DK158359B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af et vandoploeseligt, ikke-immunogent, ikke-allergent allergen/polymer-konjugat, som er i stand til specifikt at haemme dannelse af reagine antistoffer - Google Patents

Analogifremgangsmaade til fremstilling af et vandoploeseligt, ikke-immunogent, ikke-allergent allergen/polymer-konjugat, som er i stand til specifikt at haemme dannelse af reagine antistoffer Download PDF

Info

Publication number
DK158359B
DK158359B DK364277A DK364277A DK158359B DK 158359 B DK158359 B DK 158359B DK 364277 A DK364277 A DK 364277A DK 364277 A DK364277 A DK 364277A DK 158359 B DK158359 B DK 158359B
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
rag
allergen
antibodies
dnp
pegg
Prior art date
Application number
DK364277A
Other languages
English (en)
Other versions
DK158359C (da
DK364277A (da
Inventor
Weng Yek Lee
Alec Sehon
Original Assignee
Pharmacia Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pharmacia Ab filed Critical Pharmacia Ab
Publication of DK364277A publication Critical patent/DK364277A/da
Publication of DK158359B publication Critical patent/DK158359B/da
Application granted granted Critical
Publication of DK158359C publication Critical patent/DK158359C/da

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/35—Allergens
    • A61K39/36—Allergens from pollen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/35—Allergens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6093—Synthetic polymers, e.g. polyethyleneglycol [PEG], Polymers or copolymers of (D) glutamate and (D) lysine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/805—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving IgE or IgD
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/81—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving autoimmunity, allergy, immediate hypersensitivity, delayed hypersensitivity, immunosuppression, immunotolerance, or anergy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

