ES2806945T3 - Antígenos de coagulasa estafilocócica y métodos para su uso - Google Patents

Abstract

Una composición inmunógena que comprende al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes, en donde cada uno de los al menos dos dominios 1-2 es al menos 80 % idéntico en secuencia a un dominio 1-2 de la SEQ ID NO: 33-41 y en donde al menos uno del dominio 1-2 está comprendido en una proteína de coagulasa de longitud inferior a la completa que carece de todo un dominio conector (dominio L), dominio de repetición (dominio R) o dominio de unión a fibrinógeno (dominio Fgb).

Description

DESCRIPCIÓN

Antígenos de coagulasa estafilocócica y métodos para su uso

Antecedentes de la invención

I. Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, a los campos de inmunología, microbiología y patología. Más en particular, se refiere a usos y composiciones que implican variantes de coagulasa bacteriana, que se pueden utilizar para inducir una respuesta inmunitaria contra las bacterias como se especifica en las reivindicaciones.

II. Antecedentes

El número de infecciones adquiridas tanto en la comunidad como en el hospital ha aumentado en los últimos años con el mayor uso de dispositivos intravasculares. Las infecciones hospitalarias (nosocomiales) son una causa importante de morbilidad y mortalidad, más en particular en los Estados Unidos, donde afecta a más de 2 millones de pacientes anualmente. Las infecciones más frecuentes son infecciones del tracto urinario (33 % de las infecciones), seguido de neumonía (15,5 %), infecciones del sitio quirúrgico (14,8 %) e infecciones primarias del torrente sanguíneo (13 %) (Emorl y Gaynes, 1993).

Los principales patógenos nosocomiales incluyen Staphylococcus aureus, estafilococos negativos para coagulasa (principalmente Staphylococcus epidermidis), Enterococcus spp., Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa. Aunque estos patógenos provocan aproximadamente el mismo número de infecciones, la gravedad de los trastornos que pueden producir, combinada con la frecuencia de aislados resistentes a antibióticos, equilibran esta clasificación hacia S. aureus y S. epidermidis como los patógenos nosocomiales más importantes.

Los estafilococos pueden provocar una amplia variedad de enfermedades en seres humanos y otros animales a través de la producción de toxinas o la invasión. Las toxinas estafilocócicas también son una causa habitual de intoxicación alimentaria, ya que las bacterias pueden crecer en alimentos almacenados inadecuadamente.

Staphylococcus epidermidis es un comensal de la piel normal que también es un importante patógeno oportunista responsable de infecciones de dispositivos médicos deteriorados e infecciones en sitios de cirugía. Los dispositivos médicos infectados por S. epidermidis incluyen marcapasos cardíacos, derivaciones de líquido cefalorraquídeo, catéteres de diálisis peritoneal ambulatoria continua, dispositivos ortopédicos y válvulas cardíacas protésicas.

Staphylococcus aureus es la causa más común de infecciones nosocomiales con una morbilidad y mortalidad significativas. Es la causa de algunos casos de osteomielitis, endocarditis, artritis séptica, neumonía, abscesos y síndrome de choque tóxico. S. aureus puede sobrevivir en superficies secas, aumentando la probabilidad de transmisión. Cualquier infección por S. aureus puede provocar la dermatitis exfoliativa estafilocócica, una reacción cutánea a la exotoxina absorbida en el torrente sanguíneo. También puede provocar un tipo de septicemia denominada piemia que puede ser potencialmente mortal. Un aspecto problemático es que el Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) se ha convertido en una causa importante de infecciones adquiridas en el hospital.

Las infecciones por S. aureus y S. epidermidis normalmente se tratan con antibióticos, siendo la penicilina el fármaco de preferencia, mientras que se usa vancomicina para aislados resistentes a la meticilina. El porcentaje de cepas estafilocócicas que presentan resistencia de amplio espectro a antibióticos se ha vuelto cada vez más frecuente, representando una amenaza para la terapia antimicrobiana eficaz. Además, la reciente aparición de cepa de S. aureus resistente a la vancomicina, ha despertado el temor de que estén surgiendo y propagándose cepas de SARM para las que no hay terapia eficaz disponible.

Se está investigando una alternativa al tratamiento con antibióticos para infecciones estafilocócicas que utiliza anticuerpos dirigidos contra antígenos estafilocócicos. Esta terapia implica la administración de antisueros policlonales (documentos WO00/15238, WO00/12132) o tratamiento con anticuerpos monoclonales contra ácido lipoteicoico (documento WO98/57994).

Un enfoque alternativo sería el uso de una vacuna activa para generar una respuesta inmunitaria contra estafilococos. Se ha secuenciado el genoma de S. aureus y se han identificado muchas de las secuencias codificantes (documentos WO02/094868, EP0786519), lo que puede conducir a la identificación de antígenos potenciales. Lo mismo es cierto para S. epidermidis (documento WO01/34809). Como un refinamiento de este enfoque, otros han identificado proteínas que son reconocidas por inmunosueros específicos de pacientes que han padecido infección estafilocócica (documentos WO01/98499, WO02/059148).

S. aureus secreta una gran cantidad de factores de virulencia en el medio extracelular (Archer, 1998; Dinges et al., 2000; Foster, 2005; Shaw et al., 2004; Sibbald et al., 2006). Como la mayoría de las proteínas secretadas, estos factores de virulencia son translocados por la maquinaria de Sec a través de la membrana plasmática. Las proteínas secretadas por la maquinaria de Sec portan un péptido líder N-terminal que es eliminado por la peptidasa líder una vez que la preproteína interactúa en el translocón Sec (Dalbey y Wickner, 1985; van Wely et al., 2001). Un análisis reciente del genoma sugiere que las Actinobacterias y los miembros de los Firmicutes, codifican un sistema de secreción adicional que reconoce un subconjunto de proteínas de una manera independiente de Sec (Pallen, 2002). ESAT-6 (diana de antígeno secretado temprano de 6 kDa) y CFP-10 (antígeno filtrado de cultivo de 10 kDa) de Mycobacterium tuberculosis, representan los primeros sustratos de este sistema de secreción novedoso denominado eSx -1 o Snm en M. tuberculosis (Andersen et al., 1995; Hsu et al., 2003; Pym et al., 2003; Stanley et al., 2003). En S. aureus, dos factores de tipo ESAT-6 designados EsxA y EsxB son secretados por la ruta de Ess (sistema de secreción de ESAT-6) (Burts et al., 2005).

La primera generación de vacunas dirigidas contra S. aureus o contra las exoproteínas que produce han tenido un éxito limitado (Lee, 1996).

Cheng et al. (2010) desvela la contribución de las coagulasas hacia enfermedad por Staphylococcus aureus e inmunidad protectora.

McAdow et al. (2011) desvela que la coagulasa (Coa), la proteína de unión al factor de von Willebrand (vWbp) y el factor de agrupamiento (Cfa), fueron necesarios para la aglutinación estafilocócica.

Sigue existiendo la necesidad de desarrollar vacunas eficaces contra infecciones estafilocócicas. También son necesarias composiciones adicionales para tratar infecciones estafilocócicas.

Sumario de la invención

Durante la infección, Staphylococcus aureus secreta dos coagulasas, Coa y vWbp, que al asociarse con protrombina y fibrinógeno del hospedador, convierten fibrinógeno soluble en fibrina insoluble, inducen la formación de coágulos de fibrina y permiten el establecimiento de enfermedad estafilocócica. Debido al hecho de que Coa y vWbp son factores importantes para la coagulación y aglutinación estafilocócica, que promueven la patogenia de formación de abscesos por S. aureus y bacteriemia letal en ratones. Aquí los inventores demuestran que los anticuerpos dirigidos contra la parte variable de unión a protrombina de las coagulasas confieren inmunidad específica de tipo mediante la neutralización de la actividad de coagulación de S. aureus y protegen de la enfermedad estafilocócica. En particular, combinando partes variables de coagulasas de aislados norteamericanos en proteínas híbridas Coa y vWbp, se obtuvo una vacuna subunitaria que proporciona protección contra la exposición con cepas de S. aureus de diferentes tipos de coagulasa.

La invención se define por las reivindicaciones y cualquier otro aspecto o realización expuesto en el presente documento que no quede dentro del alcance de las reivindicaciones es únicamente para información. En determinadas realizaciones, se proporciona una composición inmunógena que comprende un dominio 1-2 de coagulasa estafilocócica (p. ej., un dominio 1-2 de una proteína estafilocócica Coa o vWbp) como se especifica en las reivindicaciones.

En una realización, la presente invención se refiere a una composición inmunógena que comprende al menos dos dominios de coagulasa estafilocócica 1-2 diferentes, en donde cada uno de los al menos dos dominios 1-2 es al menos 80 % idéntico en secuencia a un dominio 1-2 de la SEQ ID NO: 33-41 y en donde al menos uno del dominio 1-2 está comprendido en una proteína de coagulasa de longitud inferior a la completa que carece de todo un dominio conector (dominio L), dominio de repetición (dominio R) o dominio de unión a fibrinógeno (dominio Fgb).

Por ejemplo, los dominios 1-2 pueden comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos que sea al menos 80, 85, 90, 95, 98, 99 o 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de la TABLA DE SECUENCIAS N.° 1 (SEQ ID NO: 33-37) o de la TABLA DE SECUENCIAS N.° 2 (SEQ ID NO: 38-41). Al menos uno de los dominios de coagulasa estafilocócica 1-2 está comprendido en una proteína de coagulasa de longitud inferior a la completa que carece de todo un dominio conector (dominio L), dominio de repetición (dominio R) o dominio de unión a fibrinógeno (dominio Fgb). Por ejemplo, al menos uno de los dominios 1-2 puede estar comprendido en una proteína Coa de longitud inferior a la completa que carece de todo un segmento de dominio L o R o en una proteína vWbp de longitud menor que la completa que carece de un segmento de dominio L o F). En algunos aspectos, un dominio 1-2 es un segmento de dominio 1-2 en el que se ha eliminado la secuencia señal de secreción.

Según la invención, se proporciona una composición inmunógena que comprende al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes. Por ejemplo, una composición puede comprender al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes de una proteína Coa o vWbp estafilocócica, en donde al menos un dominio 1-2 está comprendido en una proteína de coagulasa de longitud inferior a la completa que carece de todo un dominio conector (dominio L), dominio de repetición (dominio R) o dominio de unión a fibrinógeno (dominio Fgb). La secuencia de los dominios 1-2 comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de la TABLA DE SECUENCIAS N.° 1 (SEQ ID NO: 33-37) o de la TABLA DE SECUENCIAS N.° 2 (SEQ ID NO: 38-41). En determinados aspectos, la secuencia de los dominios 1-2 comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos 85, 90, 95, 98, 99 o 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de la TABLA DE SECUENCIAS N.° 1 (SEQ ID NO: 33-37) o de la TABLA DE SECUENCIAS N.° 2 (SEQ ID NO: 38-41). Según la invención, al menos uno de los dominios 1-2 está comprendido en una secuencia de proteína de coagulasa de longitud inferior a la completa que carece de todo un dominio conector (dominio L), dominio de repetición (dominio R) o dominio de unión a fibrinógeno (dominio Fgb). En realizaciones particulares, la proteína de coagulasa de longitud completa es una proteína Coa que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 42. En aspectos particulares, la proteína de coagulasa de longitud completa es una proteína vWbp que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 75. Según la invención, al menos uno del dominio 1-2 está comprendido en una proteína de coagulasa de longitud inferior a la completa que carece de todo un dominio conector (dominio L), dominio de repetición (dominio R) o dominio de unión a fibrinógeno (dominio Fgb). En otros aspectos más, otra proteína de Coa de longitud inferior a la completa carece de un segmento de dominio L o R. En otros aspectos más, una proteína vWbp truncada adicional carece de todo un segmento de dominio L o F. El término proteína "truncada" se usa para hacer referencia a una proteína o un polipéptido que no alcanza su longitud completa y, por tanto, carece de uno o más de los restos de aminoácidos que están presentes en una proteína normal. La expresión "truncado en relación con una proteína de coagulasa de longitud completa" se utiliza para hacer referencia a una proteína o un polipéptido que no tiene la longitud completa de una proteína de coagulasa y, por tanto, carece de al menos un resto de aminoácido que está presente en un proteína de coagulasa.

En determinadas realizaciones, uno de los dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica es de cepa de S. aureus Newman, 85/2082, MW2, MSSA476, N315, Mu50, MRSA252, Cowan I, WIS o USA300, o cualquier otra cepa de S. aureus. En algunas realizaciones, uno de los dominios 1-2 de coagulasa comprende un dominio 1-2 de vWbp de un S. aureus N315 o USA300.

En algunos aspectos, uno de los dominios 1-2 comprende un dominio 1-2 de Coa al menos 80 % idéntico a una secuencia de aminoácidos de la TABLA DE SECUENCIAS N.° 1 (SEQ ID NO: 33-37) o SEQ ID NO: 41. En aspectos adicionales, uno de los dominios 1-2 comprende un dominio 1-2 de Coa al menos 85, 90, 95, 98, 99 % idéntico a una secuencia de aminoácidos de la TABLA DE SECUENCIAS N.° 1 (SEQ ID NO: 33-37) o SEQ ID NO: 41.

