DE3012204A1 - Antigen, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung - Google Patents

Antigen, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung

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DE3012204A1
DE3012204A1 DE19803012204 DE3012204A DE3012204A1 DE 3012204 A1 DE3012204 A1 DE 3012204A1 DE 19803012204 DE19803012204 DE 19803012204 DE 3012204 A DE3012204 A DE 3012204A DE 3012204 A1 DE3012204 A1 DE 3012204A1
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Description

DR. BERG DIPL.-IttG. STAPF DIPL.-ING. SCHWABE DR. DP.. SANDMAIÄ
PATENTANWÄLTE Postfach860245·8000München86 0 U I 2 20 H
■Λ-
Anwaltsakte: 30 799 Case: A 596
28. März 1980
The Wellcome Foundation Limited, London/Großbritannien
Antigen, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung.
030043/0713
■»(089)988272 Telegramme: Bankkonten: Hypo-Bank München 4410122850
988273 £ BERGSTAPFPATENT München (BLZ 700200U) Swift Code: HYPO DE MM
988274 jyi/tn TELEX: Bayet Vereinsbank Manchen 453100 (BLZ 70020270) 983310 0524560 BERG d Postscheck München 65343-808 (BLZ 70010030)
DR. BERG DIPL.-INC. STAPF
DIPL.-ING. SCHWABE DR. DR.'SANDMAIR-PATENTANWÄLTE
Postfach 860245 · 8000 München 86 3012204
Anwaltsakte: 30 799 Case: A 596
BESCHREIBUNG
Die Erfindung betrifft ein antigenes Material/ das
an Glykoproteinen angereichert ist, die man aus den Epimastigoten von T.cruzi erhält, ein Verfahren zur Herstellung dieses Antigens und dieses Antigen enthaltende Impfstoffe, die gegen die Chagas-Krankheit wirksam sind.
Die Chagas-Krankheit ist eine endemische Infektionskrankheit, die in verschiedenen Ländern Zentral- und Südamerikas verbreitet ist, insbesondere in Mexiko, Brasilien, Chile, Argentinien und Venezuela. Sie wird durch den osmotrophen Protozous Trypanosoma cruzi
verursacht, der durch die gemeine, blutsaugende Raubwanze an Wirbeltiere, wie Menschen, Haustiere, einschließlich Katzen und Hunde,sowie wilde Säugetiere übertragen wird. Die Chagas-Krankheit ist besonders gefährlich, da keine zufriedenstellenden prophylaktisch
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Bankkonten: Ilypo-Bank München 4410122850 (BLZ 70020011) Swift CoUe: HYPO DE MM Bayer. Vereinsbank München 453100 (BLZ 70020270) Postscheck Mttnchen 65343-808 (BLZ 7OOIOO8O)
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988273 BEROSTAPFPATEfJT München
988!. Jt TELEX:
983310 0524560 BERG d
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oder heilend wirksamen Mittel zur Verfügung stehen und der befallene Organismus, nachdem er die Krankheit aufgenommen hat, für die Lebensdauer infiziert ist.
Wegen des derzeitgen Mangels einer wirksamen Chemotherapie sind verschiedene Versuche unternommen worden, Impfstoffe zu entwickeln, mit denen eine Immunisierung gegen die die Chagas-Krankheit erreicht werden kann.
Es ist bekannt, daß T.cruzi in einer Vielzahl von verschiedenen morphologischen Stadien vorliegen können, die von ihrer Umgebung abhängen. In dem infizierten Säuger tritt T.cruzi in Form von Trypomastigoten und Amastigoten auf, während dieser Organismus in dem Uberträgerinsekt oder in einer axenischen Kultur in vitro einer Änderung in das Epimastigotenstadium unterliegen kann. In diesem letzteren Stadium läßt sich der Organismus relativ leicht züchten und wurde seit vielen Jahren für die Produktion von Antigenen für immunologische und diagnostische Studien verwendet.
Es wurden bereits verschiedene Methoden dazu verwendet, Antigene aus T.cruzi zu gewinnen. Die Antigene, die man durch mechanisches Aufbrechen der
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T.cruzi-Organismen durch Einfrieren und Auftauen, durch Verreiben mit oder ohne die Verwendung von Kügelchen, oder durch Ultraschalleinwirkung erhält, führen zu einem teilweisen Schutz von Mäusen gegen die akute Trypanosomiasis (P.Johnson und R.A.Neal, Nature 200 (1963) 83; F.C.Goble et al, J.Parasitol 50 (1964) (Supple) 19; und H.Seneca et al, Nature, 209 (1966) 309 - 310).
