CH641681A5 - Verfahren zur herstellung von allergen enthaltenden substanzen. - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren, um neue Allergen enthaltende Substanzen herzustellen.

Etwa 15% der Bevölkerung von entwickelten Ländern leiden an Allergien gegenüber offenbar unschädlichen Substanzen in der Umgebung, beispielsweise Inhalationsstoffen (z.B. Pollen, Stäube und Federn, die für von aussen hervorgerufenes Asthma und Heufieber verantwortlich sind), verschiedene Nahrungsmitteln, Wolle, Arzneimittel usw. Allergische Patienten erzeugen im Gegensatz zu normalen Individuen Reagine gegen die antigenen (allergenen) Bestandteile, die in diesen Substanzen vorhanden sind.

Im allgemeinen soll die Bezeichnung «Antigen» eine Substanz bezeichnen, die dazu imstande ist, eine Immunantwort hervorzurufen. Üblicherweise handelt es sich hierbei auch um die Substanz, die zum Nachweis der entsprechenden Antikörper durch eines der vielen in vitro und in vivo durchgeführten immunologischen Verfahren verwendet wird, welche zum Nachweis von Antigen-Antikörper-Reaktionen verfügbar sind. In ähnlicher Weise wird die Bezeichnung «Allergen» dazu verwendet, um ein Antigen zu bezeichnen, das die Fähigkeit hat, Reagine zu induzieren und sich damit zu kombinieren. Diese Definition schliesst jedoch nicht die Möglichkeit aus, dass Allergene auch Antikörper von anderen Klassen als IgE induzieren können. Die hierin verwendete Bezeichnung «Antigenizität» ist als die Fähigkeit eines Antigens oder Allergens, sich in vitro mit den entsprechenden Antikörpern zu kombinieren, definiert. Die Bezeichnung «Allergenizität» oder Hautaktivität ist als die Fähigkeit eines Allergens, sich in vivo mit homologen Reaginen zu kombinieren, definiert, wodurch entweder beim direkten Hauttest oder bei passiven kutanen anaphylaktischen (PCA) Reaktionen eine systemische Anaphylaxie oder lokale Hautreaktionen ausgelöst werden. Die Bezeichnung «Immunoge-nizität» ist in einem beschränkten Sinne als die Fähigkeit eines Antigens oder Allergens, die entsprechende spezifische Antikörper-Antwort in vivo zu induzieren, definiert. Die hierin verwendete Bezeichnung «Tolerogenizität» soll die Fähigkeit einer allergenhaltigen Substanz, in vivo in spezifischer Weise die Immunantwort des entsprechenden nicht-modifizierten ursprünglichen Allergens im wesentlichen zu hemmen, bezeichnen. Hierin wird die Bezeichnung «tolerogen» synonym mit der Bezeichnung «immunohemmend» bzw. «immunosuppressiv» verwendet.

Reagine bzw. reaginische Antikörper haben unter allen Klassen von Immunoglobulinen die ausgeprägte Eigenschaft, an Gewebemastzellen und Basophilen von Individuen, die diese Antikörper aktiv erzeugen, oder von Individuen, denen ein allergenisches Serum injiziert wird, fixiert zu werden. Die Vernetzung der IgE-AntikörpermoIeküle, die an diese Zellen fixiert sind, durch das geeignete Allergen löst die Degranulierung dieser Zellen aus, woran sich die Freisetzung von pharmakologisch vasoaktiven Mitteln aus den Granulaten, z. B. Histamin, Bradykinin, der «slow reacting substance» der Anaphylaxie (SRS-A), des eosinophilen chemotaktischen Faktors der Anaphylaxie (ECF-A) und eines plättchenaktivierenden Faktors anschliesst. Diese Verbindungen führen zu allergischen Symptomen, d.h. zu systemischen oder lokalen entzündlichen Reaktionen, indem sie auf die Blutgefässe und das glatte Muskelgewebe einwirken. In schweren Fällen können diese Reaktionen zu einer Anaphylaxie führen.

Bei der derzeit angewendeten Therapie erfolgt eine langandauernde Injektionsreihe des angreifenden Allergens im Verlauf von vielen Jahren. Dieses muss aufgrund der inhärenten Allergenizität der Naturprodukte und der damit verbundenen Gefahr, dass sie systemische anaphylaktische Reaktionen auslösen, in kleinsten Dosen erfolgen.

Für eine sichere und wirksame Therapie ist es daher wesentlich, Derivate von natürlichen Allergenen zu bilden, die dazu imstande sein sollten, als Tolerogene zu wirken, indem sie die IgE-Antikörper-Antwort in immunologisch spezifischer Weise ausgeprägt hemmen, wenn nicht überhaupt beseitigen. Diese tolerogenen Derivate sollten weiterhin zwei zusätzliche Eigenschaften besitzen, nämlich 1. sie sollten nicht allergen sein, d.h. sie sollten nicht dazu imstande sein, sich in vivo mit den an die Mastzellen und Basophilen fixierten IgE-Antikörpern zu kombinieren, und sie sollten folglich nicht dazu imstande sein, anaphylaktische Reaktionen auszulösen, und 2. sie sollten nichtimmunogen sein, d.h. sie sollten nicht dazu imstande sein, bei wiederholten Injektionen eine Immunantwort gegenüber ihnen selbst zu induzieren.

Es wurde nun gefunden, dass dies in der Weise erreicht werden kann, dass man immunogene Allergene (z.B. Oval-bumin (OA) und die nichtdialysierbaren Bestandteile des wässrigen Extrakts von Ambrosiapflanzenpollen (RAG) und Hundealbumin) in tolerogene Derivate, die (bei Verabreichung ohne ein Adjuvans) gleichfalls praktisch nicht im-munogen und nicht allergen sind, umwandelt, indem man nichtimmunogene wasserlösliche Polymere kovalent an diese Allergene kuppelt.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Allergen enthaltenden Substanzen ist im vorangehenden Patentanspruch 1 charakterisiert.

Als nichtimmunogene wasserlösliche Polymere, die zur Herstellung der oben genannten Allergen enthaltenden Substanzen verwendet werden können, haben sich Polyäthylen-glykole, insbesondere solche mit einem Molekulargewicht von etwa 2000 bis 35 000, als sehr gut geeignet erwiesen. Die hierin verwendete Bezeichnung «Polyäthylenglykole» soll auch physiologisch annehmbare Derivate davon, z.B. die Mononiedrigalkyläther, vorzugsweise den Monomethyl-äther, umfassen, wobei geeigneterweise die Hydroxylgruppen am Ende der Moleküle in Verbindung mit der Kupplung verwendet werden.

Es können auch andere nichtimmunogene wasserlösliche Polymere verwendet werden, z.B. Polyvinylalkohole, Poly-vinylpyrrolidone, Polyacrylamide und Homopolymere von Aminosäuren.

Zur kovalenten Kupplung von solchen Polymeren an die Allergenmoleküle können alle Kupplungsmethoden ange2

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wendet werden, die normalerweise dazu eingesetzt werden, um biologisch aktive Materialien mit inerten Polymeren zu kuppeln. Solche Methoden sind z.B. die Kupplung mittels eines gemischten Anhydrids, Cyanurchlorid, Isothiocyanat, oder Umsetzung zwischen -SH-Derivaten und -CH2J-Deri-vaten. Für den Fachmann liegen andere Verfahren, die die gewünschte Kupplung ergeben, auf der Hand.

