JP2012504660A - 細菌eap、empおよび/またはadsaタンパク質に関連する組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2008年10月6日付で出願された米国仮特許出願第61/103,196号、2008年10月6日付で出願された米国仮特許出願第61/103,190号および2009年4月20日付で出願された米国仮特許出願第61/170,779号の優先権の恩典を主張するものであり、これらの内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。
市中獲得型および病院獲得型の両感染の数はここ数年増えている。病院獲得型の(院内)感染は罹病率および死亡率の主な原因である。米国では、病院獲得型の感染は毎年2百万人超の患者に影響を与えている。最も頻度が高い感染は、尿管感染(感染の33%)であり、次いで肺炎(15.5%)、外科手術部位感染(14.8%)および主要血流感染(13%)が続く(Emorl and Gaynes, 1993)。
個もしくはそれ以上の連続アミノ酸、またはその中で導出される任意の範囲を含みうる。
生物膜は分泌された細胞外マトリックスの中に組み込まれた微生物群集である(Hall-Stoodley et al., 2004; Kolter and Greenberg, 2006)。多くの細菌種は、プランクトン様の増殖から生物膜の形成へと切り替わり、それによって抗生物質耐性の増大(Drenkard and Ausubel, 2002)、宿主免疫防御からの回避(Singh et al., 2002)を示すことができ、ヒトでの慢性感染の確立をいっそう巧みに行う(Brady et al., 2008)。ブドウ球菌種の生物膜は、心内膜炎(Xiong et al., 2005)、骨髄炎(Brady et al., 2006)、ならびに導尿カテーテル、人工心臓弁および人工関節を含むさまざまなインプラント媒介感染(Cassat et al., 2007)を含めていくつかの疾患と関連している。これは、特に、インビトロおよびインビボで生物膜をしきりに形成する日和見病原菌である表皮ブドウ球菌に当てはまる(Mack et al., 1996)。表皮ブドウ球菌での生物膜を形成する能力と病毒性との間には明らかな関連があるが、このような相関関係は、黄色ブドウ球菌の場合にはまだ実証されていない(Cassat et al., 2007)。
黄色ブドウ球菌Ess経路は、特殊化した運搬成分(Ess)、補助因子(Esa)および同族分泌基質(Esx)を備えた分泌モジュールと見なすことができる。EssA、EssBおよびEssCはEsxAおよびEsxBの分泌に必要とされる。EssA、EssBおよびEssCは膜貫通タンパク質であると予測されるので、これらのタンパク質は分泌装置を形成するものと考えられる。ess遺伝子クラスタにおけるタンパク質のなかには分泌基質を(モーターとして働き)能動的に運搬するものもあるが、運搬を調節するもの(調節因子)もある。調節は分泌ポリペプチドに対する転写機構もしくは翻訳後機構、特異的基質の規定部位(例えば、細胞外培地もしくは宿主細胞)への選別、または感染中の分泌事象のタイミングによって達成されうるが、これらに限定される必要はない。現時点では、分泌Esxタンパク質の全てが毒素として機能するか、または発病に間接的に寄与するかどうかは不明である。
もしくはそれ以上の、およびその中で導き出せる任意の範囲のアミノ分子、または本明細書において記述されるもしくは参照される対応アミノ配列の派生体を含むことができるが、これらに限定されることはない。ポリペプチドを切断によって突然変異させ、それらを、対応するその野生型よりも短くさせてもよいが、それらを(例えば、標的化または局在化のために、免疫原性の増強のために、精製目的のために、など)特定の機能を有する異種タンパク質配列に融合または結合させることによって変化させることもできると考えられる。
またはそれ以上の非連続または連続アミノ酸に影響を与えうる。
個またはそれ以上(その間の全ての値および範囲を含む)からアミノ酸
個またはそれ以上(その間の全ての値および範囲を含む)を含む本明細書において記述される抗原(AdsA、Emp、Eap、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、Ebh、Coa、vWa、SpA、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および/またはビトロネクチン結合タンパク質)のセグメントまたは断片を、その間の全てのセグメントまたは断片を含めて、含むことができる。本発明のある種の局面は、上記の断片またはセグメントの一つまたは複数に結合する抗体に関する。
本発明は、本発明のさまざまな態様で用いるためのポリペプチド、ペプチドおよびタンパク質ならびにそれらの免疫原性断片について記述する。例えば、特定のポリペプチドを、免疫反応を誘発させるかアッセイし、または免疫反応を誘発させるために用いる。特定の態様において、本発明のタンパク質の全部または一部を、従来の技術にしたがって溶液中でまたは固体支持体上で合成することもできる。各種の自動合成機が市販されており、それらを公知のプロトコルにしたがって用いることができる。例えば、Stewart and Young, (1984); Tarn et al., (1983); Merrifield, (1986); およびBarany and Merrifield (1979)を参照されたく、これらの各々が参照により本明細書に組み入れられる。あるいは、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、これを適切な宿主細胞に形質転換または形質移入し、これを発現に適した条件の下で培養する組み換えDNA技術を利用することもできる。
ワクチンによる能動免疫法および免疫グロブリンによる受動免疫法は、古典的な小分子(例えば、抗生物質)による治療の代替法としての見込みがある。かつて、広範な病気、障害および死をもたらした少数の細菌性疾患は、現在では、ワクチンの使用によって防ぐことができる。ワクチンは、弱められた(弱毒化された)細菌もしくは死細菌、細菌表面の成分または不活化毒素に基づく。ワクチンにより生じた免疫反応は、免疫系によって能動的に処理される、細菌上の免疫原性構造、つまり限られた数のタンパク質または糖構造を主に対象とする。
本発明は、ブドウ球菌感染、特に病院獲得型の院内感染を予防または改善するための方法を含む。したがって、本発明は、能動免疫法と受動免疫法の両方の態様で用いるためのワクチンを企図する。ワクチンとして用いるのに適当であると提唱されている免疫原性組成物は、全長のEmp、Eapおよび/またはAdsA抗原またはその免疫原性断片のような、免疫原性のEmp、Eapおよび/またはAdsAポリペプチドから調製することができる。他の態様において、Emp、Eapおよび/またはAdsAを、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、Ebh、Coa、vWa、SpA、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および/またはビトロネクチン結合タンパク質、あるいは当業者に公知の他のブドウ球菌抗原、ペプチドまたはタンパク質を含めて、他の分泌毒性タンパク質、表面タンパク質またはその免疫原性断片と組み合わせて用いることができる。抗原材料は、望ましくない低分子量分子を除去するために十分に透析され、および/または所望の媒体へのより容易な処方のために凍結乾燥されることが好ましい。
所与の組成物はその免疫原性が異なる場合がある。それゆえ、宿主免疫系を追加免疫することが必要になることが多く、これはペプチドまたはポリペプチドを担体にカップリングさせることにより達成することもできる。担体は、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)およびウシ血清アルブミン(BSA)を含むが、これらに限定されることはない。卵白アルブミン、マウス血清アルブミンまたはウサギ血清アルブミンなどの他のアルブミンを担体として用いることもできる。ポリペプチドを担体タンパク質に抱合させるための手段は、当技術分野において周知であり、グルタルアルデヒド、m-マレイミドベンゾイル(maleimidobencoyl)-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミドおよびビスジアゾ化(bis-biazotized)ベンジジンを含む。
ポリペプチドまたはペプチド組成物の免疫原性は、アジュバントとして公知の、免疫反応の非特異的刺激物質を用いることによって増強することができる。適当なアジュバントはサイトカイン、毒素または合成組成物などの、許容される全ての免疫刺激性化合物を含む。
受動免疫法ともいわれる、治療用免疫グロブリンの直接投与は、患者由来の免疫反応を必要とせず、それゆえ、即時防御をもたらす。さらに、受動免疫法は、免疫原性ではない、かつ生物に対して特異性が低い細菌構造を対象とすることができる。病原生物に対する受動免疫法は、ヒトまたは非ヒトドナーの血清に由来する免疫グロブリンに基づいている。
本発明の組成物および関連する方法、特に、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、Ebh、Coa、vWa、SpA、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および/またはビトロネクチン結合タンパク質のペプチドまたはタンパク質の一つまたは複数との組み合わせでのEmp、AdsAおよび/またはEapのポリペプチドまたはペプチドを含む、ブドウ球菌抗原の患者/被験体への投与を、従来の治療の施行と併せて用いることもできる。これらには、ストレプトマイシン、シプロフロキサシン、ドキシサイクリン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、アンピシリン、テトラサイクリン、または抗生物質の各種組み合わせなどの抗生物質の投与が含まれるが、これらに限定されることはない。一つの局面において、ポリペプチドワクチンおよび/または治療をAdsA活性の小分子または非ペプチド阻害剤と併せて用いることが企図される。
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
いくつかの態様において、薬学的組成物が被験体に投与される。本発明の種々の局面では、被験体に組成物の有効量を投与することを伴う。本発明のいくつかの態様において、Emp、Eapおよび/またはAdsA抗原を、Ess経路の成員と併せておよびEsaまたはEsxクラスのポリペプチドまたはペプチドを含めて、ならびに/あるいはソルターゼ基質の成員、ならびに/あるいは分泌病毒性因子および/または多糖類を患者に投与して、一種または複数種のブドウ球菌病原菌による感染を防ぐまたは処置することができる。あるいは、一つまたは複数のそのようなポリペプチドまたはペプチドをコードする発現ベクターを、予防的処置として患者に与えることもできる。さらに、そのような化合物を抗生物質と併せて投与することもできる。そのような組成物は一般に、薬学的に許容される担体または水媒体中に溶解または分散される。
本明細書において用いられる場合、インビトロ投与という用語は、培養細胞を含むが、これに限定されない、動物から取り出されたまたは動物の体外の細胞に対して行われる操作をいう。エクスビボ投与という用語は、インビトロにおいて操作されており、その後で、生きている細胞に投与される細胞をいう。インビボ投与という用語は、動物の体内で行われる全ての操作を含む。
ある種の態様において、本発明は、核酸またはポリペプチド/ペプチドと結び付いた一つまたは複数の脂質を含む組成物に関する。脂質は水に不溶な、かつ有機溶媒で抽出可能な物質である。本明細書において具体的に記述するもの以外の化合物は、当業者により脂質と理解され、本発明の組成物および方法によって包含される。脂質成分および非脂質は、共有結合的または非共有結合的に、互いに付着されてもよい。
本発明の免疫原性組成物は、PIA (PNAGとしても公知)の一つもしくは複数を含む莢膜多糖類、ならびに/または黄色ブドウ球菌V型および/もしくはVIII型莢膜多糖類、ならびに/または表皮ブドウ球菌I型および/もしくはII型および/もしくはIII型莢膜多糖類をさらに含むことができる。
現在では、PS/A、PIAおよびSAAとして同定されたブドウ球菌表面多糖類の各種形態は同じ化学的実体、つまりPNAGであることが明らかである(Maira-Litran et al., 2004)。それゆえ、PIAまたはPNAGという用語は、これらの全ての多糖類またはそれらに由来するオリゴ糖を包含する。
ヒトでの感染を引き起こす黄色ブドウ球菌の大部分の菌株が5型または8型多糖類のいずれかを含む。およそ60%のヒト菌株が8型であり、およそ30%が5型である。5型および8型莢膜多糖類抗原の構造はMoreauら、1990およびFournierら、1984に記述されている。どちらもその反復単位の中にFucNAcpと、スルフヒドリル基を導入するのに使用できるManNAcAとを有する。それらの構造は:
5型 →4)-β-D-ManNAcA(3OAc)-(1→4)-α-L-FucNAc(1→3)-β-D-FucNAc-(1→
8型 →3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1→3)-α-L-FucNAc(1→3)-β-D-FucNAc-(1→
として報告されており、
最近(Jones, 2005)では、NMR分光法によってそれらの構造は:
5型 →4)-β-D-ManNAcA-(1→4)-α-L-FucNAc(3OAc)-(1→3)-β-D-FucNAc-(1→
8型 →3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1→3)-α-L-FucNAc(1→3)-α-D-FucNAc(1→
