DE3249519T1 - Die Immunantwort unterdrückende aktive Polypeptidfraktion - Google Patents

Description

MHIIMzI, LtiiDthi, DUivat: c* γαμιιμεπ

F'Htontaciwalti¹ ΓΊιιοροηη (Silent Attorneys'

München £, Stuttgart 3 2 49 P 32 49 519.6 (PCT/US32/00836)

J. Gabriel MICHAEL 28. Februar 1984

418 Chisholm Trail Cincinnati, OH 45215 / V.St.A.

Amadeo J. PESCE

5769 Whitcchapel

Cincinnati, OH 45236 / V.St.A.

Unser Zeichen: M 1601

Die Iitimunantwort unterdrückende aktive Polypep t id fraktion

Verweis auf verwandte Anmeldung

Dies ist eine Continuation-in-part-Anmeldung der Anmeldung Nr. 139 881, die am 19. Februar 1980 namens derselben Erfinder eingereicht worden ist.

Technologischer Hintergrund der Erfindung

Zahlreiche Polypeptidmoleküle verursachen bei Mensch und Tier eine allergische Reaktion. Heuschnupfen, insbesondere Empfindlichkeit gegenüber Gräsern der Gattung Ambrosia (ragweed), der üblicherweise durch Jucken der Nasen-, Mund-, Rachen- und Augenschleimhäute, durch Tränenfluß, Niesen, wäßrigen Nasenfluß, Husten und 15

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und manchmal asthmatisches Keuchen gekennzeichnet ist, befällt eine beträchtliche Zahl von Menschen. Empfindlichkeit gegenüber Bienengift ist üblicherweise gekennzeichnet durch eine Reaktion, die zu Quaddeln, zum Brennen, Anschwellen, Uberempfindlichkeit und gelegentlich zum Tode führt. Nahrungsmittelallergien treten üblicherweise durch Urticaria, vielleicht Übelkeit, Durchfall und Nesselfieber zutage.

Es ist bekannt, daß das Auftreten von Allergie oder Atopie mit der Erzeugung eines gewebesensibilisierenden Immunglobulin (IgE)-Antikörpers verbunden ist. Diese IgE-Antikörper besitzen eine Affinität für Zellrezeptoren in verschiedenen Körpergeweben. Die Rezeptoren der Mastzellen und Basophilen sind von besonderer Bedeutung, da diese Zellen pharmakologisch aktive Mediatoren enthalten, beispielsweise Histamin, Serotonin und Kinine, die in den Granula des Cytoplasmas konzentriert sind. Wenn IgE-Antikörper an Mastzellen und Basophile gebunden werden, kann der Kontakt mit Antigenen zu einer Vernetzung führen. Diese Vernetzung verursacht die Degranulation der Mastzellen und Basophilen, welche ihrerseits die pharmakologisch aktiven Mediatoren (insbesondere Histamin) freisetzen und für die Manifestationen der allergischen Antwort verantwortlich sind.

Diese Störungen werden somit von dem mit speziellen Polypeptidmolekülen in diesen Substanzen reagierenden Immunglobulin E verursacht. Wenn sie nicht behandelt werden, können diese Störungen im Falle des Heuschnupfens zu Asthma führen, im Falle von Insektengift zu arbeitsunfähig machenden Reaktionen und im Falle der Nahrungsmittel zu eingeschränkter Diätaufnahme. Die Behandlung des Heuschnupfens erfordert gewöhnlich den Versuch mit oral wirksamen Antihistaminen, manchmal in Kombination mit Sympathikomimetika wie Phenylpropanolamin oder Phenylephrin. Die Symptome mögen so teilweise unterdrückt werden, aber das zugrundeliegende physiologische Problem,

die Histamin-Freisetzunq durch die Antikörper-Antigen-Reaktion, bleibt bestehen. Die Behandlung von Insektenstichen mit diesen Mitteln ist nicht praktikabel, weil es nicht möglich ist, zu wissen, wann das Ereignis eintritt, und die Reaktion kann sehr heftig sein, wenn nicht sofort behandelt wird. Ebenso muß die Lebensmittel-Reaktion sofort behandelt werden, wenn die Wirkung dieser Mittel erreicht werden soll. Gewöhnlich sind diese Behandlungen nicht sachgerecht oder unbefriedigend, und es mußte zu einer grundlegenderen Behandlung Zuflucht genommen werden, insbesondere bei den Pollen- und Insektengiftallergien, nämlich zur Desensibilisierung.

Eine der üblichen und weitverbreiteten Methoden zur Allergiebehandlung besteht darin, den Patienten durch wiederholte Injektionen kleiner, stufenweise steigender Mengen an Antigen zu immunisieren oder zu desensibilisieren; man nimmt an, daß dadurch die Gehalte an blockierenden Immunglobulin G (IgG)-Antikörpern ansteigen und gleichzeitig die Erzeugung von IgE-Antikörpern gehemmt wird. Diese offensichtlich widerstreitende Wirkung der Antigenverabreichung ist noch nicht völlig erforscht, aber sie ist offensichtlich mit Unterschieden in der Immunregulierung zweier verschiedener Klassen von Antikörpern, nämlich IgG und IgE, verbunden.

Diese Desensibilisierung wird mit größter Vorsicht vorgenommen. Es wird mit einer sehr verdünnten Präparation von Ragweed-Allergen oder Bienengift - Allergen begonnen, welche subkutan injiziert werden; wenn sich innerhalb einer Stunde nach der Injektion keine lokale Reaktion zeigt, wird die nächste Dosis verdoppelt und innerhalb von drei oder vier Tagen verabreicht. Um im Falle einer anaphylaktischen Reaktion verwendet werden zu können, müssen für die Verabreichung im Notfall Adrenalin, Antihistamine und intravenös applizierbare antiinflammatorische Corticosteroide während der Untersuchungs- und Desensibilisierungsverfahren zur Verfügung stehen. Sowohl

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die erforderliche Zeit als auch die die üblichen Ragweed-Desensibilisierungsverfahren begleitenden Vorsichtsmaßnahmen sind lästig und unbequem. Der durch solche Behandlungen erzielte Nutzen ist häufig wechselnd.

Die Erfindung betrifft das Auffinden, die Herstellung und ein Verfahren zur Anwendung einer neuen und spezifischen, die Immunantwort unterdrückenden Polypeptidfraktion, die durch kontrollierte proteolytische Digestion eines Polypeptid-Allergens hergestellt wird und nach der Verabreichung an Säugetiere, einschließlich des Menschen, zum Zwecke der spezifischen allergischen Reaktion den Schutz gegen die genannten Allergene bewirkt, und zwar ohne die begleitende und gefährliche Möglichkeit eines anaphylaktischen Schocks oder anderer obengenannter Nachteile. Erfindungsgemäße Pollenallergenpräparate werden beispielsweise hergestellt aus gewöhnlicher Ambrosia (common ragweed), Riesen-Ambrosia (giant ragweed), Roggen (Gruppen I, II und III), June grass, orchard grass, sweet vernal grass, red top, timothy, yellow dock, Weizen, Mais, Beifuß (sagebrush) , blue grass, California annual grass, Chenopodium (pig weed), Bermuda grass, Russian thistle, Bergzeder (moutain ceder), Eiche, box elder, Platane (sycamore), Ahorn, Ulme usw.. Ambrosia (Ragweed) stellt die am weitesten verbreitete und giftigste dieser Pflanzen dar und wird in erster Linie zur Erläuterung beispielhaft herangezogen. Die Pollenallergene von Gräsern und Bäumen sind jedoch den Ragweed-Pollen chemisch ähnlich, wobei die

3Q Hauptallergene saure Proteine mit innerhalb des Bereiches von etwa 20.000 bis 40.000 liegenden unterschiedlichen Molekulargewichten sind, wie sie von T. P. King in "Advances In Immunology", S. 77-105, Academic Press, New York, N.Y. (1976), beschrieben sind. In dieser Veröffentlichung werden Bienengift - Allergene (hauptsächlich Phospholipase und Hyaluronidase) und Nahrungsmittclallorgene (z.B. Ovalbumin und Ovomucoid) als den Inhalationsmittel-Allergenen, die alle globuläre Proteine sind,

ähnlich weiter charakterisiert.

