DE60117164T2

DE60117164T2 - Impfstoffe mit erhöhter immunantwort und verfahren zur deren herstellung

Info

Publication number: DE60117164T2
Application number: DE2001617164
Authority: DE
Inventors: George Robert Dartmouth BROWN; Bill Dartmouth POHAJDAK; Charles Warwick Halifax KIMMINS
Original assignee: IMMUNO VACCINE TECHNOLOGIES IN; Immuno Vaccine Technologies Inc Halifax
Current assignee: IMMUNO VACCINE TECHNOLOGIES IN; Immuno Vaccine Technologies Inc Halifax
Priority date: 2000-11-07
Filing date: 2001-10-31
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2021-11-01
Also published as: US20090092666A1; AU2002214861B2; US8628937B2; US9114174B2; EP1333858A1; US20050019339A1; JP4164361B2; US6793923B2; CA2428103A1; DE60117164D1; CA2428103C; EP1333858B8; EP1333858B1; WO2002038175A1; ES2258108T3; US20020110568A1; JP2004512384A; AU1486102A; ATE317267T1; US20140099358A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Immunologie, insbesondere Impfstoffe und ihre Herstellung.
Hintergrund der Erfindung
Im Allgemeinen verwenden Impfstoffe geringe Dosen eines spezifischen Antigens, um eine Resistenz in einem Wirt gegen die Wirkungen von höheren Dosen des Antigens oder ähnlicher antigener Verbindungen aufzubauen. In Impfstoffen verwendete Antigene sind normalerweise Teile von ganzen Organismen oder denaturierte Toxine (Toxoide), die die Herstellung von Antikörpern anregen. Allerdings binden nur manche der gebildeten Antikörper an den Zielorganismus oder -toxin, da sich in den meisten Fällen das in dem Impfstoff verwendete Antigen strukturell von dem Ziel unterscheidet. Die eingeschränkte Verfügbarkeit von geeigneten Antigenen hat die Impfstoffentwicklung in der Vergangenheit eingeschränkt. Fortschritte in der Gentechnik haben die Herstellung von Antigenen durch rekombinante Verfahren möglich gemacht. Jedoch führt die Verwendung von durch rekombinante Verfahren hergestellten Antigenen oft zu geringer Bildung von Antikörpern mit geringer Affinität für die nativen Zielantigene aus vorstehend genannten Gründen. Die Wirkung einer Immunisierung kann erhöht werden, wenn mehr Antikörper mit hoher Affinität für ihr Ziel gebildet werden. Es besteht ein Bedürfnis in der Technik, Impfstoffe herzustellen, die eine verbesserte Immunantwort ohne Erhöhung der Menge an im Impfstoff verwendeten Antigen hervorrufen. Insbesondere gibt es einen Bedarf für Impfstoffe zur einmaligen Verabreichung, die das Erfordernis für Auffrischungsimmunisierungen beseitigen oder reduzieren.
Viele Immunisierungsstrategien würden von einer solchen Entwicklung profitieren. Impfstoffe, die Antigene aus Säuger-, viralen, bakteriellen, Pilz- oder Hefequellen verwenden, haben viele Verwendungen. Zum Beispiel sind Antigene aus viralen, bakteriellen, Pilz- oder Hefequellen bei der Krankheitsvorbeugung nützlich. Antigene aus Säugern können in der Krebstherapie oder in der immunologischen Empfängnisverhütung verwendet werden. Impfstoffe zur immunologischen Empfängnisverhütung verwenden Antigene aus Säugern, die zu vorübergehender Unfruchtbarkeit oder Sterilität eines Wirtes, insbesondere eines Säugerwirtes, durch die Bevorzugung der Bildung von Antikörpern mit Affinität für die Oozytenoberfläche führen. Impfstoffe zur immunologischen Empfängnisverhütung werden bei der Kontrolle von Wildtierbeständen verwendet, einschließlich den Populationen von verwilderten Haustieren wie Katzen.
Insbesondere sind Populationen verwilderter Katzen schwierig zu kontrollieren und bedrohen viele Vögel und kleine Tiere. Streunende verwilderte Katzen dienen auch als Vektoren für humane und Tierkrankheiten. Verschiedene Verfahren, einschließlich Bejagen, Fallenstellen und Vergiften, sind beim Versuch verwendet worden, Populationen streunender Katzen zu kontrollieren, aber diese Verfahren sind auf eingeschränkten Erfolg und öffentlichen Widerspruch gestoßen. Während der letzten zwei Dekaden ist die chirurgische Sterilisation von verwilderten Katzen als humanes Werkzeug zur Verringerung der Populationen verwilderter Katzen vermehrt verwendet worden. Die Akzeptanz dieses Verfahrens ist weit verbreitet; Nachteile umfassen jedoch Kosten, Verhaltensänderungen und das Risiko einer Infektion und Sterblichkeit. Trotz des Erfolges der großangelegten chirurgischen Sterilisation sind solche Programme finanziell und logistisch an vielen Orten nicht durchführbar, da das Einfangen der Tiere zeitaufwändig, schwierig und für die Tiere anstrengend ist. Die immunologische Empfängnisverhütung bietet ein alternatives Verfahren mit geringeren Kosten und leichter Verabreichbarkeit. Jedoch benötigt die langzeitige immunologische Empfängnisverhütung im Allgemeinen Auffrischungsimpfungen, was sie unpraktikabel zur Kontrolle von wilden und freilaufenden Spezies macht.
Im Allgemeinen umfassen Impfstoffe ein Antigen, das die Immunantwort im Wirt auslöst, und eine Anzahl an Trägern, Exzipienzien und Hilfsmitteln (Adjuvantien), die zur Verabreichung des Antigens an den Wirt geeignet sind.
Liposome, die das Antigen einkapseln, werden zunehmend bei der Impfstoffzufuhr verwendet. Es ist gezeigt worden, dass die Abgabe über Liposome von denaturierten Antigenen die Bildung von Antikörpern bevorzugt, die native Epitope erkennen (Muttilainen, S., I. Idanpaan-Heikkila, E. Wahlstrom, M. Nurminen, P. H. Makela und M. Sarvas. 1995. "The Neisseria meningitidis outer membrane protein P1 produced in Bacillus subtilis and reconstituted into phospholipid vesicles elicits antibodies to native P1 epitopes", Microbial Pathogen. 18: 423–436). Während Liposome geeignete Impfstofftransportvehikel sind, hat ihre Verwendung alleine insbesondere im Hinblick auf Impfstoffe zur immunologischen Empfängnisverhütung keinen wirksamen Impfstoff zur einmaligen Anwendung bereitgestellt.
Die meisten Impfstoffe zur immunologischen Empfängnisverhütung verwenden Freund's komplettes Adjuvans (FCA) gefolgt von Freund's inkompletten Adjuvans (FIA) bei mehrfachen Injektionen, um die Bildung von genügend Antikörpern für eine immunologische empfängnisverhütende Wirkung zu unterstützen (siehe Ivanova, et al., 1995, "Contraceptive potential of porcine zona pellucida in cats", Theriogenology. 43: 969–981 und Sacco et al., 1989. "Effect of varying dosage and adjuvants on antibody response in squirrel monkeys (Saimiri sciureus) immunized with the porcine zona pellucida Mr = 55,000 glycoprotein (ZP3)." Am. J. Reprod. Immunol. 21: 1–8). Andere Adjuvantien wie Ribi^TM und TiterMax^TM sind von einigen Forschern verwendet worden. Alaun (Aluminiumphosphat und/oder -hydroxid) hat eine lange Geschichte in der Verwendung als Adjuvans. Alaun ist das einzige durch die US-Food and Drug Administration als sicher eingestufte Adjuvans. Viele Alaun-verwendende Impfstoffe zur immunologischen Empfängnisverhütung benötigen eine primäre Injektion und einige Auffrischungsinjektionen, um genügend Antikörper für eine immunologische empfängnisverhütende Wirkung zu bilden (siehe Bagavant et al., 1994. "Antifertility effects of porcine zona pellucida-3 immunization using permissible adjuvants in female bonnet monkeys (Macaca radiata): reversibility, effect on follicular development and hormonal profiles". J. Reprod. Fertil. 102: 17–25). Einige Studien haben gezeigt, dass Alaun kein geeignetes Adjuvans für zona pellucida-Impfstoffe zur immunologischen Empfängnisverhütung ist (siehe Sacco et al., 1989. Am. J. Reprod. Immunol. 21: 1–8 und Bagavant et al., 1994, J. Reprod. Fertil. 102: 17–25).
Der Stand der Technik beruht im Allgemeinen auf der Verwendung eines wässrigen Mediums oder von Öl-in-Wasser-Emulsionen als Träger. Zum Beispiel verwenden Muttilainen et al. (Microbial Pathogen. 18: 423–436 (1995)) ein wässriges Medium in Kombination mit liposomaler Abgabe, um eine Immunantwort hervorzurufen. Popescu (US-PSen 5,897,873, veröffentlicht am 27. April 1999 und 6,090,406, veröf fentlicht am 18. Juli 2000), Alving (US-PSen 6,093,406, veröffentlicht am 25. Juli 2000 und 6,110,492, veröffentlicht am 29. August 2000) und Muderhwa et al. ("Oilin-water liposomal emulsions: Characterization and potential use in vaccine delivery", (Dezember, 1999) J. Pharm. Sci. 88(12): 1332–9) verwenden ebenfalls liposomale Systeme zusammen mit einem Öl-in-Wasser-Träger als Abgabesystem in einem Impfstoff. Popescu verwendet Alaun mit Liposomen, die aus Cholesterin verestert mit Succinat oder anderen organischen Säuren bestehen. Die US-PS 6,093,406 beschreibt die Verwendung von Alaun und Liposomen, die Lipid A oder nicht-pyrogenes Lipid A in einer Öl-in-Wasser-Emulsion zur Abgabe eines auf Malaria-Antigenen basierenden Impfstoffes enthalten. Die US-PS 6,110,492 und Muderhwa beschreiben die Verwendung von Liposomen, die Lipid A oder nicht-pyrogenes Lipid A in einer Öl-in-Wasser-Emulsion zur Abgabe von Prostata-spezifischen Antigenen enthalten. Hilbert et al. 1999 "Biodegradable microspheres containing influenza A vaccine: immune response to mice" Vaccine. 17 (9–10): 1065–1073 betrifft Versuche, das Problem der fehlenden physikalischen Assoziationen zwischen Antigen und Adjuvans bei Influenza-Impfstoffen zu lösen. Wie von Hilbert et al. diskutiert, ist die Mikro-Verkapselung des Antigens und des Adjuvans in Polyester-Mikrosphären als Lösung vorgeschlagen worden. Jedoch ist Proteindenaturierung und -aggregation beobachtet worden, wenn PLGA-Mikrosphären verwendet werden. Bessere Ergebnisse sind berichtet worden, wenn ABA-Triblock-Copolymer-Mikrosphären verwendet werden. Hilbert et al. verglichen die Immunantwort gegen Influenza-Antigenbeladene Mikrosphären hergestellt aus entweder PLGA oder ABA (zwei Polyestermaterialien) mit einem herkömmlichen flüssigen Impfstoff. Die Polyester-Mikrosphären waren in einem wässrigen Injektionsvehikel (d.h. Träger) zur Immunisierung von Mäusen suspendiert.
Die US-PS 5,736,141, veröffentlicht am 7. April 1998, beschreibt einen Impfstoff für immunologische Empfängnisverhütung zur einmaligen Anwendung für Robben, erhalten von zona pellucida-Antigenen. Während die mit diesem Impfstoff erhaltenen Ergebnisse gut sind, gibt es noch immer ein Bedürfnis für einen langanhaltenden Impfstoff zur immunologischen Empfängnisverhütung zur einmaligen Anwendung, der in einer Anzahl an Spezies wirksam ist und von der US-Food and Drug Administration freigegebene Adjuvantien verwendet.
Es besteht auch ein Erfordernis für langanhaltende Immunimpfstoffe im Allgemeinen, die unter Verwendung von einer Auswahl an Antigenen in einer Anzahl an Spezies und unter Verwendung von von der US-Food and Drug Administration freigegebenen Adjuvantien wirksam ist.
Zusammenfassung der Erfindung
In Übereinstimmung mit der Erfindung wird eine Zusammensetzung zur Verwendung als Impfstoff bereitgestellt, umfassend:

(a) einen Träger, umfassend eine kontinuierliche Phase einer pharmazeutisch und/oder immunologisch annehmbaren hydrophoben Substanz;
(b) Liposomen;
(c) ein Antigen; und
(d) ein geeignetes Adjuvans.

Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung von:

(a) einem Träger, umfassend eine kontinuierliche Phase einer pharmazeutisch und/oder immunologisch annehmbaren hydrophoben Substanz;
(b) Liposomen;
(c) einem Antigen; und
(d) einem geeigneten Adjuvans

Ferner wird ein Verfahren zur Herstellung einer Impfstoffzusammensetzung bereitgestellt, das die Schritte umfasst:

(a) Verkapseln eines Antigens oder eines Antigen/Adjuvanskomplexes in Liposomen, um ein Liposom-verkapseltes Antigen zu bilden;
(b) Mischen des Liposom-verkapselten Antigens mit einem Träger, umfassend eine kontinuierliche Phase einer pharmazeutisch und/oder immunologisch annehmbaren hydrophoben Substanz; und
(c) Zugeben eines geeigneten Adjuvans, wenn in Teil (a) kein Antigen/Adjuvanskomplex verwendet wird.

Unerwartet und einzigartig ist nun herausgefunden worden, dass die Verwendung einer kontinuierlichen Phase einer hydrophoben Substanz als Träger in einer erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzung die Immunantwort verstärkt. Die verstärkte Antwort ist durch langanhaltende hohe Antikörper-Titer als Folge einer ein zigen Impfstoffverabreichung gekennzeichnet, was zu einer erhöhten Dauer der Immunantwort führt. Insbesondere trifft dies auf Impfstoffe zu, die auch ein Liposom-verkapseltes Antigen und ein Adjuvans (oder Gemische von Antigen/Adjuvans) umfassen. Erfindungsgemäße Impfstoffzusammensetzungen sind im Allgemeinen mit einer einmaligen Dosis wirksam und stellen eine langanhaltende Immunantwort in einer Anzahl an Spezies bereit, die typischerweise keine Auffrischungen benötigt.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Ohne an eine bestimmte Theorie der Wirkungsweise gebunden zu sein, wird vermutet, dass, wenn eine erfindungsgemäße Impfstoffzusammensetzung verwendet wird, die IgG-Antikörper-Bildung in zwei Phasen stattfindet und die gebildeten Antikörper sich in jeder Phase in ihrer Epitop-Erkennung unterscheiden. Die in der zweiten Phase der IgG-Bildung gebildeten Antikörper haben eine höhere Affinität für native Proteinantigene, wodurch der Impfstoff wirksamer wird. Die Verwendung von herkömmlichen Impfstoffen mit einer primären und einer Auffrischungsinjektion stellt Antikörper mit einer Bindungsspezifität für ein Antigen her, die sich von der bei der Verwendung einer erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzung unterscheidet.
Der Träger umfasst eine kontinuierliche Phase einer hydrophoben Substanz, vorzugsweise einer flüssigen hydrophoben Substanz. Die kontinuierliche Phase kann eine im Wesentlichen reine hydrophobe Substanz, ein Gemisch aus hydrophoben Substanzen, eine Emulsion aus Wasser in einer hydrophoben Substanz oder eine Emulsion aus Wasser in einem Gemisch aus hydrophoben Substanzen sein.
Erfindungsgemäß geeignete hydrophobe Substanzen sind diejenigen, die pharmazeutisch und/oder immunologisch annehmbar sind. Idealerweise ist die hydrophobe Substanz solch eine Substanz, die für die Verwendung durch Gesundheitsaufsichtsbehörden wie die US-Food and Drug Administration freigegeben worden ist. Der Träger ist vorzugsweise eine Flüssigkeit, aber bestimmte hydrophobe Substanzen, die keine Flüssigkeiten bei atmosphärischer Temperatur sind, können z.B. durch Erwärmen verflüssigt werden und sind auch für diese Erfindung geeignet.
Öl oder Wasser-in-Öl-Emulsionen sind besonders geeignete Träger für die erfindungsgemäße Verwendung. Öle sollten pharmazeutisch und/oder immunologisch annehmbar sein. Bevorzugte Beispiele für Öle sind Mineralöl (insbesondere leichtes oder gering viskoses Mineralöl), Pflanzenöl (z.B. Mais- oder Canola-Öl), Nussöl (z.B. Erdnussöl) und Squalen. Ein gering viskoses Mineralöl ist am meisten bevorzugt. Tierische Fette und künstliche hydrophobe polymere Materialien, insbesondere solche, die bei atmosphärischer Temperatur flüssig sind oder die relativ einfach verflüssigt werden können, können auch verwendet werden.
Die Menge der verwendeten hydrophoben Substanz ist nicht entscheidend, aber sie liegt typischerweise bei etwa 0,1 ml pro Dosis bis etwa 1,5 ml pro Dosis abhängig von der Größe des Tieres und der Menge des verwendeten Antigens. Für kleine Tiere liegt die Menge der hydrophoben Substanz vorzugsweise bei etwa 0,20 ml bis etwa 1,0 ml pro Dosis, während für große Tiere die Menge vorzugsweise bei etwa 0,45 ml bis etwa 1,5 ml pro Dosis liegt. Typischerweise werden 0,25 ml pro Dosis für kleine Tiere verwendet, während 0,5 ml pro Dosis für große Tiere verwendet werden.
Geeignete Antigene sind beliebige Chemikalien, die eine Immunantwort in einem Wirtsorganismus hervorrufen können. Vorzugsweise ist das Antigen ein geeignetes natives, nicht natives, rekombinantes oder denaturiertes Protein oder Peptid oder ein Fragment davon, das die gewünschte Immunantwort in einem Wirtsorganismus hervorrufen kann. Wirtsorganismen sind bevorzugt Tiere (einschließlich Säuger), mehr bevorzugt Katzen, Kaninchen, Pferde und/oder Rotwild (Hirsche). Das Antigen kann von viraler, bakterieller, protozoaler oder Säuger-Herkunft sein. Antigene sind im Allgemeinen als Chemikalien bekannt (typischerweise Proteine oder andere Peptide), die eine Immunantwort in einem Wirtsorganismus auslösen können. Insbesondere, wenn ein Antigen in einen Wirtsorganismus eingebracht wird, bindet es an einen Antikörper auf B-Zellen, wodurch der Wirt mehr von diesem Antikörper bildet. Für eine allgemeine Beschreibung von Antigenen und der Immunantwort siehe Kuby, J., Immunology, 3. Ausgabe, W. H. Freeman & C. NY (1997).
Antigene, die eine Immunantwort in Bezug auf Krebs, Empfängnisverhütung und andere biologische Zustände oder Wirkungen auslösen, können bei der Herstellung von Immunimpfstoffen verwendet werden. Einige typische, nicht-einschränkende Beispiele für Antigene, die verwendet werden können, sind Alkoholdehydrogenase (ADH), Streptokinase, Hepatitis B-Oberflächenantigen und zona pellucida (ZP)-Glykoproteine.
Wenn die erwünschte Immunantwort die Empfängnisverhütung bei Säugern ist, sind die Ziel-Epitope auf Säuger-Oozyten zu finden. Zona pellucida (ZP)-Glykoproteine oder davon abgeleitete rekombinante Proteine oder Peptidfragmente können in diesem Fall verwendet werden. Insbesondere Hitze-extrahierte gelöste isolierte zona pellucida-Glykoproteine (SIZP) können als Antigen in einem Impfstoff zur immunologischen Empfängnisverhütung verwendet werden. Insbesondere kann die lösliche intakte zona pellucida vom Schwein verwendet werden.
Die Menge an Antigen, die in einer Dosis der Impfstoffzusammensetzung verwendet wird, kann abhängig von der Art des Antigens und der Größe des Wirtes variieren. Ein Fachmann kann ohne übermäßige Versuche die wirksame Menge des Antigens bestimmen, die in einer bestimmten Anwendung verwendet wird.
Im Falle von SIZP liegt die typischerweise verwendete Menge im Bereich von etwa 15 μg bis etwa 2 mg pro Dosis. Bevorzugt ist der Bereich von etwa 20 μg bis etwa 2 mg pro Dosis, mehr bevorzugt von etwa 20 μg bis etwa 200 μg und insbesondere von etwa 40 μg bis etwa 120 μg. Typischerweise liegt die Menge für ein kleines Tier bei etwa 50 μg pro Dosis, während sie für ein großes Tier bei etwa 100 μg pro Dosis liegt.
Bei erfindungsgemäßen Zusammensetzungen stellen Antigene erhöhte Mengen an Wirtsantikörpern her, die an native Epitope des Zielproteins binden. Dies ist der Fall, auch wenn das Antigen ein nicht-natives, rekombinantes oder denaturiertes Protein oder Peptid oder ein Fragment davon sein kann. Nicht auf eine bestimmte Theorie abzielend kann dies darin begründet sein, dass das Antigen in einer nativähnlichen dreidimensionalen Konformation in den Liposomen gehalten wird.
Liposome sind komplett geschlossene Lipid-Doppelschichtmembranen, die ein eingekapseltes wässriges Volumen enthalten. Liposome können unilamellare Vesikel (mit einer einzelnen Doppelschichtmembran) oder multilamellare Vesikel sein (Zwiebel-ähnliche Strukturen gekennzeichnet durch Multimembran-Doppelschichten, die jeweils durch eine wässrige Schicht voneinander getrennt sind). Eine allgemeine Beschreibung von Liposomen kann gefunden werden in Gregoriadis G. (1990) Immunological adjuvants: A role for liposomes, Immunol. Today 11: 89–97 und Frezard, F. (1999) Liposomes: From biophysics to the design of peptide vaccines. Brraz. J. Med. Bio. Res 32: 181–189.
Obwohl jegliche Liposome in dieser Erfindung verwendet werden können, einschließlich Liposome aus archaebakteriellen Lipiden, verwenden besonders geeignete Liposome Phospholipide und unverestertes Cholesterin in der Liposomrezep tur. Das Cholesterin wird zur Stabilisierung der Liposome verwendet und jegliche andere Verbindung, die Liposome stabilisiert, kann das Cholesterin ersetzen. Andere Liposom-stabilisierende Verbindungen sind dem Fachmann bekannt. Die Verwendung der besonders bevorzugten Liposome kann zur Verringerung der elektrostatischen Assoziation zwischen dem Antigen und den Liposomen führen. Deswegen kann sich ein Großteil des Antigens im Inneren der Liposome ansammeln.
Bevorzugt bei der Herstellung der Liposome verwendete Phospholipide sind diejenigen mit mindestens einer Kopfgruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phosphoglycerin, Phosphoethanolamin, Phosphoserin, Phosphocholin und Phosphoinositol. Mehr bevorzugt sind Liposome, die Lipide in Phospholipon 90G^TM umfassen.
Die Menge des zur Bildung von Liposomen verwendeten Lipids hängt vom verwendeten Antigen ab, liegt aber typischerweise in einem Bereich von etwa 0,05 g bis etwa 0,5 g pro Dosis des Impfstoffs. Vorzugsweise liegt die Menge bei etwa 0,1 g pro Dosis. Wenn auch unverestertes Cholesterin bei der Liposomrezeptur verwendet wird, wird das Cholesterin in einer Menge äquivalent zu etwa 10% der Menge des Lipids verwendet. Die bevorzugte Menge an Cholesterin ist etwa 0,01 g pro Dosis des Impfstoffes. Wenn eine andere Verbindung als Cholesterin zur Stabilisierung der Liposome verwendet wird, kann ein Fachmann leicht die für die Rezeptur benötigte Menge bestimmen.
In einem mehr bevorzugten Aspekt sind die erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzungen im Wesentlichen frei von Lipid A, einschließlich nicht-pyrogenem Lipid A. Für die Zwecke dieser Beschreibung ist zu verstehen, dass, wenn der Ausdruck Lipid A verwendet wird, er auch nicht-pyrogenes Lipid A umfasst. Lipid A wird oft in liposomalen Rezepturen des Stands der Technik gefunden. Lipid A hat viele unerwünschte Nebenwirkungen, die unter Verwendung von nicht-pyrogenem Lipid A vermieden werden können, aber selbst dann hat Lipid A viele pharmazeutische Reaktionen außer der pyrogenen und kann immer noch viele ungünstige Reaktionen hervorrufen. Es ist daher wünschenswert, Lipid A von den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen auszuschließen.
