DE2939557A1

DE2939557A1 - Verfahren zur herstellung eines mit aldehyd behandelten allergens und das bei dem verfahren erhaltene produkt

Info

Publication number: DE2939557A1
Application number: DE19792939557
Authority: DE
Inventors: David George Marsh
Original assignee: Johns Hopkins University
Current assignee: Johns Hopkins University
Priority date: 1978-10-04
Filing date: 1979-09-28
Publication date: 1980-04-24
Also published as: ES484702A1; PH15825A; GR69120B; AU523526B2; AT368006B; IL58238A; GB2034585A; SE7908199L; DE2939557C2; FR2437837A1; BE879173A; IT1193763B; IL58238A0; IT7950450A0; JPS55115826A; CA1122525A; FR2437837B1; CH648757A5; US4234569A; AU5111979A

Description

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Dipl. Ing. H. Weidemann, Dipl. Pfyr Dr!r.FinckV " ^l "' Dipl. Ing. F. A. Weidmann, Dipl. Chera. B. Huber

^D-^ln9. H.Liska 2939557

iie 22, 8000 Mündien 86

Docket 114-102
HWEMY

THE JOHNS HOPKINS UNIVERSITY

Baltimore, Maryland 21218, V.St.A.

Verfahren zur Herstellung eines mit Aldehyd behandelten Allergens und das bei dem Verfahren erhaltene Produkt

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Patienten, die an Allergien des unmittelbaren Typs (Atopien) leiden, besitzen die Kapazität, daß sie spezielle Arten allergischer Antikörper (Reagine) erzeugen können, wenn sie bestimmten Substanzen (Allergenen), gegenüber denen sie empfindlich sind, ausgesetzt sind. Die Reagine haften stark an bestimmten Histamin enthaltenden Zellen einschließlich der Mastzellen des Epithels. Danach findet bei einer späteren Einwirkung des sensibilisierenden allergenen Materials eine physikalische Kombination zwischen dem bzw. den Allergenien) und ihren homologen, zellgebundenen Reaginen statt, was zu allergischen Manifestationen an den Stellen der Reagin-Allergen-Kombination führt. Allergische Individuen sind ebenfalls in der Lage, die sog. "Blockierungsantikörper" vom Nicht-Reagintyp zu erzeugen, die mit dem Allergen eine Kombination eingehen können und dieses inaktivieren können, im allgemeinen ohne unerwünschte Nebenreaktionen. Die reaginische Aktivität wurde dem Immunoglobulin E (IgE) und die ⁿBlockierungs"-Aktivität wurde dem IgG im Serum und dem IgA und dem IgG in den Sekretionen zugewiesen.

Es ist seit langem klinische Praxis, einem allergischen Patienten allmählich zunehmende Dosen von wäßrigen Extrakten, die das bzw. die allergene(n) Material(ien), gegen das bzw. die der Patient empfindlich ist, enthalten, zu injizieren. Historisch ist die Grundlage für diese Behandlung hauptsächlich eine Erhöhung der Konzentration an Schutzblockierungs-Antikörper im Serum (und anderer Körperfluide) auf einen Gehalt gewesen, wo diese wirksam mit dem zellgebundenen Reagin für Allergene, die den Körper betreten, konkurrieren können, wodurch die allergischen Reaktionen inhibiert werden. Man nimmt heute an, daß der Mechanismus bzw. die Mechanismen, gemäß dem bzw. denen die Immunotherapie zur Verbesserung der allergischen Symptome führt, komplexer ist bzw. sind. In bestimmten Fällen wurde gefunden, daß diese Therapie ebenfalls die Produktion von Reaginen unterdrückt und

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die Zellenansprechbarkeit gegenüber dem injizierten Allergen erniedrigt.

Was auch immer der genaue Mechanismus bzw. die genauen Mechanismen ist bzw. sind, gemäß dem bzw. denen die Immunotherapie einen symptomatische Besserung bewirkt, haben verschiedene Untersuchungen gezeigt, daß es wesentlich ist, eine entsprechend große Dosis an Extrakt dem Patienten zu injizieren, damit die Behandlung wirksam ist. Leider müssen bei der konventionellen Behandlung die immunisierenden Dosen des allergenischen Extrakts sehr allmählich erhöht werden, damit die Gefahr eines allgemeinen allergischen (anaphylaktischen) Ansprechens bei dem Patienten minimal gehalten wird.

Die Hauptnachteile dieser Immunotherapie sind: (1) während vieler Wochen sind wiederholte Injektionen erforderlich, (2) die Behandlung ist selten vollständig wirksam bei der Beseitigung des allergischen Syndroms und (3) die Gefahr einer allgemeinen anaphylaktisehen Reaktion ist immer bei jeder Behandlungsstufe vorhanden.

Die ursprüngliche Therapie wurde daher mit dem Ziel modifiziert, diese Nachteile zu beseitigen. Derzeit übliche Formen der Behandlung umfassen die Immunisierung des Patienten mit entweder einer Wasser-in-Öl-Emulsion des allergenischen Extrakts oder die Einarbeitung eines langsamen Freigabeadjuvans, wie Aluminiumoxidgel, oder eines Alginats mit einem Extrakt des allergenischen Materials. Diese Verfahren sind nicht vollständig zufriedenstellend, bedingt durch das Auftreten gewisser anaphylaktischer und einiger toxischer Reaktionen beim Patienten, oder deshalb, daß diese Zubereitungen klinisch nicht ausreichend wirksam sind.

Verschiedene Forscher haben allergenische Materialien chemisch oder physikalisch behandelt, um ihre allergenischen

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Eigenschaften wesentlich zu vermindern, wobei sie jedoch ihre Kapazität beibehalten sollen, die allergischen Individuen gegenüber dem nativen Allergen zu schützen. Die Immunotherapie allergischer Individuen unter Verwendung solcher modifizierten Allergene würde, so hatte man gehofft, die gewünschten Immunisierungseigenschaften des nativen Allergens beibehalten einschließlich seiner Fähigkeit, die Bildung von Blockierungs-Antikörper gegen das native Allergen in wesentlichen Mengen zu induzieren. Weiterhin würde die reduzierte Allergenizität solcher modifizierten Materialien die Verwendung wesentlich erhöhter Dosen an Immunisierungsmaterial erlauben, und somit würde die Menge an gebildeten Schutzblokkierungs-Antikörper wesentlich erhöht werden.

Es wurde weiterhin gefunden, daß bei der Verwendung einer Formaldehydlösung mit oder ohne bestimmte Zusatzstoffe mit niedrigem Molekulargewicht die große Hauptzahl der Allergen enthaltenden Substanzen so modifiziert werden kann, daß die Nachteile der mativen Allergene hinsichtlich ihrer Verwendung bei der Immunotherapie beseitigt werden. (Im folgenden werden irgendwelche Allergen enthaltenden Substanzen einfach als "Allergen" bezeichnet, obgleich es bekannt ist, daß nicht alle Komponenten von Allergen enthaltenden Substanzen notwendigerweise allergenisch sind.)

Entsprechend der GB-PS 1 282 163 wurden wasserunlösliche oder kaum in Wasser lösliche, mit Dialdehyd modifizierte Pollenmaterialien, die potentiell bei der Behandlung allergischer Patienten nützlich sind, hergestellt. Entsprechend Patterson et al. (J.Immunol. 110, 1402, 1973) wurden wasserlösliche, mit Glutaraldehyd modifizierte Kreuzkrautpolymere hergestellt. Eine spätere Untersuchung von mit Glutaraldehyd modifiziertem Kreuzkraut-Antigen E (Metzger et al., New Eng.J.Med. 295, 1160, 1976) schlägt vor, daß dieses Material nützlich sein kann bei der Therapie von gegenüber Kreuzkraut allergischen Subjekten.

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Die Anmelderin hat jetzt gefunden, daß verbesserte, mit Formaldehyd und niederem gesättigtem allphatischem Dialdehyd behandelte, Allergen enthaltende Materialien durch Umsetzung in einer ersten Stufe bei niedriger Temperatur, normalerweise um 10⁰C, mit Formaldehyd und/oder einem Dialdehyd und anschließend bevorzugt, aber nicht notwendigerweise, mit einer zweiten Stufe bei erhöhter Temperatur, normalerweise um 32⁰C, gegebenenfalls durch weitere Stufen bei ähnlich erhöhten Temperaturen, bei denen Amine, Aminosäuren und verwandte Verbindungen gegebenenfalls bei irgendeiner oder bei einer Kombination der Stufen verwendet werden können, und wobei der Formaldehyd oder irgendein Dialdehyd in irgendeiner Kombination oder Reihenfolge bei dem stufenweisen Verfahren verwendet werden kann, erhalten werden. Bei Bezugnahme auf die neuen, mit Aldehyd behandelten Allergene wird der Ausdruck "mit Aldehyd modifiziert" darauf beschränkt, modifizierte Allergene zu beschreiben, bei denen inter- oder intramolekulare Vernetzungsbindungen zwischen oder innerhalb der Allergenmoleküle selbst und zwischen dem Allergen und in dem Reaktionsgemisch vorhandenen, anderen reaktiven Molekülen erzeugt worden sind.

In der US-PS 3 135 662 und einem verwandten Artikel in Brit. J. Exp. Path, 44, 177 (1963), wird die Toxoidierung von gereinigtem Diphtherientoxin mit Formalin in Natriumbicarbonat (0,596 Gew./Vol.) bei einem pH von 7,5 beschrieben. Die Toxoidierung veräuft bei Zimmertemperatur und scheint in 3 bis 4 Wochen vollständig zu sein, was durch intrakutane Versuche bei Meerschweinchen festgestellt wurde. Versuche für die Nicht-Toxizität (200 Lf-Einheiten in einem Volumen von 5,0 ml, in Meerschweinchen subkutan injiziert) zeigen eine späte Paralyse bei allen Meerschweinchen. Die Inkubation bei 30 bis 32⁰C während weiterer 3 Wochen nach der Toxoidierung scheint bei Zimmertemperatur vollständig zu sein und ergibt ein Produkt, das, nachdem das freie Formalin durch Ultrafiltration entfernt worden ist, keine Toxizität

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zeigt. Nach dem Lagern kehrt es jedoch in den toxischen Zustand zurück. Entsprechend diesen Angaben wird die Neigung für eine Reversion oder Umkehr durch Zugabe verschiedener Amine und Aminosäuren verhindert.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind neue, mit Formaldehyd und niedrigen, gesättigten, aliphatischen Dialdehyden behandelte Allergenderivate, die hergestellt werden, indem man die Allergene chemisch bei milden Bedingungen mit verdünnten Aldehyden einschließlich ihrer Gemische in einer Vielzahl von Stufen reagieren läßt, bevorzugt wird die erste Stufe bei niedriger Temperatur über dem Gefrierpunkt der Lösung und normalerweise bei etwa 5 bis 15°C durchgeführt. Die nachfolgende(n) Stufe(n) wird bzw. werden bei einer Temperatur bzw. Temperaturen von etwa 25 bis 40°C durchgeführt, mit der Maßgabe, daß alle Reaktionen, bei denen Formaldehyd auftritt, in nicht-phenolischer Umgebung durchgeführt werden. Die Reaktion mit Kombinationen (Gemischen) aus Aldehyden kann in einer einzigen Stufe durchgeführt werden.

Die so behandelten Allergene können stark gereinigt oder teilweise gereinigt werden oder sie können rohe Extrakte sein. Die Dialdehyde besitzen die Formel

0 0 HC-(-J

worin η für 1 bis etwa 6 steht. Der Ausdruck "Aldehyd", wie er in der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, betrifft den zuvor angegebenen Formaldehyd und niedrige, gesättigte, aliphatische Dialdehyde, wie Glutaraldehyd (n = 3)» von denen jeder allein oder im Gemisch mit irgendeinem anderen während des stufenweisen Verfahrens verwendet werden kann.

Der Ausdruck "nicht-phenolisch" soll bedeuten, daß höchstens Spurenmengen an zugegebenen phenolischen Verbindungen in der Umgebung der Aldehydreaktion vorhanden sind. Dieser

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letztere Ausdruck schließt die Anwesenheit phenolischer Hydroxygruppen nicht aus, von denen bekannt ist, daß sie die Allergene per se natürlich, in den meisten Fällen, als Teil der komplexen proteinartigen Struktur enthalten.

