DE2440926A1

DE2440926A1 - Hb-ag-vaccinen mit starker antikoerperbildung und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2440926A1
Application number: DE2440926A
Authority: DE
Inventors: Tsunekazu Fukushima; Satoshi Funakoshi; Toshihiko Tanaka
Original assignee: GREEN CROSS CORP; Green Cross Corp Japan
Current assignee: GREEN CROSS CORP; Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1974-01-28
Filing date: 1974-08-27
Publication date: 1975-07-31
Also published as: JPS50105817A; CA1023662A; CH617350A5; FR2258864A1; DE2440926B2; JPS5523254B2; GB1462298A; DE2440926C3; FR2258864B1

Description

" HB-Ag-Vaccinen mit starker Ahtikörperbildung und Verfahren zu ihrer Herstellung "

Priorität: 28. Januar 1974, Japan, Nr. 11 617/74

Die Erfindung betrifft HB-Ag-(Hepatitis B-Antigen)-Vaccinen und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

Es wird angenommen, daß HB-Ag ein Virus oder ein virusähnliches Gebilde ist, das beim Menschen Hepatitis hervorruft. Plasrna-HB-Ag gehört elektrophoretisch zu den α- oder ß-Globulincii und ist bei einer Plasmafraktionierung nach üblichen Verfahren in den meisten Fraktionen verteilt.

Um dem HB-Ag seine Infektivität zu nehmen, wird eine Hitzebehandlung durchgeführt. Im allgemeinen wird ein Plasma-Älbuminpräparat 10 Stunden bei 60°C einer Hitzebehandlung unterwor-

nach
fen, um / der Verabreichung an den Menschen das Auftreten von Heptatitis zu verhindern. Bei der Verabreichung derartiger Präparate läßt sich jedoch die Bildung von HB-Ab (Antikörper

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zu HB-Ag) im Blut nicht beobachten. Da Gewebekulturen von HB-Ag bisher nicht erfolgreich durchgeführt werden konnten, stand kein Verfahren zur Herstellung von konzentrierten Vaccinen zur Verfügung.

In der US-PS 3 735 004 wird die Herstellung einer inaktivierten Vaccine durch 1 bis 3-minütiges Sieden (1 bis 3-minütige Behandlung bei 98°C) eines von Hepatitispatienten entnommenen, verdünnten Serums beschrieben. Durch intramuskuläre Verabfolgung dieser Vaccine wird das Auftreten von Hepatitis verhindert und auch bei bereits hervorgerufener Hepatitis wird der Krankheitsverlauf gemildert. Im allgemeinen wird jedoch die antigene Wirkung durch Erhitzen vermindert. Für eine bessere Prophylaxe und Therapie von Hepatitis besteht daher ein Bedarf nach inaktivierten Vaccinen mit einer stärkeren antigenen Wirkung und einer geringeren Infektivität, die in großen Dosen verabfolgt werden können.

Aufgabe der Erfindung ist es somit HB-Ag-Vaccinen mit starker Antikörperbildung zur Verfügung zu stellen, deren Infektivität durch Hitzebehandlung auf ein Minimum gesenkt ist.

Die Erfindung beruht auf dem überraschenden Befund, daß beim Erhitzen einer wäßrigen Lösung von HB-Ag in Gegenwart eines auf Proteine entfaltend v/irkenden Mittels, wie Harnstoff oder Guanidin bzw. Guanidin-hydrochlorid die antigene Wirkung von HB-Ag gesteigert wird, wodurch sich bei der Verabfolgung der Lösung an Menschen eine starke Antikörperbildung ergibt.

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Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von HB-Ag-Vaccinen mit starker Antikörperbildung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine wäßrige Lösung von HB-Ag enthaltendem, menschlichem Plasmaprotein in Gegenwart eines auf Proteine entfaltend wirkenden Mittels eine ausreir chende Zeit auf 60 bis 120⁰C erhitzt, daß die Infektivität des HB-Ag verlorengeht und seine antigene Yfirkung erhöht wird, das entfaltend wirkende Mittel entfernt und die Lösung in eine physiologisch verträgliche Form bringt.