Geeignete Adjuvantien sind Alaun, andere Verbindungen von Aluminium, Bacillus Calmette-Guerin (BCG), TiterMax^TM, Ribi^TM, Freund's komplettes Adjuvans (FCA) und ein neues Adjuvans beschrieben durch das National Wildlife Research Center des United States Department of Agriculture (USDA) auf ihrer Internetseite http://www.aphis.usda.gov/ws/nwrc/pzp.htm, basierend auf Johne's Antigen. Alaun, andere Verbindungen von Aluminium, TiterMax^TM und das neue USDA-Adjuvans sind bevorzugt. Verstärkte Immunantwort wird auch gefunden, wenn das Adjuvans Alaun ist, was in Hinblick auf den Stand der Technik überraschend ist (Sacco et al., 1989. Am. J. Reprod. Immunol., 21: 1–8). Alaun ist als Adjuvans besonders bevorzugt.
Alaun wird im Allgemeinen als ein beliebiges Salz von Aluminium angesehen, insbesondere die Salze mit anorganischen Säuren. Hydroxid- und Phosphatsalze sind als Adjuvantien besonders geeignet. Ein geeignetes Alaun-Adjuvans wird unter dem Handelsnamen ImjectAlum^TM (Pierce Chemical Company) vertrieben und besteht aus einer wässrigen Lösung von Aluminiumhydroxid (45 mg/ml) und Magnesiumhydroxid (40 mg/ml) mit inaktiven Stabilisatoren. Alaun ist ein besonders vorteilhaftes Adjuvans, da es schon behördliche Freigabe hat und weithin akzeptiert ist.
Die Menge des verwendeten Adjuvans hängt von der Menge des Antigens und von der Art des Adjuvans ab. Ein Fachmann kann leicht die bei einer bestimmten Anwendung benötigte Menge an Adjuvans bestimmen. Für immunologische Empfängnisverhütung ist eine geeignete Menge an ImjectAlum^TM für ein Kaninchen 0,1 ml/Dosis an Impfstoff, wobei eine geeignete Menge an ImjectAlum^TM für ein Pferd bei 0,5 ml/Dosis liegt.
Die Impfstoffzusammensetzung ist allgemein gestaltet aus: Verkapseln eines Antigens oder eines Antigen/Adjuvans-Komplexes in Liposomen zur Bildung eines Liposom-verkapselten Antigens und Mischen des Liposom-verkapselten Antigens mit einem Träger, der eine kontinuierliche Phase einer hydrophoben Substanz umfasst. Wenn kein Antigen/Adjuvans-Komplex im ersten Schritt verwendet wird, kann ein geeignetes Adjuvans zu dem Liposom-verkapselten Antigen, zu dem Gemisch aus Liposom-verkapseltem Antigen und Träger oder zu dem Träger vor der Vermischung des Trägers mit dem Liposom-verkapselten Antigen gegeben werden. Die Reihenfolge des Verfahrens kann von der Art des verwendeten Adjuvans abhängen. Wenn ein Adjuvans wie Alaun verwendet wird, werden das Adjuvans und das Antigen typischerweise zuerst zur Bildung eines Antigen/Adjuvans-Komplexes gemischt, gefolgt von der Verkapselung des Antigen/Adjuvans-Komplexes mit Liposomen. Das erhaltene Liposom-verkapselte Antigen wird dann mit dem Träger gemischt. (Es sollte beachtet werden, dass der Ausdruck "Liposom-verkapseltes Antigen" die Verkapse lung des Antigens alleine oder die Verkapselung des Antigen/Adjuvans-Komplexes abhängig von dem Zusammenhang bezeichnen kann.) Dies fördert den korrekten Kontakt zwischen dem Adjuvans und dem Antigen und kann zumindest teilweise für die überraschend gute Immunantwort verantwortlich sein, wenn Alaun als Adjuvans verwendet wird. Wenn ein anderes verwendet wird, kann das Antigen zuerst in den Liposomen verkapselt werden und das erhaltene Liposom-verkapselte Antigen wird dann mit dem Adjuvans in einer hydrophoben Substanz gemischt.
Beim Gestalten einer im Wesentlichen wasserfreien Impfstoffzusammensetzung wird das Antigen oder der Antigen/Adjuvans-Komplex mit Liposomen verkapselt und mit einer hydrophoben Substanz gemischt. Beim Gestalten eines Impfstoffes in einer Emulsion aus Wasser in einer hydrophoben Substanz wird das Antigen oder der Antigen/Adjuvans-Komplex mit Liposomen in einem wässrigen Medium verkapselt, gefolgt von Mischen des wässrigen Mediums mit einer hydrophoben Substanz. Um die hydrophobe Substanz in einer kontinuierlichen Phase zu halten, kann im Falle der Emulsion das Liposomen-enthaltende wässrige Medium in Aliquots unter Rühren zu der hydrophoben Substanz gegeben werden.
Bei allen Verfahren der Rezeptur kann das Liposomen-verkapselte Antigen gefriergetrocknet werden, bevor es je nach Ausführung mit der hydrophoben Substanz oder dem wässrigen Medium vermischt wird. In einigen Fällen kann ein Antigen/Adjuvans-Komplex durch Liposome verkapselt werden, gefolgt von der Gefriertrocknung. In anderen Fällen kann das Antigen durch Liposome verkapselt werden, gefolgt von der Zugabe des Adjuvans und danach der Gefriertrocknung, um ein gefriergetrocknetes Liposom-verkapseltes Antigen mit externem Adjuvans zu bilden. In einem weiteren Fall kann das Antigen durch Liposome verkapselt werden, gefolgt von Gefriertrocknung vor der Zugabe des Adjuvans. Gefriertrocknung kann eine bessere Interaktion zwischen dem Adjuvans und dem Antigen fördern, was zu einem wirksameren Impfstoff führt.
Eine Rezeptur des Liposom-verkapselten Antigens in einer hydrophoben Substanz kann auch die Verwendung eines Emulgators umfassen, um eine gleichmäßigere Verteilung der Liposome in der hydrophoben Substanz zu fördern. Typische Emulgatoren sind bekannt und umfassen Mannidoleat (Arlacel^TM A), Lecithin, Tveen^TM 80 und Spans^TM 20, 80, 83 und 85. Mannidoleat ist ein bevorzugter Emulgator. Der Emulgator wird in einer Menge verwendet, die wirksam ist, eine gleichmäßige Verteilung der Liposome zu fördern. Typischerweise ist das Volumenverhältnis (v/v) von hydrophober Substanz zu Emulgator im Bereich von etwa 5:1 bis etwa 15:1 mit einem bevorzugten Verhältnis von etwa 10:1.
Die Verabreichung der Impfstoffzusammensetzung kann durch jegliches herkömmliche Verfahren durchgeführt werden und hängt von dem verwendeten Antigen ab. Impfstoffzusammensetzungen können parenteral (einschließlich intramuskulär und subkutan) oder rektal verabreicht werden. Parenterale Verabreichung ist bevarzugt.
Besonders geeignete Einheitsdosierungsformen für die parenterale Anwendung sind Ampullen. Techniken, die den Impfstoff durch Injektion oder durch Fernzufuhr unter Verwendung von Pfeilen, federgetriebenen Spritzen an Impfstöcken, Luft-/Kohlendioxid-betriebenen Gewehren, Revolvern und/oder Ballistivet^TM-Biokugeln zuführen und die biologische Aktivität erhalten, sind besonders bevorzugt.
Die Menge einer Impfstoffzusammensetzung, die einem Wirt verabreicht wird, kann von der Menge des in einer Dosis verwendeten Antigens und von der wirksamen Menge des Antigens abhängen, die für eine bestimmte Anwendung benötigt wird. Im Falle von SIZP liegt die Größe jeder Dosis, die an ein Tier verabreicht wird, typischerweise bei etwa 0,25 ml bis etwa 2,0 ml, abhängig von der Größe des Tiers. Für kleinere Tiere (z.B. Katzen, Kaninchen, usw.) liegt die Größe der Dosis typischerweise bei etwa 0,5 ml, während für größere Tiere (z.B. Pferde, Damhirsche, Weißwedelhirsche, usw.) die Größe der Dosis typischerweise bei etwa 1,0 ml liegt. Auch wenn die Menge an SIZP verändert wird, wird die Dosisgröße typischerweise relativ konstant gehalten.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die Erfindung wird nun durch nicht-einschränkende Beispiele unter Berücksichtigung der angehängten Zeichnung beschrieben, in der:
1 ein Diagramm ist, das die Position der rekombinanten ZPB1 und ZPB2 im ZPB-Protein und ZPC1 und ZPC2 im ZPC-Protein der zona pellucida vom Schwein zeigt, die in pRSET-Vektoren hergestellt wurden.
BEISPIELE
Beispiel 1: Herstellung der Impfstoffzusammensetzung
Die Impfstoffzusammensetzung kann wasserfrei oder mit verschiedenen Mengen an Wasser (unter Verwendung von einem wässrigen Medium, z.B. einer physiologischen Kochsalzlösung, einer Phosphat-gepufferten physiologischen Kochsalzlösung (PBS) oder Pyrogen-freiem Wasser) gebildet werden, während eine kontinuierliche Ölphase beibehalten wird. Das nachstehend beschriebene Verfahren 1 trifft auf die wasserfreie Rezeptur der Impfstoffzusammensetzung zu. Das nachstehend beschriebene Verfahren 2 trifft auf die Wasser-enthaltende Rezeptur der Impfstoffzusammensetzung zu, d.h. die Wasser-in-Öl-Emulsion. Die zwei Verfahren können auch abhängig von dem verwendeten Adjuvans variieren. Zum Beispiel betrifft Verfahren A Rezepturen der Alaun-enthaltenden Impfstoffzusammensetzung und Verfahren B betrifft Rezepturen mit Freund's komplettem Adjuvans (FCA). Andere Adjuvanzien können durch Anpassen von entweder Verfahren A oder Verfahren B aufgenommen werden. Die nachstehend beschriebenen Verfahren umfassen lösliche intakte zona pellucida (SIZP) vom Schwein als Antigen, andere Antigene können SIZP in der Rezeptur ersetzen. Zum Beispiel können Alkoholdehydrogenase (ADH), Streptokinase oder Hepatitis B-Oberflächenantigen auch als das Antigen verwendet werden.
Verfahren 1: Wasserfreie Rezeptur
Verfahren A. Alaun-Adjuvans.
SIZP wird wie beschrieben hergestellt (Brown, R. G., W. D. Bowen, J. D. Eddington, W. C. Kirnmins, M. Mezei, J. L. Parsons, B. Pohajdak. (1997) Temporal trends in antibody production in captive grey seals, harp and hooded seals to a single administration immunocontraceptive vaccine. J. Reproductive Immunology 35: 53–64). Die Menge an SIZP, die für die herzustellende Anzahl an Dosen des Impfstoffes benötigt wird, wird abgewogen (die übliche zur Immunisierung verwendete Menge an SIPZ ist 50 μg für kleine Tiere und 100 μg für große Tiere). Das SIZP wird in Pyrogen-freiem destilliertem Wasser mit einer Endkonzentration von 2 mg/ml gelöst. Ein gleiches Volumen an ImjectAlum^TM (ein Alaun-Erzeugnis von Pierce Chemical Co., Katalog # 77161) wird zugegeben und die Suspension wird gemischt und dann gefriergetrocknet.
Zur Bildung von Liposomen wird Phospholipon 90 G (oder andere Lipide ausgewählt aus Phosphoglycerin, Phosphoethanolamin, Phosphoserin, Phosphocholin, Phosphoinositol, archaebakterielle Lipide, ohne Einschränkung, die eine geschlossene Lipid-Doppelschicht bilden, die ein verkapseltes Antigen enthält) abgewogen (0,1 g/Dosis der Impfstoffzusammensetzung). Das Phospholipon 90 G wird mit Cholesterin (0,01 g/Dosis der Impfstoffzusammensetzung) gemischt und das Gemisch wird in Chloroform:Methanol (1/1; v/v; 1,5 ml/Dosis der Impfstoffzusammensetzung) gelöst. Cholesterin kann durch andere Verbindungen ersetzt werden, die die Liposomen bei vom Fachmann bestimmten Konzentrationen stabilisieren. Gewaschene Glaskügelchen (mit ungefähr 3 mm Durchmesser; 15 ml für 10 Dosen des Impfstoffes) werden zugegeben und das Gemisch wird unter verringertem Druck unter Verwendung eines Rotationsverdampfers verdampft, bis es frei von Chloroform:Methanol ist. Um die Entfernung des gesamten Chloroform:Methanols sicherzustellen, wird das Gemisch in einen Dessikator unter verringertem Druck über Nacht bei Raumtemperatur platziert.