Nach King umfaßt das Antigen E aus Pollen von kurzen Ragweed-Sorten zwei nicht identische Polypeptidketten, die im nativen Molekül durch nicht-covalente Kräfte zusammengehalten werden, wobei die Ketten Molekulargewichte von etwa 26.000 bzw. 13.000 Daltons besitzen. Von Ovalbumin wird berichtet, es habe ein Molekulargewicht von 44.000, während Ovamucoid ein Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 27.000 ist. Bienengift - Phospholipase hat ein Molekulargewicht von etwa 15.800 und Hyaluronidase hat ein Molekulargewicht von etwa 50.000. Beide sind basische Glycoproteine.

King berichtet weiter, daß das Ragweedpollenantigen E gegenüber proteolytischer Digestion durch Trypsin, Chymotrypsin und Papain bei neutralem pH stabil ist, daß es aber von Nagarase bei neutralem pH verdaut wird. Nagarase-digeriertes Antigen E zeigte weniger als 0,001 % der Allergen-Aktivität des unversehrten Antigens E. Roggengras (Ryegrass)-Allergene der Gruppen I und II werden von Trypsin und Chymotrypsin ohne weiteres verdaut, wobei die Antigen- und Allergen-Aktivitäten sowie die haptenähnliche inhibitorische Aktivität im Falle der Gruppe I vollständig verschwinden.

Der Zweck der proteolytischen Digestion, von der King berichtet, war, zu zeigen, daß Allergene Polypeptide sind. Die von King beschriebenen, bei der Digestion entstandenen Produkte zeigten Eigenschaften, die von denjenigen der vorliegenden Erfindung völlig verschieden sind.

Als allgemeine Beobachtung stellt King fest:

"Die beherrschenden Antigen-Determinanten der Hauptallergene von Ragweed- und Ryegrass-Pollen, Kabeljau (codfish) und Bienengift sind sowohl

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von der Primärstruktur als auch von der Konformation des Moleküls abhängig, eine Eigenschaft, die mit den anderen Globulärproteinantigenen in Einklang steht."
5

In einem Aufsatz von L. Berrens in Annais New York Academy of Sciences, 221, S. 183-198, 1974, wird den Lysin-Zucker-Amadori-Produkten, die in allen von ihm untersuchten Allergenen vorhanden waren, Allergen-Aktivität bescheinigt, und zwar aufgrund der folgenden Beobachtungen:

"Die milde Oxidation dieser atopischen Allergene unter Verwendung von alkalischem Kaliumhexacyanoferrat(III), Wasserstoffperoxid oder ultravioletter Strahlung, die die leicht verwundbaren 1-Amino-1-desoxy-2-ketose-Seitenketten selektiv zerstörte, führte zur Verminderung der Allergenaktivität ohne die Unversehrtheit der Antigen-Eigenschaften des Trägermoleküls ernsthaft zu schädigen.

Die künstliche Einführung von (Lysin-)Zucker-Strukturen der obengenannten Konfiguration in inaktive Trägerproteine führte zur Gewinnung allergen-aktiver Präparate, die alle charakteristischen chemischen Eigenschaften "natürlicher" Allergene aufwiesen.

gO I^m Lichte dieser Ergebnisse kamen wir allmählich dazu, die "Lysin-Zucker"-Stelle als wesentlich für die Ingangsetzung der allergischen Reaktion anzusehen...".

Die erfindungsgemäßen Insektengift - Allergen-Präparate werden beispielsweise aus Bienengift, Wespengift und dem Gift anderer Insekten der Ordnung Hymenoptera gewonnen.

Die erfindungsgemäßen Nahrungsmittelallergen-Präparate werden aus Ei, Milch und anderen Quellen ähnlicher Allergen-Proteine hergestellt.

Das erfindungsgemäße Verfahren, das eine kontrollierte Digestion mittels eines proteolytischen Enzyms einschließt, kann auf alle Allergene des obengenannten Typs, die den Anmeldern bekannt sind, angewandt werden. Die erfindungsgemäßen, die Imnmnantwort unterdrückenden aktiven Polypeptidfraktionen können im Gegensatz zu bekannten Allergenen ohne die Wahrscheinlichkeit einer Anaphylaxie verabreicht werden.

Es ist bereits über Versuche brichtet worden, insbesondere bei ragweed-empfindlichen Personen eine Trennung der schützenden Aktivitäten von den Allergie hervorrufenden Aktivitäten für die Behandlung von Pollenempfindlichkeiten zu erreichen. K. Ishizaka et al., J. Immunol. 113, S. 70 - 77 (1974) stellten beispielsweise vier verschiedene Arten der aktiven, Allergen-Eigenschaften aufweisenden Fraktion von Ragweed-Pollenextrakt, dem Antigen E, her, nämlich mit Harnstoff denaturiertes Antigen E (UD) , dessen α- und (3-Polypeptidketten sowie ein reduziertes, carboxymethyliertes Antigen E (RC).

Alle diese Modifikationen verloren Antigen-Determinanten, die im unmodifizierten Antigen E enthalten waren, und konnten somit nicht dazu verwendet werden, eine befriedigende Antikörperproduktion gegen Antigen E beim Menschen zu erzielen. Keine der vier Zubereitungen reagierte mit menschlichem γ-Globulin, Human-IgG, im Gegensatz zum ursprünglichen nativen Antigen, und keines erzeugte bei ragweed-empfindlichen Personen die mit Erythem und Quaddelbildung verbundenen Reaktionen. Da die modifizierten Antigene keine Allergen-Reaktionen bei den Patienten hervorrufen, aber T-Zellen, trägerspezifische Helferzellen, zu stimulieren in der Lage sind, vermutete Ishizaka, daß solche modifizierten Antigene die T-ZeIlpopulation ohne Nebenwirkungen ändern können. Später

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berichteten Ishizaka et al., J. Immunol., 114, S. 110 115 (1975), daß Testergebnisse gemeinschaftlich zeigen, daß eine größere Population von B-Zellen, die durch natives Antigen stimuliert wurden, verschieden ist von der Mehrzahl der B-Zellen, die durch das harnstoffmodifizierte Antigen stimuliert wurden. Weitere Arbeiten über das durch Harnstoff denaturierte Antigen E (UD) bzw. über die aus dem denaturierten Molekül isolierte a-Polypeptidkette ergaben zusätzliche Anhaltspunkte dafür, daß diese Materialien T-Zellen für natives Antigen E spezifisch machen (Takatsu et al., J. Immunol. 115, S. 1469 - 1476 (1975), und ri_6, S. 1257 - 1264 (1976)). Es ist darauf hinzuweisen, daß das denaturierte Protein und die aus dem denaturierten Protein gewonnenen Polypeptidketten selbst fremdes Material einführen, welches die allergische Empfindlichkeit dadurch verschlimmert, daß neben und zusätzlich zum Ragweed-Antigen noch ein anderes sensibilisierendes Fremdmaterial hinzukommt, auf das der Körper reagieren kann.