Die Kupplungsreaktion erfolgt zwischen aktiven Gruppen in den Allergenmolekülen und in den Polymermolekülen. Erforderlichenfalls müssen solche Gruppen in die Moleküle vor der Kupplungsreaktion eingeführt werden. Solche aktiven Gruppen sind z. B. -NH2, -NCS, -SH, -OH, -CH2J und -COOH. Sie können nach bekannten Methoden eingeführt werden, wenn sie in den Molekülen nicht von Anfang an vorhanden sind. Die Kupplung der Polymeren mit dem Allergen soll, wie oben ausgeführt, bis zu einem solchen Ausmass durchgeführt werden, dass die resultierenden Substanzen sowohl tolerogen (immunohemmend bzw. immuno-suppressiv) als auch im wesentlichen nichtallergen und nichtimmunogen sind. Der Konjugationsgrad der Polymermoleküle mit dem Allergenmolekül, der dieses Ergebnis ergibt, kann von Allergen zu Allergen variieren. Für den Fachmann ist es offensichtlich, wie im Einzelfall die notwendige Konjugation erhalten werden kann. Dies kann beispielsweise anhand von einigen orientierenden Vorversuchen durchgeführt werden, wobei man Reihen von Konjugaten mit unterschiedlichen Konjugationsgraden herstellt und den speziellen Bereich festlegt, in dem die oben genannten Erfordernisse erfüllt werden. Zu niedrige Konjugationsgrade führen zu allergenen und immunogenen Konjugaten. Anderseits ergeben zu hohe Konjugationsgrade Konjugate, die nichttolero-gen sind.

Erfindungsgemäss können tolerogene Derivate von prinzipiell allen Allergenen hergestellt werden, die für die üblichen AHergieformen beim Menschen und bei Säugetieren verantwortlich sind. Solche Allergene leiten sich z.B. von Tieren (insbesondere Haustieren, wie Hunden, Katzen, Kühen, Pferden usw.), Pollen von verschiedenen Gräsern und Bäumen, Insektengiften, Nahrungsmitteln, Hausstäuben, Milben und Schimmelorganismen ab.

Die erhaltenen Allergen enthaltenden Substanzen können in gefriergetrockneter Form gelagert werden.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert. Die Fig. 1 und 2 zeigen Diagramme, welche Testergebnisse beschreiben, die gemäss der vorliegenden Erfindung erhalten wurden.

Materialien und Methoden

Tiere: Durch Inzucht hervorgebrachte 8 bis 12 Wochen alte(C57BL/6 x DBA/2)Fj-Mäuse (als B6D2F] bezeichnet) und willkürlich gezüchtete Haubenratten wurden von North American Laboratories Supply Company, Gunton, Manitoba, gekauft.

Herstellung von Hapten-Protein-Konjugaten: Oval-bumin (OA) und Rinder-y-globuline (BGG) von Nutritional Biochemicals Co., Cleveland, Ohio, bzw. Calbiochem, San Diego, Calif., wurden zur Synthese von DNP3-OA- und DNP18-BGG-Konjugaten durch Reaktion mit Natrium-2,4-dinitrobenzolsulfonat (DNBS) in 0,2M-Na2C03-Lösung verwendet. Der 2,4-dinitrophenylierte Extrakt von Ascaris suum (DNP-Asc), der 6,5 x 10"8 M DNP pro mg Ase enthielt, wurde in der Weise hergestellt, dass 46 mg Asc mit 24 mg DNBS in Gegenwart von 46 mg Na2C03 im Gesamtvolumen von 5,5 ml destilliertem Wasser bei 37 °C 2 h lang umgesetzt wurden. Das nichtumgesetzte Hapten wurde durch Gelfiltration durch eine Säule aus Sephadex G-25 (Dextran, vernetzt mit Epichlorhydrin, Herstellerfirma Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden) entfernt.

Immunisierung und Messung der Immunantworten:

Für optimale Anti-DNP- und Anti-OA-IgE-Antworten wurden den Mäusen i.p. mit dem Standard eine niedrige Dosis von 1 ng dnp3-OA, suspendiert mit 1 mg frisch hergestellten Aluminiumhydroxids in 0,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), injiziert. Diese Dosis, wenn sie auf dem i.p.-Weg verabreicht wird, wird nachstehend als «Sen-sibilisierungsdosis» bezeichnet.

Die optimale IgE-Antwort, die für Ambrosiapflanzen (RAG)-Pollenallergene spezifisch war, wurde bei den Mäusen durch i.p.-Injektion in Gegenwart von 1 mg Al(OH)3 von 10 ng entweder RAG oder von AgE, das eine der gereinigten Komponenten von RAG darstellt, induziert. AgE war von Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey, erhalten worden. Die Mäuse wurden auch mit 10 |ig von DNP-Asc, vorgemischt mit 1 mg Al(OH)3 in 0,5 ml PBS, zur Induktion der Anti-DNP- und Anti-Asc-IgE-Antikörper sensibilisiert. Gruppen von 5 Mäusen wurden in identischer Weise behandelt. Die Seren der Mäuse jeder Gruppe wurden zur Bestimmung des durchschnittlichen Reagintiters durch passive kutane Anaphylaxie(PCA)-Be-stimmung gesammelt. Der Endpunkt der Titration wurde als reziproker Wert der höchsten Verdünnung jedes Serums, die eine Reaktion mit einem Durchmesser von 5 mm ergab, genommen. Die PCA-Titer für ein und dasselbe Reaginserum, die bei verschiedenen Ratten bestimmt worden waren, waren innerhalb eines Faktors von 2 reproduzierbar. Alle PCA-Ti-ter wurden als Mittelwert von zwei Bestimmungen angegeben. Das gemeinsame Vorliegen von Antikörpern von anderen Immunoglobulinklassen als den Reaginen in den Seren von immunisierten Mäusen wurde durch einen passiven Hämaglutinations(HA)-Test ermittelt.

Die Empfindlichkeit dieses Tests wurde als für diese Untersuchung angemessen angesehen, da dieser einen HA-Titer in der Grössenordnung von 1000 mit einem Standard-Kaninchen-Anti-DNP-Serum, das als Kontrolle für jeden HA-Test verwendet wurde, ergab.

Zur Induzierung von optimalen Anti-DNP- und Anti-OA-Antworten bei Chester-Beatty-Ratten wurden den Tieren i.p. 1 fig von DNP3-OA in 0,5 ml PBS, suspendiert mit 1 mg frisch hergestellten Al(OH)3 und 1010 Organismen von Bordetella-pertussis-Vaccin (Connaught Laboratories, To-tonto), injiziert. Die Titer der bei Mäusen und Ratten erzeugten IgE-Antikörper wurden durch einen passiven kutanen Anaphylaxie(PCA)-Test bei willkürlich gezüchteten Ratten mit ausdehnbarem Hals bestimmt.

Adoptive Zellübertragung:

Bei diesem Verfahren wurden die Milzzellen von sensibilisierten und tolerisierten Mäusen in röntgenbestrahlte (550 R) syngeneische Aufnehmer übertragen. Den Aufnehmern wurde die standardsensibilisierende Dosis des Antigens in Gegenwart von Al(OH)3 innerhalb von 4 h nach der Zellübertragung injiziert.