Der gefriergetrocknete SIZP/Alaun-Komplex wird in Pyrogen-freiem destilliertem Wasser (5 ml/mg SIZP) suspendiert und die Suspension wird in den Kolben gegeben, der das Gemisch aus Phospholipon 90 G/Cholesterin enthält, das den Kolben und die Glaskügelchen benetzt. Der Inhalt des Kolbens wird ohne Schütteln 30 Minuten stehen gelassen. Nach 30 Minuten wird der Kolben in ein Wasserbad bei 35–40°C gestellt und vorsichtig mit einem Spatel zur Bildung der Liposome gerührt. Ein Mikroskop wird zur Auswertung der Liposom-Bildung verwendet und es wird unter erhöhtem Schütteln weitergerührt, bis das Gemisch hauptsächlich vom Fachmann erkennbare multilamellare Liposome enthält. Die Liposome werden gefriergetrocknet und die erhaltenen gefriergetrockneten Liposome werden in niederviskosem Mineralöl (0,25 ml Öl/Dosis für kleine Tiere und 0,5 ml Öl/Dosis für große Tiere) mit Mannidoleat als Emulgator (10:1:Öl:Emulgator:v/v) suspendiert. Da die Liposome in Öl suspendiert werden und nicht in Lösung sind, ist es nötig zu bestimmen, ob das verwendete Verfahren zu einer gleichmäßigen Verteilung von SIZP in jeder Dosis führt. Zur Bestimmung, ob die gefriergetrockneten SIZP-enthaltenden Liposome gleichmäßig in Öl verteilt sind, wird SIZP mit ¹⁴C durch reduktive Methylierung markiert (Jentoft, N. und D. G. Dearborn. 1979. Labelling of proteins by reductive methylation using sodium cyanoboronhydride. J. Biol. Chem. 254: 4359–4365) und das radioaktive SIZP wird zur Herstellung von zwei Impfstoffpräparaten verwendet. Einzelne Dosen des Impfstoffes werden hergestellt und die Radioak tivität in jeder Dosis wird bestimmt, wodurch der Gehalt an SIZP in jeder Dosis des Impfstoffes bestimmt wird (Tabelle 1). Die Verteilung von SIZP in jeder Dosis des Impfstoffs ist gut reproduzierbar (Standardabweichung, SD, war geringer als +/–10%).
Tabelle 1 Verteilung von ¹⁴C-markiertem SIZP in den Dosen des Impfstoffs aus zwei Präparaten
Verfahren B. FCA-Adjuvans
Die Herstellung der Impfstoffzusammensetzung mit FCA als Adjuvans anstelle von Alaun entspricht dem Verfahren A, außer dass SIZP selbst anstatt eines SIZP/Alaun-Komplexes in Liposome verkapselt wird wie vorstehend beschrieben. Die SIZP-enthaltenden Liposome werden gefriergetrocknet und die gefriergetrockneten Liposome werden zu FCA in Aliquots unter Rühren gegeben, um eine gleichmäßige Verteilung der Liposome in Öl zu fördern. Die erhaltene Suspension an gefriergetrockneten SIZP-enthaltenden Liposomen in FCA wird Tieren zur Impfung verabreicht.
Verfahren 2. Wasser-enthaltende Rezepturen
Verfahren A. Alaun-Adjuvans
SIZP wird wie beschrieben hergestellt (Brown, R. G., W. D. Bowen, J. D. Eddington, W. C. Kimmins, M. Mezei, J. L. Parsons, B. Pohajdak. (1997) Temporal trends in antibody production in captive grey seals, harp and hooded seals to a single administration immunocontraceptive vaccine. J. Reproductive Immunology 35: 53–64). Die Menge an SIZP, die für die herzustellende Anzahl an Dosen des Impfstoffs benötigt wird, wird abgewogen (die gewöhnlich zur Immunisierung verwendete Menge an SIZP ist 50 μg für kleine Tiere und 100 μg für große Tiere). Das SIZP wird in Pyrogen-freiem destillierten Wasser mit einer Endkonzentration von 2 mg/ml gelöst. Ein gleiches Volumen an ImjectAlum^TM (ein Alaun-Erzeugnis von Pierce Chemical Co., Katalog # 77161) wird zugegeben und die Suspension wird gemischt und danach gefriergetrocknet.
Zur Bildung von Liposomen wird Phospholipon 90 G (oder andere Lipide ausgewählt aus Phosphoglycerin, Phosphoethanolamin, Phosphoserin, Phosphocholin, Phosphoinositol, usw., die eine geschlossene Lipid-Doppelschicht bilden, die ein verkapseltes wässriges Volumen enthält), abgewogen (0,1 g/Dosis der Impfstoffzusammensetzung). Das Phospholipon 90 G wird mit Cholesterin (0,01 g/Dosis der Impfstoffzusammensetzung) gemischt und das Gemisch wird in Chloroform:Methanol (1/1; v/v; 1,5 ml/Dosis der Impfstoffzusammensetzung) gelöst. Cholesterin kann durch andere Verbindungen ersetzt werden, die Liposome bei vom Fachmann bestimmten Konzentrationen stabilisieren. Gewaschene Glaskügelchen (mit ungefähr 3 mm Durchmesser; 15 ml für 10 Dosen des Impfstoffs) werden zugegeben und das Gemisch wird unter vermindertem Druck unter Verwendung eines Rotationsverdampfers verdampft, bis es frei von Chloroform:Methanol ist. Um die Entfernung des gesamten Chloroform:Methanols sicherzustellen, wird das Gemisch in einen Dessikator unter vermindertem Druck über Nacht bei Raumtemperatur gestellt.
Der gefriergetrocknete SIZP/Alaun-Komplex wird in physiologischer Kochsalzlösung (5 ml/mg SIZP) suspendiert und die Suspension wird in den Kolben gegeben, der das Gemisch aus Phospholipon 90 G/Cholesterin enthält, das den Kolben und die Glaskügelchen beschichtet. Der Inhalt des Kolbens wird 30 Minuten ohne Schütteln stehen gelassen. Nach 30 Minuten wird der Kolben in ein Wasserbad bei 35 bis 40°C gestellt und es wird vorsichtig mit einem Spatel zur Bildung der Liposome gerührt. Ein Mikroskop wird zur Auswertung der Liposom-Bildung verwendet und es wird unter verstärktem Schütteln weiter gerührt, bis das Gemisch hauptsächlich vom Fachmann erkennbare multilamellare Liposome enthält. Die wässrige Suspension der Liposome (0,25 ml/Dosis für kleine Tiere und 0,5 ml/Dosis für große Tiere) wird zu niederviskosem Mineralöl (0,25 ml Öl/Dosis für kleine Tiere und 0,5 ml Öl/Dosis für große Tiere) mit Mannidoleat als Emulgator (10:1:Öl:Emulgator:v/v) gegeben. Die wässrige Suspension der Liposome wird zu der niederviskosen Mineralölphase in Aliquots gegeben, wobei zwischen der Aliquot-Zugabe zur Erhaltung der kontinuierlichen Ölphase gerührt wird.
Verfahren B. FCA-Adjuvans
Die Herstellung der Impfstoff-Zusammensetzung mit FCA als Adjuvans anstelle von Alaun gleicht dem Verfahren A, außer dass SIZP selbst anstatt eines SIZP/Alaun-Komplexes in Liposomen verkapselt wird wie vorstehend beschrieben. Die wässrige Suspension der Liposome wird zu FCA in Aliquots gegeben, wobei zwischen der Aliquot-Zugabe zur Erhaltung der kontinuierlichen Ölphase gerührt wird. Die erhaltene wässrige Suspension der SIZP-enthaltenden Liposome in FCA wird Tieren zur Impfung verabreicht.
Bemerkung: In einigen Versuchen wird die Menge an SIZP variiert, um die Antwort der immunisierten Tiere auf verschiedene Mengen des Antigens zu untersuchen. In solchen Experimenten war das Volumen des an kleine Tiere (Katzen, Kaninchen, usw.) verabreichten Impfstoffs 0,5 ml und das an große Tiere (Pferde, Damhirsche, Weißwedelhirsche usw.) verabreichte Volumen war 1,0 ml. In solchen Fällen wird die Menge an Liposomen in jeder Dosis des Impfstoffes konstant gehalten, während die Menge des in Liposomen verkapselten Antigens variiert.
Beispiel 2: Immunisierung von Kaninchen gegen native und denaturierte Alkoholdehydrogenase (ADH) aus Hefe
Die Impfstoffzusammensetzung ist einzigartig bei der Herstellung von hohen Titern an Anti-SIZP-Antikörpern, die nach einer einmaligen Verabreichung lang-anhaltend sind. Zur Bestimmung, ob die Impfstoffzusammensetzung hohe Antikörper-Titer mit anderen Antigenen erzeugt, insbesondere mit Proteinen, die nicht an Zellmembranen gebunden sind, werden Kaninchen mit Alkoholdehydrogenase (ADH) aus Hefe immunisiert. Zwei Formen an ADH werden als Antigen verwendet, und zwar native ADH und ADH, die zur Denaturierung des Proteins behandelt wurde. Zur Denaturierung von ADH wird diese mit Mercaptoethanol behandelt (10% v/v in Tris-Puffer, 0,1 M, pH 7,5, 30 Minuten, 100°C). Die Lösung wird gegen destilliertes Wasser dialysiert und gefriergetrocknet. Vier Kaninchen (2 für jede Behandlung) werden mit nativer oder denaturierter ADH (40 μg) unter Verwendung einer primären Injektion mit Freund's komplettem Adjuvans (FCA) immunisiert, gefolgt von einer einen Monat später gegebenen Auffrischungsinjektion mit Freund's inkomplettem Adjuvans (FIA). Die Nachimmunisierungsperiode gilt nach der Auffrischungsinjektion als begonnen. Zur gleichen Zeit, bei der die Auffrischungsinjektion verabreicht wird, werden 4 Kaninchen (2 für jede Behandlung) durch einmalige Verabreichung von entweder nativer oder denaturierter ADH (40 μg) unter Verwendung der Impfstoffzusammensetzung immunisiert, d.h. ADH ist in Liposome verkapselt, die in physiologischer Kochsalzlösung (0,5 ml) suspendiert und in FCA (0,5 ml) emulgiert sind. Anti-ADH-Titer werden mittels ELISA unter Verwendung von nativer und denaturierter ADH gemessen (Tabelle 2).
Wenn Kaninchen mit nativer ADH immunisiert werden, enthält das erhaltene Serum gleiche Mengen an Anti-ADH-Antikörpern, wenn native ADH mit der Impfstoffzusammensetzung zugeführt wird oder unter Verwendung einer primären Injektion mit einer Auffrischung. Im Gegensatz dazu enthält Serum von Kaninchen, die mit durch die Impfstoffzusammensetzung zugeführter denaturierter ADH immunisiert sind, 2,7-fach mehr Antikörper, die an native ADH binden, als Serum von Kaninchen, die mit denaturierter ADH mit einer primären Injektion und einer Auffrischung immunisiert sind (P < 0,01; T = 4,14; df = 6). In allen Fällen sind die Titer in mit nativer ADH immunisierten Kaninchen höher als in mit denaturierter ADH immunisierten Kaninchen. Dies zeigt, dass native ADH ein besseres Antigen als denaturierte ADH ist. Da viele Proteinantigene während der Extraktion und Isolation oder bei der Herstellung mit rekombinanten Verfahren zu einem gewissen Grad denaturiert werden, kann die erhöhte Bildung von Antikörpern, die besser an native Proteine binden, das Ergebnis der Impfung deutlich verbessern, wie durch immunologische Empfängnisverhütung bei einer Auswahl an Säugern mit SIZP unter Verwendung der erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzung gezeigt.
Weiterhin erkennen Anti-ADH-Seren der Kaninchen 237 und 238 denaturierte ADH in Western Blots mit der etwa 4- bis 5-fachen Intensität der Antiseren der Kaninchen 235 und 236. Dies bestätigt die Ergebnisse der Titermessungen, was zeigt, dass Immunisierung von Kaninchen mit der Impfstoffzusammensetzung die Bildung von Anti-ADH-Antikörpern bevorzugt, die besser an native ADH binden, da für viele Proteine bekannt ist, dass sie sich während des Western Blot-Protokolls in einen mehr nativen Zustand zurückfalten. Diese Schlussfolgerung wird durch Muttilainen et al. (1995) mit einer Studie des Neisseria meningitidis-Außenmembranproteins P1 gestützt, die herausgefunden haben, dass Antikörper gegen natives P1 in mit denaturiertem P1 in Phospholipidvesikeln (Liposomen) geimpften Mäusen gebildet wurden. Jedoch verwendeten Muttilainen et al. (1995) kein Öl in ihrer Impfstoffrezeptur, wodurch sich ihr Immunisierungsprotokoll von der vorliegenden Erfindung unterscheidet. Tabelle 2 Bildung von Anti-ADH-Antikörpern in Kaninchen, immunisiert mit nativer oder denaturierter ADH, zugeführt mit und ohne Liposom-Verkapselung