Zusätzlich zu den harnstoff-denaturierten Antigenen, die von Ishizaka et al. beschrieben sind und die nicht mit Antikörpern für native Antigenmoleküle reagieren, sind in der Literatur noch weitere modifizierte Antigen-Präparate offenbart. Diese können wie folgt zusammengefaßt werden:

Mit Glutaraldehyd polymerisiertes Antigen:

3Q - R. Patterson, J. Allergy and Clinical Immunology 68, S. 85 - 90 (1981) - Immunogen, aber nur in kleinen Mengen reaktiv und verabreichbar.

Mit Formaldehyd behandeltes Antigen:

- D. G. Marsh et al., J. Allergy and Clinical Immunology 68, S. 449 - 459 (1981) - nicht-reaktiv, aber unwirksam hinsichtlich der Unterdrückung der Immunantwort.

Mit δ-Aminosäuren oder Polyäthylenglykol konjugiertes Antigen:

- F. Liu et al., Proc. National Academy of Sciences USA, 76.' ^s· ¹⁴³° " ¹⁴³⁴ (1979), und A.H. Sehon et al.,

J. Allergy and Clinical Immunology, 6_4_, S. 242 - 250 (1979) - die Immunantwort unterdrückend, Reaktivität ähnlich derjenigen der unmodifizierten Extrakte mit Antigen-Eigenschaften.

Der Stand der Technik lehrt somit nicht die Herstellung eines Pollen desensibilisierenden Mittels, das frei von anaphylaktischer Reaktivität ist und somit therapeutisch verwendet werden könnte, noch legt er dies nahe.

Abriß der Erfindung

Wir haben nun gefunden, daß ein sicheres und wirksames, Pollen, Insektengift und Nahrungsmittel desensibilisierendes Material aus Pollen-, Insektengift- und Nahrungsmittelextrakten hergestellt werden kann, die mit proteolytischen Enzymen, einschließlich der Exopeptidasen wie z.B. Carboxypeptidase A und der Endopeptidasen wie z.B. Trypsin, Chymotrypsin, Papain und insbesondere bakterieller Protease, Nagarase oder Pepsin behandelt werden und dann vorzugsweise durch Molekularausschlußchromatographie, Molekularfiltration oder Affinitätsabsorption entgiftet werden, um Fraktionen zu entfernen, die die zu behandelnde Allergie verschlimmern, wobei

3Q ein Produkt entsteht, das die Fähigkeit besitzt, die Immunantwort auf die genannten Antigene zu unterdrücken, wodurch Gefahren vermieden werden, die normalerweise mit der Desensibilisierung unter Verwendung der genannten Antigene verbunden sind, die man zu erreichen sucht.

Das Allergen desensibilisierende Polypeptidprodukt wird durch proteolytische Digestion des Primärallergens erhalten, wobei eine antigenspezifische Polypeptidfraktion

entsteht, die offenbar nur eine funktioneile Antigenvalenz an jedem Molekül hat, wodurch sie nicht an Reaktionen teilnimmt, die mit einer Antigen-Verbrückung verbunden sind, einschließlich der Antikörperbildung und der anaphylaktischen Antwort. Die Polypeptidfraktion hat ein Molekulargewicht von weniger als 10.000. Das erfindungsgemäße Erzeugnis ergibt keine positive, mit Quaddelbildung und Brennen verbundene Reaktion bei empfindlichen Personen, noch reagiert es in Form der passiven Hautanaphylaxiereaktxon (PCA) bei Ratten, die durch einen spezifischen Test mit Ragweed-Antigen, Bienengift-Antigen oder Eiweiß-Ovalbumin-Antigen sensibilisiert wurden. Es wurde gefunden, daß diese Polypeptid fragmente die Immunantwort dadurch wirksam unterdrücken, daß T-Suppressorzellen aktiviert und/oder B-Zellen inaktiviert werden.

Gemäß der Erfindung wird somit eine Allergen desensibilisierende Polypeptidfraktion bereitgestellt, die durch proteolytisch-enzymatische Digestion von einem spezifischen Allergen abgeleitet wird, welches die zu behandelnde allergische Reaktion verursacht, wobei die Fraktion im wesentlichen aus einem abgebauten Polypeptid mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 10.000, einem nominalen Molekülradius von nicht mehr als etwa 15 A, mit der Unfähigkeit, mit spezifischen Antikörpern auszufallen, mit der Unfähigkeit, die passive Hautanaphylaxie - Reaktion bei einem sensibilisierten Säugetier hervorzurufen, mit der Unfähigkeit, Histamin aus sensibilisierten Mastzellen oder Basophilen freizusetzen, mit der Unfähigkeit, eine deutliche Antikörperantwort hervorzurufen, mit der Fähigkeit, immunologische Reaktionen zwischen einem Vollallergen und seinem Antikörper signifikant zu hemmen, und mit der Fähigkeit, antigenspezifische Suppression hervorzurufen, besteht.

Dir Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung einer Allergen desensibilisierenden Polypeptid-

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fraktion bereit, bei dem ein wäßriger Extrakt eines nativen Allergens der Verdauung durch ein proteolytisches Enzym ausgesetzt wird und ein Reaktionsprodukt erhalten wird, das im wesentlichen aus einer abgebauten Polypeptidfraktion mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 10.000 und mit einem nominalen Molekülradius von nicht

mehr als etwa 15 A besteht.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Desensibilisierung von Säugetieren gegenüber allergischen Reaktionen umfaßt die Verabreichung einer Dosis einer Polypeptidfraktion an einen atopischen Sauger, bevor oder nachdem er einem Antigen ausgesetzt wurde, einer Polypeptidfraktion, die von einem spezifischen Allergen, das die allergische Reaktion verursacht, durch proteolytisch-enzymatische Digestion abgeleitet ist, und zwar in einer für die signifikante Inhibierung immunologischer Reaktionen wirksamen Menge, ohne daß bei dem Säuger Anaphylaxie hervorgerufen wird, wobei die Fraktion im wesentlichen aus einem abgebauten Polypeptid mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 10.000 und mit einem

nominalen Molekülradius von nicht mehr als etwa 15 A besteht.

Alle großen Polypeptidmoleküle, einschließlich des Ragweed-Antigens, der Bienengift-Phospholipase A und des Eiweiß-Ovalbumins, stellen komplexe immunologische Körper dar. Sie enthalten eine große Zahl möglicher Orte, die vom Wirtstier oder dem als Wirt fungierenden Mensehen als fremd erkannt werden, und die Immunantwort soll Antikörper erzeugen, die mit vielen dieser Epitope reagieren. Um eine Immunantwort zu erhalten, ist ein Minimum von zwei Bindungsstellen auf dem Antigen erforderlich. Das gleiche Erfordernis nach einem Minimum von zwei Bindungsstellen ist auch bei einer allergischen Antwort, beispielsweise der Anaphylaxie, gegeben. Es besteht somit eine Beziehung zwischen der Immunantwort und der immunologischen Reaktivität. Die erfindungsge-

mäßen Produkte stellen eine Reihe von Polypeptidfraktionen dar, von denen man annimmt, daß sie nur eine funktionelle Bindungsstelle an jedem Molekül besitzen. Somit können die Epitope an diesem Molekül nur einen Teil der der Erkennung dienenden Eigenschaften bzw. einen Teil der Reaktivität besitzen. Ohne sich an eine Theorie binden zu wollen, wird angenommen, daß es diese Unfähigkeit zur vollständigen Reaktion ist, die zu den einzigartigen Eigenschaften führt.