に訂正されている。
一つの態様において、本発明の免疫原性組成物は、米国特許第6,294,177号に記述されている黄色ブドウ球菌336抗原を含む。336抗原は、β結合ヘキソサミンを含み、O-アセチル基を含まず、ATCC 55804の下で寄託された黄色ブドウ球菌336型に対する抗体と特異的に結合する。一つの態様において、336抗原は多糖類であり、これは天然のサイズのものであり、あるいは、例えばマイクロ流動化、超音波照射または化学的処理によってサイジングされてもよい。本発明はまた、336抗原に由来するオリゴ糖を網羅する。336抗原は、本発明の免疫原性組成物に含まれる場合、好ましくは、下記のように担体タンパク質と結合され、あるいは非結合とされる。
表皮ブドウ球菌の菌株ATCC-31432、SE-360およびSE-10は、それぞれ、異なる三種の莢膜I型、II型およびIII型を特徴とする(Ichiman and Yoshida, 1981)。表皮ブドウ球菌の各血清型から抽出される莢膜多糖類は、I型、II型およびIII型多糖類を構成する。多糖類は、米国特許第4,197,290号に記述されている方法を含めていくつかの方法によりまたはIchiman et al., 1991に記述されているように抽出することができる。
ワクチン接種に多糖類を用いることに付随する問題の中には、多糖類それ自体が不十分な免疫原であるという事実がある。本発明において利用される多糖類をそのようなタンパク質担体に連結させて、免疫原性を改善することが好ましい。多糖類免疫原と結合されうるそのような担体の例としては、ジフテリアおよび破傷風トキソイド(それぞれDT、DT CRM 197およびTT)、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ならびにツベルクリン精製タンパク質誘導体(PPD)、緑膿菌エキソプロテインA (rEPA)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)由来のプロテインD、肺炎球菌溶血素またはこれらのうちのいずれかの断片が挙げられる。用いるのに適した断片には、Tヘルパーエピトープを包含する断片が含まれる。特に、インフルエンザ菌由来のプロテインD断片は、そのタンパク質のN末端側の3分の1を含むことが好ましいであろう。プロテインDは、インフルエンザ菌由来のIgD結合タンパク質であり(EP 0 594 610 B1)、潜在的な免疫原である。さらに、ブドウ球菌タンパク質/抗原を本発明の多糖類結合体における担体タンパク質として用いることができる。
上記のように、本発明は、被験体においてEmp、Eapおよび/またはAdsAポリペプチドに対する免疫反応を惹起または誘導することに関係する。他の態様では、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、SpA、Ebh、Coa、vWa、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および/またはビトロネクチン結合タンパク質、あるいはその他任意のブドウ球菌ペプチドまたはタンパク質を含めて、他のペプチドまたは抗原に対する免疫反応を惹起または誘導することができる。一つの態様において、免疫反応は、感染または関連する疾患、とりわけブドウ球菌に関連する疾患を有する、有することが疑われる、または発症するリスクがある被験体を防御または処置すること(例えば膿瘍存続を限定すること)ができる。本発明の免疫原性組成物の使い方の一つは、入院処置の前に被験体を予防接種または処置することによって、院内感染を予防することである。
本発明は、Emp、Eapおよび/またはAdsAならびに本明細書において記述されるその他任意のポリペプチドまたはペプチド薬剤によって免疫反応が誘導または惹起されるかどうかを評価するための血清学的アッセイ法の実施を含む。実施されうる多くのタイプの免疫アッセイ法が存在する。本発明により包含される免疫アッセイ法には、米国特許第4,367,110号に記述されているもの(二重モノクローナル抗体サンドイッチアッセイ法)および米国特許第4,452,901号に記述されているもの(ウエスタンブロット)が含まれるが、これらに限定されることはない。他のアッセイ法には、インビトロおよびインビボの両方での、免疫細胞化学および標識リガンドの免疫沈降が含まれる。
上記の感染を処置または予防するためのタンパク質、ポリペプチドおよび/またはペプチド、ならびにこれらのポリペプチド、タンパク質および/またはペプチドに結合する抗体の使用に加え、本発明は、ブドウ球菌の存在の検出、ならびに患者内であれ医療機器上であれ、同様に感染しうる感染症を診断することを含む、種々の様式でのこれらのポリペプチド、タンパク質、ペプチドおよび/または抗体の使用を企図する。本発明によれば、感染の存在を検出する好ましい方法は、個体から、例えば、個体の血液、唾液、組織、骨、筋肉、軟骨または皮膚から採取されたサンプルのような、一種または複数種のブドウ球菌種または菌株に感染していることが疑われるサンプルを得る段階を含む。サンプルの単離に続き、本発明のポリペプチド、タンパク質、ペプチドおよび/または抗体を利用する診断アッセイ法を行ってブドウ球菌の存在を検出することができ、サンプル中でのそのような存在を判定するためのそのようなアッセイ技術は当業者に周知であり、放射免疫アッセイ法、ウエスタンブロット分析およびELISAアッセイ法などの方法を含む。概して、本発明によれば、ブドウ球菌に感染していることが疑われるサンプルを本発明によるポリペプチド、タンパク質、ペプチド、抗体またはモノクローナル抗体に加え、サンプル中の、ポリペプチド、タンパク質および/もしくはペプチドに結合する抗体、または抗体に結合するポリペプチド、タンパク質および/もしくはペプチドによってブドウ球菌が示される、感染を診断する方法が企図される。
本発明のいくつかの態様において、タンパク質性組成物は被験体に防御免疫を付与する。防御免疫とは、免疫反応が起こる作用因子を伴った特定の疾患または状態を被験体が発症することを防ぐ特異的な免疫反応を開始する身体の能力をいう。免疫原性上有効な量は、被験体に防御免疫を付与することができる。
ある種の態様において、本発明は、本発明のタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドに関する。Emp、EapまたはAdsA、ならびにEsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、Ebh、Coa、vWa、SpA、Coa、vWa、Ebh、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および/またはビトロネクチン結合タンパク質を含むが、これらに限定されない、他の細菌タンパク質の核酸配列が含まれる。
本発明のポリペプチドは、ベクター中に含まれる核酸分子によってコードされてもよい。「ベクター」という用語は、異種核酸配列を、複製され発現されうる細胞へ導入するために、挿入できる担体核酸分子をいうように用いられる。核酸配列は「異種」であってよく、これは文脈中で、ベクターが導入されている細胞にとって、または核酸配列が組み入れられる核酸にとって核酸配列が異質であることを意味し、これには、細胞または核酸中の配列と同種であるが、しかし通常は見られない、宿主細胞または核酸内の位置にある配列が含まれる。ベクターにはDNA、RNA、プラスミド、コスミド、ウイルス(バクテリオファージ、動物ウイルスおよび植物ウイルス)、ならびに人工染色体(例えば、YAC)が含まれる。当業者は、標準的な組み換え技術(例えば、ともに参照により本明細書に組み入れられるSambrook et al., 2001; Ausubel et al., 1996)を通じてベクターを構築するのに必要なものを十分に持っているであろう。Emp、EapまたはAdsAポリペプチドをコードすることに加えて、ベクターはEsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、Hlaもしくはその変種、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasB、SasF、Ebh、Coa、vWa、SpA、52 kDaのビトロネクチン結合タンパク質(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Cna、コラーゲン結合タンパク質(US6288214)、EFB (FIB)、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EPB、FbpA、フィブリノゲン結合タンパク質(US6008341)、フィブロネクチン結合タンパク質(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD (US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫優性ABC輸送体、IsaA/PisA、ラミニン受容体、リパーゼGehD、MAP、Mg2+輸送体、MHC II類似体(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III活性化タンパク質(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG / Fig (WO 00/12689)、SdrH (WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitCおよびNi ABC輸送体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、および/またはビトロネクチン結合タンパク質、あるいはその他任意のブドウ球菌ペプチドまたはタンパク質をコードすることができ、ベクターはタグまたは免疫原性増強ペプチドなどのポリペプチド配列をコードしてもよい。そのような融合タンパク質をコードする有用なベクターには、pINベクター(Inouye et al., 1985)、一続きのヒスチジンをコードするベクター、ならびに後の精製および分離または切断に向けたグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)可溶性融合タンパク質の作出で用いるpGEXベクターが含まれる。
「プロモーター」は制御配列である。プロモーターは、典型的には、転写の開始および速度が制御される核酸配列の領域である。これには、RNAポリメラーゼおよび他の転写因子のような、調節タンパク質および分子が結合しうる遺伝要素を含めてもよい。「機能的に配置された」、「機能的に連結された」、「制御下」および「転写制御下」という語句は、プロモーターが核酸配列との関連で、その配列の転写開始および発現を制御するのに正しい機能的位置および/または方向にあることを意味する。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関わるシス作用調節配列をいう「エンハンサー」とともに用いられても用いられなくてもよい。
特異的開始シグナルもコード配列の効率的な翻訳に必要とされうる。これらのシグナルには、ATG開始コドンまたは隣接配列が含まれる。ATG開始コドンを含む外因性の翻訳制御シグナルを提供する必要がありうる。当業者は容易にこれを決定して、必要なシグナルを提供することができるであろう。開始コドンは、挿入断片全体の翻訳を確実とするために所望のコード配列の読み取り枠と「インフレーム」でなければならないことは周知である。外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは天然または合成のどちらであってもよく、細菌または哺乳類細胞において機能的でありうる。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素を含めることによって増強されうる。
ベクターには、多数の制限酵素部位を含む核酸領域であって、そのうちのどれを標準的な組み換え技術と併せて用いベクターを消化してもよい、多クローニング部位(MCS)が含まれうる(参照により本明細書に組み入れられる、Carbonelli et al., 1999、Levenson et al., 1998およびCocea, 1997を参照のこと)。ベクターは、外因性の配列をベクターに核酸連結できるように、MCS内で切断を行う制限酵素を用いて直線化または断片化されることが多い。制限酵素および核酸連結反応を伴う技術は、組み換え技術の当業者に周知である。
転写された真核生物RNA分子の大部分がRNAスプライシングを受けて、一次転写産物からイントロンを除去するであろう。ゲノム真核生物配列を含むベクターは、タンパク質の発現に適した転写産物のプロセッシングを確実とするためにドナーおよび/またはアクセプタースプライシング部位を必要としうる(参照により本明細書に組み入れられる、Chandler et al., 1997を参照のこと)。
本発明のベクターまたは構築体は一般に、少なくとも一つの終結シグナルを含むであろう。「終結シグナル」または「ターミネータ」は、RNAポリメラーゼによるRNA転写産物の特異的終結に関わるDNA配列から構成される。したがって、ある種の態様では、RNA転写産物の産生を終了させる終結シグナルが企図される。ターミネータは、望ましい伝達暗号レベルを達成するのにインビボで必要となりうる。
発現において、特に真核生物発現において、典型的には、転写産物の適切なポリアデニル化をもたらすためにポリアデニル化シグナルを含めるであろう。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の実践の成功にとって決定的に重要であるものとは考えられず、および/またはそのようないかなる配列を利用してもよい。好ましい態様にはさまざまな標的細胞において好都合のおよび/または十分に機能することが公知の、SV40ポリアデニル化シグナルおよび/またはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルが含まれる。ポリアデニル化は転写産物の安定性を増大し、または細胞質輸送を促進しうる。