¹ Anti-ADH-Serum aus Kaninchen 234 wird als Referenzserum verwendet.
² Native und denaturierte ADH werden mit der Impfstoffzusammensetzung verabreicht, die in Liposomen verkapselt ist mit FCA als eine einmalige I. M.-Injektion (+Liposome) oder suspendiert in FCA gefolgt von einer Auffrischungsinjektion einen Monat später mit FIA (–Liposome). Kaninchen erhalten 40 μg ADH mit jeder Verabreichung.
³ ADH wird von Sigma Chemical Co. erhalten. Denaturierte ADH wird durch Behandlung der nativen ADH mit Mercaptoethanol und Erhitzung auf 100°C für 30 Minuten hergestellt. Die erhaltene denaturierte ADH enthält drei Hauptproteine mit Molekulargewichten von 26, 33 und 40 kDa. Die Titer werden mittels ELISA unter Verwendung von nativer und denaturierter ADH als Antigen zur Beschichtung der ELISA-Platten an getrennten Positionen gemessen.
⁴ Nachimmunisierung in Monaten.

Anmerkung: Das in Tabelle 2 angeführte Referenzserum ist das Serum des Kaninchens ID Nr. 234.
Beispiel 3: Immunologische Empfängnisverhütung bei Kaninchen
Seren von Kaninchen, die mit einem Placebo-Impfstoff immunisiert worden sind, der alle Inhaltsstoffe der Impfstoffzusammensetzung außer dem Antigen (SIZP von Schwein) enthält, enthalten keine Anti-SIZP-(Schwein)-Antikörper (siehe Tabelle 3A). Immunisierung von Kaninchen mit SIZP vom Schwein (40 μg) verkapselt in Liposomen, die Phospholipon 90 G (0,1 g) und Cholesterin (0,01 g) in physiologischer Kochsalzlösung (0,5 ml) emulgiert in FCA-Adjuvans (0,5 ml) enthalten, bildet in Folge einer einmaligen Verabreichung des Impfstoffs hohe Titer an Anti-SIZP-Antikörpern während der 12-monatigen Nachimmunisierungs-Überwachungsperiode. Immunisierung von Kaninchen mit SIZP vom Schwein (40 μg) verkapselt in Liposomen mit MF 59-Adjuvans (0,5 ml) bildet geringe Anti-SIZP-Titer. Im Gegensatz dazu bildet die Immunisierung von Kaninchen mit SIZP vom Schwein verkapselt in Liposomen mit Alaun-Adjuvans (100 μl, Pierce ImjectAlum^TM) Anti-SIZP-(Schwein)-Titer, die in der frühen Nachimmunisierungsphase geringer sind als die unter Verwendung von FCA produzierten Titer, aber im 12. Monat der Nachimmunisierungsphase sind die Titer weniger verschieden zwischen den Alaun- und den FCA-Ansätzen. Durch die Züchtung von Kaninchen wurde ermittelt, dass eine einmalige Verabreichung des Impfstoffes mit FCA oder Alaun die Fruchtbarkeit der Kaninchen um 79% bzw. 74% verringert (Tabelle 3B). Immunisierung von Kaninchen durch eine einmalige Injektion von nicht in Liposomen verkapseltem SIZP (40 μg) mit Gerbu-Adjuvans produziert geringe Anti-SIZP-(Schwein)-Titer (Tabelle 3A). Wie von den Anti-SIZP-Titern erwartet, haben Kaninchen, die mit nicht in Liposomen verkapselter SIZP mit Gerbu-Adjuvans immunisiert worden sind, die gleiche Fruchtbarkeit wie Kaninchen, die den Placebo-Impfstoff erhalten haben (Tabelle 3B). Diese Ergebnisse zeigen, dass Impfstoffe mit Liposom-verkapseltem Antigen gute Ergebnisse ergeben und dass FCA und Alaun, insbesondere Alaun, besonders gute Adjuvantien sind. Tabelle 3A Wirkung von Adjuvantien auf die Bildung von Anti-SIZP-(Schwein)-Antikörpern in Kaninchen 1

¹ Kaninchen erhalten eine einmalige Verabreichung des Placebo-Impfstoffs, des Impfstoffs mit SIZP vom Schwein (40 μg) verkapselt in Liposomen (0,25 ml) mit entweder FCA-, MF 59- oder Alaun-Adjuvans (0,25 ml) oder des Impfstoffs mit SIZP vom Schwein (40 μg) gelöst in physiologischer Kochsalzlösung (0,25 ml) mit Gerbu-Adjuvans (0,25 ml).

ND: = nicht bestimmt.

Das verwendete Referenzserum stammt aus einem Kaninchen, das mit zona pellucida vom Schwein unter Verwendung einer primären Injektion mit Freund's komplettem Adjuvans und 2 Auffrischungsinjektionen mit Freund's inkomplettem Adjuvans immunisiert worden ist. Tabelle 3B Wirkung von Adjuvantien auf die Fruchtbarkeit von Kaninchen immunisiert gegen SIZP vom Schwein

NM: = wiederholtes Zusammenbringen mit Männchen ohne eine erfolgreiche Paarung

¹ Lebendgeburten infolge einer erfolgreichen Paarung. Die Paarungsintervalle waren 65 ± 10, 141 ± 14 und 216 ± 14 Tage nach Immunisierung für die Paarungen 1, 2 bzw. 3.

Beispiel 4: Immunologische Empfängnisverhütung bei Katzen
Neunundzwanzig gezielt Pathogen-freie Kurzhaarhauskatzen werden in der gezielt Pathogen-freien Anlage an der Universität von Florida unter der Aufsicht von Dr. Julie Levy und Mr. Shawn Gorman gehalten. Der Brunstzyklus wird durch tägliche Beobachtung und vaginale Cytologie überwacht. Die erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzungen, Placebo-Impfstoffe und Serumproben werden als Teil einer Doppeltblindstudie kodiert. Die Katzen werden zufällig in drei Gruppen von je 9 oder 10 Katzen geteilt. Eine Gruppe erhält durch intramuskuläre Injektion einen Placebo-Impfstoff, der alle Komponenten der Impfstoffzusammensetzung außer dem Antigen (SIZP vom Schwein) enthält. Jede Katze dieser Gruppe erhält Liposomen ohne Antigen in physiologischer Kochsalzlösung (0,25 ml) suspendiert in FCA (0,25 ml). Jede Katze aus einer zweiten Gruppe mit neun Katzen wird durch intramuskuläre Injektion mit der Impfstoffzusammensetzung mit SIZP (135 μg) verkapselt in Liposomen in physiologischer Kochsalzlösung (0,25 ml) und suspendiert in FCA (0,25 ml) immunisiert. Jede Katze aus einer dritten Gruppe mit neun Katzen wird durch intramuskuläre Injektion mit der Impfstoffzusammensetzung mit SIZP vom Schwein (200 μg) mit Alaun (0,12 ml, Pierce Chemical Co., Katalog Nr. 77161) verkapselt in Liposomen in physiologischer Kochsalzlösung (0,12 ml) und suspendiert in einem geeigneten pharmakologischen Träger immunisiert. Die Bildung von Anti-SIZP-Antikörpern in Katzen wird mittels ELISA unter Verwendung von Protein A/alkalische Phosphatase gemessen (Brown, R. G., W. D. Bowen, J. D. Eddington, W. C. Kimmins, M. Mezei, J. L. Parsons, B. Pohajdak. (1997) Temporal trends in antibody production in captive grey seals, harp and hooded seals to a single administration immunocontraceptive vaccine. J. Reproductive Immunology 35: 53–64).
Eine einmalige Verabreichung der Impfstoffzusammensetzung mit FCA bildet Anti-SIZP-Antikörper-Titer, die in zwei Monaten maximale Titer erreichen (Tabelle 4). Der durchschnittliche Titer zwei Monate nach Immunisierung liegt bei 58 ± 2% des Referenzserums und verringert sich auf 41 ± 4% des Referenzserums 4 Monate nach Immunisierung, wenn eine überprüfte männliche Katze in die Kolonie eingebracht wird. Katzen, die eine einmalige Verabreichung der Impfstoffzusammensetzung mit Alaun als Adjuvans erhalten haben, bilden Anti-SIZP-Antikörper mit einem durchschnittlichen Titer von 67 ± 2% des Referenzserums zwei Monate nach Immunisierung.
Monatliche Serumproben der Katzen, die mit dem Placebo-Impfstoff immunisiert worden sind, der alle Komponenten der Impfstoffzusammensetzung außer dem Antigen enthält, haben einen durchschnittlichen Anti-SIZP-Titer von 0,6 ± 0,2% des Referenzserums während der Nachimmunisierungs-Überwachungsperiode. Daher ist es offensichtlich, dass Katzen, die den Placebo-Impfstoff erhalten haben, Kätzchen während der Nachimmunisierungsperiode zeugen werden. Tabelle 4 Bildung von Anti-SIZP-Antikörpern in Katzen immunisiert mit der erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzung

ND: = nicht bestimmt

Beispiel 5: Immunologische Empfängnisverhütung bei Rotwild
Einundvierzig Damhirsch-(Dama dama)-Rehe auf James Island, einer 360 Hektar großen Insel, die vor der Küste des südlichen British Columbia liegt, werden mit der Impfstoffzusammensetzung mit FCA als Adjuvans immunisiert. Eine weitere Gruppe von 40 Damhirschrehen wird mit der Impfstoffzusammensetzung mit Alaun als Adjuvans immunisiert. Zum Einfangen werden die Tiere in eine große (200 × 200 m) Einzäunung gelockt, die mit einer Serie an umzäunten Gehegen und einer Zuführung verbunden ist, die in einem kleinen Gebäude endet. Vor der Immunisierung wird jedes Tier physikalisch abgesondert und ihm wird eine nummerierte Ohrmarke, ein farbiges Plastikhalsband oder Senderhalsband mit einem Sterblichkeitssensor und eine PIT(permanenter Identifikationstransponder)-Markierung mit einem einzigartigen Code gegeben. Wenn ein behandeltes Tier alle externen Markierungen verliert, kann es folglich immer noch als behandeltes Tier aufgrund der Verletzung durch den Verlust der Ohrmarke und als ein bestimmtes Tier durch die PIT-Marke erkannt werden. Jedem gefangenen Reh wird intramuskulär in den Rumpf SIZP (100 μg) verkapselt in Liposomen mit FCA oder Alaun-Adjuvans injiziert. Unbehandelte Rehe dienen als Kontrolle.
Anti-SIZP-Titer werden wie beschrieben gemessen (Brown, R. G., W. D. Bowen, J. D. Eddington, W. C. Kimmins, M. Mezei, J. L. Parsons, B. Pohjajdak. (1997) Temporal trends in antibody production in captive grey seals, harp and hooded seals to a single administration immunocontraceptive vaccine. J. Reproductive Immunology 35: 53–64), außer dass Protein A/alkalische Phosphatase durch Protein G/alkalische Phosphatase ersetzt wird, da Protein G eine höhere Affinität für Damhirsch-Immunoglobulin als Protein A besitzt. Im Vergleich zu den Affinitäten von Protein A und Protein G für Kaninchen-Immunoglobulin (das Referenzserum) sind die Affinitäten von Protein A und Frotein G für Damhirsch-Immunoglobulin 8 bzw. 89%. Damhirsch-Anti-SIZP-Titer sind nicht mit der relativen Affinität des Protein G berichtigt (Tabelle 5A). Keines der Rehe, die 2 Monate oder mehr nach der Brunst und 8–9 Monate nach der Immunisierung mit dem Impfstoff mit FCA untersucht worden waren, waren schwanger, während 96% (192/200) der unbehandelten Rehe schwanger sind. Schwangerschaft wurde bestimmt durch Untersuchung des Fortpflanzungstraktes nach Anzeichen für Schwangerschaft oder durch Blutanalyse von lebend gefangenen Rehen auf Schwangerschafts-spezifisches Protein B (PSPB) durch BioTracking, Inc. aus Moscow, Idaho (Willard et al., "Pregnancy detection and the effects of age, body weight, and previous reproductive performance on pregnancy status and weaning rates of farmed fallow deer (Dama dama). J. Animal Science. 77: 32–38 (1999)). Der Gegensatz zwischen den Schwangerschaftsraten von immunisierten und nicht-immunisierten Rehen zeigt deutlich, dass die Impfstoffzusammensetzung mit FCA wirksam bei der Verhinderung der Empfängnis ist. Da diese Studie über mehrere Jahre geht, werden so viele Rehe wie möglich lebend gefangen. Tabelle 5A Bildung von Anti-SIZP-Antikörpern in Damhirschen immunisiert mit der erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzung mit FCA-Adjuvans

ND: = nicht bestimmt

Andere Experimente wurden mit Weißwedelhirschen durchgeführt. Keiner der Weißwedelhirsche, die mit der Impfstoffzusammensetzung mit FCA immunisiert worden sind, wurde ein Jahr nach der Immunisierung schwanger. Nur einer der Weißwedelhirsche, die mit der Impfstoffzusammensetzung mit Alaun immunisiert worden sind, wurde ein Jahr nach der Immunisierung nicht schwanger. Die Ergebnisse der Anti-SIZP-Titer-Level sind in Tabelle 5B gezeigt. Tabelle 5B Bildung von Anti-SIZP-Antikörpern in Weißwedelhirschen immunisiert mit einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung.

