DE2728925A1 - Ovomucoid-fraktion von wachtel-eiweiss, verfahren zu deren herstellung und arzneimittel - Google Patents

Ovomucoid-fraktion von wachtel-eiweiss, verfahren zu deren herstellung und arzneimittel

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DE2728925A1 DE19772728925 DE2728925A DE2728925A1 DE 2728925 A1 DE2728925 A1 DE 2728925A1 DE 19772728925 DE19772728925 DE 19772728925 DE 2728925 A DE2728925 A DE 2728925A DE 2728925 A1 DE2728925 A1 DE 2728925A1
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Description

Beschreibung
Die Erfindung betrifft die Isolierung und Reinigung einer Ovomucoid-Fraktion aus Wachtel-Eiweiß, die durch ihre Antiprotease- und insbesondere Antitrypsin-Aktivität charakterisiert ist; die Erfindung betrifft auch die Verwendung dieser gereinigten Ovomucoid-Fraktion als Arzneimittel, das insbesondere zur Behandlung verschiedener Arten von Allergien geeignet ist a
Wachtel-Eiweiß besitzt eine Antiprotease-Aktivität, die sich auf die Ovomucoid-Fraktion des Eiweiß konzentriert. Die erfindungsgemäß isolierte Ovomucoid-Fraktion von Wachtel-Eiweiß zeichnet sich durch ihre Wirksamkeit gegenüber Rinder-Trypsin aus.
Die Untersuchungen wurden hauptsächlich an den Eiern einer Wachtel-Subspecies, nämlich Coturnix coturnix japonica, und insbesondere des Stammes A dieses Subspecies, aufgezogen von R. Cordonnier in la Tublerie, durchgeführt.
Die Messung der Antiprotease-Aktivität des Eiweißes wurde nach der klassischen Methode mit Azocoll (einem Azo-Farbstoff, suspendiert in Kollagen) durchgeführt. Dieses dient gleichzeitig als Farbstoff und als Substrat, und man mißt die Färbung der durch Einwirkung von Proteasen auf das Kollagen freigesetzten Peptide. Die Aktivität einer Protease (wie Trypsin oder Chymotrypsin) wird auf folgende Weise gemessen:
In 5 Proberöhrchen verdünnt man jeweils 15 mg Azocoll in 1 cm Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 7,5 und fügt 2 χ 10 Mol Calciumchlorid und 1 mMol ß-Mercaptoäthanol zu. Man fügt in die Röhrchen 10, 20, 30, 50 bzw. 100 v- Protease. Man mißt die Farbreaktionen gleichzeitig nach 5-minütigem kontinuierlichen Bewegen bei 37°C und bestimmt die optische Dichte bei 580 nm von Lösungen nach dem Zentrifugieren an einer Entnahme von 0,8 cm überstehender Flüssigkeit. Die Protease-Aktivität wird durch
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die Änderung der optischen Dichte (DQ) pro Minute und pro mg Protease dargestellt.
Zur Messung der Antiprotease-Aktivität von Eiweiß geht man in gleicher Form vor, wobei man jedoch in die Röhrchen, die eine konstante Protease-Menge enthalten, anwachsende Mengen von Eiweiß fügt. Es wurde die Aktivität von Eiweiß gegenüber Trypsin und a-Chymotrypsin des Rindes gemessen. Da die Antitrypsin-Wirksamkeit von Wachtel-Eiweiß sehr groß ist, wurden die Bestimmungen der Antitrypsin-Wirksamkeit unter Verwendung von auf l/lO verdünntem Eiweiß durchgeführt, und es wurde die nach 5 Minuten durch Einwirkung von 100 jug Trypsin auf Entnahmen von 10, 50, 100, 250 und 500 Y von verdünntem Eiweiß bei 37 C erhaltene Verfärbung gemessen. Die Ergebnisse sind in der Figur 1 in Form einer Kurve dargestellt, wobei an der Ordinate die optischen Dichten und an der Abszisse das Gewicht des auf l/lO verdünnten Eiweiß in γ aufgetragen sind.