DK 158359B
Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte allergenholdige substanser, som er i stand til specifikt at hæmme dannelsen af reagine antistoffer rettet mod det pågældende allergen.
5 Ca. 15% af befolkningen i udviklede lande lider af allergier mod tilsyneladende uskadelige stoffer i omgivelserne, fx irihalanter (fx pollen, støv og fjer, som er ansvarlige for eksternt betinget astma og høfeber), forskellige fødevarer, uld og lægemidler. Allergiske patienter producerer, til forskel fra normale individer, reagine 10 antistoffer mod de antigene (allergene) bestanddele i disse stoffer.
Sædvanligvis betegner udtrykket "antigen" et stof med evne til at fremkalde et immunsvar, og i almindelighed er dette også det stof, som anvendes til at påvise tilsvarende antistoffer ved nogle af de mange in vitro- og in vivo-immunologiske fremgangsmåder, der er 15 tilgængelige til påvisning af antigen-antistof-vekselvirkning. På lignende måde anvendes udtrykket "allergen" til at betegne et antigen med evne til at fremkalde og forenes med reagine antistoffer; denne definition udelukker imidlertid ikke den mulighed, at allergener også kan fremkalde antistoffer af andre klasser end IgE. I nærværende 20 beskrivelse defineres udtrykket "antigenicitet" som evnen hos et antigen eller allergen til at forenes in vitro med tilsvarende antistoffer; udtrykket "allergenicitet" eller hudaktivitet som evnen hos et allergen til at forenes in vivo med homologe reagine antistoffer og derigennem udløse system-anafylaksi eller lokale hudreak-25 tioner, enten ved direkte hudtests eller ved passiv cutan anafylak-tiske (PCA) reaktioner; og udtrykket "immunogenicitet" i indskrænket betydning som evnen hos et antigen eller allergen til at fremkalde tilsvarende specifikke antistofsvar in vivo. Udtrykket "tolerogenici-tet" indebærer evnen hos et allergenholdigt stof til, på specifik 30 måde, i hovedsagen at hæmme immunsvaret in vivo på tilsvarende, ikke-modificerede oprindelige allergener; i denne sammenhæng anvendes udtrykket "tolerogen" afvekslende med udtrykket "immunosuppressiv".
Reagine antistoffer har den særlige egenskab blandt alle klasser af immunoglobuliner, at de fikseres til mastceller og basofiler hos de 35 individer, som aktivt producerer disse antistoffer, eller hos in- 2
DK 158359B
divider, i hvilke der injiceres et allergent serum. Tværbindingen af de IgE-antistofmolekyler, som er fæstnet til disse celler, med et vist allergen udløser degranulering af disse celler, hvilket efterfølges af frigørelse af farmakologisk vasoaktive stoffer fra granu-5 lerne, fx histamin, bradykinin, det langsomt reagerende anafylaksi-substans (SRS-A), en eosinofil kemotaktisk anafylaksi-faktor (ECF-A) og en blodpladeaktiverende faktor. Disse forbindelser fører til de allergiske symptomer, dvs. system- eller lokalinflammatoriske reaktioner, ved at virke på blodkarrene og det glatte muskelvæv; i svære 10 tilfælde kan disse reaktioner lede til anafylaksi.
Den for tiden anvendte terapeutiske fremgangsmåde omfatter en lang serie injektioner af de udløsende allergener i mange år, som må administreres i bestemte doser på grund af den iboende allergenicitet hos naturprodukterne og den dermed forbundne fare for, at de skal 15 udløse systemanafylaktiske reaktioner.
Til en sikker og effektiv terapeutisk fremgangsmåde er det derfor væsentligt at fremstille derivater af de naturlige allergener, som skal være i stand til at virke som tolerogener ved markant at undertrykke, om ikke helt ophæve, IgE-antistofsvaret på immunologisk 20 specifik måde. Endvidere skal disse tolerogene derivater have to yderligere egenskaber, idet de nemlig 1) skal være non-allergene, dvs. de skal ikke kunne forenes in vivo med de IgE-antistoffer, som er bundet til mastceller og basofiler, og derfor skal de ikke kunne udløse anafylaktiske reaktioner, og 1 2 3 4 5 6 2) de skal være non-immunogene, dvs. de skal ikke være i stand til at 2 fremkalde et immunsvar mod sig selv ved gentagne injektioner.
3
Det'er opfindelsens formål at fremstille sådanne derivater .
4
Det har nu vist sig, at disse mål kan opnås ved omdannelse af immuno 5 gene allergener (såsom ovalbumin (OA) og ikke-dialyserbare bestandde- 6 le i vandholdig ekstrakt af engbrandbæger-pollen (RAG) og hundealbumin) til tolerogene derivater, som selv er hovedsagelig non-immunogene (ved administration uden adjuvans) og non-allergene, ved cova- 3
DK 158359B
lent at koble non-immunogene vandopløselige polymerer til disse allergener.
Den foreliggende opfindelse angår således en analogifremgangsmåde til fremstilling af en i hovedsagen ikke-immunogen og ikke-allergen 5 substans, som er et covalent konjugat mellem: (i) et immunogent allergen og (ii) en non-immunogen vandopløselig polymer, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at polymeren, som er valgt blandt gruppen bestående af polyethylenglycoler, polyvinylalkoholer, 10 polyvinylpyrrolidoner, polyacrylamider og homopolymerer af aminosyrer bindes covalent til allergenet i en sådan udstrækning («= mængde), at konjugatet er i stand til specifikt at hæmme dannelse af reagine antistoffer rettet mod allergenet.
GB 1.469.472 (som svarer til DE 2 433 883) beskriver visse non-immu-15 nogene og non-allergene derivater af potentielt allergene immunogene substanser. Den store forskel mellem den foreliggende opfindelse og det i GB 1.469.472 beskrevne ligger i den tolerogene virkning hos de ifølge opfindelsen fremstillede substanser. I GB 1.469.472 gives absolut ingen antydning om, at det gennem hensigtsmæssig konjugering 20 er muligt at fremstille substanser, som er i stand til at hæmme allergiske reaktioner; tværtimod er formålet med modificeringen ifølge GB 1.469.472 udelukkende at mindske immunogeniciteten hos substanserne med bibeholdelse af terapeutisk virkning.
Chem. Abstr., 67 (1967) 106 927f, Chem. Abstr., 75 (1971) 149 980a, 25 Chem. Abstr., 85 (1976) 92 018t og GB 1.226.773 adskiller sig i grunden fra de ifølge den foreliggende opfindelse fremstillede substanser ved, at de beskriver konjugater, som er allergene. Konjuga-ternes allergene egenskaber gør dem uhensigtsmæssige til anvendelse som hæmmere af dannelse af specifikke reaginer hos pattedyr. 1
Som non-immunogene vandopløselige polymerer, der skal anvendes til fremstillingen ifølge opfindelsen af de ovenfor anførte allergen-holdige substanser, har især polyethylenglycoler med en molekylvægt 4
DK 158359B
på ca. 2000-35.000 vist sig at være meget anvendelige. Polyethyleng-lycoler omfatter i denne sammenhæng også fysiologisk tolerable derivater deraf, fx mono(lavere alkyl)ethere, fortrinsvis monomethylet-here, hvorhos hydroxygrupperne ved enden af molekylerne bekvemt 5 anvendes ved koblingen.
Til covalent kobling af polymererne til allergenmolekylerne kan anvendes alle koblingsmetoder, der normalt anvendes til kobling mellem biologisk aktivt materiale og inerte polymerer. Sådanne metoder er fx kobling ved hjælp af blandet anhydrid, cyanurchlorid, isothiocyanat, 10 reaktion mellem -SH-derivat og -CH2I-derivat. Det er imidlertid helt åbenbart for fagmanden at udforme andre metoder, som fører til den ønskede kobling.
Koblingsreaktionerne udføres mellem aktive grupper i allergenmolekylerne og i polymermolekylerne. Om nødvendigt må sådanne grupper 15 indføres i molekylerne før koblingsreaktionen. Sådanne aktive grupper er fx -ΝΗ2» "NCS, -SH, -OH, -CH2I og -C00H, og de kan indføres efter kendte metoder, hvis de ikke allerede forekommer i molekylerne.
Koblingen af polymererne til allergenet skal, som ovenfor anført, udføres i en sådan udstrækning, at de vundne substanser er tolerogene 20 (immunosuppressive) samt i hovedsagen non-allergene og non-immunogene. Den grad af konjugering af polymermolekyler til allergenmolekyler, som giver dette resultat, kan variere fra allergen til allergen.
Det er imidlertid klart for fagmanden, hvorledes den nødvendige konjugering skal opnås i hvert tilfælde ved fremstilling af serier af 25 konjugat med forskellige konjugeringsgrader og konstatering af det specielle område, inden for hvilket de ovenfor anførte krav er opfyldt. For lave konjugeringsgrader resulterer i allergene og immunogene konjugater, og for høje konjugeringsgrader resulterer i kon-jugater, som ikke er tolerogene. 1 2 3 4 5 6
Ifølge opfindelsen er det hensigtsmæssigt at fremstille tolerogene 2 derivater af i hovedsagen alle allergener, som er ansvarlige for de 3 sædvanlige former af allergi hos mennesker og andre pattedyr. Sådan 4 ne allergener stammer fra fx dyr (især husdyr såsom hunde, katte, 5 køer og heste), pollen fra forskellige typer græs og træer, insekt- 6 gifte, fødevarer, husstøv, mider og skimmelsvampe.
5
DK 158359B
De ifølge opfindelsen fremstillede allergeriholdige substanser anvendes fortrinsvis i form af opløsninger i saltopløsning eller i en fysiologisk tolerabel puffer. Sådanne opløsninger kan administreres parenteralt, og fortrinsvis administreres de intravenøst eller intra-5 muskulært. Administrationerne kan gentages med passende intervaller.
De allergeriholdige substanser kan opbevares i frysetørret form.
Opfindelsen belyses i de nedenfor anførte eksempler og tabeller og med henvisning til de vedlagte tegninger, i hvilke fig. 1 viser PCA-titer som funktion af tid (uger), og 10 fig. 2 viser anti-RAG-PCA-titer som funktion af tid (uger).
Materiale og metoder.
Dyr. 8-12 uger gamle, indavlede (C57BL/6 x DBA/2)F^-mus (betegnet som BgD2Fi) og ikke-indavlede pigmenterede rotter indkøbt fra North American Laboratories Supply Company, Gunton, Manitoba, Canada.
15 Fremstilling af hapten-protein-konjugat.
Ovalbumin (OA) og bovin-7-globuliner (BBG) fra Nutritional Biochemi-cals Co., Cleveland, Ohio, USA, henholdsvis Calbiochem, San Diego, Californien, USA, er anvendt til syntese af DNPg-OA og DNP^g-BGG-konjugat ved omsætning med natrium-2,4-dinitrobenzensulfonat (DNBS) i 20 0,2M Na2C03-opløsning. Det 2,4-dinitrophenylerede ekstrakt af Ascaris suum (DNP-ASc), som indeholder 6,5 x 10"® M DNP/ mg Ase, er fremstillet ved omsætning af 46 mg Ase med 24 mg DNBS i nærværelse af 46 mg Na2C03 i et totalt rumfang på 5,5 ml destilleret vand ved 37°C i 2 timer. Ikke-reageret hapten elimineres ved gelfiltrering gennem en 25 kolonne af "Sephadex"® G-25 (dextran tværbundet med epichlorhydrin, fra Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverige).
Immunisering og måling af immunsvar.
6
DK 158359B
Til opnåelse af optimale anti-DNP- og anti-OA-IgE-svar injiceredes til mus intraperitonealt den lave standarddosis på 1 /xg DNP3-OA suspenderet i 1 mg frisk fremstillet aluminiumhydroxid i 0,5 ml phosphat-pufret saltopløsning (PBS). Denne dosis administreret ad 5 intraperitoneal vej kaldes herefter sensibiliseringsdosis.
Det optimale specifikke IgE-svar for pollenallergener fra engbrand-bæger (RAG) fremkaldtes hos mus ved intraperitoneal injektion i nærværelse af 1 mg Al(OH)3 af 10 μ% af enten RAG eller AgE, som er en af de rensede komponenter i RAG; AgE indkøbtes fra Worthington Bio-10 chemical Corporation, Freehold, New Jersey, USA. Mus sensibiliseredes også med 10 £tg DNP-Asc forblandet med 1 mg Al (OH) 3 i 0,5 ml PBS før inducering af anti-DNP- og anti-Ase-IgE-antistoffer. Grupper på 5 mus blev behandlet på identisk måde, og serum fra musene inden for hver gruppe blev slået sammen til bestemmelse af den gennemsnitlige reagi-15 ne titer ved passiv cutan anafylakse(PCA)-analyse. Slutpunkterne ved titreringerne blev valgt som den reciprokke værdi for den højeste fortynding af hvert serum, som resulterede i en reaktion med en diameter på 5 mm. PCA-titerne for ét og samme reagine serum bestemt på forskellige rotter var reproducerbare inden for en faktor 2; alle 20 PCA-titrer er angivet som middeltal af to bestemmelser. Samtidig forekomst af antistoffer fra andre immunoglobulinklasser end reaginer i serum af immuniserede mus blev konstateret gennem passiv hæmagglu-tination-(HA)-analyse.