Im allgemeinen ließ sich zwar eine Verminderung der Parasitämie . jedoch nur eine geringe Steigerung der Überlebensdauer beobachten. Die fiomogenisiering der Epimastigoten von T.cruzi bei einem Druck von etwa 140 bar (140 atm) in einer Stickstoffatmosphäre bei genauer Temperaturkontrolle läßt die subzellulären Strukturen intakt und ermöglicht deren Isolierung (E.L. Segura et al, J.Protozool, 21, 571-574). Im Anschluß an diese Arbeit haben S.M.Gonzalez-Cappa et al (J.Parasitology, 62 (1976) 130) und E.L.Segura et al (loc.cit. 131) die Epimastigoten von T.cruzi durch Stickstoffkavitation aufgebrochen und das homogenisierte Material durch Zentrifugieren fraktioniert. Sie fanden, daß die Schutzwirkung eng verknüpft war mit der Geißel-Fraktion, die Mäusen eine Überlebenschance von 90% vermittelt. Die anderen Fraktionen zeigten ebenfalls eine gewisse Akti-
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vität, waren jedoch nicht so wirksam wie die Geißel-Fraktion.
Leider hat sich gezeigt, daß viele dieser Antigene, insbesondere die Geißel-Fraktionen, trotz der Tatsache, daß sie eine gewisse Immunität gegen die Chagas-Krankheit auszubilden vermögen, Symptome der Erkrankung verursachen können, die offenbar eine Folge von Auto-Immuneffekten sind (A.R.L.Texeira et al, Am.J.Pathol. 80 (1965) 163 bis 180). Aus diesem Grund ist es wahrscheinlich, daß einfache subzelluläre Fraktionen für Impfstoffe ungeeignet sind.
Seneca hat ein polysaccharidhaltiges Antigen beschrieben, das aus T.cruzi-Organismen gewonnen worden ist (Nature 209 (1966) 309) und das als "Chagas-Toxin" bekannt ist. Jüngere Untersuchungen haben gezeigt, daß Chagas-Toxin einen Komplex aus "Lipopeptidophosphoglykan" und verschiedenen anderen Komponenten darstellt (Colli et al, J.Protozool. 21 (1974) 575; FEBS-Letters 52 (1975) 188; Biochem, Biophys.Acta 444 (1976) 85; Eur.J.Biochem. 74 (1977) 263; und Gottlieb, J.Immunol. 119 (1977) 465), wobei diese Materialien jedoch keine Schutzwirkung gegen die experimentell erzeugte Chagas-Krankheit ausüben (Colli et al. Rev.Inst.Med.Trop. Sao Paulo 20 030043/0713
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(1978) 246 und Gottlieb, Mündliche Mitteilung während des International Congress of Protozoology, New York (1977)).
Von Goncalves und Yamaha (J.Trop.Med.Hyg. 72 (1969) 39 und Bergendi et al (Exp.Parasitol. 28 (1970) 258) ist ein lösliches Polysaccharid-Antigen isoliert worden, für das jedoch kein Hinweis bekannt ist, daß es eine Schutzwirkung gegen die Chagas-Krankheit ausübt.
Es besteht daher nach wie vor ein anhaltendes Bedürfnis nach einem gegen die Chagas-Krankheit wirksamen Antigen oder Impfstoff.
Es hat sich nunmehr gezeigt, daß Proteinfraktionen, die man aus in einer Kultur gezüchteten Epimastigoten erhält und die bestimmte Glykoproteine enthalten, dazu geeignet sind, eine Immunität gegen die Chagas-Krankheit zu induzieren.
