DE2939557C2 - Verfahren zur Herstellung eines mit Aldehyd behandelten Allergens - Google Patents
Verfahren zur Herstellung eines mit Aldehyd behandelten AllergensInfo
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Description
O O
Il Il
HC- (— CH2-)— CH
ist worin η eine ganze Zahl von 1 bis etwa 6 bedeutet
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Aldehyd bei allen Stufen Glutaraldehyd
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß der Aldehyd eine Kombination von Formaldehyd
und Dialdehyden ist, wobei ein Gemisch in jeder Stufe oder die individuellen Aldehyde bei aufeinanderfolgenden
Stufen verwendet werden.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zusammen mit der verdünnten Formaldchydlösung
mindestens ein Zusatzstoff, ausgewählt aus der Gruppe 1,4-Diaminobutan, Lysin, Ornithin, 1,5-Diamino-pimelinsäure.
Arginin, Adipamid, Asparaginsäure, Serin und Alanin, vorhanden ist.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Allergen enthaltende Material ein wäßriger
Extrakt einer Pollensubstanz wie Graspollensubstanz, Graspollenallergenzubereitung, Unkrautpollcnsubstanz,
Baumpollensubstanz oder/und Kreuzkrautpollen Antigen E, ist
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß das Allergen enthaltende Material ein wäßriger
Extrakt aus Hausstaubmilben, ihren Rückständen oder Mischungen davon, eines Pilzes oder von Pilzen,
eines Insekts oder Insekteilproduktes, aus tierischen Schuppen/Haut/Haar bzw. Hautrückständen, von Nahrungsmittelallergen
oder/und einer gereinigten Allergenzubereitung ist
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines mit Aldehyd behandelten Allergens, wobei Reaktionen
mit Formaldehyd in nicht-phenolischer Umgebung durchgeführt werden, mit niedriger allergenischer
Reaktivität bei allergischen Menschen und welche die gewünschten Immunisierungseigenschaften des nativen
Allergens beibehält, die zu einer Verbesserung der Symptomatologie der allergischen Individuen und der damit
einhergehenden Produktion von Blockierungsantikörper führen, wovon angenommen wird, daß sie assoziiert ist
mit, aber nicht notwendigerweise verantwortlich ist für solche Erleichterungen der Symptome, und welches
inder Lage ist, bei Säugetieren die Bildung von Blockierungsantikörpern gegen das native Allergen in ausreichender
Konzentration zu induzieren.
Patienten, die an Allergien des unmittelbaren Typs (Atopien) leiden, besitzen die Kapazität, daß sie spezielle
Arten allergischer Antikörper (Reagine) erzeugen können, wenn sie bestimmten Substanzen (Allergenen),
gegenüber denen sie empfindlich sind, ausgesetzt sind. Die Reagine haften stark an bestimmten Histamin
enthaltenden Zellen einschließlich der Mastzellen des Epithels. Danach findet bei einer späteren Einwirkung des
sensibilisierenden allergenen Materials eine physikalische Kombination zwischen dem bzw. den Allergen(en)
und ihren homologen, zellgebundenen Reaginen statt, was zu allergischen Manifestationen an den Stellen der
Reagin-Allergen-Koir.bination führt. Allergische Individuen sind ebenfalls in der Lage, die sog. »Blockierungsantikörper«
vom Nicht-Reagintyp zu erzeugen, die mit dem Allergen eine Kombination eingehen können und
diese inaktivieren können, im allgemeinen ohne unerwünschte Nebenreaktionen. Die reaginische Aktivität
wurde dem Immunoglobulin E (IgE) und die »Blockierungsw-Aktivität wurde dem IgG im Serum und dem IgA
und dem IgG in den Sekretionen zugewiesen.
Es ist seit langem klinische Praxis, einen allergischen Patienten allmählich zunehmende Dosen von wäßrigen
Extrakten, die das bzw. die allergene(n) Material(ien), gegen das bzw. die der Patient empfindlich ist, enthalten,
zu injizieren. Historisch ist die Grundlage für diese Behandlung hauptsächlich eine Erhöhung der Konzentration
an Schutzblockierungs-Antikörper im Serum ( und andere Körperfluide) auf einen Gehalt gewesen, wo diese
wirksam mit dem zellgebundenen Reagin für Allergene, die den Körper betreten, konkurrieren können, wodurch
die allergischen Reaktionen inhibiert werden. Man nimmt heute an, daß der Mechanismus bzw. die Mechanis-
men, gemäß dem bzw. denen die Immunotherapie zur Verbesserung der allergischen Symptome führt, komplexer
ist bzw. sind. In bestimmten Fällen wurde gefunden, daß diese Therapie ebenfalls die Produktion von
Reaginen unterdrückt und die Zellenansprechbarkeit gegenüber dem injizierten Allergen erniedrigt
Was auch immer der genaue Mechanismus bzw. die genauen Mechanismen ist bzw. sind, gemäß dem bzw.
denen die Immunotherapie eine symptomatische Besserung bewirkt, haben verschieden,; Untersuchungen gezeigt,
daß es wesentlich ist, eine entsprechend große Dosis an Extrakt dem Patienten zu injizieren, damit die
Behandlung wirksam ist Leider müssen bei der konventionellen Behandlung die immunisierenden Dosen des
allergenischen Extrakts sehr allmählich erhöht werden, damit die Gefahr eines allgemeinen allergischen (anaphylaktischen)
Ansprechens bei dem Patienten minimal gehalten wird.
Die Hauptnachteile dieser Immunotherapie sind: (1) während vieler Wochen sind wiederholte Injektionen
erforderlich, (2) die Behandlung ist selten vollständig wirksam bei der Beseitigung des allergischen Syndroms
und (3) die Gefahr einer allgemeinen anaphylaktischen Reaktion ist immer bei jeder Behandlungsstufe vorhanden.
Die ursprüngliche Therapie wurde daher mit dem Ziel modifiziert, diese Nachteile zu beseitigen. Derzeit
übliche Formen der Behandlung umfassen die Immunisierung des Patienten mit entweder einer Wasser-in-Öl-Emulsion
des allergenischen Extrakts oder die Einarbeitung eines langsamen Freigabeadjuvans, wie Aluminiumoxidgel,
oder eines Alginate mit einem Extrakt des allergenischen Materials. Diese Verfahren sind nicht vollständig
zufriedenstellend, bedingt durch das Auftreten gewisser anaphylaktischer und einiger toxischer Reaktionen
beim Patienten, oder deshalb, daß diese Zubereitungen klinisch nicht ausreichend wirksam sind.
Verschiedene Forscher haben allergenische Materialien chemisch oder physikalisch behandelt, um ihre allergenischen
Eigenschaften wesentlich zu vermindern, wobei sie jedoch ihre Kapazität beibehalten sollen, die
allergischen Individuen gegenüber dem nativen Allergen zu schützen. Die Immunotherapie allergischer Individuen
unter Verwendung solcher modifizierten Allergene würde, so hatte man gehofft, die gewünschten Immunisierungseigenschaften
des nativen Allergens beibehalten einschließlich seiner Fähigkeit, die Bildung von Blokkierungs-Antikörper
gegen das native Allergen in wesentlichen Mengen zu induzieren. Weiterhin würde die
reduzierte Allergenizität solcher modifizierten Materialien die Verwendung wesentlich erhöhter Dosen an
Immunisierungsmaterial erlauben, und somit würde die Menge an gebildeten Schutzblockierungs-Antikörper
wesentlich erhöht werden.
Es wurde weiterhin gefunden, daß bei der Verwendung einer Formaldehydlösung mit oder ohne bestimmte
Zusatzstoffe mit niedrigem Molekulargewicht die große Hauptzahl der Allergen enthaltenden Substanzen so
modifiziert werden kann, daß die Nachteile der nativen Allergene hinsichtlich ihrer Verwendung bei der
Immunotherapie beseitigt werden. (Im folgenden werden irgendwelche Allergen enthaltende Substanzen einfach
als »Allergen« bezeichnet, obgleich es bekannt ist, daß nicht alle Komponenten von Allergen enthaltenden
Substanzen notwendigerweise allergenisch sind.)
Entsprechend der GB-PS 12 82 163 wurden wasserunlösliche oder kaum in Wasser lösliche, mit Dialdehyd
modifizierte Pollenmaterialien, die potentiell bei der Behandlung allergischer Patienten nützlich sind, hergestellt.
Entsprechend Patterson et al. (J. Immunol. 110,1402,1973) wurden wasserlösliche, mit Glutaraldehyd modifizierte
Kreuzkiautpolymere hergestellt. Eine spätere Untersuchung von mit Glutaraldehyd modifiziertem Kreuzkraut-Antigen
E (Metzger et al, New Eng. J. Med. 295,1160,1976) schlägt vor, daß dieses Material nützlich sein
kann bei der Therapie von gegenüber Kreuzkraut allergischen Subjekten.
Die Anmelderin hat jetzt gefunden, daß verbesserte, mit Formaldehyd und niederem gesättigtem aliphatischem
Dialdehyd behandelte, Allergen enthaltende Materialien durch Umsetzung in einer ersten Stufe bei
niedriger Temperatur, normalerweise um 10° C, mit Formaldehyd und/oder Dialdehyd und anschließend bevorzugt,
aber nicht notwendigerweise, mit einer zweiten Stufe bei erhöhter Temperatur, normalerweise um 32° C,
gegebenenfalls durch weitere Stufen bei ähnlich erhöhten Temperaturen, bei denen Amine, Aminosäuren und
verwandte Verbindungen gegebenenfalls bei irgendeiner oder bei einer Kombination der Stufen verwendet
werden können, und wobei der Formaldehyd oder irgendein Dialdehyd in irgendeiner Kombination oder
Reihenfolge bei dem stufenweisen Verfahren verwendet werden kann, erhalten werden. Bei Bezugnahme auf die
neuen, mit Aldehyd behandelten Allergene wird der Ausdruck »mit Aldehyd modifiziert« darauf beschränkt,
modifizierte Allergene zu beschreiben, bei denen inter- oder intramolekulare Vernetzungsbindungen zwischen
oder innerhalb der AHergenmoleküle selbst und zwischen dem Allergen und in dem Reaktionsgemisch vorhandenen,
anderen reaktiven Molekülen erzeugt worden sind.
Aus der DE-OS 19 51 256 ist ein Verfahren zur Herstellung von formalinisierten Allergenen mit einer niedrigen
Allergenaktivität auf menschliche Lebewesen bekannt, bei dem ein wäßriger Extrakt des Allergenmaterials
mit einer verdünnten Formaldehydlösung in nichtphenolischer Umgebung behandelt wird. Ein Hinweis auf eine
Mehrstufen-Behandlung unter definierten Temperaturbedingungen für jede Stufe läßt sich daraus nicht entnehmen.
Aus der DE-OS 20 39 223 ist die einstufigen Behandlung eines allergenen Proteins oder Glykolprotiens in
wäßriger Lösung u. a. mit einem Polyaldehyd oder Polyketon bekannt; aus der DE-OS 24 22 097 die einstufige
Behandlung von Ambrosiagewächs-Extrakt mit Glutaraldehyd zur Herstellung eines polymerisierten Ambrosiagewächs-Ar.tigsris
E.
Die DE-OS 25 05 814 offenbart ein einstufiges Verfahren zur Herstellung feinverteilterTyrosin-Mikropartikel
mit einem darin dispergierten mit Dialdehyd behandelten Allergen. Nach diesem Verfahren wird eine wäßrige
Lösung eines mit einem wasserlöslichen Dialdehyd modifizierten Allergenextrakts mit einer Lösung von Tyrosin
in einer Säure vermischt und dann mit einer Base auf einen pH-Wert von 4 bis 7,5 eingestellt (vgl. Anspruch 1),
wobei die Mikropartikel ausfallen.
In der US-PS 31 35 652 und einem verwandten Artikel in Brit. J. Exp. Path, 44,177 (1963), wird die Toxoidierung
von gereinigtem Diphtherientoxin mit Formalin in Natriumbicarbonat (0,5% GewVVol.) bei einem pH von
7,5 beschrieben. Die Toxoidierung verläuft bei Zimmertemperatur und scheint in 3 bis 4 Wochen vollständig zu
sein, was durch intrakutane Versuche bei Meerschweinchen festgestellt wurde. Versuche für die Nicht-Toxizität
(200 Lf-Einheiten in einem Volumen von 5,0 ml, in Meerschweinchen subkutan injiziert) zeigen eine späte
Paralyse bei allen Meerschweinchen. Die Inkubation bei 30 bis 320C während weiterer 3 Wochen nach der
Toxoidierung scheint bei Zimmertemperatur vollständig zu sein und ergibt ein Produkt, das, nachdem das freie
Formalin durch Ultrafiltration entfernt worden ist, keine Toxizität zeigt. Nach dem Lagern kehrt es jedoch in
den toxischen Zustand zurück. Entsprechend diesen Angaben wird die Neigung für eine Reversion oder Umkehr
durch Zugabe verschiedener Amine und Aminosäuren verhindert.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher das in den Ansprüchen definierte Verfahren.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher das in den Ansprüchen definierte Verfahren.