En otros aspectos, uno de los dominios 1-2 comprende un dominio 1-2 de vWbp al menos 80 % idéntico a una secuencia de la TABLA DE SECUENCIAS N.° 2 (SEQ ID NO: 38-40). En aspectos adicionales, uno de los dominios 1-2 comprende un dominio 1-2 de vWbp al menos 85, 90, 95, 98, 99 % idéntico a una secuencia de la TABLA DE SECUENCIAS N.° 2 (SEQ ID NO: 38-40).

En determinadas realizaciones, uno de los dominios 1-2 es un dominio 1-2 de Coa, que comprende además un dominio L o R de una proteína Coa estafilocócica.

En determinadas realizaciones, uno de los dominios 1-2 es un dominio 1-2 de vWbp, que comprende además un dominio L o Fgb de una proteína vWbp estafilocócica.

En algunos aspectos, una composición inmunógena comprende al menos tres, cuatro o cinco dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes. En aspectos adicionales, una composición inmunógena comprende al menos cuatro dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes. En realizaciones particulares, los al menos cuatro dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes son dominios 1-2 de Coa estafilocócica de las cepas MRSA252, MW2, N315 y USA300.

En algunas realizaciones, se contempla que una composición inmunógena comprende al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes como se especifica en las reivindicaciones que están comprendidas en una proteína de fusión.

En realizaciones adicionales, la composición inmunógena comprende además uno o más antígenos estafilocócicos adicionales. En realizaciones adicionales, la composición inmunógena también puede incluir un adyuvante. En realizaciones particulares, el o los antígenos estafilocócicos adicionales son Emp, EsxA, EsxB, EsaC, Eap, Ebh, EsaB, Coa, vWbp, vWh, Hla, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, IsdC, ClfA, ClfB, SasF o un SpA no toxígeno.

Se desvela un polipéptido recombinante que comprende al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes. Las secuencias de los dominios 1-2 son al menos 80 % idénticas a una secuencia de aminoácidos de la TABLA DE SECUENCIAS N.° 1 (SEQ ID NO: 33-37) o de la TABLA DE SECUENCIAS N.° 2 (SEQ ID NO: 38-41). En algunos aspectos, las secuencias de los dominios 1-2 son al menos 85, 90, 95, 98, 99 % idénticas a una secuencia de aminoácidos de la TABLA DE SECUENCIAS N.° 1 (SEQ ID NO: 33-37) o de la TABLA DE SECUENCIAS N.° 2 (SEQ ID NO: 38-41).

En otra divulgación, se contempla una molécula polinucleotídica que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido recombinante que comprende una secuencia que codifica al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes. En una divulgación adicional, un vector de expresión comprende la secuencia de ácido nucleico unida operativamente a una secuencia de control de la expresión. En otra divulgación adicional, también se contempla una célula hospedadora que comprende el vector de expresión.

Se desvela el uso de la composición, el polipéptido recombinante, la molécula polinucleotídica y el vector de expresión descritos en el presente documento para tratar o prevenir una infección estafilocócica en un sujeto. La presente invención se refiere a una cantidad eficaz de una composición de la invención para su uso en un método para tratar o prevenir una infección estafilocócica en un sujeto. En algunos aspectos, se usa una composición que comprende al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes para tratar o prevenir una infección estafilocócica. Las secuencias de los dominios 1-2 son al menos 80 % idénticas a una secuencia de aminoácidos de la TABLA DE SECUENCIAS N.° 1 (SEQ ID NO: 33-37) o de la TABLA DE SECUENCIAS N.° 2 (SEQ ID NO: 38-41) y al menos uno de los dominios 1-2 es una secuencia de proteína de coagulasa truncada y carece de todo un dominio conector (dominio L), dominio de repetición (dominio R) o dominio de unión a fibrinógeno (dominio Fgb).

Se describe un método para fabricar una composición inmunógena que comprende mezclar al menos dos polipéptidos 1-2 de dominios de coagulasa estafilocócica diferentes. Las secuencias de los dominios 1-2 son al menos 80 % idénticas a una secuencia de aminoácidos de la TABLA DE SECUENCIAS N.° 1 (SEQ ID NO: 33-37) o de la TABLA DE SECUENCIAS N.° 2 (SEQ ID NO: 38-41) y al menos uno de los dominios 1-2 es una secuencia de proteína de coagulasa truncada.

Las realizaciones incluyen el uso de al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes descritos en el presente documento en composiciones para el tratamiento de infección bacteriana y/o estafilocócica. Asimismo, determinadas realizaciones proporcionan composiciones que se pueden usar para tratar (p. ej., limitando la formación y/o persistencia de abscesos estafilocócicos en un sujeto) o prevenir la infección bacteriana. En algunos casos desvelados, los métodos para estimular una respuesta inmunitaria implican administrar al sujeto una cantidad eficaz de la composición inmunógena descrita en el presente documento y en determinados aspectos, otras proteínas bacterianas. Otras proteínas bacterianas incluyen (i) un factor de virulencia secretado, y/o una proteína o un péptido de superficie celular, o (ii) una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica un factor de virulencia secretado, y/o una proteína o un péptido de superficie celular.

Se ha desvelado que se puede administrar al sujeto la composición inmunógena, el polipéptido recombinante o el vector descrito en el presente documento. El polipéptido recombinante o el vector pueden formularse en una composición farmacéuticamente aceptable. La composición puede comprender además uno o más de al menos o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19 antígenos estafilocócicos adicionales o fragmentos inmunógenos de los mismos (p. ej., Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla (p. ej., mutantes H35), IsdC, SasF, vWbp o vWh). Los antígenos estafilocócicos adicionales que pueden usarse incluyen proteína de unión a vitronectina de 52 kDa (documento WO 01/60852), Aaa (GenBank cAc80837), Aap (referencia de GenBank AJ249487), Ant (referencia de GenBank NP_372518), autolisina glucosaminidasa, autolisina amidasa, Cna, proteína de unión a colágeno (documento US6288214), EFB (FIB), proteína de unión a elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína de unión a fibrinógeno (documento US6008341), proteína de unión a fibronectina (documento US5840846), FnbA, FnbB, GehD (documento US 2002/0169288), HarA, HBP, transportador ABC inmunodominante, IsaA/PisA, receptor de laminina, lipasa GehD, MAP, transportador de Mg2+, análogo de MHC II (documento US5648240), MRPII, Npasa, proteína activadora de ARN III (RAP), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK, SbI, SdrF (documento WO 00/12689), SdrG / Fig (documento WO 00/12689), SdrH (documento WO 00/12689), exotoxinas Sea (documento WO 00/02523), exotoxinas SEB (documento WO 00/02523), transportador ABC de SitC y Ni, proteína de unión a SitC/MntC/saliva (documento US5.801.234), SsaA, SSP-1, SSP-2 y/o proteína de unión a Vitronectina (véase publicaciones PCT WO2007/113222, WO2007/113223, WO2006/032472, WO2006/032475, WO2006/032500).

El antígeno estafilocócico o fragmento inmunógeno se puede administrar simultáneamente con la composición inmunógena que comprende al menos dos dominios 1-2 de coagulasa diferentes, el polipéptido recombinante que comprende al menos dos dominios 1-2 diferentes y/o el vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos dos dominios 1-2 diferentes descritos en el presente documento. El antígeno estafilocócico o fragmento inmunógeno se puede administrar en la misma composición con la composición inmunógena que comprende al menos dos dominios 1-2 diferentes, el polipéptido recombinante que comprende al menos dos dominios 1-2 diferentes y/o el vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos dos dominios 1-2 diferentes descritos en el presente documento. Como se usa en el presente documento, el término "modular" o "modulación" abarca los significados de las palabras "mejorar" o "inhibir". La "modulación" de la actividad puede ser un aumento o una disminución de la actividad. Como se usa en el presente documento, el término "modulador" se refiere a compuestos que afectan a la función de un resto, incluyendo regulación positiva, inducción, estimulación, potenciación, inhibición, regulación negativa o supresión de una proteína, ácido nucleico, gen, organismo o similar.

Una molécula de ácido nucleico recombinante puede codificar al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes y al menos un antígeno estafilocócico o fragmento inmunógeno del mismo. En una divulgación en particular, uno de los al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes es un dominio 1-2 de Coa al menos 80 % idéntico a una secuencia de aminoácidos de la TABLA DE SECUENCIAS N.° 1 (SEQ ID NO: 33-37). En otros aspectos más, uno de los al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes es un dominio 1-2 de vWbp al menos 80 % idéntico a una secuencia de la TABLA DE SECUENCIAS N.° 2 (SEQ ID NO: 38-41). En alguna divulgación, la molécula de ácido nucleico recombinante comprende una secuencia que codifica una proteína de coagulasa truncada y la proteína de coagulasa truncada incluye uno de los al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes. En una divulgación en particular, la proteína de coagulasa es una proteína Coa que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 42. En aspectos particulares, la proteína de coagulasa es una proteína vWbp que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 75.

En determinadas realizaciones, la composición o el polipéptido que comprende al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes se puede usar en combinación con factores secretados o antígenos de superficie que incluyen uno o más de un polipéptido Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp o vWh aislado o segmento inmunógeno del mismo. Los antígenos estafilocócicos adicionales que pueden usarse incluyen proteína de unión a vitronectina de 52 kDa (documento WO 01/60852), Aaa, Aap, Ant, autolisina glucosaminidasa, autolisina amidasa, Cna, proteína de unión a colágeno (documento US6288214), EFB (FIB), proteína de unión a elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína de unión a fibrinógeno (documento US6008341), proteína de unión a fibronectina (documento US5840846), FnbA, FnbB, GehD (documento US 2002/0169288), HarA, HBP, transportador ABC inmunodominante, IsaA/PisA, receptor de laminina, lipasa GehD, MAP, transportador de Mg2+, análogo de MHC II (documento US5648240), MRPII, Npasa, proteína activadora de ARN III (RAP), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK, SbI, SdrF (documento Wo 00/12689), SdrG / Fig (documento WO 00/12689), SdrH (documento WO 00/12689), exotoxinas SEA (documento WO 00/02523), exotoxinas SEB (documento WO 00/02523), transportador ABC de SitC y Ni, proteína de unión a SitC/MntC/saliva (documento US5.801.234), SsaA, SSP-1, SSP-2 y/o proteína de unión a vitronectina. En determinadas realizaciones, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp, vWh, proteína de unión a vitronectina de 52 kDa (documento WO 01/60852), Aaa, Aap, Ant, autolisina glucosaminidasa, autolisina amidasa, Cna, proteína de unión a colágeno (documento US6288214), EFB (FIB), proteína de unión a elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína de unión a fibrinógeno (documento US6008341), proteína de unión a fibronectina (documento US5840846), FnbA, FnbB, GehD (documento US 2002/0169288), HarA, HBP, transportador ABC inmunodominante, IsaA/PisA, receptor de laminina, lipasa GehD, MAP, transportador de Mg2+, análogo de MHC II (documento US5648240), MRPII, Npasa, proteína activadora de ARN III (rAp), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK, sBi, SdrF (documento WO 00/12689), SdrG / Fig (documento WO 00/12689), SdrH (documento WO 00/12689), exotoxinas SEA (documento WO 00/02523), exotoxinas SEB (documento WO 00/02523), transportador ABC de SitC y Ni, proteína de unión a SitC/MntC/saliva (documento US5.801.234), SsaA, SSP-1, SSP-2 y/o proteína de unión a vitronectina, pueden excluirse específicamente de una formulación de la invención.

La siguiente tabla enumera las diversas combinaciones de dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica y diversos antígenos estafilocócicos adicionales:

Tabla 1. Dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica y combinaciones de antígenos estafilocócicos

En una divulgación, el polipéptido recombinante aislado que comprende al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes descritos en el presente documento está multimerizado, p. ej., dimerizado o es una fusión lineal de dos o más polipéptidos o segmentos peptídicos. En determinados aspectos de la invención, una composición comprende multímeros o concatámeros de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más proteínas de superficie celular aisladas o segmentos de las mismas. Los concatámeros son polipéptidos lineales que tienen una o más unidades peptídicas repetitivas. Los al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes, pueden ser consecutivos o estar separados por un espaciador u otras secuencias peptídicas, p. ej., uno o más péptidos bacterianos adicionales. En un aspecto adicional, los otros polipéptidos o péptidos contenidos en el multímero o concatámero pueden incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 de Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp, vWh o fragmentos inmunógenos de los mismos. Los antígenos estafilocócicos adicionales que se pueden usar en combinación con al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes, incluyen proteína de unión a vitronectina de 52 kDa (documento WO 01/60852), Aaa, Aap, Ant, autolisina glucosaminidasa, autolisina amidasa, Cna, proteína de unión a colágeno (documento US6288214), EFB (FIB), proteína de unión a elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína de unión a fibrinógeno (documento US6008341), proteína de unión a fibronectina (documento US5840846), FnbA, FnbB, GehD (documento US 2002/0169288), HarA, HBP, transportador ABC inmunodominante, IsaA/PisA, receptor de laminina, lipasa GehD, MAP, transportador de Mg2+, análogo de MHC II (documento US5648240), MRPII, Npasa, proteína activadora de ARN III (rAp ), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK, SBI, SdrF (documento WO 00/12689), SdrG / Fig (documento WO 00/12689), SdrH (documento WO 00/12689), exotoxinas SEA (documento WO 00/02523), exotoxinas SEB (documento WO 00/02523), transportador ABC de SitC y Ni, proteína de unión a SitC/MntC/saliva (documento US5.801.234), SsaA, SSP-1, SSp-2 y/o proteína de unión a vitronectina.