Eine wäßrige Pufferlösung mit 1 Prozent (Gewicht/Volumen) menschlichem Plasmaprotein und einem HB-Ag-Titer von 8x, gemessen durch gekreuzte Immunelektrophorese (im folgenden als IES-Verfahren bezeichnet; vgl. Shojiro Nakamura: Electrophoretic Experimental Method, (I963), S. 287, erschienen bei Bunko-do) wird durch Lösen der a- und ß-Globulinfraktionen von menschlichem Plasma in 0,06 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,6 hergestellt. Teile dieser Lösung werden bis zu einer Konzentration von 2 m bzw. 6 m mit Harnstoff und bis zu einer Konzentration von 2 m mit Guanidin versetzt. Diese. Lösungen werden jeweils auf Temperaturen von 60 bis 120°0 erhitzt. Die Abhängigkeit des HB-Ag-Titers von der Erhitzungsdauer ist in -Tabelle I angegeben. ■

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Tabelle I

O CO OO

Lösung

Ί
Temperatur
rc

HB-Ag
Titer vor
dem
Erhitzen

1

(Minuten)

10

*

7

HB- Ag -Titer

1

(Stunden)

6 .

10

1

■ 2*f

8x

3·

8x

eit

8x.

3

8x

hx

M-X .

Phosphat

60 ■

8x

3-0

8x

hx

2x

puffer

80

8x

2x

M

Ix

0

, 100

8x

^x

8x

Ix

2x

0

0 .

0

120

8x
8x

8x

8x
8x

hx

8x
I6x

0

8x ·
I6x

8x -'
I6x

I6x
I6x

Lösung■
mit 2 m
Harnstoff

60
80

8x

8x
8x

8x

2x

I6x

8x
I6x

I6x

-

100

8x

8x
8x

I6x

,^ΓΪ6χ
I

Γ
ι

CD CJD K) CD

Tabelle I - Fortsetzung

Lösung mit β m Harnstoff	60	8x	8x	8x	8x	8x	8x	• 8x	8x	I I6x I ·	8x
	80	8x	8x	8x	• 8x	; ~l6x "	~32x"	~ f6x~	~f6x	I6x	8x
	100	8x	8x	8x	Γ 1β~χ"	I6x	I6x *	I6x	I6x	-	-
	120	8x	8x	Γίόχ" I	I6x	I6x	I6x	I6x	8x	0	0
Lösung mit	60	8x	8x	8x	8x	8x	8x	8x	I '; I6x	Ιβχ	8x
2. m Guanidin	80	8x	8x	8x	8x	j ~l6x ~	~Ϊ6χ~	Ιβχ"	I6x	8x	8x
	100	8x	8x	8x	Γΐ6χ I I	I6x	8x	I6x	I6x	8x	0

Die zu untersuchenden Lösungen wurden nacheinander jeweils auf das doppelte Volumen verdünnt. * Als Maß des HB-Ag-Titers wird der Wert für die maximale Verdünnung der Lösung angegeben, bei der sich HB-Ag nach dem IES-Verfahren noch nachweisen läßt.

"-" bedeutet, daß keine Messung durchgeführt wnrde. Die gestrichelte Linie gibt die Grenze für die Erhitzungszeiten und Erhitzungstemperaturen ab, bei denen sich der HB-Ag-Titer erhöht. ■ ' J₀

Aus der Tabelle geht hervor, daß sich durch Zusatz von Harnoder

stoff / Guanidin ein Anstieg des HB-Ag-Titers der Lösung ergibt. Dies ist überraschend, da .der HB-Ag-Titer in der Regel beim Erhitzen abnimmt, wie auch bei der Lösung zu ersehen ist, die nicht mit Harnstoff oder Guanidin versetzt ist. Beispielsweise ergibt sich bei der 6 m Harnstofflösung ein Anstieg des HB-Ag-Titers nach 10 Stunden bei 60⁰C, 30 Minuten bei 80°C, 10 Minuten bei 100⁰C bzw. 3 Minuten bei 120⁰C. Es besteht eine Tendenz, daß der auf diese Weise erhöhte HB-Ag-Titer lange Zeit erhalten bleibt und anschließend abfällt. Da die Infektivität mit Zunahme der Erhitzungsdauer abnimmt und da die zur Erhöhung des HB-Ag-Titers notwendige minimale Erhitzungszeit langer ist, als die Zeit, die bisher zur Beseitigung der Infektivität angewendet wurde, ist es nach den erfindungsgemäßen Verfahren möglich, eine Vaccine zu erhalten, die im Vergleich zu den Vaccinen herkömmlicher Verfahren eine stärkere antigene Wirkung und eine geringere Infektivität aufweisen.

