lösung mit einem HB-Ag-Titer von 125 x. Diese Lösung wird bis zu einer Guanidinhy-drochlorid-Konzentration von 2 Mol/1 mit Guanidinhydrochlo-

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rid versetzt und anschliessend 20 Minuten auf 100° C erhitzt, wodurch sich der HB-Ag-Titer auf 250x erhöht. Die in der Lösung gebildeten geringen Mengen eines Niederschlags werden abzentrifugiert. Nach Passieren eines Sterilfilters erhält man 20 ml einer injizierbaren Lösung.

Beispiel 4

Die in Beispiel 2 hergestellte klare wässerige Lösung mit einem HB-Ag-Titer von 64x wird 30 Minuten auf 100° C erhitzt. Die erhaltene antigene Lösung mit einem HB-Ag-Titer von 16x wird gemäss Beispiel 1 eingeengt. Man erhält eine Lösung mit einem HB-Ag-Titer von 2048 x. Diese Lösung (im folgenden als «nichtaktiviertes Vaccin» bezeichnet) und die gemäss Beispiel 2 erhaltene Vaccinelösung mit einem HB-Ag-Titer von 2048x (im folgenden als «aktivierte Vaccin» bezeichnet) werden in Verbindung mit dem Freundschen kompletten Adjuvans zur Immunisierung von Kaninchen durch Injektion verwendet. 3 Wochen lang werden jedem Kaninchen pro Woche 0,5 ml Vaccin sub- und intrakutan verabfolgt. Sodann wird die Behandlung für einen Monat unterbrochen. Anschliessend werden nochmals 3 Injektionen in der vorbeschriebenen Weise vorgenommen. 1 Woche nach der letzten Injektion wird Blut aus dem Herzen der Kaninchen zur Gewinnung eines Antiserums entnommen. Das Antiserum wird in einem

Serum, das kein HB-Ag enthält, absorbiert, um ein spezifisches Antiserum gegen HB-Ag herzustellen.

Von den Antiseren, die aus 8 mit dem nichtaktivierten Vaccin immunisierten Kaninchen stammen, weist eines ein 5 HB-Ab-Titer von 8x, drei einen Titer von 4x, drei einen Titer von 2x und eines keinen messbaren Titer auf. Der Durchschnittswert beträgt 3,3x. Von den zehn mit dem aktivierten Vaccin immunisierten Kaninchen zeigen fünf Antiseren einen HB-Ab-Titer von 16x, drei einen Titer von 8x, eines einen io Titer von 2 x und eines einen Titer von 1 x. Der Durchschnittswert beträgt 10,7 x. Dies zeigt, dass bei Immunisierung von Kaninchen mit aktiviertem bzw. nichtaktiviertem Vaccin, die in bezug auf ihren HB-Ag-Titer gleichwertig sind, die Masszahl der in mit dem aktivierten Vaccin immunisierten Kais ninchen gebildeten Antikörper-Titer etwa dreimal so gross ist wie die Masszahl der Antikörper-Titer, die in Kaninchen, die mit dem nichtaktivierten Vaccin immunisiert sind, gebildet werden. Wird ausserdem der zweifache Anstieg im HB-Ag-Ti-ter des aktivierten Vaccins berücksichtigt, der auf Zusatz von 20 Harnstoff oder einem entsprechenden auf Proteine entfaltend wirkenden Mittel zurückzuführen ist, so ist die Antikörperbildung des aktivierten Vaccins etwa sechsmal grösser als die des nichtaktivierten Vaccins.

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Claims

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1. Verfahren zur Herstellung von entfalteten HB-Ag-Vac-cinen mit starker Antikörperbildung, dadurch gekennzeichnet, dass man eine wässerige Lösung von HB-Ag enthaltendem Plasmaprotein in Gegenwart einer Verbindung, die die Disul-fidbrücken des Eiweisses zu spalten vermag, eine ausreichende Zeit auf Temperaturen von 60 bis 120° C erhitzt, wodurch die Disulfidbrücken des Eiweisses gespalten werden und dadurch die Infektivität des HB-Ag verlorengeht und dessen antigene Wirkung erhöht wird, die entfaltend wirkende Verbindung entfernt und die Lösung in eine physiologisch verträgliche Form bringt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als HB-Ag enthaltendes Plasmaprotein a- undß-Globulinfraktionen verwendet.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Erhitzen so lange durchführt, bis der Antigentiter ansteigt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine wässerige Lösung des HB-Ag enthaltenden Plasmaproteins mit einem pH-Wert von 5 bis 6 verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Lösung mit einem pH-Wert von etwa 7 verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man eine wässerige Lösung verwendet, deren pH-Wert mit einem Puffer eingestellt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Lösung verwendet, deren pH-Wert mit einem Phosphatpuffer eingestellt worden ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die entfaltend wirkende Verbindung in einer Konzentration von 2 bis 5 Mol/1 verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine wässerige Lösung des HB-Ag enthaltenden Plasmaproteins verwendet, die vorher geklärt worden ist.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die entfaltend wirkende Verbindung durch Dialyse der wässerigen Lösung gegen eine physiologisch verträgliche Lösung entfernt.

11. Verfahren nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet, dass man die Lösung durch Sterilfiltration in eine physiologisch verträgliche Form bringt.