Se desvelan métodos para inducir una respuesta inmunitaria contra una bacteria estafilococo o estafilococos en un sujeto, que comprende proporcionar al sujeto una cantidad eficaz de una composición inmunógena o un polipéptido recombinante que comprende al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes o un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que lo codifica. Se desvelan métodos para inducir una respuesta inmunitaria contra una bacteria estafilococo o estafilococos en un sujeto, que comprende proporcionar al sujeto una cantidad eficaz de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o más proteínas secretadas y/o proteínas de la superficie celular o segmentos/fragmentos de las mismas. Una proteína secretada o proteína de la superficie celular incluye proteínas Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp y/o vWh proteínas y fragmentos inmunógenos de las mismas. Los antígenos estafilocócicos adicionales que pueden usarse incluyen proteína de unión a vitronectina de 52 kDa (documento WO 01/60852), Aaa, Aap, Ant, autolisina glucosaminidasa, autolisina amidasa, Cna, proteína de unión a colágeno (documento US6288214), EFB (FIB), proteína de unión a elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína de unión a fibrinógeno (documento US6008341), proteína de unión a fibronectina (documento US5840846), FnbA, FnbB, GehD (documento US 2002/0169288), HarA, HBP, transportador ABC inmunodominante, IsaA/PisA, receptor de laminina, lipasa GehD, MAP, transportador de Mg2+, análogo de MHC II (documento US5648240), MRPII, Npasa, proteína activadora de ARN III (RAP), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK, S^b I, SdrF (documento WO 00/12689), SdrG / Fig (documento WO 00/12689), SdrH (documento WO 00/12689), exotoxinas SEA (documento WO 00/02523), exotoxinas SEB (documento WO 00/02523), transportador ABC de SitC y Ni, proteína de unión a SitC/MntC/saliva (documento US5.801.234), SsaA, SSP-1, ^s S^p-2 y/o proteína de unión a vitronectina.

Se desvelan composiciones que incluyen un polipéptido, péptido o proteína que comprende una secuencia que es o es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica o similar a un dominio 1-2 de coagulasa estafilocócica, en particular, un dominio 1-2 de Coa (véase, TABLA DE SECUENCIAS N.° 1 (SEQ ID NO: 33-37) o SEQ ID NO: 41) o un dominio 1-2 de vWbp (véase, TABLA DE SECUENCIAS N.° 2 (SEQ ID NO: 38-40)), o una segunda proteína o péptido que es una proteína bacteriana secretada o una proteína bacteriana de superficie celular. La similitud o identidad, con preferencia de identidad, se conoce en la técnica y se pueden usar varios programas diferentes para identificar si una proteína (o un ácido nucleico) tiene identidad o similitud de secuencia con una secuencia conocida. La identidad y/o similitud de secuencia se determina utilizando técnicas convencionales conocidas en este campo, incluyendo el algoritmo de identidad de secuencia local de Smith y Waterman (1981), mediante el algoritmo de alineación de identidad de secuencia de Needleman y Wunsch (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFAST^a en el paquete informático Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.), el programa de secuencia Best Fit descrito por Devereux et al. (1984), utilizando preferentemente la configuración predeterminada o mediante inspección. Preferentemente, el porcentaje de identidad se calcula mediante el uso de herramientas de alineación conocidas y fácilmente comprobables por los expertos en la materia. El porcentaje de identidad es esencialmente el número de aminoácidos idénticos dividido por el número total de aminoácidos comparados por cien.

Se desvelan métodos para estimular en un sujeto una respuesta inmunitaria protectora o terapéutica contra una bacteria estafilococo, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición que incluye (i) una composición inmunógena que comprende al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes, p. ej., un dominio 1-2 de Coa (véase, TABLA DE SECUENCIAS N.° 1 (SEQ ID NO: 33-37) o SEQ ID NO: 41) o un dominio 1-2 de vWbp (véase, TABLA DE SECUENCIAS N.° 2 (SEQ ID NO: 38-40)) o un homólogo de los mismos; o, (ii) un polipéptido recombinante que comprende al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes u homólogos de los mismos; o, (iii) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica los al menos dos dominios 1-2 estafilocócicos diferentes u homólogos de los mismos, o (iv) administrar cualquiera de (i)-(iii) con cualquier combinación o permutación de proteínas bacterianas descritas en el presente documento. En una divulgación preferida, la composición no es una bacteria estafilococo. En determinada divulgación, el sujeto es un ser humano o una vaca. La composición puede formularse en una formulación farmacéuticamente aceptable. Los estafilococos pueden ser Staphylococcus aureus.

Se desvelan vacunas que comprenden una composición farmacéuticamente aceptable que tiene al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes descritos en el presente documento, o cualquier otra combinación o permutación de proteína(s) o péptido(s) descrita en el presente documento, en donde la composición es capaz de estimular una respuesta inmunitaria contra una bacteria estafilococo. La vacuna puede comprender al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes descritos en el presente documento, o cualquier otra combinación o permutación de proteína(s) o péptido(s) descrita. En determinada divulgación, al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes descritos en el presente documento, o cualquier otra combinación o permutación de proteína(s) o péptido(s) descrita, se multimerizan, p. ej., dimerizan o concatamerizan. En una divulgación adicional, la composición de la vacuna está contaminada por menos de aproximadamente 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,05 % (o cualquier intervalo derivable del mismo) de otras proteínas estafilocócicas. Una composición puede comprender además un polipéptido distinto de coagulasa aislado. Normalmente, la vacuna comprende un adyuvante. En determinada divulgación, una proteína o un péptido de la invención, está unido (de manera covalente o no covalente) al adyuvante, preferentemente el adyuvante se conjuga químicamente con la proteína.

En una otra divulgación adicional, una composición de vacuna es una composición farmacéuticamente aceptable que tiene un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido recombinante que contiene al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes descritos en el presente documento, o cualquier otra combinación o permutación de proteína(s) o péptido(s) descritos en el presente documento, en donde la composición es capaz de estimular una respuesta inmunitaria contra una bacteria estafilococo. En determinada divulgación, el ácido nucleico recombinante contiene un promotor heterólogo. Preferentemente, el ácido nucleico recombinante es un vector. Más preferentemente, el vector es un plásmido o un vector vírico. En alguna divulgación, la vacuna incluye una bacteria recombinante, no estafilocócica, que contiene el ácido nucleico. Los no estafilococos recombinantes pueden ser Salmonella u otra bacteria grampositiva. La vacuna puede comprender un excipiente farmacéuticamente aceptable, más preferentemente un adyuvante.

Se desvelan métodos para estimular en un sujeto una respuesta inmunitaria protectora o terapéutica contra una bacteria estafilococo, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición de al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes descritos en el presente documento, o un polipéptido recombinante que contiene al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes, o un ácido nucleico que lo codifica, y que además comprende una o más de una proteína Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp o vWh o péptido de las mismas. La composición puede comprender una bacteria no estafilocócica. La composición puede formularse en una formulación farmacéuticamente aceptable. Los estafilococos para los que se trata a un sujeto pueden ser Staphylococcus aureus. Los métodos de divulgación también pueden incluir adicionalmente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o más factores de virulencia secretados y/o proteínas de superficie celular, tales como Eap, Ebh, Emp, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp o vWh en diversas combinaciones. Una formulación de vacuna puede incluir Eap, Ebh, Emp, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp y vWh.

Una combinación de antígenos puede incluir (1) al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes e IsdA; (2) al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes y ClfB; (3) al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes y SdrD; (4) al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes y Hla o variante de Hla; (5) al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes y ClfB, SdrD y Hla o variante de Hla; (6) al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes, IsdA, SdrD y Hla o variante de Hla; (7) al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes, IsdA, ClfB y Hla o variante de Hla; (8) al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes, IsdA, ClfB y SdrD; (9) al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes, IsdA, ClfB, SdrD y Hla o variante de Hla; (10) al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes, IsdA, ClfB y SdrD; (11) al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes, IsdA, SdrD y Hla o variante de Hla; (12) al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes, IsdA y Hla o variante de Hla; (13) al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes, IsdA, ClfB y Hla o variante de Hla; (14) al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes, ClfB y SdrD; (15) al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes, ClfB y Hla o variante de Hla; o (16) al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes, SdrD y Hla o variante de Hla.

Una bacteria que administra una composición de la invención estará limitada o atenuada con respecto al crecimiento prolongado o persistente o la formación de abscesos. Al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes se pueden sobreexpresar en una bacteria atenuada para mejorar o complementar adicionalmente una respuesta inmunitaria o formulación de vacuna.

La expresión "proteína EsxA" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos de EsxA de tipo silvestre aislados de la bacteria estafilococo y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmunitaria contra proteínas EsxA de la bacteria estafilococo.

La expresión "proteína EsxB" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos de EsxB de tipo silvestre aislados de la bacteria estafilococo y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmunitaria contra proteínas EsxB de la bacteria estafilococo.

La expresión "proteína SdrD" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos de SdrD de tipo silvestre aislados de la bacteria estafilococo y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmunitaria contra proteínas SdrD de la bacteria estafilococo.

La expresión "proteína SdrE" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos de SdrE de tipo silvestre aislados de la bacteria estafilococo y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmunitaria contra proteínas SdrE de la bacteria estafilococo.

La expresión "proteína IsdA" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos de IsdA de tipo silvestre aislados de la bacteria estafilococo y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmunitaria contra proteínas IsdA de la bacteria estafilococo.

La expresión "proteína IsdB" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos de IsdB de tipo silvestre aislados de la bacteria estafilococo y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmunitaria contra proteínas IsdB de la bacteria estafilococo.

La expresión "proteína Eap" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos de Eap de tipo silvestre aislados de la bacteria estafilococo y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmunitaria contra proteínas Eap de la bacteria estafilococo.

La expresión "proteína Ebh" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos de Ebh de tipo silvestre aislados de la bacteria estafilococo y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmunitaria contra proteínas Ebh de la bacteria estafilococo.

La expresión "proteína Emp" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos de Emp de tipo silvestre aislados de la bacteria estafilococo y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmunitaria contra proteínas Emp de la bacteria estafilococo.

La expresión "proteína EsaB" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos de EsaB de tipo silvestre aislados de la bacteria estafilococo y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmunitaria contra proteínas EsaB de la bacteria estafilococo.

La expresión "proteína EsaC" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos de EsaC de tipo silvestre aislados de la bacteria estafilococo y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmunitaria contra proteínas EsaC de la bacteria estafilococo.

La expresión "proteína SdrC" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos de SdrC de tipo silvestre aislados de la bacteria estafilococo y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmunitaria contra proteínas SdrC de la bacteria estafilococo.

La expresión "proteína ClfA" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos de ClfA de tipo silvestre aislados de la bacteria estafilococo y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmunitaria contra proteínas ClfA de la bacteria estafilococo.

La expresión "proteína ClfB" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos de ClfB de tipo silvestre aislados de la bacteria estafilococo y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmunitaria contra proteínas ClfB de la bacteria estafilococo.

La expresión "proteína CoA" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos de CoA de tipo silvestre aislados de la bacteria estafilococo y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmunitaria contra proteínas CoA de la bacteria estafilococo.

La expresión "proteína Hla" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos de Hla de tipo silvestre aislados de la bacteria estafilococo y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmunitaria contra proteínas Hla de la bacteria estafilococo.

La expresión "proteína IsdC" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos de IsdC de tipo silvestre aislados de la bacteria estafilococo y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmunitaria contra proteínas IsdC de la bacteria estafilococo.

La expresión "proteína SasF" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos de SasF de tipo silvestre aislados de la bacteria estafilococo y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmunitaria contra proteínas SasF de la bacteria estafilococo.

La expresión "proteína vWbp" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos de vWbp (proteína de unión al factor de von Willebrand) de tipo silvestre, aislados de la bacteria estafilococo y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmunitaria contra proteínas vWbp de la bacteria estafilococo.

La expresión "proteína vWh" se refiere a una proteína que incluye polipéptidos de vWh (homólogo de la proteína de unión al factor de von Willebrand) de tipo silvestre, aislados de la bacteria estafilococo y segmentos de los mismos, así como variantes que estimulan una respuesta inmunitaria contra proteínas vWh de la bacteria estafilococo.

Una respuesta inmunitaria se refiere a una respuesta humoral, una respuesta celular o una respuesta tanto humoral como celular en un organismo. Una respuesta inmunitaria puede medirse mediante ensayos que incluyen ensayos que miden la presencia o la cantidad de anticuerpos que reconocen específicamente una proteína o proteína de superficie celular, ensayos que miden la activación o proliferación de linfocitos T y/o ensayos que miden la modulación en términos de actividad o expresión de una o más citocinas.