Es scheint so zu schein, daß die bei der nachstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrensweise gebildete Glykoprotein-Fraktion frei von Determinanten ' der Kreuzprobe sind, von denen man annimmt, daß sie die Auto-Immunitätsphänomene verursachen, die man
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bei infizierten Individuen feststellt. Die Anwesenheit solcher Determinanten in Epimastigoten und Fraktionen davon kann in der Weise nachgewiesen werden, daß man einen Test durchführt/ der eine Wechselwirkung der Epimastigoten oder der Fraktionen davon mit Komponenten verdeutlicht, die Herzgewebe in den Antiseren von Patienten, die an chronischer Chagas-Krankheit leiden, zu erkennen vermögen.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Antigen, das aus T.cruzi-Organismen gewonnene Glykoproteine mit einem Molekulargewicht im Bereich von 6 bis 9,5 χ 1o^ enthält, welche Glykoproteine in Wasser im wesentlichen unlöslich sind und mit Lectinen in Wechselwirkung treten, die eine Affinität für Glucose, Mannose oder Galaktose aufweisen, wobei das Antigen im wesentlichen frei ist von nicht-proteinartigem Material.
Das Molekulargewicht der oben angepsprochenen Proteine kann bequem unter Verwendung von Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Techniken abgeschätzt werden (U.K.Laemmli, Nature (Lond.) 227 (1970) 680 bis 685).
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Das in dem erfindungsgemäßen Antigen enthaltene Glykoprotein ist in Wasser weitgehend unlöslich. Wenn man es jedoch mit Hilfe des nachstehend beschriebenen Verfahrens isoliert/ kann man die Glykoproteinfraktion mit bis zu 5 Gew.-% eines wasserlöslichen Materials nicht-proteinartiger Natur kombinieren.
Lectine sind proteinartige Materialien, die mit bestimmten Zuckerresten, zum Beispiel Glucoseeinheiten, in Wechselwirkung treten können, währenddem sie keine merkliche Wechselwirkung mit anderen " Zuckern zeigen. Daher kann man sie zur Unterscheidung der Arten von Zucker verwenden, die in einem -j5 Glykosid, wie einem Glykoprotein, enthalten sind. Die in dem erfindungsgemäßen Antigen enthaltenen Glykoproteine können mit jenen Lectinen in Wechselwirkung treten oder reagieren damit, die eine Affinität für Glucose-, Mannose- oder Galaktose-Reste aufweisen.
Das antigenwirksame Glykoprotein ist ein relativ wenig stabiles Molekül, das durch Proteasen abgebaut werden kann, die man ebenfalls in T.cruzi findet. Demzufolge muß man bei der Extraktion und der Reinigung des Antigens vorsichtig vorgehen.
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Gegenstand der Erfindung ist daher ebenfalls ein Verfahren zur Extraktion und Reinigung des oben angesprochenen erfindungsgemäßen Antigens, das dadurch gekennzeichnet ist/ daß man
a) Trypanosomen aus einer Kultur gewinnt oder erntet;
b) das Antigen löst bzw. solubilisiert; und
c) durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Lectinen mit einer Affinität für Glucose/ Mannose oder Galaktose im wesentlichen sämtliche nicht-glykoproteinartigen Proteine entfernt.
Man findet das Antigen in sämtlichen Stadien von T.cruzi, wenngleich es erfindungsgemäß bevorzugt ist/ das Antigen aus den Epimastigoten zu gewinnen, da man dieses Stadium am leichtesten züchten bzw. vermehren kann. Man züchtet die Epimastigoten mit Vorteil in Bone-and-Parents-Medium aus Trypomastigoten, die in einer Blutprobe enthalten sind, die man einem infizierten Tier entnommen hat. Man hält die Epimastigoten durch Serum-Passage in dem Medium mit 5% Kaninchenserum, Penicillin (200 Einheiten/ml) und Streptomycin (100 Einheiten/ml), wenngleich man auch andere Kulturmedien verwenden kann, wie das (modifizierte) Lit-Medium bei 28°C (Gutteridge et al, J.Protozoology 21 (1969) 5127). Man kann Trypomastigoten und Amastigoten aus infizierten Tieren
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oder durch Züchtung in vitro erhalten, beispielsweise unter Anwendung der Methode von Stohlman et al (Arch.Microbiol. 9 (1973) 301 bis 311).
Mit Vorteil kann man die Amastigoten in-vitro bei 370C in Gegenwart von Mäusemuskel-Sarkom-Zellen (mouse muscle sarcoma cell line 52) in dem von Dulbecco modifizierten Eagles-Medium, das 10% Kalbsfötenserum, Penicillin und Streptomycin enthält, ο züchten.