Polypeptidmoleküle bilden eine Reihe von Produkten unterschiedlicher Molekülgröße, wenn sie durch proteolytische Enzyme abgebaut werden. Kurze Abbauzeiten oder sehr geringe Enzymmengen bauen das Molekül teilweise ab, was große Fragmente ergibt. Demgegenüber führen große Enzymmengen oder lange Digestionszeiten zu vollständiger abgebautem Polypeptid. Das erfindungsgemäße Erzeugnis ist eine Folge der Auswahl des für die Bildung von Polypeptiden, die die einzigartigen immunologischen Eigenschäften besitzen, geeigneten Enzyms. Ein zu geringer Abbau würde zu Polypeptiden führen, die Eigenschaften haben, die denjenigen der nativen Moleküle ähnlich sind, während ein zu weitgehender Abbau zu Fragmenten führen würde, die keine immunologische oder immunchemische Reaktivität besitzen. Im Falle der Ragweed-Pollen wurde gefunden, daß Fragmente mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 2.000 keine immunologische oder immunchemische Reaktivität besitzen.

Die Reinigung des Produktes kann erforderlich sein, um diejenigen Allergeneigenschaften aufweisenden Moleküle zu entfernen, deren immunologische Reaktivität zu hoch ist. Dies wird dadurch erreicht, daß man Polypeptidfragmente mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 10.000 und mit einem nominalen Molekülradius von

nicht mehr als etwa 15 A auswählt. Heftig reagierende Polypeptide können, falls sie noch anwesend sind, durch Affinitätschromatographie mittels allergenspezifischer

Antikörper-Säulen entfernt werden.

Es liegt im Rahmen der Erfindung, die Digestion des Allergens durch proteolytische Enzyme in solcher Weise sorgfältig zu steuern, daß im wesentlichen kein Rest an reaktiven Antigenen zurückbleibt, wodurch es unnötig wird, eine Reinigungs- oder Selektionsstufe mittels der Molekularausschlußchromatographie, der Molekularfiltration oder der Affinitätsabsorption durchzuführen. Eine Reinigungs- oder Entgiftungsstufe wird somit beim erfindungsgemäßen Verfahren als fakultativ betrachtet, wird aber aus Sicherheitsgründen dennoch bevorzugt.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung 15

Präparat I

Extrakt aus kurzem Ragweed und Fraktion A

10g entfettete Shortragweed-Pollen wurden 50 ml destilliertem Wasser zugegeben und 48 Stunden lang bei 4⁰C gerührt oder aber, fakultativ, nur 2 Stunden bei 25°C. Die Aufschlämmung wurde durch Papier auf einem Büchner-Trichter filtriert, wobei das Filtrat ein wäßriger Extrakt aus Voll-Ragweed-Pollen ist. Zu diesem Extrakt wurde festes Ammoniumsulfat bis zu 90%iger Sättigung gegeben, und das Gemisch wurde 2 bis 3 Stunden auf 4°C gehalten und zentrifugiert. Der Niederschlag wurde abgetrennt und in 3,5 ml 0,1 M TRIS-Puffer und 0,06 M-HCl (pH 7,9) gelöst. Diese gepufferte Lösung wurde durch eine 95 cm hohe Sephadex G-25 Polydextran-Molekularsieb-Säule mit einem Durchmesser von 4 cm laufen gelassen, die mit 0,025 M-TRIS und 0,015 M-HCl (pH 7,9) equilibriert worden war. Das aus der Säule austretende Raffinat des ersten Peaks war die Fraktion A. Um sich der Reinheit zu versichern, wurde die Fraktion A fakultativ noch einmal durch die Säule gelassen. Das Raffinat wurde zentrifugiert und der Überstand wurde lyophilisiert.

Beispiel 1

Die lyophilisierte Fraktion A des Präparats I wurde in 0,1 M-Natriumbicarbonatpuffer, pH 8,0, zu einer Konzentration von 20 mg/ml gelöst. Das proteolytische Enzym Nagarase, gewonnen aus B.subtilis, wurde in 0,1M-Natriumbicarbonatpuffer, pH 8,0, zu einer Konzentration von 20 mg/ml gelöst. Die Nagarase-Lösung wurde der Fraktion Α-Lösung zugegeben, bis zu einem Endverhältnis

¹^ von 100:1 Teilen Fraktion A zu Nagarase. Nach 24stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Enzym-Digestion durch Zugabe von PMSF-Lösung gestoppt, und zwar 190 mg/ml in 0,1 M-Natriumbicarbonat (pH 8,0), die der Enzym-DigestionslÖsung unter Bildung eines molaren

¹^ Verhältnisses von 1,5:1 (PMSF:Nagarase) zugegeben wurden. Dies war die rohe, aktive, gegen Ragweed-Pollen immunisierende Polypeptidf raktion-.

Beispiel 2
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Die lyophilisierte Fraktion A des Präparats I wurde in 0,1 M-Citrat-Phosphat-Puffer, pH 3,0, in einer Konzentration von 200 mg Fraktion A pro 10 ml Pufferlösung gelöst und wiederholt langsam durch eine Säule aus ²^ immobilisiertem Pepsin-Enzym auf Glaskügelchen laufen gelassen. Nach 20 Durchläufen bei Raumtemperatur wurde der Auszug aus der Säule entfernt und lyophilisiert.

Beispiel 3
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Ein Citrat-Phosphat-Puffer (pH 3,0) wurde aus 39,8 ml 0,1 M-Zitronensäure und 10,2 ml 0,2 M Dinatriumhydrogenphosphat, verdünnt auf 100 ml mit destilliertem Wasser, hergestellt. Die lyophisilierte Fraktion A des Präparats ι wurde in dieser Pufferlösung in einem Verhältnis von 20 mg Fraktion A pro ml Puffer gelöst. Hierzu wurde ein Aliquot von 5 mg Pepsin in 1 ml destilliertem Wasser unter Bildung eines Verhältnisses von 100:1 (Fraktion A:

Pepsin) gegeben. Die Lösung wurde 24 Stunden auf Raumtemperatur gehalten und dann durch Zugabe von 0,1 M-Natriumhydroxid auf pH 7,4 gebracht. Das entstehende Produkt war die rohe, die Immunantwort unterdrückende, aktive Ragweed-Polypeptidfraktion.

Beispiel 4

100 mg Bienengift-Phospholipase A (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo. #P2509) wurden in 10 ml Citrat-Phosphat-Puffer, pH 3,0, gelöst und 1 Stunde lang bei 25°C gerührt. Der pH wurde auf 3,0 durch Zugabe von 1 N-HCl eingestellt. Die Digestion wurde durch Zugabe von 5 mg Rinderpepsin durchgeführt, und man ließ die Reaktion 6 Stunden lang bei 2 5°C ablaufen. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 N-NaOH, mit der der pH auf 8,0 gebracht wurde, beendet. Dies zerstörte die restliche Pepsinaktivität· Das entstehende Produkt war die rohe, aktive, die Immunantwort unterdrückende Phospholipase A-Polypeptidfraktion.

Beispiel 5

1 g Ovalbumin (Sigma Chemical Co., Fraktion V) wurde in 100 ml destilliertes Wasser gegeben und 1 Stunde lang bei 25°C gerührt. Der pH wurde auf 3,0 durch Zugabe von 1 N HCl eingestellt. Die Digestion wurde durch Zugabe von 50 mg Rinderpepsin durchgeführt, und man ließ die Reaktion 6 Stunden lang bei 25°C ablaufen. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 N-NaOH, womit der pH auf 8,0 gebracht wurde, beendet. Dies zerstörte jede restliche Pepsinaktivität. Das entstehende Produkt war die rohe, aktive, die Immunantwort unterdrückende Ovalbumin-Polypeptidfraktion.