In gleicher Weise wurde die Aktivität des Eiweiß gegenüber a-Chymotrypsin bestimmt, jedoch ist diese nicht so groß wie die vorstehende. Die mit Versuchen erhaltenen Ergebnisse, die unter Verwendung von 1 mg α-Chymotrypsin und Entnahmen von 10, 100 und 50Or unverdünntem Eiweiß durchgeführt wurden, sind in der Figur 2 aufgeführt, wo an der Ordinate die optischen Dichten und an der Abszisse das Gewicht an Eiweiß in τ aufgetragen sind.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Isolierung einer Ovomucoid-Fraktion mit erhöhter Antitrypsin-Aktivität aus Wachtel-Eiweiß, sowie das dabei erhaltene Produkt und seine Anwendung als Arzneimittel.
Das erfindungsgemäße Verfahren besteht in einer Anpassung der klassischen Isolierungsverfahren für das Ovomucoid.
Das verwendete Eiweiß stammte aus der Zucht von R. Cordonnier, dessen hochleistungsfähiger Zuchtstamm sich durch eine beson-
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dere Albumen-Menge auszuzeichnen scheint. In jedem Falle erfolgten die den Migrationen vorausgehenden Entnahmen an frischen (in der gleichen Woche gelegten) Eiern. Das Eiweiß wurde in kleinen sterilisierten und mit Kunststoff-Stopfen verschlossenen Plexiglasröhrchen konserviert. Es kann mehrere Monate in einem kalten Raum von 4 C ohne Änderung des Proteinogramms konserviert werden. Eine längere Lagerung im Eisschrank und vor allem aufeinanderfolgende Erstarrungsvorgänge (bzw. ununterbrochenes Dekongelieren) sollten jedoch vermieden werden.
Die aktive Fraktion wird wie folgt isoliert und gereinigt:
250 cm Eiweiß werden durch langsamen Zusatz eines Volumenteils einer Lösung von Trichloressigsäure-Aceton (1 Volumenteil 0,5m-Trichloressxgsäure + 2 Volumenteile Aceton) auf den pH-Wert 3,5 gebracht, wobei man langsam einen Glasstab in dem das Eiweiß enthaltenden Kristallisationsgefäß bewegt. Die resultierende cremeartige Flüssigkeit bringt man für 48 Stunden bei +4°C in ein Dekantiergefäß ein. Die überstehende Flüssigkeit muß klar sein, und es muß erneut dekantiert oder filtriert werden, bis man zu diesem Ergebnis kommt. Hierzu kann die überstehende Flüssigkeit oder das Filtrat 5 Hinuten auf 80 C erwärmt und anschließend erneut filtriert werden.
Die Fraktion mit einer gesteigerten Antitrypsin-Aktivitüt fällt durch Zusatz von 2 bis 3 Volumenteilen Aceton zum Filtrat aus, wobei diese Ausfällung mehrfach wiederholt werden kann und der Niederschlag entweder gewonnen oder filtriert wird. Die in Wasser gelöste Ausfällung wird dialysiert, um überschüssige Trichloressigsäure zu entfernen, erneut ausgefällt, mit Aceton und Äther gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet.
Man erhält so etwa 1 mg wirksames Produkt pro 100 ml Eiweiß. Um eine maximale Wirksamkeit zu erhalten, ist es günstiger, die Erwärmungsphase für die überstehende Flüssigkeit auszulassen, obwohl die Antitrypsin-Wirksamkeit des Eiweiß außerordentlich widerstandsfähig gegen Wärme ist, was die nachfol-
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gende Tabelle I zeigt, in der die prozentuale Aktivität aufgeführt ist, die nach Erwärmen (auf 100 C beim pH-Wert 6 und auf 85 C beim pH-Wert 8,6) nach verschiedenen Zeiten erhalten wird.
