DE2639012B2

DE2639012B2 - Immuntherapeutikum zur Prophylaxe und Therapie von Pseudomonas aeruginosa-Infeklionen

Info

Publication number: DE2639012B2
Application number: DE2639012A
Authority: DE
Inventors: Yuzuru Tokio Homma
Original assignee: Green Cross Corp Japan
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1976-02-05
Filing date: 1976-08-30
Publication date: 1978-08-03
Also published as: DK42677A; DE2639012C3; JPS5296731A; AT343798B; GB1545862A; ATA637776A; DK143249C; US4120950A; JPS546608B2; FR2361905A1; DK143249B; DE2639012A1; FR2361905B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Immuntherapeutikum zur Prophylaxe und Therapie von Pseudomonas aeruginosa-Infektionen auf der Basis eines humanen Gamma-Globulinpräparats.

Pseudomonas aeruginosa ist ein typischer Vertreter der sogenannten »opportunistischen« Erreger, die bedingt durch die moderne Medikamentation sich immer stärker in den Vordergrund schieben und große Probleme aufwerfen.

Durch Pseudomonas aeruginosa hervorgerufene Infektionskrankheiten werfen ernstliche Probleme im Falle einer physiologischen Immuninsuffizienz bei Neugeborenen oder verminderter Immunofunktion bei Patienten auf, die an Krebs oder Leukämie erkrankt sind oder bei denen eine Transplantation vorgenommen wurde oder die großflächige Verbrennungen aufweisen oder bei denen die Immunofunktion durch Verabfolgung von Immunosuppressiva, wie Adrenocorticosteroiden oder Azathioprin, aufgehoben ist.

Es sind bereits einige Antibiotika bekannt, die auch gegen Pseudomonas aeruginosa wirken. Diese Verbindungen zeigen jedoch bei Immuninsuffizienz praktisch keine Wirkung. Es wäre daher erwünscht, zur Behandlung von Pseudomonas aeruginosa-Infektionen ein Arzneimittel zur Verfugung zu haben, das als Immuntherapeutikum entweder allein oder zur Unterstützung einer Chemotherapie eingesetzt werden könnte.

Zur Immunotherapie wurden Antikörper gegen das OEP (original Endotoxin Protein), ein in Pseudomonas aeruginosa enthaltenes übliches Antigen, gewonnen. Diese Antikörper verhindern sämtliche Infektionen, die durch Pseudomonas aeruginosa hervorgerufen werden, unabhängig von der Art der Serotypen dieses Stammes. Bis jetzt wurden mindestens 13 Serotypen gefunden (vgl. Ja-OS 4092/73, Jap. Exp. Med., Bd. 42 [1972], S. 23 bis 34 und US-PS 39 28 565).

Die extrazellulär produzierten Enzyme Elastase und Protease werden nicht von jedem Pseudomonas aeruginosa Stamm erzeugt. Außerdem unterliegt die erzeugte Menge Schwankungen. Es ist bekannt, daß Stämme, die diese Stoffwechselprodukte erzeugen, schwerere Krankheitssymptome verursachen, beispielsweise Hornhautulcus, hämorrhagische Pneumonie, Hämmorhagie im oberen Teil des Dünndarms, Septihämie usw. Neben den OEP-Antikörpern wurden Antikörper gegen diese Enzyme im Serum von Tieren gefunden, die an Infektionen leiden, die durch diese Enzyme erzeugende Bakterien hervorgerufen werden. Ein Verfahren zur Herstellung von Elastase und die Eigenschaften dieser Elastase sind in der JA-AS 27 315/65 und J. Biol. Chem, Bd. 240 (1965), S. 3295 bis 3304 beschrieben.

Ein Verfahren zur Herstellung von Protease und die Eigenschaften dieses Enzyms sind in der JA-AS 27 315/65 und Biochem. Biophys. Acta, Bd. 73 (1963),· S. 113 bis 124 und S. 125 bis 131, Bd. 92 (1964), S. 351 bis 360 und 360 bis 366 sowie Bd. 309 (1973), S. 414 bis 429 beschrieben.