宿主細胞においてベクターを増殖させるために、ベクターは、複製が開始される特異的核酸配列である一つまたは複数の複製起点部位(「ori」と呼ばれることが多い)を含んでもよい。あるいは宿主細胞が酵母であれば、自己複製配列(ARS)が利用されてもよい。
本発明のある種の態様において、本発明の核酸構築体を含む細胞は、発現ベクターの中にスクリーニング可能または選択可能なマーカーをコードすることによってインビトロまたはインビボで同定することができる。転写され翻訳される場合、マーカーは同定可能な変化を細胞に付与し、発現ベクターを含んだ細胞の容易な同定を可能にする。一般的に、選択可能なマーカーは、選択を可能にする特性を付与するものである。陽性選択可能なマーカーは、マーカーが存在することでその選択が可能になるものであるのに対し、陰性選択可能なマーカーは、マーカーが存在することでその選択が妨害されるものである。陽性選択可能なマーカーの例は、薬物耐性マーカーである。
本明細書において用いられる場合、「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」という用語は互換的に用いることができる。これらの用語の全てが、任意のおよび全ての次世代の、その子孫も含む。故意または偶然の変異により全ての子孫が同一ではないことがあると理解されよう。異種核酸配列を発現するという文脈において、「宿主細胞」とは、原核細胞または真核細胞をいい、これには、ベクターを複製できるまたはベクターによってコードされる異種遺伝子を発現できる、任意の形質転換可能な生物が含まれる。宿主細胞はベクターまたはウイルスのレシピエントとして、使用されることができ、使用されている。宿主細胞は「形質移入」または「形質転換」されてもよく、それらは組み換えタンパク質をコードする配列などの、外因性の核酸が宿主細胞に移入または導入される過程をいう。形質転換細胞には、初代被験細胞およびその子孫が含まれる。
先に論じた組成物の少なくとも一部または全部を含む多数の発現系が存在する。原核生物および/または真核生物に基づく系を本発明で用いるために利用して、核酸配列、またはその同源のポリペプチド、タンパク質およびペプチドを産生することができる。そのような多くの系が市販されており、広く利用可能である。
増幅の鋳型として用いられる核酸は、標準的な方法論(Sambrook et al., 2001)にしたがって細胞、組織または他のサンプルから単離されてもよい。ある種の態様において、鋳型核酸を実質的に精製することなく、サンプルに関して分析を行う。核酸はゲノムDNAであってもよい。RNAが用いられる場合には、RNAを相補的DNAに最初に変換することが望ましいかもしれない。
本発明の組成物の発現をもたらすのに適した核酸送達の方法は、本明細書において記述されるようにまたは当業者に公知であるように、核酸(例えば、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを含む、DNA)を細胞、組織または生物に導入できる実質的にいかなる方法も含むものと考えられる。そのような方法には、微量注入(参照により本明細書に組み入れられる、Harland and Weintraub, 1985; 米国特許第5,789,215号)を含む注入(それぞれが参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,994,624号、同第5,981,274号、同第5,945,100号、同第5,780,448号、同第5,736,524号、同第5,702,932号、同第5,656,610号、同第5,589,466号および同第5,580,859号)による; 電気穿孔(参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,384,253号)による; リン酸カルシウム沈殿(Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al., 1990)による; DEAEデキストランの後にポリエチレングリコールを用いること(Gopal, 1985)による; 直接超音波負荷(Fechheimer et al., 1987)による; リポソーム媒介トランスフェクション(Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al., 1980; Kaneda et al., 1989; Kato et al., 1991)による; または微小発射物衝突(それぞれが参照により本明細書に組み入れられる、PCT出願番号WO 94/09699および95/06128; 米国特許第5,610,042号; 同第5,322,783号、同第5,563,055号、同第5,550,318号、同第5,538,877号および同第5,538,880号)によるような、DNAの直接送達が含まれるが、これらに限定されることはない。これらのような技術の適用によって、オルガネラ、細胞、組織または生物は、安定的または一過的に形質転換されうる。
以下の実施例は、本発明のさまざまな態様を例証する目的で与えられており、いかなる形においても本発明を限定することを意図するものではない。本発明は本明細書の中にある目標、目的および利点のほかに、言及されている、目標を実行するために、かつ目的および利点を得るために十分に適していることを当業者は容易に理解するであろう。本実施例は、本明細書において記述される方法とともに、目下、好ましい態様を代表するものであり、例示するものであり、本発明の範囲に対する限定と意図するものではない。その変更および特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨のなかに包含されるその他の用途が、当業者には思い浮かぶであろう。
A. 結果
本発明者らは、ブドウ球菌膿瘍形成の発病を研究し、この病変部内でのブドウ球菌の生存および増殖を可能にする細菌因子を同定しようとした。本研究では、マウスに致死未満量の黄色ブドウ球菌を感染させ、持続的感染を発現させるネズミ腎膿瘍モデル(Burts et al., 2005)を用いた。感染後5日目にマウスを殺処理し、その腎臓を切除し、薄切片ヘマトキシリン・エオシン染色組織の病理組織診断に供し、または、コロニー形成単位(CFU)に向けた組織ホモジネートのプレーティングによるブドウ球菌負荷の数え上げに供した。野生型の臨床分離ブドウ球菌Newman (Baba et al., 2008)と比べて、ソルターゼAに対する構造遺伝子の中にトランスポゾンの挿入がある同質遺伝子変種は、膿瘍を形成できなかった(図1B、1Dおよび1F)。細胞壁外膜にLPXTGモチーフ選別シグナルを有する広範な表面タンパク質を固定するソルターゼAは、多くの異なる病毒性因子の表面提示に関与している(Mazmanian et al., 2000; Mazmanian et al., 1999)。膿瘍形成を定量化するために、腎臓を目視検査し、各個々の器官に1 (表面膿瘍あり)または0 (なし)のスコアをつけた。最終の合計を腎臓の総数で割って小数値を得た。さらに、無作為に選択した3つの右側腎臓を終夜10%ホルマリンに入れ、包埋し、薄片を作り、およびヘマトキシリン・エオシンで染色した。腎臓ごとに、200 μMの間隔で4つの矢状断面を顕微鏡で見た。いずれの検査面にも病変部が観察されたなら、その器官を膿瘍形成陽性と判断した。3×107 CFU/mlの黄色ブドウ球菌Newmanに感染したマウスは、腎臓16/20に可視病変部(表面膿瘍80%)を呈し、病理組織診断について調べた腎臓3/3で膿瘍形成が陽性であった(表3)。対照的に、ΔsrtA変異体に感染したマウスは表面膿瘍0%および組織学的病変3中0 (0/3)を示した(表3)。
a攻撃菌株あたりBALB/cマウス15匹のコホートにおいて感染から5日後のホモジナイズ腎組織でlog10 CFU g-1として計算されたコロニー形成単位(CFU)におけるブドウ球菌負荷の平均。平均の標準誤差(±SEM)が示してある。
b統計的有意性をスチューデントt検定で計算し、P値を記録した。
clog10 CFU g-1として計算された細菌負荷の低下。
c感染から5日後の腎臓組織における膿瘍形成を、動物3匹からヘマトキシリン・エオシン染色し、薄切片にした組織の顕微鏡検査(%陽性)および病理組織診断によって測定し、それによって陽性組織を小数値(3/n)として記録した。
回収された標準誤差付きのCFU、Newmanに対してのlog低下、P値(スチューデントt検定)、観察された表面膿瘍%、#観察された組織学的膿瘍。
腎臓を切片にし、固定し、ヘキサメチルジシラザン(HMDS)中で脱水し、観察の前に80%Pt/20%Pdでスパッタコートした。黄色ブドウ球菌Newmanに感染した腎臓組織は、膿瘍の中心領域内に細菌を含んでいた。野生型ブドウ球菌は、密に結び付いた菌叢に見られ(図1G)、さらに大きな線維嚢内部の線維構造に被包されていた。これらのブドウ球菌巣は白血球を欠いており、接着性の細胞外マトリックスによって埋め込まれているように思われる。srtA変異体に感染した腎臓組織もブドウ球菌を含んでいたが、細菌は健常腎組織中に分散しており、野生型と比べて数が著しく低下していた(図1H)。
黄色ブドウ球菌膿瘍形成の発病を特徴付けるために、腎膿瘍モデルを改変し(Albus et al., 1991)、このなかでBALB/cマウスに静脈内注射によって1×107 CFUのヒト臨床分離株の黄色ブドウ球菌Newmanを感染させた(Baba et al., 2007)。感染後6時間以内に、99.999%のブドウ球菌が血流から消失し、脈管構造を介して行き渡った(図7A)。末梢組織へのブドウ球菌の播種は、腎臓および他の末梢器官組織における細菌負荷が最初の3時間以内に1×105 CFU g-1に達したことから、急速に起こった(図7B)。腎臓組織におけるブドウ球菌の負荷は、24時間以内に1.5 log CFUまで増加した(図7B)。感染から48時間後に、マウスはヘマトキシリン・エオシン染色し、薄切片にした腎臓組織の光学顕微鏡検査によって検出可能な、多器官における播種性膿瘍を発現した(図7D〜K)。初期の膿瘍直径は524 μM (± 65 μM)であった。病変部は病初では多形核白血球(PMN)の流入が目立ち、識別可能なブドウ球菌組織化がなく、その大部分はPMN内に存在するものと思われた(図8A〜C)。感染5日目に、膿瘍はサイズが増大し、好酸球性の無形性物質の層および大きなPMNカフで囲まれた、中心のブドウ球菌集団を含んでいた(図8D〜F)。病理組織診断によって、膿瘍病変部の中心にあるブドウ球菌巣のすぐ近くでのPMNの大量壊死および一面の正常食細胞が明らかになった(図8D〜F)。正常腎組織を感染病変部から分離していた好酸球性の無形性物質に隣接する、膿瘍病変部周辺の壊死PMNの縁も観察された(図8D〜F)。膿瘍は15または36日目に≧ 1,524 μMの直径に最終的に達した(図7K)。もっと後の時間間隔で、ブドウ球菌負荷は104〜106 CFU g-1まで増大し、成長中の膿瘍病変部は器官被膜の方へ移動した(図7J〜K)。末梢病変部は裂けやすく、それによって壊死物質およびブドウ球菌を腹膜腔または後腹膜腔へ放出した。これらの事象は菌血症および膿瘍の第二波を引き起こし、最終的には、これらの感染の致死的転帰を招いた(データ不掲載)。
腎組織における細菌負荷を数え上げるために、動物を殺処理し、その腎臓を切除し、コロニー形成のため組織ホモジネートを寒天培地上に広げた。感染5日目に、黄色ブドウ球菌Newmanに対して平均1×106 CFU g-1腎組織が観察された(図9P)。膿瘍形成を定量化するために、腎臓を目視検査し、各個々の器官に1 (図9A)または0 (図9F)のスコアをつけた。最終の合計を腎臓の総数で割って%表面膿瘍を計算した(表6)。さらに、無作為に選択した腎臓をホルマリン中で固定し、包埋し、薄片を作り、およびヘマトキシリン・エオシンで染色した。腎臓ごとに、200 μMの間隔で4つの矢状断面を顕微鏡で見た(図9)。病変部の数を切片ごとにカウントし平均して、腎臓内の膿瘍の数を定量化した。黄色ブドウ球菌Newmanは腎臓あたり4.364±0.889個の膿瘍を引き起こし、腎臓20個のうち14個(70%)で表面膿瘍が観察された(表6)。
a攻撃菌株あたりBALB/cマウス15匹のコホートにおいて感染から5日後のホモジナイズ腎組織でlog10 CFU g-1として計算されたブドウ球菌負荷の平均。平均の標準誤差(±SEM)が示してある。
b統計的有意性をスチューデントt検定で計算し、P値を記録した; P値<0.05を有意と見なした。
clog10 CFU g-1として計算された細菌負荷の低下。
d感染から5日後の腎臓組織における膿瘍形成を巨視的検査(%陽性)により測定した。
e動物8〜10匹からヘマトキシリン・エオシン染色し、薄切片にした腎臓の病理組織診断; 腎臓あたりの平均膿瘍数を記録し、最終平均(±SEM)を目的に再び平均化した。
f統計的有意性をスチューデントt検定で計算し、P値を記録した。P値<0.05を有意と見なした。