Beispiele 1 und 2

Zwei Ansätze Polyäthylenglykol (PEG von Baker Chemical Co., Phillipsburg, New Jersey) mit durchschnittlichen Molekulargewichten von 6000 und 20 000, nachstehend als PEG6 bzw. PEG20 bezeichnet, wurden an OA und RAG unter Verwendung von Cyanurchlorid als Kupplungsmittel nach einer Methode gekuppelt, die ähnlich der von R. Sharon et al. in J. Immunol. 114: 1585 (1975) beschriebenen Methode war.

Die OA-PEG6- und OA-PEG20-Konjugate wurden wie folgt hergestellt: jedes PEG (0,4 g), gelöst in 6 ml 0,5N-NaOH, wurde mit 0,1 g OA in 5 ml PBS vermischt und zu diesem Gemisch wurde tropfenweise unter konstantem Rüh5

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ren eine Lösung von Cyanurchlorid (0,2 g in 3 ml N,N'-Di-methylformamid) gegeben. Es wurde unter Rühren 2 h bei Raumtemperatur und weitere 24 h bei 4 °C umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde sodann gegen PBS dialysiert, um nichtumgesetztes Cyanurchlorid zu entfernen. Es wurde unter vermindertem Druck zu einem Volumen von 5 bis 7 ml eingeengt. Die Konjugate wurden sodann aus freiem PEG und OA durch Filtration durch eine Sepharose-4B-Säule von Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden, isoliert, wobei boratgepufferte Kochsalzlösung (BBS) als Eluierungsmittel verwendet wurde. Die OA-PEG-Konjugate waren hauptsächlich in den Fraktionen vorhanden, die dem Hohlraumvolumen der Säule entsprachen. Diese Fraktionen wurden gesammelt und konzentriert.

Die Herstellung von RAG-PEG6 und RAG-PEG20 erfolgte ähnlich wie die Herstellung der OA-PEG-Konjugate. Das Reaktionsgemisch bestand aus 0,1 g PEG6 oder PEG20 in 2 ml 0,5N-NaOH, 40 mg RAG in 5 ml PBS und 80 mg Cyanurchlorid in 1 ml N,N'-Dimethylformamid. Die RAG-PEG-Konjugate wurden ebenfalls, wie oben beschrieben, durch Filtration durch eine Sepharose-4B-Säule isoliert.

Biologische Versuche I. DNP-OA-System:

(A)Hemmung der Reaginantwort mit OA-PEG-Konjuga-

ten:

Um die Aktivität des OA-PEG6-Konjugats gegenüber der Bildung von Reagin zu testen, wurde 1 mg OA-PEG6 i.v. Mäusen 4 h injiziert, bevor diese mit einer Standardsensibili-sierungsdosis von 1 jxg DNP3-0A in Al(OH)3 am Tag 0 immunisiert wurden. Die Mäuse erhielten i.p. eine zweite Injektion des immunisierenden Antigens am Tag 28 ohne eine weitere Verabreichung des Konjugats. Eine Kontrollgruppe der Mäuse erhielt PBS anstelle des Konjugats. Die Reaginantworten, die für das Hapten und den Träger spezifisch sind, sind in dem Diagramm der Fig. 1 dargestellt. In diesem Diagramm sind die PCA-Titer auf der vertikalen Achse gegenüber dem in Wochen ausgedrückten Zeitraum auf der horizontalen Achse dargestellt. Die zwei oberen Kurven beziehen sich auf die Kontrollgruppe, während sich die zwei unteren Kurven auf die Testgruppe beziehen. Die voll ausgezogenen Linien zeigen Anti-DNP an, während die strichgepunkteten Kurven Anti-OA darstellen.

Wie aus Fig. 1 ersichtlich wird, erreichte die Kontrollgruppe maximale primäre IgE-Antworten sowohl gegenüber dem Hapten als auch gegenüber dem Träger 14 Tage nach der Sensibilisierung. Ausgeprägt verstärkte sekundäre Anti-DNP- und Anti-OA-IgE-Antworten wurden 7 Tage nach der zweiten Injektion der sensibilisierenden Dosis von DNP-OA ausgelöst, welche 4 Wochen nach der primären Immunisierung verabreicht wurde. Anderseits führte die Behandlung der Mäuse mit einer einzigen Injektion von OA-PEG6 am Tag 0 zu einer vollständigen Hemmung der primären IgE-Antworten sowohl gegenüber DNP als auch OA. Die sekun-. däre Immunisierung dieser Mäuse löste nur niedrige IgE-Antworten aus, die etwa 10% derjenigen entsprachen, welche bei den Kontrolltieren festgestellt wurden. Es wird daher ersichtlich, dass die Behandlung der Mäuse mit OA-PEG6 zu einer verlängerten Hemmung von OA-spezifischen T-Hel-ferzellen führt, die bei der Antwort auf DNP-OA beteiligt sind.

Zur Untersuchung der Frage, ob der beobachtete Hemmeffekt auf OA-PEG6 immunologisch spezifisch war, wurden den Mäusen 1 mg PEG6 i.v. 4 h injiziert, bevor sie die sensibilisierende Dosis von DNP-OA erhielten. Bei einer anderen Gruppe von Mäusen wurde PEG20 anstelle von PEG6 verwendet. Wie üblich enthielten die Kontrollmäuse nur die sensibilisierende Dosis von DNP-OA. Alle Mäuse erhielten am Tag 20 eine zweite sensibilisierende Dosis von DNP-OA. Aus den in Tabelle I aufgeführten Ergebnissen wird ersichtlich, dass keines der freien PEG6 oder PEG20 die Fähigkeit der Tiere, Reaginantworten zu erreichen, beein-s trächtigte. Es kann daher die Schlussfolgerung gezogen werden, dass die durch OA-PEG6 induzierte Hemmung tatsächlich für das an PEG6 gekuppelte Antigen spezifisch war.

(B) Spezifizität der Immunohemmung mit OA-PEG6:

io Um einen weiteren Beweis für die Spezifizität der beobachteten Hemmung von IgE-Antikörpern zu erbringen, erhielten Mäuse am Tag 04h vor der i.p.-Verabreichung von 1 [ig DNP-OA oder 10 \ig DNP-Asc in Al(OH)3 eine i.v.-Injektion von 0,8 mg OA-PEG6. Am Tag 28 erhielten diese 15 Tiere eine zweite i.p.-Injektion der gleichen Antigene in Al(OH)3. Bei diesem Versuch wurden auch zwei Kontroll-gruppen von Mäusen verwendet, die kein OA-PEG6 erhielten. Bei diesen erhielt eine Gruppe zwei sensibilisierende Dosen von DNP-OA am Tag 0 und am Tag 28 und die andere 20 Gruppe erhielt zwei Dosen von 10 jig DNP-Asc in Al(OH)3 an den gleichen Tagen.

Die in Tabelle II zusammengestellten Versuchsergebnisse stützen weiterhin die Spezifizität der Hemmung der IgE-Antworten gegenüber DNP und OA durch i.v.-Verabrei-25 chung von OA-PEG6. Es wird daher ersichtlich, dass Mäuse, die mit OA-PEG6 (Test A) behandelt worden waren, weder gegenüber DNP oder OA eine primäre IgE-Antwort erreichten, wenn sie gegenüber DNP-OA sensibilisiert worden waren, wobei die sekundäre Antwort gegenüber DNP-OA aus-30 geprägt niedriger war als bei den Kontrolltieren. Anderseits beeinträchtigte die Behandlung der Mäuse mit dem OA-PEG6-Konjugat nicht ihre Fähigkeit, eine IgE-Antikör-perantwort gegenüber dem nichtverwandten Antigen DNP-Asc zu erreichen, d.h. es lag kein signifikanter Unterschied 35 zwischen den IgE-Anti-DNP- und Anti-Asc-Antikörper-titern der Seren der Tiere in den Kontroll-B- und Test-B-Gruppen der Mäuse vor.