Die gleichzeitige Anwendung der Chemotherapie und Immunotherapie ist bekannt Diese Terhapie ist jedoch von geringer Wirkung, wenn die Immuniofunktion des Wirts aufgrund der Insuffizienz der Immunofunktion abfällt Mit anderen Worten, eine Vaccine ist in diesem Zustand nicht wirksam, und Antibiotika vom bakteriostatischen Wirkungstyp zeigen nur eine geringe Wirkung, sofern sie nicht in großen Dosen eingesetzt werden, wodurch die Gefahr von Nebenwirkungen erhöht wird.

Die gleichzeitige Verwendung eines humanen Immunoglobulins (entsprechend dem japanischen Arzneibuch) mit Antikörpern wurde bereits zur vorbeugenden Behandlung und zur Therapie von durch Pseudomonas aeruginosa hervorgerufenen Infektionskrankheiten versucht (vgl. Fujii und Mitarb, Abstract of 4th P. aeruginosa Research Meeting, 1970, S. 83 bis 87 und Shibata und Mitarb, Chemotheraphy, Bd. 18 [1971], S. 991 bis 999). Untersuchungen haben jedoch ergeben, daß nur Spuren an OEP-Antikörpern festgestellt werden konnten; die Menge an Antikörper gegen Elastase und Protease ist derart gering, daß sie in humanem Immunoglobulin, wie es in den Handel gebracht wird, nicht feststellbar ist

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, humanes Gamma-Globulin zur Immunotheraphie von Infektionen zu schaffen, die durch Pseudomonas aeruginosa, insbesondere Elastase und Protease erzeugende Stämme, hervorgerufen werden. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Immuntherapeutikum zur Prophylaxe und Therapie von Pseudomonas aeruginosa-Infektionen, bestehend aus einer wäßrigen Lösung von Gamma-Globulin aus humanem Serum oder Plasma mit einem HA-Titer von mindestens 1 :128 für OEP-Antikörper, mindestens 1 :32 für Elastase-Antikörper und mindestens 1 :64 für Protease-Antikörper. Vorzugsweise enthält diese Lösung 15 bis 17% derartigen Gamma-Globulins.

Das erfindungsgemäß verwendete humane Gamma-Globulin kann in an sich bekannter Weise aus homanem Plasma mit hohem Gehalt an OEP-, Elastase- und Protease-Antikörpern gewonnen werden. Bei normalem humanem Plasma kann ein HA-Titer von 1 :8 für OEP-Antikörper festgestellt werden, jedoch liegen die Konzentrationen an Protease- und Elastase-Antikörper unter der erkennbaren kritischen Konzentration. In keinem Fall enthalten die aus normalem humanem Plasma gewonnenen Immunoglobuline die drei genannten Antikörperarten in HA-Titern, die denen in dem erfindungsgemäßen Immunglobulin vergleichbar wären.

Erfindungsgemäß wird ein Immunglobulin mit höheren HA-Titern der vorgenannten Antikörper als den HA-Titern von gewöhnlichem Plasma aus Plasma oder Serum gesunder humaner Spender gewonnen, deren Blut einen hohen HA-Titer von OEP-, Protease- und Elastase-Antikörpern zeigt, die durch Verabreichung von Vaccinen von OEP, Protease und Elastase von Pseudomonas aeruginosa gewonnen werden. Nach

vorheriger Bestimmung der HA-Titer der vorgenannten drei Antikörper im Plasma werden gegebenenfalls ein einziges oder Gemische von humanem Plasma verwendet Dieses Gamma-Globulin wird durch Reinigung dieses Materials nach üblichen Verfahren gewonnen, beispielsweise durch Fraktionierung mit kaltem Äthanol nach der Methode von C ο h η oder durch Fraktionierung mit Ammoniumsulfat.

Die Bestimmung der HA-Titer der vorgenannten Antikörper ist in »Pseudomonas aeruginosa and its infections«, 1975, veröffentlicht von Bunkodo.S. 355 bis 359 beschrieben. Der Titer wird nach der Methode der passiven Hämagglutination mit OEP, Protease und Elastase als Antigenen bestimmt.