ソルターゼAは、黄色ブドウ球菌株Newmanの外膜中に19種の表面タンパク質を固定化するトランスペプチダーゼである(Mazmanian et al., 1999; Mazmanian et al., 2000)。以前の研究では、多数の動物モデル系においてソルターゼAを病毒性因子と同定しているが、膿瘍の形成または存続へのこの酵素およびその固定表面タンパク質の寄与はまだ明らかにされていない(Jonsson et al. 2002; Weiss et al., 2004)。野生型の親株と比べて(Baba et al., 2007)、同質遺伝子srtA変種(ΔsrtA)は2、5または15日目に肉眼検査または病理組織学的検査のいずれに関しても膿瘍病変部を形成できなかった(図9F〜Jおよび表6)。strA変異体に感染したマウスでは、感染5日目に腎臓組織から1×104 CFU g-1しか回収されず、これは野生型の親株と比べて2.046 log10 CFU g-1の低下である(P=6.73×10-6) (図9P)。類似の欠陥はMRSA株USA300のsrtA変異体にも観察された(データ不掲載)。走査電子顕微鏡法から、srtA変異体(矢じり)が、その他の点では健常な腎組織において高度に分散し、多くの場合、白血球と結び付いていることが示された(図10B)。感染後15日目に、srtA変異体は、腎組織から除去され、野生型と比べて≧ 3.5 log10 CFU g-1の低下であった(図9P)。このように、ソルターゼA固定表面タンパク質は、宿主組織において膿瘍病変部の形成および細菌の存続を可能にし、その場所でブドウ球菌は、細胞外マトリックスに埋め込まれ、かつ無定形の偽被膜により周囲の白血球から保護された群集として複製する。
ソルターゼAは、LPXTGモチーフ選別シグナルを有する広範なタンパク質を細胞壁外膜に固定し、それによって多くの病毒性因子の表面提示を可能にする(Mazmanian et al., 2002)。ブドウ球菌膿瘍形成に必要な表面タンパク質を同定するために、LPXTGモチーフタンパク質を有するポリペプチドをコードする遺伝子の5'コード配列の中にブルサアウレアリスの挿入を導入し(Bae et al., 2004)、これらの変異を黄色ブドウ球菌Newmanへ形質導入した。マウスの静脈内感染および腎膿瘍モデルを通じた分析の後、観察された病毒性欠陥の重度を、ブドウ球菌CFU g-1平均のlog10の低下としてランク付けした(図11および表6)。sdrD、isdB、clfB、isdA、clfAおよびisdCにおける変異は、細菌負荷の低下を引き起こした(表6)。本発明者らは、表面膿瘍が<30%またはそれ以下および組織学的膿瘍平均がP<0.05の変異体を、膿瘍形成の欠陥について有意と考え、これには、sdrD、isdBおよびisdAにおいて変異を有する変種が含まれた(表6)。興味深いことに、clfAおよびclfBにおける変異は、ブドウ球菌負荷の欠陥を示したが、膿瘍形成の欠陥は示さなかった(図11)。これらの病毒性の所見は、クランピング因子タンパク質がフィブリノゲン結合および貪食排除に対する耐性、つまり血中での病原菌の生存および播種に必要な特質を媒介するということを示唆している過去の研究と一致している(McDevitt et al., 1994; Ni Eidhin et al. 1998)。プロテインAは、免疫グロブリンのFc成分に結合することによって食作用を妨害し(Uhlen et al., 1984; Jensen et al., 1958)、フォン・ヴィレブランド因子を介して血小板凝集を活性化し(Hartleib et al., 2000)、VH3を持つIgMのFab領域を捕捉することによってB細胞超抗原として機能し(Roben et al., 1995)、および、そのTNFR1活性化を通じて、ブドウ球菌性肺炎を引き起こすことができる(Gomez et al., 2004)。プロテインA変異体(spa)は、ブドウ球菌負荷の中程度の低下を示した(5日目)が、野生型、clfAおよびclfB菌株とは対照的に、spa変種が膿瘍を形成する能力は減少した(図11および表6)。
黄色ブドウ球菌は二つの糖鎖構造、つまり莢膜多糖類(CPS) (Jones 2005)およびポリ-N-アセチルグルコサミン(PNAG) (Gotz 2002)を作り出す。黄色ブドウ球菌NewmanおよびUSA300は、5型CPSを合成し、これは繰り返し三糖類サブユニット[→4)-β-D-ManAcA-(1→4)-α-L-FucNAc(3OAc)-(1→3)-β-D-FucNAc-(1→]から構成される(Baba et al., 2007)。cap5遺伝子クラスタのヌクレオチド配列は16個の遺伝子オペロン(capA-P)を含み、その二つの産物CapPおよびCapOはUDP-N-アセチルマンノサミン酸(UDP-ManNAcA)の合成においてエピメラーゼおよびデヒドロゲナーゼとして機能する(O'Riordan and Lee, 2004; Sau et al., 1997)。予想通り、capOへのブルサアウレアリスの挿入はCPS5合成を抑止した(データ不掲載)。直鎖状のβ(1-6)結合グルコサミノグリカンPNAG (またはPIA)は、2-デオキシ-2-アミノ-D-グルコピラノシル残基から構成され、そのうち80〜85%がN9アセチル化されている(Mack et al., 1996)。残りのグルコサミン残基はプラスに帯電しており、多糖類と細菌外膜との結合を促進する(Vuong et al., 2004)。PNAGは、細胞間付着因子遺伝子座(icaADBC)の産物によって合成される(Heilmann et al., 1996; Cramton et al., 1999)。どちらの黄色ブドウ球菌糖鎖構造も動物感染の発病にとって必要でなかった。というのは、capOおよびicaADBCまたは調節因子icaRにおける変異が5日目の細菌負荷、つまりブドウ球菌群集の確立または腎膿瘍の形成に影響を与えなかったからである(表6)。ブドウ球菌膿瘍形成への外膜結合タンパク質の寄与も調べた。外膜結合タンパク質の特徴は、それらを熱SDS中で煮沸することによって抽出できるということである。この方法を用いて、黄色ブドウ球菌Newmanの外膜におけるそのような二つのタンパク質EapおよびEmpの沈着を検出した。empの中にブルサアウレアリスの挿入がある変異体は、膿瘍の形成の顕著な欠陥および宿主組織内での細菌存続の顕著な欠陥に加えて、感染5日目に腎臓組織における細菌負荷の低減を示した(図12、表6)。eap変異体には膿瘍形成の低下が認められなかったのに対し、5日目および15日目の細菌負荷の低下は、宿主組織内での細菌存続(peristence)の欠陥を示唆している(図12、表6)。感染中のEmpおよびEapの発現は免疫蛍光実験で検出された(図12J〜K)。Eapは偽被膜内に沈着していることが分かったのに対し、Empはブドウ球菌膿瘍群集中に検出された。これらの観察結果は、Empが、膿瘍病変部を引き起こすブドウ球菌群集の形成に寄与し、その一方で偽被膜におけるEapの沈着が宿主組織中での細菌存続を促進するというモデルを支持している。
以前の研究では、ブドウ球菌疾患に対する防御免疫を誘発させる能力がないか精製ソルターゼA基質を調べることによって黄色ブドウ球菌ワクチン抗原を特徴付けようとした(Stranger-Jones et al., 2006)。個々のサブユニットワクチン抗原として使用された場合、表面タンパク質はさまざまな程度の防御を生み出した; SdrD、IsdA、IsdB、SdrE、SpA、ClfAおよびClfBによる免疫は細菌負荷の有意な低下を達成したが、これらのワクチンのどれも完全な防御を与えられなかった。対照的に、4つの抗原の組み合わせによっては、いくつかの異なる黄色ブドウ球菌株での致死的攻撃または膿瘍形成に対するはるかに強いワクチン防御をもたらした(Stranger-Jones et al., 2006)。組み換えEapおよびEmpを大腸菌から精製し、これらのタンパク質を用いて、黄色ブドウ球菌Newmanでの後の攻撃のためにBALB/cマウスを免疫した(図13)。免疫の後、マウスは両方の外膜結合タンパク質に対する体液性免疫反応を発現した(図13A)。Empでの免疫は腎臓組織内でのブドウ球菌負荷の中程度0.959 log10 CFU g-1の低下を引き起こした(P=0.5114)のに対し、Eapでは顕著なレベルの防御が達成された(細菌負荷の1.939 log10 CFU g-1の低下、P=0.0079) (図13B)。EmpまたはEap特異的な抗体がブドウ球菌の攻撃に対する防御を提供できるかどうか試験するために、ウサギを免疫し、EmpおよびEap特異的な抗体を親和性クロマトグラフィーによって精製した。
細菌株および増殖
ブドウ球菌はトリプトソイ寒天またはブロスにて37℃で培養した。大腸菌株DH5αおよびBL21(DE3)はルリア寒天またはブロスにて37℃で培養した。アンピシリン(100 μg/ml)およびエリスロマイシン(10 μg/ml)をそれぞれ、プラスミドおよびトランスポゾン変異体の選択に用いた。
Phoenixライブラリ由来の挿入変異をヒト臨床分離株黄色ブドウ球菌Newmanに導入した。各変異体は、関心対象の遺伝子の中にエリスロマイシン耐性カセットを含むトランスポゾン・ブルサアウレアリスを保有する。変異は既報(Bae et al., 2004)のように検証した。手短に言えば、染色体DNAを抽出(Promega Wizard Kit)し、AciI (NEB)で消化し、T4リガーゼ(Promega)で再び核酸連結して個々のプラスミドを形成させ、トランスポゾン・ブルサアウレアリスに特異的なプライマーを用いてPCR増幅した。これらの産物を配列決定して、標的遺伝子中のトランスポゾン挿入部位を検証した。
EapおよびEmpのコード配列は黄色ブドウ球菌Newman鋳型DNAを用いてPCR増幅した(Baba et al., 2007)。PCR産物をpET15bにクローニングして、N末端His6タグ融合を有する組み換えタンパク質を発現させた。細菌をFrenchプレス中で破壊し、膜および不溶性成分を超遠心によって沈降した。Hisタグ付きEmpを親和性クロマトグラフィーによりその天然状態で精製した。Eapを含有する抽出物を8 M尿素、50 mM Tris-HCl pH 8.0中にて室温で4〜5時間可溶化し、その後、10,000×gで遠心分離した。変性タンパク質を含有する上清をニッケル-ニトリロ三酢酸(Ni-NTA)親和性クロマトグラフィー(Promega)に供した。タンパク質を、逐次的に高い濃度のイミダゾール(100〜500 mM)を含有するPBS-8M尿素中で溶出した。Eap陽性の溶出液画分をプールし、PBS-1 M尿素中に希釈し、第二のNi-NTAカラムに通した。再び折り畳まれたEapを、イミダゾールを含有するPBS緩衝液で溶出した。タンパク質濃度を280 nmでの吸光度によって決定した。ウサギ(6ヶ月齢のNew-Zealandホワイト、雌性、Charles River Laboratories)に初回免疫の場合CFA (Difco)または24日目および48日目の追加免疫の場合IFA中で乳化されたタンパク質500 μgを免疫した。60日目に、ウサギを採血し、免疫ブロッティング、免疫蛍光顕微鏡検査または受動移入実験のために血清を回収した。
感染腎(右側)を8%グルタルアルデヒド中4℃で24〜48時間固定し、2〜5 mm片の薄片を作って内部組織または膿瘍を曝露した。これらのサンプルを次いで、25、50、75、90、100%エタノール、引き続き100% HMDS中での連続的なインキュベーションにより脱水した。脱水の後、サンプルをマウントし、80%Pt/20%Pdで8 nmにスパッタコートした後にFei NovaNano SEM200走査電子顕微鏡下で観察した。生物膜アッセイの場合、ブドウ球菌をカバースリップ上、5% CO2中にて鉄枯渇RPMI中で増殖させ、PBS中で3回洗浄した。カバースリップをエタノールおよびHMDS中でのインキュベーションによって連続的に脱水し、マウントし、スパッタコートした後に走査電子顕微鏡下で観察した。
黄色ブドウ球菌株は、10% RPMI1640および1%カザミノ酸(Difco)を補充したChelex (Sigma)処理RPMI 1640 (Gibco)中で増殖させた。終夜培養物を6% CO2中にて37℃で増殖させ、次に新鮮培地を含有する96ウェル平底組織培養プレート(Costar)へ四つ組として10分の1で植菌した。これらのプレートを24時間6% CO2中にて37℃で静的にインキュベートした。ウェルを1×PBSで3回洗浄し、37℃で2時間乾燥し、1%サフラニンで染色した。450 nmでの吸光度を測定して生物膜形成を定量化した。各菌株を少なくとも3回の個別の実験で試験し、両側スチューデントt検定を用いて変異体を野生型と比較した。
黄色ブドウ球菌Newmanの終夜培養物を新鮮なトリプトソイブロスへ100分の1で植菌し、37℃で2時間増殖させた。ブドウ球菌を沈降し、1×PBSで洗浄し、多量のPBSに懸濁して0.6のA600 (3×108 CFU/ml)を得た。植菌液をプレーティングおよびコロニーの数え上げによって検証した。マウスを体重1キログラムあたり100 mg/mlのケタミンおよび2 mg/mlのキシラジンの腹腔内注射によって麻酔した。6〜8週齢の雌性BALB/cマウス(Charles River Laboratories)に眼窩後部注射によって100 μlの細菌懸濁液(3×107 CFU)を感染させた。ブドウ球菌株あたりマウス10または20匹のコホートを感染させた。感染後5日目に、マウスをCO2吸入によって殺処理し、解剖し、腎臓を切除し、超音波処理器を用い0.01% Triton X-100中でホモジナイズした。CFUの決定のためアリコット(20 μl)を連続的に希釈し、プレーティングした。各コホートのマウス由来の3〜4個の右腎を室温で24時間10%ホルマリン中で固定した。組織をパラフィン包埋し、薄片にし、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、顕微鏡検査した。3〜4週齢雌性BALB/cマウスを存続試験に用いた。
後肢への筋肉内注射により精製タンパク質でBALB/cマウス(24日齢雌性、1群あたりマウス8〜10匹、Charles River Laboratories, Wilmington, MA)を免疫した。抗原(動物1匹あたり精製タンパク質25 μg)を0日目(完全フロインドアジュバントで1:1に乳化)および11日目(不完全フロインドアジュバントで1:1に乳化)に投与した。マウスを20日目に眼窩周囲から採血し、引き続いて21日目に107 CFU/mlの細菌で反対の眼に眼窩後部攻撃を行った。マウスを25日目に殺処理し、腎膿瘍モデルにしたがって処理した。