In der Stufe a) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann man die Trypanosomen mit Vorteil durch Zentrifugieren bei niedriger Drehzahl, vorzugsweise bei weniger als 8000 g«min gewinnen oder ernten, da stärkere Zentrifugalkräfte zu einem Abbau des Antigens führen. Vorzugsweise arbeitet man zwischen und 600 g während 10 Minuten und noch bevorzugter bei etwa 400 g während 10 Minuten. Die Zellen werden dann mit einer phosphatgepufferten Salzlösung (pH-Wert = 7,2) gewaschen.
Die Bedingungen des Zentrifugierens sind in g*min-Einheiten angegeben, das heißt in Werten, die dem Produkt aus der angewandten Kraft und der Einwirkungsdauer der Kraft entsprechen. Somit umfaßt ein
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Wert von 4000 g-min eine Behandlung bei 400 g während 10 Minuten ebenso wie eine Behandlung bei 2000 g während 2 Minuten und dergleichen, wobei diese Werte innerhalb annehmbarer Grenzen liegen sollten. Bestimmte Bedingungen haben sich als besonders vorteilhaft erwiesen und betragen beispielsweise 400 g während 10 Minuten.
In der Stufe b) kann man das Antigen durch Zugabe eines Detergens zu einer Suspension der Zellen in der phosphatgepufferten Salzlösung lösen oder solubilisieren. Es ist keine spezifische Zeitdauer oder Temperatur für den Lösungsvorgang erforderlich, wenngleich sich erwiesen hat,daß man für eine Suspension von 5 χ 10 Zellen pro Milliliter die Behandlung während 5 Minuten bei 00C durchführen sollte.
Man kann ionische oder nicht-ionische Detergentien verwenden. Die Verwendung von ionischen Detergentien kann jedoch die Bildung bei .DNA-Gelen fördern, so daß die nicht-ionischen Detergentien bevorzugt sind. Beispiele für nicht-ionische Detergentien sind Nonidet P 40, Triton X-100 und Brij 99 (Handelsnamen der Firmen Shell, Rohn und Hass Co. bzw. I.C.I.) und ein Detergens ^auf „4er ßrundlage von Polyoxy-
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äthylen-(12)-tridecylather (Renex 30 der Firma Honeywell Atlas Limited)/ das das bevorzugte Detergens darstellt. Man gibt das Detergens bis zu einer Endkonzentration zwischeni und 5% und vorzugsweise etwa 2% (Volumen/Volumen) zu.
Die anderen unerwünschten Proteine werden in der Stufe c) beispielsweise durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Lectinen (siehe bei-
^Q spielsweise M.J.Hayman und M.J.Crumpton, Biochem und Biophys Research Gomitis. 47 (1972) 923) , die eine Affinität für Glucose, Mannose oder Galaktose aufweisen, entfernt. Für diesen Zweck sind Concanavalin A oder aus Ricinis communis gewonnene Lectine geeignet.
Am bevorzugtesten ist das aus Lens culinaris erhaltene Lectin mit einer Affinität für Glucose und Mannose.
Die Lectine werden für ihre Verwendung in Affinitäts-Chromatographiesäulen vorbereitet, indem man das Protein an ein inertes Trägermaterial bindet, beispielsweise an mit Canogenbromid aktivierte Sepharose 4b. Nach dem Auftragen des in der Stufe b) erhaltenen Antigens auf die Affinitätschromatographiesäule wird das Nicht-Glykoproteinmaterial mit einer
das Detergens enthaltenden Elutionslösung durch die 030043/0713
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Kolonne gewaschen. Das Elutionsmittel kann mit Vorteil Puffer und Salze enthalten, wobei man vorzugsweise eine O/15m Natriumchlorid-Lösung und einen OfO1m Tris-hydrochloridpuffer mit einem pH-Wert von 7,4 verwendet, wenngleich man auf diese Materialien verzichten oder sie in anderen Konzentrationen einsetzen kann. Man kann auch aridere Puffer und Salze verwenden, vorausgesetzt, daß man extreme pH-Werte und hohe Salzkonzentrationen vermeidet. Man eluiert
.10 das gewünschte Glykoprotein aus der Säule durch Zugabe eines Zuckers in einer Konzentration von 1 bis 4%, vorzugsweise 2% (Gewicht/Volumen) zu dem Elutionsmittel, wobei man als Zucker Glucose, Mannose oder Derivate davon verwendet, wenngleich es bevorzugt ist, Methyl-mannosid zu verwenden. Alternativ kann man das Glykoprotein dadurch gewinnen, daß man das Lectin denaturiert, beispielsweise durch Verwenden einer konzentrierten Natriumdodecylsulfatlösung.