Das erfindungsgemäße Verfahren führt zur Erzeugung von mit Aldehyd behandelten Allergenen mit niedriger allergenischer Reaktivität bei allergischen Mengen, die jedoch ihre gewünschten Immunisiereigenschaften des nativen (unbehandelten) Allergens beibehalten einschließlich der Fähigkeit, wesentliche Mengen an Blockierungs-Antikörper zu induzieren, die mit den nativen Allergenen nach der Injizierung in Menschen stark kreuz- bzw. vemetzungs-reaktiv sind. Es wurde gefunden, daß eine längere Therapie mit solchen mit Aldehyd behandeltenen Allergenen eine wesentliche Unterdrückung der Serum IgE-Antikörper gegen die entsprechenden Allergene bewirkt. Große, therapeutisch wirksame Dosen solcher mit Aldehyd behandelten Allergene können allergischen Menschen verabreicht werden, wobei die Gefahr, systemischer, allergischer Reaktionen stark verringert ist, verglichen mit ähnlich großen Dosen von nativen Allergenen. Dadurch kann der Arzt die Zahl der Injektionen der mit Aldehyd behandelten Allergene, bezogen auf die der nativen Allergene, verringern. Die mit Aldehyd behandelten Allergene sind weiterhin für die Immunisierung anderer Säugetiere für die Blockierung der Antikörperproduktion nützlich.

Die Anmelderin nimmt an, obgleich sie nicht auf irgendeine Theorie beschränkt sein will, daß ein Hauptgrund, warum die erfindungsgemäßen, mit Aldehyd modifizierten Allergene besser sind als die zuvor beschriebenen, in der Verwendung einer niedrigen Reaktionstemperatur bei der ersten Stufe liegt. Bei dieser niedrigen Temperatur findet eine inter- und intramolekulare Vernetzung langsam ohne nachteilige thermische oder chemische Denaturierung der kritischen labilen Immuno-Determinanten an den Allergenen statt, wobei solche nachtei-

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ligen Reaktionen im Gegensatz zu der Forderung stehen, die gewünschten Immunisierungseigenschaften in dem aldehydmodifizierten Allergen beizubehalten. Die entstehenden Vernetzungen stabilisieren das Molekül für die nachfolgenden Reaktionen bei höherer Temperatur, die in einer oder mehreren Stufen unter Verwendung des gleichen oder eines anderen Mono- oder Dialdehyds durchgeführt werden können. Die optimale Ausnutzung von mehr als einem Dialdehyd bewirkt eine bessere Flexibilität in der Reaktionssequenz, wodurch die aldehydmodifizierten Allergene weniger allergenisch mittels einer Reaktion gemacht werden können, bei der eine Vielzahl unterschiedlicher Aldehyde verwendet werden kann.

Der Erfindung liegt somit das Ziel zugrunde, eine neue und verbesserte Klasse von aldehydmodifizierten Allergenen zur Verfügung zu stellen. Erfindungsgemäß sollen neue Verfahren für die Bildung von aldehydmodifizierten Allergenen zur Verfügung gestellt werden.

Obgleich die Anmelderin nicht auf irgendeine Theorie beschränkt sein will, nimmt man an, daß bei der Reaktion die Hauptvernetzungsreaktionen, an denen Formaldehyd beteiligt ist, durch die Ausbildung von inter- oder intra-molekularen Methylen-Brückenbindungen zwischen Amino einerseits und Guanidino, Säureamid und bestimmten aromatischen Gruppen (insbesondere Tyrosylresten in Proteinen) andererseits stattfinden. Obgleich dies wieder keine Beschränkung auf eine Theorie sein soll, nimmt man weiterhin an, daß hauptsächlichen inter- und intramolekularen Vernetzungsreaktionen, bei denen die Dialdehyde teilnehmen, zwischen Paaren von Aminogruppen stattfinden. Die Chemie der beiden Arten von Vernetzungen ist daher etwas unterschiedlich, und die kinetischen Werte des Dialdehyd-Vernetzungsverfahrens sind offensichtlich höher als die, bei denen Formaldehyd eine Rolle spielt. Ist ein geeigneter Zusatzstoff, wie er in der vor-

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-ff- 1ST

liegenden Anmeldung beschrieben wird, in dem Reaktionsgemisch vorhanden, kann eine ausgedehnte inter-molekulare Vernetzung zwischen den Allergenmolekülen und dem Zusatzstoff stattfinden.

Werden rohe Allergene verwendet, sollten fettartige Substanzen und nicht-allergenische Materialien mit niedrigem Molekulargewicht in den nativen Substanzen bevorzugt, obgleich nicht notwendigerweise, hauptsächlich vor der Aldehydbehandlung entfernt werden.

Rohe, allergenische Zubereitungen, die besonders für die Aldehydbehandlung geeignet sind, können durch Entfettung des nativen, Allergen enthaltenden Materials mit wasserfreiem, peroxidfreiem Diäthylather oder Petroläther und Extraktion des entfetteten Materials mit einer wäßrigen Lösung, bevorzugt gepuffert auf etwa pH 6 bis 8 (z.B. 0,125 M NH^HCO,), hergestellt werden. Nicht-allergenische Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht, die normalerweise vorhanden sind, können aus dem Extrakt durch Dialyse oder Ultrafiltration durch eine semipermeable Membran (z.B. Visking-Schlauch, Milliporen-Membran, Amicon-Hohlfaservorrichtung mit einem geeigneten Molekulargewichtswegschnitt, normalerweise im Bereich von etwa 3000 bis 10 000 Dalton und bevorzugt 3000 bis 5000 Dalton) entfernt werden, obgleich Gelfiltration oder ein ähnliches Verfahren, die dem Fachmann geläufig sind, ebenfalls verwendet werden kann, um ein ähnliches Resultat zu ergeben. Alemativ können die Materialien mit hohem Molekulargewicht ohne signifikante, irreversible Denaturierung von dem Gesamtextrakt durch ein Salz- oder Lösungsmittelpräzipitationsverfahren ausgefällt werden. Diese Materialien mit hohem Molelulargewicht können aus den präzipitierten Materialien in Form einer wäßrigen Lösung rekonstituiert werden. Gereinigte oder teilweise gereinigte, allergenische Substanzen können nach irgendeinem der normalerweise für die Reinigung von Makromolekülen von komplexen Gemischen verwen-

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deten Verfahren gereinigt werden. Geeignete Reinigungsverfahren wurden in der Literatur für Fischallergene, Kreuzkrautpollen, Roggen- und Timotheusgras-Pollen, Fungi, Hausstaubmilben und Insektengifte beschrieben, obgleich dies nicht die einzigen Verfahren sind noch die einzigen allergenischen Materialien, die bei dem Aldehydbehandlungsverfahren verwendet werden können.

Die vorliegende Erfindung ist nicht auf irgendein besonderes, Allergen enthaltendes Material oder einen Extrakt beschränkt. Jedoch können Pflanzenpollenallergen enthaltende Materialien, insbesondere solche von Gräsern, Bäumen und Unkräutern, die bei der Allergie eine große Rolle spielen, extrahiert und mit Erfolg mit den Aldehyden erfindungsgemäß behandelt werden. Beispiele von Pollen aus der Grasfamilie (Gramineae), die für die Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen Wiesenschwingelgras (Festuca elatior), Blaues Kentuckygras (Poa pratensis) und Obstkulturen (Dactylis glomerata) des Stammes Festuceae; perennierendes Roggengras (Lolium perenne) und Italienisches Roggengras (Lolium multiflorum) des Stammes Hordeae; Timotheus (Phleum pratense) und Rotspitze (Agrostis palustris) des Stammes Agrostideae; und Süßes Ruchgras (Anthoxanthum odoratum) des Stammes Phalarideae. Vergleichsbeispiele von Baumpollen umfassen verschiedene Species von Walnüssen, wie Juglans californica, von Birken (z.B. Betula alba), von Eichen (z.B. Quercus alba) und von Ulmen (z.B. Ulmus parvifolia). Nützliche Unkrautpollen umfassen Kurzes Kreuzkraut (Ambrosia elatior), Großes Kreuzkraut (Ambrosia trifida), Russische Distel (Salsola pestifer), Gemeiner Salbei bzw. Beifuß (Artemisia tridentata) und Englischer Wegerich (Plantago lanceolata). Andere allergenische Materialien, die behandelt werden können, umfassen Extrakte, die ganze Körper und/oder Exkrete und Sekrete von Hausstaubmilben des Genus Dermatophagoides und verwandte Arten enthalten , wobei solche Extrakte rohe Extrakte von Hausstaub, Lösungen von Nahrungsmittelallergenen

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(z.B. Extrakte von Nüssen, Gemüse, Hühnereiern usw.), Extrakte von Fungi (z.B. Alternaria, Penicillium, Aspergillus, Helminthosporium, Hefen, Basidiosporen, Ascosporen usw.), Extrakte von Pflanzensamen und -fasern (z.B. Baumwolle, Rizinus usw.), Extrakte von ganzen Körpern oder Gifte von

stechenden und beißenden Insekten (z.B. Bienen, Wespen der Familie Vespidae, deren Körper mit hellem Gelb gefärbt ist (yellow jackets), Hornissen, Wespen und Moskitos), und Extrakte von Schuppen ⁺VHaut/Haar von Tieren (z.B. Katzen, Hunde, Pferde, Meerschweinchen, Mäuse, Kaninchen usw.) mitumfassen.

Hochgereinigte oder teilweise gereinigte Allergene können ebenfalls mit einem Aldehyd behandelt werden, z.B. Gruppe I Graspollenallergen, Antigen E von Kreuzkrautpollen, teilweise gereinigte Hausstaubmilbenextrakte und Phospholipase-A von Bienengift.

Die Reaktion zwischen den rohen oder hochgereinigten allergenischen Materialien und dem bzw. den Aldehyd(en) kann in Anwesenheit eines Zusatzstoff mit niedrigem Molekulargewicht durchgeführt werden. Geeignete Zusatzstoffe enthalten normalerweise weniger als etwa 8 Kohlenstoffatome zusätzlich zu anderen, vorhandenen, funktionellen Gruppen und Beispiele hierfür sind: aliphatische Diamine; Guanidine; aliphatische Säureamide; aliphatische Carbonsäuren, die Aminogruppen enthalten, mit Einschluß aliphatischer Aminosäuren (Monoaminomonocarbonsäuren, Monoamino-dicarbonsäuren und Diamino-monocarbonsäuren), aliphatischer Hydroxyaminesäuren und aliphatischer Diamino-dicarbonsäuren; und aliphatische Verbindungen, die Kombinationen von Permutationen von einer oder mehreren Amino-, Guanidino- und Säureamidogruppen enthalten. Zusätzlich kann eine beschränkte Zahl von Hydroxygruppen in irgendwelchen der obigen Typen von Verbindungen vorhanden sein. Die Verbindungen umfassen 1,4-Diaminobutan, Lysin, Orithinin, 1,5-Diaminopimelinsäure, Arginin, Adipamid, As- ⁺'einschließlich von Haut- und Fellrückständen

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paraginsäure, Serin und Alanin. Der Zusatzstoff wird so gewählt, daß er sich chemisch mit den Pollenkomponenten während des Verfahrens der Aldehydbehandlung verbindet.

Für jede Stufe des Verfahrens hängen die Konzentrationen von Allergen, Aldehyd und irgendwelchem, in dem Reaktionsgemisch vorhanden Zusatzstoff und der pH sowie die Inkubationszeit des Reaktionsgemisches, die optimale Bedingungen für die Aldehydbehandlung ergeben, voneinander in gewissem Grad ab. Die folgenden Bedingungen sind bevorzugt. Jede Bedingung setzt voraus, daß die anderen Bedingungen innerhalb geeigneter Grenzen gehalten werden, so daß das gewünschte, mit Aldehyd behandelte Allergen erhalten wird.

Die Endkonzentration an allergenischem Material, die für die Aldehydreaktion verwendet wird, sollte bevorzugt sein: (1) so, daß alle Komponente vollständig löslich sind und (2) daß sie mit der Konzentration an Aldehyd und verwendetem Zusatzstoff verträglich ist. Bei Formaldehydreaktionen sollten die Lösungen in wäßrigem Puffer, bevorzugt bei etwa pH 7,4 bis 7,6, mit einer geeigneten Molarität hergestellt werden, so daß dieser pH-Wert während des Verlaufs der Umsetzung bei etwa 7,2 bis 7,6 gehalten wird, damit das Ablaufen der gewünschten Aldehydreaktionen optimal gehalten wird. Konzentrationen bis zu etwa 12 mg/ml an allergenischem Material (bezogen auf das Trockengewicht der Feststoffe/ml) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer bei pH 7,5+0,1 erfüllen im allgemeinen die obigen Erfordernisse, die Auswahl der Allergenkonzentration hängt in gewissem Ausmaß von der Temperatur bei der Inkubierung und *r Aldehydkonzentration ab.