(C) Fähigkeit der OA-PEG-Konjugate, eine ablaufende Re-« aginantwort abzubrechen:

Dieser Versuch war dazu bestimmt, um die Möglichkeit zu untersuchen, durch Verabreichung von OA-PEG-Kon-jugaten eine ablaufende bzw. stattfindende Reaginantwort abzubrechen bzw. auszuschalten, welche mindestens 5 Wo-45 chen vor dem Versuch, sie zu hemmen, ausgebildet worden war. Das Schema der Injektionen und die PCA-Titer der Seren sind in Tabelle III zusammengestellt. Diese Werte zeigen, dass, während eine langandauernde und verstärkte IgE-Ant-wort gegenüber DNP und OA im Verlauf von 82 Tagen in so der Kontrollgruppe der Mäuse aufrechterhalten werden konnte, die eine zweite und dritte Sensibilisierungsdosis von DNP an den Tagen 40 und 68 erhalten hatten, die Verabreichung von drei i.v.-Injektionen täglich mit 0,8 mg OA-PEGe an den Tagen 37,38 und 39 an sensibilisierte Tiere eine sehr 55 ausgeprägte Verminderung der Fähigkeit dieser Mäuse ergab, Anti-DNP- und Anti-OA-IgE-Antworten nach der sekundären und tertiären Injektion zu erreichen.

Um zu beweisen, dass OA-PEG20 dazu imstande ist, eine ablaufende Reaginantwort gegenüber DNP-OA abzubre-60 chen, erhielten Mäuse, die am Tag 0 gegenüber DNP-OA sensibilisiert worden waren, eine Injektion von 1 mg OA-PEG20 am Tag 22 und eine i.p.-Verstärkungsinjektion der sensibilisierenden Dosis von DNP-OA am Tag 28. Die Kontrollgruppe der Mäuse erhielt nur die zwei sensibilisierenden 65 Injektionen von DNP-OA am Tag 0 und 28. Wie aus Tabelle IV ersichtlich wird, ergab die Behandlung der sensibilisierten Mäuse mit OA-PEG20 eine sehr ausgeprägte Hemmung der Reaginantworten sowohl gegenüber DNP und OA.

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Es wird daraufhingewiesen, dass die Anti-OA-IgE-Titer der Mäuse innerhalb von 2 Tagen nach der Verabreichung von OA-PEG6 oder OA-PEG20 (d.h. am Tag 24) hinsichtlich des Reaginspiegels in den Seren der Kontrolltiere nicht beeinträchtigt wurde. Dies zeigt, dass die Modifizierung von OA durch Konjugation mit PEG zu einer Maskierung oder radikalen Veränderung der Determinanten von nichtmodifi-ziertem OA führt, da sonst zu erwarten wäre, dass die Reagine, die in den Seren der Tiere vorhanden waren, die 24 Tage früher sensibilisiert worden waren, durch Injizierung der relativ grossen Dosis von OA-PEG-Konjugaten neutralisiert worden wären. Tatsächlich wurde diese Erklärung bei den untenstehend beschriebenen Versuchen bestätigt.

(D)Aufrechterhaltung der Nicht-Empfindlichkeit bei der adoptiven Übertragung:

Alle Donatoren der Milzzellen waren mit einer sensibilisierenden Dosis von DNP-OA 45 Tage vor dem Töten immunisiert worden. 9 Tage vor der Entfernung der Milze wurden diese Tiere in drei Gruppen aufgeteilt. Jede Gruppe erhielt eine i.v.-Dosis von 0,2 mg OA-PEG6 in 0,5 ml PBS oder von 0,8 mg OA-PEG6 in 0,5 ml PBS oder nur von 0,5 ml PBS. Alle Tiere wurden sodann getötet. Suspensionen mit 5 x 107 Milzzellen jeder der drei Gruppen wurden den aufnehmenden syngeneischen röntgenbestrahlten (550 R) Mäusen übertragen. Innerhalb von weniger als 4 h nach der Zellübertragung erhielten alle Aufnehmer eine i.p.-sensibili-sierende Dosis von DNP-OA. Die Anti-DNP- und Anti-OA-IgE-Antikörpertiter wurden über einen Zeitraum von 2 Wochen verfolgt.

Wie aus Tabelle 5 ersichtlich wird, waren die Reagin-spiegel innerhalb von 5 Tagen nach Injektion von OA-PEG6 in die intakten sensibilisierten Mäuse, die dazu bestimmt waren, zur Zellübertragung getötet zu werden, nur geringfügig vermindert worden. Nach einer adoptiven Übertragung der Milzzellen der Testmäuse, die mit OA-PEG6 behandelt worden waren, antworteten diese jedoch sehr schwach auf eine weitere sensibilisierende Dosis von DNP-OA, die röntgenbestrahlten Aufnehmern verabreicht wurde, im Vergleich zu den Milzzellen der Mäuse der Kontrollgruppe. Es kann daher die Schlussfolgerung gezogen werden, dass die Behandlung der sensibilisierten Mäuse mit OA-PEG6 zu einem Abbruch der Fähigkeit der Milzzellen dieser Tiere führte, eine Reaginantwort beim Wiederaussetzen einer weiteren sensibilisierenden Dosis des Antigens nach einer adoptiven Übertragung zu erreichen.

(E) Hemmung der hämagglutinierenden Antikörper mit OA-

PEG-Konjugaten:

Zusätzlich zu den hemmenden Effekten der OA-PEG-Konjugate auf die Bildung der Reagine wurden die Effekte dieser Konjugate auf die Bildung von hämagglutinierenden Antikörpern untersucht. Zu diesem Zweck erhielten die Mäuse eine i.v.-Injektion von 0,2 mg oder 1,0 mg von OA-PEG6 oder OA-PEG20 4 h vor der Verabreichung der sensibilisierenden Dosis von DNP-OA. Alle Mäuse erhielten eine zweite Injektion der sensibilisierenden Dosis 28 Tage" später. Wie aus den Ergebnissen der Tabelle VI hervorgeht, hatte keine der zwei OA-PEG-Zubereitungen einen signifikanten Effekt auf die Hämagglutinationstiter bei einer Dosis von 0,2 mg. Jedoch führte die Verabreichung der OA-PEG-Zubereitungen mit einer höheren Dosis von 0,8 mg zu einer niedrigen, aber signifikanten Hemmung der hämagglutinierenden Antikörper. Dieser Effekt war bei Anti-DNP-An-tikörpern stärker ausgeprägt als bei Anti-OA-hämaggluti-nierenden Antikörpern. Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass OA-PEG-Konjugate einen ausgeprägteren hemmenden Effekt auf die Zellen haben, die bei der Erzeugung von IgE-Antikörpern beteiligt sind, als auf die Bildung von IgM- und/oder IgG-Antikörper.