Man kann das Reinigungsverfahren durch die zusätzliche Maßnahme der Entfernung von Zellresten, Zelltrümmern oder Zellrückständen vor der Durchführung der Affinitätschromatographie verbessern. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, das Material bei etwa 450 000 g-min zu zentrifugieren. Vorzugsweise zentrifugiert man bei etwa 15 000 g während 30 Minuten,
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wenngleich man auch höhere oder niedrigere Zentrifugationsgeschwindigkeiten, die Kräfte bis herab zu etwa 3000g ergeben, während 30 Minuten anwenden kann. ... Alternativ kann man die Zellreste durch FiI-tration entfernen.
Man kann die Antigenausbeute dadurch steigern, daß man zu der Zellsuspension entweder vor der Durchführung der Stufe b) oder gleichzeitig mit der Zugabe
.-|Q des Detergens Proteaseinhibitoren zussetzt. Wenngleich man auf die Verwendung dieser Inhibitoren bei einer Produktion des Antigens in kleinem Maßstab verzichten kann, ist es in größerem Maßstab von Bedeutung, eine Proteolyse zu verhindern, da sonst die Hauptmenge des Antigens während der längeren Reinigungsprozedur zerstört wird. Die Proteaseinhibitoren schützen auch die Lectin-Affinitätschromatographiesäulen, wodurch es möglich wird, die Säulen wiederzuverwenden, die andernfalls durch die Proteasen geschädigt würden.
Es sind drei Klassen von Protease-Inhibitoren bekannt, nämlich jene, die die Proteasen ganz allgemein inhibieren, jene,die für Serin-Proteasen spezifisch sind und jene, die für Sulphydryl-Proteasen spezifisch sind. Beispiele für allgemein wirksame
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Inhibitoren sind Aprotinin, Metallenelatbildner/ wie Äthylendiamintetraacetat (EDTA), und Metallionen, wie Quecksilberionen oder Zinkionen. Inhibitoren von Serin-Proteasen schließen Tosyl-L-lysin-chlormethylketon-hydrochlorid (TLCK), Phenylmethylsulfon^ säurefluorid und Diisopropylfluorphosphat ein. Jodacetamid, Jodessigsäure oder p-Chlormercuribenzoat sind Beispiele für Sulphydryl-Protease-Inhibitoren. Es ist eine Vielzahl von Proteaseinhibitoren aus der Literatur bekannt; erfindungsgemäß bevorzugt sind jedoch Aprotinin, TLCK und Jodacetamid, die die bevorzugtesten Inhibitoren darstellen. Die empfohlenen Konzentrationen betragen für Aprotinin 2 bis 10 und vorzugsweise etwa 5 Einheiten/ml/ für TLCK 0,5 bis 2 mMol, vorzugsweise 1 inMol, und für'Jodacetamid 5 bis 20 mMol, vorzugsweise etwa 10 mMol.
Die Untersuchung der Reinheit des Antigens durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese zeigt ,daß das aus der Affinitätschromatographiesäule eluierte Glykoprotein eine Vielzahl von Komponenten mit einem geschätzten Molekulargewicht zwischen 6 und 9,5 χ 10 enthält. Das bevorzugteste Glykoprotein besitzt
4 ein Molekulargewicht von etwa 9 χ 10 , während die anderen Bestandteile des Antigens Fragmente dieses Glykoproteins sind. Man könnte das Antigen mit Hilfe
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bekannter Verfahrensweisen weiter reinigen; jedoch sind der Aufwand und die sich dadurch ergebenden Antigenverluste normalerweise nicht notwendig und überflüssig, da diese Glykoproteinfragmente ebenfalls ihre antigene Wirkung beibehalten.