Bei den Dialdehydreaktionen sollte der pH-Wert der Reaktionslösungen bevorzugt 7,0 bis 8,0 und die Allergenkonzentration 1,0 bis 2,0 mg/ml betragen.

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Die Konzentration an Aldehyd(en) in dem Reaktionsgemisch sollte nicht so groß sein, daß die gewünschten Immunisierungseigenschaften des entstehenden, mit Aldehyd behandelten Allergens nachteilig beeinflußt werden, sie sollte aber ausreichen, daß man eine ausgedehnte Zerstörung der Allergenizitat des nativen Allergens bei der besonderen Temperatur des Inkubationsgemisches erhält. Die entstehende Verringerung in der Allergenizität liegt normalerweise im Bereich von dem 100- bis 10 OOOfachen nach Beendigung des stufenweisen Verfahrens. Zusätzlich zu den oben erwähnten Faktoren variieren bevorzugte Aldehydkonzentrationen ert sprechend der Reinheit des zu behandelnden Allergens, d.h. daß das untere Ende des oben angegebenen Bereichs geeigneterweise verwendet wird bei hochgereinigten Materialien.

Allergenzubereitungen

Bei allergenischen Extrakten werden die fetthaltigen Materialien von den getrockneten Allergenquellen (Pollen, Schuppen , Fungus usw.) durch Extraktion mit trockenem Petrolather oder mit trockenem, peroxidfreiem Diäthylather entfernt. Das entfettete, allergenische Material wird bei 0 bis 5°C während etwa 15 Minuten bis zu 4 Tagen mit einer geeigneten, gepufferten Lösung (z.B. 0,125 M NH^HCO,) bei einem pH-Wert von 6,0 bis 8,0 extrahiert. Die Länge der Zeit hängt von der Art des gewünschten Extrakts und der Natur der Allergenquelle ab. Festes Material wird durch Filtration, Zentrifugieren oder nach einem ähnlichen Verfahren entfernt. Über 90% der Materialien mit niedrigem Molekulargewicht (im wesentlichen nicht-allergenisch) werden aus dem Extrakt durch Dialyse oder Ultrafiltration längs einer Membran oder einer Hohlfiltervorrichtung (Molekulargewichtabschnitt 3000 bis 5000 Dalton) oder durch Gelfiltration entfernt. Die Allergenlösung wird auf geeignete Sto ckkonzentration hinsichtlich des Trockengewichts von festem, Allergen enthaltendem Material/ml (normalerweise das 1,5-bis 2,Ofache von dem, das bei der folgenden Stufe 1 vorhan-

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10 - Xf -

den ist) durch Ultrafiltration und Dialyse gegen oder Lyophilisierung und Rekonstitution in einem Puffer, wie 0,1 M Natriumphosphat, eingestellt auf pH 7*5+ 0,1, gebracht.

Gereinigte oder teilweise gereinigte Allergene werden ebenfalls in dem gleichen Puffer für die im folgenden beschriebenen Reaktionen hergestellt.

Zusammenfassung der Reaktionsbedingungen Formaldehyd, Stufe 1

Allergenkonzentration 1,0 bis 12,0 mg/ml; Formaldehydkonzentration 0,5 bis 2,5 M; Temperatur 5 bis 15°C, bevorzugt etwa 10⁰C; pH 7,2 bis 7,6; Zeit 8 bis 32 Tage.

Formaldehyd, Stufe "n" (worin n>1 und im allgemeinen n=2)

Allergenkonzentration 1,0 bis 3,0 mg/ml; Formaldehydkonzentration 0,36 bis 0,5 M; Temperatur etwa 25 bis 40°C, bevorzugt 30 bis 34°C; pH 7,2 bis 7,6; Zeit 16 bis 35 Tage.

Dialdehvd. Stufe 1

Allergenkonzentration 1,0 bis 2,0 mg/ml; Aldehydkonzentration 0,01 bis 0,1 M, bevorzugt etwa 0,025 M; Temperatur 5 bis 15⁰C, bevorzugt etwa 10°C; pH etwa 7,0 bis 8,0; Zeit 4 bis 24 Stunden, bevorzugt 16 bis 20 Stunden.

Dialdehyd, Stufe "n" (worin n>1 und im allgemeinen n=2)

Allergenkonzentration 1,0 bis 2,0 mg/ml; Aldehydkonzentration 0,01 bis 0,1 M, bevorzugt etwa 0,025 M; Temperatur etwa 25 bis 40⁰C, bevorzugt etwa 30°C; pH etwa 7,0 bis 8,0; Zeit 16 bis 32 Stunden, bevorzugt etwa 24 Stunden.

Gegen Ende der Inkubation(en) werden überschüssige Aldehyde nach einem der folgenden Verfahren entfernt: Ausgedehnte Di-

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alyse mit verschiedenen Wechseln im Dialysat unter Verwendung eines Cellulosegehäuses, wie Visking Größe 18, ausgedehnte Membrandialyse/Ultrafiltration unter Verwendung einer Milliporen-, Amicon- oder äquivalenten Membran oder einer Hohlfaservorrichtung mit einem Molekulargewichtsabschneiden von etwa 5000 bis 30 000 Dalton oder durch Gelfiltration an einem geeigneten Xerogel, wie Sephadex G10 oder G25 bei etwa 4°C.

Erfindungsgemäß wird die Reaktion in einer oder mehreren und bevorzugt zwei Stufen durchgeführt. Werden zwei der mehr Stufen verwendet, so unterscheidet sich die erste von den nachfolgenden Stufen durch die verwendete unterschiedliche Temperatur. Im Falle von mehrstufigen Reaktionen kann die Reaktionssequenz durchgeführt werden mit: (a) Formaldehyd bei der ersten und den nachfolgenden Stufen, (b) einem besonderen Dialdehyd in der ersten und den nachfolgenden Stufen, (c) Formaldehyd in der ersten und einem besonderen Dialdehyd in den nachfolgenden Stufen, (d) einem besonderen Dialdehyd in der ersten und Formaldehyd in den nachfolgenden Stufen, (e) einem Gemisch aus Formaldehyd und einem oder mehreren Dialdehyden in einer Reihe von Stufen. Die bevorzugten Kombinationen sind im allgemeinen die einfachen Fälle (a) oder (b), jedoch bieten die Fälle (c) und (d) den Vorteil einer Kombination unterschiedlicher Arten chemischer Reaktionen unter Verwendung eines relativ einfachen Protokolls, Die Reaktionen des Typs (e) bieten, obgleich sie manchmal komplexer durchzuführen sind, die Kombinationen von Reaktionsverfahren, die zu den größten Verringerungen der allergenischen Eigenschaften führen.

Gemische aus Formaldehyd und einem Dialdehyd (normalerweise Glutaraldehyd) können in einer Reihe von Stufen (normalerweise zwei) verwendet werden. Diese Ausführungsform eliminiert die Entfernung des Aldehyds nach der ersten Stufe, vor der Zugabe des zweiten Aldehyds. Da die Dialdehydreaktion im

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wesentlich innerhalb von etwa 20 Stunden beendigt ist, kann das Gemisch dann zu der zweiten Stufe geführt werden, wo eine weitere ausgedehnte Reaktion mit Formaldehyd stattfinden kann. Die Allergenkonzentration wird durchweg bei etwa 1,0 bis 2,5 mg/ml, Formaldehyd bei 0,36 bis 0,5 M und Dialdehyd bei etwa 0,025 M und der pH bei 7,2 bis 7,6 gehalten. Die erste Stufe daue*rt 4 bis 24 Stunden (bevorzugt 16 bis 20 Stunden) bei 5 bis 15⁰C ( bevorzugt etwa 10°C) und die zweite Stufe dauert 16 bis 32 Tage bei 30 bis 34⁰C.

Bei der ersten Stufe wird die Reaktion bei einer Temperatur über dem Gefrierpunkt der Lösung (der besonders bevorzugte Bereich beträgt etwa 5 bis 15⁰C) und bevorzugt bei etwa 10°C durchgeführt. Die nachfolgende(n) Stufe(n) wird/werden bei etwa 25 bis 40°C und bevorzugt bei 30 bis 34°C durchgeführt. Es wurde gefunden, daß eine Beibehaltung dieser Sequenz bei der Temperatur wesentlich die Wirksamkeit des Endprodukt bei der Immunisierung allergischer Individuen erhöht.

Bei dem bevorzugten zweistuf igen Verfahren wird die erste Stufe bei der niedrigeren Temperatur im allgemeinen während einer Zeit von etwa 8 bis 32 Tagen im Falle von Formaldehyd und etwa 20 Stunden im Falle von Dialdehyd durchgeführt, obgleich im letzteren Falle kürzere Inkubationszeiten von 4 Stunden verwendet werden können. Die Dauer der zweiten Stufe beträgt im allgemeinen etwa 14 bis 35 Tage für Formaldehyd und etwa 24 Stunden für Dialdehyde.

Die vorliegende Erfindung kann mit Formaldehyd, mit allen niederen, gesättigten, aliphatischen Dialdehyden, insbesondere Glutaraldehyd, und Dialdehyden der allgemeinen . Formel (CHp)_<^^CH0 , worin η = 1 bis 6 ist, und ihren ver-

* ^{n x} CHO
zweigkettigen Isomeren und Vorstufen und mit ihren Gemischen

durchgeführt werden.

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Die mit Aldehyd behandelten Allergene, hergestellt wie oben beschrieben, sind geeignete immunotherapeutische Mittel für Säugetiere einschließlich allergischer Menschen. Ein Adjuvans, wie ein Alaun oder ein Alginat, kann in die gewünschte Immunisierungszubereitung eingearbeitet werden, um die immunogene Wirksamkeit zu verbessern. Die mit Aldehyd behandelten Allergene können beim diagnostischen Test vor und während der Immunotherapie allergischer Menschen verwendet werden.

Die erfindungsgemäßen, mit Aldehyd behandelten Allergene können Säugetieren in an sich bekannter Weise, wie intradermal, subkutan oder intramuskulär, verabreicht werden. Zusätzlich erlaubt die niedrige Allergenizität dieser Materialien die Verabreichung in Form eines Aerosolsprays durch die Nase und/oder den Mund, um eine Immunisierung transmucosal zu erreichen.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Die folgenden Pollen werden verwendet: (1) Kurzes Kreuzkraut (Ambrosia elatior) und (2) gemischtes Gras, enthaltend 3056 Obstkultur (Dactylis glomerata), 25% Blaues Kentuckygras (Poa pratensis), 25% Timotheus (Phleum pratense), 10?S Rotes Schwingelgras (Festuca rubra) und 1096 Wiesenschwingelgras (Festuca elatior). Jede der Pollen wird durch aufeinanderfolgende Extraktionen mit Diäthylather oder Petrolather (ca. 8x11 Mengen) entfettet und bei 4⁰C entweder einmal mit dem 10fachen Volumen (ml) von 0,125 M NHaHCO,, bezogen auf das Gewicht (g) der Pollen, während ca. 18 h (unter Rühren) oder in drei aufeinanderfolgenden Extraktionen mit einem Volumen einer NH^HCO^-Lösung, das etwa die 1Ofache Menge der Pollen ausmacht, extrahiert. Nach dem Zentrifugieren wird jeder überstehende Extrakt ausgedehnt bei 4⁰C in einem Visking Größe 18-Cellulosegehäuse gegenüber 0,002 M NH^HCO₃ (4 bis

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5 χ 72 1) und schließlich gegenüber destilliertem Wasser (1 χ 72 l) während einer Zeit von insgesamt etwa 4 Tagen dialysiert. Dieses Dialyseverfahren dient dazu, im wesentlichen alle nicht-allergenischen Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen. Jeder dialysierte Extrakt wird zentrifugiert, um Spurenmengen an Präzipitat zu entfernen, lyophilisiert und bei -20⁰C in einem luftdichten Behälter bis zur Verwendung gelagert.