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Beispiel 6

Die gemäß den Beispielen 1 bis 5 hergestellten Produkte wurden dadurch weiter gereinigt, daß man jedes von ihnen . 5 durch eine Affinitätsabsorptionssäule laufen ließ, die wie folgt hergerichtet wurde:

Sepharose CL-4B-Polydextran wurde mit destilliertem Wasser gewaschen. 0,5 Volumteile gewaschene Sepharose CL-4B und 0,5 Volumteile destilliertes Wasser wurden zu einem Volumteil 2 M-Natriumcarbonat gegeben und langsam gerührt. Zu dieser Aufschlämmung wurden auf einmal 0,5 Volumteile einer Lösung von 2 g/ml Bromcyan in Acetonitril gegeben. Die Aufschlämmung wurde 2 Minuten lang heftig gerührt. Die Sepharose wurde dann mit 10 Volumteilen 0,1 M-Natriumbicarbonat, pH 9,5, gewaschen. Die Aufschlämmung wurde unter Vakuum filtriert und der Filterkuchen wurde in einen Kolben verbracht, der 100 ml eines γ-Globulin-Antikörpers (1%ig) für das spezifische Allergen enthielt, beispielsweise Ragweed-Human-y-Globulin in 2 M-Natriumbicarbonat. Die Kupplung von Sepharose und Globulin wurde dadurch bewirkt, daß man die Zubereitung 20 Stunden lang auf 4⁰C hielt. Nach dem Kuppeln wurden die Sepharose-Kügelchen nacheinander mit jeweils 20 Volumteilen 0,1 M-Natriumacetat, pH 4,O₇ 0,1 M-Natriumbicarbonat und physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Lowry-Bestimmungen, die vor und nach dem Kuppeln durchgeführt wurden, zeigten eine 86,3%ige Wirksamkeit der Kupplung von Human-y-Globulin an Sepharose-Kügelchen.

Die gereinigten Produkte jedes der Beispiele 1 bis 5, die nach diesem Beispiel erhalten wurden, besitzen im wesentlichen gleiche biochemische und immunologische Eigenschaften. Der entstehende nicht-absorbierte Allergen-Auszug, die aktive, die Immunantwort unterdrückende Polypeptidfraktion, wird zur Allergiebehandlung verwendet. Gewünschtenfalls kann das Raffinat zu einem trocke-

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nen festen Produkt lyophilisiert werden, das sich gut hält und zur therapeutischen Verwendung in Kochsalzlösung resuspendiert werden kann.

Das aus Ragweed-Pollen hergestellte Material besitzt ein Molekulargewicht von weniger als etwa 10.000, aber nicht weniger als etwa 2000. Die Antigen-Determinanten, die nicht durch Antikörper herausabsorbiert werden,

bleiben noch erhalten.
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Beispiel 7

Die Produkte gemäß den Beispielen 1 bis 5 wurden weiter dadurch gereinigt, daß man jedes davon durch ein MoIekularsieb oder eine Gelfiltrationssäule laufen ließ, die wie folgt hergestellt wurden:

500 g Sepharose G-50 ließ man über Nacht in 1 1 phosphatgepufferter Kochsalzlösung bei pH 7 quellen. Die entstandene Aufschlämmung wurde gerührt, man ließ absetzen und dekantierte die feinen Teilchen. Aus dem Material wurde eine Säule hergestellt, indem man die Aufschlämmung sorgfältig auf eine 10 cm χ 200 cm große Glassäule gab. Die Polypeptidfraktionen von Ragweed, Bienengift bzw. Ovalbumin wurden in der Fraktion mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 10.000 eluiert.

Beispiel 8

Die Produkte gemäß den Beispielen 1 bis 5 wurden weiter dadurch gereinigt, daß man jedes von ihnen durch ein Molekularsieb wie z.B. das immersible Millipore CX-10, Amicon PM-10, UM-10, UM-5 laufen ließ. Die Fraktionen wurden durch Ultrafiltration entweder mittels Vakuum oder Druck gereinigt. Die Filter ließen keine Moleküle durch, die einen größeren nominalen Molekülradius hatten als

etwa 15 A.

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Zur Erleichterung der Auswertung der in den nachfolgenden Tabellen I bis XlII enthaltenen Daten werden die folgenden Definitionen gegeben:

C) Nicht-immunogene Substanz

Bei Verabreichung durch Injektion in Gegenwart eines Adjuvans tritt keine oder eine sehr geringe Imraunantwort auf. Dies wird durch eine oder mehrere IQ Injektionen der Polypeptidfraktionen erreicht. Es wird auf die Immunantwort durch Verwendung der passiven Hautanaphylaxie (PCA)-Reaktion untersucht.

(2) Substanz, die keine Antigen-Eigenschaften aufweist

Bei Verabreichung an durch Antikörper für das spezifische Antigen sensibilisierte Lebewesen verursacht die Polypeptidfraktion keine allergische Reaktion. Dies wird durch subdermale Antikörper-

2Q injektion erreicht, wobei der Antikörper an Wirt-Mastzellen anhaftet, gefolgt von einer Herausforderung mit dem Antigen. Diese Behandlung führt gewöhnlich zu einer passiven Hautanaphylaxie (PCA)-Reaktion. Das Ausbleiben einer Reaktion zeigt den Verlust der Antigen-Eigenschaften an.

(3) Die Immunantwort hemmende Substanz

Die Polypeptidfraktion vermindert oder eliminiert ₃q die allergische Antwort, wenn sie vor oder nach dem Antigen verabreicht wird. Die Behandlung mit der Polypeptidfraktion erniedrigt oder eliminiert somit die erwartete oder angehende IgE-Antwort, geprüft durch PCA.

(4) Passive Hautanaphylaxie (PCA)

Ein hochempfindlicher und zuverlässiger Test auf unmittelbare Uberempfindlichkeit, der auf der Messung der Titer derjenigen Antikörper beruht, die Mastzellen und Basophile sensibilisieren. PCA entspricht der PK-Reaktion beim Menschen.

(5) Primärantwort - Folgt der ersten Antigenaussetzung.

Sekundärantwort - Folgt der zweiten oder mehrfachen Antigenaussetzung.

Die in den Tabellen I bis XIII wiedergegebenen Versuchsergebnisse sind Durchschnittswerte, die auf entweder zwei oder aber drei Experimenten beruhen.

Beispiel 9

Ragweed-Extrakt und Alaun als Adjuvans wurde an BDF..-Mäuse durch intraperitoneale Injektion verabreicht. Die Immunantwort wurde durch die passive Hautanaphylaxie (PCA)-Reaktion in Rattenhaut gemessen. Die PCA-Herausforderung bestand aus 1 mg Ragweed-Extrakt, gelöst in 1 ml 1%igem Evans-Blau. Die Immunantwort unterdrückende, aktive Pollen-Polypeptidfraktion (PAPIF) wurde ebenfalls injiziert, und zwar mit den in der Tabelle I zusammengefaßten Ergebnissen.

Tabelle I

Immunogene Eigenschaften der PAPIF

Präparat**	1	10	μπι	Primärantwort nach 10 Tagen PCA-Titer	Sekundärantwort nach 40 Tagen* PCA-Titer
Ragweed Ext.		00	μπι	1:320 Verdünnung	1:1620 Verdünnung
Ragweed Ext.	1	10	um	1:160 Verdünnung	1:1620 Verdünnung
PAPIF		00	1m	0	0
PAPIF		0	0

Die Titer stellen das Mittel der vereinigten Sera von 5 Mäusen dar.