Man kann das Antigen in der Form, in der es aus der Affinitätschromatographiesäule eluiert worden ist, verwenden oder man kann es weiterverarbeiten. So kann man das Material mit einem organischen Lösungsmittel, wie einem Alkohol, beispielsweise Äthanol, ausfällen und dann erneut in Teilchenform suspendieren oder durch Zugabe einer Detergenslösung solubilisieren oder lösen. Diese zusätzlichen Maßnahmen ergeben zwar ein reineres Antigen, führen jedoch auch zu einer Verminderung der Gesamtausbeute des Antigens.
Die Konzentration der Antigenlösungen kann beispielsweise spektrophotometrisch bestimmt werden. Geeigneterweise mißt man die Absorption bei 280 nm und bestimmt dann die Antigenkonzentration unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten, der bei einer Lösung von 1mg des Proteins pro Milliliter 1,2 beträgt.
Man kann das oben beschriebene erfindungsgemäße Antigen in einen Impfstoff, der ebenfalls Gegenstand der
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Erfindung ist/ einarbeiten, um eine Immunität gegen die Chagas-Krankheit in Wirtsorganismen, wie Säugern, einschließlich Menschen, zu erzeugen, die das Risiko laufen, von T.cruzi infiziert zu werden.Zu diesem Zweck kann man das Antigen mit einem pharmazeutisch geeigneten Trägermaterial, Bindemittel und/oder Hilfsstoff kombinieren.
Gegenstand dßr Erfindung ist daher auch ein Impfstoff -|q zur Induzierung einer Immunität gegen die Chagas-Krankheit, der gekennzeichnet ist durch das oben definierte erfindungsgemäße Antigen in Kombination mit einem pharmazeutisch geeigneten Trägermaterial, Bindemittel und/oder Hilfsstoff.
Pharmazeutisch annehmbare Trägermaterialien, Bindemittel und/oder Hilfsstoffe sind in diesem Fall flüssige Medien, die als Vehikel zur Einführung des Antigens in den Patienten verwendet werden können.
Ein Beispiel für ein solches Trägermaterial ist eine Salzlösung. Man kann das Antigen als Feststoff in dem Trägermaterial suspendieren oder kann es durch die Zugabe eines pharmazeutisch annehmbaren Detergens lösen oder solubilisieren.
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Der erfindungsgemäße Impfstoff kann weiterhin ein Adjuvans enthalten, das die Immunreaktion stimuliert und dadurch die Wirkung des Impfstoffs verstärkt. Erfindungsgemäß geeignete Adjuvantien sind das vollständige Freund"sehe Adjuvans und insbesondere Saponin-Corynebacterium parvum (Corparvax) und Aluminiumhydroxid oder eine Mischung aus diesen und anderen bekannten Adjuvantien.
Vorzugsweise formuliert man die Impfstoffe in der Weise, daß sie das Antigen in einer Endkonzentration im Bereich von 0,2 bis 5, vorzugsweise von 0,5 bis 2 und noch bevorzugter von etwa 1 mg/ml enthalten. Nach der Formulierung kann man den Impfstoff in einen sterilen Behälter einführen, der dann dicht verschlossen und bei niedriger Temperatur, beispiels weise bei 40C, gelagert wird, oder man kann das Material gefriertrocknen.
Um den Menschen gegen die Chagas-Krankheit zu immuni sieren, kann man eine oder mehrere Dosierungen des in der obigen Weise formulierten Impfstoffs verabreichen. Hierzu wird empfohlen, den Impfstoff in Dosierungen von 0,1 bis 2 ml, vorzugsweise 0,2 bis 1 ml und am bevorzugtesten etwa 0,5 ml einzusetzen.
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Gegenstand der Erfindung ist daher auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Antigens oder des erfindungsgemäßen Impfstoffs bei der Bekämpfung der Chagas-Krankheit in dafür empfänglichen Wirtsorganismen und insbesondere zur Erzeugung einer Immunität gegen diese Krankheit. Bei dieser Verwendung verabreicht man eine wirksame Menge des Impfstoffs an den zu behandelnden Wirtsorganismus. Die wirksame Menge des Impfstoffs ist daher die Menge, die dazu ausreicht, in dem Wirtsorganismus die Immunität gegen die Chagas-Krankheit zu erzeugen.