Dialysierter Allergenextrakt (1) oder (2) bei 2 mg/ml wird mit 0,5 M Formaldehydlösung während 14 bis 18 Tagen bei 10°C+1°C in 0,1 M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄-PUffer bei pH 7,5+0,1 (Puffer A) inkubiert, direkt in einen Inkubator bei 32°+1°C überführt und während weiterer 14 bis 18 Tage inkubiert. Überschüssiger Formaldehyd wird durch Dialyse gegenüber Puffer A, physiologisch gepufferter Salzlösung oder destilliertem Wasser (wie im folgenden erläutert) entfernt.

Beispiel 2

Dialysierter Allergenextrakt (1) (2 mg/ml) wird mit 0,5 M Formaldehydlösung während 30 bis 35 Tagen bei 10°C+1°C und pH 7,7+0,1 in Puffer A inkubiert, direkt in einen Inkubator bei 32°+1°C überführt und weitere 30 bis 35 Tage inkubiert. Überschüssiger Formaldehyd wird durch Dialyse gegenüber Puffer A, physiologischer gepufferter Salzlösung oder destilliertem Wasser entfernt.

Beispiel 3

Dialysierter Allergenextrakt (2) (2 mg/ml) wird mit 0,5 M

Formaldehydlösung während etwa 8 Tagen bei 10°+1°C und pH 7,5 in Puffer A inkubiert, direkt in einen Inkubator bei 32°+1°C überführt und während etwa 32 Tagen inkubiert. Überschüssiger Formaldehyd wird durch Dialyse gegenüber Puffer A, physiologischer gepufferter Salzlösung oder destilliertem Wasser entfernt.

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Beispiel 4

Dialysierter Allergenextrakt (1) oder (2) (10 mg/ml) wird mit 2 M Formaldehydlösung während etwa 14 bis 18 Tagen bei 10°+1°C inkubiert. Die Lösung wird auf das 4fache verdünnt (d.h. auf 2,5 mg/ml Kreuzkraut und 0,5 M Formaldehyd). Die Lösung wird erneut während etwa 14 bis 18 Tagen bei 32+1⁰C inkubiert. Überschüssiger Formaldehyd wird durch Dialyse gegenüber Puffer A, physiologischer gepufferter Salzlösung
oder destilliertem Wasser entfernt.

Beispiel 5

Dialysierter Allergenextrakt (1) oder (2) (8 mg/ml) wird mit 2 M Formaldehydlösung während etwa 14 bis 18 Tagen bei
10+1⁰C inkubiert. Die Lösung wird auf das 4fache verdünnt (d.h. auf 2,0 mg/ml Kreuzkraut und 0,5 M Formaldehyd). Die Lösung wird erneut während etwa 14 bis 18 Tagen bei 32+1⁰C inkubiert. Überschüssiger Formaldehyd wird durch Dialyse
gegenüber Puffer A, physiologischer gepufferter Salzlösung und destilliertem Wasser entfernt.

Beispiel 6

Ein dialysierter Allergenextrakt (1) von Pollen von Kurzem Kreuzkraut (2 mg/ml) wird mit 2 M Formaldehydlösung während etwa 14 bis 18 Tagen bei 10+1⁰C bei pH 7,5+0,1 in 0,1 M
Natriumphosphatpuffer (Puffer A) inkubiert. Die Lösung wird bei 4°C stark gegenüber verschiedenen Änderungen im Puffer A zur Entfernung von Formaldehyd dialysiert. Zusätzlicher Formaldehyd (12,3 M) wird langsam zugegeben, um die Lösung auf 0,36 M, bezogen auf Formaldehyd, einzustellen. Die Lösung wird erneut während 16 Tagen bei 32+1⁰C und pH 7,5+0,1 inkubiert, überschüssiger Formaldehyd wird durch Dialyse
gegenüber Puffer A oder physiologischer gepufferter Salzlösung entfernt.

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Beispiel 7

Dialysierter Allergenextrakt (1) oder (2) (2 mg/ml) wird mit einem Gemisch aus 0,025 M Glutaraldehyd und 0,5 M Formaldehyd in Puffer A während etwa 18 h bei 10+1⁰C inkubiert. Das Gemisch wird dann unmittelbar bei 32+1⁰C gehalten und während etwa 21 Tagen bei pH 7,5+0,2 inkubiert, überschüssiger Glutaraldehyd und Formaldehyd werden gegen Ende des Versuchs durch Dialyse entfernt.

Beispiel 8

Dialysierter Allergenextrakt (1) und (2) (2 mg/ml) wird mit 0,025 M Flutaraldehyd in PufferA während etwa 18 h bei 10+1⁰C inkubiert. Überschüssiger Glutaraldehyd wird durch Dialyse gegenüber Puffer A entfernt. Die Formaldehydlösung wird zu der mit Glutaraldehyd behandelten Allergenlösung zugegeben, um sie auf 0,5 M, bezogen auf Formaldehyd, zu bringen. Dieses Gemisch wird dann etwa 21 Tage bei 32+1⁰C inkubiert. Überschüssiger Formaldehyd wird durch Dialyse gegen Ende des Versuchs entfernt.

Beispiel 9

Dialysierter Allergenextrakt (1) oder (2) (2 mg/ml) wird mit Glutaraldehyd (0,025 M) bei 10+1⁰C während etwa 20 h und bei 30+1⁰C während etwa 24 h bei pH 7,5+0,1 in Puffer A inkubiert. Überschüssiger Glutaraldehyd wird durch Dialyse gegenüber Puffer A oder physiologischer gepufferter Salzlösung gegen Ende des Versuchs entfernt. Andere Glutaraldehydkonzentrationen wurden untersucht (im Bereich von 0,0005 bis 0,1 M), es wurde jedoch gefunden, daß 0,025 M die besten Produkte hinsichtlich der niedrigen allergenischen Aktivität und der Retention der gewünschten Immunisierungseigenschaften ergibt.

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Beispiel 10

Pollen von getrocknetem Kurzen Kreuzkraut (Ambrosia elatior) werden durch Soxhlet-Extraktion unter Verwendung von Petroläther entfettet. Das Erhitzen am Rückfluß wird fortgesetzt, bis das Eluierungsmittel frei von Farbe ist, die von den Pollen stammt. Die Pollen werden an der Luft getrocknet, gewogen und in dichtverschlossenen Behältern bei -5 bis -30⁰C gelagert. 5 ml eines 0,125 M Ammoniumbicarbonatpuffers/g entfetteter Pollen werden zu den Pollen zugegeben, und das Gemisch wird unter konstantem Rühren bzw. Bewegen bei 0 bis 5⁰C während 18 bis 26 h extrahiert. Nach dieser ersten Extraktion wird der Extrakt aus den Pollenkörnern durch Filtration entfernt und der Pollenkuchen wird mit 4 ml Puffer/g Pollen (Ausgangsgewicht) erneut während 2 bis 4 h bei 0 bis 5⁰C extrahiert und dann mit 1 ml Puffer/g Pollen gespült. Alle drei Extrakte werden vereinigt und in einem Visking Größe 18 saumfreien Celluloseschlauch gegenüber einem 35fach größeren Volumen an 0,002 M Ammoniumbicarbonat während 30 bis 40 h dialysiert. Gegenüber destilliertem Wasser wird während 12 bis 14 h eine weitere Dialyse durchgeführt. Der Extrakt wird durch eine Reihe von Filtern filtriert, endend mit einer sterilen Filtration durch ein 0,45 m/u-Filter. Der sterile Extrakt wird lyophilisiert und gewogen. Die Inkubation dieses dialysierten Extraktes (10 mg Pollenfeststoffe/ml) erfolgt unter Verwendung von 2 M Formaldehyd in 0,1 M Natriumphosphatpuffer bei pH 7,2 bis 7,6 während 12 bis 18 Tagen bei 10+2⁰C. Die entstehende Lösung wird auf das 4fache in dem 0,1 M Phosphatpuffer verdünnt und 18 bis 24 Tage bei pH 7,2 bis 7,6 und 32+2⁰C inkubiert. Die entstehende Lösung wird in einem Viskinggehäuse Größe 2,22 cm (1-7/8 in.) Durchmesser gegenüber dem 35fachen Volumen an 0,002 M NH^HCO, dialysiert. Die Lösung wird auf die Abwesenheit von Formaldehyd geprüft, unter Verwendung eines Milliporen-Pellicon-Kassettensystems konzentriert, steril filtriert und lyophilisiert.

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zt -

Bei jedem der vorherigen Beispiele wurden die Inkubationen und Dialysen unter Verwendung eines 0,1 M Natriumphosphatpuffers und bei einem pH-Wert von 7,5+0,1 durchgeführt. Alle Lösungen werden ausgedehnt bei etwa 4⁰C gegenüber verschiedenen Änderungen des großen Dialysatvolumens dialysiert, um nichtumgesetzten Aldehyd am Ende jedes Versuchs zu entfernen. Die Lösungen werden entweder gefroren gelagert, oder in verschiedenen Fällen werden die mit Aldehyd modifizierten Allergene aus wäßrigen Lösungen lyophilisiert, ein Verfahren, das zu im wesentlichen aldehydfreien Feststoffen mit ausgezeichneten Langzeitlagerungseigenschaften führt.

Beispiel 11 Allergen

Pollen von Kurzem Kreuzkraut (Ambrosia elatior) werden von Greer Laboratories gekauft und bei -20⁰C in einem luftdichten Behälter bis zur Verwendung gelagert. Die Pollen (150 g) werden durch acht aufeinanderfolgende Extraktionen mit 1 1-Teilen wasserfreiem, peroxidfreiem Diäthylather (J.T.Baker Co.)entfettet, wodurch die Entfernung des gesamten, gefärbten, fettartigen Materials möglich wird. Die Pollen werden getrocknet und Ätherspuren werden im Vakuum über Nacht verdampft. Die entfetteten Pollen werden dann bei 4⁰C unter leichtem Rühren während 18 h mit 1,5 1 0,125 M NH₄HCO₃ extrahiert, und die Pollen wird von der überstehenden Flüssigkeit durch Zentrifugieren abgetrennt. Der überstehende Extrakt (1185 ml) wird in einer Visking Größe 18 Celluloseumhüllung (Union Carbide Corp.) ausreichend gegenüber 0,002 M NH₄HCO₃ (5 x 72 1) und schließlich gegenüber destilliertem Wasser (2 χ 72 1) während einer Gesamtzeit von 4 Tagen bei 4⁰C dialysiert. Der dialysierte Extrakt wird zur Entfernung einer kleinen Menge des Präzipitats zentrifugiert und lyophilisiert (Ausbeute = 14,104 g). Dieses Material, das als "Kreuzkraut-Pollen Allergen, Charge 11RWC" bezeichnet wird, wird bei -20⁰C in einem luftdichten Behälter bis zur Ver-, wendung gelagert.

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Allergoid (Allergoid)

Ein Teil des lyophilisierten Allergens wird der Formaldehydmodifizierung nach dem "Zwei-Stufen-Verfahren" unterworfen. Kreuzkraut-Pollen Allergen (13,603 g) wird in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5, (453,4 ml) [hergestellt durch Vermischen geeigneter Volumen an 0,1 M NaH₂PO^ und 0,1 M Na₂HPO^ (beide Baker Reagensqualität), um einen End-pH-Wert von 7,50 zu erhalten] gelöst. Man erhält eine Lösung, die 30 mg Pollenfeststoffe/ml enthält. Diese Lösung wird (in einem Größe 18 Visking-Schlauch) gegenüber Phosphatpuffer (11,2 1) während 24 h bei 4°C dialysiert. Nach der Dialyse wird das Endvolumen der Allergenlösung auf 907 ml (15 mg Pollenfeststoffe/ ml) mit 0,1 M Phosphatpuffer bei Ph 7,50 eingestellt.

Das folgende Reaktionsgemisch wird bei 4°C hergestellt. 10 M Formaldehydlösung (270 ml)[hergestellt durch Verdünnen von p.a. Formaldehyd (Fisher Scientific Co., 37% Gew./Gew.) mit entionisiertem Wasser] wird sehr langsam und sorgfältig unter konstantem Rühren zu 900 ml der Allergenlösung gegeben, wobei eine lokalisierte, hohe Konzentration an Formaldehyd vermieden wird. Der pH-Wert der Lösung wird während der ganzen Zugabe verfolgt, und insgesamt 6,5 ml 2 M NaOH (Baker Co.) werden während des Mischens zugegeben, um den pH-Wert bei 7,50+0,1 zu halten. Das Endvolumen des Reaktionsgemisches wird auf 1350 ml unter Verwendung von 170 ml 0,2 M Phosphatpuffer bei pH 7,50, von 1,1 ml 2 M NaOH und 2,5 ml 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 7,50 eingestellt. Man erhält eine Lösung der folgenden Zusammensetzung: 10 mg/ml Pollenfeststoffe; 2,0 M Formaldehyd; ungefähr 0,1 M Phosphat, bei einem pH von 7,50, bestimmt bei 10⁰C.