Una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que es o es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína EsxA.

Una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que es o es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína EsxB.

Una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que es o es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína SdrD.

Una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que es o es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína SdrE.

Una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que es o es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína IsdA.

Una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que es o es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína IsdB.

Las composiciones pueden incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que es o es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína EsaB.

Una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que es o es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína ClfB.

Una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que es o es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína IsdC.

Una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que es o es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína SasF.

Una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que es o es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína SdrC.

Una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que es o es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína ClfA.

Una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que es o es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína Eap.

Una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que es o es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína Ebh.

Una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que es o es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína Emp.

Una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que es o es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína EsaC. La secuencia de polipéptidos de EsaC se puede encontrar en las bases de datos de proteínas e incluye los números de referencia ZP_02760162 (GI:

168727885), NP_645081.1 (GI:21281993) y NP_370813.1 (GI:15923279).

Una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que es o es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína Coa.

Una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que es o es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína Hla.

Una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que es o es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína vWa.

Una composición puede incluir un polipéptido, un péptido o una proteína que es o es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una proteína vWbp.

Un polipéptido o segmento/fragmento puede tener una secuencia que sea al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % o más, idéntica a la secuencia de aminoácidos del polipéptido de referencia.

El término "similitud" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia que tiene un determinado porcentaje de aminoácidos que son idénticos al polipéptido de referencia o constituyen sustituciones conservadoras con los polipéptidos de referencia.

Los polipéptidos descritos en el presente documento pueden incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más aminoácidos variantes dentro de al menos, o como máximo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 300, 400, 500, 550, 1000 o más aminoácidos contiguos, o cualquier intervalo derivable de los mismos, de la secuencia de la TABLA DE SECUENCIAS N.° 1 (SEQ ID NO: 33-37) o de la TABLA DE SECUENCIAS N.° 2 (SEQ ID NO: 38-41).

Un segmento polipeptídico como se describe en el presente documento puede incluir 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 300, 400, 500, 550, 1000 o más aminoácidos contiguos, o cualquier intervalo derivable de los mismos, de la secuencia de la TABLA DE SECUENCIAS N.° 1 (SEQ ID NO: 33-37) o de la TABLA DE SECUENCIAS N.° 2 (SEQ ID NO: 38-41).

En una divulgación, una composición puede incluir un polinucleótido que es o es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína Coa. En determinada divulgación, la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína Coa de la cepa USA300 tendrá toda o parte de la secuencia de ácido nucleico proporcionada en el presente documento. En determinada divulgación, la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína Coa de la cepa N315 tendrá toda o parte de la secuencia de ácido nucleico proporcionada en el presente documento. En determinada divulgación, la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína Coa de la cepa MW2 tendrá toda o parte de la secuencia de ácido nucleico proporcionada en el presente documento. En determinada divulgación, la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína Coa de la cepa MRSA252 tendrá toda o parte de la secuencia de ácido nucleico proporcionada en el presente documento. En determinada divulgación, la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína Coa de la cepa WIS tendrá toda o parte de la secuencia de ácido nucleico proporcionada en el presente documento. En determinada divulgación, la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína Coa de la cepa MU50 tendrá toda o parte de la secuencia de ácido nucleico proporcionada en el presente documento. En determinada divulgación, la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína Coa de la cepa 85/2082 tendrá toda o parte de la secuencia de ácido nucleico proporcionada en el presente documento. En determinada divulgación, la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína Coa de la cepa Newman tendrá toda o parte de la secuencia de ácido nucleico proporcionada en el presente documento.

En una divulgación, una composición puede incluir un polinucleótido que es o es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión vWbp. En determinada divulgación, la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína vWpb de la cepa USA300 tendrá toda o parte de la secuencia de ácido nucleico proporcionada en el presente documento. En determinada divulgación, la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína vWbp de la cepa N315 tendrá toda o parte de la secuencia de ácido nucleico proporcionada en el presente documento. En determinada divulgación, la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína vWbp de la cepa Newman tendrá toda o parte de la secuencia de ácido nucleico proporcionada en el presente documento. En determinada divulgación, la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína vWbp de la cepa MRSA252 tendrá toda o parte de la secuencia de ácido nucleico proporcionada en el presente documento. En determinada divulgación, la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína vWbp de la cepa MW2 tendrá toda o parte de la secuencia de ácido nucleico proporcionada en el presente documento.

Una composición puede incluir un polinucleótido que es o es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio 1-2 de Coa. En determinada divulgación, la secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio 1-2 de Coa de la cepa N315 tendrá toda o parte de la secuencia de ácido nucleico proporcionada en el presente documento. En determinada divulgación, la secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio 1-2 de Coa de la cepa MW2 tendrá toda o parte de la secuencia de ácido nucleico proporcionada en el presente documento. En determinada divulgación, la secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio 1-2 de Coa de la cepa MRSA252 tendrá toda o parte de la secuencia de ácido nucleico proporcionada en el presente documento. En determinada divulgación, la secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio 1-2 de Coa de la cepa WIS tendrá toda o parte de la secuencia de ácido nucleico proporcionada en el presente documento.

En una divulgación, una composición puede comprender un polinucleótido que es o es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una secuencia de ácido nucleico que codifica cinco dominios 1-2 de Coa diferentes de las cepas WIS, MRSA252, N315, MW2 y USA300, respectivamente. En una divulgación, la secuencia de ácido nucleico que codifica cinco dominios 1-2 de Coa diferentes tendrá toda o parte de la secuencia de ácido nucleico proporcionada en el presente documento.

En una divulgación, una composición puede incluir un polinucleótido que es o es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico o similar a una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio 1-2 de vWbp. En una divulgación, la secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio 1-2 de vWbp de la cepa N315 tendrá toda o parte de la secuencia de ácido nucleico proporcionada en el presente documento. En una divulgación, la secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio 1-2 de vWbp de la cepa MW2 tendrá toda o parte de la secuencia de ácido nucleico proporcionada en el presente documento. En una divulgación, la secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio 1-2 de vWbp de la cepa MRSA252 tendrá toda o parte de la secuencia de ácido nucleico proporcionada en el presente documento.

Las composiciones pueden formularse en una composición farmacéuticamente aceptable. En determinados aspectos de la invención, la bacteria estafilococo es una bacteria S. aureus.

En aspectos adicionales, una composición puede administrarse más de una vez al sujeto y puede administrarse 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o más veces. La administración de las composiciones incluye oral, parenteral, subcutánea, intramuscular, intravenosa o diversas combinaciones de las mismas, incluyendo inhalación o aspiración. En otra divulgación adicional, una composición comprende una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido descrito en el presente documento o segmentos/fragmentos del mismo. Normalmente, una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido descrito en el presente documento contiene un promotor heterólogo. En determinada divulgación, una molécula de ácido nucleico recombinante de la invención es un vector, en otra divulgación más, el vector es un plásmido. En determinada divulgación, el vector es un vector vírico. En determinada divulgación, una composición incluye una bacteria recombinante, no estafilocócica que contiene o expresa un polipéptido descrito en el presente documento. La bacteria recombinante no estafilocócica puede ser Salmonella u otra bacteria grampositiva. Una composición se administra normalmente a mamíferos, tales como sujetos humanos, pero se contempla la administración a otros animales que son capaces de inducir una respuesta inmunitaria. En una divulgación adicional, la bacteria estafilococo que contiene o expresa el polipéptido es Staphylococcus aureus. En una divulgación adicional, la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria protectora.

En una divulgación adicional, una composición comprende una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica todo o parte de una o más de una proteína Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, SpA, vWbp o vWh o péptido o variante de las mismas. Los antígenos estafilocócicos adicionales que pueden usarse en combinación con los polipéptidos descritos en el presente documento incluyen la proteína de unión a vitronectina de 52 kDa (documento WO 01/60852), Aaa, Aap, Ant, autolisina glucosaminidasa, autolisina amidasa, Cna, proteína de unión a colágeno (documento US6288214), EFB (FIB), proteína de unión a elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína de unión a fibrinógeno (documento US6008341), proteína de unión a fibronectina (documento US5840846), FnbA, FnbB, GehD (documento US 2002/0169288), HarA, HBP, transportador ABC inmunodominante, IsaA/PisA, receptor de laminina, lipasa GehD, MAP, transportador de Mg2+, análogo de MHC II (documento US5648240), MRPII, Npasa, proteína activadora de ARN III (RAP), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK, SBI, SdrF (documento WO 00/12689), SdrG / Fig (documento WO 00/12689), SdrH (documento WO 00/12689), exotoxinas SEA (documento WO 00/02523), exotoxinas SEB (documento WO 00/02523), transportador ABC de SitC y Ni, proteína de unión a SitC/MntC/saliva (documento US5.801.234), SsaA, SSP-1, SSP-2 y/o proteína de unión a vitronectina. En una divulgación en particular, una bacteria es una bacteria recombinante no estafilocócica, tal como una Salmonella u otras bacterias grampositivas.

Las composiciones analizadas en el presente documento se administran normalmente a sujetos humanos, pero se contempla la administración a otros animales que son capaces de inducir una respuesta inmunitaria a una bacteria estafilococo, en particular ganado bovino, caballos, cabras, ovejas y otros animales domésticos, es decir, mamíferos. En determinados aspectos, la bacteria estafilococo es un Staphylococcus aureus. En realizaciones adicionales, la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria protectora. En otros aspectos más, las composiciones de la invención pueden usarse para prevenir, aliviar, reducir o tratar la infección de tejidos o glándulas, p. ej., glándulas mamarias, en particular mastitis y otras infecciones. Otros métodos divulgados incluyen la reducción profiláctica de la carga bacteriana en un sujeto que no presenta signos de infección, en particular los sujetos sospechosos o en riesgo de ser colonizados por una bacteria diana, p. ej., pacientes que están o van a estar en riesgo o susceptibles a infección durante una estancia en el hospital, tratamiento y/o recuperación.

Cualquier realización analizada con respecto a un aspecto de la invención se aplica también a otros aspectos de la invención. En particular, cualquier realización analizada en el contexto de una composición que comprende al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes puede implementarse con respecto a otros antígenos, tales como Eap, Ebh, Emp, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp, vWh, proteína de unión a vitronectina de 52 kDa (documento WO 01/60852), Aaa, Aap, Ant, autolisina glucosaminidasa, autolisina amidasa, Cna, proteína de unión a colágeno (documento US6288214), EFB (FIB), proteína de unión a elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína de unión a fibrinógeno (documento US6008341), proteína de unión a fibronectina (documento US5840846), FnbA, FnbB, GehD (documento US 2002/0169288), HarA, HBP, transportador ABC inmunodominante, IsaA/PisA, receptor de laminina, lipasa GehD, MAP, transportador de Mg2+, análogo de MHC II (documento US5648240), MRPII, Npasa, proteína activadora de ARN III (RAP), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK.SBI, SdrF (documento w O 00/12689), SdrG / Fig (documento WO 00/12689), SdrH (documento WO 00/12689), exotoxinas SEA (documento WO 00/02523), exotoxinas SEB (documento WO 00/02523), transportador ABC de SitC y Ni, proteína de unión a SitC/MntC/saliva (documento US5.801.234), SsaA, SSP-1, SSP-2 y/o proteína de unión a vitronectina (o ácidos nucleicos), y viceversa. También se entiende que uno o más cualesquiera de Eap, Ebh, Emp, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp, vWh, proteína de unión a vitronectina de 52 kDa (documento WO 01/60852), Aaa, Aap, Ant, autolisina glucosaminidasa, autolisina amidasa, Cna, proteína de unión a colágeno (documento US6288214), EFB (FIB), proteína de unión a elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína de unión a fibrinógeno (documento US6008341), proteína de unión a fibronectina (documento US5840846), FnbA, FnbB, GehD (documento US 2002/0169288), HarA, HBP, transportador ABC inmunodominante, IsaA/PisA, receptor de laminina, lipasa GehD, MAP, transportador de Mg2+, análogo de MHC II (documento US5648240), MRPII, Npasa, proteína activadora de ARN III (RAP), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK.SBI, SdrF (documento ^w O 00/12689), SdrG / Fig (documento WO 00/12689), SdrH (documento WO 00/12689), exotoxinas SEA (documento WO 00/02523), exotoxinas SEB (documento WO 00/02523), transportador ABC de SitC y Ni, proteína de unión a SitC/MntC/saliva (documento US5.801.234), SsaA, SSP-1, SSP-2 y/o proteína de unión a vitronectina puede excluirse específicamente de una composición reivindicada.