Die Bestimmung erfolgt folgendermaßen:

Schaferythrocyten werden mit Kohlenmonoxid behandelt und in 0,6prozentiger wäßriger Formaldehydlösung 24 Stunden bei 37° C inkubiert Digallussäure in Phosphatgepufferter Kochsalzlösung in einer Konzentration von 1 :100 000 wird mit einem gleichen Volumen einer 2prozentigen Zellensuspension vermischt Das Gemisch wird 15 Minuten bei 37° C inkubiert. Sodann werden die Zellen abzentrifugiert. Die behandelten (gegerbten) Zellen werden mit einem gleichen Volumen einer OEP-, Protease- oder Elastase-Lösung versetzt und 15 Minuten bei 37°C inkubiert Sodann werden die Zellen zweimal mit dem Verdünnungsmittel gewaschen. Auf diese Weise werden sensibilisierte Zellen hergestellt Der Hämagglutinin (HA)-Titer wird durch den passiven Hämagglutinationstest mit diesen Zellen bestimmt und ausgedrückt durch den reziproken Wert der maximalen Globulinverdünnung, bei der nach 18stündigem Stehen bei Raumtemperatur Hämagglutination erfolgt. Die Einzelheiten der Versuchsmethodik sind von Tomiyama u. Mitarb, in der Zeitschrift Jap. J. Exp. Med., Bd. 43 (1973), S. 183 bis 189 für OEP und in Jap. J. Exp. Med. Bd. 45 (1975), S. 361 bis 365 für Protease und Elastase beschrieben.

Das erfindungs£emäß verwendete Immunoglobulin wird vorzugsweise als wäßrige Lösung in einer Konzentration von 150 bis 170 mg/ml verwendet, wie dies für übliche Immunglobulinpräparate der Fall ist. Sie können einen Proteinstabilisator, wie Aminoessigsäure, und Konservierungsmittel, wie Thimerosal, enthalten. Präparate mit einem HA-Titer von mindestens 1 :200 für OEP-Antikörper und 1 :64 für Protease- und Elastase-Antikörper sind bevorzugt. Bei der Behandlung des Präparats mit Pepsin oder Plasmin wird die Eigenschaft der Komplementbindung des Immunoglobulins eliminiert, doch ist seine Antikörperaktivität beibehalten. Derartige Präparate eignen sich zur intravenösen Injektion.

Das erfindungsgemäß verwendete Immunoglobulin zeichnet sich im Vergleich zu üblichem Gamma-Globuün bei der Verabfolgung während einer Behandlung mit beispielsweise 3',4'-Didesoxykanamycin B (DICB) durch eine wesentlich höhere Wirkung aus. Das Wirkungsverhältnis auf der Basis des ED₅o-Wertes zeigt einen signifikanten Unterschied im Vergleich zu den Einzelkomponenten DKB und Gamma-Globulin des Japanisehen Arzneibuches.

Das Immunotherapeutikum der Erfindung eignet sich zur Behandlung von schweren Infektionen, wie humanem Hornhautulcus, Infektionen des Bauchraumes, Septiokämie und Meningitis, die durch Pseudomonas aeruginosa hervorgerufen werden, und bei denen die gleichzeitige Anwendung eines Chemotherapeutikums bei der üblichen Immunotherapie unwirksam ist.

Die Tagesdosis beträgt 150 mg (1,0 ml) pro kg bei intramuskulärer Injektion. Die Dosis hängt vom Zustand des Patienten ab.

In der Zeichnung ist graphisch das Ergebnis von Versuchen wiedergegeben, bei denen die Rekonvaleszenz auf der Ordinate (im logaritlimischen Maßstab) und auf der Abszisse (im logarithmischen Maßstab) die verabreichte Menge ^g/Maus) von DKB aufgetragen ist.