Die obige Lösung wird 16 Tage bei 10+0,5⁰C inkubiert, wobei zu diesem Zeitpunkt der pH auf 7,41 gefallen ist. Nach dieser ersten Inkubation wird die Lösung auf das 4fache mit 0,1 M Phosphat bei pH 7,50 verdünnt und bei 32+0,5°C weitere

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16 Tage inkubiert. Der Ausgangs-pH für diese zweite Inkubation beträgt 7,49 (bestimmt bei 32°C) und der End-pH beträgt 7,47 (bei 32⁰C). Die entstehende Allergoidlösung wird nacheinander gegenüber 4 χ 72 1 entionisiertem Wasser bei 4⁰C zur Entfernung von Formaldehyd und Puffersalzen dialysiert. Ein Spurenniederschlag wird durch Zentrifugieren entfernt und die entstehende Lösung wird lyophilisiert. Dies dient nicht nur dazu, ein stabiles, trockenes Material herzustellen, sondern ebenfalls dazu, um mögliche geringe Restspuren an Formaldehyd zu entfernen. Die Ausbeute an "Kreuzkraut-Pollen Allergoid, 11RWF" beträgt 13,135 g (97,3% der theoretischen Ausbeute). Das Allergoid wird bei 20°C in einem luftdichten Behälter bis zur Verwendung gelagert.

Herstellung von Lösungen für die Immunotherapie

Lösungen werden hergestellt, ausgedrückt als "Allergeneinheiten/ml" oder "Allergoideinheiten/ml", wobei die Allergoideinheit um das 50fache größer ist als die Allergeneinheit in Maßstäben von Pollenfeststoffen und "Antigen E-Äqui valenten/ml (AgE Äquiv./ml)" [im Falle von Allergen bedeutet dies den Gehalt an Antigen E; im Falle von Allergoid bedeutet dies den Gehalt an Antigen E in dem Allergen, aus dem es sich ableitet (Antigen E ist in dem Allergoid nicht direkt meßbar)]. Bezogen auf einen vorherigen Versuch wird die Vorrats- bzw. Stocklösung von Allergen 11RWC (1000 Einheiten/ml) so hergestellt, daß sie 10/Ug AgE Äquiv./ml (0,28 mg nicht-dialysierbare Pollenfeststoffe/ml) enthält. Auf ähnliche Weise wird die Stocklösung des Allergoids 11RWF (1000 Einheiten/ml) bei 500/ug AgE Äquiv./ml (14,1 mg Allergoidfeststoffe/ml) hergestellt. Die Stocklösungen von Allergen und Allergoid werden steril durch eine Nalgene Filtereinheit, die mit einer Membran mit einer Porengröße von 0,45/um ausgerüstet ist (Nalge Sybron Corp., Rochester, N.Y.), filtriert. Jede Lösung wird anschließend in sterilen

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Ampullen in Mengen von ungefähr 10 ml verteilt. Es werden so insgesamt 30 Ampullen aus Allergen und 23 Ampullen aus Allergoid hergestellt. Beide Sätze von Ampullen werden in der Reihenfolge numeriert, in der sie abgefüllt werden. Die Ampullen werden ungefähr 3 Wochen vor Beginn der Therapie hergestellt und bei 4° C während der Untersuchung gehalten.

Die Sterilitäten der Allergen- und Allergoidlösungen werden durch Inkubation von 0,5 ml aliquoten Teilen, die aus ausgewählten Ampullen entnommen wurden, mit Thioglycollat Medium entsprechend den FDA Rules and Regulations,"Paragraph 610.12, Sterility", geprüft. Die Inkubationen werden bei Temperaturen von 25 und 32°C während 2 Wochen durchgeführt. Im Falle der Allergenlösung werden die aliquoten Teile den Ampullen Nr. 1, 11, 20 und 30 entnommen. Im Falle der Allergoidlösung werden die aliquoten Teile den Ampullen Nr. 1, 11 und 23 entnommen. Alle Sterilitätstestlösungen werden visuell auf das Auftreten von Wachstum am 4., 7. und 14. Tag der Inkubationszeit geprüft. Bei der visuellen Prüfung konnte kein Auftreten einer Bakterienverunreinigung festgestellt werden. Am Ende des 14. Tag nach der Inkubation wird jede der Testkulturen auf Platten von Trypticasesoja^gar mit 5% Schafblut (Baltimore Biological Labs. Cockeysville, MD.) gegeben und 24 h bei 37°C inkubiert. Es wird festgestellt, daß alle für irgendeine Art von Wachstum negativ sind. Alle aliquoten Teile von Allergen und Allergoid mit Ausnahme derjenigen, die auf die Sterilität geprüft wurden, werden bis zur Verwendung bei 4⁰C gelagert.

Die allgemeinen Toxizitätstests werden sowohl mit der Allergenlösung als auch mit der Allergoidlösung unter Verwendung des in "Paragraph 610.11, Safety" der FDA Rules and Regulations beschriebenen Analyseverfahrens durchgeführt. Diese Versuche werden bei Mäusen und Meerschweinchen unter der Leitung von Irving Levenstein, Ph.D. Leberco Laboratories, 123 Hawthorne Street, Roselle Park, N.J., durchgeführt. Jede

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Maus erhält 0,5 ml und Jedes Meerschweinchen 5 ml entweder der Allergen- oder der Allergoid-Stocklösung intraperitoneal verabreicht. Die Ergebnisse dieser Versuche zeigen kein Auftreten von Toxizität entweder bei dem Allergen oder bei dem Allergoid, was aus keinem ungewöhnlichen Gewichtsverlust 7 Tagen nach der Injektionen der Materialien hervorgeht.

Immunochemische Analysen

Die Analysen der Gehalte an Kreuzkraut-Allergenen, Antigen E, Ra3 und Ra5 in Kreuzkraut-Pollen Allergen, Charge 11RWC, werden durch Radialimmunodiffusion (H.Baer, C.J.Maloney, P.S. Norman und D.G.Marsh, 1974, J.Allergy Clin.Immunol. 54, 157-164) unter Verwendung geeigneter spezifischer Antisera und Vergleichsantigene durchgeführt. Die Antigen E-Vergleichsprobe ist NIH-Material, das weiter durch Sephadex G75-Chromatographie gereinigt wurde,und Ra3-Vergleichsmaterialien stammen von Dr. Lawrence Goodfriend, McGiIl University, Montreal. Eine zusätzliche Antigen E-Vergleichsprobe wird von Dr.T.P. King, Rockefeller University, New York, erhalten. Die Antisera werden im Labor der Anmelderin durch Immunisierung von Kaninchen oder Ziegen hergestellt, und zwar mit den entsprechenden Antigenen.

Eine gekreuzte Immunoelektrophorese des Allergens wird ebenfalls gegenüber Kaninchen-Anti-Allergen-Serum unter Verwendung eines Verfahrens durchgeführt, das analog zu dem von Weeke und Lowenstein (1973) in A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis (Herausgeber N.H.Axelsen, J. Kroll und B. Weeke), Universitetsforlaget, Oslo, Seiten 149 bis 153, beschriebenen ist.

Standard-"Proteinstickstoffeinheit (PNU)"-Bestimmungen des Allergens und Allergoids erfolgten entsprechend den von der FDA anerkannten Routineverfahren von Mr. Bill White, Jr. and associates of Greer Laboratories, Le no ir, N. C.

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Patienten

14 Kreuzkraut-allergische kaukasische, bezahlte Versuchspersonen (7 männliche, 7 weibliche, Durchschnittsalter 33; Altersbereich 25 bis 44) werden für die Untersuchung entsprechend den folgenden Kriterien ausgewählt. Alle Patienten berichten, daß sie starkes Heufieber während der Kreuzkrautsaison haben, wobei sich das Grasheufieber bei drei Personen mäßig und bei weiteren drei Personen schwach zeigt. Patienten, die über Asthma berichten, werden speziell von der Untersuchung ausgeschlossen. Patienten mit starkem Symptomen während des Monats Juli werden ebenfalls ausgeschlossen. Da frühere Versuche gezeigt haben, daß die Immunotherapie mit Kreuzkrautextrakten das anschließende immunologische Ansprechen beeinflußt, wurden automatisch Patienten, die Irgendeine frühere Behandlung mit Kreuzkrautextrakten erfahren haben, ausgeschlossen. Weiterhin wurden die Patienten hinsichtlich ihrer Arbeitsstelle und der Gefühlstabilität beurteilt, so daß man gute Kandidaten für die Untersuchung erhielt.

Die Patienten werden in sieben Paare entsprechend ihrer Vorbehandlung der Leukocyten Histamin- Freigabe und Hauttestempfindlichkeiten gegenüber Allergen und Allergoid und den Gesamtserum IgE-Gehalten eingeteilt.

Behandlungsschema

Die Patienten wurden in der Zeit vom spaten Mai bis Mitte August 1977 behandelt. Am ersten Behandlungstag (Tag 0) erhielten sie Folgen von 1 bis 5 Injektionen in steigenden Mengen an Allergen oder Allergoid im Verlauf von 30 min bis 2 h, bis lokale Quaddel- und Erythem-Reaktionen oder systemische Symptome anzeigen, daß die Dosis nahe oder an dem tolerierten Wert liegt. Der behandelnde Arzt führt eine vollständige Aufzeichnung der Injektionen und der unmittelbaren lokalen und systemischen Reaktionen für jeden Patienten durch.

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Verzögerte lokale Reaktionen an den Injektionsstellen und systemische Symptome (sofern vorhanden) werden von dem Patienten aufgezeichnet. Eine medizinische Betreuung ist für alle Patent!en während der 24 Stunden-Zeit auf die Injektionsreihenfolgen verfügbar, und die Information auf jedem Formular wurde durch telefonische Rücksprache mit jedem Patienten bestätigt. Alle lokalen Reaktionen werden entsprechend ihrer maximalen Intensität, die normalerweise etwa 24 h nach der Injektion folgend eintritt, bewertet. (Informationen, die die Bewertung der lokalen und systemischen Reaktionen betreffen, finden sich bei der Fußnote von Tabelle V.)

Nach der ersten Reihenfolge werden Serum IgG-Antikörper zu Antigen E in Intervallen von ungefähr.4 bis 14 Tagen bestimmt, und die zweite und die nachfolgenden Folgen werden als Antikörperansprechen verabreicht, die man durch darauffolgende Plateaugehalte bei den Patienten erzeugt. Die Reaktionen auf die Injektionen werden in jedem Fall, wie oben beschrieben, aufgezeichnet. 6 mit Allergen und 6 mit Allergoid behandelte Patienten gehören zu dem Untersuchungsschema, wobei jeder Patient 4 oder 5 Injektionsfolgen zwischen Ende Mai und Mitte August 1977 erhält (Tabellen I und II).

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	und Anzahl	der	Injektionen pro Folge	Tabelle	I	in	5. Klammern)	Summe insgesamt
Dosis
	Patient		1. 2. Allergeneinheiten
Paar Nr.			für die mit Allergen behandelten Patienten
	Folgen

3. 4. (Zahl der Injektionen

1
2

3
4
5
7

E.E. L.L. M.K. G.J. B.D. L.D.

6(4) ⁺	15(2)	10(1)	60(2)	50(1)
31(4)	170(3)	50(1)	350(3)	1200(3)
31(4)	70(2)⁺⁺	50(2)	50(1)⁺⁺	30(1)
6(3)	15(2)	10(1)	60(2)⁺⁺	20(1)
4(5)	17(3)	70(2)	150(2)⁺⁺	100(2)
36(4)	164(3)	200(1)	700(2)	500(1)

141(10)

1801(14)

231(10)

111(9)

341(14)

1601(11)

Mittelwert 19(4,0)

75(2,5)

65(1,3) 228(2,0) 317(1,5)

704(11,3)'

ausgeschieden 6 S.B.