感染動物の腎臓を解剖し、氷上の1×PBS中に入れ、その後、クリオモールド内のTissue Tek OCT Compound中で急速冷凍した。サンプルを薄切り(4 μmの厚さ)にし、スライドにマウントし、-80℃で貯蔵した。染色の前に、スライドを30分間室温にまで加温し、10分間氷冷アセトン中で固定し、氷冷PBSで2回洗浄した。スライドを振盪しながら室温で1時間3% BSA、20分の1のヒトIgG (Sigma)、1×PBS、0.1% Tween-80中でブロッキングした。特異的ウサギ抗体(2,000分の1)を混合物に加え、スライドをさらに1時間インキュベートさせた。溶液をデカントし、スライドグラスをPBSおよび各10分のインキュベーションで3回洗浄した。スライドを3% BSA、1×PBS、0.1% Tween-80、200分の1のAlexaFluor-647マウス抗ウサギ二次抗体中に入れ、振盪しながら、暗所中にて室温でインキュベートさせた。溶液をデカントし、スライドをPBSで3回洗浄し、1,000分の1のHoechst色素(Invitrogen)および1 μg/mlのBODIPY-バンコマイシンを含有するPBS中に入れ、振盪しながら5分間暗所中でインキュベートさせた。スライドをもう一度PBSで洗浄し、Nプロピル没食子酸中でマウントし、Leica SP5 AOBSスペクトル二光子共焦点顕微鏡下で観察した。
BALB/cマウス(n=15)を0、11日目に精製EapもしくはEmpまたはPBSで免疫した。免疫後20日目に、マウス5匹を採血し血清を得て抗体力価を決定し、21日目に、全てのマウスを1×107 CFUの黄色ブドウ球菌Newmanで攻撃した。感染から5日後、死体解剖中に腎臓を取り出し、腎組織をブドウ球菌負荷または病理組織診断のために分析した。
A. 結果
AdsAは血中でのブドウ球菌の生存に必要である
先天性免疫反応からの回避に必要なブドウ球菌遺伝子を同定するため、BALB/cマウスまたはSprague-Dawleyラット由来の全血中で生存する黄色ブドウ球菌株Newmanの能力を、寒天培地上でのコロニーの形成を介し定時間隔で細菌負荷を記録することによって調べた(図15)。予想通り、ブドウ球菌に特異的な抗体のない、未処置マウスおよびラットの血液内の免疫細胞(データ不掲載)は、黄色ブドウ球菌Newmanを食菌および死滅化することができなかった(図15Aおよび15D)。野生型株とは対照的に、ソルターゼA (srtA)に対する構造遺伝子を欠いた変種は、食細胞性死からのブドウ球菌の回避の欠陥を示した(P<0.05) (図15Aおよび15D)。ソルターゼAは、ペプチド転移機構および表面タンパク質C末端のLPXTGモチーフ選別シグナルを用いて、ブドウ球菌外膜中の広範な種々のポリペプチドを固定する(Mazmanian et al., 2002)。食細胞性死からのブドウ球菌の回避へのこれらの表面タンパク質の寄与について調べるために、本発明者らは、表面タンパク質遺伝子におけるブルサアウレアリスの挿入(Bae et al., 2004)を野生型株の黄色ブドウ球菌Newmanへ形質導入し、血中でのブドウ球菌変種の生存を測定した(図15Bおよび15E)。clfA、および以後adsAとするsasH (Staphylococcus aureus surface protein; 黄色ブドウ球菌表面タンパク質)における変異は、恒常的な生存欠陥を示した。clfA変異体の表現型は期待した結果を示す。これは、コードされるクランピング因子A (ClfA)が線維素を沈殿させ、マクロファージおよび好中球の食作用を妨害することが公知だからである(Palmqvist et al., 2004; Higgins et al., 2006)。発病へのAdsAの寄与は分かっていない。AdsAは、二つの特徴的配列ILHTnDiHGrL (残基番号124-134)およびYdamaVGNHEFD (残基番号189-201)を有する5'-ヌクレオチダーゼドメインを持っており、このタンパク質が5'-AMPからのアデノシンの合成を触媒できることを示唆している。ブドウ球菌病毒性におけるadsAの重要性をさらに調べるために、本発明者らは、全adsA遺伝子および上流プロモーター配列を発現ベクターpOS1にクローニングすることによってadsA遺伝子を補完し、padsAを作出した。padsAでのadsA変異体ブドウ球菌の形質転換は、マウスまたはラット血中で生存するその能力を回復したことから、観察された病毒性欠陥がadsA発現のないことで実際に引き起こされることが示された(図15Cおよび15F、ならびに図20)。黄色ブドウ球菌の生存をヒト志願者の血液でも調べた。ネズミ血液と同様に、adsA変異体ブドウ球菌の数が減少し、好中球によるブドウ球菌貪食が野生型株の黄色ブドウ球菌Newmanと比べて増加した(図15Gおよび15H)。
侵襲的ブドウ球菌疾患におけるadsAの寄与について調べるために、107コロニー形成単位(CFU)の野生型黄色ブドウ球菌Newmanまたはその同質遺伝子asdA変種での静脈内接種によってBALB/cマウスを感染させた。動物を感染後5日目に殺処理し、両方の腎臓を取り除いた。右腎をホモジナイズし、ブドウ球菌負荷を寒天上でのプレーティングおよびコロニー形成によって数え上げた(図16A)。左腎をグルタルアルデヒドで固定し、パラフィン包埋し、薄片にし、組織診断によって分析した(図16B)。予想通り、野生型黄色ブドウ球菌Newmanは、器官組織1グラムあたり107 CFUの平均細菌負荷で腎臓組織中に膿瘍を形成した。対照的に、adsA変異体ブドウ球菌は、膿瘍を形成することができず、野生型と比べて、細菌負荷の10倍超の低下を示した(図16A)。
AdsAが5'ヌクレオチダーゼ特徴的配列を持つことを考慮し、AdsAがAMPからアデノシンを合成できるかどうかを問いかけた。黄色ブドウ球菌の野生型、adsAおよびisdB (鉄表面決定因子B; iron surface determinant B、AMP加水分解に寄与しない遺伝子) (Mazmanian et al., 2003)変異体株、ならびにadsA:padsA株の細胞壁ペプチドグリカンをリソスタフィン(Schindler and Schuhardt, 1964)で分解し、細胞壁抽出物を放射標識[14C]AMPとともにインキュベートした。アデノシンの生成を薄層クロマトグラフィー(TLC)によってモニターした。adsA変異体ブドウ球菌のリソスタフィン抽出物は、顕著に低減したアデノシンシンターゼ活性(野生型のおよそ25%)を示した。アデノシンシンターゼ活性は、adsA変異体にpadsAを形質転換すると、野生型のレベルにまで回復した(図17A)。isdBの破壊は、対照的に、黄色ブドウ球菌によるアデノシンの生成に影響を与えなかった。
他の病原菌もアデノシンシンターゼを利用して貪食排除からの回避を促進するかどうか調べるために、AdsAのアデノシンシンターゼドメインを持つ産物がないか細菌ゲノム配列を探索し、いくつかの異なる遺伝子を同定した(表3)。炭疽菌のゲノムは、5'-ヌクレオチダーゼ特徴的配列(YdvisLGNHEFN、残基番号131-142)およびC末端LPXTG選別シグナルを有するBasA (炭疽菌表面; Bacillus anthracis surfaceタンパク質、NCBI遺伝子座タグBAS4031)をコードしており、この表面タンパク質が同様に、細胞壁外膜においてソルターゼAにより沈着されることを示唆している(Gaspar et al. 2005)。BasAがアデノシンシンターゼとして機能し、先天性免疫反応からの回避に寄与するかどうかを判定するため、本発明者らは、対立遺伝子置換によってbasAの欠失変異体を構築した(図19)。ムタノリシン、つまりペプチドグリカン内のN-アセチルムラミル-(β1→4)-N-アセチルグルコサミンを切断する壁溶解酵素(Yokigawa et al., 1974)を用いて、細胞壁溶解物を作出した。野生型桿菌由来の細胞壁抽出物はアデノシンシンターゼ活性を持っていたが、basA変異体桿菌に由来する抽出物はこの活性の低減を示した(図19A)。構造遺伝子basAの欠失は炭疽菌におけるBasAの発現(図19B)および表面提示(図19C)を消失させ、アデノシンを合成する桿菌の能力を低減した(図19A)。残存するAMP加水分解量は他のホスファターゼ、例えばアルカリホスファターゼに起因しうる。本発明者らは、大腸菌からタグ付きBasAを発現し親和性精製した。黄色ブドウ球菌AdsAと同様に、BasAの至適アデノシンシンターゼ活性は5 mM MnCl2の存在下で観察された(KM = 2.01 nM)のに対し、5 mM MgCl2では活性の低減が示された(図19D)。マウス血液に植菌した場合、野生型の親炭疽菌Sterneと比べて、basA変異体の貪食排除の増大が観察された(図19E)。ともにこれらの実験は、ブドウ球菌と同様に、炭疽菌もAdsAを利用してアデノシンを合成し、先天性免疫反応を回避することを示唆している。
細菌株
黄色ブドウ球菌株をTSB中にて37℃で増殖させた。黄色ブドウ球菌株USA300は黄色ブドウ球菌での抗菌薬耐性に関するネットワーク(NARSA, NIAID)を通じて得た。この試験に用いた全ての変異体はPhoenix (ΦΝΞ)ライブラリ(Bae et al., 2004)から得た。各Phoenix分離株は示したように臨床分離株Newman (Duthie and Lorenz, 1952)またはUSA300 (Carleton et al., 2004)の派生株である。ブルサアウレアリスの挿入は全て、バクテリオファージφ85を用いて野生型黄色ブドウ球菌NewmanまたはUSA300に形質導入し、PCR分析によって検証した。padsAによるプラスミドおよび対立遺伝子選択の場合にはクロラムフェニコールを10 mg l-1で用いた。黄色ブドウ球菌Newmanにおける対立遺伝子選択の場合には10 mg l-1でおよびUSA300における対立遺伝子選択の場合には50 mg l-1でエリスロマイシンを用いた。炭疽菌株Sterneの変異体は、温度感受性複製起点を含んだpLM4で作出した。変異のそれぞれの側に隣接する1 kbのDNA配列を有するプラスミドを、炭疽菌に形質転換し、形質転換体をLBブロス(20 μg ml-1のカナマイシン)中にて30℃ (許容温度)で増殖させた。培養物を100分の1に希釈し、終夜43℃(制限温度)でLB寒天(20 μg ml-1のカナマイシン)上にプレーティングした。単一のコロニーを抗生物質なしのLBブロスに植菌し、30℃で終夜増殖させた。pLM4に基づくプラスミドの欠損を確実にするため、これらの培養物を抗生物質圧なしの新鮮LBブロスへ4倍希釈し、30℃で増殖させた。培養物を希釈し、LB寒天上にプレーティングし、コロニーをカナマイシン耐性について調べた。カナマイシン感受性コロニー由来のDNAを変異体対立遺伝子の有無についてPCRにより分析した。
以下のプライマーをPCR増幅反応に利用した。
pOS1 (EcoRI)へのFP10/RP10 (adsA + 開始部位より上流の700 bp) PCR産物の核酸連結によってpadsAを作出した。pLM4 (EcoRI、SacIおよびXmaI部位)へのP55/P56 (basA 1 kb 5'隣接配列)およびP57/P58 (basA 1 kb 3'隣接配列) PCR産物の核酸連結によってpJK34を作出した。このプラスミドを用いてbasAコード配列を欠失させた。核酸連結産物を大腸菌DH5αに形質転換し、プラスミドDNAを大腸菌K1077 (dam-、dcm-)に形質転換し、以前に開発されたプロトコル(Gaspar et al., 2005)にしたがって精製(非メチル化)プラスミドDNAを炭疽菌に形質転換した。pGEX-2T (GE Healthcare)へのFP3C/RPB (シグナルペプチドの後の5'側で始まるadsAの1.2 kbの切断) PCR産物の核酸連結によってadsA発現ベクターpVT1を作出し、このプラスミドを大腸菌BL21に形質転換した。
全ての実験プロトコルはシカゴ大学の施設内生物安全委員会(IBC)および動物実験委員会(IACUC)の規制監督下で検討され、承認され、実施された。BALB/cマウスはCharles River Laboratoriesから購入し、Sprague-DawleyラットはHarlanから購入した。黄色ブドウ球菌株の終夜培養物を新鮮TSB中に100分の1希釈し、37℃で3時間増殖させた。ブドウ球菌を遠心分離し、2回洗浄し、PBSに希釈してOD600 0.5 (1×108 CFU ml-1)を得た。ブドウ球菌生菌をトリプトソイ寒天プレート上でのコロニー形成により数え上げて感染用量を定量化した。マウスを体重1キログラムあたり80〜120 mgのケタミンおよび3〜6 mgのキシラジンの腹腔内注射によって麻酔した。細菌懸濁液100マイクロリットル(1×107 CFU)をBALB/cマウス(6週齢雌性)へ眼窩後部注射によって静脈内に投与した。5日目に、マウスを圧縮CO2の吸入によって殺処理した。腎臓を取り除き、1% Triton X-100を含有するPBS中でホモジナイズした。CFUを三つ組で測定するためにホモジネートのアリコットを希釈し、寒天培地上にプレーティングした。統計分析のためにPrizmソフトウェアを用いてスチューデントt検定を行った。病理組織診断のため、腎臓組織を24時間10%ホルマリン中にて室温でインキュベートした。組織をパラフィン包埋し、薄片にし、ヘマトキシリン・エオシンで染色し、顕微鏡検査した。
ムタノリシン(Sigma)は、1 mM PMSFを含有する100 mMリン酸ナトリウム, pH 6.0に5,000単位ml-1の濃度で懸濁し、-20℃で貯蔵した。[14C]AMPおよび[14C]アデノシンはMoravek Biochemicalsから購入した。リソスタフィンはAMBIから購入し、精製アデノシンはSigmaから購入した。