Tabelle I
% Wirksamkeit % Wirksamkeit
Minuten r85°C
(pH = 8,6
0 '100°C 100
15 pH = 6,0 55
30 100 20
45 36 10
60 15 5
8
2
Es wurde die Antitrypsin-Wirksamkeit des so erhaltenen trockenen Produkts, das einen Gegenstand der Erfindung darstellt, bestimmt. Die Antitrypsin-Aktivitätseinheit wird unter Bezug auf kristallines Trypsin als Standard definiert und entspricht der Menge an aktivem Produkt (in ug), die bei 0 C in einer Trypsinlösung von 50 ug/ml in einem Boratpuffer vom pH-Wert 7,9, die
10 Mol CaCIp enthält, die Hydrolysegeschwindigkeit des Substrats um 50 % verringert. Unter diesen Bedingungen weist das erfindungsgemäße Produkt im trockenen Zustand einen Titer von etwa 100 Antitrypsin-Einheiten pro mg auf.
Es wurde versucht, die erfindungsgemäße aktive Fraktion unter Auswertung des Proteinogramms des gesamten Eiweiß und der aktiven Fraktion, die durch Elektrophorese an Stärkegel und durch Immunoelektrophorese erhalten wurden, zu identifizieren.
Die Technik der Wahl zur Trennung der Wachtel-Eiweißproteine ist die Elektrophorese an Stärkegel, horizontal in diskontinuierlichem System (Tris-Citrat-Puffer vom pH-Wert 8,6), wobei
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die Proteine mit Amid-Schwarz entwickelt werden. Durch diese Technik wurde es möglich, die verschiedenen das Eiweiß bildenden Proteine (G. Lucotte und M. Kaminski, Exp.Anim. 1, 21-41) in dem in der Figur 3 dargestellten Proteinogramm I festzustellen Ca1, a2» a3 sind die Prä-Ovalbumine; A1, A2, A3 die Ovalbumine; pA das Post-Ovalbumin; Gp und G3 die Ovoglobuline; C1 und C- das Conalbumin; OM das Ovomakroglobulin; die Proteine X und Y und L das Lysozym).
Bei der Analyse der erfindungsgemäß isolierten aktiven Fraktion mittels der gleichen Elektrophorese-Methode erhält man ein Proteinogramm II, das ebenfalls in der Figur 3 in Gegenüberstellung zum Gesamt-Eiweiß dargestellt ist und die Anwesenheit von zwei Proteinen zeigt: das eine wandert wie das Post-Ovalbumin und ist durch dieses Charakter!stikum gänzlich mit dem aviären Ovomucoid gleichstellbar (Inhibitor für normale Proteasen), das zweite wandert wie das Protein Y, was auf eine Gleichstellbarkeit mit dem Ονο-Inhibitor (Inhibitor für prokaryotische Proteasen) schließen läßt.
Darüber hinaus wurden das Eiweiß einerseits und die erfindungsgemäße aktive Fraktion andererseits durch Immunoelektrophorese analysierti man erhält ein Anti-Eiweiß-Serum durch Immunisieren von Kaninchen mit Eiweiß. Im Verlauf der Immunoelektrophorese fallen die Proteine des Eiweiß mit den Antikörpern des Anti-Eiweiß-Serums In Form von Bögen aus. Die Interpretation dieser Bögen oder Banden, von denen die wichtigsten in der Figur 4 dargestellt sind, ermöglicht die Auffindung der verschiedenen in dem durch Elektrophorese erhaltenen Proteinogramm aufgezeigten Proteine, d.h. insbesondere der Flecken (1) β Ovalbumin, (2) = Post-Ovalbumin, (3) = Conalbumin.
In dem Immunoelektrophorese-Diagramm der erfindungsgemäßen Fraktion, das in gleicher Weise erhalten wurde und ebenfalls in der Figur 4 dargestellt ist, sind noch zwei Banden vorhanden, wovon eine (21) dem Post-Ovalbumin entspricht und die zweite (I1), bezogen auf die erste, kathodisch wandert. Die
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erfindungsgemäße aktive Fraktion besteht daher im wesentlichen aus einem Post-Ovalbumin und einem anderen, dem Ovo-Inhibitor gleichstellbaren Protein.
Es wurde auch die pharmakologisehe Aktivität der erfindungsgemäßen Ovomucoid-Fraktion untersucht:
A) beim Tier:
Unterrsuchun2_der;_Ant±ri±starni.n—Wi
Diese Untersuchung wurde durchgeführt an:
isolierten Organen (Ileum der Ratte und des Meerschweinchens);
am arteriellen Blutdruck und der Atmung des mit Histamin behandelten Kaninchens;
gegenüber der DLcn von Histamin bei der Maus.