Der Mechanismus für den Anstieg des HB-Ag-Titers, der sich beim erfindungsgemäßen Verfahren erreichen läßt, ist noch nicht genau geklärt. Es wird jedoch angenommen, daß das entfaltend wirkende Mittel, wie Harnstoff oder Guanidin, mit dem HB-Ag unter Modifikation der multidimensionalen Struktur des Proteinmoleküls reagiert, wobei mehr antigen wirkende Zentren freigesetzt werden.

Als Denaturierungsmittel bzw. entfaltend wirkende Mittel werden erfindungsgemäß Verbindungen verwendet, die auf native Proteine, die aus Polypeptidketten bestehen, unter Einwirkung

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auf ionische oder andere schwache Bindungen entfaltend wirken. Besonders bevorzugt sind Harnstoff und Guanidin-hydroChlorid. Es ist bekannt, daß die Wirkung dieser entfaltend wirkenden Mittel eintritt, wenn sie in relativ hohen Konzentrationen

Lösungen einer/

eingesetzt werden. Im erfindungsgemäßen Verfahren werden/Konzentration von 2 bis 8 m, vorzugsweise 6 bis 8 m eingesetzt. Bei relativ niedrigen Konzentrationen sind längere Zeiten bis zum Erreichen des erhöhten HB-Ag-Titers erforderlich, der dann aber langer anhält.

Unter menschlichen Plasmaproteinen, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind nicht nur solche zu verstehen, die HB-Ag enthalten, das tatsächlich Hepatitis beim Menschen hervorrufen kann,_ sondern auch alle anderen Proteine, in denen sich HB-Ag nach dem IES-Verfahren oder radioimmunologisch (im folgenden als RIA-Verfahren bezeichnet; vgl. Shigeshi

(Japan) H^oshima et al., "Pediatric Clinic¹^, Bd. 24 (1971), S. 3044), nachweisen läßt. Es können also Plasma, Serum und verschiedene Proteinfraktionen, die sich durch übliche Fraktionierungsmetho-· den aus Plasmaprotein erhalten lassen, verwendet werden.

und Größe

HB-Ag weist eine veränderliche Gestalt/auf, wie sich elektronenmikroskopisch feststellen ließ. Die Infektivität von HB-Ag hängt spezifisch von der einzelnen Plasmaproteinfraktion ab, die HB-Ag enthält. Beispielsweise weist eine Fibrinogenfraktion trotz ihres geringen Gehalts an HB-Ag, bestimmt nach dem RIA-Verfahren, eine wesentlich höhere Hepatitis-Infektivität auf, als andere Plasmaproteinfraktionen. Dies ist vermutlich darauf zurückzuführen, daß die Fibrinogenfraktion stark

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infektiöse Teilchen enthält. Die nach dem RIA-Verfahren bestimmte HB-Ag-Menge in einer Albuminfraktion entspricht zumindest der in der Fibrinogenfraktion enthaltenen Menge, während ihre Infektivität so gering ist, daß sie kaum ausreicht, Hepatitis zu verursachen, wenn das Präparat 10 Stunden bei 6O⁰C einer Hitzebehandlung unterzogen wird. Andererseits enthalten α- und ß-Globulinfraktionen mehr Hb-Ag als die Albuminfraktion. Demgemäß ist die HB-Ag-Menge, die sich in aus diesen Fraktionen fraktionierten Transferrin- und Haptoglobinpräparaten nachweisen läßt, höher als im Albuminpräparat. Werden diese Transferrin- und Haptoglobinpräparate jedoch der gleichen Hitzebehandlung wie das Albuminpräparat unterzogen, so verursachen sie beim Menschen keine Hepatitis. Es ist daher anzunehmen, daß das in diesen α- und ß-Globulinfraktionen enthaltene HB-Ag eine niedrige Infektivität aufweist.