Følsomheden ved denne analyse blev anset for at være fuldt tilstræk-25 keligt til denne undersøgelse, eftersom den gav en HA-titer af størrelsesordenen 1000 med en kanin-standard-anti-DNP-serum anvendt som kontrol i hver HA-test.
Til inducering af optimale anti-DNP- og anti-OA-svar i Chester Beatty-rotter blev der til disse dyr injiceret intraperitoneaLt 1 μ& 30 DNP3-OA i 0,5 ml PBS suspenderet med 1 mg frisk fremstillet A1(0H)3 og 10“ organismer fra en Bordetella pertussis-vaccine (Connaught Laboratories, Toronto, Canada). Titerne for IgE-antistoffer fremkaldt i mus og rotter blev målt ved passiv cutan anafylakse(PCA)-analyse i ikke-indavlede, pigmenterede rotter.
7
DK 158359B
Adoptiv celleoverførsel.
Denne fremgangsmåde bestod i overførsel af miltceller fra sensibiliserede og toleriserede mus til røntgenbestrålede (550 R) syngenetiske modtagere og injicering af modtagerne med standard-sensibiliserings-5 doser af antigen i nærværelse af Al(OH)3 inden for 4 timer efter celleoverførslen.
Eksempel 1-2.
To ansatser polyethylenglycol (PEG, fra Baker Chemical Co., Phillips -burg, New Jersey, USA) med middelmolekylvægter omkring 6000 og 10 20.000, herefter kaldet henholdsvis PEGg og PEG20, blev koblet til OA
og RAG ved anvendelse af cyanurchlorid som koblingsmiddel ved hjælp af en metode i lighed med den, som er beskrevet af R. Sharon et al., J. Immunol. 114:1585 (1975).
OA-PEGg- og 0A-PEG20'konjugaterne blev fremstillet på følgende måde: 15 Den ene PEG (0,4 g) opløst i 6 ml 0,5N NaOH blev blandet med 0,1 g OA i 5 ml PBS, og en opløsning af cyanurchlorid (0,2 g i 3 ml N,N'-dimethylformamid) blev tilsat dråbevis under konstant omrøring til denne blanding. Reaktionen fik lov at forløbe under omrøring ved stuetemperatur i 2 timer og i yderligere 1 døgn ved 4°C. Reaktions-20 blandingen blev derefter dialyseret mod PBS til eliminering af alt ikke-omsat cyanurchlorid og inddampet ved reduceret tryk til et rumfang på 5-7 ml. Konjugaterne blev derefter isoleret fra fri PEG og OA ved filtrering gennem en "Sepharose" ® 4B-kolonne (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverige) ved anvendelse af boratpufret saltop-25 løsning (BBS) som elueringsmiddel. OA-PEG-Konjugateme forelå i overvejende grad i de fraktioner, som svarede til kolonnens frie kanalrumfang; disse fraktioner blev sammenhældt og koncentreret.
Måden at fremstille RAG-PEGg og RAG-PEG20 lignede den, som er beskrevet for OA-PEG-konjugat, dvs. reaktionsblandingen bestod af 0,1 g 30 af enten PEGg. eller PEG20 i 2 ml 0,5N NaOH, 40 mg RAG i 5 ml PBS og 80 mg cyanurchlorid i 1 ml N,N'-dimethylformamid. RAG-PEG-Konjugater- 8
DK 158359B
ne blev ligeledes isoleret ved filtrering gennem en "Sepharose"® 4B-kolonne som beskrevet ovenfor.
Biologiske forsøg: I. DNP-OA-System.
5 (A) Hæmning af reagint antistofsvar med OA-PEG-konjugat.
For at afprøve virkningen af OA-PEGg-konjugat på dannelse af reagine antistoffer blev 1 mg 0A-PEG6 injiceret intravenøst i mus 4 timer, før de blev immuniseret med standardsensibiliseringsdoser på 1 /xg DNP3-OA i Al(OH)3 på dag 0. Musene fik intraperitonealt en anden 10 injektion af det immuniserende antigen på dag 28 uden yderligere administration af konjugatet. En kontrolgruppe af mus fik PBS i stedet for konjugatet. De reagine antikropsvar, der var specifikke for haptenet og bæreren, er illustreret i diagrammet i fig. 1, i hvilket PCA-titerne på ordinataksen er afsat som funktion af tiden, 15 udtrykt i uger, på abscisseaksen. De to øverste kurver refererer til kontrolgruppen, medens de to nederste kurver repræsenterer testgruppen. De kurver, der er optegnet med fulde linjer, angiver anti-DNP, medens de stiplede kurver repræsenterer anti-OA.
Som det fremgår af fig. 1 fremkaldte kontrolgruppen maksimale primære 20 IgE-svar på såvel haptenet som bæreren 14 dage efter sensibiliseringen, og markant forøgede sekundære anti-DNP- og anti-OA-IgE-svar blev frembragt 7 dage efter den anden injektion af sensibiliseringsdosen DNP-OA, som blev administreret 4 uger efter den primære immunisering.
På den anden side resulterede behandlingen af mus med en enkelt 25 injektion af OA-PEGg på dag 0 i fuldstændig undertrykkelse af de primære IgE-svar på både DNP og OA, og den sekundære immunisering af disse mus frembragte kun lave IgE-svar svarende til ca. 10% af de svar, som blev registreret for kontroldyrene. Det er således klart, at behandling af mus med OA-PEGg fører til en forlænget undertrykkel-30 se af OA-specifikke T-hjælpeceller involveret i svaret på DNP-OA.
9
DK 158359B
For at undersøge, om den observerede hæmmende effekt på OA-PEGg var immunologisk specifik, blev der til musene injiceret 1 mg PEGg intravenøst, 4 timer inden de fik den sensibiliserende dosis DNP-OA. I en anden gruppe mus blev PEGg erstattet med PEG20· Som sædvanlig fik 5 kontrolmusene kun sensibiliseringsdoser DNP-OA. Alle mus fik på dag 20 en yderligere sensibiliseringsdosis DNP-OA. Af de i tabel I angivne resultater er det klart, at hverken frit PEGg eller PEG20 påvirkede dyrenes evne til at fremkalde reagine antistofsvar, og der kan derfor drages den slutning, at den hæmning, som fremkaldtes af 10 OA-PEGg, virkelig var specifik for det til PEG koblede antigen.
(B) Specificiteten for immunosuppression med OA-PEGg.
For yderligere at give bevis for specificiteten i hæmningen af IgE-antistoffer fik mus på dag 0 en intravenøs injektion af 0,8mg OA-PEGg 4 timer før intraperitoneal administration af 1 /ig DNP-OA eller 10 jig 15 DNP-Asc i A1(0H>3· På dag 28 fik disse dyr en yderligere intraperitoneal injektion af samme antigener i Al(OH)3. To kontrolgrupper med mus, som ikke fik OA-PEGg, blev inkorporeret i dette forsøg, dvs. en gruppe fik to sensibiliseringsdoser DNP-OA på dag 0 og dag 28, og den anden gruppe to doser 10/ug DNP-Asc i Al(OH)3 samme dage.
20 De i tabel II sammenfattede resultater underbygger yderligere specificiteten for hæmning af IgE-svarene på både DNP og OA ved intravenøs administration af OA-PEGg. Således fremgår det utvetydigt, at der hos mus, der var behandlet med OA-PEGg (test-A), ikke fremkom noget primært IgE-svar, hverken på DNP eller OA, når de blev sensibiliseret 25 mod DNP-OA, og sekundærsvaret på DNP-OA var markant lavere end kontroldyrenes. På den anden side påvirkede behandlingen af musene med OA-PEGg-konjugat ikke deres evne til at fremkalde et IgE-antistofsvar på det ubeslægtede antigen DNP-Asc, dvs. der var ingen signifikant forskel i IgE-anti-DNP- og -anti-Asc-antistoftiterne for sera fra dyr 30 i kontrolgruppen B og testgruppen B.
(C) 0A-PEG-Konjugatets evne til at ophæve et værende reagint antistofsvar.
10
DK 158359B
Dette forsøg udføres for at studere muligheden for gennem administration af OA-PEG-konjugat at ophæve et reagint antistofsvar, som er fastslået mindst 5 uger før forsøget på at undertrykke det. Skemaet for injektioner og PCA-titre for seraene er angivet i tabel III.
5 Disse værdier viser, at medens et langvarigt og forøget IgE-svar på DNP og OA kunne opretholdes i 82 dage i kontrolgruppen af mus, som havde fået en anden og tredje sensibiliseringsdosis af DNP på dag 40 og dag 68, resulterede administration af tre intravenøse injektioner pr. dag af 0,8 mg OA-PEGg på dag 37, 38 og 39 i sensibiliserede mus i 10 en meget markant nedgang i disse dyrs evne til at fremkalde anti-DNP-og anti-OA-IgE-svar efter sekundære og tertiære injektioner.
For at bestyrke, at OA-PEG20 skulle være i stand til at ophæve et værende reagint antistofsvar på DNP-OA, fik mus, som på dag 0 blev sensibiliseret mod DNP-OA, på dag 22 en injektion af 1 mg OA-PEG20 °g 15 på dag 28 en intraperitoneal boosterinjektion af sensibiliserings- dosen DNP-OA. Kontrolgruppen af mus fik kun de to sensibiliseringsinjektioner DNP-OA på dag 0 og 28. Som det fremgår af tabel IV resulterede behandlingen af sensibiliserede mus med OA-PEG20 i en meget udpræget hæmning af de reagine antistofsvar på både DNP og OA. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Det skal understreges, at anti-OA-IgE-titerne for musene inden for 2 2 dage efter administration af enten OA-PEGg eller OA-PEG20 (dvs. dag 3 24) ikke blev påvirket i relation til niveauet for reagine antistof 4 fer i kontroldyrenes sera. Dette tyder på, at modificering af OA ved 5 konjugering med PEG resulterede i maskering eller radikal forandring 6 af determinanterne hos umodificeret OA, eftersom det ellers skulle 7 forventes, at de reagine antistoffer, som levede videre i serummet 8 hos dyr, som blev sensibiliseret 24 dage tidligere, skulle være 9 blevet neutraliseret ved injektion af den relativt store dosis af OA- 10 PEG-konjugat. Denne fortolkning viste sig faktisk at være korrekt i 11 de forsøg, som nedenfor skal omtales.
(D) Opretholdelse af ufølsomhed ved adoptiv overføring.
Alle donatorerne af miltceller var blevet immuniseret med en sensibiliseringsdosis DNP-OA 45 dage før aflivningen. 9 dage inden deres milter blev udtaget, opdeltes disse dyr i 3 grupper, og hver gruppe
DK 158359B
u fik en intravenøs dosis af 0,2 mg OA-PEGg i 0,5 ml PBS eller 0,8 mg OA-PEGg i 0,5 ml PBS, eller kun 0,5 ml PBS. Derefter blev samtlige dyr aflivet, og suspensioner på 5 x 10^ miltceller fra hver af tre grupper blev overført til syn-genetiske, røntgeribestrålede (550 R) 5 modtagermus. Inden for mindre end 4 timer efter celleoverføringen fik alle modtagende mus en intraperitoneal sensibiliseringsdosis DNP-OA, og deres anti-DNP- og anti-OA-IgE-antistoftitere blev fulgt i en 2 ugers periode.
Som det fremgår af tabel V blev de reagine antistofniveauer kun 10 ubetydeligt sænket i løbet af 5 dage efter injektion af OA-PEGg i intakte sensibiliserede mus, som var udpeget til at ofres til celleoverføring. Efter adoptiv overføring svarede miltcellerne hos de testmus, som var behandlet med OA-PEGg' imidlertid meget dårligt på en yderligere sensibiliseringsdosis DNP-OA, som blev administreret 15 til røntgenbestrålede modtagerdyr, i sammenligning med miltcellerne hos mus i kontrolgruppen. Derfor kan der drages den slutning, at behandling af sensibiliserede mus med OA-PEGg resulterede i ophævelse af evnen hos disse dyrs miltceller til at fremkalde et reagint svar på fornyet eksponering af en yderligere sensibiliseringsdosis af 20 antigenet efter adoptiv overføring.
(E) Hæmning af hæmagglutinerende antistoffer med OA-PEG-konjugat.
Foruden de hæmmende indvirkninger af OA-PEG-konjugat på dannelsen af reagine antistoffer er virkningen af disse konjugater på dannelsen af hæmagglutinerende antistoffer blevet studeret. Til dette formål fik 25 mus en intravenøs injektion af 0,2 mg eller 1,0 mg af enten OA-PEGg eller OA-PEG20 4 timer før administrationen af sensibiliseringsdosen af DNP-OA, og samtlige mus fik en yderligere injektion af sensibiliseringsdosen 28 dage senere. Som det fremgår af de i tabel VI opstillede resultater havde ingen af de to OA-PEG-tilberedninger nogen 30 signifikant indvirkning på hæmagglutinationstiterne ved en dosis på 0,2 mg. Administration af OA-PEG-tilberedningerne ved den højere dosis 0,8 mg førte imidlertid til en lille, men signifikant formindskelse af hæmagglutinerende antistoffer, og denne virkning var mere tydelig på anti-DNP-. end på anti-OA-hæmagglutinerende antistoffer. Af 35 dette resultat kan det sluttes, at OA-PEG-konjugat har en mere udtalt 12