Als Immuntherapeutikum zur Behandlung von Pseudomonas aeruginosa-Infektionen wurde bisher ein intracelluläres Toxin, insbesondere OEP, verwendet. Extracellular erzeugte Substanzen wurden bisher nicht in Betracht gezogen (vgl. US-PS 39 28 565).

Es ist überraschend, daß aus den extracellular produzierten Enzymen Elastase und Protease, die sich durch hohe Toxizität auszeichnen und schwere Krankheitssymptome verursachen, Antikörper für jedes Enzym gewonnen werden können, die sich zur Behandlung von Pseudomonas aeruginosa-Infektionen eignen.

Die Immuntherapie der Pseudomonas aeruginosa-Infektionen mit OEP-Antikörpern war nicht in allen Fällen immer wirkungsvoll. Überraschenderweise zeigt das Immuntherapeutikum der Erfindung eine sichere Wirksamheit bei Infektionen durch solche Stämme, die nicht nur OEP sondern auch Elastase und Protease erzeugen. Die Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe beruht auf der Erkenntnis der Bedeutung der von Pseudomonas aeruginosa-Stämmen extracellular gebildeten Elastase und Protease, sowie auf dem Befund, daß ein zur Behandlung von sämtlichen Pseudomonas-aeruginosa-Infektionen wirksames Gamma-Globulin OEP-, Elastase- und Protease-Antikörper enthalten muß, und der Erkenntnis bestimmter Mindest-HA-Titer für jeden der Antikörper zur erfolgreichen Behandlung. Der Grund, warum das bekannte Immuntherapeutikum zur Behandlung von Pseudomonas aeruginosa-Infektionen wenig geeignet war, ist darin zu erblicken, daß den extracellular gebildeten Enzymen Elastase und Protease keine Beachtung geschenkt wurde, so daß eine Immuntherapie unter Verwendung eines Gamma-Globulins mit ausreichend hohem Elastase- und Protease-Antikörperspiegel nicht durchgeführt werden konnte.

Das Beispiel erläutert die Herstellung des Immuntherapeutikums der Erfindung.

Beispiel 1

500 ml Plasma eines humanen gesunden Spenders mit einem HA-Titer von 1 :32 für OEP-Antikörper, 1 :8 für Protease-Antikörper und 1 :8 für Elastase-Antikörper werden mit Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 22% versetzt Die entstandene Fällung wird abgetrennt. Der Überstand wird weiter mit Ammoniumsulfat bis zu 33prozentiger Sättigung versetzt Die hierbei entstandene Fällung wird abgetrennt und in einer entsprechenden Menge Wasser gelöst, und die vorstehend beschriebene Fraktionierung mit Ammoniumsulfat wird mit dieser Lösung wiederholt. Es werden auf diese Weise aus verschiedenen Ansätzen insgesamt 200 g Gamma-Globulin als Fällung erhalten. Das Präparat wird getrocknet und in Wasser zu einer Lösung gelöst, die 150 mg/ml enthält. Die wäßrige Lösung wird in Anteile von jeweils 1 ml -nterteilt. Der HA-Titer beträgt 1 :200 für OEP-Antikörper, 1 :64 für Protease-Antikörper und 1 : 64 für Elastase-Antikörper.

Die Wirksamkeit von bekannten humanem Immunoglobulin (Gamma-Globulingehalt 150 mg/ml, OEP-An-

tikörper-HA-Titer höchstens 1:8, Protease-Antikörper-HA-Titer und Elastase-Antikörper-HA-Titer unterhalb der erkennbaren kritischen Konzentration; japanisches Arzneibuch) sowie des Immuntherapeutikums der Erfindung (Gamma-Globulingehalt 156 mg/ml, OEP-Antikörper-HA-Titer 1 : 200, Protease-Antikörper-HA-Titer 1 :64 und Elastase-Antikörper-HA-Titer 1 :64) wird an einer durch Pseudomonas aeruginosa hervorgerufenen Infektion der Cornea an der Maus nach der in Japan J. Exp. Med., Bd. 44 (1974), S. 435 bis 442 beschriebenen Methode unter gleichzeitiger Verwendung des gegen Pseudomonas aeruginosa wirksamen Antibiotikums DKB bestimmt.