* Die zweite Injektion wurde nach 30 Tagen verabreicht. ** Dosis i.p. in Alaun.

Die vorgenannten Daten zeigen das völlige Fehlen von Immunogen-Eigenschaften der PAPIF sowohl hinsichtlich der primären als auch der sekundären Immunantwort, verglichen mit Ragweed-Extrakt, der in Verdünnungen von 1:160 und 1:1620 Antworten bewirkte.

Beispiel

Um die Wirksamkeit von Ragweed-PAPIF als ein die Immunantwort unterdrückendes Mittel zu testen, wurde PAPIF gemäß den Beispielen 3 und 6 an Mäuse durch intravenöse Injektion vor der Immunisierung mit Ragweed-Extrakt gemäß Tabelle II verabreicht.

-y^

Tabelle II

Die Immunantwort unterdrückende Eigenschaften von

PAPIF

Vorbehandlung	PAPIF*	0	Herausforderung mit	PCA-Titer am
mit	μΐη Tag	0	Ragweed-Extrakt* *	10. Tag
100	μπι Tag	0	100 μΐη Tag 1	0
10	μΐη Tag	1	Il	0
1	μπ\ Tag	1	Il	1:10
100	μΐη Tag	1	Il	1:10
10	μπι Tag		Il	1 :20
1		Il	1 :40
0		Il	1:160

Die Titer stellen das Mittel der vereinigten Sera von 5 Tieren dar.

* i.v. in Kochsalzlösung verabreicht,

** i.p. in Alaun.

Die Daten der Tabelle II zeigen deutlich die die Immunantwort unterdrückende Wirkung von PAPIF bezüglich der Immunantwort auf Ragweed-Antigen hinsichtlich der primären Immunantwort.

Ein ähnliches Maß an Unterdrückung durch i.v.-Injektion des Produkts gemäß den Beispielen 2 und 6 wurde bei der sekundären Immunantwort auf Ragweed-Antigen beobachtet, wie aus Tabelle III hervorgeht.

Tabelle III

Die Immunantwort unterdrückende Eigenschaften von PAPIF bei der Sekundärantwort

Vorbehandlung mit PAPIF*	pm	Tag	0,	Tag	29	Herausforderung mit Ragweed-Extrakt**	PCA, am 40. Tag
100	μιτι	Tag	0,	Tag	29	100 ρ Tag 1, Tag 30	1:10
10	μΐη	Tag	o,	Tag	29	Il	1 :40
1						Il	1 :80
0			"	1 :3200

Die angegebenen Titer stellen das Mittel der vereinigten Sera von 5 Tieren dar. 15

* i.v. in Kochsalzlösung ** i.p. in Alaun.

Die Wirkungen von gemäß Beispiel 2 hergestelltem PAPIF bei der Inhibierung der angehenden Immunantwort auf Ragweed-Antigen wurde ebenfalls aufgezeigt. Nachdem die IgE-Antwort sichtbar wurde, wurde den Tieren PAPIF intravenös injiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV angegeben.

Tabelle IV

Wirkung von PAPIF auf die angehende Antwort

Behandlung mit PAPIF am 6., 7., 8. Tag*	Behandlung mit Ragweed-Extrakt am 1. Tag**	PCA, am 20. Tag
100 um 100 \im	100 \im 100 um	1 :160 1 :10 0

Die angegebenen Titer stellen das Mittel der vereinigten Sera von 5 Tieren dar.

* i.V. in Kochsalzlösung.

** i.p. in Alaun.

Die Verabreichung von PAPIF unterdrückte somit auch die bereits angehende IgE-Antwort.

Beispiel 11

Das PAPIF-Material gemäß Beispiel 8 wurde sowohl an nicht-empfindlichen als auch an speziell .gegenüber

Ragweed-Antigen empfindlichen Menschen getestet. 15

Fraktion A und gereinigte PAPIF wurden mit einer Konzentration von 1 mg/ml in nicht-pyrogener Kochsalzlösung hergestellt und durch ein 0,25 μ-Millipore-Bakterien-

filter filtriert. Das Filtrat wurde mit steriler —3

isotonischer Kochsalzlösung weiter verdünnt auf 10 bis 10 -Verdünnungen, und die Hautreaktivität wurde durch intradermale Injektionen von 0,02 ml pro Injektion wie folgt untersucht:

Bei drei nicht-atopischen Personen verursachten die 10 bis 10 -Verdünnungen keine Hautreaktion. Dies zeigt, daß PAPIF bei diesen Konzentrationen bei normalen Personen keine inhärente Reaktivität besitzt.

Bei drei atopischen Personen wurden die folgenden Reaktionen beobachtet, wobei die Intensität der Quaddelbildung von einem Maximum von +4 bis hinuter auf 0 abgestuft war, wie aus Tabelle V hervorgeht. Diese Daten zeigen, daß PAPIF fast nicht-reaktiv war, sogar in der konzentriertesten Lösung, die an atopischen Personen getestet wurde.

2 4 9 5

Tabelle V

Reaktivität von PAPIF bei Ragweed-empfindlichen Patienten

Verdünnung	Patient A	PAPIF	Patient B	PAPIF	Patient C	PAPIF
des Präpa rats*	Frak tion A	+ ,0 0 0 0	Frak tion A	0000	Frak tion A	+ ,0 0 0 0
ΙΟ"3 10~4 ΙΟ"5 10"6	+ + + +	+ + + +

* Unverdünntes Präparat enthielt 1 mg/ml der Fraktion.

Beispiel

Tabelle VI zeigt die blockierende Aktivität von PAPIF bei Ratten, die intradermal mit Reagin-IgE-Anti-Ragweed-Antikörpern, welche aus BDF.-Mäusen gewonnen wurden, sensibilisiert wurden. PAPIF wurde intravenös verabreicht, 15 Minuten vor der intravenösen Herausforderung mit Fraktion A und Evans-Blau. Wie aus Tabelle VI ersichtlicht, verminderte PAPIF die Reaktivität zwischen IgE-Antikörper und Antigen wesentlich.

Tabelle VI

Blockierende Aktivität von PAPIF

Anti-Ragweed- IgE-Serum Verdünnung	10	PCA	PAPIF
1	20	Kein PAPIF*	+ + +
1	40	+++	+ + +
1	80	+ + +	+ + +
1	160	+ + +	+
1:	320	+ + +	-
1 :	640	+ + +	-
1-	+
—

* Fraktion A: 100 \iq in 1,0 ml 0,5 %-Evans-Blau, 15 Minuten nach PAPIF intravenös verabreicht.

Beispiel

Tabelle VII zeigt, daß Fragmente mit einem Molekulargewicht von weniger als 10.000 bei der PCA-Herausforderung nicht reaktiv sind.

Ratten wurden intradermal mit Anti-Ragweed-IgE-Antikörpern sensibilisiert, die aus BDF₁-Mäusen gewonnen wurden. 24 Stunden später wurden sie intravenös mit 1 mg der geeigneten, durch Ultrafiltration (Beispiel 8) gereinigten Fragmente in 1 ml 0,5 %-Evans-Blau herausgefordert. Es ist offenkundig, daß Fragmente mit einem Molekulargewicht von weniger als 10.000 nicht reaktiv beim PCA waren.

Tabelle VII

PCA-Reaktivität der Fragmente

Ungefähres Molekular gewicht der Fragmente	PCA*
20.000 - 30.000 10.000 - 20.000 2.000 - 10.000 < 2.000	+ + + + + +

* Sensibilisierendes Antiserum: Verdünnung 1:50.