DK 158359B
hæmmende indvirkning på de celler, som er involveret i dannelsen af IgE-antistoffer end i fremstillingen af IgM- og/eller IgG-antistof-fer.
II. Engbrandbæger-allergensystem.
5 (F) Ophævelse af reagint antistofsvar på RAG.
Det har vist sig, at optimal produktion af reagine antistoffer mod RAG kunne fremkaldes i BgD2F^-mus ved administration af 10 pg RAG suspenderet med 1 mg Al (OH) 3 i 0,5 ml PBS. I det nedenfor beskrevne forsøg bestod standardsensibiliseringsdoserne til inducering af 10 reagine antistoffer mod engbrandbæger-al ler gen af 10 /*g RAG blandet med 1 mg Al(OH)3 i 0,5 ml PBS. Ved et forsøg på at ophæve et eksisterende reagint svar på RAG fik sensibiliserede mus 0,8 mg af enten RAG-PEGg eller RAG-PEG20 på dag 15. Forsøgsresultaterne er illustreret i fig. 2, hvor anti-RAG-PCA-titerne på ordinataksen er afsat som 15 funktion af tiden i uger på abscisseaksen. Den fuldt optrukne kurve repræsenterer kontrolgruppen, og den stiplede kurve repræsenterer RAG-PEG20-gruppen, og den med streger og prikker tegnede kurve repræsenterer RAG-PEGg-gruppen. Som det fremgår af fig. 2 førte behandling med den ene af de to RAG-PEG-konjugater til en formindskelse af anti-20 RAG-IgE-antistoffer, og IgE-antistofniveauerne fortsatte med at synke trods administration af den anden sensibiliseringsdosis RAG dag 21. Kontroldyr fremkaldte derimod et typisk sekundærsvar.
Specificiteten for den hæmmende effekt af RAG-PEG-konjugat på det anti-RAG-reagine svar blev demonstreret ved det forsøg, som er anført 25 i tabel VII. Medens således administration af en yderligere sensibi-lisereringsdosis RAG dag 34 efter den primære immunisering i mus, som havde fået OA-EEGg eller RAG eller PBS ad intravenøs vej på dag 33, resulterede i et forøget IgE-svar (dvs. anti-RAG-PCA-titeren var af størrelsesordenen 500), resulterede administration af den anden 30 sensibiliseringsdosis på dag 34 i dyr, som dagen forinden havde fået RAG-PEGg- i en dramatisk sænkning af den anti-RAG-reagine titer (dvs. anti-RAG-PCA-titeren formindskedes til 60). Desuden antyder det faktum, at administration af 500 pg af den ukonjugerede RAG-tilberedning uden Al(OH)3 på dag 33 ikke påvirkede sekundærsvaret som 13
DK 158359B
påvistes dag 41 (hvilket var resultatet af den gentagne injektion til dyrene med den anden sensibiliseringsdosis RAG dag 34), at den ovenfor observerede sænkning i anti-RAG-IgE-antistofniveauet ikke beroede på en neutralisering af IgE-antistoffer med det injicerede konjugat, 5 men på en modulering af det immunologiske system hos dyrene, som førte til en specifik hæmning af anti-RAG-IgE-svaret. Det skal også bemærkes, at intravenøs administration af 800 /zg RAG på dag 28 (dvs. samme dag, som de immune dyr også fik en yderligere sensibiliserings-dosis af antigenet), resulterede i reduktion af den sekundære anti-10 RAG-PCA-titer dag 35 til ca. 20, hvilket kan have sin årsag i neutralisation af cirkulerende IgE-antistoffer; men ikke engang disse dyr viste noget tegn på immunosuppression, eftersom yderligere immunisering med en tredje sensibiliseringsdosis#RAG på dag 56 resulterede i et normalt anamnestisk IgE-svar.
15 (G) Manglende evne hos OA-PEG- og RAG-PEG-konjugat til at fremkalde PCA-reaktioner.
Allergeniciteten for OA-PEG-konjugat blev afprøvet på rotter ved hjælp af PCA-analyse. Til dette formål blev der udført dobbeltserie-fortynding af 0,1 ml af et standardmusereaginserum med kendt PCA-20 titer (dvs. 1400), som var fremstillet ved intraperitoneal immunisering med en sensibiliseringsdosis DNP-OA, og 50 μΐ rumfang af disse fortyndede opløsninger blev injiceret intradermalt i den barberede hud på ikke-indavlede pigmenterede rotter. 24 timer efter sensibiliseringen af huden blev injiceret 1,0 ml's opløsninger indeholdende 25 forskellige mængder ikke-modificeret OA eller OA-PEGg eller OA-PEG20 og 0,5% Evans' blue dye intravenøst i forskellige rotter. Rotterne blev aflivet 30 minutter senere, og PCA-reaktionerne blev bestemt.
Som det fremgår af tabel VIII fremkaldte 1 mg ikke-modificeret OA en kraftig PCA-reaktion, og tilsætning af ikke-konjugeret PEG med en 30 molekylvægt på enten 6000 eller 20.000 til OA påvirket ikke PCA- reaktionen fremkaldt af OA. Derimod kunne hverken OA-PEGg eller OA-PEG2o> selv når de blev injiceret i meget større mængder end OA (dvs.
10 henholdsvis 6 mg), fremkalde en signifikant reaktion. Desuden viser forsøg 8 og 9, at dyr, som ikke havde vist nogen PCA-reaktion, 35 når de blev provokeret med enten OA-PEGg eller OA-PEG201 gav gode 14
DK 158359B
reaktioner ved fornyet injektion med 1 mg ikke-modificeret OA 20 minutter efter den primære provokation med dette konjugat. Dette resultat viser, at OA-PEG-konjugat ikke kunne forenes med og neutralisere anti-OA-IgE-antistoffer in vivo. I lyset af denne erkendelse 5 kan den minimale PCA-reaktion (titer af størrelsesordenen 60), som blev observeret i forsøg 5 med en dosis af 10 mg OA-PEGg, anses at bero på tilstedeværelse af meget små mængder ikke-modificeret OA eller af noget OA-PEG-konjugat, som indeholdt meget få PEG-molekyler pr. molekyle OA, i den tilberedning af OA-PEGg, som blev anvendt til 10 provokationen, og som således stadig havde nogle tilgængelige antigene determinanter. På basis af alle disse resultater kan man slutte sig til, at den manglende evne hos PEG-konjugaterne af OA til enten at udløse en PCA-reaktion eller neutralisere de anti-OA-reagine antistoffer, som var fikseret på de sensibiliserede hudområder, 15 beroede på, at de oprindelige antigene determinanter hos OA enten var utilgængelige eller radikalt forandrede i OA-PEG-konjugaterne.
Evnen hos RAG-PEG20 til at fremkalde PCA-reaktioner blev undersøgt som ovenfor beskrevet ved anvendelse af et muse-anti-RAG-reaginserum til sensibilisering af huden hos rotter. For at provokere de sensibi-20 liserede hudsteder blev en opløsning af enten RAG eller RAG-PEG20 injiceret intravenøst i rotterne (i nærværelse af Evans' blue dye). Resultaterne af disse PCA-forsøg er sammenfattet i tabel IX, hvoraf der kan udledes den slutning, at medens ikke-modificerede RAG-aller-gener fremkaldte en kraftig PCA-reaktion, kunne RAG-PEG20 ikke frem-25 kalde nogen PCA-reaktion. Desuden viser resultaterne fra det sidste forsøg, som er anført i denne tabel, at administration af RAG-PEG20 ikke indvirkede på fremkaldningen af PCA-reaktioner ved gentagen injicering af dyrene med ikke-modificeret RAG 20 minutter senere. Der kan derfor drages den slutning, at RAG -PEG20-konj ugatet ikke havde 30 let tilgængelige antigene determinanter, som blev delt af de ikke-modificerede RAG-allergener og derfor var ude af stand til at udløse mastceller overtrukne med anti-RAG-IgE-antistoffer.
(H) Manglende evne hos OA-PEG-konjugat til at inducere anafylakse hos rotter, der var sensibiliseret med OA.
15
DK 158359B
De nedenfor beskrevne forsøg er udført for at give yderligere bevis på den manglende evne hos OA-PEG-konjugat til at forenes in vivo med anti-OA-IgE-antistoffer. Eftersom mus er modstandsdygtige mod histamin, fremkalder injektion af det sensibiliserende antigen i mus, der 5 har IgE-antistoffer mod det tilsvarende antigen, ikke let anafylakse.
Derfor blev der valgt mus, der er tilbøjelige til anafylakse, for at undersøge om OA-PEG-konjugat havde evne eller ikke til at forenes in vivo med anti-OA-IgE-antistoffer fæstet til mastceller og således udløse en anafylaktisk reaktion. Til dette formål blev Chester Be-10 atty-rotter sensibiliseret systematisk ved immunisering med DNP-OA som ovenfor beskrevet. Til systemreaktioner blev administreret 2 mg ikke-modificeret OA eller OA-PEGg eller OA-PEG20 i 1 ml PBS intravenøst til hvert sensibiliseret dyr 6 timer efter blødning, og dyrene blev observeret nøje med henblik på hver effekt af disse forbindel-15 ser, Alle sensibiliserede rotter, som havde fået en intravenøs injektion af OA, døde i løbet af 15-30 minutter af anafylaktisk shock.
Derimod kunne hverken OA-PEGg eller OA-PEG20 inducere nogen som helst synlig lidelse ved administration til de sensibiliserede dyr. Dette resultat, som er i overensstemmelse med det ovenfor i afsnit (G) 20 omtalte, viser videre utvetydigt, at de PEG-modificerede antigener ikke kunne samvirke in vivo med IgE-antistoffer i aktivt sensibiliserede dyr og derfor var ude af stand til at udløse en anafylaktisk reaktion.
16
DK 158359B
A A
g . -S 5 i OO oo oo 2
H CN P* O O U3tN
+» θ'» <» vø lø id O id o &> C ·· ·· *’ J , 01 C < H CM η CS HH P -Q. lw p p «w Id 2 01 u c H ft) H (Lj 0
P S 01 g H
§ Q O H 4J
S I O O O O O O
g H ro cn o o æ co w ^ ®
Η -P 0\ VØ t" o cm 21 ^ [J
C · · · · C c ti < H HH H T3° « f “Is rd 3 2 c s ^ ty) H 2 w <u <d in n m n m cm η P p (_i i|_| ODD ro ·>» ro *» ro τ* Æ <u ^ Η 3 « H g 0) ω m ω rt S £ < W U° S’ ^ijj+j ?o o o c w ό rtH H £ ο Η 0) * ^ ©eh -P o vø τι« . h, n hAjcS^· η Η n e a* a u r? p 8 0) 5 « g H g _ _ g
0) CD nnQ
1 3io ο o 0 0 1 ΕΗΓ- Γ^ N Λ , 2 B g -p «3· ·» vo ortjw Λ ^ s -5 « "· g> S !
4) H J g S
« » ” s 8.
rt -rt 0. _ ® 0-5 h p © -¾1 ^ 2 34 p
-P 0)DH Η H *qE<U
o o> « m ^ +1 ^
S Ή W 'j J
W 00 <1 ft ft «Μ <I) ·Η H
4J S3 3 ο .+>£<?
-f-ί I I I h ^ J
P Digj gj gi ϊ H Ϊ g “ & £ S I § I s !§
OH >h 0 C
2 d << »a; < & μ ή ¢) Λ c© ο ο ο o h g «» “ m rt I vo cn i N Μ I 0 6 ,, 0 e _ern cl n 3 ft OSfti P C Ό > ο!? a HHg ω h g ^ “ Q) PQQ Q P4&Q ft)0)Q οϊίοβ
m ,¾ Η H
5 «4 «< -M O -P M
C 3 « H flj <D
© © Ο < β rn ? ij j
Jj n, Li I I 01 (0 -P H
S +» i +» dQWH
fi 3 C “ “ S
id poo 0 2 g O W H Eh * *
DK 158359 B
&» 17 3 L' tn i \ 0 3 *h o m \ tO ri o C .
1 OOOO Η Φ Ό +) -r) ,, .. ©'ίΟ'» M <U tT> +1 E-t Eh E-i E-i ^ CO r- to m Es.
ri tø·· · · *riMH rø < H W HH Ή Η J? j[j *0 C τΐ Ό
>H O H C
S O -Η Φ 3
i O O O O Λ -P W
»-r. ._j O CA CO vo ·· ·· C Pfl *H(1) β +) in o fl1 m Η Η EhEh 0) M h ^ .3 c .· ·· · * £:+)1-1.¾ μ rij mm HWWW -Q ·Η
Ri Ή -rt « ? -H S " § & g ·§ · tn1+1
Sg Q (0 oo
Si O O O O O O O O ^ El •Η -Η H 00 00 00 O ^ tn 00 to £ .g *
μ nnj oto tor- *H s On m W
M3 ·· _· J n^rni.
,2 ** m M τί m a> S to Φ ·ω E · 3 0i É ft -H oo S tn β -H +» cm
Φ ω in n m m m cm mcM H 143 S
to Q m m <ϋ< ro ^ co «τ M ^ O ^ to & ko ό
•H to g O
H O Q W O
•H H ft 10 Λ fit tn L <
•Η I Ή <d I
n to < to O di
tn rM S O O S
i? <D Ό CD Q
iCj Ph o o 10 tP 3
M 1.. o oo 3 Φ \ W
n ±3 η El) CM H c \ E ° ή M <1) O § O to , . 2 5 o 3 co o Φ +) Φ ^ sootnm,a rt&iiia: m <ΰ «j φ S S’ g·· g g1 10 I c i ? I ^ § s . · 0 c E o i 0 u 3 o V t* Eh oow^jto H W W 4) Ό Λ Ό rl 9 *· H σι^φφφ
Ru td Φ Μ ΤΊ g
δω Ό Π Φ C
^ S «i c i-i w 1 -W g Φ *H O Φ
ri c o 01 > tn TI
° § V o o o o OitOOS-φ ni S .1 o rH σι O Φ S M C )-i |I|§ v s ® Λ§0.«® β ^ 5 H ^>C0rto 5 a IW μ +) o 9 2 +) o c u E w. fQ β Ή Qi S μ ίο -ί -¾1 τ 3 h cp Φ Λ Q Η Η Η Η 0β·§Φ0
n <D
£ rij »cd X o S* o O A< ft -ri n co < < M “ g CMO O < f I cS I I 1 g'rg.gS0· ^ h vo o toonaOi pco μ 5 < Oisdto O ω O'OPSilCi
r\ r<n ri M O <C W< rH ^ μ Φ tT> K
^ 5 w λ ^ 3 i i Ϊ U S<^||2 Ϊ m o § g^,§§ SUi §-*31,"« il * ri Mi I H 10 ι-l i-l
9 «S r-iS iHrtJUtOO
uj ω i^ *> η CQ i in Φ S to S g, ii S i « o« s « a *<
u S IH +) +) +) 3 2 S ^ ^ I
Φ p c p to c* to 2 D ^ ^2 &
Oj d o Μ φ OCQW IKiHIlg S* S Η K I Η ΚΚΛΛΩ 18
DK 158359B
< I o o o o o o o o -H O UD LO O O ti) vo o 4J in ^ r- oo id o in oo £ ···· ·*·· f£ f'VDnjio h nj <s η P 1-1