II. Ambrosiapflanzen-Allergensysterti:

(F) Abbruch der Reaginantwort auf RAG:

5 Es ist gezeigt worden, dass die optimale Bildung von Reaginen gegenüber RAG bei B6D2Fj-Mäusen durch Verabreichung von 10 Hg RAG, das mit 1 mg Al(OH)3 in 0,5 ml PBS suspendiert war, hervorgerufen wurde. Bei den unten beschriebenen Versuchen bestand jedoch die Standardsen-10 sibilisierungsdosis für die Induzierung der Reagine gegenüber Ambrosiapflanzenallergen aus 10 |xg RAG, gemischt mit i mg Al(OH)3 in 0,5 ml PBS. Bei einem Versuch, eine ablaufende Reaginantwort gegenüber RAG abzubrechen, erhielten sensibilisierte Mäuse 0,8 mg RAG-PEG6 oder 15 RAG-PEG20 am Tag 15. Die Testergebnisse sind in Fig. 2 zusammengestellt. In dieser ist der Anti-RAG-PCA-Titer auf der vertikalen Achse gegen die in Wochen ausgedrückte Zeit auf der horizontalen Achse aufgetragen. Die ausgezogen dargestellte Kurve bezieht sich auf die Kontrollgrup-20 pe. Die gestrichelt gezeichnete Kurve bezieht sich auf die RAG-PEG20-Gruppe und die strichgepunktete Kurve bezieht sich auf die RAG-PEGÖ-Gruppe. Wie aus Fig. 2 ersichtlich wird, führte eine Behandlung mit einem dieser zwei RAG-PEG-Konjugate zu einem Rückgehen der Anti-RAG-25 IgE-Antikörper. Die IgE-Antikörperspiegel fielen weiterhin ab, trotzdem eine zweite sensibilisierende Dosis von RAG am Tag 21 verabreicht wurde. Im Gegensatz dazu erreichten die Kontrolltiere eine typische sekundäre Reaktion.

Die Spezifizität des Hemmeffekts der RAG-PEG-Kon-30 jugate auf die Anti-RAG-Reaginreaktion wurde in dem in Tabelle VII dargestellten Versuch gezeigt. Während die Verabreichung einer zweiten sensibilisierenden Dosis von RÄG am Tag 34 nach der primären Immunisierung an Mäuse, welche am Tag 33 auf dem i.v.-Weg OA-PEG6 oder RAG 35 oder PBS erhalten hatten, eine gesteigerte IgE-Reaktion bzw. IgE-Antwort ergab (d.h. der Anti-RAG-PCA-Titer lag in der Gegend von 500), führte die Verabreichung der zweiten sensibilisierenden Dosis am Tag 34 an Tiere, die am Tag zuvor RAG-PEGe erhalten hatten, zu einer dramatischen 40 Verminderung des Anti-RAG-Reagin-Titers (d.h. der Anti-RAG-PCA-Titer fiel auf 60 ab). Weiterhin weist die Tatsache, dass die Verabreichung von 500 (ig der nichtkonjugier-ten RAG-Zubereitung ohne Al(OH)3 am Tag 33 die sekundäre Antwort, die am Tag 41 ermittelt wurde, nicht störte 45 (die das Ergebnis der Reinjektion der zweiten sensibilisierenden Dosis von RAG am Tag 34 an die Tiere war), darauf hin, dass der oben beobachtete Abfall des Anti-RAG-IgE-Antikörperspiegels nicht auf eine Neutralisation der IgE-Antikörper durch das injizierte Konjugat, sondern auf eine 50 Modulierung des immunologischen Systems der Tiere zurückzuführen war, die zu einer spezifischen Hemmung der Anti-RAG-IgE-Antwort führte. Es sollte auch beachtet werden, dass die i.v.-Verabreichung von 800 Hg RAG am Tag 28 (d.h. am gleichen Tag als die immunisierten Tiere auch eine 55 sekundäre sensibilisierende Dosis des Antigens erhielten) zu einer Verminderung des sekundären Anti-RAG-PCA-Titers am Tag 35 auf etwa 20 führte, was auf die Neutralisation von zirkulierenden IgE-Antikörpern zurückzuführen sein kann. Jedoch zeigten nicht einmal diese Tiere irgendwelche 60 Anzeichen einer Immunhemmung, da eine weitere Immunisierung mit einer dritten sensibilisierenden Dosis von RAG am Tag 56 zu einer normalen anamnestischen IgE-Antwort führte.

65 (G)Unvermögen von OA-PEG- und RAG-PEG-Konjuga-ten, PCA-Reaktionen hervorzurufen:

Die Allergenizität von OA-PEG-Konjugaten wurde unter Anwendung des PCA-Tests bei Ratten getestet. Zu die

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sem Zweck wurde 0,1 ml eines Standard-Maus-Reagin-serums mit bekanntem PCA-Titer (d.h. 1400), das durch i.p.-Immunisierung mit einer sensibilisierenden Dosis von DNP-OA erzeugt worden war, zweifach serienverdünnt. 50-Hl-Volumina dieser verdünnten Lösungen wurden i.d. in die rasierte Haut von willkürlich gezüchteten Haubenratten bzw. Ratten mit verlängerbarem Hals injiziert. 24 h nach der Sensibilisierung der Haut wurden verschiedenen Ratten i.v. 1,0-ml-Lösungen injiziert, welche verschiedene Mengen von nichtmodifizierten OA oder OA-PEG6 oder OA-PEG20 und 0,5% Evans-Blaufarbstoff enthielten. Die Ratten wurden 30 min später getötet und die PCA-Reaktionen wurden bestimmt.

Wie aus Tabelle VIII ersichtlich wird, löste 1 mg von nichtmodifiziertem OA eine starke PCA-Reaktion aus. Die Zugabe von nichtkonjugiertem PEG mit einem Molekulargewicht von entweder 6000 oder 20 000 zu OA störte die auf OA zurückgeführte PCA-Reaktion nicht. Im Gegensatz dazu waren sowohl OA-PEG6 als auch OA-PEG20, selbst wenn sie in erheblich höheren Mengen als das OA injiziert wurden (d.h. 10 bzw. 6 mg), nicht dazu imstande, eine signifikante Reaktion hervorzurufen bzw. auszulösen. Weiterhin zeigen die Versuche 8 und 9, dass Tiere, die keinerlei PCA-Reaktion zeigten, wenn sie entweder mit OA-PEG6 oder OA-PEGzo provoziert worden waren, gute Reaktionen bei einer Reinjektion mit 1 mg des nichtmodifizierten OA 20 min nach der primären Provozierung mit diesen Konjugaten zeigten. Diese Ergebnisse zeigen, dass OA-PEG-Konjugate nicht dazu imstande waren, sich mit Anti-OA-IgE-Antikörpern in vivo zu kombinieren und diese zu neutralisieren. Im Lichte dieser Erklärung kann davon ausgegangen werden, dass die minimale PCA-Reaktion (der Titer liegt in der Gegend von 60) im Versuch 5 mit einer Dosis von 10 mg OA-PEG6 beobachtet worden war, auf das Vorhandensein von OA-PEG6, das für die Provozierung verwendet worden war, von sehr geringen Mengen von nichtmodifiziertem OA oder von einigen OA-PEG-Konjugaten, die sehr wenig PEG-Moleküle pro Molekül OA enthalten und immer noch einige zugängliche antigene Determinanten besitzen, in der Zubereitung zurückzuführen ist. Auf der Grundlage aller dieser Ergebnisse kann gefolgert werden, dass das Unvermögen der PEG-Konjugate von OA, entweder eine PCA-Reaktion auszulösen oder die an die sensibilisierten Haut-stellen fixierten Anti-OA-Reagine zu neutralisieren, auf die Tatsache zurückzuführen war, dass die ursprünglichen an-tigenen Determinanten von OA in den OA-PEG-Konjugaten entweder unzugänglich waren oder radikal verändert worden waren.