Las realizaciones incluyen composiciones que contienen o no contienen una bacteria. Una composición puede incluir o no una bacteria estafilocócica atenuada o viable o intacta. En determinados aspectos, la composición comprende una bacteria que no es una bacteria estafilocócica o que no contiene bacterias estafilocócicas. En determinada divulgación, una composición bacteriana comprende un aislado o expresado recombinantemente de al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes descritos en el presente documento o un nucleótido que los codifica. La composición puede ser o incluir una bacteria estafilococo modificada por ingeniería genética recombinante que se ha alterado de una manera que comprende alterar específicamente la bacteria con respecto a un factor de virulencia secretado o proteína de superficie celular. Por ejemplo, la bacteria puede modificarse de manera recombinante para expresar más factor de virulencia o proteína de superficie celular de lo que expresaría si no se modificara.

El término "aislado" puede referirse a un ácido nucleico o polipéptido que está sustancialmente exento de material celular, material bacteriano, material vírico o medio de cultivo (cuando se produce mediante técnicas de ADN recombinante) de su fuente de origen, o precursores químicos u otros productos químicos (cuando se sintetizan químicamente). Por otro lado, un compuesto aislado se refiere a uno que puede administrarse a un sujeto como un compuesto aislado; en otras palabras, el compuesto no puede considerarse simplemente "aislado" si está adherido a una columna o incluido en un gel de agarosa. Por otro lado, un "fragmento de ácido nucleico aislado" o "péptido aislado" es un fragmento de ácido nucleico o proteína que no se produce de manera natural como un fragmento y/o no está normalmente en el estado funcional.

Los restos, tales como polipéptidos, péptidos, antígenos o inmunógenos, pueden conjugarse o unirse covalentemente o no covalentemente con otros restos tales como adyuvantes, proteínas, péptidos, soportes, restos de fluorescencia o marcadores. El término "conjugado" o "inmunoconjugado" se usa ampliamente para definir la asociación operativa de un resto con otro agente y no se pretende que haga referencia únicamente a ningún tipo de asociación operativa y en particular no se limita a la "conjugación" química. Se contemplan en particular proteínas de fusión recombinantes. Las composiciones de la invención pueden comprender además un adyuvante o un excipiente farmacéuticamente aceptable. Un adyuvante puede acoplarse de manera covalente o no covalente a un polipéptido o péptido de la invención. En determinados aspectos, el adyuvante está conjugado químicamente con una proteína, un polipéptido o un péptido.

El término "proporcionar" se usa según su significado ordinario para indicar "suministrar o facilitar para su uso". En algunas realizaciones, la proteína se proporciona directamente administrando la proteína, mientras que, en otras realizaciones, la proteína se proporciona eficazmente administrando un ácido nucleico que codifica la proteína. La divulgación contempla composiciones que comprenden diversas combinaciones de ácido nucleico, antígenos, péptidos y/o epítopos.

El sujeto tendrá (p. ej., se le diagnostica una infección estafilocócica), se sospechará que tiene o estará en riesgo de desarrollar una infección estafilocócica. Las composiciones de la presente invención incluyen composiciones inmunógenas en donde el o los antígenos o epítopos están contenidos en una cantidad eficaz para lograr el fin pretendido. De manera más específica, una cantidad eficaz significa una cantidad de principios activos necesarios para estimular o inducir una respuesta inmunitaria o proporcionar resistencia a, alivio de o mitigación de la infección. En aspectos más específicos, una cantidad eficaz previene, alivia o mejora los síntomas de una enfermedad o afección o prolonga la supervivencia del sujeto que se trata. La determinación de la cantidad eficaz está dentro de la capacidad de los expertos en la materia, especialmente a la luz de la divulgación detallada proporcionada en el presente documento. Para cualquier preparación de los usos de la invención, puede estimarse una cantidad o dosis eficaz inicialmente a partir de estudios in vitro, cultivo celular y/o ensayos con modelos animales. Por ejemplo, se puede formular una dosis en modelos animales para lograr una respuesta inmunitaria o concentración o título de anticuerpos en circulación deseados. Dicha información se puede utilizar para determinar con más precisión las dosis útiles en seres humanos.

El uso del término "o" en las reivindicaciones se usa para dar a entender "y/o" a menos que se indique explícitamente que se refiera solo a alternativas o las alternativas sean mutuamente excluyentes, aunque la divulgación respalda una definición que se refiere solo a alternativas y a "y/o". También se contempla que todo lo que se enumere usando el término "o" también puede excluirse de manera específica.

A lo largo de la presente solicitud, el término "aproximadamente" se usa para indicar que un valor incluye la desviación típica de error para el dispositivo o método que se emplea para determinar el valor.

Siguiendo la ley de patentes habitual, las palabras "un" y "uno/a", cuando se usan junto con la expresión "que comprende" en las reivindicaciones o la memoria descriptiva, designa uno o más, a no ser que se indique específicamente.

Descripción de los dibujos

De modo que pueda entenderse en detalle el asunto en el que se obtienen las características, ventajas y objetivos mencionados anteriormente de la invención, así como otros que se aclararán, se ilustran en los dibujos adjuntos descripciones más particulares y determinadas realizaciones de la invención resumidas de manera breve anteriormente. Estos dibujos forman parte de la memoria descriptiva. Debe observarse, sin embargo, que los dibujos adjuntos ilustran determinadas realizaciones de la invención y, por lo tanto, no deben considerarse limitantes en su alcance.

FIG. 1A-1D. Respuestas inmunitarias a la coagulasa. (A) Dibujo para ilustrar la estructura primaria de la coagulasa de S. aureus Newman (CoaNM), que se purificó a través de un marcador de His6 N terminal de E. coli. La CoaNM abarca los dominios D1 y D2 implicados en la unión a protrombina, el dominio conector (L) y el dominio de repetición (R), que se compone de repeticiones en tándem de una secuencia peptídica de 27 restos que se une al fibrinógeno. Además de CoaNM, se purificaron los dominios D1ooa > D2ooa, D12ooa, Looa y Rooa. (B) Los conejos se inmunizaron con CoaNM purificada y los sueros inmunitarios se examinaron mediante ELISA para IgG en suero reactivo con CoaNM, D1ooa, D2ooa, D12ooa, Looa o CTooa. (C) La asociación de D12ooa con protrombina humana o la unión de CTCoa al fibrinógeno se midieron mediante ELISA y se alteraron con concentraciones crecientes de IgG de conejo dirigida contra CoaNM o el antígeno de la vacuna contra la peste V10 como control. (D) Se añadieron IgG de conejo purificada por afinidad específica para CoaNM (a-Co3NM), D12Coa (a-D12Coa) o CTCoa (a-CTCoa) a sangre de ratón tratada con citrato y se inocularon con S. aureus Newman para supervisar la inhibición de la coagulación estafilocócica.

FIG. 2A-2C. Dominios de coagulasa como antígenos de vacuna. (A) Se utilizaron CoaNM, D12Coa y CTCoa purificados recombinantes para inmunizar ratones BALB/c (n = 5) con un régimen de sensibilización-refuerzo y se analizaron los sueros inmunitarios mediante ELISA para determinar la reactividad de la IgG en suero de ratón frente a CoaNM, D12Coa o CTCoa purificada. (B) Cohortes de ratones BALB/c (n = 10) con un régimen de sensibilización-refuerzo de CoaNM, Dl2Coa y CTCoa purificados y expuestos mediante inyección intravenosa con S. aureus Newman (1 x 108 UFC). La supervivencia de los animales se supervisó durante 10 días. (C) Se inyectó IgG de conejo purificada por afinidad específica para CoaNM (a-CoaNM), D12Coa (a-D12Coa), CTCoa (a-CTCoa) o V10 (a-V10) a una concentración de 5 mg/kg de peso corporal en la cavidad peritoneal de ratones BALB/c sin exposición previa. Los ratones inmunizados de manera pasiva se expusieron mediante inyección intravenosa con S. aureus Newman (1 x 108 UFC) y la supervivencia de los animales se supervisó durante 10 días.

FIG. 3A-3D. Respuestas inmunitarias a la proteína de unión al factor de von Willebrand (vWbp). (A) Dibujo para ilustrar la estructura primaria de vWbp de S. aureus Newman (vWbpNM), que se purificó a través de un marcador de His6 N terminal de E. coli. vWbpNM abarca los dominios D1 y d2 implicados en la unión de la protrombina, el dominio conector (L) y el dominio de unión a fibrinógeno (Fgb). Además de vWbpNM, se purificaron los dominios D1vWbp, D2vWbp, D12vWbp, LvWbp, FgbvWbp y CTvWbp. (B) Los conejos se inmunizaron con vWbpNM purificada y los sueros inmunitarios se examinaron mediante ELISA para IgG en suero reactivo con vWbpNM, la D1vWbp, D2vWbp, D12vWbp, LvWbp, FgbvWbp y la CTvWbp. (C) La asociación de D12vWbp con protrombina humana o la unión de CTvWbp al fibrinógeno se midieron mediante ELISA y se alteraron con concentraciones crecientes de IgG de conejo dirigida contra vWbpNM o el antígeno de la vacuna contra la peste V10 como control. (D) Se añadieron IgG de conejo purificada por afinidad específica para vWbpNM (a-vWbpNM), D12vWbp (a-D12vWbp) o CTvWbp (a-CTvWbp) a sangre de ratón tratada con citrato y se inocularon con S. aureus Newman para supervisar la inhibición de la coagulación estafilocócica.

FIG. 4A-4C. Dominios de proteína de unión al factor de von Willebrand (vWbp) como antígenos de vacuna. (A) Se utilizaron vWbpNM, D12vWbp y CTvWbp purificados recombinantes para inmunizar ratones BALB/c (n = 5) con un régimen de sensibilización-refuerzo y se analizaron los sueros inmunitarios mediante ELISA para determinar la reactividad de la IgG en suero de ratón frente a vWbpNM, D12vWbp y CTvWbp purificados. (B) Cohortes de ratones BALB/c (n = 10) con un régimen de sensibilización-refuerzo de vWbpNM, D12vWbp y CTvWbp purificados y se expusieron mediante inyección intravenosa con S. aureus Newman (1 x 108 UFC). La supervivencia de los animales se supervisó durante 10 días. (C) Se inyectó IgG de conejo purificada por afinidad específica para vWbppNM (a-vWbpNM), D12vWbp (a-D12vWbp), CTvWbp (a-CTvWbp) o V10 (a-V10) a una concentración de 5 mg/kg de peso corporal en la cavidad peritoneal de ratones BALB/c sin exposición previa. Los ratones inmunizados de manera pasiva se expusieron mediante inyección intravenosa con S. aureus Newman (1 x 108 UFC) y la supervivencia de los animales se supervisó durante 10 días.

FIG. 5A-5F. Inmunización de ratones con vacuna de CoaNM/vWbpNM y el espectro de protección de enfermedades contra diferentes aislados de S. aureus. (A) Se utilizaron vacuna de CoaNM recombinante/vWbpNM o simulada (PBS) para inmunizar ratones BALB/c (n = 5) con un régimen de sensibilización-refuerzo. Los sueros inmunitarios se analizaron mediante ELISA para determinar la reactividad de IgG en suero de ratón frente a CoaNM y vWbpNM purificadas. Se inmunizaron cohortes de ratones BALB/c (n = 10) con un régimen de sensibilización-refuerzo de vacuna de CoaNM purificada/vWbpNM o simulada y se expusieron mediante inyección intravenosa con S. aureus USA300 (B), N315 (C), MW2 (D), Cowan I (E) o WIS (^f ). La supervivencia de los animales se supervisó durante 10 días.

FIG. 6A-6C Inmunogenicidad de la vacuna de Coa4/vWbp2. (A) Dibujo para ilustrar el diseño de los componentes de la vacuna de Coa4 y vWbp2. Coa4 está compuesta por un marcador de His6 N-terminal, los dominios D12 de Coa de las cepas de S. aureus MRSA252, MW2, N315 y la secuencia madura de longitud completa de Coa de la cepa USA300 además de un marcador de STREP C-terminal. vWbp2 está compuesta por un marcador de His6 N-terminal, los dominios D12 de vWBp de S. aureus N315 y la secuencia madura de longitud completa de vWbp de la cepa USA300 además de un marcador STREP C-terminal. (B) Coa4 y vWbp2 se purificaron de E. coli mediante cromatografía de afinidad con Ni-NTA y estreptavidina y se analizaron mediante SDS-PAGE teñida con Coomassie.

FIG. 7A-7F Inmunización de ratones con la vacuna de Coa4/vWbp2 y el espectro de protección de enfermedades contra diferentes aislados de S. aureus. (A) Se utilizaron vacuna de Coa4/vWbp2 o simulada (PBS) para inmunizar ratones BALB/c (n = 5) con un régimen de sensibilización-refuerzo. Los sueros inmunitarios se analizaron mediante ELISA para determinar la reactividad de IgG en suero de ratón frente a Coa4 y vWbp2 purificadas. (B) Se inmunizaron cohortes de ratones BALB/c (n = 10) con un régimen de sensibilización-refuerzo de vacuna de Coa4/vWbp2 o simulada y se expusieron mediante inyección intravenosa con S. aureus USA300 (B), N315 (C), MW2 (D), Cowan I (E) o WIS (F). La supervivencia de los animales se supervisó durante 10 días. FIG. 8A-B: Alineaciones de secuencias de Coa. (A) Alineación de secuencias de ácido nucleico de Coa de cinco cepas de S. aureus. (B) Alineación de secuencias de aminoácidos de los dominios 1-2 de Coa seleccionados de cepas de S. aureus.