Im Verfahren der Erfindung werden als Ausgangsmaterialien vorzugsweise Plasma und Serum eingesetzt, die große Mengen an HB-Ag enthalten, insbesondere α- und ß-Globulinfraktionen, die große HB-Ag-Mengen enthalten und eine niedrige Infektivität aufweisen. Diese Fraktionen werden zweckmäßigerweise als Neben- und Unterfraktionen bei der Gewinnung anderer wertvoller Plasmaproteinfraktionen erhalten. Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Plasmaproteinfraktionen werden nach üblichen Verfahren zur Fraktionierung von Plasmaproteinen erhalten, beispielsweise durch Fällung mit Ammoniumsulfat oder durch Fraktionierung mit Äthanol in der Kälte nach Cohn; vgl. E.J. Cohn, L.E. Strong, W.L. Hughes, D.J. Mulford, J.N. Ashworth, M. Melin und H.L. Taylor, Journal öf the American Chemical Society ,

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Bd. 68 (19^6), S. 459. Beispielsweise werden die α- und ß-Globulinfraktionen als Fraktionen IV und IV-1 nach der Cohn'sehen Fraktionierung oder durch Fällung mit Ammoniumsulfat zwischen 35 Prozent und 50 Prozent Sättigung erhalten. Falls eine wäßrige Lösung der Proteinfraktion trüb ist, kann sie zur Erleichterung der nachfolgenden Behandlung geklärt werden. Die Klärung wird beispielsweise durch Zentrifugation oder durch Erhitzen der Lösung auf etwa 6O⁰C bei neutralem pH-Wert und anschließendem Abfiltrieren der gebildeten Niederschläge durchgeführt.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das HB-Ag enthaltende Ausgangsmaterial in einem wäßrigen Medium in Gegenwart des genannten entfaltend wirkenden Mittels erhitzt. Beispiele für wäßrige Medien sind Wasser und physiologisch verträgliche wäßrige Salzlösungen, insbesondere physiologische Kochsalzlösung. Der pH-Wert der zu erhitzenden Lösung liegt zweckmäßigerweise im Neutralbereich und wird auf einem Wert von 5 bis 9, vorzugsweise 6,5 bis 7,5 gehalten. Um die Lösung auf dem gewünschten pH-Wert zu halten, ist die Verwendung eines Puffers empfehlenswert. Es können anorganische Puffer, wie Phosphate und Carbonate, oder organische Puffer, wie Acetate, Trisaminomethan-hydrochlorid und Glycin-hydrochlorid, verwendet werden.

Wie bereits erwähnt, werden die Lösungen auf Temperaturen von 60 bis 12O⁰C erhitzt. Die Zeitdauer, während der die Lösung erhitzt wird, hängt von der Temperatur ab. Auf jeden Fall wird sie so gewählt, daß sie ausreicht, um die Infektivität zu beseiti-

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gen und die durch den HB-Ag-Titer wiedergegebene antigene Wirkung zu erhöhen. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Erhitzungsdauer gegenüber den herkömmlichen Verfahren verlängert werden. Demgemäß kann bei Verwendung des entfaltend wirkenden Mittels in niedrigen Konzentrationen die übliche Erhitzungsdauer von 10 Stunden bei 6O⁰C, die bisher beispielsweise bei der Hitzebehandlung von Albuminfraktionen und α- und ß-Globulinfraktionen angewendet wurde, auf mehr als 24 Stunden bei 100⁰C verlängert werden. Eine herkömmliche Erhitzungsdauer von 3 Minuten kann auf Zeiträume von 30 Minuten bis mehr als 6 Stunden ausgedehnt werden. Bei der Verwendung des entfaltend wirkenden Mittels in hohen Konzentrationen können herkömmliche Erhitzungszeiten von 3 Minuten bei 100⁰C auf 10 Minuten bis mehr als 6 Stunden verlängert werden. Auch bei anderen Temperaturen lassen sich die herkömmlichen Erhitzungszeiten verlängern, so daß die Infektivität gesenkt und die antigene Wirkung gesteigert wird. Wenn innerhalb des Bereichs der so verlängerten Erhitzungszeiten (bei verschiedenen Temperaturen) eine relativ kurze Erhitzungszeit gewählt wird, bei der die Infektivität beseitigt und die antigene Wirkung gesteigert wird, ist es möglich, eine Vaccine zu erhalten, deren Infektivität nicht höher liegt als die von herkömmlichen Vaccinen und. deren antigene Wirkung, wiedergegeben durch den HB-Ag-Titer, höher als vor dem Erhitzen ist. Andererseits kann bei der Wahl relativ langer E_rhitzungszeiten innerhalb des vorerwähnten Zeitraums inaktiviertes HB-Ag erhalten v/erden, dessen antigene Wirkung gesteigert und dessen Infektivität wesentlich gesenkt oder vollkommen beseitigt ist.