Die erfindungsgemäßen Impfstoffe werden mit Vorteil durch subkutane oder intramuskuläre Injektion ver- .
abreicht, wenngleich man sie auch intravenös geben kann. Die Behandlung kann darin bestehen, eine einzige Dosis des Impfstoffs zu verabreichen oder eine Vielzahl von Dosierungen während einer längeren Zeitdauer zu verabreichen. Ein bevorzugter Behandlungsplan umfaßt die Verabreichung von zwei Impfdosierungen in einem Intervall von 7 bis 56 und vorzugsweise 14 Tagen zwischen den Dosierungen. Wenn ein längerer Schutz erforderlich ist, kann man Auffrischungsdosierungen nach längeren Intervallen, beispielsweise nach einem Jahr, verabreichen.
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3Q122Q4 • 23.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
Beispiel 1
Extraktion und Reinigung des Antigens
• Man gewinnt Trypomastigoten aus einer Blutprobe eines infizierten Tieres und züchtet sie in einem flüssigen Bone- and Parents-Medium (G.J.Bone et al, J.Gen. Microbiol. 31 (1963) 261 bis 266), wobei man 5% Kaninchenserum, Penicillin (bis 200 Einheiten/ml) und Streptomycin (bis 100 Einheiten/ml) zugibt, wodurch sich die Trypomastigoten in Epimastigoten umwandeln, die durch Serum-Passage in dem Bone-and-Parents-Medium gehalten werden.
Man bildet Kulturen, die 1 χ 10 Epimastigoten pro Milliliter enthalten und inkubiert sie unter mäßiger Bewegung während 4 bis 7 Tagen bei 26°C in Glasflaschen, die 1000 ml des Mediums enthalten. Nach Ablauf der Züchtungsdauer enthält das Medium ca. 2 χ 108 Epimastigoten/ml. Man trennt die Epimastigoten durch Zentrifugieren bei 400 g während 10 Minuten von der überstehenden Flüssigkeit ab und wäscht sie mit einer phosphatgepufferten Salzlösung (mit einem pH-Wert von 7,2). Man suspendiert den Zentrifugenrückstand erneut in der phosphatgepufferten Salzlösung (pH-Wert = 7,2)
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(5 x 10 Epimastigoten/ml) und versetzt die Suspension mit einem Detergens (Renex 30) (bis 2% (Volumen/ Volumen)), Aprotinin (bis 5 Einheiten/ml), Tosyl-L-lysin-chlormethylketon-hydrochlorid (TLCK) (bis 1 mMol) und Jodacetamid (bis 10 mMol). Dann hält man die Suspension während 5 Minuten bei 00C und zentrifugiert sie (15 000 g während 30 Hinuten) zur Entfernung der Zellreste.
Dann trägt man die überstehende Flüssigkeit (200 ml, die das Produkt von 2 χ 10 Zellen enthält), oben auf eine Affinitätschromatographiesäule (2,5 χ 10 cm, die das an mit Cyanogenbromid aktivierte Sepharose 4b gebundene Lens culinaris-Lectin, das Glucose und Mannose bindet, in einer Menge von 10 mg Protein/ml Sepharose enthält) auf, die zuvor gut mit einer Detergenslösung (1% (Volumen/Volumen) Renex 30, 10 Säulen Volumen) gewaschen worden ist, die Natriumchlorid (0,15m) und Tris-hydrochlorid-Puffer (0,01m, pH-Wert = 7,4) enthält. Dann eluiert man das Antigen unter Verwendung einer Methylmannosid-Lösung (2% (Gewicht/Volumen)), die das Detergens (1% (Volumen/Volumen) Renex 30), Salz (0,15m Natriumchlorid) und den Puffer (0,01m Tris-hydrochlorid-Puffer mit einem pH-Wert von 7,4) enthält, bis kein weiteres Glykoprotein mehr eluiert wird
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(was sich durch die Absorption bei 280 nm feststellen läßt). Das Glykoprotein erscheint in den ersten 20 ml der aus der Säule eluierten Methylmannosidlösung.
5
Man fängt das Eluat auf und fällt das Antigen aus, indem man Äthanol (3 Volumen) zugibt und das Material während 48 Stunden bei -200C stehen läßt. Man gewinnt den Niederschlag durch Zentrifugieren bei 2500 g während 15 Minuten, wobei man 10 mg des Glykoproteins erhält.