Bei diesen drei vorstehenden Versuchsreihen zeigte die cvomucoide Fraktion des Wachtel-Eiweiß keine antihistaminische Wirkung.
Bei den während mehrerer Tage mit der erfindungsgemäßen ovomucoiden Fraktion präventiv behandelten Tieren (Ratten, Mäuse, Kaninchen, Meerschweinchen) beobachtete man eine variable Schutzwirkung gegenüber Unterdruck und histaminischem Bronchospasmus.
Dagegen wurde beim Hund mit einem natürlichen Ekzem oder einem kreisförmigen Haarausfall allergischen Ursprungs nach der Verabreichung von vier Dosierungen (eine Dosis = 40 γ des Produkts in wäßriger Lösung) pro Tag während 9 Tagen mit einer anschließenden 9-tägigen Unterbrechnung und schließlich einer erneuten 9-tägigen Behandlung eine Verschlimmerung der kutanen Merkmale während der ersten Behandlung vom 3. bis zum 6. Tag festgestellt, worauf am Ende der Behandlung eine leichte Besserung folgte. Zu Beginn der zweiten Behandlung trat eine erneute, mitunter heftige kutane Reaktion auf, und am Ende der zweiten Behandlung er-
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gab sich eine wesentliche Besserung der kutanen Merkmale (die bis zum völligen Verschwinden während mehrerer Monate - im Durchschnitt 6 - und in einigen Fällen während mehrerer Jahre reichte).
Beim in der Folge erneuten Auftreten führt eine neue Behandlung zur gleichen Anfangsreaktion, worauf neuerlich die Merkmale an der Haut verschwinden.
Gleichzeitig wurden eine Besserung des Allgemeinzustands, eine Wiederkehr der Libido und humorale Änderungen (Senkung der Azotämie) festgestellt. Um diarrhoetische Erkrankungen zum Verschwinden zu bringen, muß man hohe Dosierungen verwenden (30 Dosierungen von 40 y- pro Tag während 2 bis 3 Mo-
naten).
B) Beim Menschen:
Das polyallergische Asthma wurde auf buccalem bzw. oralem Wege (6 bis 8 Dosierungen von 40 v· jeden 4. Tag) während eines Jahres behandelt.
Es wurde eine fortschreitende Besserung mit einer Umwandlung des Asthmas in einen Husten, anschließend in eine Rhinitis und schließlich Verschwinden der Rhinitis festgestellt, wobei alle diese Phänomene sehr progressiv auftraten. Die Unterbrechung der Behandlung führt zu einem progressiven Wiederauftreten der Erkrankung, 4 Monate oder 1 Jahr später.
Es wurden Untersuchungen zur Dosierung entsprechend dem Alter durchgeführt: Die Behandlung wurde mit einer ersten fortschreitenden Kur von 3 bis 7 Dosierungen pro Tag während 7 Tagen eingeleitet, worauf eine 9-tägige Unterbrechung folgte, dann mit einer etwas höheren Dosis als der ersten Dosis 9 Tage lang behandelt wurde, erneut 9 Tage unterbrochen und schließlich eine Mini-Kur von 6 Tagen mit 6 Dosierungen pro Tag durchgeführt wurde. Es wurde festgestellt, daß bei mehr als 80 % der Fälle zwischen dem 3. und
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und 6. Tag eine Verschlimmerung der ursprünglichen Erkrankung (oder eine Umwandlung des Asthmas in ein Ekzem) erfolgte, worauf eine progressive Besserung folgte. Die gleiche Reaktion zeigte sich nach der zweiten und auch der dritten Kur. Die klinische Besserung erfolgt dann progressiv und bestätigt sich nur etwa 10 bis 15 Tage nach beendeter Behandlung. Sie hält mehrere Monate (im Durchschnitt 4 bis 6 Monate) bis zu mehreren Jahren (in einigen Fällen 5 bis 6 Jahre ) an.