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Nach der Hitzebehandlung wird die Lösung gegebenenfalls durch Filtrieren geklärt und' anschließend gegen eine isotonische Lösung, beispielsweise eine isotonische Kochsalzlösung, dialysiert, um Stabilisatoren, Puffersalze und gebildete niedermolekulare Substanzen zu entfernen, wodurch eine erfindungsgemäße Vaccine erhalten wird.

Durch Dialyse unter vermindertem Druck gemäß einem üblichen Verfahren kann die Lösung gleichzeitig mit der Entfernung der vorgenannten Verbindungen eingeengt werden. Die so erhaltene Vaccine wird auf eine geeignete Konzentration eingestellt. Nach Passieren eines Sterilfilters erhält man eine Vaccine, die zur Verabfolgung an Menschen geeignet ist.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten HB-Ag-Vaccinen weisen im Vergleich zu herkömmlichen Vaccinpräparaten die gleiche oder eine höhere HB-Ag-Antigenkapazität auf und sind in ihrer Anwendung beim Menschen sicherer.

Der Vorteil der erfindungsgemäß hergestellten HB-Ag-Vaccinen liegt nicht nur in ihrer starken antigenen Wirkung sondern auch in ihrer starken Antikörperbildung nach Verabfolgung an den Menschen. Werden beispielsweise durch 1- bis 3-minütiges Erhitzen des gleichen Ausgangsmaterials auf 98⁰C eine Vaccine nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und eine nach einem herkömmlichen Verfahren hergestellt, so sind beide Vaccine im Bezug auf ihren HB-Ag-Titer identisch. Werden diese Vaccinen intramuskulär verabfolgt, so ist die Antikörpermenge, die sich im Serum des Patienten mit der erfindungsgemäß hergestellten

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Vaccine einige Male größer als die entsprechende Menge bei einem Patienten, der mit der herkömmlichen Vaccine behandelt worden ist. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich also Vaccinen erhalten, die in ihrer Antikörperbildung aktiviert sind. Dies bedeutet im Zusammenhang mit der Steigerung des HB-Ag-Titers durch Erhitzen, daß es gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung des gleichen Ausgangsmaterials möglich ist, eine Vaccine herzustellen, die eine wesentlich höhere Antikörperbildung als eine herkömmlich hergestellte Vaccine aufweist.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. In den Beispielen ist der HB-Ag-Titer durch die maximale Verdünnung der zu untersuchenden Lösung, bei der sich HB-Ag nach dem IES-Verfahren noch nachweisen läßt, angegeben. Das HB-Ab enthaltende Serum wird jeweils auf das doppelte Volumen verdünnt. Der HB-Ab-Titer wird als maximale Verdünnung des Serums angegeben, bei der sich HB-Ab nach dem IES-Verfahren unter Verwendung eines Standardserums, dessen HB-Ag-Titer 1x ist, noch nachweisen läßt.