黄色ブドウ球菌株の終夜培養物を新鮮TSB中に100分の1希釈し、37℃で3時間増殖させた。ブドウ球菌を遠心分離し、2回洗浄し、PBSに希釈してOD600 0.5 (1×108 CFU ml-1)を得た。全血をSprague-DawleyラットまたはBALB/cマウスの心穿刺によって採取し、5 μg ml-1のレピルジン抗凝固剤をすぐに加えた。105 CFU ml-1の細菌100 μlをラットまたはマウス血液900 μlと混合した。ヒト血液試験の場合、108 CFU ml-1の細菌100 μlを新たに採血した血液900 μlと混合した。次に試験管を、表示した時点の間ゆっくり回転させながら37℃でインキュベートし、その時点でアリコットを0.5%サポニン/PBSの終濃度にて30分間氷上でインキュベートして、真核細胞を溶解した。生存CFUの数え上げのためTSA上にブドウ球菌の希釈液をプレーティングした。ヒト志願者由来の血液を用いた実験では、シカゴ大学の施設内治験審査委員会(IRB)の規制監督下で検討され、承認され、実施されたプロトコルを伴った。
黄色ブドウ球菌株の終夜培養物を新鮮TSB中に100分の1希釈し、37℃で3時間増殖させた。ブドウ球菌を遠心分離し、PBSで2回洗浄した。細胞3 mlをスピンダウンし、TSM緩衝液(50 mM Tris-HCL pH 7.5、10 mM MgCl2および0.5 Mスクロース) 100 μLに再懸濁し; 次いでリソスタフィン2 μlを加え、37℃で30分間インキュベートさせた。次いで溶液を10k rpmで5分間スピンダウンし、放出された細胞表面タンパク質を含有する懸濁液を集めた。次いでリソスタフィン抽出物15 μlを37℃で30分間3 μCi [14C]AMPとともにインキュベートした。次いでサンプルをシリカプレートにスポットし、その後、(75:25のイソプロパノール:ddH2O) 0.2 M重炭酸アンモニウム溶媒を用いTLCによる分離を行った。ムタノリシンで消化された黄色ブドウ球菌、E.フェカリス(E. faecilis)、炭疽菌および表皮ブドウ球菌の細胞壁抽出物の場合、リソスタフィンの代わりにムタノリシンを用い、製造元の推奨条件で用いた。精製タンパク質でのアッセイ時には、2 μMの精製AdsAまたはBasAをTSM緩衝液中にて表示した金属陽イオンの存在下、3 μCi [14C]AMPとともに15 μlの終容量でインキュベートした。
ブドウ球菌による全血死滅アッセイは、上記のように行った。血漿の抽出は記述(Mo and Ballard, 2001)のように行った。手短に言えば、全血死滅アッセイの結論の後、血液サンプルを5分間13 k rpmで遠心分離し、非細胞性血漿を集めた。次いで血漿600 μlを75 μlの過塩素酸(1.5 M)および1 mM EDTAで抽出した。13 k rpmで5分間の遠心分離の後に上清(500 μl)を取り除き、4 M KOH 29 μlで中和した。10分間氷冷した後に、サンプルを再び、5分間13 k rpmで遠心分離した。上清のpHを6〜7に最終的に調整し、PBSで4分の1希釈し、逆相高性能液体クロマトグラフィー(rpHPLC)の前に0.22 μmのシリンジフィルタでろ過した。
アデノシン産生の存在をrpHPLCによって決定した。サンプルを250 mm×3 mmのカラム(BDS Hypersil C18、粒径5 μm、Thermoscientific)にてクロマトグラフィー法で分離した。移動相は溶液A (dH2O:0.1%トリフルオロ酢酸)および溶液B (アセトニトリル:0.1%トリフルオロ酢酸)からなった。溶液Bを1〜100%の勾配で5〜50分流して、アデノシンを溶出させた。溶媒の流速は0.5 ml/分であった。ピークを280 nmでのそのUV吸光度によって検出した。HPLCクロマトグラムにおけるアデノシンのピークは、その保持時間と、標準サンプルとして用いた精製アデノシン(Sigma)の保持時間との比較によって同定した。次いでアデノシンを含有する画分をマトリックス(α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸)とともにスポットし、反射器ポジティブ条件の下でMALDI-MSに供した。
Claims (215)
- (a) 単離されたEmp抗原、またはその免疫原性断片と、
(b) 単離されたClfA、ClfB、Eap、EsaB、EsxA、EsxB、EsaC、IsdA、IsdB、IsdC、SasF、SasB、SdrC、SdrD、SdrE、SasH、Ebh、Coa、vWa、HlaおよびSpA抗原からなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片と
を含む抗原組成物であって、
該抗原が、免疫反応をそれを必要とする被験体において刺激できる薬学的に許容される組成物に含まれる、前記抗原組成物。 - V型莢膜糖類、VIII型莢膜糖類、および/または多糖類細胞内付着因子(PIA)の一つまたは複数をさらに含む、請求項1記載の組成物。
- V型莢膜糖類、VIII型莢膜糖類、および/または多糖類細胞内付着因子(PIA)がタンパク質担体に抱合される、請求項2記載の組成物。
- タンパク質担体が破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、CRM197、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)プロテインD、肺炎球菌溶血素およびα毒素からなる群より選択される、請求項3記載の組成物。
- 少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原が単離されたClfB、Eap、EsxA、EsxB、IsdAおよびSrdDからなる群より選択される、請求項1記載の組成物。
- 少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原が単離されたIsdA抗原である、請求項1記載の組成物。
- ClfB、Eap、EsxA、EsxB、H1aおよびSdrDからなる群より選択される一つまたは複数のさらなるブドウ球菌抗原をさらに含む、請求項6記載の組成物。
- V型莢膜糖類、VIII型莢膜糖類、および/または多糖類細胞内付着因子(PIA)の一つまたは複数をさらに含む、請求項7記載の組成物。
- V型莢膜糖類、VIII型莢膜糖類、および/または多糖類細胞内付着因子(PIA)がタンパク質担体に抱合される、請求項8記載の組成物。
- タンパク質担体が破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、CRM197、インフルエンザ菌プロテインD、肺炎球菌溶血素およびα毒素からなる群より選択される、請求項9記載の組成物。
- 他のブドウ球菌成分による1%重量/重量未満の混入を含む、請求項1記載の組成物。
- 一つまたは複数の単離された抗原がアジュバントにカップリングされる、請求項1記載の組成物。
- Emp抗原がSEQ ID NO:2の少なくとも5、10、15または20個の連続アミノ酸を含む、請求項1記載の組成物。
- Emp抗原がSEQ ID NO:2に対して少なくとも70%、80%、90%、95%または98%同一である、請求項1または13記載の組成物。
- Emp抗原がSEQ ID NO:2に対して少なくとも90%同一である、請求項1または13記載の組成物。
- Emp抗原がSEQ ID NO:2に対して少なくとも95%同一である、請求項1または13記載の組成物。
- Emp抗原がSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む、請求項1記載の組成物。
- 薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項1記載の組成物。
- カップリングされて多量体抗原を形成している、ClfA、ClfB、Eap、Emp、EsaB、EsxA、EsxB、EsaC、IsdA、IsdB、IsdC、SasF、SasH、Ebh、Coa、vWa、Hla、SasB、SdrC、SdrD、SdrEおよびSpA抗原のうちの二つまたはそれ以上を含む抗原。
- 化学的にカップリングされている、請求項19記載の抗原。
- 二つまたはそれ以上の抗原を含む融合タンパク質である、請求項19記載の抗原。
- 少なくとも二つの抗原のそれぞれの間にリンカー部分をさらに含む、請求項21記載の抗原。
- 請求項1〜22の組成物およびアジュバントを含む免疫原性組成物。
- 被験体においてブドウ球菌感染を減弱できる、薬学的に許容される組成物の中に、Emp抗原またはその断片に結合する、単離抗体またはその断片を含む治療用組成物。
- 抗体がヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項24記載の組成物。
- 抗体がモノクローナル抗体またはその断片である、請求項24記載の組成物。
- 抗体がヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項26記載の組成物。
- 抗体が一本鎖抗体またはその断片である、請求項24記載の組成物。
- 抗体がヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項28記載の組成物。
- 単離されたClfA、ClfB、Eap、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、Hla、IsdA、IsdB、IsdC、SasB、SasF、SasH、Ebh、Coa、vWa、SdrC、SdrD、SdrEおよびSpA抗原からなる群より選択される抗原、またはその断片に結合する少なくとも一つのさらなる単離抗体をさらに含む、請求項24記載の組成物。
- (a) 単離されたEmp抗原、またはその免疫原性断片と、
(b) 単離されたClfA、ClfB、Eap、EsaB、EsxA、EsxB、EsaC、Hla、SasB、SasH、Ebh、Coa、vWa、IsdA、IsdB、IsdC、SasF、SdrC、SdrD、SdrEおよびSpA抗原からなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片と
を含む組成物の有効量を被験体に投与する段階を含む、被験体においてブドウ球菌に対する免疫反応を誘発させるための方法。 - i) 単離された抗原、または
ii) 該抗原をコードする少なくとも一つの単離された組み換え核酸分子
を含む組成物を被験体に投与することにより、単離された抗原の有効量を被験体に提供する、請求項31記載の方法。 - 被験体にアジュバントも投与する、請求項31記載の方法。
- 一つまたは複数の抗原がアジュバントにカップリングされる、請求項33記載の方法。
- 一つまたは複数の抗原がアジュバントに共有結合的にカップリングされる、請求項34記載の方法。
- Emp抗原がSEQ ID NO:2の少なくとも5、10、15または20個の連続アミノ酸を含む、請求項31記載の方法。
- Emp抗原がSEQ ID NO:2に対して少なくとも70%、80%、90%、95%または98%同一である、請求項31または36記載の方法。
- Emp抗原がSEQ ID NO:2に対して少なくとも90%同一である、請求項31または36記載の方法。
- Emp抗原がSEQ ID NO:2に対して少なくとも95%同一である、請求項31または36記載の方法。
- Emp抗原がSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む、請求項31記載の方法。
- ブドウ球菌が黄色ブドウ球菌(S. aureus)である、請求項31記載の方法。
- ブドウ球菌が薬物耐性菌である、請求項31記載の方法。
- ブドウ球菌が黄色ブドウ球菌である、請求項42記載の方法。
- 黄色ブドウ球菌がメチシリン耐性である、請求項43記載の方法。
- 組成物を二回以上被験体に投与する段階をさらに含む、請求項31記載の方法。
- 組成物が経口的に投与される、請求項31記載の方法。
- 組成物が吸入または吸引によって投与される、請求項31記載の方法。
- 組成物が非経口的に投与される、請求項31記載の方法。
- 組成物が皮下に、筋肉内にまたは静脈内に投与される、請求項48記載の方法。
- 組み換え核酸分子が異種プロモーターを含む、請求項32記載の方法。
- 組み換え核酸分子がベクターである、請求項32記載の方法。
- ベクターがプラスミドまたはウイルスベクターである、請求項51記載の方法。
- 組成物が、単離されたEmp抗原、またはその免疫原性断片、ならびに単離されたClfA、ClfB、Eap、EsaB、EsxA、EsxB、EsaC、Hla、SasB、SasH、Ebh、Coa、vWa、IsdA、IsdB、IsdC、SasF、SdrC、SdrD、SdrEおよびSpA抗原からなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片を発現する組み換え非ブドウ球菌を含む、請求項31記載の方法。
- 組み換え非ブドウ球菌がサルモネラ菌(Salmonella)である、請求項53記載の方法。
- 被験体が哺乳類である、請求項31記載の方法。
- 被験体がヒトである、請求項31記載の方法。
- 免疫反応が防御免疫反応である、請求項31記載の方法。
- (a) 単離されたEmp抗原、またはその免疫原性断片と、
(b) 単離されたClfA、ClfB、Eap、EsaB、EsxA、EsaC、Hla、EsxB、IsdA、IsdB、IsdC、SasF、SasB、SasH、Ebh、Coa、vWa、SdrC、SdrD、SdrEおよびSpA抗原からなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片と
を含む組成物を、ブドウ球菌感染の予防または処置を必要とする患者投与する段階を含む、ブドウ球菌感染を予防または処置する方法。 - 単離されたEmp抗原、またはその免疫原性断片と、単離されたClfA、ClfB、Eap、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、IsdA、IsdB、IsdC、SasF、SdrC、SasB、SasH、Ebh、Coa、vWa、Hla、SdrD、SdrEおよびSpA抗原からなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片とを含む組成物でレシピエントを免疫する段階、およびレシピエントから免疫グロブリンを単離する段階を含む、ブドウ球菌感染の予防または処置で用いる免疫グロブリンを調製する方法。