Die so behandelten Allergene können stark gereinigt oder teilweise gereinigt werden oder sie können rohe
Extrakte sein. Die Dialdehyde besitzen die Formel
HC- (— CH2-)— C — H
worin η für 1 bis etwa 6 steht. Der Ausdruck »Aldehyd«, wie er in der vorliegenden Anmeldung verwendet wird,
betrifft den zuvor Formaldehyd und niedrige, gesättigte, aliphatische Dialdehyd, wie Glutaraldehyd (n =3), von
denen jeder allein oder im Gemisch mit irgendeinem anderen während des stufenweisen Verfahrens verwendet
werden kann.
Der Ausdruck »nicht-phenolisch« soll bedeuten, daß höchstens Spurenmengen an zugegebenen phenolischen
Verbindungen in der Umgebung der Aldehydreaktion vorhanden sind. Dieser letztere Ausdruck schließt die
Anwesenheit phenolischer Hydroxygruppen nicht aus, von denen bekannt ist, daß sie die Allergene per se
natürlich, in den meisten Fällen, als Teil der komplexen proteinartigen Struktur enthalten.
Das erfindungsgemäße Verfahren führt zur Erzeugung von mit Aldehyd behandelten Allergenen mit niedriger
allergenischer Reaktivität bei allergischen Mengen, die jedoch ihre gewünschten Immunisiereigenschaften des
nativen (unbehandelten) Allergens beibehalten einschließlich der Fähigkeit, wesentlich Mengen an Blockierungs-Antikörper
zu induzieren, die mit den nativen Allergenen nach der Injizierung in Menschen stark kreuz-
bzw. vernetzungs-reaktiv sind. Es wurde gefunden, daß eine längere Therapie mit solchen mit Aldehyd behandelten
Allergenen eine wesentliche Unterdrückung der Serum IgE-Antikörper gegen die entsprechenden Allergene
bewirkt. Große, therapeutisch wirksame Dosen solcher mit Aldehyd behandelten Allergene können allergischen
Menschen verabreicht werden, wobei die Gefahr, systemischer, allergischer Reaktionen stark verringert ist,
verglichen mit ähnlich großen Dosen von nativen Allergenen. Dadurch kann der Arzt die Zahl der Injektionen
der mit Aldehyd behandelten Allergene, bezogen auf die der nativen Allergene, verringern. Die mit Aldehyd
behandelten Allergene sind weiterhin für die Immunisierung anderer Säugetiere für die Blockierung der Antikörperproduktion
nützlich.
Die Annielderin nimmt an, obgleich sie nicht auf irgendeine Theorie beschränkt sein will, daß ein Hauptgrund,
warum die erfindungsgemäßen, mit Aldehyd modifizierten Allergene besser sind als die zuvor beschriebenen, in
der Verwendung einer niedrigen Reaktionstemperatur bei der ersten Stufe liegt. Bei dieser niedrigen Temperatür
findet eine inter- und intramolekulare Vernetzung langsam ohne nachteilige thermische oder chemische
Denaturierung der kritischen labilen Immuno-Determinanten an den Allergenen statt, wobei solche nachteiligen
Reaktionen im Gegensatz zu der Forderung stehen, die gewünschten Immunisierungseigenschaften in dem
aldehydmodifizierten Allergen beizubehalten. Die entstehenden Vernetzungen stabilisieren das Molekül für die
nachfolgenden Reaktionen bei höherer Tempertur, die in einer oder mehreren Stufen unter Verwendung des
gleichen oder eines anderen Mono- oder Dialdehyds durchgeführt werden können. Die optimale Ausnutzung
von mehr als einem Dialdehyd bewirkt eine bessere Flexibilität in der Reaktionssequenz, wodurch die aldehydmodifizierten
Allergene weniger allergenisch mittels einer Reaktion gemacht werden können, bei der eine
Vielzahl unterschiedlicher Aldehyde verwendet werden kann.
Der Erfindung liegt somit das Ziel zugrunde, eine neue und verbesserte Klasse von aldehydmodifizierten
Der Erfindung liegt somit das Ziel zugrunde, eine neue und verbesserte Klasse von aldehydmodifizierten
so Allergenen zur Verfügung zu stellen. Dieses Ziel wird erfindungsgemäß durch das in den Ansprüchen definierte
Verfahren zur Bildung von aldehydmodifizierten Allergenen erreicht
Obgleich die Anmelderin nicht auf irgendeine Theorie beschränkt sein will, nimmt man an, daß bei der
Reaktion die Hauptvernetzungsreaktionen, an denen Formaldehyd beteiligt ist, durch die Ausbildung von inter-
oder intra-molekularen Methylen-Brückenbindungen zwischen Amino einerseits und Guanidino, Säureamid und
bestimmten aromatischen Gruppen (insbesondere Tyrosylresten in Proteinen) andererseits stattfinden. Obgleich
dies wieder keine Beschränkung auf eine Theorie sein soll, nimmt man weiterhin an, daß hauptsächlichen inter-
und intramolekularen Vernetzungsreaktionen, bei denen die Dialdehyde teilnehmen, zwischen Paaren von
Aminogruppen stattfinden. Die Chemie der beiden Arten von Vernetzungen ist daher etwas unterschiedlich, und
die kinetischen Werte des Dialdehyd-Vernetzungsverfahrens sind offensichtlich höher als die, bei denen Formaldehyd
eine Rolle spielt. Ist ein geeigneter Zusatzstoff, wie er in der vorliegenden Anmeldung beschrieben wird, in
dem Reaktionsgemisch vorhanden, kann eine ausgedehnte inter-molekulare Vernetzung zwischen den Allergenmolekülen
und dem Zusatzstoff stattfinden.
Werden rohe Allergene verwendet, sollten fettartige Substanzen und nicht-allergenische Materialien mit
niedrigem Molekulargewicht in den nativen Substanzen bevorzugt, obgleich nicht notwendigerweise, hauptsächlich
vor der Aldehydbehandlung entfernt werden.
Rohe, allergenische Zubereitungen, die besonders für die Aldehydbehandlung geeignet sind, können durch
Entfettung des nativen. Allergen enthaltenen Materials mit wasserfreiem, peroxidfreiem Diäthyläther oder
Petroläther und Extraktion des entfetteten Materials mit einer wäßrigen Lösung, bevorzugt gepuffert auf etwa
pH 6 bis 8 (ζ. B. 0,125 M NH4HCO3), hergestellt werden. Nicht-allergenische Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht,
die normalerweise vorhanden sind, können aus dem Extrakt durch Dialyse oder Ultrafiltration durch
eine semipermeable Membran (z. B. Visking-Schlauch, Mulliporen-Membran, Amicon-Hohlfaservorrichtung mit
einem geeigneten Molekulargewichtswegschnitt, normalerweise im Bereich von etwa 3000 bis 10 000 Dalton
und bevorzugt 3000 bis 5000 Dalton) entfernt werden, obgleich Gelfiltration oder ein ähnliches Verfahren, die
dem Fachmann geläufig sind, ebenfalls verwendet werden kann, um ein ähnliches Resultat zu ergeben. Alternativ
können die Materialien mit hohem Molekulargewicht ohne signifikante, irreversible Denaturierung von dem
Gesamtextrakt durch ein Salz- oder Lösungsmittelpräzipitationsverfahren ausgefällt werden. Diese Materialien
mit hohem Molekulargewicht können aus den präzipitierten Materialien in Form einer wäßrigen Lösung
rekonstituiert werden. Gereinigte oder teilweise gereinigte, allergenische Subtanzen können nach irgendeinem
der normalerweise für die Reinigung von Makromolekülen von komplexen Gemischen verwendeten Verfahren
gereinigt werden. Geeignete Reinigungsverfahren wurden in der Literatur für Fischallergene, Kreuzkrautpollen,
Roggen- und Timotheusgras-Pollen, Fungi, Hausstaubmilben und Insektengifte beschrieben, obgleich dies nicht
die einzigen Verfahren sind noch die einzigen allergenischen Materialien, die bei dem Aldehydbehandlungsverfahren
verwendet werden können.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf irgendein besonderes, Allergen enthaltendes Material oder einen
Extrakt beschränkt Jedoch können Pflanzenpollenallergen enthaltende Materialien, insbesondere solche von
Gräsern, Bäumen und Unkräutern, die bei der Allergie eine große Rolle spielen, extrahiert und mit Erfolg mit
den Aldehyden erfindungsgemäß behandelt werden. Beispiele von Polen aus der Grasfamilie (Gramineae), die
für die Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen Wiesenschwingelgras (Festuca elatior),
Blaues Kentuckygras (Poa pratensis) und Obstkulturen (Dactylis glomerata) des Stammes Festuceae; perennierendes
Roggengras (Lolium perenne) und Italienisches Roggengras (Lolium multiflorum) des Stammes Hordeae;
Timotheus (Phleum pretense) und Rotspitze (Agrostis palustris) des Stammes Agrostideae; und Süßes Ruchgras
(Anthoxanthum odoratum) des Stammes Phalarideae. Vergleichsbeispiele von Baumwollen umfassen verschiedene
Species von Walnüssen, wie Juglans californica, von Birken (z. B. Betula alba), von Eichen (z. B. Quercus
alba) und von Ulmen (z. B. Ulmus parvifolia). Nützliche Unkrautpollen umfassen Kurzes Kreuzkraut (Ambrosia
elatior), Großes Kreuzkraut (Ambrosia trifida), Russische Distel (Salsola pestifer), Gemeiner Salbei bzw. Beifuß
(Artemisia tridentata) und Englischer Wegerich (Plantago lanceolata). Andere allergenische Materialien, die
behandelt werden können, umfassen Extrakte, die ganze Körper und/oder Exkrete und Sekrete von Hausstaubmilden
des Genus Dermatophagoides und verwandte Arten enthalten, wobei solche Extrakte rohe Extrakte von
Hausstaub, Lösungen von Nahrungsmittelallergenen (z. B. Extrakte von Nüssen, Gemüse, Hühnereiern usw.),
Extrakte von Fugi (z. B. Alternaria, Penicillium, Aspergillus, Helminthosporin, Hefen, Basidiosporen, Ascosporen
usw.), Extrakte von Pflanzensamen und -fasern (z. B. Baumwolle, Rizinus usw.), Extrakte von ganzen Körpern
oder Gifte von siechenden und beißenden Insekten (z. B. Bienen, Wespen der Familie Vespidae, deren Körper
mit hellem HeIb gefärbt ist, Hornissen, Wespen und Moskitos), und Extrakte von Schuppen/Haut/Haar, einschließlich
von Haut- und Fellrückständen, von Tieren (z. B. Katzen, Hunde, Pferde, Meerschweinchen, Mäuse,
Kaninchen usw.) mitumfassen.
Hochgreinigte oder teilweise gereinigte Allergene können ebenfalls mit dem Aldehyd behandelt werden, z. B.
Gruppe I Graspollenallergen, Antigen E von Kreuzkrautpollen, teilweise gereinigte Hausstaubmilbenextrakte
und Phospholipase-A von Bienengift.
Die Reaktion zwischen den rohen oder hochgereinigten allergenischen Materialien und dem bzw. den Aldehyden)
kann in Anwesenheit eines Zusatzstoffes mit niedrigem Molekulargewicht durchgeführt werden. Geeignete
Zusatzstoffe enthalten normalerweise weniger als etwa 8 Kohlenstoffatome zusätzlich zu anderen, vorhandenen,
funktionellen Gruppen und Beispiele hierfür sind: aliphatische Diamine; Guanidine; aliphatische Säureamide;
aliphatische Carbonsäuren, die Aminogruppen enthalten, mit Einschluß aiiphatischer Aminosäuren (Monoaminomonocarbonsäuren,
Monoamino-dicarbonsäuren und Diamino-monocarbonsäuren), aiiphatischer Hydroxyaminosäuren
und aiiphatischer Diamino-dicarbonsäuren; und aliphatische Verbindungen, die Kombintionen
von Permutationen von einer oder mehreren Amino-, Guanidino- und Säureamidogruppen enthalten.
Zusätzlich kann eine beschränkte Zahl von Hydroxygruppen in irgendwelchen der obigen Typen von Verbindungen
vorhanden sein. Die Verbindungen umfassen 1,4-Diaminobutan, Lysin, Orithinin, 1,5-Diaminopimelinsäure,
Arginin, Adipamid, Asparaginsäure, Serin und Alanin. Der Zusatzstoff wird so gewählt, daß er sich
chemisch mit den Pollenkomponenten während des Verfahrens der Aldehydbehandlung verbindet.