•H
+> p Q) (h -P 2
Q
tril OOOO O O O O
η -η m H m r- noovo . +j r-< ro r· m n ** co γιο P G .... ·
U (¾ c m co m ro H
Η Ό
Pi C
I P
ti q 'm i— ^3* in n r· in n H ° WQ 5 in r- oo ^ m r- oo
'O
iH QJ (D
Φ 6 U
Λ , id P -P <
Eh id -H O _
> &h I ° O
03 i -H 00 ® m < -P vd to o o cd c 41 Qi G <
03 *H
-Η P
41 <D
C W Pi id *H 2 CO _ -P dl ° o c g -H m m •H 1 -P ^
tji *H C
id <
Q) P
P ffi E _ <u *h tn T3 p rd i£> J® c OP rn <n O)
P
« <D
m H < < < < Ό Ό U> < · <
,§ φ O O O OWHWO O
O) ·ΰ I I I I dl 04 Pi I I
jj c p, Pi Pi o i i i o g; 03 tn -H 2 2 2 Js Js ro ^
rH C^QQ Q QOOOQ Q
•H -HP
-P iH O
•ti t*i
41 C
O) Id
m am o o co ° £ £ S 2 S
η} PQQ -r o nnm^pio 5 c S o s s I li
•g. s § I
o O w fr4 19
DK 158359B
< 0 o o o o
1 Η N O O
•ri UD H CO 00 4J . · tji β id in β <3 •ri
U
Φ w -ri (¾ β 2
β P
g| o o o o
g -ri O CM O O
•H +) m h rr r- C · · U < H in « Ό β • β o λ; tn cm cu cd m cm m cm 0 CO P 00 'tf ro *tf m Λ .
1 *d li O ooo o o o
J>0 I CO ID CM CO ID ID
H Q) ·Η CM ID ID CM UD ID
T3 M 4-> ... ...
H φ Cl) DO c HHH H 1-1 H
Φ g 4J C < ' X) -ri -ri cd i-i e-ι m
Eh cd | φ Oi > <; cd s ooo o o m tn CJ-H P ud m r~ io m oo U_| ft β I ID CO CO ID 00 00 0 β -H ·
4J i -P Η H
m g β •H -ri <3 44 β u
Cd « g •P -H tn _ , c μ Cd 'tfH'tf 'tfH'tf
tH (X, Q ι-H CM CM H CM CM
tn Q) 00 rfj «3
l-ι CM O O
I I
a) tn λ 5} Ό cd 2 2
β P P P
Φ U
01 O r^ S CM t n Φ cm O g
rrj CM W
<U Pk 00 4-1 tn l ' w t n cd S ° i—I β P I o ~ •ri i-l 44 H ^ .
Ό < <
+) β O O O
Φ Cd I I
x; tn P cu 44 φ Id 2 2
cd pq P P P
tn β •ri r4 β Φ 0 % a £ +1
Λ 3 S S
CU 14 O Φ o O « E4
DK 158359B
u u
O) O I
20 4J G Ό
W O O
0) Ό E
S-ι co ta
Q) O O
E A A
•Η
P U U
Q) 0) >3· m m-i «w m m o o te -p +> co co
+1 -Η -H
rf <U -P -P
0 & C G
1 oo OO OO © (8 Ό λ -η om cn r- co r- tji +J m σι ro ro h cm d) 2 G G · · ·Η S 5 •H C HH 'd. Ti •S om« (TY I 0) 0) U ft gi ^ u * > Q § h «Η «Η
ju o I 00-00 OO d) (8 CO
HK 0) *H O 00 'T CO 'TO W 5-1 · r—1 4-! Cl <N O ω Φ φ ·
m iH C · tø C fi C C H
Η O O M 0) P 0)
m η ΌΌ 0) CO <U CO
jj ° CO G G 3 u
Tjjj OMumgiO·© S m fift ί) ΟΉ
V Π -Hft > U
> *5 £ t* ? τί03 Ti S
. Ud) (O r»·'* Γ"^ <D V-) C __ G t> i—I (Π (¾ w Q Η H <H “ ^ H if H ° S 5 H d) -H -H- -H > mil -H +) -P P +> Ή £ 5 § Λ CO 0) +> ^ tS i OOOO O O O O OOOO -Η -Η P CO PGt s. ^ -h © m vd m o in o o o in oo co co > d) *H d)0
m cp +j οοοοσισ» co oo t" co oocon cm fi C P •"J
•s η ^ ···· ···· ···· ω cd o ή o) fo I i « hh,hh % sa s» iS-K Cd) M-ι cd m 0)
C iIT d) t3 Φ (fi d) -P
ω u (¾ Ud) nm n HK d) 2 OOOO OOOO OOOO M G co d) HK > Q oo tn η H co m Η φ co m tn o -P P fi , £ ^ O I CM CO CO CO CM 00 P· CMOOM'i *H *W Q) P d)d) T d)o) -Η · · · «» « ’Ί m !d !? ji tt j jJ ,—{ rH rH <D Μ Η -P H fd
Ϊ S H C P <D O *W (DO
& 5 ® § Λ ® Λ g g u S« 5* 53 10 I U -P O &> *rii-©& Ό -P «-< «8 <4-10 m 0*H 18 -<3· VD CO H *3* CO CO Ή ^31 ID CO iH Or-1 (8 'O C80
> ^ P HcnnM1 «Η ro ro ^ rH ro ro E *H
c t"“i rt r* m 0)-¾1 d)
m ^ ~ ΌΡ- Ό Ό 4J
)¾ \otj\ ioCp d) o O' y1 g 10 Og OE hh d) ° m ©
niw ro ω P ®c8CCCD
S ^ £ OM P co HX C co G P
“ 03 tu CO i - 7 *· 4J Q) ro Q) d) ^ Di G S < O <o jgm -O Ό *§
ή c q p o— L
§« * IH « 1 «si ° ? ? ? ff i? s § 0) S fi & Z 2 ©H-PH+j” C0 d) O 18 2 g g ic ,2 CD Η I 0) I 0)
η οι < ω <1 J
λ« _j H>UdUl8 S a o < n riJOPEft-p Φ Bi jj i* ή* U G G « « HK 2 5 S S m2« o o P E* cH HKHK*l
..DK 158359 B
«5
O
cu
• 21 S
n c 0
•H
+1 .¾
<D
•ro
C
Ή · 01 dl O' c C 0) •H 01 H 3 Q) g rf w
o -H IH
, iH 10 -η (Τ\ o σι o oooo θ' Η σ> σ ·η +) Η Η Η >5 Ο* C << ω -η 5 ** C Η
u <u<D
dj οι w -H S d) Η
C Q H *H
§ 7 di ja
c -H oooo r·· r·* m m co t-- in in O' -H
S jj *H 01 .5 c H c H 5 M <u • u ® m jj W Ud) ro *0 ?, ^ C C 01 H (0 3 m u
K, U_| |Tl IL> H
^ O d) (0 m cn m μ m cn m cn “i m „ ® ,_!+) y} q co co rr n^1 co ro *w s 3 * § g g c * o ® 10
10 ® ^ Η H
d)£U +) CM in CN ID CN 'd* Hin CNCN KJ d) •O +1 O' C ^ £ 3 -H G C 5 m ® t* -H Z\ ® J-l I ' H Ai cn
® < ® g O
G 33 01 Q o -N-
Tj fN "rj -H T3> id ^ COCO in VD ^J· CO O' O' 3 0 3 +J « ° H o i 3 ^ in
Oi J g rij . X? 11 M 5 »ro <o
S' ^ CU
fro 3 O'
S G |H
Jh S
«d Ti ro r- n* ** γ-μ· o* o1 t' ^ II! * ft ft Q Η Η Η Η Η'ΟΓ' ji Λ ^ ro O' m O' O' ja ro & ff ff s e · n s B e c o “ >
o * ” < ° < O rt H rt S V
f g· £?3?~?“?S§ O -H pi A) OP) ° +) μ H to 3 to 2 M2 Μ Z 3 01
g ία <C ØSOQOCIOCI ®S
i ro ° ? pi ro ftro ftra “ro g .
§ I S' g A'3i3i3i3 5»S
IH 1¾ Q Q O ft O ft Oft O ft « S O' ® >_ Ό ro -η c rH 3 Ό &Ί
•nå) ortim o 9 % ^ L
hS +»+)+> +) +) feftw llH 0<U(l)<U<U g >0 tii E-* Eh &«<·< 22
DK 158359B
«k •fl· C n 0) Ό tr c Π) — »o 0) ·
Dl «1 H O H 'S* ® O Ό I? C t0 θ' Ή φ t0 Λ *ϋ μ «ο o a <kC M-i ft μ a) ® ΓΟ C Ή ___ > lt-4 33 -H 0 O O' -P ^ β M «Η (0 *H +> tu c rl c to (3
U O <D
Η < H fi
□ 2 Ο -H
> Λ 0» p o u (0 hh Jj φ φ φ ω -η « ^ Λ Eh Η O * »
Ό I ^ ^ Φ O
g4 irf tfl μ ^ .80¾ 00 o 0 O'-μ« VO (1| (0 00 VO O VO Cl
UlQ 10 m Ή -Η -Η m rn >H +1 g 2 ® c c , 2 to a) to
Ol ^ -rt «3* .j H *f0 S3 Ή -P ft C Λ tn
m W C -H
g C 0) H
a) > A
c n to to C
m H<U
c O' o u o o 0 +) .c 5 S gggg [0 ,¾ Φ w -H 0) g m M-I Οι u * Λ ^ vo ~ a. -p Q. O' VC O' O O' 0 O' S O' fo 3 0 c ω c HhL1®· o c ro \ H \ ft \ >1 O' to to-H O PM Ο I O 'O p 0<H O' WOOIOOO U 0) c; Ό ro cq rij in <! in rfj in m-i ω φ § 5 a 22-8-2- <3 > 5 H jo μ .5 ® tu > mo cx> -η φ
ji Oi W H
o O' 0 U Ο Ο C Λ Q (r| £§ c! a! O' M O'
j O
φ H 0) O' +j H H p to - -Η Η Η Η -Η Ό tn O III ^ . p •Η Η Η H *2 ® m ο 000 ® ft 0 0 ft +3-P-P-P f-j o' h 0) C CCCtO rtjO>< ft μ ooo® „
CO 0 33 33 W ϊΗ H
Tabel VIII
23
DK 158359B
Manglende evne hos OA-PEG-konjugat til at fremkalde PCA-reaktioner*
Forsøg nr. Forbindelse anvendt Injiceret mængde PCA-Titere til provokation (mg) 5 _ 1 OA 1 1.400 2 OA plus 1 1.500 PEG6** 3 3 OA plus 1 1.500 10 PEGg** 3 4 OA-PEGg 1 <10 5 OA-PEGg 10 60 6 OA-PEG2o 1 <10 7 OA-PEG2o 6 <10 15 8 OA-PEGg plus 20 minutter 1 <10 senere 0A 1 960 9 0A-PEG2q plus 20 minutter 1 <10 senere 0A 1 900 1 2 3 4 5 6 2 * Ikke-indavlede pigmenterede rotter sensibiliseredes intradermalt 3 med et muse-anti-OA-reaginserum og provokeredes 24 timer senere 4 ved intravenøs injektion af de i kolonne 2 angivne forbindelser 5 sammen med Evans' blue dye i PBS.
6 ** De ikke-konjugerede tilberedninger af PEGg og PEG2q injiceredes i samme opløsning med 0A i nærværelse af Evans' blue dye.
24
DK 158359B
Tabel IX
Manglende evne hos RAG-PEG-konjugat til at fremkalde PCA-reaktioner*
Forsøg nr. Forbindelse anvendt Mængde af forbindelse PCA-Titere til provokation (mg) 5 _ 1 RAG 1 740 2 RAG-PEG2o 1 <10 3 RAG-PEG2o <10 plus 20 minutter senere 10 RAG 1 740 * Ikke-indavlede rotter sensibiliseredes med et muse-anti-RAG-reaginserum og provokeredes 24 timer senere ved intravenøs injektion af den i kolonne 2 angivne forbindelse i nærværelse af 15 Evans' blue dye;.
Eksempel 3.
Konjugat af hundealbumin (DA) med monomethoxypolyethylenglycoler (m.PEG-OH) med forskellige molekylvægte blev fremstillet ved anvendelse af blandet anhydridmetode. Denne metode omfatter tre trin.
20 a) Fremstilling af m.PEG-0-CCH2CH2C00H
o
Til en opløsning af 0,8 millimol m.PEG-OH i 20 ml tørt pyridin blev 25 sat 800 mg (8 millimol) ravsyreanhydrid, og den kombinerede opløsning blev omrørt natten over ved stuetemperatur. Opløsningsmidlet blev afdampet i vakuum. Remanensen blev opløst i 15 ml benzen, og produktet blev udfældet ved tilsætning af 20 ml forud afkølet hexan.
Det udfældede blev opsamlet ved filtrering og opløst i destilleret 30 vand. Den vandige opløsning blev dialyseret mod destilleret vand i "Quantipore”®-gamma-dialyseposer (grænsemolekylvægt: 4.000, frem- 25
DK 158359B
stillet af Quantimetrix Co., Culber City, Californien, USA), hvorefter produktet til sidst blev lyofiliseret.
b) Fremstilling af m.PEG-O-CCl^Ci^COCOCI^CHCCI^ i ; i i > i : 5 0 0 0 0,4 millimol m.PEG-O-CCi^C^COOH blev opløst i 10 ml chloroform.
0 10 Temperaturen blev holdt ved 0°C ved hjælp af isbad, og tør nitrogen blev boblet gennem opløsningen. 0,4 millimol triethylamin blev sat til opløsningen, hvorefter der dråbevis blev tilsat 0,4 millimol chlormyresyre-isobutylester. Reaktionsopløsningen blev holdt ved 0°C i 30 minutter og blev derefter inddampet under vakuum ved stuetem-15 peratur. Remanensen blev vasket flere gange med petroleumsether, hvorved der blev fremstillet et hvidt krystallinsk produkt.
c) Konjugering af m.PEG-0-CCH2CH2C0C0CH2CH(CH3)2 til hundealbumin.
0 0 0 20 _ 200 mg hundealbumin blev opløst i 30 ml boratpuffer (pH-værdi 9,6).
Ved hjælp af isbad blev temperaturen holdt ved 0eC.
m.PEG-0-CCH2CH2C0C0CH2CH(CH3)2 (med hensyn til mængde, se tabel X) 25 0 0 0 blev tilsat portionsvis i fast form. Reaktionsopløsningen blev omrørt i 3 timer ved 0°C og senere opbevaret i køleskab 16 timer. Reaktionsopløsningen blev ledt gennem en "Sepharose"® 6B-kolonne. De fraktioner, som indeholdt protein og intet frit m.PEG-derivat, blev 30 opsamlet og lyofiliseret. Frit m.PEG kunne påvises ved tyndtlagsch-romatografi.
26
DK 158359B
ri!
Q
\
O
W
O.
»0 oo Η o o m m m I (d ri (N η Η η π
Φ P CP 17» p tn •n tp C C -P O -H id ft P
σ>
•n β I
0 O * β
•H
ε p
Id 0) ft <D ft •Hp o cn ro 'tf m o ro
}q 54 in Ί N in Ί> N N
ft tr> * < Η Ω (1) w Φ c É-l -ri g b1 3 g ,Q w ooooooo
H OOOOOOO
(00) W N N N (X M N
α> ό Π3 (Τ' β β β « « ε ”9» ,ε φ ooooooo ffi «ο ο co ο ο r~ m ο Ο & μ ν ο m οο > ιη Ο β · · · Ν 8 Η Η Μ s s υ Μ SS +1 8=»ο $ ό «Η 1 >ι Ο χ ooooooo Η φ ooooooo (¾ rH ooomminin • 0 .......
g g ιί μ η η w η λ Μ β ιη _ c rt λ ο *0 ω «η οι nj ro ro ro ro ro ro ro +> tn Λ β co 27
DK 158359B
Konjugeringsgraden blev bestemt ved kvantificering af mængden af m.PEG-substituenter i det modificerede hundealbumin ved NMR-teknik.
Antallet af frie aminogrupper blev bestemt ved O-phthalaldehydmetoden (A.R. Torres et al., Biophys. Biochim. Acta Vol. 434 (1976), side 5 209). I tabel X er angivet konjugeringsgraden som antallet af PEG- molekyler pr. molekyle DA.
De således fremstillede konjugater blev afprøvet med hensyn til allergenicitet, tolerogenicitet og antigenicitet, og resultatet er sammenfattet nedenfor i tabel XI.
10 Tolerogeniciteten blev bestemt efter de ovenfor beskrevne metoder, og tolerogenicitetsgraden repræsenterer den gennemsnitlige formindskelse i IgE-titere efter tredje sensibilisering, beregnet på titerne for kontroldyr, som kun har fået de tre sensibiliseringsdoser DA. En mindskning med en faktor 6-100 indebærer god tolerogenicitet.
15 Allergeniciteten blev bestemt ved to metoder, en RAST-baseret metode og en PCA-neutraliseringstest.
.Ved den RAST-baserede metode [Ref. Yman et al., Int. WHO-IABS Symp. on standardization and control of allergens administered to man,
Geneve, 1974; Develop, biol. standard. Vol. 29, side 151-165 (Karger, 20 Basel, 1975)] reagerer de modificerede allergener med et serum indeholdende allergen-specifikt IgE. Overskydende mængde IgE reagerer med ikke-modificerede allergener, som er covalent koblede til en papirskive. Radioaktivt mærkede antistoffer mod IgE tilsættes, hvorved der dannes et complex. Radioaktiviteten for dette complex måles i et 7- 25 apparatur. Pulstallet er direkte proportionalt med overskydende mængde IgE i serummet efter omsætning med ekstrakt (se den ovenfor anførte reference). Allergenstyrken for modificeret allergen udtrykkes som den procentvise andel af styrken for det oprindelige hundealbumin (- 100Z). 1
Antigeniciteten for de modificerede allergener blev bestemt ved omvendt enkel radialimmunodiffusion. Antisera med høj titer mod de ikke-modificerede allergener blev produceret i kaniner. Specifik præcipitatdannelse blev sammenlignet ved forskellige koncentrationer