- 請求項59記載の方法によって調製された免疫グロブリン。
- 請求項60記載の免疫グロブリンと、薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物。
- 単離されたClfA、ClfB、Eap、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、IsdA、IsdB、IsdC、SasF、SdrC、SasB、SasH、Ebh、Coa、vWa、Hla、SdrD、SdrEおよびSpA抗原からなる群より選択される一つもしくは複数の単離された抗原、またはその免疫原性断片に結合する、抗体、または一つもしくは複数の抗体を産生する抗体産生細胞を単離する段階を含む、ブドウ球菌感染の予防または処置で用いる抗体を調製する方法。
- 抗体がモノクローナル抗体である、請求項62記載の方法。
- モノクローナル抗体がヒトモノクローナル抗体である、請求項63記載の方法。
- モノクローナル抗体がヒト化モノクローナル抗体である、請求項63記載の方法。
- 抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項62記載の方法。
- 一つまたは複数の単離された抗体でレシピエントを免疫する段階をさらに含む、請求項62記載の方法。
- 単離された抗原がClfA、ClfB、Eap、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、IsdA、IsdB、IsdC、SasF、SdrC、SasB、SasH、Ebh、Coa、vWa、Hla、SdrD、SdrEまたはSpAポリペプチドの5、10、15、20個またはそれ以上の連続アミノ酸を含む、請求項62記載の方法。
- 請求項62記載の抗体および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物。
- (a) 単離されたEmp抗原、またはその免疫原性断片、
(b) 単離されたClfA、ClfB、Eap、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、IsdA、IsdB、IsdC、SasF、SasB、SasH、Ebh、Coa、vWa、SdrC、SdrD、SdrE、HlaおよびSpA抗原からなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片、および
(c) 薬学的に許容される賦形剤
を混合する段階を含む、ワクチンを作出する方法。 - 請求項70記載のワクチンの有効量を被験体に投与する段階を含む、ブドウ球菌感染の処置または予防のための方法。
- ブドウ球菌感染を有するもしくは有することが疑われる、または発症するリスクがある被験体に、単離されたEmp抗原、またはその免疫原性断片、ならびに単離されたClfA、ClfB、Eap、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、IsdA、IsdB、IsdC、SasB、SasH、Ebh、Coa、vWa、SasF、SdrC、SdrD、SdrE、HlaおよびSpA抗原からなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片の有効量を提供する段階を含む、被験体においてブドウ球菌の膿瘍形成および/または存続を制限するための方法。
- (a) 単離されたEap抗原、またはその免疫原性断片と、
(b) 単離されたClfA、ClfB、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、IsdA、IsdB、IsdC、SasF、SdrC、SdrD、SdrE、SasH、Ebh、Coa、vWa、SasB、HlaおよびSpA抗原からなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片と
を含む抗原組成物であって、
該抗原が、免疫反応をそれを必要とする被験体において刺激できる薬学的に許容される組成物に含まれる、前記抗原組成物。 - V型莢膜糖類、VIII型莢膜糖類、および/または多糖類細胞内付着因子(PIA)の一つまたは複数をさらに含む、請求項73記載の組成物。
- V型莢膜糖類、VIII型莢膜糖類、および/または多糖類細胞内付着因子(PIA)がタンパク質担体に抱合される、請求項74記載の組成物。
- タンパク質担体が破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、CRM197、インフルエンザ菌プロテインD、肺炎球菌溶血素およびα毒素からなる群より選択される、請求項75記載の組成物。
- 少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原が単離されたClfB、Emp、EsxA、EsxB、IsdA、HlaおよびSrdDからなる群より選択される、請求項73記載の組成物。
- 少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原が単離されたIsdA抗原である、請求項73記載の組成物。
- ClfB、Emp、EsxA、EsxB、H1aおよびSdrDからなる群より選択される一つまたは複数のさらなるブドウ球菌抗原をさらに含む、請求項78記載の組成物。
- V型莢膜糖類、VIII型莢膜糖類、および/または多糖類細胞内付着因子(PIA)の一つまたは複数をさらに含む、請求項79記載の組成物。
- V型莢膜糖類、VIII型莢膜糖類、および/または多糖類細胞内付着因子(PIA)がタンパク質担体に抱合される、請求項80記載の組成物。
- タンパク質担体が破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、CRM197、インフルエンザ菌プロテインD、肺炎球菌溶血素およびα毒素からなる群より選択される、請求項81記載の組成物。
- 他のブドウ球菌成分による1%重量/重量未満の混入を含む、請求項73記載の組成物。
- アジュバントをさらに含む、請求項73記載の組成物。
- 一つまたは複数の単離された抗原がアジュバントにカップリングされる、請求項84記載の組成物。
- EapペプチドがSEQ ID NO:4の少なくとも5、10、15または20個の連続アミノ酸を含む、請求項73記載の組成物。
- Eap抗原がSEQ ID NO:4に対して少なくとも70%、80%、90%、95%または98%同一である、請求項73または86記載の組成物。
- Eap抗原がSEQ ID NO:4に対して少なくとも90%同一である、請求項73または86記載の組成物。
- Eap抗原がSEQ ID NO:4に対して少なくとも95%同一である、請求項73または86記載の組成物。
- Eap抗原がSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む、請求項73記載の組成物。
- 薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項73記載の組成物。
- 請求項73〜91の組成物およびアジュバントを含む免疫原性組成物。
- 被験体においてブドウ球菌感染を減弱できる、薬学的に許容される組成物の中に、Eap抗原またはその断片に結合する、単離抗体またはその断片を含む治療用組成物。
- 抗体がヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項93記載の組成物。
- 抗体が一本鎖抗体またはその断片である、請求項93記載の組成物。
- 抗体がヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項95記載の組成物。
- 単離されたClfA、ClfB、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、IsdA、IsdB、IsdC、SasF、SasH、Ebh、Coa、vWa、SasB、SdrC、SdrD、SdrE、HlaおよびSpA抗原からなる群より選択される抗原、またはその断片に結合する少なくとも一つのさらなる単離抗体をさらに含む、請求項93記載の組成物。
- (a) 単離されたEap抗原、またはその免疫原性断片と、
(b) 単離されたClfA、ClfB、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、IsdA、IsdB、IsdC、SasF、SasH、Ebh、Coa、vWa、SasB、SdrC、SdrD、SdrE、HlaおよびSpA抗原からなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片と
を含む組成物の有効量を被験体に投与する段階を含む、被験体においてブドウ球菌に対する免疫反応を誘発させるための方法。 - i) 単離された抗原、または
ii) 該抗原をコードする少なくとも一つの単離された組み換え核酸分子
を含む組成物を被験体に投与することにより、単離された抗原の有効量を被験体に提供する、請求項98記載の方法。 - 被験体にアジュバントも投与する、請求項98記載の方法。
- 一つまたは複数の抗原がアジュバントにカップリングされる、請求項100記載の方法。
- 一つまたは複数の抗原がアジュバントに共有結合的にカップリングされる、請求項101記載の方法。
- Eap抗原がSEQ ID NO:4の少なくとも5、10、15または20個の連続アミノ酸を含む、請求項98記載の方法。
- Eap抗原がSEQ ID NO:4に対して少なくとも70%、80%、90%、95%または98%同一である、請求項98または103記載の方法。
- Eap抗原がSEQ ID NO:4に対して少なくとも90%同一である、請求項98または103記載の方法。
- Eap抗原がSEQ ID NO:4に対して少なくとも95%同一である、請求項98または103記載の方法。
- Eap抗原がSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む、請求項98記載の方法。
- ブドウ球菌が黄色ブドウ球菌である、請求項98記載の方法。
- ブドウ球菌が薬物耐性菌である、請求項98記載の方法。
- ブドウ球菌が黄色ブドウ球菌である、請求項109記載の方法。
- 黄色ブドウ球菌がメチシリン耐性である、請求項110記載の方法。
- 組成物を二回以上被験体に投与する段階をさらに含む、請求項98記載の方法。
- 組成物が経口的に投与される、請求項98記載の方法。
- 組成物が吸入または吸引によって投与される、請求項98記載の方法。
- 組成物が非経口的に投与される、請求項98記載の方法。
- 組成物が皮下に、筋肉内にまたは静脈内に投与される、請求項115記載の方法。
- 組み換え核酸分子が異種プロモーターを含む、請求項99記載の方法。
- 組み換え核酸分子がベクターである、請求項99記載の方法。
- ベクターがプラスミドまたはウイルスベクターである、請求項99記載の方法。
- 組成物が、単離されたEap抗原、またはその免疫原性断片と、単離されたClfA、ClfB、EsaB、EsaC、Emp、EsxA、EsxB、IsdA、IsdB、IsdC、SasF、SasH、Ebh、Coa、vWa、SasB、SdrC、SdrD、SdrE、HlaおよびSpA抗原からなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片を発現する組み換え非ブドウ球菌とを含む、請求項118記載の方法。
- 組み換え非ブドウ球菌がサルモネラ菌である、請求項120記載の方法。
- 被験体が哺乳類である、請求項98記載の方法。
- 被験体がヒトである、請求項98記載の方法。
- 免疫反応が防御免疫反応である、請求項98記載の方法。
- (a) 単離されたEap抗原、またはその免疫原性断片と、
(b) 単離されたClfA、ClfB、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、IsdA、IsdB、IsdC、SasH、Ebh、Coa、vWa、SasB、SasF、SdrC、SdrD、SdrE、HlaおよびSpA抗原からなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片と
を含む組成物を、ブドウ球菌感染の予防または処置を必要とする患者に投与する段階を含む、ブドウ球菌感染を予防または処置する方法。 - 単離されたEap抗原、またはその免疫原性断片と、単離されたClfA、ClfB、Emp、EsaB、EsxA、EsxB、EsaC、IsdA、IsdB、IsdC、SasB、SasH、Hla、Ebh、Coa、vWa、SasF、SdrC、SdrD、SdrEおよびSpA抗原からなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片とを含む組成物でレシピエントを免疫する段階、およびレシピエントから免疫グロブリンを単離する段階を含む、ブドウ球菌感染の予防または処置で用いる免疫グロブリンを調製する方法。
- 請求項126記載の方法によって調製された免疫グロブリン。
- 請求項127記載の免疫グロブリンと、薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物。
- (a) 単離されたEap抗原、またはその免疫原性断片、
(b) 単離されたClfA、ClfB、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、IsdA、IsdB、IsdC、SasB、SasH、Ebh、Coa、vWa、SasF、SdrC、SdrD、SdrE、HlaおよびSpA抗原からなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片、および