31(4)

170(3)

226(8)

2 Injektionen/Tag werden an zwei aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht systemische Reaktion

die mittlere kumulative Dosis für alle Patienten, ausschließlich S.B., entspricht 7,04/Ug AgE Äquivalenten

Dosis	und Anzahl	Tabelle II der Injektionen pro Folge für die mit Allergoid	Folgen	behandelten	Patienten	Summe insgesamt

Paar Nr.	Patient	1. 2. 3. Allergoideinheiten (Zahl	4. 5. der Injektionen in Klammern)

1.	E.F.	31(4)	170(3)	100(1)	200(2)	200(2)	701(12)
2.	D.H.	16(4)⁺	2(1)	5(2)	16(3)	-⁺⁺	40(10)
3.	G.D.	32(4)	70(2)	125(2)	310(2)	1200(3)	1737(13)
4.	J.B.	31(4)	170(3)	70(2)	300(2)	1200(3)	1771(14)
5.	J.K.	37(4)	70(2)	150(2)	300(2)	300(2)	857(12)
7.	M.B.	32(3)	170(3)	300(3)	1200(3)	-⁺⁺	1702(11)

Mittelwert

¹^ ausgeschieden
ο 6 P.J.

30(3,8) 109(2,3) 125(1,8) 388(2,3) 725(2,5)

26(4)

5(1)

°» systemische Reaktion
++

1135(12)

42(8)

eine 5. Injektionsfolge wurde nicht verabreicht

die mittlere kumulative Dosis für alle Patienten, ausschließlich P.J., entspricht 567,35/Ug AgE Äquivalenten.

Analysen der relativen Allergenizität, Allergoid/Allergen

Die relativen Allergenizitäten von Allergoid zu Allergen in den Versuchspersonen werden sowohl durch den Leukocyt Histamin-Freigabeversuch (D.G. Marsh, L.M.Lichtenstein und D.H.Campbell, 1970, Immunology, _18_f 705-722) als auch durch die quantitative intradermale Endpunkthauttitration [P.S. Norman, 1976, in Manual of Clinical Immunology (Ed. N.R. Rose und H. Friedman), American Soc. for Microbiol., Washington, D.C, Seite 585] bestimmt. Das Leukocyten-Empfindlichkeitsverhältnis jedes Patienten wird als Verhältnis von Allergoid/Allergen-Konzentrationen, die eine 5C$>ige Histaminfreigabe von den Leukocyten des Patienten ergeben, bestimmt. Das Hauttest-Empfindlichkeitsverhältnis ist das Verhältnis von Allergoid/Allergen-Konzentrationen, die zweiplus (8 bis 10 mm Quaddeldurchmesser mit Erythem) Hauttestendpunkte ergeben.

Gesamtserum IgE-Analysen

Die Messung des Gesamtserums IgE in einer Vor- und drei Nachbehandlungssera von allen Patienten wird nach dem "direkten RIST"-Verfahren, das von Schellenberg und Adkinson (R.R. Schellenberg und N.F. Adkinson, 1975, J.Immunol. 115, 1577-1583) entwickelt wurde, bestimmt. Das Verfahren ist dem»PRIST"-Verfahren von Wide[ L. Wide, 1971, in Radioimmunoassay Methods (Ed. K.E.Kirkham und W.M. Hunter, Livingstome, Edinburgh, S. 173] ähnlich, mit der Ausnahme, daß bei der ersten Stufe der Analyse spezifische Anti-IgE-Antikörper (erzeugt in Ziegen), gekuppelt an Sepharose 4B anstelle von Papierscheiben, verwendet werden. Nach der Inkubation des Serums des Patienten mit Sepharose Immunoadsorbensperlen werden die Perlen gewaschen und anschließend mit radiomarkiertem Kaninchen Anti-IgE (fc -kettenspezifischer, gereinigter Antikörper) inkubiert. Die Perlen werden dann erneut gewaschen und in einem γ-Zähler gezählt. Die Zählungen wer-

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den mit solchen verglichen, die man mit Reihentitration unter Verwendung eines Kontrollserums mit bekanntem IgE-Gehalt erhält. Die obigen Versuche werden alle dupliziert mit geeigneten positiven und negativen Kontrollen und drei inneren Standardsera mit bekanntem IgE-Gehalt. Weiterhin wird jede Analyse mindestens einmal wiederholt, und irgendwelche nicht zusammenpassende Werte (die sich voneinander um mehr als +1096 unterscheiden) werden wiederholt, bis Werte mit erhalten werden.

Analyse des Serum IgG-Antikörpers gegen Antigen E

Immunoglobulin G-Antikörper zu Antigen E wird unter Verwendung eines hochempfindlichen Doppel-Antikörper-Radioimmunoassay-Verfahrens bestimmt, das ähnlich dem von Black et al beschriebenen ist (P.L.Black, D.G.Marsh, E.Jarrett, G.J.

Delespesse und W.B. Bias, Immunogenetics 3, 349-368). Gerei-

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nigtes Antigen E wird mit "V nach dem Chloramin T-Verfahren markiert, zur Entfernung von Mikroaggregaten ultrazentrifugiert und bei -70⁰C in kleinen, aliquoten Teilen bis zur Verwendung gelagert. Geeignete 2fache Reihenverdünnungen mit Standardserum (von einem allergischen Subjekt, das ausgedehnt mit Kreuzkrautextrakt behandelt wurde), die Sera von den Versuchspatienten und geeignete Kontrollen werden mit einer konstanten Menge an markiertem Antigen E (etwa 1,2 ng bei einer Konzentration von 6,2 ng/ml) während 5 h bei 23⁰C inkubiert. Zur Erhöhung der Empfindlichkeit der Analyse für die niedrige Konzentration an Antikörper wird die nichtspezifische Bindung der Radioaktivität (hauptsächlich an die Kunststoffanalysenröhrchen) reduziert, indem man die Analysenröhrchen zuvor mit Rinderserumalbumin, O,3?6 (Gew./VoI), vorbeschichtete und das markierte Antigen in 5% (Gew./Vol.) Albumin verdünnte. Alle Serumproben werden 1:50 in boratgepufferter Salzlösung (BBS), pH 8,0, verdünnt und geeignete weitere Verdünnungen erfolgen mit BBS, enthaltend 1:50 normales Menschenserum, das von Antikörper zu

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Antigen E frei ist. Negative Kontrollröhrchen enthalten eine 1:50 Verdünnung dieses normalen Serums. Folgend auf die Anfangsinkubation wird Serum IgG (und gebundene Antigen- Antikörper-Komplexe) durch Zugabe eines geringen Überschusses von Ziegen Anti-IgG (Anti-Fc-Fragment) und Inkubation über Nacht bei 4⁰C ausgefällt. Die entstehenden Niederschläge werden gewaschen und gezählt und die Testsera werden mit der Standardkontrollkurve verglichen. Alle Ergebnisse sind als willkürliche "Einheiten von IgG Antikörper/ml Serum", bezogen auf die Kontrollserumkurve, angegeben. In früheren Untersuchungen (T.A.E. Platts-Mills, R.K. vonMaur, K.Ishizaka, P.S.Norman und L.M.Lichtenstein, J.Clin.Invest. 57, 1041-1050) wurde gezeigt, daß das unverdünnte Kontrollserum etwa 24/Ug Antigen E/ml im Antigenüberschuß bindet. Auf diese Basis wurde berechnet, daß angenommen werden kann, daß eine der willkürlichen Einheiten 1,3 ng Antigen E in Antigenüberschuß binden würde. Unter dieser Annahme würde unter solchen Bedingungen das gebundene Antigen als Ag₂Ab-Komplexe vorliegen, 1 Einheit = 2,8 ng Antikörper. Bei den beschränkten Antigen-Konzentrationen der vorliegenden Analyse wird weniger Antigen gebunden und die wirksame Antikörperkonzentration kann um das etwa 3fache geringer sein. (T.A.E.Platts-Mills, M.J.Snajdr, K.Ishizaka und A.W.Frankland, 1978, J.Immunol. 120, 1201-121Q)

14 bis 16 Serumproben von jedem Patienten vervollständigen die Untersuchung und mehrere Proben von jedem der zwei ausgeschiedenen Personen werden analysiert. Damit Änderungen in den IgG-Antikörper-Titern schnell bestimmt werden können, wodurch ein geeigneter Zeitplan für die Injektionssequenz möglich wird, wurde das Antikörperansprechen innerhalb von etwa 3 Tagen nach der Abnahme der Blutproben gemessen. Alle Analysen werden bei jedem Versuch doppelt durchgeführt und bei dem nachfolgenden Versuch wiederholt. Die Analysen werden je nach Bedarf wiederholt, bis Werte innerhalb +10% erhalten werden.

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Blutchemie und Urinanalyse

Messungen der Blutchemie und die Urinanalysen werden vor der Immunotherapie und etwa 1 und etwa 14 Wochen nach Beendigung der Therapie durchgeführt. Die Standard SMA-11 Blutchemie wird durch The Good Samaritan Hospital Clinical Laboratory unter Verwendung automatisierter analytischer Verfahren bestimmt. Die Standardurinanalysen erfolgen im Allergie-Labor der Anmelderin.

Symptombewertung

HeufieberSymptome während der Kreuzkraut-Pollensaison werden durch jeden Patienten zweimal am Tag auf einem Standardaufzeichnungsblatt bewertet. Es wurde gefunden, daß die durchschnittlichen täglichen Symptombewertungen (P.S.Norman und W.L.Winkenwerder, 1965, J.Allergy, 36, 284-292) für Gruppen von Heufieberpatienten mit den täglichen Pollenzählungen korrelieren. Zusätzlich zu diesen Selbstbewertungen wird jeder Patient von dem behandelnden Arzt zweimal während der Kreuzkrautsaison interviewt.

Ergebnisse

In Tabelle III sind die immunochemischen Analysen für Allergen und Allergoid aufgeführt.

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Tabelle III Immunochemische Analyse der Antigene

Kreuzkrautpollen Allergen 11RWC: 35,5/Ug AgE/mg lyophilisierte

' Feststoffe

6,5/Ug Ra3/mg "

6,0/Ug Ra5/mg "

6390 PNU/mg "

Kreuzkrautpollen Allergoid,11RWF: 35,5/Ug AgE Äqu./mg"

6100 PNU/mg "

1 Allergeneinheit ^ 0,01 /Ug AgE Äquiv. ^1,8 PNU)50facher Un-1 Allergoideinheit= 0,5/Ug AgE Äquiv. ^ 86 PlW Ausgedrückt

durch d.Gewicht

Analysen ähnlicher, anderer Zubereitungen von lyophilisiertem, dialysiertem Kreuzkraut Allergen zeigen die folgenden, mittleren antigenischen Zusammensetzungen: AgE (5 Zubereit.)= 24,3/ug/mg (Bereich: 11,3-41,1 /ug/mg); Ra3 (4 Zuber.) = 7,1/ug/mg (Bereich: 5,0-9,4/ug/mg); Ra5 (4 Zuber.)= 4,1/ug/ mg (Bereich: 2,3-6,1 /Ug/mg).

Die Gehalte an Antigen E, Ra3 und Ra5 in dem Allergen sind im allgemeinen höher als die durchschnittlichen Werte, die man bei der Analyse verschiedener, unterschiedlicher Ansätze von lyophilisiertem Allergen (vergl. Fußnote zu Tabelle III) erhält. Die PNU-Werte für Allergen und Allergoid sind ähnlich, wie erwartet. (Es soll bemerkt werden, daß nichtdialysierte Kreuzkrautextrakte, die die gleichen Mengen an nichtdiaylierbaren Pollenfeststoffen enthalten, etwa das Doppelte dieser Werte ergeben, bedingt durch die Tatsache, daß durch diese Verfahren etwas Stickstoff in dem dialysierbaren Peptidmaterial bestimmt wird.) Kreuzkraut Antigen E, Ra3 und Ra5 ins in dem Allergoid nicht meßbar. Damit werden die Konzentrationen als "AgE Äquiv./ml" usw., bezogen auf die entsprechenden Antigengehalte des nativen Kreuzkraut-Allergens, angegeben.

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Hl -

Tabelle IV zeigt die Histaminfreigabe, den Hauttest und die gesamten IgE-Werte für 7 Paare von Patienten zu Beginn der Untersuchung.