Die Fähigkeit von RAG-PEG2Q, PCA-Reaktionen auszulösen, wurde in der oben beschriebenen Weise untersucht, wobei ein Maus-Anti-RAG-Reaginserum zur Sensibilisierung der Haut der Ratten verwendet wurde. Zur Provozierung der sensibilisierten Hautstellen wurde eine Lösung von RAG oder RAG-PEG20 (in Gegenwart von Evans-Blau-farbstoff) den Ratten i.v. injiziert. Die Ergebnisse dieser PCA-Tests sind in Tabelle IX zusammengestellt. Daraus 5 kann gefolgert werden, dass, obgleich die nichtmodifizierten RAG-Allergene eine starke PCA-Reaktion auslösen, das RAG-PEG20 nicht dazu imstande war, irgendeine PCA-Reaktion auszulösen. Die Ergebnisse dieses letzten Versuchs dieser Tabelle zeigen weiterhin, dass die Verabreichung von 10 RAG-PEG20 die Auslösung von PCA-Reaktionen bei der Reinjektion von nichtmodifiziertem RAG 20 min später an die Tiere nicht störte. Es kann daher gefolgert werden, dass das RAG-PEG20-Konjugat keine leicht zugänglichen antige-nen Determinanten besitzt, die von den nichtmodifizierten is RAG-Allergenen geteilt werden. Dieses Produkt war daher nicht dazu imstande, Mastzellen, die mit Anti-RAG-IgE-Antikörpern beschichtet worden waren, auszulösen.

(H)Unvermögen von OA-PEG-Konjugaten, eine Anaphylaxie bei Ratten zu induzieren, die mit OA sen-20 sibilisiert worden waren.

Die unten beschriebenen Versuche waren vorgesehen, um einen weiteren Beweis für das Unvermögen von OA-PEG-Konjugaten zu erbringen, sich in vivo mit Anti-OA-IgE-An-tikörpern zu kombinieren. Da Mäuse gegenüber Histamin 25 beständig sind, induziert eine Injektion des sensibilisierenden Antigens in Mäuse, die IgE-Antikörper gegen das entsprechende Antigen besitzen, nicht ohne weiteres eine Anaphylaxie. Es wurden daher Ratten, die gegenüber einer Anaphylaxie anfällig waren, ausgewählt, um zu testen, ob OA-PEG-30 Konjugate dazu imstande waren, sich in vivo mit Anti-OA-IgE-Antikörpern, die an Mastzellen fixiert waren, zu kombinieren und auf diese Weise eine anaphylaktische Reaktion auszulösen oder nicht. Zu diesem Zweck wurden Chester-Beatty-Ratten systemisch durch Immunisierung mit DNP-35 OA auf die oben beschriebene Weise sensibilisiert. Für systemische Reaktionen wurden 2 mg nichtmodifiziertes OA oder OA-PEG6 oder OA-PEG20 in 1 ml PBS i.v. jedem sensibilisierten Tier (6 h nach dem Blutablassen) verabreicht. Die Tiere wurden sorgfältig auf Effekte dieser Verbindungen 40 beobachtet. Alle sensibilisierten Ratten, die eine i.v.-Injek-tion von OA erhalten hatten, starben innerhalb von 15 bis 30 min an einem anaphylaktischen Schock. Im Gegensatz dazu waren weder OA-PEG6 noch OA-PEG20 dazu imstande, bei Verabreichung an die sensibilisierten Tiere irgendwel-45 che sichtbare Anzeichen von Unbehagen hervorzurufen. Diese Feststellungen, die in Übereinstimmung mit den oben im Abschnitt (G) berichteten Tatsachen stehen, zeigen zweifelsfrei, dass die PEG-modifizierten Antigene nicht dazu imstande waren, sich in vivo mit IgE-Antikörpern von aktiv 50 sensibilisierten Tieren umzusetzen, und dass sie daher nicht dazu imstande waren, eine anaphylaktische Reaktion auszulösen.

Tabelle I Unvermögen von freiem PEG, Reaginantworten zu hemmen

Gruppe

Behandlung TagO

Tag 28

primäre Immunisierung Tag Anti-DNP

PCA-Titer Anti-OA

sekundäre Immunisierung Tag Anti-DNP

Anti-OA

Kontrolle*

DNP-OA

DNP-OA

14

3470

2090

35

930

1620

42

1620

2470

Test A**

peg6

DNP-OA

14

3470

1600

35

1400

1400

plus

42

1700

2690

DNP-OA

Test B**

peg20

DNP-OA

14

2620

1410

35

980

1660

plus

42

1280

1520

DNP-OA

* Die Mäuse der Kontrollgruppe erhielten am Tag 0 und 28 jeweils eine sensibilisierende Dosis von DNP-OA.

** Am Tag 0 erhielten die Mäuse in den Testgruppen A und B 1 mg PEG6 oder PEG20 4 h vor der Verabreichung der sensibilisierenden Dosis von DNP-OA. Am Tag 28 erhielten sie nur eine Injektion der sensibilisierenden Dosis von DNP-OA.

7 641681

Tabelle II

Spezifität der Immunohemmung mit OA-PEG-Konjugaten

Gruppe Behandlung PCA-Titer

TagO Tag 28 primäre Immunisierung sekundäre Immunisierung

Tag Anti-DNP Anti-OA Anti-Asc Tag Anti-DNP Anti-OA Anti-Asc

Kontrolle A*

DNP-OA

DNP-OA

14

1000

1000

N.T.+

35

3310

3500

N.T.

42

1280

3020

N.T.

Test A**

OA-PEG6

DNP-OA

14

<10

<10

N.T.

35

80

480

N.T.

plus

42

480

860

N.T.

DNP-OA

Kontrolle B*

DNP-Asc

DNP-Asc

14

890

N.T.

200

35

1000

N.T.

1500

42

640

N.T.

840

Test B***

oa-peg6

DNP-Asc

14

600

N.T.

180

35

1650

N.T.

1700

plus

42

780

N.T.

640

DNP-Asc

* Die Mäuse der Kontrollgruppen A und B erhielten am Tag 0 und 28 jeweils eine sensibilisierende Dosis von DNP-OA oder 10 |ig von DNP-Asc in Al(OH)3.

** Die Mäuse der Testgruppe A erhielten eine i. v.-Injektion von 800 (ig OA-PEG6 4 h vor der Verabreichung der sensibilisierenden Dosis von DNP-OA am Tag 0. Sie wurden am Tag 28 mit der gleichen Dosis von DNP-OA provoziert.

*** Die Mäuse der Testgruppe B erhielten eine i.v.-Injektion von 800 (ig OA-PEG6 4 h vor der Sensibilisierung mit 10 (ig DNP-Asc in Al(OH)3 am Tag 0. Sie wurden mit der gleichen Dosis von DNP-Asc am Tag 28 provoziert.