Für jede Stufe des Verfahrens hängen die Konzentrationen von Allergen, Aldehyd und irgendwelchem, in dem
Reaktionsgemisch vorhandenen Zusatzstoff und der pH sowie die Inkubationszeit des Reaktionsgemisches, die
opitmale Bedingungen für die Aldehydbehandlung ergeben, voneinander in gewissem Grad ab. Die folgenden
Bedingungen sind bevorzugt. Jede Bedingung setzt voraus, daß die anderen Bedingungen innerhalb geeigneter
Grenzen gehalten werden, so daß das gewünschte, mit Aldehyd behandelte Allergen erhalten wird.
Die End konzentration an allergenischem Material, die für die Aldehydreaktion verwendet wird, sollte bevorzugt
sein: (1) so, daß alle Komponenten vollständig löslich sind und (2) daß sie mit der Konzentration an Aldehyd
und verwendetem Zusatzstoff verträglich ist Bei Formaldehydreaktionen sollten die Lösungen in wäßrigem
Puffer, bevorzugt bei etwa pH 7,4 bis 7,6, mit einer geeigneten Molarität hergestellt werden, so daß dieser
pH-Wert während des Verlaufs der Umsetzung bei etwa 7,2 bis 7, gehalten wird, damit das Ablaufen der
gewünschten Aldehydreaktionen optimal gehalten wird. Konzentrationen bis zu etwa 12 mg/ml an allergenischem
Material (bezogen auf das Trockengewicht der Feststoffe/ml) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer bei pH
7,5 + 00,1 erfüllen im allgemeinen die obigen Erfordernisse, die Auswahl der Allergenkonzentration hängt in
gewissem Ausmaß von der Temperatur bei der Inkubierung und der Aldehydkonzentration ab.
Bei den Dialdehydreaktionen sollte der pH-Wert der Reaktionslösungen bevorzugt 7,0 bis 8,0 und die Allergenkonzentration
1,0 bis 2,0 mg/ml betragen.
Die Konzentration an Aldehyd(en) in dem Reaktionsgemisch sollte nicht so groß sein, daß die gewünschten
Immunisierungseigenschaften des entstehenden, mit Aldehyd behandelten Allergens nachteilig beeinflußt werden,
sie sollte aber ausreichen, daß man eine ausgedehnte Zerstörung der Allergenizität des nativen Allergens
bei der besonderen Temperatur des Inkubationsgemisches erhält. Die entstehende Verringerung in der Allergenizität
liegt normalerweise im Bereich von dem 100- bis lOOOOfachen nach Beendigung des stufenweisen
Verfahrens. Zusätzlich zu den oben erwähnten Faktoren variieren bevorzugte Aldehydkonzentrationen entsprechend
der Reinheit des zu behandelnden Allergens, d. h. daß das untere Ende des oben angegebenen Bereichs
geeigneterweise verwendet wird bei hochgereinigten Materialien.
10 Allergenzubereitungen
Bei allergenischen Extrakten werden die fetthaltigen Materialien von den getrockneten Allergenquellen
(Pollen, Schuppen, Fungus usw.) durch Extraktion mit trockenem Petroläther oder mit trockenem, peroxidfreiem
Diäthyläther entfernt. Das entfettete, allergenische Material wird bei 0 bis 5° C während etwa 15 Minuten bis zu
4 Tagen mit einer geeigneten, gepufferten Lösung (z. B. 0,125 M NH4HCO3) bei einem pH-Wert von 6,0 bis 8,0
extrahiert. Die Länge der Zeit hängt von der Art des gewünschten Extrakts und der Natur der Allergenquelle ab.
Festes Material wird durch Filtration, Zentrifugieren oder nach einem ähnlichen Verfahren entfernt. Über 90%
der Materialien mit niedrigem Molekulargewicht (im wesentlichen nicht-allergenisch) werden aus dem Extrakt
durch Dialyse oder Ultrafiltration längs einer Membran oder einer Hohlfiltervorrichtung (Molekulargewichtabschnitt
3000 bis 5000 Dalton) oder durch Gelfiltration entfernt. Die Allergenlösung wird auf geeignete Stockkonzentration
hinsichtlich des Trockengewichts von festem, Allergen enthaltendem Material/ml (normalerweise das
1,5- bis 2,0fache von dem, das bei der folgenden Stufe 1 vorhanden ist) durch Ultrafiltration und Dialyse gegen
oder Lyophilisierung und Rekonstruktion in einem Puffer, wie 0,1 M Natriumphosphat, eingestellt auf pH
7,5 ±0,1, gebracht.
Gereinigte oder teilweise gereinigte Allergene werden ebenfalls in dem gleichen Puffer für die im folgenden
beschriebenen Reaktionen hergestellt.
Zusammenfassung der Reaktionsbedingungen
Formaldehyd, Stufe 1
Formaldehyd, Stufe 1
Allergenkonzentration 1,0 bis 12,0 mg/ml; Formaldehydkonzentration 0,5 bis 2,5 M; Temperatur 5 bis 15°C,
bevorzugt etwa 1O0C; pH 7,2 bis 7,6; Zeit 8 bis 32 Tage.
Formaldehyd, Stufe wM(worin π
> 1 und im allgemeinen η = 2)
Allergenkonzentration 1,0 bis 3,0 mg/ml; Formaldehydkonzentration 0,36 bis 0,5 M; Temperatur etwa 25 bis
40° C, bevorzugt etwa 30 bis 34° C; pH 7,2 bis 7,6; Zeit 16 bis 35 Tage.
40 Dialdehyd, Stufe 1
Allergenkonzentration 1,0 bis 2,0 mg/ml; Aldehydkonzentration 0,01 bis 0,1 M; bevorzugt etwa 0,025 M;
Temperatur 5 bis 150C, bevorzugt etwa 100C; pH etwa 7,0 bis 8,0; Zeit 4 bis 24 Stunden, bevorzugt 16 bis 20
Stunden.
45
45
Dialdehyd, Stufe »n« (worin η
> 1 und im allgemeinen π =2)
Allergenkonzentration 1,0 bis 2,0 mg/ml; Aldehydkonzentration 0,01 bis 0,1 M; bevorzugt etwa 0,025 M;
Temperatur 25 bis 4O0C, bevorzugt etwa 30° C; pH etwa 7,0 bis 8,0; Zeit 16 bis 32 Stunden, bevorzugt etwa 24
50 Stunden.
Gegen Ende der Inkubation(en) werden überschüssige Aldehyde nach einem der folgenden Verfahren entfernt:
Ausgedehnte Dialyse mit verschiedenen Wechseln im Dialysat unter Verwendung eines Cellulosegehäuses,
wie Visking Größe 18, ausgedehnte Membrandialyse/Ultrafiltration unter Verwendung einer Milliporen-,
Amicon- oder äquivalenten Membran oder einer Hohlfaservorrichtung mit einem Molekulargewichtsabschneiden
von etwa 5000 bis 30 000 Dalton oder durch Gelfiltration an einem geeigneten Xerogel, wie Sephadex G10
oder G25 bei etwa 4° C.
Erfindungsgemäß wird die Reaktion in zwei oder mehreren und bevorzugterweise in zwei Stufen durchgeführt,
wobei sich die erste von den nachfolgenden Stufen durch die verwendete unterschiedliche Temperatur
unterscheidet Die Reaktionssequenz kann durchgeführt werden mit: (a) Formaldehyd bei der ersten und den
nachfolgenden Stufen, (b) einem besonderen Dialdehyd in der ersten und den nachfolgenden Stufen, (c) Formaldehyd
in der ersten und einem besonderen Dialdehyd in den nachfolgenden Stufen, (d) einem besonderen
Dialdehyd in der ersten und Formaldehyd in den nachfolgenden Stufen, (e) einem Gemisch aus Formaldehyd und
einem oder mehreren Dialdehyden in einer Reihe von Stufen. Die bevorzugten Kombinationen sind im allgemeinen
die einfachen Fälle (a) oder (b), jedoch bieten die Fälle (c) und (d) den Vorteil einer Kombination unterschiedlicher
Arten chemischer Reaktionen unter Verwendung eines relativ einfachen Protokolls. Die Reaktionen
des Typs (e) bieten, obgleich sie manchmal komplexer durchzuführen sind, die Kombinationen von Reaktionsverfahren,
die zu den größten Verringerungen der allergenischen Eigenschaften führen.
Gemische aus Formaldehyd und einem Dialdehyd (normalerweise Glutaraldehyd) können in einer Reihe von
Gemische aus Formaldehyd und einem Dialdehyd (normalerweise Glutaraldehyd) können in einer Reihe von
Sliifcn (normalerweise zwei) verwendet werden. Diese Ausfiihrungsforni eliminiert die Entfernung des Aldehyds
nach der ersten Stufe, vor der Zugabe des zweiten Aldehyds. Da die Diuldehydreuktion im wesentlichen
innerhalb von etwa 20 Stunden beendigt ist, kann das Gemisch dann zu der zweiten Stufe geführt werden, so eine
weitere ausgedehnte Reaktion mit Formaldehyd stattfinden kann. Die Allergenkonzentration wird durchweg bei
etwa 1,0 bis 2,5 mg/ml, Formaldehyd bei 0,36 bis 0,5 M und Dialdehyd bei etwa 0,025 M und der pH bei 7,2 bis 7,6
gehalten. Die erste Stufe dauert 4 bis 24 Stunden (bevorzugt 16 bis 20 Stunden) bei 5 bis 15°C (bevorzugt etwa
1O0C) und die zweite Stufe dauert 16 bis 32 Tage bei 30 bis 34° C.
Bei der ersten Stufe wird die Reaktion bei einer Temperatur über dem Gefrierpunkt der Lösung (der
besonders bevorzugte Bereich beträgt etwa 5 bis 15° C) und bevorzugt bei etwa 10cC durchgeführt. Die
nachfolgende^) Stufe(n) wird/werden bei etwa 25 bis 400C und bevorzugt bei 30 bis 34° C durchgeführt. Es
wurde gefunden, daß eine Beibehaltung dieser Sequenz bei der Temperatur wesentlich die Wirksamkeit des
Endprodukts bei der Immunisierung allergischer Individuen erhöht.
Iv Bei dem bevorzugten zweistufigen Verfahren wird die erste Stufe bei der niedrigeren Temperatur im allge-
Iv Bei dem bevorzugten zweistufigen Verfahren wird die erste Stufe bei der niedrigeren Temperatur im allge-
!;; meinen während einer Zeit von etwa 8 bis 32 Tagen im Falle des Formaldehyd und etwa 20 Stunden im Falle von
i| Dialdehyd durchgeführt, obgleich im letzteren Falle kürzere Inkubationszeiten von 4 Stunden verwendet wer-
£ den können. Die Dauer der zweiten Stufe beträgt im allgemeinen etwa 14 bis 35 Tage für Formaldehyd und etwa
24 Stunden für Dialdehyde.
f| Die vorliegende Erfindung kann mit Formaldehyd, mit allen niederen, gesättigten, aliphatischen Dialdehyden,
e| insbesondere Glutaraldehyd, und Dialdehyden der allgemeinen Formel
. CHO
■ /
;1 (CH\
CHO
;':' worin π = 1 bis 6 ist, und ihren verzweigtkettigen Isomeren und Vorstufen und mit ihren Gemischen durchge-
führt werden.
f j Die mit Aldehyd behandelten Allergene, hergestellt wie oben beschrieben, sind geeignete immunotherapeuti-
· sehe Mittel für Säugetiere einschließlich allergischer Menschen. Ein Adjuvans, wie ein Alaun oder ein Alginat,
fc kann in die gewünschte Immunisierungszubereitung eingearbeitet werden, um die immunogene Wirksamkeit zu
£.{ verbessern. Die mit Aldehyd behandelten Allergene können beim diagnostischen Test vor und während der
if- Immunotherapie allergischer Menschen verwendet werden.
|vj Die erfindungsgemäßen, mit Aldehyd behandelten Allergene können Säugetieren in an sich bekannter Weise,
i.:: wie intradermal, subkutan oder intramuskulär, verabreicht werden. Zusätzlich erlaubt die niedrige Allergenizität
Γ;; dieser Materialien die Verabreichung in Form eines Aerosolsprays durch die Nase und/oder den Mund, um eine
;, I mmunisierung transmucosal zu erreichen.
■ Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
■ Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Die folgenden Pollen werden verwendet: (1) Kurzes Kreuzkraut (Ambrosia elatior) und (2) gemischtes Gas,
enthaltend 30% Obstkultur (Dactylis glomerata), 25% Blaues Kentuckygras (Poa pratensis), 25% Timotheus
(Phleum pratense), 10% Rotes Schwingelgrad (Festuca rubra) und 10% Wiesenschwingelgras (Festuca elatior).
jede der Pollen wird durch aufeinanderfolgende Extraktionen mit Diäthyläther oder Petroläther (ca. 8x1! «
Mengen) entfettet und bei 4°C entweder einmal mit dem lOfachen Volumen (ml) von 0,125 M NH4HCO3,
bezogen auf das Gewicht (g) der Pollen, während ca. 18 h (unter Rühren) oder in drei aufeinanderfolgende
Extraktionen mit einem Volumen einer NH4HCO3-Lösung, das etwa die 1Ofache Menge der Pollen ausmacht,
extrahiert Nach dem Zentrifugieren wird jeder überstehende Extrakt ausgedehnt bei 4° C in einem Visking
Größe 18-Cellulosegehäuse gegenüber 0,002 M NH4HCO3 (4 bis 5 χ 72 1) und schließlich gegenüber destilliertem
Wasser (1 χ 721) während einer Zeit von insgesamt etwa 4 Tagen dialysiert. Dieses Dialyseverfahren dient dazu,
im wesentlichen alle nicht-allergenischen Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen. Jeder
dialysierte Extrakt wird zentrifugiert, um Spurenmengen an Präzipitat zu entfernen, lyophilisiert und bei — 200C
in einem luftdichten Behälter bis zur Verwendung gelagert
Dialysierter Allergenextrakt (1) oder (2) bei 2 mg/ml wird mit 0,5 N Formaldehydlösung während 14 bis 18
Tagen bei 10°C± PC in 0,1 M Na2HPO4/NaH2PO4-Puffer bei pH 7,5±0,l (Puffer A) inkubiert, direkt in einen
Inkubator bei 32° ± PC überführt und während weiterer 14 bis 18 Tage inkubiert Überschüssiger Formaldehyd
wird durch Dialyse gegenüber Puffer A, physiologisch gepufferter Salzlösung oder destilliertem Wasser (wie im
folgenden erläutert) entfernt
Dialysierter Allergenextrakt (1) (2 mg/ml) wird mit 0,5 M Formaldehydlösung während 30 bis 35 Tagen bei
10°C± PC und pH 7,7±O,l in Puffer A inkubiert, direkt in einen Inkubator bei 32° ± PC überführt und weitere
30 bis 35 Tage inkubiert Überschüssiger Formaldehyd wird durch Dialyse gegenüber Puffer A, physiologischer
ι gepufferter Salzlösung oder destilliertem Wasser entfernt.
Dialysieiter Allergenextrakt (2) (2 mg/ml) wird mit 0,5 M Formaldehydlösung während etwa 8 Tagen bei
10°C± TC und pi* 7,5 in Puffer A inkubiert, direkt in einen Inkubator bei 32° ± 1°C überführt und während 32
Tagen inkubiert Überschüssiger Formaldehyd wird durch Dialyse gegenüber Puffer A, physiologischer gepufferter
Salzlösung oder destilliertem Wasse·· entfernt
Dialysierter Allergenextrakt (1) oder (2) (10 mg/ml) wird mit 2 M Formaldehydlösung während 14 bis 18
Tagen bei 10°C± I0C inkubiert Die Lösung wird auf das 4fache verdünnt (d. h. auf 2,5 mg/ml Kreuzkraut und
03 M Formaldehyd). Die Lösung wird erneut während etwa 14 bis 18 Tagen bei 32± 1°C inkubiert Überschüssiger
Formaldehyd wird durch Dialyse gegenüber Puffer A, physiologischer gepufferter Salzlösung oder destilliertem
Wasser entfernt
Dialysierter Allergenextrakt (1) oder (2) (8 mg/ml) wird mit 2 M Formaldehydlösung während 14 bis 18 Tagen
bei 10°C± 1°C inkubiert Die Lösung wird auf das 4fache verdünnt (d. h. auf 2,0 mg/ml Kreuzkraut und 0,5 M
Formaldehyd). Die Lösung wird erneut während etwa 14 bis 18 Tagen bei 32±1°C inkubiert Überschüssiger
Formaldehyd wird durch Dialyse gegenüber Puffer A, physiologischer gepufferter Salzlösung oder destilliertem
Wasser entfernt
Ein dialysierter Allergenextrakt (1) von Pollen von Kurzem Kreuzkraut (2 mg/ml) wird mit 2 M Formaldehydlösung
während etwa 14 bis 18 Tagen bei 10±1 "C bei pH 7,5±0,1 in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (Puffer A)
inkubiert. Die Lösung wird bei 4° C stark gegenüber verschiedenen Änderungen im Puffer A zur Entfernung von
Formaldehyd (1Z3 M) wird langsam zugegeben, um die Lösung auf 0,36 M, bezogen auf Formaldehyd, einzustellen.
Die Lösung wird erneut während 16 Tagen bei 32 + 1°C und pH 7,5±0,1 inkubiert Überschüssiger Formaldehyd
wird durch Dialyse gegenüber Puffer A oder physiologischer gepufferter Salzlösung entfernt.
Dialysierter Allergenextrakt (1) oder (2) (2 mg/ml) wird mit einem Gemisch aus 0,025 M Glutaraldehyd und
0,5 M Formaldehyd in Puffer A während etwa 18 h bei 10± 1°C inkubiert. Das Gemisch wird dann unmittelbar
bei 32± TC gehalten und während etwa 21 Tagen bei pH 7,5±0,2 inkubiert Überschüssiger Glutaraldehyd und
Formaldehyd werden gegen Ende des Versuchs durch Dialyse entfernt.
Dialysierter Allergenextrakt (1) oder (2) (2 mg/ml) wird mit 0,025 M Glutaraldehyd in Puffer A während etwa
18 h bei 10± TC inkubiert. Überschüssiger Glutaraldehyd wird durch Dialyse gegenüber Puffer A entfernt. Die
Formaldehydlösung wird zu der mit Glutardehyd behandelten Allergenlösung zugegeben, um sie auf 0,5 M,
bezogen auf Formaldehyd, zu bringen. Dieses Gemisch wird dann etwa 21 Tage bei 32± 1CC inkubiert. Überschüssiger
Formaldehyd wird durch Dialyse gegen Ende des Versuchs entfernt.
so Dialysierter Allergenextrakt (1) oder (2) (2 mg/ml) wird mit Glutaraldehyd (0,025 M) bei 10± 1°C während
etwa 20 h und bei 30± I0C während etwa 24 h bei pH 7,5±0,l in Puffer A inkubiert. Überschüssiger Glutaraldehyd
wird durch Dialyse gegenüber Puffer A oder physiologischer gepufferter Salzlösung gegen Ende des
Versuchs entfernt Andere Glutaraldehydkonzentrationen wurden untersucht (im Bereich von 0,005 bis 0,1 M),
es wurde jedoch gefunden, daß 0,025 M die besten Produkte hinsichtlich der niedrigen allergenischen Aktivität
und die Retention der gewünschten Immunisierungseigenschaft ergibt.
Beispiel 10
Pollen von getrocknetem Kurzen Kreuzkraut (Ambrosia elatior) werden durch Soxhlet-Extraktion unter
Verwendung von Petroläther entfettet Das Erhitzen am Rückfluß wird fortgesetzt, bis das Eluierungsmittel frei
von Farbe ist, die von den Pollen stammt. Die Pollen werden an der Luft getrocknet, gewogen und in dichtverschlossenen
Behältern bei —5 bis — 300C gelagert. 5 m! eines 0,125 M Ammoniumbicarbonatpuffers/g entfetteter
Pollen werden zu den Pollen zugegeben, und das Gemisch wird unter konstantem Rühren bzw. Bewegen bei
0 bis 5°C während 18 bis 26 h extrahiert. Nach dieser ersten Extraktion wird der Extrakt aus den Pollenkörnern
durch Filtration entfernt und der Pollenkuchen wird mit 4 ml Puffer/g Pollen (Ausgangsgewicht) erneut während
2 bis 4 h bei 0 bis 50C extrahiert und dann mit 1 ml Puffer/g Pollen gespült. Alle drei Extrakte werden vereinigt
und in einem Visking Größe 18 saumfreien Celluloseschlauch gegenüber einem 35fach größeren Volumen an
0,002 M Ammoniumbicarbonat während 30 bis 40 h dialysiert. Gegenüber destilliertem Wasser wird während 12
bis 14 h eine weitere Dialyse durchgeführt Der Extrakt wird durch eine Reihe von Filtern filtriert, endend mit
einer sterilen Filtration durch ein 0,45 m μ-Filter. Der sterile Extrakt wird lyophilisiert und gewogen. Die
Inkubation dieses dialysierten Extraktes (10 mg Pollenfeststoffe/ml) erfolgt unter Verwendung von 2 M Formaldehyd
in 0,1 M Natriumphosphatpuffer bei pH 7,2 bis 7,6 während 12 bis 18 Tagen bei 10±2°C. Die entstehende
Lösung wird auf das 4fache in dem 0,1 M Phosphatpuffer verdünnt und 18 bis 24 Tage bei pH 7,2 bis 7,6 und
32±2°C inkubiert. Die entstehende Lösung wird in einem Viskinggehäuse Größe 2,22 cm (1 —7/8 in.) Durchmesser
gegenüber dem 25fachen Volumen an 0,002 M NH4HCO3 dialysiert Die Lösung wird auf die Abwesenheit
von Formaldehyd geprüft, unter Verwendung eines Milliporen-Pellicon-Kassettensystems konzentriert, steril
filtriert und lyophilisiert
Bei jedem der vorherigen Beispiele wurde die Inkubation und Dialysen unter Verwendung eines 0,1 M
Natriumphosphatpuffers und bei einem pH-Wert von 7,5 ±0,1 durchgeführt Alle Lösungen werden ausgedehnt
bei etwa 4° C gegenüber verschiedenen Änderungen des großen Dialysatvolumens dialysiert, um nichtumgesetzten
Aldehyd am Ende jedes Versuchs zu entfernen. Die Lösungen werden entweder gefroren gelagert, oder in
verschiedenen Fällen werden die mit Aldehyd modifizierten Allergene aus wäßrigen Lösungen lyophilisiert, ein
Verfahren, das zu im wesentlichen aldehydfreien Feststoffen mit ausgezeichneten Langzeitlagerungseigenschaften
führt
Beispiel 11
Allergen
Pollen von Kurzem Kreuzkraut (Ambrosia elatior) werden von Greer Laboratories gekauft und bei -2O0C in
einem luftdichten Behälter bis zur Verwendung gelagert. Die Pollen (150 g) werden durch acht aufeinanderfolgende
Extraktionen mit 11-Teilen wasserfreiem, peroxidfreiem Diäthyläther (J. T. Baker Co.) entfettet, wodurch
die Entfernung des gesamten, gefärbten, fettartigen Materials möglich wird. Die Pollen werden getrocknet und
Ätherspuren werden im Vakuum über Nacht verdampft Die entfetteten Pollen werden dann bei 4°C unter
leichtem Rühren während 18 h mit 1,51 0,125 M NH4HCO3 extrahiert und die Pollen werden von der überstehenden
Flüssigkeit durch Zentrifugieren abgetrennt Der überstehende Extrakt (1185 ml) wird in einer Visking
Größe 18 Celluloseumhüllung (Union Carbide Corp.) ausreichend gegenüber 0,002 M NH4HCO3 (5 χ 721) und
schließlich gegenüber destilliertem Wasser (2 χ 721) während einer Gesamtzeit von 4 Tagen bei 40C dialysiert.
Der dialysierte Extrakt wird zur Entfernung einer kleinen Menge des Präzipitats zentrifugiert und lyophilisiert
(Ausbeute= 14,104 g). Dieses Material, das als »Kreuzkraut-Pollen Allergen, Charge 11 RWC« bezeichnet wird,
wird bei - 20° C in einem luftdichten Behälter bis zur Verwendung gelagert.
Allergoid (Allergoid)
Ein Teil des lyophilisierten Allergens wird der Formaldehydmodifizierung nach dem »Zwei-Stufen-Verfahren«
unterworfen. Kreuzkraut-Pollen Allergen (13,603 g) wird in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5, (453,4 ml) [hergestellt
durch Vermischen geeigneter Volumen an 0,1 M NaHjPO4 und 0,1 M Na2HPO4 (beide Baker Reagensqualität),
um einen End-pH-Wert von 7,50 zu erhalten] gelöst. Man erhält eine Lösung, die 30 mg Pollenfeststoffe/m!
enthält. Diese Lösung wird (in einem Größe 18 Visking-Schlauch) gegenüber Phosphatpuffer (11,21) während
24 h bei 40C dialysiert Nach der Dialyse wird das Endvolumen der Allergenlösung auf 907 ml (15 mg Pollenfeststoffe/ml)
mit 0,1 M Phosphatpuffer bei Ph 7,50 eingestellt.