Claims (2)

10 DA lisering af PCA 3a 64 80 100 30 3b 21 30 50 20 15 3c <3 0 <6 2 3d 77 90 50 30 3e <10 60 25 30 3f <5 0 <6 20 3g <2 0 <6 2 20 DA 100 100 100 50
1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af en i hovedsagen non-immunogen og non-allergen substans, som er et covalent konjugat 25 mellem: (i) et immunogent allergen og (ii) en non-immunogen vandopløselig polymer, kendetegnet ved, at polymeren, som er valgt blandt gruppen bestående af polyethylenglycoler, polyvinylalkoholer, polyvinylpyrro-30 lidoner, polyacrylamider og homopolymerer af aminosyrer, bindes covalent til allergenet i en sådan udstrækning (- mængde), at kon- DK 158359B jugatet er i stand til specifikt at hæmme dannelse af reagine antistoffer rettet mod allergenet.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at polymeren er polyethylenglycol med en 5 molekylvægt på ca. 2000-35.000.
DK364277A 1976-08-17 1977-08-16 Analogifremgangsmaade til fremstilling af et vandoploeseligt, ikke-immunogent, ikke-allergent allergen/polymer-konjugat, som er i stand til specifikt at haemme dannelse af reagine antistoffer DK158359C (da)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB34114/76A GB1578348A (en) 1976-08-17 1976-08-17 Products and a method for the therapeutic suppression of reaginic antibodies responsible for common allergic
GB3411476 1976-08-17