FIG. 9A-C: alineaciones de secuencias de vWbp. (A) Alineación de secuencias de ácido nucleico de vWbp de cinco cepas de S. aureus. (B) Alineación de secuencias de aminoácidos de vWbp (la secuencia del dominio 1 está sombreada) de cepas seleccionadas de S. aureus. (C) Alineación de secuencias de aminoácidos de vWbp de cepas seleccionadas de S. aureus sin los dos alelos truncados.

Descripción detallada

Staphylococcus aureus, un microbio grampositivo que coloniza la piel humana y las narinas, provoca enfermedades invasivas tales como infecciones de piel y tejidos blandos, bacteriemia, septicemia y endocarditis (Lowy 1998). La aparición de cepas resistentes a antibióticos, designadas S. aureus resistente a la meticilina adquirido en la comunidad (SARM-AC) o adquirido en el hospital (SARM-AH), presenta una exposición terapéutica formidable (Klevens 2008). Aunque se han iniciado varias iniciativas de desarrollo de vacunas, aún no está disponible una vacuna de S. aureus autorizada por la FDA (DeDent 2012).

Un sello distintivo de los aislados de S. aureus es su capacidad de formar coágulos cuando se inoculan en plasma o sangre humano con citrato (Much 1908). Este fenotipo se ha ligado a la secreción de coagulasa (Coa) (Cheng 2010), que se une a la protrombina y altera el sitio activo de la enzima mediante la inserción de sus restos N-terminales en el exorreceptor 1, convirtiendo de este modo el fibrinógeno en fibrina (Friedrich 2003). La forma madura de Coa se compone de los dominios D1 y D2 N-terminales, que proporcionan asociación con y activación de protrombina (Panizzi 2004) (Fig. 1A). Un dominio conector (L) conecta D12 y la región R con repeticiones en tándem de un péptido de 27 restos que se une al fibrinógeno (Panizzi 2006) (Fig. 1A). El complejo de Coa con protrombina (estafilocoagulasa) convierte el fibrinógeno soluble en fibrina insoluble, formando la red de malla de un coágulo (Friedrich 2003; Kroh 2009).

Cuando se inyecta en animales, la Coa purificada coagula la sangre in vivo y se cree que esto promueve el escape estafilocócico de la muerte fagocítica (Hale 1945; Smith 1956). Más recientemente, la tipificación de la coagulasa, es decir, la neutralización de coagulación de S. aureus de citrato-plasma con antisuero específico se usó para distinguir diez tipos de Coa serológicos diferentes (Kanemitsu 2001). Los tipos de coagulasa (Coa) también se analizaron mediante secuenciación de ADN, que reveló variación significativa dentro de secuencias de coa para el dominio D1-2 y poca variación para las regiones conectoras y repetidas, respectivamente (Watanabe 2005). Para abordar la cuestión de si la variación de secuencia dentro de genes coa de S. aureus es el resultado de una selección negativa, como podría producirse cuando los individuos infectados desarrollan respuestas de anticuerpos contra Coa secretada, Watanabe y colaboradores secuenciaron los genes coa de 126 aislados de S. aureus, que se analizaron simultáneamente para determinar el serotipo de coagulasa y el tipo de agolpamiento clonal (CC). Esto último se logra a través de la tipificación de secuencia de múltiples locus (MLST), que examina secuencias de siete genes diferentes (arc, aro, glp, gmk, pta, tpi, e yqf) (Enright 2000). Con la excepción de las cepas CC1 y CC8, la mayoría de los aislados que se han definido por MLST eran del mismo tipo de secuencia de coa (Watanabe 2009). Probablemente se genera variación de secuencias de coa a través de transferencia horizontal de genes (transducción de fagos o transformación de ADN), ya que se encuentran genes coa del mismo tipo de secuencia dispersos a lo largo del árbol de MLST (Watanabe 2009). Junto con la observación de que la inmunoglobulina humana agrupada neutraliza la mayoría de los tipos de coagulasa, pero no todos (Streitfeld 1959), estos resultados sugieren que la diversificación del gen coa puede permitir a S. aureus eludir las respuestas inmunitarias humorales de los hospedadores con exposición previa al patógeno (Watanabe 2009). Por tanto, Coa puede representar un antígeno protector de S. aureus y debería analizarse cuidadosamente para determinar su posible uso como antígeno de vacuna.

Casi un siglo después de la primera descripción de la coagulasa estafilocócica, Bjerketorp y colaboradores descubrieron vWbp (Bjerketorp 2002). vWbp es una proteína secretada que, además de unirse al factor de von Willebrand, también se asocia con la protrombina para convertir el fibrinógeno en fibrina (Friedrich 2003; Kroh 2009; Bjerketorp 2004). vWbp desempeña homología de secuencia con los dominios D12 de Coa (Watanabe 2005; Bjerketorp 2004), sin embargo, su dominio C-terminal carece de los dominios L y R de Coa, que se reemplazan por sitios únicos de unión de vWF y fibrinógeno (Cheng 2010; Bjerketorp 2002). La secuenciación del genoma descubrió dos alelos de vwb distintos con variación en los dominios D1-2 predichos (Watanabe 2005). La inmunización de ratones con Coa o vWbp recombinante purificada solo no fue suficiente para inducir respuestas inmunitarias protectoras contra la exposición con la misma cepa de S. aureus de tipo coagulasa, sin embargo, anticuerpos contra ambos, Coa y vWbp, protegieron animales contra formación de abscesos y bacteriemia letal por S. aureus (Cheng 2010). De manera similar, mutantes de S. aureus Newman que carecen de coa y vwb, pero no variantes con supresiones de un solo gen, presentaron defectos significativos en modelos de ratón de formación de abscesos o bacteriemia letal (Cheng 2010). La secreción de Coa y vWbp permite que S. aureus se aglutine en presencia de plasma, dando lugar a lesiones tromboembólicas, así como endocarditis, y promoviendo el resultado letal de bacteriemia estafilocócica (McAdow2011; Panizzi 2011). El bloqueo de las coagulasas con inhibidores directos univalentes de la trombina retarda el tiempo transcurrido hasta la muerte asociado con exposición a S. aureus letal, destacando adicionalmente la importancia de las coagulasas para la enfermedad estafilocócica (McAdow 2011).

Los primeros trabajos sobre la coagulasa demostraron que, después de la infección por S. aureus, los seres humanos así como los animales generan anticuerpos específicos de Coa (Tager 1948; Lominski, 1946). Cuando se transfieren a conejos sin exposición previa, estos anticuerpos pueden neutralizar la coagulación por S. aureus y, al menos en algunos casos, puede conferir inmunidad a la exposición con S. aureus (Lominski, 1949; Lominski, 1962). La inmunización activa de conejos con preparaciones que contienen coagulasa podría prolongar la vida de los conejos que se habían expuesto mediante inoculación intravenosa con dosis letales de S. aureus (Boake, 1956). La comparación de diferentes aislados de S. aureus (de tipo fago) para la inhibición de la coagulación del plasma por el antisuero de coagulasa reveló neutralización tanto específica como inespecífica del tipo de fago (Lominski 1946; Lominski 1962; Rammelkamp 1950; Duthie 1952; Harrison 1964). Estos datos apoyaron un concepto general para la existencia de tipos serológicos de Coa, que no están estrictamente vinculados a tipos de fago de S. aureus (Rammelkamp 1956).

Toxoide de coagulasa purificado, que abarca Coa purificada de las cepas de S. aureus M1 y Newman adsorbidas en fosfato de aluminio, se examinó para determinar la inmunización terapéutica de 71 pacientes con furunculosis crónica (Harrison 1963). En comparación con el placebo, la inmunización contra la coagulasa generó un aumento en los títulos de anticuerpos específicos de coagulasa, pero no logró mejorar el resultado clínico de la furunculosis crónica (Harrison 1963). Cabe observar que no se examinó el desarrollo de anticuerpos neutralizantes o la posibilidad de inmunidad específica de tipo (Harrison 1963). Por tanto, aunque los primeros trabajos revelaron la eficacia preclínica de las vacunas de subunidades de coagulasa, los estudios clínicos no consiguieron demostrar la eficacia en un ensayo en seres humanos. Ya que la mayoría de estos estudios se realizaron entre 1945 y 1965, se deben considerar las herramientas limitadas para el aislamiento de coagulasas muy purificadas, así como la incapacidad para tipificar cepas de S. aureus o preparaciones de vacunas de coagulasa en función de su secuencia de nucleótidos. Además, se han realizado estudios anteriores sin conocimiento de vWbp o de los mecanismos moleculares de la activación de protrombina mediada por Coa y vWbp y la escisión de fibrinógeno (Friedrich 2003; Kroh 2009).

Los inventores han observado recientemente que ambas coagulasas secretadas por S. aureus Newman, CoaNM y vWbpNM, son suficientes para que la capacidad de esta cepa provoque formación de abscesos y bacteriemia letal rápida en ratones (Cheng 2010). En experimentos de inmunización activa y pasiva, fueron necesarios anticuerpos tanto contra CoaNM como contra vWbpNM para conferir protección contra la formación de abscesos o bacteriemia letal (Cheng 2010). En función de estas observaciones, los inventores plantean la hipótesis de que las coagulasas pueden actuar como antígenos protectores que inducen respuestas de anticuerpos contra Coa y vWbp, que protegen a los animales y a los seres humanos contra enfermedad por S. aureus (Cheng 2010). De acuerdo con este modelo, la expresión de coa y vwb es un rasgo universal de cepas de S. aureus (Cheng 2011). Cabe observar que el gen coa de aislados de S. aureus es variable (McCarthy 2010), con mayor variación en la secuencia de aminoácidos incluso que las repeticiones en tándem del gen de la proteína A (spa); la variación en spa se utiliza para experimentos de tipificación epidemiológica (Watanabe 2009; Koreen 2004). Aún no se han aislado mutantes de S. aureus que no pueden expresar coa de seres humanos con enfermedad estafilocócica manifiesta. El gen vwb es menos variable (McCarthy 2010). Analizando secuencias del genoma de S. aureus disponibles en la actualidad para determinar la homología de vwb, los inventores han identificado tres alelos. Dos de los alelos de vwb variaron en su secuencia codificante para el dominio D12 (S. aureus N315 y USA300 son representativos de estos alelos), mientras que el tercer alelo albergaba una supresión de nucleótido en el codón 102, que crea un desplazamiento de marco que da lugar a una mutación sin sentido en el codón 107 (S. aureus MRSA252).

Gracias a estas observaciones, los inventores examinaron las respuestas inmunitarias a las coagulasas y demostraron que los anticuerpos contra el dominio D1-2 neutralizan la coagulación estafilocócica de una manera específica de tipo. Al inyectar en ratones una vacuna de Coa4/vWbp2 que alberga determinantes antigénicos de los principales aislados norteamericanos [CC1, CC5 (USA100), CC8 (USA300), CC30, CC45] (Klevens 2007; Patel 2011), los ratones podrían estar protegidos contra la exposición con varias cepas de S. aureus diferentes.

La inmunización con Coa y vWbp de conejos o ratones generó predominantemente anticuerpos contra el dominio D1-2 de CoaNM o vWbpNM. Los anticuerpos específicos de D1-2 neutralizaron las actividades coagulasa de S. aureus Newman y, cuando se transfirieron a animales sin exposición previa, confirieron protección contra bacteriemia letal. Se produjo neutralización y protección contra enfermedades de anticuerpos específicos de CoaNM y vWbpNM de una manera específica de tipo, de manera similar a la inmunidad específica de tipo indicada para proteínas M de Streptococcus pyogenes (Lancefield 1928; Lancefield 1962) o los antígenos de pilus(T) de S. pyogenes y Streptococcus agalactiae (Mora 2005; Niccitelli 2011). A la luz del enfoque de vacunación estructural para antígenos de pilus (Nuccitelli 2011; Schneewind 2011), los inventores diseñaron dos polipéptidos que abarcan los dominios D1-2 de los principales tipos de Coa y vWbp de los aislados de S. aureus norteamericanos: cepas CC1, CC5, CC8, CC30 y CC45 (Tenover 2012). Los productos purificados, Coa4 y vWbp2, se usaron como antígenos e indujeron respuestas de anticuerpos contra los dominios D12 de cada tipo de Coa y vWbp examinado. La inmunización de ratones con Coa4/vWbp2 proporcionó protección contra la exposición de bacteriemia letal con cepas de S. aureus CC1, CC5, CC8, CC30 y CC45 representativas. Por tanto, los criterios de diseño de la vacuna de Coa4/vWbp2, para generar respuestas inmunitarias universales contra Coa y vWbp contra S. aureus clínicamente relevante, se han cumplido. Además de la neutralización específica de tipo de Coa y vWbp a través de anticuerpos dirigidos contra el dominio D12, los anticuerpos contra los dominios R (Coa) y CT (vWbp) también proporcionaron protección contra enfermedad por S. aureus.