Das folgende Reaktionsgemisch wird bei 4° C hergestellt. 10 M Formaldehydlösung (270 ml) [hergestellt durch
Verdünnen von p. a. Formaldehyd (Fisher Scientific Co., 37% Gew./Gew.) mit entionisiertem Wasser] wird sehr as
langsam und sorgfältig unter konstantem Rühren zu 900 ml der Allergenlösung gegeben, wobei eine lokalisierte,
hohe Konzentration an Formaldehyd vermieden wird. Der pH-Wert der Lösung wird während der ganzen
Zugabe verfolgt, und insgesamt 6,5 ml 2 M NaOH (Baker Co.) werden während des Mischens zugegeben, um den
pH-Wert bei 7,50+0,1 zu halten. Das Endvolumen des Reaktionsgemisches wird auf 1350 ml unter Verwendung
von 170 ml 0,2 M Phosphatpuffer bei pH 7,50, von 1,1 ml 2 M NaOH und 2,5 ml 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 7,50
eingestellt. Man erhält eine Lösung der folgenden Zusammensetzung: 10 mg/ml Pollenfeststoffe; 2,0 M Formaldehyd;
ungefähr 0,1 M Phosphat, bei einem pH von 7,50, bestimmt bei 100C.
Die obige Lösung wird 16 Tage bei 10±0,5°C inkubiert, wobei zu diesem Zeitpunkt der pH auf 7,41 gefallen
isi. Nach dieser ersten Inkubation wird die Lösung auf das 4fache mit 0,1 M Phosphat bei pH 7,50 verdünnt und
bei 32±0,5°C weitere 16 Tage inkubiert. Der Ausgangs-pH für diese zweite Inkubation beträgt 7,49 (bestimmt
bei 320C) und der End-pH beträgt 7,47 (bei 32°C). Die entstehende Allergoidlösung wird nacheinander gegenüber
4x72 I entionisiertem Wasser bei 4° C zur Entfernung von Formaldehyd und Puffersalzen dialysiert. Ein
Spurenniederschlag wird durch Zentrifugieren entfernt und die entstehende Lösung wird lyophilisiert. Dies dient
nicht nur dazu, ein stabiles, trockenes Material herzustellen, sondern ebenfalls dazu, um mögliche geringe
Restspuren an Formaldehyd zu entfernen. Die Ausbeute an »Kreuzkraut-Pollen Allergoid, 11RWF« beträgt
13,135 g (97,3"/b der theoretischen Ausbeute). Das Aiiergoid wird bei 20"C in einem luftdichten Behälter bis zur
Verwendung gelagert.
Herstellung von Lösungen für die Immunotherapie
Lösungen werden hergestellt, ausgedrückt als »Allergeneinheiten/ml« oder »Allergoideinheiten/ml«, wobei
die Allergoideinheit um das 50fache größer ist als die Allergeneinheit in Maßstäben von Pollenfeststoffen und
»Antigen E-Äquivalenten/ml (AgE Äquiv./ml)« [im Falle von Allergen bedeutet dies den Gehalt an Antigen E; im
Falle von Allergoid bedeutet dies den Gehalt an Antigen E in dem Allergen, aus dem es sich ableitet (Antigen £
ist in dem Allergoid nicht direkt meßbar)]. Bezogen auf einen vorherigen Versuch wird die Vorrats- bzw.
Stocklösung von Allergen URWC (1000 Einheiten/ml) so hergestellt, daß sie 10 μg AgE Äquiv7n?l (0,28 mg
nicht-dialysierbare Pollenfeststoffe/ml) enthält Auf ähnliche Weise wird die Stocklösung des Allergoids 11 RWF
(1000 Einheiten/ml) bei 500 μg AgE Äquiv^ml (14,1 mg Allergoidfeststoffe/ml) hergestellt Die Stocklösungen
von Allergen und Allergoid werden steril durch eine Nalgene Filtereinheit die mit einer Membran mit einer
Porengröße von 0,45 μπι ausgerüstet ist (Nalge Sybron Corp, Rochester, N. Y.), filtriert Jede Lösung wird
anschließend in sterilen Ampullen in Mengen von ungefähr 10 ml verteilt Es werden so insgesamt 30 Ampullen
aus Allergen und 23 Ampullen aus Allergoid hergestellt Beide Sätze von Ampullen werden in der Reihenfolge
numeriert, in der sie abgefüllt werdea Die Ampullen werden ungefähr 3 Wochen vor Beginn der Therapie
hergestellt und bei 4° C während der Untersuchung gehalten.
Die Sterilitäten der Allergen- und Allergoidlösungen werden durch Inkubation von 0,5 ml aliquoten Teilen, die
aus ausgewählten Ampullen entnommen werden, mit Thioglycollat Medium entsprechend den FDA Rules and
Regulations, »Paragraph 610.12, Sterility«, geprüft Die Inkubationen werden bei Temperaturen von 25 und 32°C
während 2 Wochen durchgeführt Im Falle der Allergenlösung werden die aliquoten Teile der Ampullen Nr. 1,11,
20 und 30 entnommen. Im Falle der Allergoidlösung werden die aliquoten Teile den Ampullen Nr. 1,11 und 23
entnommen. Alle Sterilitätstestlösungen werden visuell auf das Auftreten von Wachstum am 4, 7. und 14. Tag der
Inkubationszeit geprüft Bei der visuellen Prüfung konnte kein Auftreten einsr Bakterienverunreinigung festgestellt
werden. Am Ende des 14. Tages nach der Inkubation wird jede der Testkulturen auf Platten von Trypticasesojaagar
mit 5% Schafblut (Baltimore Biologial Labs. Cockeysville, MD.) gegeben und 24 h bei 370C inkubiert.
Es wird festgestellt, daß alle für irgendeine Art von Wachstum negativ sind. Alle aliquoten Teile von Allergen
und Allergoid mit Ausnahme derjenigen, die auf die Sterilität geprüft wurden, werden bis zur Verwendung bei
4° C gelagert
Die allgemeinen Toxizitätstests werden sowohl mit der Allergenlösung als auch mit der Allergoidlösung unter
Verwendung des in »Paragraph 610.11, Safety« der FDA Rules and Regulations beschriebenen Analyseverfahrens
durchgeführt. Diese. Versuche werden bei Mäusen und Meerschweinchen unter der Leitung von Irving
Levenstein, Ph. D. Leberco Laboratories, 123 Hawthorne Street, Roselle Park, N. J, durchgeführt. Jede Maus
erhält 0,5 ml und jedes Meerschweinchen 5 ml entweder der Allergen- oder der Allergoid-Stocklösung intraperitoneal
verabreicht. Die Ergebnisse dieser Versuche zeigen kein Auftreten von Toxizität entweder bei dem
Allergen oder bei dem Allergoid, was aus keinem ungewöhnlichen Gewichtsverlust 7 Tagen nach den Injektionen
der Materialien hervorgeht.
Immunochemische Analysen
Die Analysen der Gehalte an Kreuzkraut-Allergenen, Antigen E, Ra3 und Ra5 in Kreuzkraut-Pollen Allergen,
Charge 1IRWC, werden durch Radialimmunodiffusion (H. Baer, C. J. Maloney, P. S. Norman und D. G. Marsh,
1974, J. Allergy Gin. Immunol. 54,157 — 164) unter Verwendung geeigneter spezifischer Antisera und Vergleichsantigene
durchgeführt Die Antigen E-Vergleichsprobe ist NIH-Material, das weiter durch Sephadex G75-Chromatographie
gereinigt wurde, und Ra3-Vergleichsmaterialien stammen von Dr. Lawrence Goodfriend, McGiII
University, Montreal. Eine zusätzliche Antigen E-Vergleichsprobe wird von Dr. T. P. King, Rockefeller University,
New York, erhalten. Die Antisera werden im Labor der Anmelderin durch Immunisierung von Kaninchen
oder Ziegen hergestellt, und zwar mit den entsprechenden Antigene.
Eine gekreuzte Immunoelektrophorese des Allergens wird ebenfalls gegenüber Kaninchen-Anti-Aliergen-Serum
unter Verwendung eines Verfahrens durchgeführt, das analog zu dem von Weeke und Lowenstein (1973) in
A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis (Herausgeber N. H. Axelsen, J. Kroll und B. Weeke), Universitetsforlaget,
Oslo, Seiten 149 bis 153, beschrieben ist.
Standard-»Proteinstickstoffeinheit (PNU)«-Bestimmungen des Allergens und Allergoids erfolgten entsprechend
den von der FDA anerkannten Routineverfahren von Mr. Bill White, Jr. and associates of Greer Laboratories,
Lenoir, N. C.
Patienten
14 Kreuzkraut-allergische kaukasische, bezahlte Versuchspersonen (7 männliche, 7 weibliche, Durchschnittsalter
33; Altersbereich 25 bis 44) werden für die Untersuchung entsprechend den folgenden Kriterien ausgcwählt.
Alle Patienten berichten, daß sie starkes Heufieber während der Kreuzkrautsaison haben, wobei sich das
Grasheufieber bei drei Personen mäßig und bei weiteren drei Personen schwach zeigt. Patienten, die über
Asthma berichten, werden speziell von der Untersuchung ausgeschlossen. Patienten mit starken Symptomen
während des Monats Juli werden ebenfalls ausgeschlossen. Da frühere Versuche gezeigt haben, daß die Immunotherapie
mit Kreuzkrautextrakten das anschließende immunologische Ansprechen beeinflußt, wurden automatisch
Patienten, die irgendeine frühere Behandlung mit Kreuzkrautextrakten erfahren haben, ausgeschlossen.
Weiterhin wurden die Patienten hinsichtlich ihrer Arbeitsstelle und der Oetühlstabilität beurteilt, so daß man
gute Kandidaten für die Untersuchung erhielt.
Die Patienten werden in sieben Paare entsprechend ihrer Vorbehandlung der der Leukocyten Histamin-Freigabe
und Hauttestempfindlichkeit gegenüber Allergen und Allergoid und den Gesamtserum IgE-Gehalten
eingeteilt.
Il Behandlungsschema
|ί Die Patienten wurden in der Zeit vom spaten Mal· bis Mitte August 1977 behandelt Am ersten Behandlungs-
Ii tag (Tag O) erhielten sie Folgen von 1 bis 5 Injektionen in steigenden Mengen an Allergen oder Allergoid im
|; Verlauf von 30 min bis 2 h, bis lokale Quaddel- und Erythem-Reaktionen oder systemische Symptome anzeigen.
p daß die Dosis nahe oder an dem tolerierten Wert liegt Der behandelnde Arzt führt eine vollständige Aufzeich-
1$. nung der Injektionen und der unmittelbaren lokalen und systemischen Reaktionen für jeden Patienten durch.
|| Verzögerte lokale Reaktionen an den Injektionsstellen und systemischen Symptome (sofern vorhanden)
|| werden von dem Patienten aufgezeichnet Eine medizinische Betreuung ist für alle Patienten während der 24
§i Stunden-Zeit auf die Injektionsreihenfolgen verfügbar, und die Information auf jedem Formular wurde durch
'ß · telefonische Rücksprache mit jedem Patienten bestätigt Alle lokalen Reaktionen werden entsprechend ihrer
H maximalen Intensität die normalerweise etwa 24 h nach der Injektion folgend eintritt bewertet (Informationen,
S die die Bewertung der lokalen und systemischen Reaktionen betreffen, finden sich bei der Fußnote von Tabelle
1 V.)
|i Nach der ersten Reihenfolge werden Serum IgG-Antikörper zu Antigen E in Intervallen von ungefähr 4 bis 14
ii Tagen bestimmt und die zweite und die nachfolgenden Folgen werden als Antikörperansprechen verabreicht,
if; die man durch darauffolgende Plateaugehalte bei den Patienten erzeugt Die Reaktionen auf die Injektionen
% werden in jedem Fall, wie oben beschrieben, aufgezeichnet 6 mit Allergen und 6 mit Allergoid behandelte
$ Patienten gehören zu dem Untersuchungsschema, wobei jeder Patient 4 oder 5 Injektionsfolgen zwischen Ende
S Mai und Mitte August 1977 erhält (Tabellen I und II).
v';1 Tabelle I
Dosis und Anzahl der Injektionen pro Folge für die mit Allergen behandelten Patienten
Folgen
Folgen
Summe
insgesamt
1.
2.
3.
4.
5.
7.
2.
3.
4.
5.
7.
E.E.
LL
M.K..
CJ.
B.D.
LD.
Mittelwert
ausgeschieden
6 S.B.
6 S.B.
6(4)«)
31(4)
31(4)
31(4)
31(4)
6(3)
4(5)
36(4)
36(4)
19(4,0)
31(4)
15(2) 170(3)
70(2)*·)
15(2)
17(3) 164(3)
75(2,5)
10(1) 50(1) 50(2) 10(1) 70(2) 200(1)
350(3) 50(1)··) 60(2)··)
150(2)··)
700(2)
50(1)
1200(3)
30(1)
20(1)
100(2)
500(1)
65(1,3) 228(2,0)
170(3)*·) 25(1)
141(10)
1801(14)
231(10)
111(9)
341(14)
1601(11)
317(1,5) 704(11,3)»··)
226(8)
*) 2 Injektionen/Tag werden an zwei aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht.