Beispiel 1 S amme 1;
100 ml/plasma mit einem· HB-Ag-Titer von 8x werden nach dem Cohn'sehen Verfahren mit Äthanol fraktioniert. Die Fraktion IV-1 wird mit Phosphatpuffer auf den pH-Wert 7,6 gebracht und anschließend 10 Minuten auf 100⁰C erhitzt. Nach dem Entfernen des gebildeten Niederschlags erhält man eine klare Lösung mit einem HB-Ag-Titer von 16x. 180 ml dieser Lösung werden mit Harnstoff bis zu einer Konzentration von 6 m versetzt und anschließend 1 Stunde auf 85⁰C erhitzt, wobei sich der HB-Ag-Ti-

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ter der Lösung auf 32x erhöht. Anschließend wird die Lösung unter vermindertem Druck gegen eine isotonische Kochsalzlösung dialysiert, wobei die Phosphate und der Harnstoff entfernt werden. Sodann wird die Lösung durch ein Sterilfilter gegeben. Man erhält 80 ml einer injizierbaren Lösung.

Beispiel 2 Samme^

10 Liter fplasma mit einem HB-Ag-Titer von 4x werden einer üblichen Ammoniumsulfatfällung unterworfen. Die zwischen einer 30prozentigen und 50prozentigen Ammoniumsulfatsättigung erhaltenen α- und ß-Globulinfraktionen werden gegen Wasser dialysiert. Nach dem Entfernen des gebildeten Niederschlags erhält man eine klare wäßrige Lösung mit einem HB-Ag-Titer von 64x. 500 ml dieser Lösung werden bis zu einer Konzentration von 2 m mit Harnstoff versetzt und anschließend 1 Stunde auf 105°C erhitzt, wobei sich der HB-Ag-Titer auf 128x erhöht. Anschließend wird die Lösung zur Entfernung des Harnstoffs gegen eine isotonische Kochsalzlösung dialysiert. Nach dem Abfiltrieren der gebildeten Niederschläge wird durch Ultrafiltration eine Konzentration bis zu einem HB-Ag-Titer von 2048x erreicht. Sodann wird durch ein Sterilfilter gegeben. Man erhält 21 ml einer injizierbaren Vaccine in isotonischer Kochsalzlösung.

Beispiel 3 Samme>
1000 ml (plasma mit einem HB-Ag-Titer von 4x werden gemäß dem Cohn¹sehen Verfahren fraktioniert. Die Fraktion IV-T wird gegen Wasser dialysiert und anschließend 1 Stunde zur Ausfällung unerwünschter Proteine auf 60⁰C erhitzt. Nach dem Entfernen der Niederschläge durch Zentrifugation wird zu dem erhaltenen

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von 100 ml Volumen

Überstand/eine konzentrierte Ammoniumsulfatlösung gegeben, bis eine 50prozentige Ammoniumsulfatsättigung erreicht ist. Anschließend wird 30 Minuten gerührt, wodurch die . Fällung vervollständigt wird. Die Niederschläge werden abzentrifugiert und anschließend in einer geringen Menge Wasser gelöst. Die erhaltene Lösung wird gegen einen .'Natriumchlorid enthaltenden isotonischen Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,2 dialysiert. Man erhält 20 ml einer Lösung mit einem HB-Ag-Titer von 125x. Diese Lösung wird bis zu einer Konzentration von 2 m mit Guanidin-hydrochlorid versetzt und anschließend 20 Minuten auf 10O⁰C erhitzt, wodurch sich der HB-Ag-Titer auf 25Ox erhöht. Die in der Lösung gebildeten geringen Mengen eines Niederschlags werden abzentrifugiert. Nach Passieren eines Sterilfilters erhält man 20 ml einer injizierbaren Lösung.

Beispiel 4

Die in Beispiel 2 hergestellte klare wäßrige .Lösung mit einem HB-Ag-Titer von 64x wird 30 Minuten auf 100⁰C erhitzt'.' Die erhaltene antigene Lösung mit einem HB-Ag-Titer von I6x wird gemäß Beispiel 1 eingeengt. Man erhält eine Lösung mit einem HB-Ag-Titer von 2048x. Diese Lösung (im folgenden als "nicht aktivierte Vaccine" bezeichnet) und die gemäß Beispiel 2 erhaltene Vaccinelösung mit einem HB-AgrTiter von 2048x (im folgenden als "aktivierte Vaccine" bezeichnet) werden in Verbindung mit dem Freundschen kompletten Adjuvans zur Immunisierung von Kaninchen durch Injektion verwendet. 3 Wochen lang werden jedem Kaninchen pro Woche 0,5 ml Vaccine sub- und intrakutan verabfolgt. Sodann wird die Behandlung für einen Monat unterbrochen. Anschließend werden nochmals 3 Injektionen in der vorbeschrie-