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DK364277A DK364277A (da) 1978-02-18
DK158359B true DK158359B (da) 1990-05-07
DK158359C DK158359C (da) 1990-10-01

Family

ID=10361546

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK364277A DK158359C (da) 1976-08-17 1977-08-16 Analogifremgangsmaade til fremstilling af et vandoploeseligt, ikke-immunogent, ikke-allergent allergen/polymer-konjugat, som er i stand til specifikt at haemme dannelse af reagine antistoffer

Country Status (14)

Country Link
US (1) US4261973A (da)
JP (1) JPS5324033A (da)
AT (1) AT359637B (da)
AU (1) AU520366B2 (da)
BE (1) BE857869A (da)
CA (1) CA1091153A (da)
CH (1) CH641681A5 (da)
DE (1) DE2736223A1 (da)
DK (1) DK158359C (da)
FR (1) FR2362156A1 (da)
GB (1) GB1578348A (da)
NL (1) NL7709025A (da)
NO (1) NO148281C (da)
SE (1) SE448147B (da)

Families Citing this family (74)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4140679A (en) * 1976-10-12 1979-02-20 Research Corporation Antigen-protein complex for blocking allergic reactions
DE3160926D1 (en) * 1980-04-15 1983-10-27 Beecham Group Plc Allergens modified with polysarcosines
EP0077158A1 (en) * 1981-10-09 1983-04-20 Beecham Group Plc Modified allergens
EP0098110B1 (en) * 1982-06-24 1989-10-18 NIHON CHEMICAL RESEARCH KABUSHIKI KAISHA also known as JAPAN CHEMICAL RESEARCH CO., LTD Long-acting composition
US6022544A (en) * 1983-01-24 2000-02-08 The John Hopkins University Therapeutic suppression of specific immune responses by administration of oligomeric forms of antigen of controlled chemistry
US5370871A (en) * 1983-01-24 1994-12-06 The Johns Hopkins University Therapeutic suppression of specific immune responses by administration of oligomeric forms of antigen of controlled chemistry
US5126131A (en) * 1983-01-24 1992-06-30 The Johns Hopkins University Therapeutic suppression of specific immune responses by administration of antigen-competitive conjugates.
US5447722A (en) * 1983-12-12 1995-09-05 University Of Manitoba Method for the suppression of an immune response with antigen-MPEG conjugates in nonsensitized individuals
US4880635B1 (en) * 1984-08-08 1996-07-02 Liposome Company Dehydrated liposomes
US5206344A (en) * 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US4766106A (en) * 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
JP2514950B2 (ja) * 1986-03-10 1996-07-10 エフ・ホフマン―ラ ロシユ アーゲー 化学修飾蛋白質，その製造法および中間体
US5037969A (en) * 1986-07-03 1991-08-06 Takeda Chemical Industries, Ltd. Glycosyl derivatives and use thereof
US4894226A (en) * 1986-11-14 1990-01-16 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polyproline conjugation
SE458339B (sv) * 1987-05-25 1989-03-20 Pharmacia Ab Testremsa foer att paavisa kontaktallergi
US5116612A (en) * 1987-06-23 1992-05-26 Allergy Immuno Technologies, Inc. Immunotherapy agents for treatment of IgE mediated allergies
US6093699A (en) * 1987-07-09 2000-07-25 The University Of Manitoba Method for gene therapy involving suppression of an immune response
US4847325A (en) * 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US5306500A (en) * 1988-11-21 1994-04-26 Collagen Corporation Method of augmenting tissue with collagen-polymer conjugates
US5510418A (en) * 1988-11-21 1996-04-23 Collagen Corporation Glycosaminoglycan-synthetic polymer conjugates
US5162430A (en) * 1988-11-21 1992-11-10 Collagen Corporation Collagen-polymer conjugates
US5565519A (en) * 1988-11-21 1996-10-15 Collagen Corporation Clear, chemically modified collagen-synthetic polymer conjugates for ophthalmic applications
US4990336A (en) * 1989-02-08 1991-02-05 Biosearch, Inc. Sustained release dosage form
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US5358710A (en) * 1989-12-01 1994-10-25 Alec Sehon Method for the suppression of an immune response
US5126147A (en) * 1990-02-08 1992-06-30 Biosearch, Inc. Sustained release dosage form
US5595732A (en) * 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
AU662155B2 (en) 1991-05-10 1995-08-24 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Targeted delivery of bone growth factors
WO1993012145A1 (en) * 1991-12-19 1993-06-24 Baylor College Of Medicine Pva or peg conjugates of peptides for epitope-specific immunosuppression
US5382657A (en) * 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
AU6368394A (en) * 1993-03-23 1994-10-11 Liposome Technology, Inc. Polymer-polypeptide composition and method
KR100361933B1 (ko) * 1993-09-08 2003-02-14 라 졸라 파마슈티칼 컴파니 화학적으로정의된비중합성결합가플랫폼분자및그것의콘주게이트
CA2175578A1 (en) * 1993-11-03 1995-05-11 Alec Sehon Cell control and suppression
US6485726B1 (en) 1995-01-17 2002-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6030613A (en) * 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6086875A (en) * 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
AU717660B2 (en) * 1995-12-18 2000-03-30 Angiodevice International Gmbh Crosslinked polymer compositions and methods for their use
US7883693B2 (en) 1995-12-18 2011-02-08 Angiodevice International Gmbh Compositions and systems for forming crosslinked biomaterials and methods of preparation of use
US6833408B2 (en) * 1995-12-18 2004-12-21 Cohesion Technologies, Inc. Methods for tissue repair using adhesive materials
US6458889B1 (en) 1995-12-18 2002-10-01 Cohesion Technologies, Inc. Compositions and systems for forming crosslinked biomaterials and associated methods of preparation and use
AU7485398A (en) * 1997-05-14 1998-12-08 Emory University Antigen-mpeg conjugates suppress humoral and cell mediated immune responses
DE19726186A1 (de) * 1997-06-20 1998-12-24 Boehringer Ingelheim Int Komplexe für den Transport von Nukleinsäure in höhere eukaryotische Zellen
HUP0004831A3 (en) 1997-10-30 2001-09-28 Leti Lab Tolerogenic fragments of natural allergens
ES2170042T3 (es) 1998-08-28 2004-10-01 Gryphon Therapeutics, Inc. Procedimiento para la preparacion de cadenas de poliamida de longitud precisa y sus conjugados con proteinas.
US6458953B1 (en) * 1998-12-09 2002-10-01 La Jolla Pharmaceutical Company Valency platform molecules comprising carbamate linkages
GB9913327D0 (en) * 1999-06-08 1999-08-11 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
AU2001268228A1 (en) 2000-06-08 2001-12-17 La Jolla Pharmaceutical Company Multivalent platform molecules comprising high molecular weight polyethylene oxide
DE10112825A1 (de) * 2001-03-16 2002-10-02 Fresenius Kabi De Gmbh HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung
DE10209822A1 (de) * 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10209821A1 (de) * 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
AU2003241279A1 (en) * 2002-03-26 2003-10-13 Biosynexus Incorporated Antimicrobial polymer conjugates
CA2495242A1 (en) * 2002-09-11 2004-03-25 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Hasylated polypeptides, especially hasylated erythropoietin
DE10242076A1 (de) * 2002-09-11 2004-03-25 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh HAS-Allergen-Konjugate
US8129330B2 (en) * 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US20040062748A1 (en) * 2002-09-30 2004-04-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
AU2003273413A1 (en) * 2002-10-08 2004-05-04 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Pharmaceutically active oligosaccharide conjugates
DK1667708T5 (da) * 2002-12-26 2012-11-12 Mountain View Pharmaceuticals Polyethylenglycolkonjugater af interferon-beta-1b med forøget biologisk styrke in vitro
MXPA05006945A (es) * 2002-12-26 2005-12-14 Mountain View Pharmaceuticals Conjugados polimericos de citoquinas, quimiocinas, factores de crecimiento, hormonas polipeptidicas y sus antagonistas con actividad conservada de union al receptor.
CA2511486A1 (en) * 2002-12-30 2004-07-22 Angiotech International Ag Tissue reactive compounds and compositions and uses thereof
AU2003300076C1 (en) 2002-12-30 2010-03-04 Angiotech International Ag Drug delivery from rapid gelling polymer composition
US20080206182A1 (en) * 2003-08-08 2008-08-28 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of a Polymer and a Protein Linked by an Oxime Group
WO2005014655A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
US20080274948A1 (en) * 2003-08-08 2008-11-06 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of Hydroxyalkyl Starch and G-Csf
EP1758608A2 (en) * 2004-03-11 2007-03-07 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyethyl starch and erythropoietin
WO2005092928A1 (en) * 2004-03-11 2005-10-06 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein, prepared by reductive amination
CN101080246A (zh) 2004-04-28 2007-11-28 安希奥设备国际有限责任公司 用于形成交联生物材料的组合物和系统及关联的制备方法与用途
CA2579790A1 (en) * 2004-07-30 2006-02-09 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Npc1l1 and npc1l1 inhibitors and methods of use thereof
US8303973B2 (en) 2004-09-17 2012-11-06 Angiotech Pharmaceuticals (Us), Inc. Multifunctional compounds for forming crosslinked biomaterials and methods of preparation and use
US20100062973A1 (en) * 2005-03-11 2010-03-11 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Production of bioactive glycoproteins from inactive starting material
TWI299257B (en) * 2005-05-16 2008-08-01 Tung Hai Biotechnology Corp γ-POLYGLUTAMIC ACID (γ-PGA, H FORM), γ-POLYGLUTAMATES AND γ-POLYGLUTAMATE HYDROGEL FOR USE AS NUTRITION SUPPLEMENTS IN DIETARY PRODUCTS
EP1762250A1 (en) * 2005-09-12 2007-03-14 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and an active substance, prepared by chemical ligation via thiazolidine
EP2070950A1 (en) * 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation
EP2070951A1 (en) * 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Method for producing a hydroxyalkyl starch derivatives with two linkers
WO2023194333A1 (en) 2022-04-04 2023-10-12 Swiftpharma Bv Recombinant spider silk-reinforced collagen proteins produced in plants and the use thereof