Für die Versuche werden 5 Wochen alte weibliche Mäuse des ddy-Stammes verwendet. Die Mäuse werden in Gruppen unterteilt und jedem Tier wird subkutan 0,1 ml des bekannten humanen Immunoglobulins bzw. 0,1 ml des Immuntherapeutikums der Erfindung injiziert. Eine Gruppe dient als Kontrollgruppe. Es werden insgesamt 5 Gruppen verwendet. Jede Gruppe besteht aus 6 Mäusen und insgesamt werden 90 Mäuse verwendet.

Nach 18 Stunden wird jeder Maus intramuskulär 0,2 ml der DKB-Lösung injiziert. Die Lösung wird durch Auflösen von DKB in physiologischer Kochsalzlösung in Konzentrationen von 400 y, 200 y, 100 y, 50 y und 25 y pro 0,2 ml hergestellt. Sodann werden die Mäuse mit Äther anästhesiert. Hierauf wird die Cornea mit einer Nadel der Größe ¹A unter einem Stereomikroskop

Tabelle I

21) verletzt und mit 0,1 ml einer Suspension von Pseudomonas aeruginosa, Stamm »IFO-1210« (10⁷ Keime/ml), infiziert. Der verwendete Stamm erzeugt Elastase und Protease.

Der Schädigungsgrad der Cornea jeder Maus wird 5 Tage später beobachtet und entsprechend dem Ausmaß der Durchsichtigkeit der Cornea, der Größe von Abszessen und Ulcerationen in Zahlen entsprechend einer Bewertungsskala von 1 bis 8 ausgedrückt:

1 = keine pathologische Veränderung

2 = sehr geringe Trübung im Zentrum der Cornea

3 = sichtbare Trübung im Zentrum der Cornea

4 = Trübung in der gesamten Cornea; die Vorkammer

durchsichtig

5 = stärkere Trübung im Zentrum und keine Durchsichtigkeit

6 = Trübung in der gesamten Fläche und Abszess im

Zentrum
= sichtbare Trübung über den gesamten Bereich der

Cornea und Abszess im Zentrum 8 = Ulcerationen über die gesamte Cornea.

Die Bewertungszahlen 1 bis 2 bedeuten Heilung.

Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt. Die Werte für die ED50 und die Wirksamkeit wurden nach der Methode von Li tch field und Wilcoxon J. Pharmacol. Exp. Therap., Bd. 96 (1949), S. 99 bis 112 bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle II und Fig. 1 angegeben.

DKB. γ	Bewi	rtung	3
	I	2
400	5/6		1/6
200	3/6	1/6	1/6
100	2/6	1/6	1/6
50	1/6	2/6
25
400	3/6		1/6
200	1/6
100
50
25			2/6
400	1/6	1/6
200	1/6
100
50
25

Mit dem Immuntherapeutikum
der Erfindung behandelte Gruppe

Mit bekanntem Immunoglobulin-Präparat behandelte Gruppe

Kontrollgruppe

(nur mit DKB behandelt)

1/6

Tabelle II

EDm

Immunotherapeutikum der	90y
Erfindung
Bekanntes humanes Immuno-	40Oy
globulin-Präparat
DKB allein	620y

Grad der Wirksamkeit

DKB allein bekanntes humanes

Immunoglobulin-Präparat

3,00 0,73 1,80

0,73

Der Wert für die Wirksamkeit, der einen signifikanten Unterschied zeigt, beträgt mindestens 1,00.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Immunotherapeutikum zur Prophylaxe und Therapie von Pseudomonas aeruginosa-Infektionen, bestehend aus einer wäßrigen Lösung eines aus humanem Serum oder Plasma hergestellten Gamma-Globulins mit einem HA-Titer von mindestens 1 :128 für OEP-Antikörper, mindestens 1 :32 für Elastase-Antikörper und mindestens 1 :64 für Protease-Antikörper.

2. Immuntherapeutikum nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung 15 bis 17% Gamma-GJobulin enthält