··) Systemische Reaktion.
***) Die mittlere kumulative Dosis für alle Patienten, ausschließlich S.B, entspricht 7,04 μg AgE Äquivalenten.
Dosis und Anzahl der Injektionen pro Folge für die mit Allergoid behandelten Patienten
Folgen
Paar | Patient | 1. | 2. | 3. | 4. | 170(3) | 100(1) | 200(2) | 5. | Summe |
Nr. | Allergoideinheiten(Zahl der Injektionen in Klammern) | 2(1) | 5(2) | 16(3) | insgesamt | |||||
1. | E.F. | 31(4) | 70(2) | 125(2) | 310(2) | 200(2) | 701(12) | |||
2. | D.H. | 16(4)·) | 170(3) | 70(2) | 300(2) | _··) | 40(10) | |||
3. | CD. | 32(4) | 70(2) | 150(2) | 300(2) | 1200(3) | 1737(13) | |||
4, | j.B. | 31(4) | 170(3) | 300(3) | 1200(3) | 1200(3) | 1771(14) | |||
5. | J.K. | 37(4) | 109(2,3) | 125(1,8) | 388(2,3) | 300(2) | 857(12) | |||
7. | M.B. | 32(3) | -**) | 1702(11) | ||||||
Mittelwert | 30(3,8) | 725(2,5) | 1135(12)·*) |
PJ.
26(4)
5(1)
6(2)
42(8)
*) Systemische Reaktion.
**) Eine 5. Injektionsfolge wurde nicht verabreicht.
***) Die mittlere kumulative Dosis für alle Patienten, ausschließlich P.J., entspricht 567,35 μg AgE Äquivalenten.
11
Analysen der relativen Allergenizität, Allergoid/Allergen :
Die relativen Allergenizitäten von Allergoid zu Allergen in den Versuchpersonen werden sowohl durch den )
Leukocyt Histamin-Freigabeversuch (D. G. Marsh, L M. Lichtenstein und D. H. Campbell, 1970, Immunology,
18,705—722) als auch durch die quantitative intradermale Endpunkthauttitration [P. S. Norman, 1976, in Manual ι
of Clinical Immunology (Ed. N.R. Rose und H. Friedman), American Soc. for Microbiol., Washington, D. C, Seite
585] bestimmt Das Leukocyten-Empfindlichkeitsverhältnis jedes Patienten wird als Verhältnis von Allergoid/ \.;
Allergen-Konzentration, die eine 50%ige Histaminfreigabe von den Leukocyten des Patienten ergeben, be- ii
stimmt Das Hauttest-Empfindlichkeitsverhältnis ist das Verhältnis von Allergoid/Allergen-Konzentration, die j
ίο zweiplus(8 bis IO mm Quaddeldurchmesser mit Erythem) Hauttestendpunkte ergeben. ;,'
Gesamtserum igE-Analysen $|,
Die Messung des Gesamtserums IgE in einer Vor- und drei Nachbehandlungssera von allen Patienten wird ||
nach dem »direkten RIST«-Verfahren, das von Schellenberg und Adkinson (R. R. Schellenbereg und N. F. Ie
Adkinson, 1975, J. Immunol. 115,1577—1583) entwickelt wurde, bestimmt Das Verfahren ist dem »PRIST«-Ver- ff
fahren von Wide [L Wide, 1971, in Radioimmunoassay Methods (Ed. K. E. Kirkham und W. M. Hunter, |s
Livingstome, Edinburgh, S. 173] ähnlich, mit der Ausnahme, daß bei der ersten Stufe der Analyse spezifische |
Anti-IgE-Antikörper (erzeugt in Ziegen), gekuppelt an Sepharose 4B anstelle von Papierscheiben, verwendet j
werden. Nach der Inkubation des Serums des Patienten mit Sepharose Immunoadsorbensperlen werden die ?
Perlen gewaschen und anschließend mit radiomarkiertem Kaninchen Anti-IgE (e-kettenspezifischer, gereiniger A
Antikörper) inkubiert Die Perlen werden erneut gewaschen und in einem ^-Zähler gezählt. Die Zählungen :!\
werden den mit solchen verglichen, die man mit Reihentitration unter Verwendung eines Kontrollserums mit ,·
bekannten IgE Gehalt erhält Die obigen Versuche werden alle dupliziert mit geeigneten positiven und negati- ,,
ven Kontrollen und drei inneren Standardsera mit bekanntem IgE-Gehalt. Weiterhin wird jede Analyse minde- :■;;
stens einmal wiederholt, und irgendwelche nicht zusammenpassende Werte (die sich voneinander um mehr als :$
± 10% unterscheiden) werden wiederholt, bis Werte mit ± 10% erhalten werden. ί
Analyse des Serum IgG-Antikörpers gegen Antigen E ;'.·'
lmmunoglobulin G-Antikörper zu Antigen E wird unter Verwendung eines hochempfindlichen Doppel-Anti- ?f
körper-Radioimmunoassay-Verfahrens bestimmt, das ähnlich dem von Black et al beschrieben ist (P. L. Black, D.
G. Marsh, E Jarrett, G. J. Delespesse und W. B. Bias, Immunogenetics 3,349-368). Gereinigtes Antigen E wird mit
125 J nach dem Chloramin T-Verfahren markiert zur Entfernung von Mikroaggregaten ultrazentrifugiert und
bei -7O0C in kleinen, aliquoten Teilen bis zur Verwendung gelagert. Geeignete 2fache Reihenverdünnungen =
mit Standardserum (von einem allergischen Subjekt, das ausgedehnt mit Kreuzkrautextrakt behandelt wurde),
die Sera von den Versuchpatienten und geeignete Kontrollen werden mit einer konstanten Menge an markiertem
Antigen E (etwa 1,2 ng bei einer Konzentration von 6,2 ng/ml) während 5 h bei 23° C inkubiert. Zur
Erhöhung der Empfindlichkeit der Analyse für die niedrige Konzentration an Antikörper wird die nichtspezifisehe
Bindung der Radioaktivität (hauptsächlich an die Kunststoffanalysenröhrchen) reduziert indem man die
Analysenröhrchen zuvor mit Rinderserumalbumin, 0,3% (Gew.-A'ol), vorbeschichtete und das markierte Antigen
in 5% (GewyVol.) Albumin verdünnte. Alle Serumproben werden 1 :50 in boratgepufferter Salzlösung
(BBS), pH 8,0, verdünnt und geeignete weitere Verdünnungen erfolgen mit BBS, enthaltend 1 :50 normales
Menschenserum, das von Antikörper zu Antigen E frei ist. Negative Kontrollröhrchen enthalten eine 1 :50
Verdünnung dieses normalen Serums. Folgend auf die Anfangsinkubation wird Serum IgG (und gebundene
Antigen-Antikörper-Komplexe) durch Zugabe eines geringen Überschusses von Ziegen Anti-IgG (Anti-Fc-Fragment)
und Inkubation über Nacht bei 4° C ausgefällt Die entstehenden Niederschläge werden gewaschen
und gezählt und die Testsera werden mit der Standardkontrollkurve verglichen. Alle Ergebnisse sind als
willkürliche »Einheiten von IgG Antikörper/ml Serum«, bezogen auf die Kontrollserumkurve, angegeben. In
früheren Untersuchungen (T. A. E Platts-Mills, R. K. von Maur, K. Ishizaka, P. S. Norman und L M. Lichtenstein,
J. Clin. Invest 57,1041 — 1050) wurde gezeigt daß das unverdünnte Kontrollserum etwa 24 μg Antigen E/ml im ϊ
Antigenüberschuß bindet Auf diese Basis wurde berechnet daß angenommen werden kann, daß eine der ;i.
willkürlichen Einheiten 13 ng Antigen E in Antigenüberschuß binden würde. Unter dieser Annahme würde ■,
unter solchen Bedingungen das gebundene Antigen als AgjAb-Komplexe vorliegen, 1 Einheit=2,8 ng Antikörper.
Bei den beschränkten Antigen-Konzentrationen der vorliegenden Analyse wird weniger Antigen gebunden ί
und die wirksame Antikörperkonzentration kann um das etwa 3fache geringer sein. (T.A.E Platts-Mills, M. j. ;
Snajdr, K. Ishizaka und A. W. Frankland, 1978, J. Immunol. 120,1201-1210.)
14 bis 16 Serumproben von jedem Patienten vervollständigen die Untersuchung und mehere Proben von /
jedem der zwei ausgeschiedenen Personen werden anlysiert Damit Änderungen in den IgG-Antikörper-Titern ·
schnell bestimmt werden können, wodurch ein geeigneter Zeitplan für die Injektionssequenz möglich wird,
wurde das Antikörperansprechen innerhalb von etwa 3 Tagen nach der Abnahme der Blutproben gemessen.
Alle Analysen werden bei jedem Versuch doppelt durchgeführt und bei dem nachfolgenden Versuch wiederholt
Die Analysen werden je nach Bedarf wiederholt bis Werte innerhalb ± 10% erhalten werden.
Blutchemie und Urinanalyse
Messungen der Blutchemie und die Urinanalysen werden vor der Immunotherapie und etwa 1 und etwa 14
Wochen nach Beendigung der Therapie durchgeführt. Die Standard SMA-11 Blutchemie wird durch The Good
Samaritan Hospital Clinical Laboratory unter Verwendung automatisierter analytischer Verfahren bestimmt. 5 H
Die Standardurinanalysen erfolgen im Allergie-Labor der Anmelderin.
Symptombewertung
Heufieberschnupfensymptome während der Kreuzkraut-Pollensaison werden durch jeden Patienten zweimal 10
am Tag auf einem Standardaufzeichnungsblatt bewertet. Es wurde gefunden, daß die durchschnittlichen täglichen
Symptombewertungen (P. S. Norman und W. L Winkenwerder, 1965, J. Allergy, 36,284—292) für Gruppen
von Heuschnupfenpatienten mit den täglichen Pollenzählungen korrelieren. Zusätzlich zu diesen Selbstbewertungen
wird jeder Patient von dem behandelnden Arzt zweimal während der Kreuzkrautsaison interviewt.
Ergebnisse
In Tabelle III sind die immunochemischen Analysen für Allergen und Allergoid aufgeführt.
In Tabelle III sind die immunochemischen Analysen für Allergen und Allergoid aufgeführt.
Tabelle III 20
Immunochemische Analyse der Antigene
Kreuzkrautpollen Allergen 11RWC:
35,5 μg AgE/mg lyophilisierte Feststoffe
6,5 μg Ra3/mg lyophilisierte Feststoffe 25
6,0 μg Ra5/mg lyophilisierte Feststoffe
6390 PN U/mg
6390 PN U/mg
Kreuzkrautpollen Allergoid, 11RWF:
35,5 μg AgE Äquirng lyophilisierte Feststoffe 30
6100 PNU/mg lyophilisierte Feststoffe
1 Allergeneinheit 0,01 μg AgE Äquiv. 1,8PNU 1 50facher Unterschied,
1 Allergeneinheit 0,5 μg AgE Äquiv. 86 PNU J ausgedrückt durch d. Gewicht
Analysen ähnlicher, anderer Zubereitungen von lyophilisiertem, dialysiertem Kreuzkraut Allergen zeigen die
folgenden, mittleren antigenischen Zusammensetzungen:
AgE (5 Zubereit)=24,3 μg/mg (Bereich: 11,3-41,1 μg/mg);
Ra3 (4 Zuber.) = 7,1 μg/mg (Bereich: 5,0—9,4 μg/mg);
Ra5 (4 Zuber.)=4,1 μg/mg (Bereich: 2,3—6,1 μg/mg}. 40
Die Gehalte an Antigen E, Ra3 und Ra5 in dem Allergen sind im allgemeinen höher als die durchschnittlichen
Werte, die man bei der Analyse verschiedener, unterschiedlicher Ansätze lyophilisierte, Allergen (vergl. Fußnote
zu Tabelle III) erhält Die PNU-Werte für Allergen und Allergoid sind ähnlich, wie erwartet. (Es soll bemerkt _
werden, daß nichtdiaiysierte Kreuzkrautextrakte, die die gleichen Mengen an nichtdiaylierbaren Pollenfeststof- 45 —
fen enthalten, etwa das Doppelte dieser Werte ergeben, bedingt durch die Tatsache, daß durch diese Verfahren
etwas Stickstoff in dem dialysierbaren Peptidmaterial bestimmt wird.) Kreuzkraut Antigen E, Ra3 und Ra5 ins in
dem Allergoid nichtmeßbar. Damit werden die Konzentrationen als »AgE Äquiv7ml« usw, bezogen auf die
entsprechenden Antigengehalte des nativen Kreuzkraut-Allergens, angegeben.
Tabelle IV zeigt die Histaminfreigabe, den Hauttest und die gesamten IgE-Werte für 7 Paare von Patienten zu 50
Beginn der Untersuchung.