+ N.T. = nicht getestet.

Tabelle III

Abbruch einer stattfindenden Reaginantwort mit OA-PEG6

Gruppe Behandlung PCA-Titer

Tag Verbindung primäre Immunisierung sekundäre Immunisierung

Tag Anti-DNP Anti-OA Tag Anti-DNP Anti-OA

Kontrolle

Test

0 40

68

37

38

39

40

68

DNP-OA DNP-OA

DNP-OA

DNP-OA

OA-PEG OA-PEG OA-PEG DNP-OA

DNP-OA

36

36

450

680

450

680

47 54

75 82

47 54

75 82

5750 3310

5750 3570

230 1400

800 760

7500 6450

12750 6800

1600 2050

2560 1800

Tabelle IV

Abbruch einer stattfindenden Reaginantwort mit OA-PEG20

Gruppe Behandlung PCA-Titer

TagO Tag22 Tag28 primäre Immunisierung sekundäre Immunisierung

Tag

Anti-DNP

Anti-OA

Tag

Anti-DNP

Anti-(

Kontrolle

DNP-OA

keine DNP-OA

14

1660

1280

35

1500

6610

21

850

1660

42

5120

5120

24

870

1620

Test

DNP-OA

OA-PEG2o DNP-OA

14

1660

1280

35

400

800

(0,8 mg)

21

850

1660

42

700

800

24

835

1660

641 681

8

Tabelle V

Aufrechterhaltung der Nicht-Empfindlichkeit bei der adoptiven Zellübertragung

Gruppe

Behandlung* der Donatormäuse

PCA-Titer**

(vor der Zellübertragung)

PCA-Titer***

(nach der Zellübertragung)

TagO

Tag 36

Tag

Anti-DNP

Anti-OA

Tag

Anti-DNP

Anti-OA

Kontrolle

DNP-OA

PBS

14

1280

1800

7

900

1500

36

850

1850

14

1280

1950

38

810

1960

41

810

2950

Test A

DNP-OA

OA-PEG6

14

1280

1800

7

40

320

(0,2 mg)

36

850

1850

14

80

370

38 41

710 760

1700 1600

TestB

DNP-OA

OA-PEGö

14

1280

1800

7

40

180

(0,8 mg)

36 38 41

850 350 400

1850 1280 1280

14

60

270

* Alle röntgenbestrahlten Aufnehmer erhielten eine sensibilisierende Dosis von DNP-OA innerhalb von 4 h nach Übertragung von 5 x 107 Milzzellen von der entsprechenden Donatorgruppe.

** Die PCA-Titer in diesem Abschnitt der Tabelle beziehen sich auf die Spiegel der Reagine in den Donatormäusen 14,36,38 und 41 Tage nach Sensibilisierung der Mäuse.

*** Die PCA-Titer in diesem Abschnitt der Tabelle beziehen sich auf die Spiegel der Reagine in den aufnehmenden Mäusen, bestimmt 7 und 14 Tage nach der adoptiven Übertragung.

Tabelle VI

Effekt von OA-PEG-Konjugaten auf die hämagglutinierenden Antikörperantworten

Gruppe

Behandlung*

Log2-

-HA-Titer**

am Tag 0

primäre Immunisierung

sekundäre Immunisierung

Tag

Anti-DNP

Anti-OA

Tag

Anti-DNP

Ànti-OA

Kontrolle

DNP-OA

7

4

2

35

8

9

14

6

5

42

8

10

Test A

OA-PEG6 (0,2 mg)

7

4

2

35

7

9

plus DNP-OA

14

4

6

42

7

10

TestB

OA-PEG6 (1,0 mg)

7

3

2

35

5

8

plus DNP-OA

14

3

4

42

5

8

Test C

OA-PEG20 (0,2 mg)

7

5

1

35

8

9

plus DNP-OA

14

6

5

42

7

11

Test D

OA-PEG20 (1,0 mg)

7

4

2

35

5

9

plus DNP-OA

14

3

2

42

5

9

* Zusätzlich zu der angegebenen Behandlung am Tag 0 erhielten alle Mäuse eine zweite sensibilisierenden Injektion von DNP-OA am Tag 28. ** Die HA-Titer wurden am Tag 7, 14, 35 und 42 nach der ersten Sensibilisierung der Mäuse bestimmt.

Tabelle VII

Spezifität der Immunohemmung mit RAG-PEG6

Gruppe

Behandlung* TagO

Tag 33

Tag 34

Anti-RAG-PCA-Titer am Tag 41

Kontrolle I Kontrolle II

Kontrolle III

Test

RAG RAG

RAG

RAG

pbs rag (500 Hg) oa-peg6 (500 Hg) rag-peg6 (500 Hg)

RAG RAG RAG RAG

480 560 500 60

* Alle vier Gruppender Tiere erhielten zwei sensibilisierende Dosen von RAG am Tag 0 und34. Am Tag 33 erhielt jede Gruppe i.v. die in der dritten Spalte angegebene Verbindung. Am Tag 41 wurde auf die Anti-RAG-Reagine getestet.

9

641681

Tabelle Vili Unvermögen von OA-PEG-Konjugaten, PCA-Reaktionen auszulösen*

Versuch zur Provokation ver injizierte

PCA-

Nr.

wendete Verbindung

Menge (mg)

Titer

1

oa

1

1400

2

oa

1

plus peg6**

3

1500

3

oa

1

plus peg6**

3

1500

4

oa-peg«

1

<10

5

oa-peg6

10

60

6

oa-peg20

1

<10

7

oa-peg20

6

<10

8

oa-peg6

1

<10

plus 20 min später oa

1

960

9

oa-peg20

1

<10

plus 20 min später oa

1

900

* Willkürlich gezüchtete Haubenratten wurden i.d. mit einem Maus-Anti-OA-Reaginserum sensibilisiert. 24 h wurden sie durch i. v.-Injektion der in Spalte 2 angegebenen Verbindungen zusammen mit Evans-Blaufarbstoff in PBS provoziert.

** Die nicht-konjugierten Zubereitungen von PEG6 und PEG20 wurden in der gleichen Lösung mit OA in Gegenwart von Evans-Blaufarbstoff injiziert.

Tabelle IX Unvermögen von RAG-PEG-Konjugaten, PCA-Reaktionen auszulösen*

Versuch zur Provokation ver-Nr. wendete Verbindung injizierte PCA-Menge (mg) Titer

RAG 1

RAG-PEG20 1

RAG-PEG20 1

plus 20 min später RAG 1

740 <10 <10 740

* Willkürlich gezüchtete Haubenratten wurden mit einem Maus-Anti-RAG-Reaginserum sensibilisiert. Sie wurden 24 h später durch i. v.-Injektion der in der Spalte 2 angegebenen Verbindung in Gegenwart von Evans-Blaufarbstoff provoziert.