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR1296529A (fr) * 1960-03-24 1962-06-22 Leurquin Lab Procédé de solubilisation de la terpine dans l'eau
DE1212680B (de) * 1961-04-17 1966-03-17 Carter Prod Inc Verfahren zur Herstellung eines injizierbaren, Pollen-Antigene enthaltenden Impfstoffes
US3487046A (en) * 1961-04-24 1969-12-30 Georges Negrevergne Novel pyrazolidone derivatives substituted on the 4 position with a phenolhcho-polyamine ion exchange resin
US3185625A (en) * 1961-11-08 1965-05-25 Brown Ethan Allan Injectionable substances
GB1218277A (en) * 1968-08-20 1971-01-06 Miles Lab Dry water-dispersible aluminium hydroxide gels
GB1282163A (en) * 1969-08-06 1972-07-19 Beecham Group Ltd Modified allergens and a process for their preparation
FR2145376A1 (en) * 1971-07-09 1973-02-23 Mundipharma Ag Antigens derived from acarids - for asthma treatment and diagnosis
US3919411A (en) * 1972-01-31 1975-11-11 Bayvet Corp Injectable adjuvant and compositions including such adjuvant
US3869546A (en) * 1972-12-22 1975-03-04 Cutter Lab Adjuvant compositions and medicinal mixtures comprising them
US3920811A (en) * 1972-12-22 1975-11-18 Cutter Lab Adjuvant compositions
FR2346065A1 (fr) * 1976-03-29 1977-10-28 Muratov Rustem Dispositif pour le filage des pieces creuses

Also Published As

Publication number Publication date
SE7709233L (sv) 1978-02-18
CH641681A5 (de) 1984-03-15
ATA592477A (de) 1980-04-15
NO148281C (no) 1983-09-14
NL7709025A (nl) 1978-02-21
DK158359C (da) 1990-10-01
AT359637B (de) 1980-11-25
JPH0116812B2 (da) 1989-03-27
DE2736223C2 (da) 1987-04-23
DE2736223A1 (de) 1978-02-23
CA1091153A (en) 1980-12-09
SE448147B (sv) 1987-01-26
US4261973A (en) 1981-04-14
AU2794277A (en) 1979-02-22
JPS5324033A (en) 1978-03-06
BE857869A (fr) 1978-02-17
DK364277A (da) 1978-02-18
AU520366B2 (en) 1982-01-28
FR2362156A1 (fr) 1978-03-17
NO148281B (no) 1983-06-06
GB1578348A (en) 1980-11-05
FR2362156B1 (da) 1981-07-24
NO772848L (no) 1977-02-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK158359B (da) Analogifremgangsmaade til fremstilling af et vandoploeseligt, ikke-immunogent, ikke-allergent allergen/polymer-konjugat, som er i stand til specifikt at haemme dannelse af reagine antistoffer
US4411888A (en) Composition of a novel immunogen for protection against diarrheal disease caused by enterotoxigenic Escherichia coli
Liang et al. Oral administration of cholera toxin-Sendai virus conjugate potentiates gut and respiratory immunity against Sendai virus.
AU669354B2 (en) Synthetic haemophilus influenzae conjugate vaccine
US6531131B1 (en) Conjugate vaccine for Neisseria meningitidis
ES2540771T3 (es) Composición de anticuerpos para uso en vacunación contra estafilococos
Lee et al. Suppression of reaginic antibodies with modified allergens: I. Reduction in allergenicity of protein allergens by conjugation to polyethylene glycol
FI110234B (fi) Menetelmä koostumuksen valmistamiseksi immuunivasteen aikaansaamiseksi antigeenille
US8168195B2 (en) Vaccines against Escherichia coli O157 infection
Pierce et al. Induction of a mucosal antitoxin response and its role in immunity to experimental canine cholera
Lowell et al. Immunogenicity and efficacy against lethal aerosol staphylococcal enterotoxin B challenge in monkeys by intramuscular and respiratory delivery of proteosome-toxoid vaccines
Asherson The role of micro-organisms in autoimmune responses
CN111448204B (zh) 抗肺炎克雷伯菌的疫苗
AU684369B2 (en) Peptides used as carriers in immunogenic constructs suitable for development of synthetic vaccines
Liang et al. Cholera toxin as a mucosal adjuvant. Glutaraldehyde treatment dissociates adjuvanticity from toxicity.
KR100433986B1 (ko) 식물또는과실의폴리사카라이드로부터합성된장티푸스백신및그제법
US20150093412A1 (en) Use of saccharides cross-reactive with bacillus anthracis spore glycoprotein as a vaccine against anthrax
EP0081582B1 (en) Composition of a novel immunogen for protection against diarrheal disease caused by enterotoxigenic escherichia coli
EP0623026A1 (en) Detoxified lps-cholera toxin conjugate vaccine for prevention of cholera
JP6784841B2 (ja) ヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型に対するワクチンとしての安定した加水分解耐性合成ポリリボシルリビトールホスフェート誘導体
Haughton et al. Suppression or augmentation of the antihapten response in mice by antibodies of different specificities
Estrada et al. Intestinal immunization of mice with antigen conjugated to anti-MHC class II antibodies
Svenson et al. Artificial salmonella vaccines
EP0471954A2 (en) Immunogenic conjugates of nontoxic oligosaccharide derived from bordetella pertussis lipooligosaccharide
KR20010034124A (ko) 포유동물에서 모락셀라(브란하멜라) 카타르할리스 감염의예방을 위한 리포올리고당에 기초한 백신

Legal Events

Date Code Title Description
PBP Patent lapsed