ND: = nicht bestimmt

Beispiel 6: Die Wirkung des Ölanteils auf die Bildung von Anti-SIZP-Antikörpern
Die Impfstoffzusammensetzung ergibt gute Antikörper-Titer infolge von einer einmaligen Verabreichung eines Antigens. Soweit nicht anders verlautet, sind deswegen alle angegebenen Titer in den folgenden Beispielen aus einer einmaligen Verabreichung des Antigens in der Impfstoffrezeptur oder anderen Immunisierungsprotokollen erhalten.
Zur Bestimmung, ob eine wässrige Phase eine notwendige Komponente der Impfstoffzusammensetzung zum Erreichen einer guten Immunantwort ist, werden drei Gruppen von Kaninchen (2 oder 3 Kaninchen/Gruppe) mit drei verschiedenen Herstellungen des Impfstoffs mit SIZP (50 μg SIZP/Kaninchen) verkapselt in Liposomen, suspendiert in physiologischer Kochsalzlösung (0,5 ml) und emulgiert in Freund's komplettem Adjuvans (0,5 ml) immunisiert. Der Anteil der Öl-Phase und der Wasserphase ist in diesen Herstellungen gleich (Tabelle 6A). Tabelle 6A Wirkung des Öl-Gehalts der Impfstoffzusammensetzung auf die Bildung von Anti-SIZP-Antikörpern in Kaninchen

¹ Jede Zeile stellt Titer von Blutproben desselben Kaninchens dar.
² Liposome mit SIZP (50 μg/Kaninchen) wurden in physiologischer Kochsalzlösung (0,5 ml) suspendiert und diese wässrige Phase wurde mit Freund's komplettem Adjuvans (0,5 ml) emulgiert.
³ Liposome mit SIZP (50 μg/Kaninchen) wurden gefriergetrocknet und die erhaltenen gefriergetrockneten Liposome wurden in Freund's komplettem Adjuvans (0,5 ml) suspendiert.
⁴ Liposome mit SIZP (50 μg/Kaninchen) wurden gefriergetrocknet und die erhaltenen gefriergetrockneten Liposome wurden in Freund's komplettem Adjuvans (0,2 ml) suspendiert.

ND: = nicht bestimmt

Der ohne Wasser gebildete Impfstoff wird zur Immunisierung von vier Gruppen an Kaninchen (2 oder 3 Kaninchen/Gruppe) mit vier verschiedenen Herstellungen des Impfstoffs mit SIZP (50 μg SIZP/Kaninchen) verkapselt in gefriergetrockneten Liposomen und suspendiert in Freund's komplettem Adjuvans (0,2 ml oder 0,5 ml) verwendet. Da Freund's komplettes Adjuvans kein Wasser enthält, sind diese Herstellungen wasserfrei und enthalten nur eine Ölphase. Durchschnittliche Anti-SIZP-Titer vier Monate nach Immunisierung sind 55 ± 44% (Koeffizient der Abweichung, cv 80%) für Kaninchen, die mit der Zusammensetzung mit 50% Öl immunisiert sind, und 59 ± 41% (cv 69%) für Kaninchen, die mit dem Impfstoff mit 100% Öl immunisiert sind. Es gibt keinen Unterschied in der Antwort weiblicher Kaninchen, die den Impfstoff mit 100% Öl erhalten haben, und weiblicher Kaninchen, die mit dem Impfstoff mit 50% Öl immunisiert worden sind (P = 0,87; F (1,45) = 0,03; durchschnittliche Titer waren 71 ± 7% für 50% Öl und 72 ± 12% für 100% Öl). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Anwesenheit einer wässrigen Phase nicht für eine gute Immunantwort auf den Impfstoff notwendig ist.
Zur Bestimmung, ob es einen Unterschied in der Dauer der Anti-SIZP-Titer in Kaninchen gibt, die mit der Impfstoffzusammensetzung mit 50% und 100% Öl immunisiert worden sind, werden die Anti-SIZP-Titer für 12 Monate gemessen (Tabelle 6B). Anti-SIZP-Titer während der 12-monatigen Nachimmunisationsperiode sind in mit einer 50% Öl-Rezeptur immunisierten Kaninchen und in mit einer 100% Öl-Rezeptur immunisierten Kaninchen gleich. Zur Bestimmung der biologischen Wirkung der Immunisierung mit SIZP werden überprüfte weibliche Kaninchen, immunisiert mit beiden Rezepturen des Impfstoffes, mit überprüften Männchen dreimal während der 12-monatigen Nachimmunisierungsperiode gepaart. Die Verringerung der Fruchtbarkeit lag bei 80% bei den Kaninchen, die mit dem Impfstoff mit 50% Öl immunisiert worden sind, und die weiblichen Kaninchen, die mit dem Impfstoff mit 100% Öl immunisiert worden sind, erzeugten keine Nachkommen. Dies zeigt, dass die biologische Wirkung der verminderten Fruchtbarkeit bei beiden Rezepturen des Impfstoffs ähnlich ist. Tabelle 6B Wirkung des Öl-Gehalts der Impfstoffzusammensetzung auf die Dauer der Anti-SIZP-Antikörper in Kaninchen

ND: = nicht bestimmt.

Da Liposome aus lipophilem Material bestehen, kann die Aufbewahrung von Liposomen in Öl zu ihrer Zerstörung durch Auflösung der Liposom-Bestandteile im Öl führen. Zur Untersuchung dieser Frage werden Kaninchen (2 Kaninchen in jeder Gruppe) mit dem Impfstoff (100% Öl-Rezeptur) immunisiert, der für bis zu 5 Monate bei 5°C und –20°C gelagert worden ist. Die Lagerung des Impfstoffs bei 5°C für 5 Monate verringerte die Anti-SIZP-Titer der Kaninchen nur um 28% (Tabelle 6C; P = 0,002; F (5,33) = 4,9). Die Lagerung des Impfstoffs bei –20°C für 5 Monate verringerte die Anti-SIZP-Titer nur um 14% (Tabelle 6D; P = < 0,001; F (5,35) = 23,7). Diese Ergebnisse zeigen, dass die meisten Liposome in Öl intakt bleiben, da die Immunisierung von Kaninchen mit einer einmaligen Injektion an SIZP, die in Freund's komplettem Adjuvans ohne Liposom-Verkapselung suspendiert worden ist, zu niedrigen Titern führt (Tabelle 6E). Tabelle 6C Wirkung der Lagerung der Impfstoffzusammensetzung mit einer 100% Öl-Rezeptur auf die Bildung von Anti-SIZP-Antikörpern in Kaninchen

¹ Die Impfstoffzusammensetzung (100% Öl-Rezeptur) wird in Biokugeln von Ballistivet^TM platziert und chirurgisch intramuskulär in die Kaninchen implantiert.
² Die Biokugeln werden bei 5°C gelagert.

¹ Die Impfstoffzusammensetzung (100% Öl-Rezeptur) wird in Biokugeln von BallistivetTM platziert und chirurgisch intramuskulär in die Kaninchen implantiert.
² Die Biokugeln werden bei –20°C gelagert.

¹ Kaninchen werden mit einer einmaligen Verabreichung von SIZP (50 μg/Kaninchen), suspendiert in Freund's komplettem Adjuvans, immunisiert.

Zur Bestimmung, ob der ohne wässrige Phase gebildete Impfstoff zu einer guten Antwort in anderen Säugerspezies führen kann, werden Kegelrobben (Halichoerus grypus) mit dem Impfstoff mit entweder gleichen Öl- und wässrigen Phasen, nur einer wässrigen Phase oder nur einer Ölphase immunisiert (Tabelle 6F). Es gab keine Unterschiede in den Anti-SIZP-Titern zwischen dem Impfstoff, der gleiche Öl- und wässrige Phasen enthielt, und dem, der nur Öl enthielt, aber die Verabreichung des Impfstoffs, der alle Inhaltsstoffe außer Öl enthielt, führte zu deutlich geringeren Titern. Tabelle 6F Wirkung des Öl-Gehalts der Impfstoffzusammensetzung auf die Bildung von Anti-SIZP-Antikörpern in Kegelrobben.

¹ Jede Zeile stellt Titer von Blutproben von derselben Kegelrobbe dar.
² Liposome mit SIZP (100 μg/Kegelrobbe) und Hitze-getötete Mycobacterium tuberculosis (2 mg/Kegelrobbe), der aktive Inhaltsstoff in Freund's komplettem Adjuvans wie von Sigma Chemical Co. vertrieben und in allen hierin berichteten Studien verwendet, sind in physiologischer Kochsalzlösung (0,5 ml) suspendiert.
³ Liposome mit SIZP (100 μg/Kegelrobbe) sind in physiologischer Kochsalzlösung (0,5 ml) suspendiert und diese wässrige Phase ist in Freund's komplettem Adjuvans (0,5 ml) emulgiert.
⁴ Liposome mit SIZP (100 μg/Kegelrobbe) sind gefriergetrocknet und die erhaltenen gefriergetrockneten Liposome sind in Freund's komplettem Adjuvans (0,5 ml) suspendiert.

Beispiel 7: Verwendung von archaebakteriellen Lipiden in Liposomen
Liposome sind vollständig geschlossene Lipid-Membranen, die aus einer Auswahl an Lipid-Materialien bestehen können. In diesem Beispiel werden unter Verwen dung von archaebakteriellen Lipiden hergestellte Liposome mit unter Verwendung von Sojabohnen-Lecithin hergestellten Liposomen auf ihre Fähigkeit zur Stimulation der Antikörperbildung in Kaninchen verglichen (Tabelle 7). Liposome mit Sojabohnen-Lecithin führen zu einer besseren Bildung von Anti-SIZP-Antikörpern als Liposome mit archaebakteriellen Lipiden. Tabelle 7 Bildung von Anti-SIZP-Antikörpern in Kaninchen, immunisiert mit Liposomen, hergestellt mit archaebakteriellen Lipiden oder Sojabohnen-Lecithin.

ND: = nicht bestimmt.

Beispiel 8: Immunisierung gegen Streptokinase
Die Impfstoffzusammensetzung ist einzigartig bei der Bildung von hohen Titern an Anti-SIZP-Antikörpern, die infolge einer einmaligen Verabreichung langanhaltend sind. Zur Bestimmung, ob die Impfstoffzusammensetzung hohe Antikörper-Titer mit anderen Antigenen erzeugen kann, werden Kaninchen mit Streptokinase immunisiert.
Streptokinase ist ein von pathogenen Stämmen der Streptococci-Bakterien-Familie hergestelltes Exoprotein. Als ein Aktivator der vaskulären Fibrinolyse wird ihr therapeutischer Nutzen seit vielen Jahren bei der Behandlung von Herzinfarkt geschätzt. Streptokinase entfaltet sich in einer nicht-kooperativen Weise. Daher kann das Protein eine Anzahl an teilweise gefalteten Zuständen einnehmen, die einige Regionen enthalten, die nativ erscheinen, und andere, die ungefaltet sind. Drei Domänen unterschiedlicher Stabilität existieren, die unabhängig von anderen Regionen des Proteins sind (Teuten et al., 1993, Biochem. J. 290: 313–319). Die native Strep tokinase enthält immunologisch dominante Epitope in der C-terminalen Region (Torrens et al., 1999, Immunology Letters 70: 213–218). Die C-terminale Region ist relativ unstrukturiert (Parrado et al., 1996, Protein Sci. 5: 693–704), weswegen Hitzebehandlung die Struktur nicht verändern kann, da sie schon vor der Hitzebehandlung unstrukturiert war. Die thermische Stabilität der Domäne C wird durch ihre Isolation vom Rest der Kette deutlich gesteigert (Connejero-Lara et al., 1996, Protein Sci. 5: 2583–2591). Der Verlust der C-terminalen Region führt zu einem weniger immunogenen Protein, zeigt aber immunogene Epitope, die im nativen Molekül verborgen sind. In unseren Studien war die C-terminale Region in der nativen und der Hitze-behandelten Streptokinase vorhanden, weswegen sie als immunologisch dominante Region des Proteins die Antwort der Kaninchen bestimmen könnte. Wenn die C-terminale Region nach der Hitzebehandlung dieselben Epitope wie im nativen Zustand behält, erwartet man keinen Unterschied bei der Bindung von Anti-Streptokinase-Antikörpern an native und Hitze-behandelte Streptokinase. Dies sind exakt die erhaltenen Beobachtungen (Tabelle 8). Wir haben vorgeschlagen, dass die Zufuhr von denaturierten Proteinen mittels einer erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzung die Bildung von Antikörpern gegen native Epitope favorisiert. Dies wird durch die Studien mit Alkoholdehydrogenase in Beispiel 2 unterstützt. Die Ergebnisse mit Streptokinase sind im Einklang mit diesem Vorschlag, da eine Hitzebehandlung die Struktur der immunologisch dominanten Region nicht ändert. Daraus folgt die Vorhersage, dass es keinen Unterschied in der Immunantwort von mit nativer oder Hitze-behandelter Streptokinase immunisierten Kaninchen unabhängig vom verwendeten Zufuhrsystem gibt. Dies deckt sich genau mit unseren Beobachtungen (Tabelle 8). Tabelle 8 Epitop-Kartierung von Kaninchen-Anti-Streptokinase-Seren von Kaninchen immunisiert mit nativer und Hitze-behandelter Streptokinase (100°C für 10 Minuten in 5% Mercaptoethanol) unter Verwendung von herkömmlichen Immunisierungsprotokollen¹ oder dem erfindungsgemäßen Verfahren².