Beispiel 3

Konjugate von Hundealbumin (DA) mit Monomethoxy-polyäthylenglykolen (m. PEG-OH) mit verschiedenen Molekulargewichten wurden nach der Mischanhydridmethode hergestellt. Diese Methode umfasste drei Stufen:

a) Herstellung von m.PEG-0-CCH2CH2C00H:

O

Zu einer Lösung von m.PEG-OH (0,8 mMol) in 20 ml s trockenem Pyridin wurden 800 mg (8 mMol) Bernsteinsäureanhydrid gegeben. Die Mischlösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum abgedampft. Der Rückstand wurde in 15 ml Benzol aufgelöst. Das Produkt wurde durch Zugabe von 20 ml vor-lo gekühlten Hexans ausgefallt. Der Niederschlag wurde sodann durch Filtration gesammelt und in destilliertem Wasser gelöst. Die wässrige Lösung wurde gegen destilliertes Wasser in Quantipore-gamma-Dialysebeuteln (abgeschnittenes Molekulargewicht: 4000; hergestellt von Quantimetrix Co., Cul-i5 ber City, California) dialysiert. Das Produkt wurde schliesslich lyophilisiert.

b) Herstellung von m.PEG-0-CCH2CH2C0C0CH2CH(CH3)2:

II II II o o o m.PEG-0-CCH2CH2C00H (0,4 mMol) wurde in O

25 10 ml Chloroform aufgelöst. Die Temperatur wurde bei 0 °C mit einem Eisbad gehalten. Trockenes Stickstoffgas wurde durch die Lösung geleitet. Triäthylamin (0,4 mMol) wurde zu der Lösung gegeben und sodann wurde tropfenweise Iso-butylchloroformiat (0,4 mMol) zugesetzt. 30 Die Reaktionslösungen wurden 30 min bei 0 °C gehalten und sodann unter Vakuum bei Raumtemperatur eingedampft. Der Rückstand wurde mehrmals mit Petroläther gewaschen. Es wurde ein weisses kristallines Produkt erhalten.

35 c) Konjugation von m.PEG-0-CCH2CH2C0C0CH2CH(CH3)2 mit Hun-

O

O O

dealbumin:

Hundealbumin (200 mg) wurde in 30 ml Boratpuffer (pH 40 9,6) aufgelöst. Die Temperatur wurde mit einem Eisbad bei 0°C gehalten. m.PEG-0-CCH2CH2C0C0CH2CH(CH3)2

O

O O

(in den in Tabelle X angegebenen Mengen) wurde portions-45 weise in festem Zustand zugesetzt. Die Reaktionslösung wurde 3 h bei 0 °C gerührt und sodann 16 h lang in einem Kühlschrank gelagert. Die Reaktionslösung wurde hierauf durch eine Sepharose-6B-Säule geleitet. Die Fraktionen, die Protein und kein freies m.PEG-Derivat enthielten, wurden so gesammelt und lyophilisiert. Freies m.PEG wurde durch Dünnschichtchromatographie festgestellt.

Tabelle X

Substanz Nr.

m. PEG-0-CCH2€H200H

II o

Molekulargewicht

Menge (mg)

Hundealbumin Ronjugat (DA)

Menge (mg) freie Amino-gruppen

Konjugationsgrad von PEG/DA

3a 2000 200

3b 2000 280

3c 2000 1000

3d 3500 500

3e 3500 870

3f 3500 1750

3g 3500 2500

200 50 13

200 42 21

200 23 36

200 54 9

200 45 15

200 29 33

200 23 35

641 681

Der Konjugationsgrad wurde durch Quantitation der Menge der m.PEG-Substituenten in dem modifizierten Hundealbumin durch NMR-Technik bestimmt. Die Anzahl der freien Aminogruppen wurde nach der o-Phthalaldehyd-Me-thode (A.R. Torres et al., Biochim. Biophys. Acta, Band 434 (1976), Seite 209) bestimmt. In Tabelle X ist der Konjugationsgrad als Anzahl von PEG-Molekülen pro ein Molekül DA angegeben.

Die so hergestellten Konjugate wurden auf die Allergenizität, die Tolerogenizität und die Antigenizität getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle XI zusammengestellt.

Die Tolerogenizität wurde nach den oben beschriebenen Methoden bestimmt. Der Tolerogenizitätsgrad entspricht der durchschnittlichen Verminderung der IgE-Titer nach der dritten Sensibilisierung, bezogen auf die Titer der Kontrolltiere, die nur die drei sensibilisierenden Dosen von DA erhielten. Eine Verminderung um einen Faktor von 6 bis 100 bedeutet eine gute Tolerogenizität.

Die Allergenizität wurde nach zwei Methoden bestimmt, nämlich einer Methode auf RAST-Grundlage und einem PCA-Neutralisationstest.

Bei der Methode auf RAST-Grundlage (Ref. Yman et al. Int. Whoiabs Symp. on standardization and control of aller-gens administered to man, Geneva, 1974; Develop. biol. Standard, Band 29, Seiten 151 bis 165 (Karger, Basel, 1975))

10

setzten sich die modifizierten Allergene mit einem Serum um, das allergenspezifisches IgE enthält. Der Überschuss von IgE setzt sich mit nichtmodifizierten Allergenen um, die kovalent an eine Papierscheibe gekuppelt sind. Radioaktiv 5 markierte Antikörper gegen IgE werden zugesetzt und diese bilden einen Komplex. Die Radioaktivität dieses Komplexes wird in einem gamma-Zähler gemessen. Die Zählung ist direkt dem Überschuss von IgE in dem Serum nach der Reaktion mit dem Extrakt proportional (vgl. die obigen Litera-io turreferenzen). Die Allergenpotenz des modifizierten Allergens wird als Prozentsatz zu derjenigen des nativen Hundealbumins (= 100%) ausgedrückt.

Die Antigenizität der modifizierten Allergene wird durch eine umgekehrte Einzelradialimmunodiffusion bestimmt. i5 Antiseren mit hohen Titern gegen die nichtmodifizierten Allergene wurden in Kaninchen gebildet. Die spezifische Präzi-pitatbildung wurde bei verschiedenen Konzentrationen von Allergenen verglichen, die in Agarose in Petrischalen eingearbeitet waren. Die relative Aktivität wurde aus der niedrig-20 sten Konzentration der modifizierten Allergene errechnet, die ein ausgeprägtes Präzipitat ergaben. Die minimalen prä-zipitatbildenden Konzentrationen von nichtmodifizierten Allergenen wurden als Standard verwendet. Die Antigenizität des Hundealbumins wurde als eine Aktivität von 100% 25 genommen.

Tabelle XI

Substanz Allergenizität Antigenizität Tolerogenizität

Nr. RAST % Neutralisation % von DA

% von DA von PCA

3a 64 80 100 30

3b 21 30 50 20

3c <3 0 <6 2

3d 77 90 50 30

3e <10 60 25 30

3f <5 0 <6 20

3g <2 0 <6 2

DA 100 100 100 50

s

2 Blatt Zeichnungen

Claims (4)

641681 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung von Allergene enthaltenden Substanzen, wobei diese Substanzen kovalente Konjugate der Allergenmoleküle mit nichtimmunogenen, wasserlöslichen Polymeren darstellen, dadurch gekennzeichnet, dass man nichtimmunogene, wasserlösliche Polymere bis zu einem solchen Ausmass an die Allergenmoleküle kovalent anheftet, dass die erhaltenen Konjugate sowohl tolerogen als auch im wesentlichen nichtallergen und nichtimmunogen gemacht werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer ein Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 2000 bis 35 000 ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer aus der Gruppe Polyvinylalkohole, Poly-vinylpyrrolidone, Polyacrylamide und Homopolymere von Aminosäuren ausgewählt wird.

4. Allergene enthaltende Substanzen, erhalten gemäss dem Verfahren nach Anspruch 1.