Tabelle IV

Vorbehandlungsempfindlichkeiten gegenüber Allergen und	HR ST	mit Allergen behandelt	Allerffoid"¹"	Verhältnis	Gesamt IgE
Allergoid und gesamte IgE-Werte	HR	Empfindlichkeit gegenüber.	4,0 χ 10"² 3 χ 10"³	Go id/Gen	Einheit/ml
	ST	Allergen+	6,0 χ 10~³	67 300	218
	HR	6,0 χ 10"⁴ 10-5	ΙΟ"²	88
Paar	ST	6,8 χ ΙΟ"⁵	Freigabe	100	88
Nr	HR ST	ΙΟ"*	10"²	-	174
1	HR ST	sehr niedrige	2,2 χ 10"¹ 10"².	1000
2	HR	ΙΟ"⁵	2,2 χ 10"¹ 10"²	278 1000	119
	ST	5,4 χ ΙΟ"⁵ ΙΟ"⁵	3,6 χ 10"²	957 1000	107
3	HR	2,3 x 10"⁴ 10-5	10"³	300	OQ
	ST	1,2 χ 10"⁴		30
4	l.	3 x ΙΟ"⁵	^ 3 x 10°	-	679
5	Mittel	keine Freigabe	5,3 x 10"²	~3000
6		10"³	7 x 10"·⁵	216
		HR⁰I,4 χ 10"⁴	432
7	ST 3 x ΙΟ"⁵

Geon
•

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Tabelle IV (Fortsetzung)

mit Allergoid behandelt

Paar

Nr.

Empfindlichkeit gegenüber Allergen"¹" Allergoid+

Verhältnis Gesamt IgE Goid/Gen Einheit/ml

HR	nicht bestimmt	10"⁵	3 χ 10"³	300	196
ST		χ 10"⁵ ΙΟ"⁶	9,0 x 10"⁴ 3 x 10"⁴	23 300
HR ST	4,0	24#⁺⁺ ΙΟ"⁴	ίο"¹	^100 1000	710
HR ST		x 10"³ χ 10"⁵	1,8 x 10"¹ 10"²	180 300	113
HR ST	1,0 3	x 10"⁴ ΙΟ'⁵	1,5 X 10"² 10"³	136 100	85
HR ST	1,1	X 10"* ¹⁰"l	7,0 χ 10~² 10"¹	700 1000	120
HR ST	1,0	10"⁵	keine Freigabe 10"²	1000	45
HR ST			15

Geom. HR Mittel _ST

1,4 χ 2 χ 10

"⁵

2,0 x 7 x 1O

132 432

102

⁺ Konz. (/ug/ml), die eine 50%ige Histaminfreigabe (HR) oder einen zwei-plus Hauttest (ST) bewirken

⁺⁺ niedrige Freigabe; max.% der zitierten Freigabe. Die Verhältnisse werden, soweit möglich, geschätzt

° mit Ausschluß von Patienten mit unmeßbaren Werten.

Alle Patienten mit Ausnahme des Paars Nr. 6 hielten des Versuchsschema ein, und die nachfolgenden Vergleich betreffen vor allem die 12 Indivuduen, die den Versuch beendeten. Es wurde gefunden, daß es extrem schwierig ist, die Patienten vollständig in allen Kriterien in Übereinstimmung zu bringen, aber die geometrischen mittleren Histamin-Freigabe und Hauttestempfindlichkeiten für Allergen und Allergoid und

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die gesamten Serum IgE-Gehalte passen recht gut zusammen.

In den Tabellen I und II sind die Injektionsdosen hinsichtlich der Allergen- und Allergoid-Einheiten für die mit Allergen und Allergoid behandelten Gruppen angegeben. Alle 6 mit Allergen behandelten Patienten, die dem Untersuchungsschema zustimmten, empfingen 5 Injektionsfolgen mit einer bis fünf Behandlungen für jede Folge. Bei der mit Allergoid behandelten Gruppe haben zwei Patienten nur vier Folgen und der Rest fünf Folgen erhalten. Die mittlere kumulative Dosis für die mit Allergoid behandelten Patienten beträgt 567/Ug AgE Äquiv. (1135,7 Einheiten), was um das 80,6fache größer ist als die mittlere kumulative Dosis von 7,0/Ug AgE Äquiv. (704 Einheiten) für die mit Allergen behandelte Gruppe. Im allgemeinen sollte die Dosis bei jeder neuen Folge wesentlich erhöht werden, wobei das Haupthindernis das Auftreten von fünf systemischen Reaktionen bei der mit Allergen behandelten Gruppe ist (einschließlich des einen Patienten, der ausgeschieden war) und einer in der mit Allergoid behandelten Gruppe. Diese werden durch Sternchen in den Tabellen I und II angegeben und entsprechend der Häufigkeit und Stärke in Tabelle V bewertet.

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	¹ lokalen	«-y-	• - ' ■ ■ * - 2939557	(24 h) Goid	systemisch Gen Goid	0
	Tabelle V		17	0	2
Bewertung der		und systemischen Reaktionen auf die	19	0	0
Injektion von		. Allergen (Gen) oder Allergoid (Goid)	15	2	0
Paar Nr.	lokal Gen	4	2	0
1	9	14	1	0
2	20	4	0	2
3	16	73	5	,86 0,33
4	17	12,2	O₁	,17 0,07
5	3	2,6	O₁
7	1			0
Gesamtbewert.	66	8	1
Durchschn. pro Patient	11,0
Durchschn. pro Injektion	2,2
ausgeschieden
6	0

Lokale Reaktionen werden wie folgt bewertet:

1+ (1 Punkt): jegliches Schwellen bis zu einem Durchmesser

von 10 cm

2+(2 Punkte): Schwellen mit einem Durchmesser von 10-20 cm 3+(3 Punkte): größer als 20 cm, jedoch nicht weiter als bis

zum Ellenbogen
4+(4 Punkte): Schwellen bis zum Ellenbogen (tritt bei dieser

Reihe nicht auf)

Systemische Reaktionen werden wie folgt bewertet:

1+ (1 Punkt): jegliche systemische Symptome über die lokale Fläche der Injektion, jedoch ist kein Epinephrin erforderlich

2+(2 Punkte): Nesselausschlag-, Heufieber- oder Astma-Symptome, die Epinephrin erfordern, der Blutdruck bleibt normal

3+(3 Punkte): systemische allergische Symptome mit Erniedrigung des Blutdrucks (treten bei dieser Reihe nicht auf)

4+(4 Punkte): freie Anaphylaxe, erfordert Notfallmaßnahmen (treten nicht auf).

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Die systemischen Reaktionen treten innerhalb einer halben Stunde nach der Antigenverabrexchung auf und gegebenenfalls werden sie prompt durch die Verabreichung von Epinephrin umgekehrt. Die anderen wesentlichen, nachteiligen Reaktionen bestehen in einem lokalisierten Schwellen an den Verabreichungsstellen bei höheren Antigendosen. Diese Reaktionen beginnen etwa 6 Stunden und erreichen ihr Maximum etwa 24 h auf die Injektionen folgend. Die durchschnittlichen Bewertungen für solche lokalisierten Reaktionen sind bei beiden Patientengruppe etwa gleich (Tabelle V).

Eine Prüfung der Blutchemie-(SMA-11) und der Urinanalysenwerte zeigt, daß kein toxisches Ansprechen auftritt als Folge der Behandlung mit entweder Allergoid oder Allergen.

Da es erforderlich war, wiederholte Doppel-Antikörper-Radioimmunoassayversuche für die Messung von Serum IgG-Antikörper gegenüber Antigen E durchzuführen, wurde beachtliche Sorgfalt darauf verwendet, eine gute Reproduzierbarkeit von einem Versuch zum anderen zu erhalten. In Fig. 1 ist der hohe Grad an Reproduzierbarkeit dargestellt, den man für die Standardkurven in 14 von 15 durchgeführten Analysen erhält. Die Standardkurve für die verbleibende Analyse liegt außerhalb der Grenzen für die anderen Analysen, und die Werte für diesen Versuch wurden nicht beachtet. Da Antikörpermessungen für einfache Serumverdünnungen innerhalb der meisten Versuche der Untersuchungen durchgeführt wurden, ist es wesentlich sicherzustellen, daß die Neigung der Bindungskurven für jeden Patienten von der der Vergleichsproben unterscheidbar ist. Daher wurde beliebig gewähltes Serum von jedem Patienten entnommen und bis zu den vollen Bindungskurven analysiert. Es wurde gefunden, daß die Bindungskurven für jeden Patienten sich nicht wesentlich von denen des Standards (Fig. 2) unterscheiden, wodurch sichergestellt wurde, daß eine einfache Verdünnung bei der Analyse der Antikörpergehalte in den restlichen Sera sinnvoll ist.

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Die Fig. 2 bis 4 zeigen das Anti-Antigen E IgG-Ansprechen bei 6 Paaren von Patienten, die das Untersuchungsschema erfüllten, und Fig. zeigt die Kurven der beiden ausgeschiedenen Patienten. Auf die erste Reihe von Injektionen am Tag O folgend, steigen die IgG-Antikörpertiter beachtlich bei den meisten Patienten und erreichen Plateauwerte zwischen 2 und 3 Wochen. Nachdem sichergestellt wurde, daß die Plateauwerte bei den meisten Patienten tatsächlich erreicht wurden, indem die Antikörpertiter in einer Reihe von 4 bis 5 aufeinanderfolgenden Blutproben bestimmt wurden, wurde eine zweite Reihe von Injektionen zwischen den Tagen 28 und 42 verabreicht. Nach etwa weiteren 3 bis 4 Wochen wurden sekundäre Plateauwerte bei den meisten Patienten erreicht, und es wurde eine weitere Folge von Injektionen verabreicht. Weitere 2 oder 3 Injektionsfolgen werden vor der Kreuzkrautsaison in der Augustmitte verabreicht. Bedingt durch die Kürze der Zeit vor der Saison war es nicht möglich, die Gewißheit abzuwarten, daß die Plateauwerte bei allen Patienten zwischen der Verabreichung dieser letzteren Folgen erreicht wurden.

Die Fig. 2 bis 5 erläutern, daß Patienten mit stark unterschiedlichen Antikörpergehalten vor der Behandlung (3 bis 114 Einheiten/ml) begannen. Die Antikörpergehalte steigen bei allen Patienten nach der Behandlung, wobei die mit Allergoid behandelte Gruppe einen 5_f7fach höheren geometrischen mittleren Anstieg und einen 5_f2fach höheren Peaktiter als die mit Allergen behandelte Gruppe zeigte. Mit Ausnahme des Paars Nr. 2 erzeugen alle mit Allergoid behandelten Patienten größere Antikörperanstiege - normalerweise um das 5- bis 20fache größer - als ihre mit Allergen behandelten Gegenstücke. Von weiterer Bedeutung ist die Tatsache, daß, folgend auf nur zwei Folgen der Immunisierung, die mit Allergoid behandelten Patienten im Durchschnitt 47% (Bereich: 15 bis 91?0 des maximalen Antikörperansprechens ergeben, das nach der vollen 4 bis 5 Folgenbehandlung erreicht wird.

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Die entsprechenden Werte für die mit Allergen behandelten Individuen betragen 32% (Bereich: 6 bis 43%) der maximalen Empfindlichkeit nach 2 Injektionsfolgen. Der geometrische mittlere Anstieg nach nur 2 Folgen der Behandlung ist um das 7,9fache größer bei den mit Allergoid behandelten Patienten als bei der mit Allergen behandelten Gruppe. Überraschenderweise wurde gefunden, daß alle, mit Ausnahme eines Patienten (G.T., Gen Nr. 4), IgG-Antikörpertiter innerhalb von 50 bis 100% ihrer Peakwerte beibehalten, einige 3 1/2 Monate auf die letztere Injektion folgend, die 2 Monate nach der Kreuzkrautsaison erfolgte.

In Fig. 6 ist die Beziehung zwischen der kumulativen Antigendosis (ausgedrückt in/ug AgE Äquiv.) und der Gesamtzunahme in der IgG-Antikörperempfindlichkeit (Peakempfindlichkeit minus Anfangswert) für alle 12 Patienten dargestellt, die die Untersuchung beendeten. Es gibt eine klare Beziehung zwischen der Antikörperempfindlichkeit und der Dosis, unabhängig davon, ob ein Patient mit Allergen oder mit Allergoid behandelt wurde. Da die Regressionslinien für die beiden Gruppen sich nicht wesentlich unterscheiden, wurden die Werte für alle 12 Patienten zusammengenommen. Durch lineare Regressionsanalyse von log (Antikörpertiter) versus log Dosis wird der Korrelationskoeffizient r = 0,83; ρ <0,001, bestimmt. Die entsprechenden Werte für die Antikörperempfindlichkeit versus kumulative Dosis nach nur zwei Injektionsfolgen zeigen eine ähnliche Korrelation (r = 0,81; ρ< 0,001).