Es ist unerläßlich, daß sich der allergische Patient in Kontakt mit den verantwortlichen Alergenen befindet. Im Falle von Pollinosen beispielsweise weist die Behandlung keinen Präventiv-Effekt auf; die Krankheit muß während des klinischen Auftretens behandelt werden.
Andererseits kann man selbst nach 8-jähriger klinischer Ruhe feststellen, daß Reaktionen durch eine neue Behandlung verschwinden.
Als Nebenwirkungen wurden im Verlauf der Behandlungen außer den vorstehend genannten Verschlechterungen ζwischenzeitliehe Kopfschmerzen, selten Unverträglichkeiten in Verdauungsbereich, ein starker Schleimauswurf und eine manchmal svarke, jedoch vorübergehende Asthenie festgestellt.
Bei den behandelten Erkrankten wurde auch untersucht:
a) die Wirkung auf die Eosinophile;
Ein Vergleich des Gehalt der Eosinophile vor und nach der Behandlung zeigt beträchtliche Änderungen mit gelegentlich einer deutlichen Häufung in der ersten Zeit (3 Wochen bis 1 Monat) und anschließend einer stetigen Regularisierung ;
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- ια - 2728^25
b) die Wirkung auf IGE;
Eine erste Untersuchung an 60 Fällen mit Bestimmung vor und nach der Behandlung (durch Radio-Immunologie oder Immunodiffusion) zeigt manchmal starke Modifizierungen (Koeffizient 10) in 90 % der Fälle in einer Richtung (Senkung um 60 %) oder in der anderen Richtung (Erhöhung um 30 %). Anschließend stellt man eine langfristige Normalisierung fest (etwa 2 Jahre).
c) die Wirkung auf die anderen humoralen Konstanten;
Man stellte eine Steigerung des Gehalts an roten Blutkörperchen, eine Senkung von zu Beginn erhöhten Leukozyten, eine geringe Auswirkung auf die Sedimentationsgeschwindigkeit und geringe Änderungen der Lipid-Bilanz fest; im Gegensatz hierzu wurde eine deutliche Senkung von zu Beginn erhöhten Harnsäuregehalten festgestellt. In mehreren Fällen wurden auch Normalisierungen einer zu Beginn erhöhten Glykämie, das Verschwinden von verschiedenen Glykosurien und Albuminurien, die zu Beginn vorlagen, festgestellt;
d) die Wirkung bei Hautuntersuchunqen;
Werden bei den Patienten Hautuntersuchungen vor und nach der Behandlung durchgeführt, so beobachtet man in zahlreichen Fällen eine Verschlimmerung dieser Tests, eine Positivierung von negativen oder zweifelhaften Tests.
Untersuchungen, die mehrere Jahre nach beendeter Behandlung durchgeführt werden, zeigen eine Rückkehr zu den ursprünglichen Tests. In keinem Falle ergibt sich eine völlige, selbst teilweise Negativierung nach 10-jähriger klinischer Ruhe.
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Therapeutische Indikation^
Das erfindungsgemäße Produkt ist bei der Behandlung von verschiedenen Allergieformen verwendbar:
- den imraunoallergischen Reaktionen vom Typ I oder den allergischen Erkrankungen des Typs I:
- allergisches Asthma,
- nicht jahreszeitlich bedingte allergische Rhinitis (und Laryngitis),
- Polliniosis (mit Rhinitis, Konjuktivitis, gegebenenfalls Asthma,
- akute Urticaria,
- Verhinderung des anaphylaktisehen Schocks (Penicillin , Hautflügler-Stiche),
- verschiedene Verdauungsstörungen (Quincke-Ödem, Erbrechen),
- den Allergien vom Typ II (Inhibierung der Fixierung des Komplements) und
- den Allergien des Typs III und IV (Ekzeme).
Es kann auch erfolgreich bei hepatischen Erkrankungen (Nachwirkungen der Hepatitis, Zirrhose), bei Pankreatiten und bei a-1-Antitrypsin-Mangel verabreicht werden.