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benen Weise vorgenommen. 1 Woche nach der letzten Injektion wird Blut aus dem Herzen der Kaninchen zur Gewinnung eines Antiserums entnommen. Das Antiserum wird in einem Serum, das kein HB-Ag enthält, absorbiert, um ein spezifisches Antiserum gegen HB-Ag herzustellen.

Von den Antiseren, die aus 8 mit der nicht-aktivierten Vaccine immunisierten Kaninchen stammen, weist eines ein HB-Ab-Titer von 8x, drei einen Titer von 4x,' drei einen Titer von 2x und eines keinen meßbaren Titer auf. Der Durchschnittswert beträgt 3,3x. Von den zehn mit der aktivierten Vaccine immunisierten Kaninchen zeigen fünf Antiseren einen HB-Ab-Titer von 16x, drei einen Titer von 8x, eines einen Titer von 2x und eines einen Titer von 1x. Der Durchschnittswert beträgt 10,7x. Dieszeigt,daß bei Immunisierung von Kaninchen mit aktivierter bzw. nicht-aktivierter Vaccine, die im Bezug auf ihren HB-Ag-Titer gleichwertig sind, die Anzahl der in mit der aktivierten Vaccine immunisierten Kaninchen gebildeten Antigene etwa dreimal so groß ist wie die Anzahl der Antigene, die in Kaninchen, die mit der nicht aktivierten Vaccine immunisiert sind, gebildet werden. Wird außerdem der zweifache Anstieg im HB-Ag-Titer der aktivierten Vaccine berücksichtigt, der auf Zusatz von Harnstoff oder einem entsprechenden auf Proteine entfaltend.

Qccrper^i wirkenden Mittel zurückzuführen ist, so ist die AntiViildung der aktivierten Vaccine etwa sechsmal größer als die der nichtaktivierten Vaccine.

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Claims

-¹⁶- 2A40926 ^Π

Patentansprüche

(i) Verfahren zur Herstellung von HB-Ag-Vaccinen mit starker Antikörperbildung, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung von HB-Ag enthaltendem Plasmaprotein in Gegenwart eines auf Proteine entfaltend v/irkenden Mittels eine ausreichende Zeit auf Temperaturen von 60 bis 120⁰C erhitzt, daß die Aktivität des HB-Ag-verlorengeht und seine antigene Wirkung erhöht wird, das entfaltend wirkende Mittel entfernt und die Lösung in eine physiologisch verträgliche Form bringt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als HB-Ag enthaltendes Plasmaprotein α- und ß-Globulinfraktionen verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Erhitzen solange durchführt, bis der Antigentiter ansteigt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Erhitzen solange durchführt, bis der Antigentiter ein Maximum erreicht.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung des HB-Ag enthaltenden Plasmaproteins mit einem pH-Wert von etwa 5 bis 9 verwendet.

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6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung mit einem pH-Wert von etwa 7 verwendet.
7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung verwendet, deren pH-Wert mit einem
Puffer eingestellt ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung verwendet, deren pH-Wert mit einem Phosphatpuffer eingestellt worden ist.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als entfaltend v/irkende Verbindung Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid verwendet.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

man die entfaltend v/irkende Verbindung in einer Konzentration

etwa
von/2 m bis 8 m verwendet.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung des HB-Ag enthaltenden Plasmaproteins verwendet, die vorher geklärt worden ist.
12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die entfaltend wirkende Verbindung durch Dialyse der wäßrigen Lösung gegen eine physiologisch verträgliche Lösung entfernt.

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13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lösung durch Sterilfiltration in eine physiologisch verträgliche Form bringt.
14. Physiologisch verträgliche wäßrige Lösung einer entfalteten HB-Ag-Vaccine, dadurch gekennzeichnet, daß sie gemäß Anspruch 1 hergestellt worden ist.

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