Beispiel

Die die Immunantwort unterdrückende Aktivität der durch Ultrafiltration (vgl. Beispiel 8) abgetrennten Fragmente wird in Tabelle VIII gezeigt.

Die Fragmente wurden intravenös an Gruppen von BDF..-Mäusen verabreicht, die nachfolgend mit Fraktion A in Alaun immunisiert wurden. Fragmente mit einem Molekulargewicht von weniger als 2.000 erwiesen sich als die Immunantwort nicht unterdrückend.

Tabelle VIII

Ungefähres gewicht der	- 30	Molekular- Fragmente	Vorbehand lung*	(3X)	Herausgefor dert mit Ragweed**	ng	PCA
20.000 -	- 20	.000	10 \iq	(3X)	100	ng	1 :5
10.000 -	- 10	.000	10 ng	(3X)	100	ng	1 :10
2.000 -	000	.000	10 μg	(3X)	100	ng	1 : 10
< 2			10 [ig		100	ng	1 :320
""" — "—		_ — —	100	1 :32Ö

* Durch intravenöse Injektion 24,48 und 72 Stunden vor der Herausforderung mit Ragweed vorbehandelte Mäuse.

** In 1 mg Alaun intraperitoneal injiziert. 5

Beispiel

Die immunogenen, die Immunantwort unterdrückenden und antigenen Eigenschaften der Phospholipase A-Fragmente (Fr. 1) sind in den Tabellen IX, X und XI erläutert. Die Eigenschaften dieser Fragmente sind identisch mit denjenigen von PAPIF, wie in den Beispielen 9 und 10 beschrieben.

Tabelle IX

Immunogene Eigenschaften von Phospholipase-

Fragmenten

Präparat*	PCA am 14. Tag	PCA am 21. Tag
PS A**	160	320
PS A	320	640
FR.1***	0	o
FR.1	0	0

*." i.p. in Alaun verabreicht. ** Phospholipase A. *** Fragment

Die angegebenen Titer stellen das Mittel aus 5 vereinigten Sera dar.

^ 2*1

Tabelle X

Unterdrückung durch Phospholipase-Fragitiente

Vorbehandlung *	Immunisierung**	PCA am 21. Tag
Fr.1 10 μg (3X) Fr.1 10 ng (3X)	PS 10 μg PS 10 μg	0 0 640

* i.v. in Kochsalzlösung.

** i.p. in Alaun.

Die angegebenen Titer stellen das Mittel aus 5 vereinigten Sera dar.

Tabelle XI

Antigen-Eigenschaften von Phospholipase-

Fragmenten

Sensibilisiert mit*	Herausforderung	PCA
Anti PS IgE	PS 100 ng	160
Anti PS IgE	Fr.1 100 μg	0
Anti PS IgE	Kochsalzlösung	0

* Antikörper intradermal 24 Stunden vor der intravenösen Herausforderung mit in 10 ml 0,5 %-Evans-Blau-Farbstoff gelöstem Antigen injiziert.

Beispiel 16

Die Phospholipase Α-Fragmente (Fr.1) der Beispiele 4 und 6 wurden an gegenüber Bienengift nicht-empfindlichen bzw. empfindlichen Menschen getestet. Tabelle XII zeigt die Ergebnisse dieser Versuche, aus denen sich ergibt,

daß Fr.1 bei gegenüber Bienengift empfindlichen Patienten bei einer Konzentration von 1 mg nicht-reaktiv ist.

Tabelle XII

Untersuchung der Haut von bienengift-empfindlichen

Patienten

Testmaterial	Reaktion	Patient #1	Patient #2	Patient #3
Bienengift 1 μg Phospholipase 1 ng Fraktion I 1 ^g Kochsalzlösung	+ + + + + + + + 0 0	+ + + + + 0 0	O O O O

Beispiel 17

Ovalbumin-Fragmente (OVA Fr.), die wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellt wurden, wurden auf ihre immunogenen, suppressiven und antigenen Eigenschaften getestet. Die Eigenschaften dieser Fragmente waren identisch mit denjenigen von PAPIF und Phospholipase A-Fragmenten, wie sie in den Beispielen 9, 10 und 15 beschrieben sind.

Tabelle XIII zeigt die die Immunantwort unterdrückenden Eigenschaften von OVA-Fragmenten an BDF.-Mäusen.

Tabelle XIII Suppression durch OVA-Fragmente

Vorbehandlung*	Immunisierung**	PCA am 21. Tag
OVA-Fr. 10 ng (3X) OVA-Fr. 10 μg (3X	OVA 10 μg OVA 10 μg	0 0 320

* i.V. in Kochsalzlösung.
** i.p. in Alaun.

f- Die angegebenen Titer stellen das Mittel aus 5 vereinigten Sera dar.

Kurz zusammengefaßt, ergibt sich aus Tabelle I, daß die Fragmente völlig nicht-immunogen waren, sogar dann, wenn sie in einem Adjuvans verabreicht wurden.

Die die Immunantwort unterdrückende Aktivität dieser Fragmente ist in den Tabellen II, III und IV festgehalten. Diese Daten zeigen, daß die Fragmente wirksam waren, ρ- wenn sie vor der primären oder sekundären Antwort oder sogar nachdem die Antwort bereits im Gange war, verabreicht wurden.

Tabelle V zeigt, daß die Ragweed-Fragmente völlig nichtreaktiv bei ragweed-empfindlichen Pi sie intradermal verabreicht wurden.

reaktiv bei ragweed-empfindlichen Patienten waren, wenn A U

Die Tabellen VI bis VIII zeigen die blockierenden Eigenschaften und die Molekulargewichtsabhängigkeit der Eigenschaften der Ragweed-Fragmente.

Die Tabellen IX bis XI zeigen die Eigenschaften der Fragmente (Fr.1), die aus Phospholipase A (PSA), der Hauptkomponente des Bienengifts, gemäß den Beispielen

4 und 6 hergestellt wurden. Diese Tabellen zeigen deut-3Ü

lieh, daß Phospholipase Α-Fragmente wirksame, die Immunantwort unterdrückende Mittel sind.

Tabelle XII zeigt, daß Phospholipase Α-Fragmente völlig

nicht-reaktiv bei gegenüber Bienengift empfindlichen 35

Personen waren.

Tabelle XIII zeigt Ergebnisse von Experimenten, bei denen Hühneralbumin (OVA) und dessen Fragmente (Fr. OVA), die gemäß den Beispielen 5 und 6 hergestellt wurden, vor der parenteralen Herausforderung mit OVA in Alaun verabreicht wurden. Ein hoher Suppressionsgrad wurde erzielt.

Die vorgenannten Testdaten zeigen, daß die erfindungsgemäßen Polypeptidfraktionen die Fähigkeit, allergische Reaktionen zu verursachen, d.h. die Freisetzung von gefäßaktiven Aminen aus mit Antikörpern sensibilisierten Mastzellen und Basophilen zu verursachen, verloren haben. Die Polypeptidfraktionen behalten jedoch ihre immunregulatorischen Eigenschaften, und die parenterale Verabreichung des erfindungsgemäßen Produkts an Ver-. suchstiere unterdrückt die Initiierung bzw. die Fortsetzung der bereits in Gang gekommenen IgE-Immunantwort auf das behandelte spezifische Allergen.