Die Originalität der Behandlung mit dem erfxndungsgemaßen Produkt drückt sich in folgenden Punkten aus:
1.) Sie erfordert die Anwesenheit von feindlichen Antigenen für eine wirksame Behandlung: Beispielsweise ist es bei der Behandlung von polyallergischem Asthma bei Entfernung von Federn während der Behandlung nur möglich, zu unvollständigen Ergebnissen zu gelangen, da die Allergie gegen Federn weiter bestehenbleibt; die Behandlung einer Allergie gegen Federn-Staub-Pollen ist nur in der Pollen-Saison wirksam oder erfordert eine erneute Kur während dieser Zeit; 709881/1079
2.) in einer semi-raschen Wirkung: Man erhält das therapeutische Ergebnis erst nach drei Wochen oder einem Monat, jedoch hält es 6 Monate bis zu mehreren Jahren an;
3.) in einer Modifizierung des Gebiets: Diese manifestiert sich in der Einwirkung auf die IGE und durch kutane Tests einerseits sowie andererseits durch die Entwicklung klinischer Allergie-Zeichen im Verlauf dieser Therapie (stetige Verbesserung, Umwandlung von Asthma in Husten, anschließend Rhinitis oder von Asthma in ein Ekzem und umgekehrt) ;
4.) in einer endgültigen Heilung: Die Behandlung mit dem erfindungsgemäßen Produkt muß nur dann v/i eder auf genommen werden, wenn sich ein Rückfall anzeigt;
5.) in keiner direkten antihistaminischen Wirkung, weder beim Menschen noch beim Tier;
6.) in keiner vorbeugenden Wirkung, wie sie sich vergleichsweise bei der Desensibilisierung mit Corticoiden oder Allergoglobulinen ergibt.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel wirkt auf zweifache Weise:
a) antigene atopische Wirkung, die zunächst einen Antigen-Antikörper-Konflikt bewirkt, worauf eine Blockierung-Inhibierung der vorher existierenden Antikörper erfolgt (Tachyphylaxie-Wirkung);
b) Antiprotease-Wirkung, insbesondere Antitrypsin-Wirkung beim Menschen.
Es scheint daher, daß das erfindungsgemäße Ovomucoid einen vorher bestehenden Mangel ausgleichen kann, einen Mangel, der nur auf dem Immunitätsgebiet liegen kann.
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Nach dieser Hypothese würde es insbesondere beim Bronchialasthma einfach eine Ergänzung für die menschlichen Phänotypen mit einem Mangel an α-1-Antitrypsin darstellen und das zur Aufhebung der Wirkung durch Granulozyten freigesetzter Elastase notwendige Inhibierungsniveau wiederherstellen.
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Claims (4)

Patentansprüche
1. Ovomucoid-Fraktion von Wachtel-Eiweiß mit einer Rinder-Antitrypsinaktivität in der Größenordnung von 100 Einheiten pro mg, bestehend im wesentlichen aus einem Postovalbumin und einem dem Protein Y entsprechenden Protein gemäß dem durch Elektrophorese an Stärkegel erhaltenen Proteinogramm.
2. Verfahren zur Herstellung der Ovomucoid-Fraktion von Wachtel-Eiweiß gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man:
- nach Zugabe von einem Volumenteil einer Lösung von Trichloressigsäure in Aceton, die 1 Volumenteil O,5m-Trichloressigsäure pro 2 Volumina Aceton enthält, bei 4°C absitzen läßt und nach 48 Stunden die klare überstehende Flüssigkeit abtrennt ,
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ORIGINAL INSPBCTED
- die Antiproteasen-Fraktion durch Zugabe von 2 bis 3 Volumina Aceton zur überstehenden Flüssigkeit ausfällt und die Ausfällung durch Filtrieren abtrennt,
- die Ausfällung in Wasser löst und sie zur Entfernung von überschüssiger Trichloressigsäure dialysiert, anschließend mit Aceton erneut ausfällt, die Ausfällung mit Aceton und Äther wäscht und sie bei Raumtemperatur trocknet.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsmaterial das Eiweiß der Wachtel Coturnix coturnix japonica verwendet.
4. Arzneimittel, insbesondere geeignet zur Behandlung von Allergien, enthaltend die aktive Fraktion gemäß Anspruch 1, gegebenenfalls zusammen mit üblichen Hilfs- und Trägerstoffen.
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