Man bestimmt die Reinheit des Glykoproteins durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese. 15
Beispiel 2
Herstellung eines Impfstoffs
Man suspendiert den in Beispiel 1 erhaltenen Niederschlag in einer Salzlösung (0,9% (Gewicht/
Volumen)) und emulgiert mit einem gleich großen Volumen des vollständigen Freund'sehen Adjuvans. Der Impfstoff stellt eine 0,1%ige (Gewicht/Volumen) Suspension des Glkyoproteins dar.
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.46.
Beispiel 3
Pharmakologische Untersuchung
Man immunisiert Gruppen von 10 Mäusen (C57BL) durch intraperitoneale und/oder subkutane Verabreichung von 100 μΐ des Impfstoffs von Beispiel 2 an den Tagen 0 und 14. Die Kontrollmäuse bleiben entweder unbehandelt oder werden lediglich mit dem vollständigen Freund1sehen Adjuvans behandelt.
Am 28. Tag behandelt man die Mäuse mit 5 χ 10 Blutstrom-Trypomastigoten von T.cruzi. Sämtliche Kontrollmäuse starben (mit einer mittleren Überlebensdauer von 21 Tagen, wobei die maximale
Parasitämie .> 3 χ 10 Parasiten pro Milliliter Blut betrug),während die immunisierten Mäuse noch am Tage 61, an dem das Experiment beendet wurde, sämtlich am Leben waren. In dieser letzteren Gruppe betrug die maximale Parasitämie am Tage 21 5x10 Parasiten/Milliliter Blut, wobei nach dem Tage 38 keine mikroskopisch nachweisbaren Parasiten mehr feststellbar waren.
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Claims (10)

DR. BERG DIPL.-ING;. STAPF DIPL.-ING. SCHWABE DR^DR...SAN DMAIR PATENTANWÄLTE Postfach 860245 · 8000 München 86 V V Ί 2 2 V Anwaltsakte: 30 799 Case: A 596 PATENTANSPRÜCHE
1. Antigen, erhältlich aus T.cruzi-Organismen, dadurch gekennzeichnet/ daß es ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von
6 bis 9,5 χ 10 enthält, das in Wasser im wesentlichen unlöslich ist und mit Lectinen, die eine Affinität für Glucose, Mannose oder Galaktose aufweisen, in Wechselwirkung zu treten vermag; und daß das Antigen im wesentlichen fei ist von Nicht-Proteinmaterial .
2. Antigen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Glykoprotein ein
durch Gelelektrophorese über Polyacrylamid ermitteltes Molekulargewicht von etwa 9 χ 1Q^ aufweist.
3. Verfahren zur Extraktion und Reinigung des Antigens nach Anspruch 1, dadurch gekenn-
Bankkonten: Hypo-Bank München 4410122850 (BLZ 70020011) Swift Code: HYPO DE MM Buyer Vcreinsbiink München 453100 (BLZ 70020270) Postscheck München 65343-801 (BLZ 70010080)
©(089)988272 Telegramme: 988273 BERGSTAPFPATENT Manchen 988274 TELEX: 983310 0524560 BERO d
. The. We .!!come
A 596 ■-
a) Trypanosomen aus einer Kultur gewinnt,
b) das Antigen löst und
c) durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Lectinen, die eine Affinität für Glucose, Mannose oder Galaktose aufweisen, im wesentlichen sämtliche nicht-glykoproteinartigen Proteine entfernt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch g e 10. kennzeichnet, daß man vor der Durchführung der Stufe c) eine weitere Stufe zur Abtrennung von Zellresten durchführt.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 3 oder 4,
dadurch gekennzeichnet, daß man als Trypanosomen Epimastigoten verwendet.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Lösen des Antigens ein nichtionisches Detergens verwendet.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man in der Stufe c) Concanavalin A, das Lectin von Ricinis communis oder von Lens cullinaris mit
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einer Affinität für Glucose und Mannose verwendet.
8. Impfstoff zur Ausbildung einer Immunität gegen die Chagas-Krankheit, enthaltend ein Antigen nach Anspruch 1 in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägermaterial, Bindemittel und/oder Hilfsstoff.
9. Impfstoff nach Anspruch 8, dadurch g e 1Q kennzeichnet, daß er ein Adjuvans zur Stimulierung der Immunreaktion enthält.
10. Verwendung des Impfstoffs nach den Ansprüchen 8
oder 9 bei der Erzeugung der Immunität gegen die Chagas-Krankheit.
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