Bei einem typischen Fall von Pollen- oder Ragweed-Allergie wird die Desensibilisierung durch 14tägige Behandlung des Patienten mit den geeigneten Fragmenten bewerkstelligt. Da diese Fragmente relativ nicht-verschlimmernd sind, können relativ große Dosen davon subkutan injiziert werden, um sicher eine schnelle Desensibilisierung zu erreichen. Beispielsweise wird die Injektion von 0,1 ml einer 10 -Verdünnung von PAPIF (die Urlösung enthält 1 mg/ml PAPIF) mehrere Wochen lang 14tägig verabreicht, vorzugsweise innerhalb von 3 Monaten vor dem Beginn der Ragweed-Empfindlichkeitszeit des Patienten. Gleichzeitig wird der Patient mittels Radioimmunoassay auf die Konzentration des spezifischen Antiragweed-IgE sowie auf die Hautreaktivität gegenüber Ragweed-Antigen untersucht. Infolge der Desensibilisierung gibt es keinen Anstieg der Antiragweed-IgE-Titer, wenn die Person dem Ragweed ausgesetzt wird. Außerdem wird die Reaktivität des desensibilisierten Patienten gegenüber Ragweed-Extrakt signifikant vermindert.

Die Erfindung stellt einen Fortschritt auf zwei Gebieten hinsichtlich der Durchführung und der Bequemlichkeit der Verabreichung dar. Erstens wurde gefunden, daß die Digestion eines Allergens durch proteolytische Enzyme in einem solchen Maße gesteuert werden kann, daß es nicht erforderlich ist, restliche reaktive Antigene zu entfernen. Somit führt die Stufe der kontrollierten enzymatischen Digestion des Allergens zu dem gewünschten Endprodukt. Zweitens wurde gefunden, daß parenterale Verabreichung des Produkts an Mäuse in relativ hohen Dosen zur Suppression der IgE-Immunantwort führt.

Claims (21)

1. Γ" ΓΛΙ I NJ ^- , L- l_ I <^> L_ I 1 , UWMlVU »_Χ I ./ Λ I I · I N r _ ι ι

   I 'alt ¹IiIiH lw; ill f ■> F in (>|Η.ίίιί CaIi¹Dt AltiniH'ys

   München ru, Stuttgart 3 2 4 9

   P 32 4 9 519.6 (PCT/US82/00886)

   J. Gabriel MICHAEL 28.. Februar 1984

   418 Chisholm Trail
   Cincinnati, OH 45215 / V.St.Λ.

   Amadeo J. PESCE

   5769 VJhitechapel

   Cincinnati, OH 45236 / V.St.A.

   Unser Zeichen: M 1601

   Patentansprüche

   1 ./ Allergen desensibilisxerende Polyoeptidfraktion, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch proteolytische enzymatische Digestion aus einem spezifischen Allergen, das die zu behandelnde allergische Reaktion verursacht, gewonnen wird und daß sie im wesentlichen aus einem abgebauten Polypeptid besteht, welches ein Molekulargewicht von weniger als etwa 10.000, einen nominalen

   Molekülradius von nicht mehr als etwa 15 A, die Unfähigkeit, mit spezifischen Antikörpern einen Niederschlag zu bilden und auszufallen, die Unfähigkeit, passive Hautanaphylaxie-Reaktion bei einem sensibilisierten Säuger hervorzurufen, die Unfähigkeit, Histamin aus sensibilisierten Mastzellen oder Basophilen freizusetzen, die Unfähigkeit, eine wesentliche Antikörper-Antwort hervorzurufen, die Fähigkeit, immunologische Reaktionen zwischen einem Vollallergen und seinem Antikörper signifikant zu inhibieren, sowie die Fähigkeit, antigenspezifische Suppression hervorzurufen, besitzt.

   Bj/Ma

   32Λ9519
2. 2. Allergen desensibilisierende Polypeptidfraktion nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das spezifische Allergen ein natives Pollen-, Insektengift- oder Nahrungsmittel-Protein ist.
3. 3. Allergen desensibilisierende Polypeptidfraktion nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die nativen Pollen Ragweed-Pollen sind und daß das Molekulargewicht der Fraktion nicht weniger als etwa 2.000 beträgt.
4. 4. Allergen desensibilisierende Polypeptidfraktion nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das native Insektengift Phospholipase A einschließt.
5. 5. Allergen desensibilisierende Polypeptidfraktion nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das native Nahrungsmittelprotein Ovalbumin ist.
6. 6. Verfahren zur Herstellung einer Allergen desensi-

   bilisierenden Polypeptidfraktion, dadurch gekennzeichnet, daß ein wäßriger Extrakt eines nativen Allergens der Digestion durch ein proteolytisches Enzym unterworfen und ein Reaktionsprodukt erhalten wird, das im wesentlichen aus einer abgebauten Polypeptidfraktion mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 10.000 und einem

   nominalen Molekülradius von nicht mehr als etwa 15 A besteht.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, gO daß das Enzym Carboxypeptidase A, Trypsin, Chymotrypsin, Papain, Protease bakteriellen Ursprungs, Nagarase oder Pepsin ist.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Allergen nativer Blütenstaub, natives Insektengift oder natives Nahrungsmittelprotein ist.
9. 9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es die Stufe des Abtrennens restlicher reaktiver Antigene von dem Reaktionsprodukt nach der Digestion durch ein proteolytisches Enzym einschließt.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe des Abtrennens von restlichen reaktiven Antigenen das Entgiften des Reaktionsprodukts durch Molekularausschlußchromatographie, Molekularfiltration oder Affinitätsabsorption des restlichen reaktiven Antigens umfaßt.
11. 11. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Allergen aus Ragweed-Pollen besteht und daß das Enzym Nagarase oder Pepsin ist.
12. 12. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Allergen Insektengift-Phospholipase A und das Enzym Pepsin ist.
13. 13. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Allergen Ovalbumin und das Enzym Pepsin ist.
14. 14. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die abgebaute Polypeptidfraktion die Unfähigkeit, mit spezifischen Antikörpern einen Niederschlag zu bilden und auszufallen, die Unfähigkeit, passive Hautanaphylaxie bei einem sensibilisierten Säuger zu erzeugen, die Unfähigkeit, Histamin aus sensibilisierten Mastzellen oder Basophilen freizusetzen, die Unfähigkeit, eine wesentliche Antikörper-Antwort hervorzurufen, die Fähigkeit, immunologische Reaktionen zwischen einem Vollallergen und seinem Antikörper signifikant zu inhibieren, und die Fähigkeit, antigen-spezifische Suppression zu erzeugen, besitzt.
15. 15. Verfahren zur Desensibilisierung eines Säugers gegenüber einer allergischen Reaktion, dadurch gekennzeichnet, daß einem atopischen Säuger, bevor oder nachdem er einem Antigen ausgesetzt wurde, eine Dosis einer Polypeptidfraktion verabreicht und die durch proteolytische enzymatische Digestion aus einem spezifischen Allergen, das die allergische Reaktion verursacht, gewonnene Polypeptidfraktion in einer Menge verabreicht wird, die zur signifikanten Inhibierung immunologischer Reaktionen, ohne bei dem Säuger Anaphylaxie hervorzurufen, wirksam ist, wobei die Fraktion im wesentlichen aus einem abgebauten Polypeptid mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 10.0 00 und einem nominalen

    Molekülradius von nicht mehr als etwa 15 A besteht.
16. 16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das spezifische Allergen native Pollen sind, ein natives Insektengift oder Nahrungsmittelprotein ist.
17. 17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das spezifische Allergen Ragweed-Pollen sind.
18. 18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das spezifische Allergen Insektengift-Phospholipase A ^ist·
19. 19. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das spezifische Allergen Ovalbumin ist.
20. 20- Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Polypeptidfraktion parenteral verabreicht wird.
21. 21. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Polypeptidfraktion gemäß Anspruch 1 einem atopi-3g sehen Säuger verabreicht wird.