(c) 薬学的に許容される賦形剤
を混合する段階を含む、ワクチンを調製する方法。 - 請求項129記載のワクチンの有効量を被験体に投与する段階を含む、ブドウ球菌感染の処置または予防のための方法。
- ブドウ球菌感染を有するもしくは有することが疑われる、または発症するリスクがある被験体に、単離されたEap抗原、またはその免疫原性断片、ならびに単離されたClfA、ClfB、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、IsdA、IsdB、IsdC、SasH、Ebh、Coa、vWa、SasB、SasF、SdrC、SdrD、SdrE、HlaおよびSpA抗原からなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片の有効量を提供する段階を含む、被験体においてブドウ球菌の膿瘍形成および/または存続を制限するための方法。
- 単離されたブドウ球菌AdsAペプチド、またはその免疫原性断片を含むペプチド組成物であって、該ペプチドが、免疫反応をそれを必要とする被験体において刺激できる薬学的に許容される組成物に含まれる、前記ペプチド組成物。
- 単離されたClfA、ClfB、Eap、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、Hla、IsdA、IsdB、IsdC、SasF、SasB、SdrC、SdrD、SdrEおよびSpaペプチドからなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片をさらに含む、請求項132記載の組成物。
- V型莢膜糖類、VIII型莢膜糖類、および/または多糖類細胞内付着因子(PIA)の一つまたは複数をさらに含む、請求項132記載の組成物。
- V型莢膜糖類、VIII型莢膜糖類、および/または多糖類細胞内付着因子(PIA)がタンパク質担体に抱合される、請求項134記載の組成物。
- タンパク質担体が破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、CRM197、インフルエンザ菌プロテインD、肺炎球菌溶血素およびα毒素からなる群より選択される、請求項135記載の組成物。
- 少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原が単離されたClfB、Eap、Emp、EsxA、EsxB、IsdA、SasBおよびSrdDからなる群より選択される、請求項133記載の組成物。
- 少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原が単離されたIsdA抗原である、請求項137記載の組成物。
- ClfB、Eap、Emp、EsxA、EsxB、Hla、SasBおよびSdrDからなる群より選択される一つまたは複数のさらなるブドウ球菌抗原をさらに含む、請求項138記載の組成物。
- V型莢膜糖類、VIII型莢膜糖類、および/または多糖類細胞内付着因子(PIA)の一つまたは複数をさらに含む、請求項139記載の組成物。
- V型莢膜糖類、VIII型莢膜糖類、および/または多糖類細胞内付着因子(PIA)がタンパク質担体に抱合される、請求項140記載の組成物。
- タンパク質担体が破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、CRM197、インフルエンザ菌プロテインD、肺炎球菌溶血素およびα毒素からなる群より選択される、請求項141記載の組成物。
- 他のブドウ球菌成分による1%重量/重量未満の混入を含む、請求項132記載の組成物。
- 一つまたは複数の単離されたペプチドがアジュバントにカップリングされる、請求項132記載の組成物。
- AdsAペプチドがSEQ ID NO:36の少なくとも5、10、15または20個の連続アミノ酸を含む、請求項132記載の組成物。
- AdsAペプチドがSEQ ID NO:36に対して少なくとも70%、80%、90%、95%または98%同一である、請求項132または145記載の組成物。
- AdsAペプチドがSEQ ID NO:36に対して少なくとも90%同一である、請求項132または145記載の組成物。
- AdsAペプチドがSEQ ID NO:36に対して少なくとも95%同一である、請求項132または145記載の組成物。
- AdsAペプチドがSEQ ID NO:36のアミノ酸配列を含む、請求項132記載の組成物。
- 薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項132記載の組成物。
- 請求項132〜150の組成物およびアジュバントを含む免疫原性組成物。
- 被験体において細菌感染を減弱できる、薬学的に許容される組成物の中に、細菌AdsA活性の阻害剤を含む組成物。
- 細菌AdsAがブドウ球菌AdsAである、請求項152記載の組成物。
- 細菌感染がブドウ球菌感染である、請求項152記載の組成物。
- ブドウ球菌が黄色ブドウ球菌または表皮ブドウ球菌(S. epidermidis)である、請求項154記載の組成物。
- 細菌感染が炭疽菌(Bacillus anthracis)感染である、請求項152記載の組成物。
- 阻害剤が抗AdsA抗体である、請求項152記載の組成物。
- 抗AdsA抗体がAdsAの細胞外ドメインに結合する、請求項157記載の組成物。
- 抗体がモノクローナル抗体またはその断片である、請求項157記載の組成物。
- 抗体がAsdAの触媒活性を低減する、請求項157記載の組成物。
- 阻害剤が小分子である、請求項152記載の組成物。
- 小分子がアデノシン類似体である、請求項161記載の組成物。
- 単離されたAdsAペプチド、またはその免疫原性断片を含む組成物の有効量を被験体に投与する段階を含む、被験体においてブドウ球菌に対する免疫反応を誘発させるための方法。
- 単離されたClfA、ClfB、Eap、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、Hla、IsdA、IsdB、IsdC、SasF、SasB、SdrC、SdrD、Ebh、Coa、vWa、SdrEおよびSpaペプチドからなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片の有効量を提供する段階をさらに含む、請求項163記載の方法。
- (i) 単離されたAdsAペプチド、または
(ii) 該ペプチドをコードする少なくとも一つの単離された組み換え核酸分子
を含む組成物を被験体に投与することにより、単離されたAdsAペプチドの有効量を被験体に提供する、請求項163記載の方法。 - 被験体にアジュバントも投与する、請求項163記載の方法。
- ペプチドがアジュバントにカップリングされる、請求項166記載の方法。
- ペプチドがアジュバントに共有結合的にカップリングされる、請求項167記載の方法。
- AdsAペプチドがSEQ ID NO:36の少なくとも5、10、15または20個の連続アミノ酸を含む、請求項163記載の方法。
- AdsAペプチドがSEQ ID NO:36に対して少なくとも70%、80%、90%、95%または98%同一である、請求項163または169記載の方法。
- AdsAペプチドがSEQ ID NO:36に対して少なくとも90%同一である、請求項163または169記載の方法。
- AdsAペプチドがSEQ ID NO:36に対して少なくとも95%同一である、請求項163または169記載の方法。
- AdsAペプチドがSEQ ID NO:36のアミノ酸配列を含む、請求項163記載の方法。
- ブドウ球菌が黄色ブドウ球菌である、請求項163記載の方法。
- ブドウ球菌が薬物耐性菌である、請求項163記載の方法。
- ブドウ球菌が黄色ブドウ球菌である、請求項175記載の方法。
- 黄色ブドウ球菌がメチシリン耐性である、請求項176記載の方法。
- 組成物を二回以上被験体に投与する段階をさらに含む、請求項163記載の方法。
- 組成物が経口的に投与される、請求項163記載の方法。
- 組成物が吸入または吸引によって投与される、請求項163記載の方法。
- 組成物が非経口的に投与される、請求項163記載の方法。
- 組成物が皮下に、筋肉内にまたは静脈内に投与される、請求項181記載の方法。
- 組み換え核酸分子が異種プロモーターを含む、請求項165記載の方法。
- 組み換え核酸分子がベクターである、請求項165記載の方法。
- ベクターがプラスミドまたはウイルスベクターである、請求項184記載の方法。
- 組成物が、単離されたAdsAペプチド、またはその免疫原性断片を発現する組み換え非ブドウ球菌を含む、請求項163記載の方法。
- 非ブドウ球菌が、単離されたClfA、ClfB、Eap、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、Hla、IsdA、IsdB、IsdC、SasB、SasF、SdrC、SdrD、SdrEおよびSpaペプチドからなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片を発現する、請求項186記載の方法。
- 組み換え非ブドウ球菌がサルモネラ菌である、請求項186記載の方法。
- 被験体が哺乳類である、請求項163記載の方法。
- 被験体がヒトである、請求項163記載の方法。
- 免疫反応が防御免疫反応である、請求項163記載の方法。
- 抗生物質を被験体に投与する段階をさらに含む、請求項163記載の方法。
- 単離されたAdsAペプチド、またはその免疫原性断片を含む組成物を、ブドウ球菌感染の予防、改善、または処置を必要とする患者に投与する段階を含む、ブドウ球菌感染を予防する、改善する、または処置する方法。
- 組成物が、単離されたClfA、ClfB、Eap、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、Hla、IsdA、IsdB、IsdC、SasB、SasF、SdrC、SdrD、Ebh、Coa、vWa、SdrEおよびSpaペプチドからなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片を含む、請求項193記載の方法。
- 単離されたAdsAペプチド、またはその免疫原性断片を含む組成物でレシピエントを免疫する段階を含む、ブドウ球菌感染の予防または処置で用いる免疫グロブリンを調製する方法。
- 組成物がさらに、単離されたClfA、ClfB、Eap、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、Hla、IsdA、IsdB、IsdC、SasB、SasF、SdrC、SdrD、Ebh、Coa、vWa、SdrEおよびSpaペプチドからなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片を含み、かつ免疫グロブリンをレシピエントから単離する段階を含む、請求項195記載の方法。
- 抗体産生細胞を収集する段階をさらに含む、請求項195記載の方法。
- 請求項195記載の方法によって調製された免疫グロブリン。
- 請求項198記載の免疫グロブリンと、薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物。
- (a) 単離されたAdsAペプチド、またはその免疫原性断片、および
(b) 薬学的に許容される賦形剤
を混合する段階を含む、ワクチンを作出する方法。 - 単離されたClfA、ClfB、Eap、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、Hla、IsdA、IsdB、IsdC、SasB、SasF、SdrC、SdrD、SdrE、Ebh、Coa、vWaおよびSpaペプチドからなる群より選択される少なくとも一つのさらなるブドウ球菌抗原、またはその免疫原性断片を混合する段階をさらに含む、請求項200記載の方法。
- 請求項200記載のワクチンの有効量を患者に投与する段階を含む、ブドウ球菌感染の処置または予防のための方法。
- 細菌感染を有するもしくは有することが疑われる、または発症するリスクがある被験体に、単離されたAdsAペプチド、その免疫原性断片、または細菌AdsA活性の阻害剤の有効量を提供する段階を含む、被験体において細菌の貪食排除を増強するための方法。
- 細菌感染が菌血症である、請求項203記載の方法。
- 単離されたAdsAペプチド、その免疫原性断片、または細菌AdsA活性の阻害剤が経脈管的に投与される、請求項203記載の方法。
- 細菌AdsA活性の阻害剤が抗体である、請求項203記載の方法。
- 抗体がモノクローナル抗体またはその断片である、請求項206記載の方法。
- 単離されたAdsAペプチド、またはその免疫原性断片がブドウ球菌AdsAである、請求項203記載の方法。
- ブドウ球菌AdsAが黄色ブドウ球菌または表皮ブドウ球菌AdsAである、請求項208記載の方法。
- 細菌AdsAが炭疽菌AdsAである、請求項203記載の方法。
- (a) 試験薬剤の存在下および非存在下でのAdsAポリペプチドの活性を評価する段階; および
(b) 試験薬剤の存在下および非存在下でのAdsA活性の相違に基づいてAdsA活性の修飾因子を同定する段階
を含む、細菌AdsAの修飾因子をスクリーニングする方法。 - 試験薬剤がアデノシン類似体である、請求項211記載の方法。
- AdsAポリペプチドが細胞によって発現される、請求項211記載の方法。
- 細胞が細菌細胞である、請求項213記載の方法。
- インビトロで行われる、請求項211記載の方法。
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