¹ Kaninchen wurden mit 75 μg Streptokinase in Freund's komplettem Adjuvans immunisiert, gefolgt von einer Auffrischungsinjektion ein Monat später mit 75 μg Streptokinase in Freund's inkomplettem Adjuvans.
² Kaninchen wurden mit einer einmaligen Injektion von 75 μg Streptokinase in einem erfindungsgemäßen Impfstoff immunisiert.
³ Titer wurden sowohl mit nativer als auch mit Hitze-behandelter Streptokinase gemessen.

Aus den Ergebnissen ist offenkundig, dass eine einmalige Injektion von Streptokinase unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Impfstoffs Anti-Streptokinase-Titer hervorruft, vergleichbar mit den Titern, die durch herkömmliche Protokolle mit primären und Auffrischungsinjektionen erreicht werden. Auch binden die gebildeten Antikörper unabhängig von dem verwendeten Immunisierungsprotokoll, d.h. gemäß der vorliegenden Erfindung oder herkömmlich, gleich gut an native und Hitzebehandelte Streptokinase.
Beispiel 9: Verwendung eines pflanzlichen Speiseöls
Eine Impfstoffzusammensetzung wurde gemäß dieser Erfindung unter Verwendung von Canola-Öl anstelle von Mineralöl gebildet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass mit Canola-Öl gebildete Impfstoffe Anti-SIZP-Antikörper in Kaninchen bilden. Folglich ist Canola-Öl geeignet. Jedoch sind die Titer-Level nicht so hoch wie mit Mineralöl. Tabelle 9 Wirkung von Canola-Öl auf die Bildung von Anti-SIZP-Antikörper in Kaninchen

¹ Freund's komplettes Adjuvans (FCA) wurde aus einer kommerziellen Quelle erhalten (Sigma) und war mit Mineralöl gebildet.
² FCA/Canola-Öl enthielt die gleiche Menge an Hitze-getöteten Mycobacterium-Zellen wie in FCA, aber die Mineralölkomponente von FCA wurde durch Canola-Speiseöl ersetzt.

ND: = nicht bestimmt.

Beispiel 10: Immunisierung gegen Hepatitis B
Ein Hepatitis B-Impfstoff wurde gemäß der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von 5 μg Hepatitis B-Oberflächen-Antigen (Recombivax HB^TM, ein rekombinantes Hepatitis B-Antigen) mit Alaun-Adjuvans verkapselt in Liposomen mit Sojabohnen-Lecithin (0,05 g) und Cholesterin (0,005 g), suspendiert in physiologischer Kochsalzlösung (0,25 ml) und dann emulgiert in gering viskosem Mineralöl (0,225 ml) und Mannidoleat (0,025 ml), gebildet. Ein herkömmlicher Hepatitis B-Impfstoff unter Verwendung von 5 μg Hepatitis B-Oberflächen-Antigen (Recombivax HB^TM) mit Alaun-Adjuvans in einem Volumen von 0,5 ml wässrigem Medium, wie vom Hersteller empfohlen, wurde ebenfalls verabreicht. Acht Kaninchen wurden mit dem gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten Impfstoff und acht Kaninchen wurden mit dem herkömmlichen Impfstoff immunisiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 gezeigt.
Aus Tabelle 10 ist offensichtlich, dass der gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellte Impfstoff einen Monat nach Immunisierung zu etwa 6-fach mehr Antikörper als die herkömmliche Zufuhr des Hepatitis B-Oberflächen-Antigens führt. Tabelle 10 Bildung des Anti-HepB-Antikörpers in Kaninchen immunisiert mit einem kommerziellen HepB-Impfstoff oder mit einem HepB-Impfstoff gebildet gemäß der vorliegenden Erfindung

¹ Antikörper-Titer wurden unter Verwendung des Enzym-Immunoassays zur Detektion des Antikörpers gegen Hepatitis B-Oberflächen-Antigen (Anti-HBs), vertrieben von DiaSorin Inc., Stillwater, MN, USA, gemessen.

Beispiel 11: Wirkung von gebildeten Impfstoffen mit Alaun-Adjuvans in und außerhalb der Liposome
Die Impfstoffe wurden wie folgt hergestellt:
Gruppen 1–4 wurden mit 100 μg SIZP verkapselt in Liposomen gebildet mit 0,1 g Sojabohnen-Lecithin und 0,01 g Cholesterin hergestellt. Die Liposome in den Gruppen 1 und 3 enthielten auch 100 μl ImjectAlum^TM. In den Gruppen 2 und 4 wurden 100 μl ImjectAlum^TM außerhalb der Liposome platziert. In den Gruppen 1 und 2 wurden die Liposome in 0,25 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und diese Suspension wurde in 0,225 ml gering viskosem Mineralöl und 0,025 ml Mannidoleat emulgiert. In den Gruppen 3 und 4 wurden die Liposome gefriergetrocknet und dann in 0,225 ml gering viskosem Mineralöl und 0,025 ml Mannidoleat suspendiert und diese Suspension wurde in 0,25 ml physiologischer Kochsalzlösung emulgiert. In Gruppe 5 wurden 100 μg SIZP und 100 μl ImjectAlum^TM gefriergetrocknet, dann in 0,225 ml gering viskosem Mineralöl und 0,025 ml Mannidoleat suspendiert und in 0,25 ml physiologischer Kochsalzlösung emulgiert. In Gruppe 6 wurden 100 μg SIZP und 100 μl ImjectAlum^TM gefriergetrocknet, dann in 0,25 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und in 0,225 ml gering viskosem Mineralöl und 0,025 ml Mannidoleat emulgiert. Kaninchen wurden mit den sechs Gruppen an Impfstoffen immunisiert und die Ergebnisse sind in Tabelle 11 gezeigt.
Tabelle 11 Bildung von Anti-SIZP-Antikörpern in Kaninchen, immunisiert mit 4 Rezepturen eines erfindungsgemäßen Impfstoffs mit Alaun-Adjuvans (Gruppen 1 bis 4) und zwei Kontrollrezepturen mit Alaun-Adjuvans (Gruppen 5 bis 6)
Beispiel 12: Wirkung eines gebildeten Impfstoffs mit Hitze-getötetem Mycobacterium tuberculosis-Adiuvans in und außerhalb der Liposome
Die Impfstoffe wurden wie folgt hergestellt:
Die Gruppen 1–4 wurden mit 100 μg SIZP verkapselt in Liposomen gebildet mit 0,1 g Sojabohnen-Lecithin und 0,01 g Cholesterin hergestellt. Die Liposome in den Gruppen 1 und 3 enthielten außerdem 200 μg Hitze-getötetes M. tuberculosis. In den Gruppen 2 und 4 wurden 200 μg des Hitze-getöteten M. tuberculosis außerhalb der Liposome platziert. In den Gruppen 1 und 2 wurden die Liposomen in 0,2 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und diese Suspension wurde in 0,18 ml gering viskosem Mineralöl und 0,02 ml Mannidoleat emulgiert. In den Gruppen 3 und 4 wurden die Liposome gefriergetrocknet und dann in 0,18 ml gering viskosem Mineralöl und 0,02 ml Mannidoleat suspendiert und diese Suspension wurde in 0,2 ml physiologischer Kochsalzlösung emulgiert. Kaninchen wurden mit den vier Gruppen an Impfstoffen immunisiert und die Ergebnisse sind in Tabelle 12 gezeigt.
Tabelle 12 Bildung von Anti-SIZP-Antikörpern in Kaninchen immunisiert mit vier Rezepturen eines erfindungsgemäßen Impfstoffs mit Hitze-getöteten M. tuberculosis
Beispiel 13: Immunisierung von Kaninchen mit nativer und denaturierter Alkoholdehydrogenase (ADH) aus Hefe zusammen mit einem Alaun-Adjuvans
Erfindungsgemäße Impfstoffe wurden mit 100 μg nativer oder denaturierter ADH zusammen mit 100 μl ImjectAlum^TM verkapselt in Liposomen gebildet mit 0,1 g Sojabohnen-Lecithin und 0,01 g Cholesterin hergestellt. Die Liposome wurden in 0,25 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und die Suspension wurde in 0,225 ml gering viskosem Mineralöl und 0,025 ml Mannidoleat emulgiert.
Herkömmliche Impfstoffe wurden mit 100 μg der nativen oder denaturierten ADH zusammen mit 100 μl ImjectAlum^TM gebildet und in 0,5 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert.
Denaturierte ADH wurde durch Erhitzen der ADH auf 100°C für 30 Minuten und Behandlung mit 10% Mercaptoethanol für 30 Minuten bei Raumtemperatur zum Spalten der Disulfitbindungen hergestellt. Mercaptoethanol wurde durch 12-stündige Dialyse entfernt und die denaturierte ADH wurde durch Gefriertrocknung erhalten.
Die Ergebnisse, die die erfindungsgemäßen Impfstoffe mit den herkömmlichen Impfstoffen vergleichen, sind in Tabelle 13 gezeigt.
Tabelle 13 Bildung von Anti-ADH-Antikörpern in Kaninchen immunisiert mit nativer und denaturierter ADH unter Verwendung von Alaun als Adjuvans
Die Ergebnisse zeigen, dass die Zufuhr der nativen oder denaturierten ADH unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Rezeptur zu erhöhter Bildung von Anti-ADH-Antikörpern führt, verglichen zu der Bildung von Anti-ADH-Antikörpern im Kaninchen, die nach herkömmlichen Verfahren gegen native oder denaturierte ADH immunisiert worden sind. Des Weiteren bilden mit denaturierter ADH immunisierte Kaninchen mehr Antikörper gegen native ADH, wenn eine erfindungsgemäße Rezeptur verwendet wird, verglichen mit wenn die denaturierte ADH nach herkömmlichen Verfahren ohne Auffrischungsinjektionen zugeführt wird.
Beispiel 14: Epitop-Kartierung
Epitop-Kartierungsexperimente werden zum Beweis durchgeführt, dass erfindungsgemäße Impfstoffe Antikörper mit anderen Bindungsspezifitäten für ein Antigen herstellen als mit herkömmlichen Immunisierungsprotokollen mit primären und sekundären Auffrischungsinjektionen erreicht. Es wurden speziell Fragmente des ZP-Antigens verwendet, aber es ist davon auszugehen, dass sich andere Antigene in gleicher Weise verhalten.
Herkömmliche Immunisierung von Kegel- und Sattelrobben mit einer primären Injektion und zwei Auffrischungsinjektionen führt zu geringen Anti-SIZP-Antikörper-Titern, die ihr Maximum zwei Monate nach Immunisierung bei sowohl den Kegel- als auch den Sattelrobben haben. Im Gegensatz dazu produziert die Immunisierung mit einem gemäß der vorliegenden Erfindung gebildeten Impfstoff Anti-SIZP-Antikörper-Titer, die mit einer Ausnahme für mindestens 24 Monate in Kegelrobben und 5 bis 6 Monate in Sattelrobben bestehen. Die Titer in Sattelrobben erreichen ein Plateau, das für 6 bis 10 Monate nach der Immunisierung besteht. Folglich bewirkt ein gemäß der vorliegenden Erfindung gebildeter Impfstoff hohe Anti-SIZP-Titer mit langer Dauer, verglichen zu den herkömmlichen Immunisierungsprotokollen, die primäre und Auffrischungsinjektionen verwenden.
Die Polypeptidfragmente von ZPB und ZPC, die bei der Epitop-Kartierung zum Beweis verwendet wurden, dass infolge von herkömmlichen Immunisierungsprotokollen gebildete Anti-SIZP-Antikörper eine andere Bindungsspezifität haben als Anti-SIZP-Antikörper, die infolge einer Immunisierung mit einem erfindungsgemäßen Impfstoff gebildet worden sind, sind in 1 gezeigt. Die Fragmente ZPB1, ZPB2, ZPC1 und ZPC2 sind kurze Polypeptide und haben keine dreidimensionalen Strukturen der Vollängen-ZPB und -ZPC. In 1 werden die unprozessierten Polypeptide mit voller Länge über den zwei ZPB- und ZPC-Fragmenten gezeigt. Die in den nativen Proteinen abgespaltenen sekretorischen Signalpeptide sind schwarz markiert.
Infolge einer herkömmlichen Immunisierung (eine primäre und zwei Auffrischungsinjektionen unter Verwendung von FCA-Adjuvans) gebildete Anti-SIZP-Antikörper der Kegelrobbe haben eine hohe Affinität für die Fragmente ZPB1, ZPB2, ZPC1 und ZPC2 (Tabelle 14A, Robbe ID 1). Im Gegensatz dazu bilden Kegelrobben, die mit einem gemäß der vorliegenden Erfindung gebildeten Impfstoff immunisiert worden sind (Tabelle 14A, Robben ID 76 und 96), Antikörper mit einer niedrigen Affinität für die Fragmente ZPB2, ZPC1 und ZPC2 ein Jahr nach Immunisierung und mit einer niedrigen Affinität für alle vier Fragmente drei Jahre nach Immunisierung. Die vier Fragmente bilden zusammen 80% des in SIZP gefundenen Proteins.
Tabelle 14A Epitop-Kartierung von Kegekobben-Anti-SIZP-Antikörpern unter Verwendung von rekombinanten Fragmenten von ZPB und ZPC hergestellt in E. coli
Eine temporäre Studie der Bindungsspezifität der Antikörper, die in mit einem gemäß der vorliegenden Erfindung gebildeten Impfstoff immunisierten Kegelrobben gebildet wurden, zeigte, dass die kurz nach der Immunisierung (< 7 Monate) gebildeten Antikörper an hauptsächlich im ZPB1-Fragment zu findende Epitope binden. Später nach der Immunisierung (> 7 Monate) gebildete Antikörper haben eine niedrigere Affinität für ZPB1 und die anderen drei Fragmente. ZPB1, ZPB2, ZPC1 und ZPC2 haben ein niedriges Molekulargewicht und sind nicht glykosyliert. Diese Fragmente haben aufgrund ihres niedrigen Molekulargewichts eine geringere dreidimensionale Struktur als Volllängen-ZPB und -ZPC. Folglich müssen Antikörper, die an SIZP aber nicht an ZPB1, ZPB2, ZPC1 oder ZPC2 binden, entweder nur in Volllängen-ZPB und -ZPC zu findende dreidimensionale Strukturen oder das kovalent an diese Proteine gebundene Kohlenhydrat erkennen. Da die gesamte Menge an Antikörpern, die kurz nach Immunisierung an die Fragmente binden, die Menge an an ZPB- und ZPC-bindende Antikörper übersteigt oder äquivalent dazu ist, müssen Kohlenhydrat-erkennende Antikörper eine untergeordnete Rolle spielen. Dies impliziert, dass 3D-Strukturen den Unterschied in der Bindung an die Fragmente im Gegensatz zur SIZP bestimmen. Eine Untersuchung mit neun anderen Kegelrobben, die mit SIZP in einem erfindungsgemäßen Impfstoff immunisiert worden sind, zeigt eine ähnliche Verringerung bei 5 Monate oder mehr nach Immunisierung gebildeten Antikörpern.
In einem weiteren Experiment bildeten drei von vier Kaninchen, die mit einem erfindungsgemäßen Impfstoff immunisiert worden waren, Antikörper mit einer höheren Affinität für Epitope in ZPB1 als in den anderen drei Fragmenten. Nur 20 bis 40% der in allen vier Kaninchen gebildeten Antikörper haben die in den vier ZP-Fragmenten zu findenden Epitope gebunden. Folglich banden 60–80% der Anti-SIZP-Antikörper, die in mit einem erfindungsgemäßen Impfstoff immunisierten Kaninchen gebildet worden waren, nur an in Vollängen-ZPB und -ZPC zu findende Epitope. Folglich erkennen 60–80% der Antikörper, die in mit einem erfindungsgemäßen Impfstoff immunisierten Kaninchen gebildet worden sind, Epitope, die mit nativen 3D-Strukturen in Beziehung stehen.
In einem weiteren Experiment stellte die Immunisierung von Sattelrobben (156 und 162) durch herkömmliche Protokolle mit einer primären Injektion mit FCA-Adjuvans gefolgt von Auffrischungsinjektionen mit FIA-Adjuvans Antikörper kurz nach Immunisierung her, die an Epitope banden, die in ZPB1, ZPB2 und ZPC2 (Sattelrobbe 156) oder allen vier Fragmenten (Sattelrobbe 162) sowie in SIZP zu finden sind (Tabelle 14B). Im Gegensatz dazu stellte die Immunisierung der Sattelrobbe 151 mit einem gemäß der vorliegenden Erfindung gebildeten Impfstoff Antikörper kurz nach Immunisierung (< 5 Monate) her, die an in allen vier ZP-Fragmenten zu findende Epitope banden, aber später nach Immunisierung (> 7 Monate) gebildete Antikörper banden an nur in Volllängen-ZPB und -ZPC zu findende Epitope (Tabelle 14B). Nur 30 bis 40% der Antikörper, die durch Immunisierung der Sattelrobbe 153 mit einem erfindungsgemäßen Impfstoff gebildet worden waren, banden gut an Epitope auf den vier ZP-Fragmenten. Daraus ist zu schließen, dass 60–70% der Antikörper, die von der Sattelrobbe 153 während der 7-monatigen Nachimmunisierungsphase gebildet worden waren, nur an Epitope banden, die in Volllängen-ZPB und -ZPC zu finden waren. Diese Epitope stehen mit Strukturen in Verbindung, die nur in Volllängen-ZPB und -ZPC zu finden sind, was auf 3D-Strukturen schließen lässt. Die Immunisierung der Klappmützenrobbe 1 mit einem erfindungsgemäßen Impfstoff bildete Antikörper mit einer ähnlichen temporären Sequenz der Spezifität wie die Sattelrobbe 151.
Tabelle 14B Epitop-Kartierung der Sattel- und Klappmützenrobben-Anti-SIZP-Antikörper unter Verwendung von rekombinanten Fragmenten von ZPB und ZPC hergestellt in E. coli