Die mittleren Tag-zu-Tag-Symptombewertungen in den beiden Gruppen von Patienten im Verlauf der 1977er Kreuzkraut-Pollensaison (Fig. 7) zeigen einen Trend in Richtung auf eine niedrigere Gesamtsymptomatologie innerhalb der Saison. Dies folgt durch Analyse der durchschnittlichen täglichen Bewertungen für jeden Patienten, wobei der Durchschnitt während der gesamten Kreuzkrautsaison genommen wird(Fig.8A).

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Die durchschnittliche Bewertung für die mit Allergoid behandelte Gruppe beträgt 1,1 Symptomeinheiten weniger als bei der mit Allergen behandelten Gruppe. Diese Ergebnisse sind statistisch nicht mit diesen wenigen Patienten unterschiedlich. Frühere Untersuchungen (P.S. Norman, W.L. Winkenwerder und Lichtenstein, 1971 (J. Allergy 47, 273) haben gezeigt, daß die durchschnittliche tägliche Symptombewertung für die gesamte Kreuzkrautsaison für ähnlich empfindliche, mit Placebo behandelte Patienten normalerweise in den Bereich von 7 bis 10 Einheiten fällt, wobei die peakdurchschnittlichen täglichen Bewertungen 12 bis 14 Einheiten betragen. Daher scheint es den meisten der behandelten Patienten besser zu gehen, als man es von der dazu passenden Placebo-Gruppe erwarten würde. Die Bewertungen der behandelten Patienten sind ähnlich wie diejenigen, die man bei Patienten findet (die auch zuvor unbehandelt waren), die nach einem herkömmlichen Behandlungsschema von 16 bis 24 wöchentlichen Injektionen von Antigen behandelt wurden, und zwar bei einer 1973 durchgeführten Untersuchung von Allergen gegen Allergoid (Fig. 8B). Die Beurteilung des Arztes der Patienten während der Kreuzkrautsaison ist in Übereinstimmung mit den selbst durchgeführten Bewertungen der Symptome.

Diskussion

Die vorliegende Untersuchung stellt die ersten systematischen Versuche dar, das optimale Behandlungsschema hinsichtlich der Antlgendosis und den Injektionszwischenräumen für die Immunotherapie allergischer Patienten zu definieren. Gegen Ende der Untersuchung wurde ein intensives "EiI"-Schema verwendet, das 1 bis 5 Injektionen für jeden Behandlungstag umfaßte. Dieses Protokoll erlaubt dem Arzt, dem Patienten die optimal tolerierbare Dosis zu verabreichen. In den meisten Fällen sind solche Dosiseinheiten etwa um

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das 100- bis 10 OOOfache größer als diejenigen, die normalerweise am ersten Tag der Behandlung des Patienten verabreicht werden. Bei Al]s*goid ergibt eine hohe Behandlungsdosis am ersten Injektionstag eine wesentliche (10-bis 10Ofache) Erhöhung im IgG-Antikörper zu Antigen E etwa 2 bis 3 Wochen später. Eine zweite Folge von Injektionen bei höheren Dosen kann dann verabreicht werden, was eine Antikörperempfindlichkeit bewirkt, die durchschnittlich etwa 5090 von der darauffolgenden beträgt, die man erhält folgend auf 2 bis 3 weitere Folgen von Injektionen mit hohen Dosen an Allergoid.

Aus den Antikörper-Untersuchungen folgt, daß ein Injektionszwischenraum von 2 bis 4 Wochen optimal sein wird, da zu diesem Zeitpunkt der Patient seine maximale Empfindlichkeit für die Immunisierung erreicht hat. Es ist jedoch auch möglich, daß ein etwas größeres Intervall, das eine zusätzliche Auffrischung von IgG Antikörper liefernden Zellen bewirkt, wirksamer sein kann, vorausgesetzt, daß die Antikörpergehalte nicht drastisch fallen werden.

Trotz der hohen Dosisbereiche (insbesondere mit Allergoid) werden bei keinem der behandelten Patienten nachteilige toxische Empfindlichkeiten beobachtet.

Diese Untersuchungen zeigen die klaren Vorteile von Allergoid gegenüber Allergen, da sehr hohe Allergoiddosen dem Patienten mit relativ geringer Gefahr systemischer Reaktionen und mit einhergehenden hohen Gehalten an IgG-Antikörper verabreicht werden. In der vorliegenden Untersuchung war die einzige Ausnahme für diese Regel der Patient D.H. beim Allergoid-Paar Nr. 2. Dieser Patient zeigte höhere als durchschnittliche Empfindlichkeit gegenüber Allergoid und retrospektiv scheint es wahrscheinlich, daß in diesem Fall die Anfangsbehandlungsfolge zu stark bzw. streng war. Das

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Auftreten systemischer Reaktionen bei der mit Allergen behandelten Gruppe ist im Durchschnitt 0,7/Patient mit einer durchschnittlichen Reaktionsbewertung von 0,8/Patient (einschließlich des ausgeschiedenen Patienten). Dies ist unannehmbar hoch, so daß ein intensives Dosierungsschema für eine Eilbehandlung mit Allergen nicht empfohlen werden kann.

Diese Untersuchung, die in zwei kleinen Gruppen von Patienten durchgeführt wurde, die mit Allergen und Allergoid behandelt wurden, läßt den Schluß zu, daß mit größeren Patientengruppen weitergearbeitet werden sollte, wobei die bekannten Behandlungsschemata für Allergen mit dem modifizierten Eilschema für Allergoid verglichen werden sollten.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung eines mit Aldehyd behandelten Allergens mit niedriger allergenischer Reaktivität bei allergischen Menschen und welches die gewünschten Immunisierungseigenschaften des nativen Allergens beibehält, die zu einer Verbesserung der Symptomatologie der allergischen Individuen und der damit einhergehenden Produktion von Blockierungsantikörper führen, wovon angenommen wird, daß sie assoziiert ist mit, aber nicht notwendigerweise verantwortlich ist für solche Erleichterung der Symptome, und welches ±1 der Lage ist, bei Säugetieren die Bildung von Blockierungsantikörpern gegen das native Allergen in ausreichender Konzentration zu induzieren, dadurch gekennzeichnet , daß man Allergene chemisch unter milden Bedingungen mit einer Lösung reagieren läßt, ausgewählt aus der Gruppe Formaldehyd, niedrige, gesättigte, aliphatische, difunktionelle Aldehyde und ihre Gemische, in einer Vielzahl von Stufen, mit dem Proviso, daß irgendwelche Formaldehydreaktionen in nicht-phenolischer Umgebung durchgeführt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion der ersten Stufe bei einer Temperatur gerade über dem Gefrierpunkt der Lösung bis 15⁰C durchgeführt wird und daß jede darauffolgende Stufe bei einer Temperatur von etwa 25 bis 40⁰C durchgeführt wird, wobei irgendeine Kombination von Formaldehyd und Dialdehyd in jeder der aufeinanderfolgenden Stufen verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Aldehyd bei allen Stufen Formaldehyd ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Aldehyd bei allen Stufen ein Dialdehyd der Formel

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O O HC-(-CH₂-)-_nCH

ist, worin η eine ganze Zahl von 1 bis etwa 6 bedeutet.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Aldehyd bei allen Stufen Glutaraldehyd ist.

6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Aldehyd eine Kombination von Formaldehyd und Dialdehyden ist, wobei ein Gemisch in jeder Stufe oder die individuellen Aldehyde bei aufeinanderfolgenden Stufen verwendet werden.

7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Aldehyd eine Kombination aus Formaldehyd und Glutaraldehyd ist, die als Gemisch in jeder Stufe verwendet wird, oder wobei die individuellen Aldehyden in aufeinanderfolgenden Stufen verwendet werden.

8. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Allergene mit dem bzw. den Aldehyd(en) in zwei Stufen reagieren können.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zusammen mit der verdünnten Formaldehydlösung mindestens ein Zusatzstoff, ausgewählt aus der Gruppe 1,4-Diaminobutan, Lysin, Ornithin, 1,5-Diamino-pimelinsäure, Arginin, Adipamid, Asparaginsäure, Serin und Alanin, vorhanden ist.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Allergen enthaltende Material ein wäßriger Extrakt einer Pollensubstanz ist.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Allergen enthaltende Material ein wäßriger Extrakt einer Graspollensubstanz ist.

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12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Allergen enthaltende Material eine Gruppe I Graspollenallergenzubereitung enthält.

13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Allergen enthaltende Material ein wäßriger Extrakt einer Unkrautpollensubstanz ist.

14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Allergen enthaltende Material ein wäßriger Extrakt einer Baumpollensubstanz ist.

15· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Allergen enthaltende Material Kreuzkrautpollen Antigen E enthält.

16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Allergen enthaltende Material ein wäßriger Extrakt ist, der Hausstaubmilben oder ihre Rückstände enthält.

17. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Allergen enthaltende Material ein wäßriger Extrakt eines Pilzes oder von Pilzen ist.

18. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Allergen enthaltende Material ein wäßriger Extrakt eines Insekts oder Insektenprodukts ist.

19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Allergen enthaltende Material ein wäßriger Extrakt aus tierischen Schuppen/Haut/Haar bzw. Hautrückständen ist.

20. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Allergen enthaltende Material ein wäßriger Extrakt von Nahrungsmitte!allergen ist.

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21. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Allergen enthaltende Material eine gereinigte Allergenzubereitung ist.

22. Produkt, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren von Anspruch 1 erhalten worden ist.

23. Produkt, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren von Anspruch 2 erhalten worden ist.

24. Produkt, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren von Anspruch 3 erhalten worden ist.

25. Produkt, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren von Anspruch 4 erhalten worden ist.

26. Produkt, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren von Anspruch 5 erhalten worden ist.

27. Produkt, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren von Anspruch 6 erhalten worden ist.

28. Produkt, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren von Anspruch 7 erhalten worden ist.

29. Produkt, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren von Anspruch 8 erhalten worden ist.

30. Produkt, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren von Anspruch 9 erhalten worden ist.

31. Produkt, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren von Anspruch 10 erhalten worden ist.

32. Produkt, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren von Anspruch 11 erhalten worden ist.

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33· Produkt, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren von Anspruch 12 erhalten worden ist.

34. Produkt, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren von Anspruch 13 erhalten worden ist.

35. Produkt, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren von Anspruch 14 erhalten worden ist.

36. Produkt, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren von Anspruch 15 erhalten worden ist.

37· Produkt, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren von Anspruch 16 erhalten worden ist.

38. Produkt, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren von Anspruch 17 erhalten worden ist.

39. Produkt, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren von Anspruch 18 erhalten worden ist.

40. Produkt, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren von Anspruch 19 erhalten worden ist.

41. Produkt, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren von Anspruch 20 erhalten worden ist.

42. Produkt, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren von Anspruch 21 erhalten worden ist.

43. Verfahren zur Herstellung eines mit Aldehyd behandelten Allergens mit niedriger allergenischer Reaktivität bei allergischen Menschen und welches die gewünschten Immunisierungseigenschaften des nativen Allergens beibehält und zu einer Verbesserung der Symptomatologie allergischer

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Individuen führt mit einhergehender Produktion von Blockierungsantikörper, von dem angenommen wird, daß er assoziiert ist, aber nicht notwendigerweise verantwortlich ist für die Erleichterung der Symptome, und das in Säugetieren die Bildung von Blockierungsantikörpern gegen das native Allergen in ausreichender Konzentration induziert, dadurch gekennzeichnet , daß man Allergene chemisch unter milden Bedingungen mit einem Gemisch aus mindestens zwei Verbindungen, ausgewählt aus der Gruppe Formaldehyd und niedere, gesättigte, difunktionelle Aldehyde, in mindestens einer Stufe reagieren läßt, mit dem Proviso, daß irgendwelche Formaldehydreaktionen in nicht-phenolischer Umgebung durchgeführt werden.

44. Produkt, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren von Anspruch 43 erhalten worden ist.

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