Vorbehandlungsempfindlichkeiten gegenüber Allergen und Allergoid und gesamte IgE-Werte
mit Allergen behandelt
Paar | Empfindlichkeit | Empfindlichkeit | gegenüber | Verhältnis | Gesamt IgE |
Nr. | Allergen*) | Allergen") | Allergoid·) | Goid/Gen | Einheit/ml |
1 HR | 6,0x10-" | nicht bestimmt | 4,0x10-2 | 67 | 218 |
ST | 10-5 | 10-5 | 3x10-3 | 300 | |
2 HR | 6,8x10-5 | 4,0x10-5 | 6,0x10-3 | 88 | 88 |
ST | 10-" | 10-« | 10-2 | 100 | |
3 HR | sehr niedrige Freigabe | 24%·*) | sehr niedrige Freigabe | _ | 174 |
ST | ΙΟ"5 | 10-" | ΙΟ"2 | 1000 | |
4 HR | 5,4xlO-5 | 1,OxIO-3 | 2,2x10-' | 278 | 119 |
ST | 10-5 | 3x10-5 | 10-2 | 1000 | |
5 HR | 2,3x10-" | 1,1x10-" | 2,2x10-· | 957 | 107 |
ST | ΙΟ"5 | 10-5 | ΙΟ-2 | 1000 | |
6 HR | UxIO-" | 1,0x10-" | 3,6x10-2 | 300 | 28 |
ST | 3x10-5 | 10-" | ΙΟ-3 | 30 | |
7 HR | keine Freigabe | 370/0··) | keine Freigabe | — | 679 |
ST | 10-3 | 10-5 | -3x10° | -3000 | |
Geom. HR···) | 1,4x10-" | 1,4x10-" | 5,3x10-2 | 216 | 135 |
Mitte ST | 3x10-5 | 2x10-5 | 7x10-3 | 432 | |
Tabelle IV (Fortsetzung) | |||||
Mit Allergoid behandelt | |||||
Paar | gegenüber | Verhältnis | Gesamt IgE | ||
Nr. | Allergoid*) | Goid/Gen | Einheit/ml | ||
1 HR | nicht bestimmt | nicht bestimmt | 196 | ||
ST | 3x10-3 | 300 | |||
2 HR | 9,OxIO-" | 23 | 710 | ||
ST | 3x10-" | 300 | |||
3 HR | 23%··) | -100 | 113 | ||
ST | 10-' | 1000 | |||
4 HR | l,8xlO-i | 180 | 85 | ||
ST | ίο-2 | 300 | |||
5 HR | 1,5x10-2 | 136 | 120 | ||
ST | 10-3 | 100 | |||
6 HR | 7,0x10-2 | 700 | 45 | ||
ST | 10-' | 1000 | |||
7 HR | keine Freieabe | 15 | |||
ST | 10-2 | 1000 | |||
Geom. HR**') | 2,OxIO-2 | 132 | 102 | ||
Mitte ST | 7x10-3 | 432 |
*) Konz. (jig/ml), die eine 50%ige Histaminfreigabe (HR) oder einen zwei-plus Hauttest (ST) bewirken.
**) Niedrige Freigabe; max.-% der zitierten Freigabe. Die Verhältnisse werden, soweit möglich, geschätzt
***) Mit Ausschluß von Patienten mit ummeßbaren Werten.
Alle Patienten mit Ausnahme des Paars Nr. 6 hielten das Versuchsschema ein, und die nachfolgenden
Vergleiche betreffen vor allem die 12 Individuen, die den Versuch beendeten. Es wurde gefunden, daß es extrem
schwierig ist ist, die Patienten vollständig in allen Kriterien in Übereinstimmung zu bringen, aber die geometrischen
mittleren Histamin-Freigabe und Hauttestempfindlichkeiten für Allergen und Allergoid und die gesamten
Serum IgE-Gehalte passen recht gut zusammen.
In den Tabellen I und II sind die Injektionsdosen hinsichtlich der Allergen- und AHergoid-Einheiten für die mit
Allergen und Allergoid behandelten Gruppen angegeben. Alle 6 mit Allergen behandelten Patienten, die dem
Untersuchungsschema zustimmmten, empfingen 5 Injektionsfolgen mit einer bis fünf Behandlungen für jede
Folge. Bei der mit Allergoid behandelten Gruppe haben zwei Patienten nur vier Folgen und der Rest fünf Folgen
erhalten. Die mittlere kumulative Dosis für die mit Allergoid behandelten Patienten beträgt 567 μg AgE Äquiv.
(1135,7 Einheiten), was um das 80,6fache größer ist als die mittlere kumulative Dosis von 7,0 μg AgE Äquiv. (704
Einheiten) für die mit Allergen behandelte Gruppe. Im allgemeinen sollte die Dosis bei jeder neuen Folge
wesentlich erhöht werden, wobei das Haupthindernis das Auftreten von fünf systemischen Reaktionen bei der
mit Allergen behandelten Gruppe ist (einschließlich des einen Patienten, der ausgeschieden war) und einer in der
mit Allergoid behandelten Gruppe. Diese werden durch Sternchen in den Tabellen I und II angegeben und
entsprechend der Häufigkeit und Stärke in Tabelle V bewertet.
lokal (24 h) | Goid | systemisch | Goid |
Gen | 17 | Gen | 0 |
9 | 19 | 0 | 2 |
20 | 15 | 0 | 0 |
16 | 4 | 2 | 0 |
17 | 14 | 2 | 0 |
3 | 4 | 1 | 0 |
1 | 73 | 0 | 2 |
66 | 12,2 | 5 | 0,33 |
11,0 | 2,6 | 0,86 | 0,07 |
2,2 | 0,17 | ||
Bewertung der lokalen und systemischen Reaktionen auf die Injektion von Allergen (Gen) oder Allergoid (Goid)
Paar Nr.
4 17 4 2 0 ίο
Gesamtbewert.
Durchschn. pro Patient
Durchschn. pro Injektion
Durchschn. pro Injektion
ausgeschiedenö 0 8 1 0
\A Lokale Reaktionen werden wie folgt bewertet:
1 +(1 Punkt): jegliches Schwellen bis zu einem Durchmesser von 10 cm
2+(2 Punkte): Schwellen mit einem Durchmesser von 10—20 cm
3+(3 Punkte): größer als 20 cm, jedoch nicht weiter als bis zum Ellenbogen
4+(4 Punkte): Schwellen bis zum Ellenbogen (tritt bei dieser Reihe nicht auf)
Systemische Reaktionen werden wie folgt bewertet:
1 +(1 Punkt): jegliche systemische Symptome über die lokale Fläche der Injektion, jedoch ist kein Epinephrin
erforderlich
2+(2 Punkte): Nesselausschlag-, Heufieber- oder Astma-Symptome, die Epinephrin erfordern, der Blutdruck
bleibt normal
3 Η-(3 Punkte): systemische allergische Symptome mit Erniedrigung des Blutdrucks (treten bei dieser Reihe
nicht auf)
4 + (4 Punkte): freie Anaphylaxe, erfordert Notfallmaßnahmen (treten nicht auf)·
Die systemischen Reaktionen treten innerhalb einer halben Stunde nach der Antigenverabreichung auf und
gegebenenfalls werden sie prompt durch die Verabreichung von Epinephrin umgekehrt Die anderen wesentlichen,
nachteiligen Reaktionen bestehen in einem lokalisierten Schwellen an den Verabreichungsstellen bei
höheren Antigendosen. Diese Reaktionen beginnen etwa 6 Stunden und erreichen ihr Maximum etwa 24 h auf
die Injektionen folgend. Die durchschnittlichen Bewertungen für solche lokalisierten Reaktionen sind bei beiden
Patientengruppe etwa gleich (Tabelle V).
Eine Prüfung der Blutchemie-(SMA-ll) und der Urinanalysenwerte zeigt, daß kein toxisches Ansprechen
auftritt als Folge der Behandlung mit entweder Allergoid oder Allergen.
Da es erforderlich war, wiederholte Doppel-Antikörper-Radioimmunoassayversuche für die Messung von
Serum IgG-Antikörper gegenüber Antigen E durchzuführen, wurde beachtliche Sorgfalt darauf verwendet, eine
gute Reproduzierbarkeit von einem Versuch zum anderen zu erhalten. In F i g. 1 ist der hohe Grad an Reproduzierbarkeit
dargestellt den man für die Standardkurven in 14 von 15 durchgeführten Analysen erhält Die
Standardkurven für die verbleibende Analyse liegt außerhalb der Grenze für die anderen Analysen, und die
Werte für diesen Versuch wurden nicht beachtet Da Antikörpermessungen für einfache Serumverdünnungen
innerhalb der meisten Versuche der Untersuchungen durchgeführt wurden, ist es wesentlich sicherzustellen, daß
die Neigung der Bindungskurven für jeden Patienten von der der Vergleichsproben unterscheidbar ist. Daher
wurde beliebig gewähltes Serum von jedem Patienten entnommen und bis zu den vollen Bindungskurven
analysiert Es wurde gefunden, daß die Bindungskurven für jeden Patienten sich nicht wesentlich von denen des
Standards (F i g. 2) unterscheiden, wodurch sichergestellt wurde, daß eine einfache Verdünnung bei der Analyse
der Antikörpergehalte in den restlichen Sera sinnvoll ist
Die F i g. 2 bis 4 zeigen das Anti-Antigen E IgG-Ansprechen bei 6 Paaren von Patienten, die das Untersuchungsschema
erfüllten, und F i g. 5 zeigt die Kurven der beiden ausgeschiedenen Patienten. Auf die erste Reihe
von Injektionen am Tag 0 folgend, steigen die IgG-Antikörpertiter beachtlich bei den meisten Patienten und
erreichen Plateauwerte zwischen 2 und 3 Wochen. Nachdem sichergestellt wurde, daß die Plateauwerte bei den
meisten Patienten tatsächlich erreicht wurden, indem die Antikörpertiter in einer Reihe von 4 bis 5 aufeinanderfolgenden
Blutproben bestimmt wurden, wurde eine zweite Reihe von Injektionen zwischen den Tagen 28 und
42 verabreicht Nach etwa weiteren 3 bis 4 Wochen wurden sekundäre Plateauwerte bei den meisten Patienten
erreicht und es wurde eine weitere Folge von Injektionen verabreicht Weitere 2 oder 3 Injektionsfolgen werden
vor der Kreuzkrautsaison in der Augustmitte verabreicht. Bedingt durch die Kürze der Zeit vor der Saison war
es nicht möglich, die Gewißheit abzuwarten, daß die Plateauwerte bei allen Patienten zwischen der Verabreichung
dieser letzteren Folgen erreicht wurden.
Die F i g. 2 bis 5 erläutern, daß Patienten mit stark unterschiedlichen Antikörpergehalten vor der Behandlung
(3 bis 114 Einheiten/ml) begannen. Die Antikörpergehalte steigen bei allen Patienten nach der Behandlung,
wobei die mit Allergoid behandelte Gruppe einen 5,7fach höheren Peaktiter als die mit Allergen behandelte
Gruppe zeigte. Mit Ausnahme des Paars Nr. 2 erzeugen alle mit Allergcid behandelten Patienten größere
Antikörperanstiege — normalerweise um das 5- bis 2Ofache größer — als ihre mit Allergen behandelten
Gegenstücke. Von weiterer Bedeutung ist die Tatsache, daß, folgend auf nur zwei Folgen der Immunisierung, die
mit Allergoid behandelten Patienten im Durchschnitt 47% (Bereich: 15 bis 91%) des maximalen Antikörperansprechens ergeben, das nach der vollen 4 bis 5 Folgenbehandlung erreicht wird.
Die entsprechenden Werte für die mit Allergen behandelten Individuen betragen 32% (Bereich: 6 bis 43%)
der maximalen Empfindlichkeit nach 2 Injektionsfolgen. Der geometrische mittlere Anstieg nach nur 2 Folgen
ίο der Behandlung ist um das 7,9fache größer bei den mit Allergoid behandelten Patienten als bei der mit Allergen
behandelten Gruppe. Überraschenderweise wurde gefunden, daß alle, mit Ausnahme eines Patienten (G. T, Gen
letztere Injektion folgend, die 2 Monate nach der Kreuzkrautsaison erfolgte.
Gesamtzunahme in der IgG-Antikörperempfindlichkeit (Peakempfindlichkeit minus Anfangswert) für alle 12
Patienten dargestellt, die die Untersuchung beendeten. Es gibt eine klare Beziehung zwischen der Antikörperempfindlichkeit und der Dosis, unabhängig davon, ob ein Patient mit Allergen oder mit Allergoid behandelt
wurde. Da die Regressionslinien für die beiden Gruppen sich nicht wesentlich unterscheiden, wurden die Werte
für alle 12 Patienten zusammengenommen. Durch lineare Regressionsanalyse von log (Antikörpertiter) versus
log Dosis wird der Korrelationskoeffizient r=0,83; p< 0,001, bestimmt Die entsprechenden Werte für die
Antikörperempfindlichkeit versus kumulative Dosis nach nur zwei Injektionsfolgen zeigen eine ähnliche Korrelation fr =0,81;p<0,001).