Claims

Zusammensetzung zur Verwendung als Impfstoff, umfassend: (a) einen Träger, umfassend eine kontinuierliche Phase einer pharmazeutisch und/oder immunologisch annehmbaren hydrophoben Substanz; (b) Liposomen; (c) ein Antigen; und (d) ein geeignetes Hilfsmittel.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die hydrophobe Substanz eine Flüssigkeit ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei der Träger ein Öl oder eine Wasser-in-Öl-Emulsion ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei das Öl Mineralöl, ein pflanzliches Öl, Squalen oder ein Nussöl ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei das Hilfsmittel Alaun oder eine andere Aluminiumverbindung ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei das Hilfsmittel Alaun ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei das Antigen ein natives, nicht natives, rekombinantes oder denaturiertes Protein oder Peptid oder ein Fragment davon ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei das Antigen ein virales Antigen, ein bakterielles Antigen, ein Antigen aus Protozoa oder ein Antigen aus Säugern ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei das Antigen in der Lage ist einen Antikörper auszulösen, der ein natives Epitop erkennt.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei das native Epitop ein Epitop aus Säugern ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei der Säuger ein Pferd, ein Kaninchen, ein Hirsch, oder eine Katze ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei das Antigen ein Zona pellucida Glycoprotein oder ein Fragment davon, Alkoholdehydrogenase, ein Hepatitis B Antigen oder Streptokinase ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei die Liposomen nicht verestertes Cholesterin und ein Phospholipid mit wenigstens einer Kopfgruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phosphoglycerin, Phosphoethanolamin, Phosphoserin, Phosphocholin und Phosphoinositol umfassen.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, die im wesentlichen frei von Lipid A ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin das Antigen ein Zona pellucida Glycoprotein oder ein Fragment davon ist, das Hilfsmittel Alaun ist und der Impfstoff eine langfristig wirksame Immunokontrazeption in einem Säuger bereitstellt.
Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei das Öl Mineralöl ist und die Zusammensetzung im wesentlichen frei von Lipid A ist.
Verwendung von: (a) einem Träger umfassend eine kontinuierliche Phase einer pharmazeutisch und/oder immunologisch annehmbaren hydrophoben Substanz; (b) Liposomen; (c) einem Antigen; und (d) einem geeignetem Hilfsmittel zur Herstellung eines Medikaments zum Ermöglichen einer Immunantwort in einem Tier.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei die hydrophobe Substanz eine Flüssigkeit ist.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei der Träger ein Öl oder eine Wasser-in-Öl-Emulsion ist.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei das Öl Mineralöl, ein pflanzliches Öl, Squalen oder ein Nussöl ist.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Hilfsmittel Alaun ist.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Antigen ein Zona pellucida Glycoprotein oder ein Fragment davon, Alkoholdehydrogenase, ein Hepatitis B Antigen oder Streptokinase ist.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei das Antigen in der Lage ist, einen Antikörper auszulösen, der ein natives Epitop erkennt.
Verwendung nach Anspruch 23, wobei das native Epitop ein Epitop aus Säugern ist.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei der Säuger ein Pferd, ein Kaninchen, ein Hirsch, oder eine Katze ist.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei die Zusammensetzung im wesentlichen frei von Lipid A ist.
Verfahren zur Herstellung einer Impfstoffzusammensetzung, umfassend die Schritte: (a) Verkapseln eines Antigens oder eines Antigen/Hilfsmittel-Komplexes in Liposomen, um ein Liposom-verkapseltes Antigen zu bilden; (b) Mischen des Liposom-verkapselten Antigens mit einem Träger, umfassend eine kontinuierliche Phase einer pharmazeutisch und/oder immunologisch annehmbaren hydrophoben Substanz; und (c) Zugeben eines geeigneten Hilfsmittels, wenn in Teil (a) kein Antigen/Hilfsmittel-Komplex verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei das Liposom-verkapselte Antigen gefriergetrocknet ist.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei ein Antigen ohne Hilfsmittel vor Zugabe des Hilfsmittels in den Liposomen verkapselt wird und das Liposom-verkapselte Antigen nach Zugabe des Hilfsmittels gefriergetrocknet wird, um ein gefriergetrocknetes Liposom-verkapseltes Antigen mit externem Hilfsmittel zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei das Hilfsmittel bevor es zu Liposom-verkapseltem Antigen zugegeben wird zu pyrogenfreiem Wasser zugegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei das gefriergetrocknete Liposom-verkapselte Antigen mit externem Hilfsmittel mit dem Träger vermischt wird, und wobei ein wässriges Medium mit dem Träger vermischt wird, um eine Emulsion von Wasser in hydrophober Substanz zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei das gefriergetrocknete Liposom-verkapselte Antigen mit externem Hilfsmittel anschließend mit dem Träger vermischt wird.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei das Liposom-verkapselte Antigen einen Antigen/Hilfsmittel-Komplex umfasst, und wobei das gefriergetrocknete Liposom-verkapselte Antigen mit dem Träger vermischt wird, und wobei ein wässriges Medium mit dem Träger vermischt wird, um eine Emulsion von Wasser in hydrophober Substanz zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei: (i) das Liposom-verkapselte Antigen mit einem wässrigen Medium vermischt wird, bevor es mit dem Träger vermischt wird; (ii) das Hilfsmittel zu dem Träger gegeben wird, bevor der Träger mit dem Liposom-verkapseltem Antigen vermischt wird; und (iii) der Träger mit dem Liposom-verkapseltem Antigen vermischt wird, um eine Emulsion von Wasser in hydrophober Substanz zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei: (i) das Liposom-verkapselte Antigen einen Antigen-Hilfsmittel-Komplex umfasst: (ii) das Liposom-verkapselte Antigen mit einem wässrigen Medium vermischt wird, bevor es mit dem Träger vermischt wird; und (iii) das Liposom-verkapselte Antigen mit dem Träger vermischt wird, um eine Emulsion mit Wasser in hydrophober Substanz zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei die hydrophobe Substanz eine Flüssigkeit ist.
Verfahren nach Anspruch 36, wobei die Flüssigkeit ein Öl ist.
Verfahren nach Anspruch 37, wobei das Öl Mineralöl ist.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei das Hilfsmittel Alaun ist.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei das Antigen Zona pellucida Glycoprotein oder Fragment davon, Alkoholdehydrogenase, ein Hepatitis B Antigen oder Streptokinase ist.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei das Hilfsmittel Alaun ist und der Träger ein Öl oder eine Wasser-in-Öl-Emulsion ist.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei das Öl Mineralöl ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Antigen ein Antigen ist, welches eine mit Krebs in Zusammenhang stehende Immunantwort auslöst.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei das Antigen ein Antigen ist, welches eine mit Krebs in Zusammenhang stehende Immunantwort auslöst.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei das Antigen ein Antigen ist, welches eine mit Krebs in Zusammenhang stehende Immunantwort auslöst.