I. ANTÍGENOS ESTAFILOCÓCICOS

A. Coagulasas estafilocócicas

Las coagulasas son enzimas producidas por bacterias de Staphylococcus que convierten el fibrinógeno en fibrina. Coa y vWh activan la protrombina sin proteólisis (Friedrich et al., 2003). El complejo de protrombina de coagulasa reconoce el fibrinógeno como un sustrato específico, convirtiéndolo directamente en fibrina. La estructura cristalina del complejo activo reveló la unión de los dominios D1 y D2 a la protrombina y la inserción de su extremo N de Ile1-Val2 en el bolsillo de Ile16, induciendo un sitio activo funcional en el zimógeno a través del cambio conformacional (Friedrich et al., 2003). Exorreceptor I de a-trombina, el sitio de reconocimiento de fibrinógeno y el proexorreceptor I en protrombina están bloqueados por el D2 de Coa (Friedrich et al., 2003). No obstante, la asociación del complejo tetramérico (protrombina de Coa)2 une fibrinógeno en un sitio nuevo con alta afinidad (Panizzi et al., 2006). Este modelo explica las propiedades coagulantes y la conversión eficaz del fibrinógeno por coagulasa (Panizzi et al., 2006).

El fibrinógeno es una glucoproteína grande (Mr ~340.000) formada por tres pares de cadenas Aa, Bp y y unidas covalentemente para formar un "dímero de trímeros", donde A y B designan los fibrinopéptidos liberados por la escisión de trombina (Panizzi et al., 2006). La molécula alargada se pliega en tres dominios separados, un fragmento central E que contiene los extremos N de las seis cadenas y dos fragmentos D flanqueantes formados principalmente por los extremos C de cadenas Bp- y y. Estos dominios globulares están conectados por estructuras triples helicoidales largas. Los complejos de coagulasa-protrombina, que convierten el fibrinógeno humano en la fibrina autopolimerizable, no son diana de los inhibidores de trombina en circulación (Panizzi et al., 2006). Por tanto, las coagulasas estafilocócicas evitan la ruta fisiológica de la coagulación sanguínea.

Todas las cepas de S. aureus secretan coagulasa y vWbp (Bjerketorp et al., 2004; Field y Smith, 1945). Aunque trabajos iniciales informaron de contribuciones importantes de la coagulasa a la patogenia de infecciones estafilocócicas (Ekstedt y Yotis, 1960; Smith et al., 1947), investigaciones más recientes con herramientas de genética molecular han puesto en duda este punto de vista al no observar fenotipos de virulencia con endocarditis, absceso cutáneo y modelos de mastitis en ratones (Moreillon et al., 1995; Phonimdaeng et al., 1990). Generando variantes isogénicas de S. aureus Newman, un aislado clínico completamente virulento (Duthie et al., 1952), se describe en el presente documento que los mutantes de coa presentan de hecho defectos de virulencia en un modelo de bacteriemia letal y absceso renal en ratones. En la experiencia de los inventores, S. aureus 8325-4 no es completamente virulento y se supone que las lesiones mutacionales en esta cepa pueden no ser capaces de revelar defectos de virulencia in vivo. Por otro lado, los anticuerpos inducidos contra Coa o vWbp alteran la patogenia de infecciones por S. aureus Newman en un grado que refleja la influencia de las supresiones génicas. Coa y vWbp contribuyen a la formación de abscesos estafilocócicos y bacteriemia letal y también pueden actuar como antígenos protectores en vacunas subunitarias.

Los estudios bioquímicos documentan el valor biológico de los anticuerpos contra Coa y vWbp. Al unirse al antígeno y bloquear su asociación con factores de coagulación, los anticuerpos evitan la formación de complejos de Coaprotrombina y vWbp-protrombina. Los estudios de transferencia pasiva revelaron la protección de animales experimentales contra la formación de abscesos estafilocócicos y la exposición letal por anticuerpos de Coa y vWbp. Por tanto, los anticuerpos neutralizantes de Coa y vWbp generan protección inmunitaria contra la enfermedad estafilocócica.

Estudios anteriores revelaron un requisito de coagulasa para resistir la fagocitosis en sangre (Smith et al., 1947) y los inventores observaron un fenotipo similar para mutantes Acoa en sangre de ratón tratada con lepirudina (véase ejemplo 3 posterior). Ya que vWbp muestra mayor afinidad por la protrombina humana que la homóloga de ratón, se sospecha que lo mismo puede ser cierto para variantes AvWbp en sangre humana. Además, la expresión de Coa y vWbp en lesiones de abscesos, así como su llamativa distribución en la pseudocápsula eosinófila circundante (comunidades de abscesos estafilocócicos (SAC) o la pared periférica de fibrina, sugieren que las coagulasas secretadas contribuyen al establecimiento de estas lesiones. Se ensayó esta hipótesis y, de hecho, los mutantes Acoa eran defectuosos en el establecimiento de abscesos. Una prueba correspondiente, bloqueando la función de Coa con anticuerpos específicos, produjo el mismo efecto. Por consiguiente, se propone que la coagulación de la fibrina es un acontecimiento crítico en el establecimiento de abscesos estafilocócicos que puede ser diana para el desarrollo de vacunas protectoras. Debido a su función solapante en la protrombina humana, tanto Coa como vWbp se consideran excelentes candidatos para el desarrollo de vacunas.

A. Proteína estafilocócica A (SpA)

Todas las cepas de Staphylococcus aureus expresan el gen estructural para la proteína A (spa) (Jensen, 1958; Said-Salim et al., 2003), un factor de virulencia bien caracterizado cuyo producto de proteína de superficie anclada a la pared celular (SpA) abarca cinco dominios de unión a inmunoglobulina de alta homología designados E, D, A, B y C (Sjodahl, 1977). Estos dominios muestran ~80 % de identidad en el nivel de aminoácidos, son de 56 a 61 restos de longitud y se organizan como repeticiones en tándem (Uhlen et al., 1984). SpA se sintetiza como una proteína precursora con un péptido señal YSIRK/GS N-terminal y una señal de clasificación de motivo LPXTG C-terminal (DeDent et al., 2008; Schneewind et al., 1992). La proteína A anclada a la pared celular se presenta en gran abundancia en la superficie estafilocócica (DeDent et al., 2007; Sjoquist et al., 1972). Cada uno de sus dominios de unión a inmunoglobulina está compuesto por hélices a antiparalelas que se ensamblan en un haz de tres hélices y se unen al dominio Fc de inmunoglobulina G (IgG) (Deisenhofer, 1981; Deisenhofer et al., 1978), la cadena pesada VH3 (Fab) de IgM (es decir, el receptor de linfocitos B) (Graille et al., 2000), el factor de von Willebrand en su dominio A1 [vWF AI es un ligando para plaquetas] (O'Seaghdha et al., 2006) y el receptor del factor de necrosis tumoral a (TNF-a) I (TNFRI) (Gómez et al., 2006), que se presenta en las superficies de los epitelios de las vías respiratorias (Gómez et al., 2004; Gómez et al., 2007).

SpA impide la fagocitosis de neutrófilos de los estafilococos a través de su atributo de unión al componente Fc de IgG (Jensen, 1958; Uhlen et al., 1984). Por otro lado, SpA puede activar la coagulación intravascular a través de su unión a dominios AI del factor de von Willebrand (Hartleib et al., 2000). Las proteínas plasmáticas tales como el fibrinógeno y la fibronectina actúan como puentes entre los estafilococos (ClfA y ClfB) y la integrina plaquetaria GPIIb/IIIa (O'Brien et al., 2002), una actividad que se complementa a través de la asociación de la proteína A con vWF AI, lo que permite que los estafilococos capturen plaquetas a través del receptor plaquetario GPIb-a (Foster, 2005; O'Seaghdha et al., 2006). SpA también se une a TNFRI y esta interacción contribuye a la patogenia de la neumonía estafilocócica (Gómez et al., 2004). SpA activa la señalización proinflamatoria a través de la activación mediada por TNFR1 de TRAF2, la p38/c-jun cinasa, proteína cinasa activada por mitógeno (MAPK) y el factor de transcripción de Rel NF-KB. La unión de SpA induce además la eliminación de TNFR1, una actividad que parece requerir la enzima convertidora de TNF (TACE) (Gómez et al., 2007). Todas las actividades de SpA mencionadas anteriormente están mediadas a través de sus cinco dominios de unión a IgG y pueden ser alteradas por las mismas sustituciones de aminoácidos, inicialmente definidas por su requisito de la interacción entre la proteína A y la IgG1 humana (Cedergren et al., 1993.

SpA también actúa como un superantígeno de linfocitos B al capturar la región Fab de VH3 que porta IgM, el receptor de linfocitos B (Gómez et al., 2007; Goodyear et al., 2003; Goodyear y Silverman, 2004; Roben et al., 1995). Después de la exposición intravenosa, las mutaciones de la proteína A estafilocócica (SpA) muestran una reducción de la carga estafilocócica en tejidos de órganos y disminución drástica de la capacidad para formar abscesos (descrita en el presente documento). Durante la infección con S. aureus de tipo silvestre, se forman abscesos en las primeras cuarenta y ocho horas y son detectables mediante microscopia óptica de tejido renal cortado en secciones delgadas, teñido con hematoxilina-eosina, inicialmente marcado por una afluencia de leucocitos polimorfonucleares (PMN). El día 5 de la infección, los abscesos aumentan de tamaño y encierran una población central de estafilococos, rodeados por una capa de material amorfo, eosinófilos, y una gran envoltura de PMN. La histopatología reveló necrosis masiva de PMN cerca del foco estafilocócico en el centro de las lesiones de absceso, así como un manto de fagocitos sanos. Los inventores también observaron un borde de PMN necróticos en la periferia de las lesiones de absceso, que rodeaba la pseudocápsula eosinófila que separaba el tejido renal sano de la lesión infecciosa. Las variantes estafilocócicas que carecen de proteína A no pueden establecer las características histopatológicas de los abscesos y se eliminan durante la infección.

En estudios previos, Cedergren et al., (1993) diseñaron cinco sustituciones individuales en el subdominio de unión al fragmento Fc del dominio B de SpA, L17D, N28A, I31A y K35A. Estos autores crearon estas proteínas para probar datos recopilados de una estructura tridimensional de un complejo entre un dominio de SpA y Fc1. Cedergren et al., determinaron los efectos de estas mutaciones sobre la estabilidad y la unión, pero no contemplaron el uso de dichas sustituciones para la producción de un antígeno de vacuna.

Brown et al., (1998) describen estudios diseñados para obtener por ingeniería genética nuevas proteínas basadas en SpA que permiten el uso de condiciones de elución más favorables cuando se usan como ligandos de afinidad. Las mutaciones estudiadas incluyeron mutaciones individuales de Q13A, Q14H, N15A, N15H, F17H, Y18F, L21H, N32H o K39H. Brown et al., informan de que las sustituciones Q13A, N15A, N15H y N32H supusieron poca diferencia en los valores de constantes de disociación y que la sustitución de Y18F dio lugar a una disminución doble de la afinidad de unión en comparación con SpA de tipo silvestre. Brown et al., también informan de que las sustituciones L21H y F17H disminuyen la afinidad de unión en cinco veces y cien veces, respectivamente. Los autores también estudiaron sustituciones análogas en dos dominios en tándem. Por tanto, los estudios de Brown et al., se dirigieron a generar una SpA con un perfil de elución más favorable, de ahí el uso de sustituciones de His para proporcionar una alteración sensible al pH en la afinidad de unión. Brown et al., no mencionan el uso de SpA como antígeno de vacuna.

Graille et al., (2000) describen una estructura cristalina del dominio D de SpA y el fragmento Fab de un anticuerpo IgM humano. Graille et al., definen mediante análisis de una estructura cristalina los restos de aminoácidos del dominio D que interactúan con el fragmento Fab como restos Q26, G29, F30, Q32, S33, D36, D37, Q40, N43, E47 o L51, así como los restos de aminoácidos que forman la interfaz entre los subdominios del dominio D. Graille et al., definen las interacciones moleculares de estas dos proteínas, pero no dicen nada al respecto de ningún uso de sustituciones en los restos que interactúan para producir un antígeno de vacuna.

O'Seaghdha et al., (2006) describen estudios dirigidos a dilucidar qué subdominio del dominio D se une a vWF. Los autores generaron mutaciones individuales en los subdominios de unión a Fc o VH3, es decir, restos de aminoácidos F5A, Q9A, Q10A, F13A, Y14A, L17A, N28A, I31A, K35A, G29A, F30A, S33A, D36A, D37A, Q40A, E47A o Q32A. Los autores descubrieron que vWF se une al mismo subdominio que se une a Fc. O'Seaghda et al., definen el subdominio del dominio D responsable de la unión a vWF, pero no dicen nada al respecto de ningún uso de sustituciones en los restos que interactúan para producir un antígeno de vacuna.

Gómez et al., (2006) describen la identificación de los restos responsables de la activación del TNFR1 mediante el uso de mutaciones individuales de F5A, F13A, Y14A, L17A, N21A, I31A, Q32A y K35A. Gómez et al., no dicen nada al respecto de ningún uso de sustituciones en los restos que interactúan en la producción de un antígeno de vacuna.