Die mittleren Tag-zu-Tag-Symptombewertungen in den beiden Gruppen von Patienten im Verlauf der 1977er
Kreuzkraut-Pollensaison (F i g. 7) zeigen einen Trend in Richtung auf eine niedrigere Gesamtsymptomatologie
innerhalb der Saison. Die folgt durch Analyse der durchschnittlichen tägi.ohen Bewertungen für jeden Patienten,
wobei der Durchschnitt während der gesamten Kreuzkrautsaison genommen wird (F i g. 8A).
Die durchschnittliche Bewertung für die mit Allergoid behandelte Gruppe beträgt 1,1 Symptomeinheiten
weniger als bei der mit Allergen behandelten Gruppe. Diese Ergebnisse sind statistisch nicht mit diesen wenigen
Patienten unterschiedlich. Frühere Untersuchungen (P. S. Norman, W. L Winkenwerder und Lichtenstein, 1971,
J. Allergy 47,273) haben gezeigt, daß die durchschnittliche tägliche Symptombewertung für die gesamte Kreuzkrautsaison für ähnlich empfindliche, mit Placebo behandelte Patienten normalerweise in den Bereich von 7 bis
10 Einheiten fällt, wobei die peakdurchschnittlichen täglichen Bewertungen 12 bis 14 Einheiten betragen. Daher
scheint es den meisten der behandelten Patienten besser zu gehen, als man es von der dazu passenden Placebo-Gruppe erwarten würde. Die Bewertung der behandelten Patienten sind ähnlich wie diejenigen, die man bei
Patienten findet (die auch zuvor unbehandelt waren), die nach einem herkömmlichen Behandlungsschema von
16 bis 24 wöchentlichen Injektionen von Antigen behandelt wurden, und zwar bei einer 1973 durchgeführten
Untersuchung von Allergen gegen Allergoid (F i g. 8B). Die Beurteilung des Arztes der Patienten während der
Kreuzkrautsaison ist in Übereinstimmung mit den selbst durchgeführten Bewertungen der Symptome.
Die vorliegende Untersuchung stellt die ersten systematischen Versuche dar, das optimale Behandlungsschema hinsichtlich der Antigendosis und den Injektionszwischenräumen für die Immunotherapie allergischer Patienten zu definieren. Gegen Ende der Untersuchung wurde ein intensives »Eil«-Schema verwendet, das 1 bis 5
Injektionen für jeden Behandlungstag umfaßte. Dieses Protokoll erlaubt dem Arzt, dem Patienten die optimal
tolerierbare Dosis zu verabreichen. In den meisten Fällen sind solche Dosiseinheiten etwa um das 100- bis
10 OOOfache größer als diejenigen, die normalerweise am ersten Tag der Behandlung des Patienten verabreicht
werden. Bei Allergoid ergibt eine hohe Behandlungsdosis am ersten Injektionstag eine wesentliche (10- bis
10Ofache) Erhöhung im IgG-Antikörper zu Antigen E etwa 2 bis 3 Wochen später. Eine zweite Folge von
Injektionen bei höheren Dosen kann dann verabreicht werden, was eine Antikörperempfindlichkeit bewirkt, die
durchschnittlich etwa 50% von der darauffolgenden beträgt, die man erhält folgend auf 2 bis 3 weitere Folgen
von Injektionen mit hohen Dosen an Allergoid.
Aus den Antikörper-Untersuchungen folgt, daß ein Injektionszwischenraum von 2 bis 4 Wochen optimal sein
wird, da zu diesem Zeitpunkt der Patient seine maximale Empfindlichkeit für die Immunisierung erreicht hat. Es
ist jedoch auch möglich, daß ein etwas größeres Intervall, das eine zusätzliche Auffrischung von IgG Antikörper
liefernden Zellen bewirkt, wirksamer sein kann, vorausgesetzt, daß die Antikörpergehalte nicht drastisch fallen
werden.
Trotz der hohen Dosierbereiche (insbesondere mit Allergoid) werden bei keinem der behandelten Patienten
nachteilige toxische Empfindlichkeiten beobachtet.
Diese Untersuchungen zeigen die klaren Vorteile von Allergoid gegenüber Allergen, da sehr hohe Allergoiddosen dem Patienten mit relativ geringer Gefahr systemischer Reaktionen und mit einhergehenden hohen
Gehalten an IgG-Antikörper verabreicht werden. In der vorliegenden Untersuchung war die einzige Ausnahme
für diese Regel der Patient D. H. beim Allergoid-Paar Nr. 2. Dieser Patient zeigte höhere als durchschnittliche
Empfindlichkeit gegenübere Allergoid und retrospektiv scheint es wahrscheinlich, daß in diesem Fall die An
fangsbehandlungsfolge zu stark bzw. streng war. Das Auftreten systemischer Reaktionen bei der mit Allergen
behandelten Gruppe ist mit Durchschnitt 0,7/Patient mit einer durchschnittlichen Reaktionsbewertung von
0,8/Patient (einschließlich des ausgeschiedenen Patienten). Dies ist unannehmbar hoch, so daß ein intensives
Dosierungsschema für eine Eilbehandlung mit Allergen nicht empfohlen werden kann.
Diese Untersuchung, die in zwei kleinen Gruppen von Patienten durchgeführt wurde, die mit Allergen und
Allergoid behandelt wurden, läßt den Schluß zu, daß mit größeren Patientengruppen weitergearbeitet werden
sollte, wobei die bekannten Behandlungsschemata für Allergen mit dem modifizierten Eilschema für Allergoid
verglichen werden sollten.
Allergoid behandelt wurden, läßt den Schluß zu, daß mit größeren Patientengruppen weitergearbeitet werden
sollte, wobei die bekannten Behandlungsschemata für Allergen mit dem modifizierten Eilschema für Allergoid
verglichen werden sollten.
Hierzu 7 Blatt Zeichnungen
Claims (3)
1. Verfahren zur Herstellung eines mit Aldehyd behandelten Allergens, wobei Reaktionen mit Formaldehyd
in nicht-phenolischer Umgebung durchgeführt werden, mit niedriger allergenischer Reaktivität bei
allergischen Menschen und welches die gewünschten Immunisierungseigenschaften des nativen Allergens
beibehält die zu einer Verbesserung der Symptomatologie der allergischen Individuen und der damit
einhergehenden Produktion von Blockierungsantikörper führen, wovon angenommen wird, daß sie assoziiert
ist mit, aber nicht notwendigerweise verantwortlich ist für solche Erleichterung der Symptome, und
welches in der Lage ist, bei Säugetieren die Bildung von Biockierungsantikörpern gegen das native Allergen
in ausreichender Konzentration zu induzieren, dadurch gekennzeichnet, daß man Allergene chemisch
unter Bedingungen, die die gewünschte Immunisierungseigenschaften des nativen Allergens beibehalten,
in mindestens zwei Stufen mit einer Aldehydiösung ausgewählt aus der Gruppe Formaldehyd, niedrige
gesättigte aliphatische difunktionelle Aldehyde, und ihre Gemische reagieren läßt, wobei die erste Reaktionsstufe bei einer Temperatur gerade über dem Gefrierpunkt der Lösung bis 15° C durchgeführt wird, und jede
nachfolgende Stufe bei einer Temperatur von 25 bis 40° C durchgeführt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Aldehyd bei allen Stufen Formaldehyd ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Aldehyd bei allen Stufen ein Dialdehyd
der Formel
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS58110240A (ja) * | 1981-12-24 | 1983-06-30 | いすゞ自動車株式会社 | アスフアルトシ−ト及びその使用方法 |
EP0083497A3 (de) * | 1982-01-06 | 1985-11-06 | Beecham Group Plc | Verfahren zur Herstellung von modifizierten Allergenen und ihre Verwendung in der Behandlung von allergischen Zustanden |
US4880635B1 (en) * | 1984-08-08 | 1996-07-02 | Liposome Company | Dehydrated liposomes |
US5543145A (en) * | 1984-09-17 | 1996-08-06 | Baxter International, Inc. | Pharmaceutical composition and method for the suppression of factor VIII inhibitor production |
US4740371A (en) * | 1984-09-17 | 1988-04-26 | International Institute Of Cellular And Molecular Pathology | Treatment of allergy |
US5026545A (en) * | 1984-09-17 | 1991-06-25 | Baxter International, Inc. | Treatment of allergy and composition therefor |
US4990336A (en) * | 1989-02-08 | 1991-02-05 | Biosearch, Inc. | Sustained release dosage form |
NL8900652A (nl) * | 1989-03-16 | 1990-10-16 | Leti Lab | Primair-toxische stoffen of allergenen, isoleerbaar uit plantaardig materiaal, alsmede werkwijzen ter bereiding ervan en de toepassing ervan. |
IT1237475B (it) * | 1989-10-06 | 1993-06-07 | Allergeni modificati chimicamente e procedimento per la loro preparazione | |
CA2015515C (en) | 1990-01-03 | 1999-12-07 | Jean-Marie Saint-Remy | Pharmaceutical compositions containing antigen-antibody complexes and uses therefor |
US5126147A (en) * | 1990-02-08 | 1992-06-30 | Biosearch, Inc. | Sustained release dosage form |
DE69233772D1 (de) * | 1991-10-16 | 2009-11-12 | Merck Patent Gmbh | T-zell epitopen von den wichtigsten allergene von dermatophagoides (hausmilbe) |
US20020090381A1 (en) * | 1999-04-09 | 2002-07-11 | H. Kim Bottomly | System for controlling immune system response to antigen |
GB0326439D0 (en) * | 2003-11-13 | 2003-12-17 | Imp College Innovations Ltd | Methods |
EP1637147B1 (de) * | 2004-09-18 | 2008-12-10 | Protectimmun GmbH | Stallstaub-Extrakt zum Schutz vor Allergien |
EP2258391A1 (de) * | 2009-06-05 | 2010-12-08 | Stallergenes S.A. | Reduktion der In-vitro-Genotoxizität von Pollenextrakten durch Entfernen von Flavonoiden |
WO2011098569A1 (en) * | 2010-02-12 | 2011-08-18 | Laboratorios Leti, S.L. Unipersonal | Process for producing an allergen extract |
GB201106802D0 (en) * | 2011-04-21 | 2011-06-01 | Allergy Therapeutics Ltd | Process for preparing vaccine composition |
ES2439617B1 (es) * | 2012-07-20 | 2015-03-13 | Diater Lab De Diagnostico Y Aplicaciones Terapeuticas S A | Composicion para la administracion intradermica de alergoides |
US20140170727A1 (en) * | 2012-12-19 | 2014-06-19 | Nanomr, Inc. | Affinity medium using fixed whole cells |
US11617789B2 (en) | 2018-11-09 | 2023-04-04 | Jubilant HollisterStier LLC | Process for the preparation of allergenic extracts |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2019808A (en) * | 1932-10-08 | 1935-11-05 | Abbott Lab | Detoxified pollen extract |
US3057775A (en) * | 1959-02-04 | 1962-10-09 | Champion Co | Embalming composition |
US3135662A (en) * | 1961-01-05 | 1964-06-02 | Burroughs Wellcome Co | Diphtheria toxoid preparation and its production |
FR2035774A2 (en) * | 1969-03-19 | 1970-12-24 | Anvar | Active protein product - with polymeric carrier |
CH453269A4 (de) * | 1968-03-29 | 1973-01-31 | ||
FR1604982A (en) * | 1968-03-29 | 1972-06-26 | Active protein product - with polymeric carrier | |
NO132132C (de) * | 1968-10-10 | 1975-09-24 | David George Marsh | |
GB1282163A (en) * | 1969-08-06 | 1972-07-19 | Beecham Group Ltd | Modified allergens and a process for their preparation |
BE754523A (fr) * | 1969-08-06 | 1971-02-08 | Beecham Group Ltd | Vaccins |
JPS4935413A (de) * | 1972-08-09 | 1974-04-02 | ||
DE2310964A1 (de) * | 1973-03-02 | 1974-09-05 | Schering Ag | Antigen- bzw. antigen-proteinkonjugatbeschichtete erythrocytenpraeparation |
FR2227861B1 (de) * | 1973-05-04 | 1976-07-02 | Anvar | |
GB1444652A (en) * | 1973-05-08 | 1976-08-04 | Abbott Lab | Polymerized gagweed antigen e |
US4070455A (en) * | 1974-02-16 | 1978-01-24 | Beecham Group Limited | Process for preparing injectable desensitizing compositions and products thereof in microparticle form |
GB1492973A (en) * | 1974-02-16 | 1977-11-23 | Beecham Group Ltd | Process for preparing injectable compositions |
-
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