Se purificó proteína A marcada por afinidad recombinante, un polipéptido que abarca los cinco dominios de IgG (EDCAB) (Sjodahl, 1977) pero que carece de la región X C-terminal (Guss et al., 1984), de E. coli recombinante y se usó como antígeno de vacuna (Stranger-Jones et al., 2006). Debido a los atributos de SpA en la unión de la parte Fc de IgG, no se pudo medir una respuesta inmunitaria humoral específica a la proteína A (Stranger-Jones et al., 2006). Los inventores han superado este obstáculo mediante la generación de SpA-DQ9,10K; D36,37A. Los ratones BALB/c inmunizados con proteína A recombinante (SpA) presentaron protección significativa contra la exposición intravenosa con cepas de S. aureus: una reducción logarítmica de la carga estafilocócica de 2,951 en comparación con el tipo silvestre (P > 0,005; prueba de t de Student) (Stranger-Jones et al., 2006). Los anticuerpos específicos de SpA pueden provocar eliminación fagocítica antes de la formación de abscesos y/o afectar a la formación de la barrera eosinófila mencionada anteriormente en los abscesos que separan las comunidades estafilocócicas de las células inmunitarias, ya que estas no se forman durante la infección con cepas mutantes para proteína A. Cada uno de los cinco dominios SpA (es decir, dominios formados a partir de tres haces de hélices designados E, D, A, B y C) ejerce propiedades de unión similares (Jansson et al., 1998). La solución y la estructura cristalina del dominio D se han resuelto con y sin los ligandos Fc y VH3 (Fab), que se unen a la proteína A de manera no competitiva en sitios distintos (Graille et al., 2000). También son necesarias mutaciones en restos que se sabe que están implicados en la unión a IgG (FS, Q9, Q10, S11, F13, Y14, L17, N28, I31 y K35) para la unión a AI de vWF y TNFR1 (Cedergren et al., 1993; Gómez et al., 2006; O'Seaghdha et al., 2006), mientras que los restos importantes para la interacción con VH3 (Q26, G29, F30, S33, D36, D37, Q40, N43, E47) parecen no influir en las otras actividades de unión (Graille et al., 2000; Jansson et al., 1998). SpA se dirige específicamente a un subconjunto de linfocitos B que expresan IgM relacionada con la familia VH3 en su superficie, es decir, receptores de linfocitos B de tipo VH3 (Roben et al., 1995). Tras la interacción con SpA, estos linfocitos B proliferan y se destinan a la apoptosis, lo que conduce a la supresión preferente y prolongada de linfocitos B de tipo innato (es decir, linfocitos B de la zona marginal y linfocitos B2 foliculares) (Goodyear et al., 2003; Goodyear et al., 2004).

Base molecular de la función y presentación en superficie de la proteína A. La proteína A se sintetiza como un precursor en el citoplasma bacteriano y se secreta a través de su péptido señal YSIRK en el septo, es decir, el tabique de división celular de los estafilococos (DeDent et al., 2007; DeDent et al., 2008). Tras la escisión de la señal de clasificación LPXTG C-terminal, la proteína A se ancla a puentes cruzados de peptidoglucano bacteriano mediante sortasa A (Mazmanian et al., 1999; Schneewind et al., 1995; Mazmanian et al., 2000). La proteína A es la proteína de superficie más abundante de los estafilococos; la molécula es expresada prácticamente por todas las cepas de S. aureus (Cespedes et al., 2005; Kennedy et al., 2008; Said-Salim et al., 2003). Los estafilococos renuevan 15-20 % de su pared celular por cada ciclo de división (Navarre y Schneewind, 1999). Las hidrolasas murinas escinden las cadenas de glucano y los péptidos de la pared del peptidoglucano, liberando de este modo al medio extracelular la proteína A con su tetrapéptido disacárido de pared celular C-terminal unido (Ton-That et al., 1999). Por tanto, por diseño fisiológico, la proteína A está anclada tanto a la pared celular como presentada en la superficie bacteriana, pero también se libera a los tejidos circundantes durante la infección del hospedador (Marraffini et al., 2006).

La proteína A captura inmunoglobulinas en la superficie bacteriana y esta actividad bioquímica permite el escape estafilocócico de las respuestas inmunitarias innatas y adquiridas del hospedador (Jensen, 1958; Goodyear et al., 2004). Resulta interesante que la región X de la proteína A (Guss et al., 1984), un dominio de repetición que une los dominios de unión a IgG a la señal de clasificación LPXTG/anclaje de la pared celular, es quizás la parte más variable del genoma estafilocócico (Said-Salim, 2003; Schneewind et al., 1992). Cada uno de los cinco dominios de unión a inmunoglobulina de la proteína A (SpA), formados a partir de tres haces de hélices y designados E, D, A, B y C, ejerce propiedades estructurales y funcionales similares (Sjodahl, 1977; Jansson et al., 1998). La solución y la estructura cristalina del dominio D se han resuelto con y sin los ligandos Fc y V^h3 (Fab), que se unen a la proteína A de manera no competitiva en sitios distintos (Graille 2000).

En el complejo de estructura cristalina, el Fab interactúa con la hélice II y la hélice III del dominio D a través de una superficie compuesta por cuatro cadenas p de la región VH (Graille 2000). El eje principal de la hélice II del dominio D está aproximadamente a 50° con respecto a la orientación de las cadenas y la parte interhelicoidal del dominio D está más próxima a la cadena C0. El sitio de interacción en Fab está alejado de la cadena ligera de Ig y la región constante de la cadena pesada. La interacción implica los siguientes restos del dominio D: Asp-36 de la hélice II, Asp-37 y Gln-40 en el bucle entre la hélice II y la hélice III y varios otros restos (Graille 2000). Ambas superficies de interacción están compuestas predominantemente por cadenas laterales polares, con tres residuos con carga negativa en el dominio D y dos restos con carga positiva en el Fab 2A2 internado por la interacción, proporcionando una atracción electrostática general entre las dos moléculas. De las cinco interacciones polares identificadas entre Fab y el dominio D, tres están entre cadenas laterales. Se forma un enlace salino entre Arg-H19 y Asp-36 y se crean dos enlaces de hidrógeno entre Tyr-H59 y Asp-37 y entre Asn-H82a y Ser-33. Debido a la conservación de Asp-36 y Asp-37 en los cinco dominios de unión a IgG de la proteína A, los inventores mutaron estos restos.

Los sitios SpA-D responsables de la unión a Fab están estructuralmente separados de la superficie del dominio que media en la unión a F^cy. La interacción de F^cy con el dominio D implica principalmente restos en la hélice I con menor participación de la hélice II (Gouda et al., 1992; Deisenhofer, 1981). Con la excepción del Gln-32, un contacto menor en ambos complejos, ninguno de los restos que median en la interacción con Fcy están implicados en la unión a Fab. Para examinar la relación espacial entre estos diferentes sitios de unión a Ig, los dominios SpA en estos complejos se han superpuesto para construir un modelo de un complejo entre Fab, el dominio D de SpA y la molécula de F^cy. En este modelo ternario, Fab y F^cy forman un emparedado sobre caras opuestas de la hélice II sin pruebas de impedimento estérico de ninguna de las interacciones. Estos hallazgos ilustran cómo, a pesar de su pequeño tamaño (es decir, 56-61 aa), un dominio de SpA puede presentar simultáneamente ambas actividades, lo que explica las pruebas experimentales de que las interacciones de Fab con un dominio individual no son competitivas. Los restos para la interacción entre SpA-D y F^cy son Gln-9 y Gln-10.

Por el contrario, la ocupación de la parte Fc de IgG en el dominio D, bloquea su interacción con vWF A1 y probablemente también con TNFR1 (O'Seaghdha et al., 2006). También son necesarias mutaciones en restos esenciales para la unión de Fc IgG (F5, Q9, Q10, S11, F13, Y14, L17, N28, 131 y K35) para la unión a A1 de vWF y TNFR1 (O'Seaghdha et al., 2006; Cedergren et al., 1993; Gómez et al., 2006), mientras que los restos importantes para la interacción con VH3 (Q26, G29, F30, S33, D36, D37, Q40, N43, E47) no tienen influencia en las actividades de unión de Fc IgG, A1 de vWf o TNFR1 (Jansson et al., 1998; Graille et al., 2000). La actividad de unión de Fab de inmunoglobulina a proteína A se dirige a un subconjunto de linfocitos B que expresan IgM relacionada con la familia V^h3 en su superficie, es decir, estas moléculas actúan como receptores de linfocitos B de tipo VH3 (Roben et al., 1995). Tras la interacción con SpA, estos linfocitos B proliferan rápidamente y después se destinan a la apoptosis, lo que conduce a la supresión preferente y prolongada de linfocitos B de tipo innato (es decir, linfocitos B de la zona marginal y linfocitos B2 foliculares) (Goodyear y Silverman, 2004; Goodyear y Silverman, 2003). Más del 40 % de los linfocitos B en circulación son dianas de la interacción de la proteína A y la familia de V^h3 representa la mayor familia de receptores de linfocitos B humanos para transmitir respuestas humorales protectoras contra patógenos (Goodyear y Silverman, 2004; Goodyear y Silverman, 2003). Por tanto, la proteína A actúa de manera análoga a superantígenos estafilocócicos (Roben et al., 1995), aunque esta última clase de moléculas, por ejemplo SEB, TSST-1, TSST-2, forman complejos con el receptor de linfocitos T para estimular de manera inadecuada las respuestas inmunitarias del hospedador y precipitar de este modo elementos característicos de la enfermedad de infecciones estafilocócicas (Roben et al., 1995; Tiedemann et al., 1995). Juntos, estos hallazgos documentan las contribuciones de la proteína A en el establecimiento de infecciones estafilocócicas y en la modulación de respuestas inmunitarias del hospedador.

C. Otros antígenos estafilocócicos

La investigación durante las últimas décadas ha identificado exotoxinas, proteínas de superficie y moléculas reguladoras de S. aureus como factores de virulencia importantes (Foster, 2005; Mazmanian et al., 2001; Novick, 2003). Se ha logrado mucho progreso con respecto a la regulación de estos genes. Por ejemplo, los estafilococos realizan un censo bacteriano a través de la secreción de péptidos autoinductores que se unen con un receptor afín a una concentración umbral, activando de este modo las reacciones de fosfotransmisión y la activación transcripcional de muchos de los genes de exotoxinas (Novick, 2003). La patogenia de las infecciones estafilocócicas se basa en estos factores de virulencia (exotoxinas secretadas, exopolisacáridos y adhesinas de superficie). El desarrollo de vacunas estafilocócicas está obstaculizado por la naturaleza multifacética de los mecanismos de invasión estafilocócica. Está bien establecido que los microorganismos vivos atenuados son vacunas muy eficaces; las respuestas inmunitarias inducidas por dichas vacunas son con frecuencia de mayor magnitud y mayor duración que las producidas por inmunógenos no replicantes. Una explicación para esto puede ser que las cepas vivas atenuadas establecen infecciones limitadas en el hospedador e imitan las primeras etapas de la infección natural. Se desvelan composiciones y métodos que incluyen polipéptidos y péptidos de coagulasa variantes, en particular, uno o más dominios de coagulasa 1-2, así como otras proteínas, polipéptidos y péptidos extracelulares inmunógenos (incluyendo proteínas o péptidos secretados y de la superficie celular) de bacterias grampositivas para el uso en la mitigación o inmunización contra la infección. En realizaciones particulares, la bacteria es una bacteria estafilococo. Las proteínas, los polipéptidos o los péptidos extracelulares incluyen proteínas secretadas y de la superficie celular de las bacterias diana.

El patógeno humano S. aureus secreta EsxA y EsxB, dos proteínas de tipo ESAT-6, a través de la envoltura bacteriana (Burts et al., 2005). EsxA y esxB estafilocócicos están agrupados con otros seis genes en el orden de transcripción: esxA esaA essA esaB essB essC esaC esxB. Los acrónimos esa, ess y esx representan la secreción de ESAT-6 auxiliar, sistémica y extracelular, respectivamente, dependiendo de si las proteínas codificadas desempeñan una función auxiliar (esa) o directa (ess) para la secreción o se secretan (esx) en el medio extracelular. El grupo completo de ocho genes se denomina en el presente documento grupo Ess. EsxA, esxB, essA, essB y essC son todos necesarios para la síntesis o secreción de EsxA y EsxB. Los mutantes que no producen EsxA, EsxB y EssC presentan defectos en la patogenia de abscesos murinos por S. aureus, lo que sugiere que este sistema de secreción especializado puede ser una estrategia general de la patogenia bacteriana humana. Se ha informado de la secreción de sustratos distintos de WXG100 por la ruta de ESX-1 para varios antígenos, incluyendo EspA, EspB, Rv3483c y Rv3615c (Fortune et al., 2005; MacGurn et al., 2005; McLaughlin et al., 2007; Xu et al., 2007). También se ha mostrado que la ruta de ESX-5 alternativa secreta proteínas tanto WXG100 como distintas de WXG100 en micobacterias patógenas (Abdallah et al., 2007; Abdallah et al., 2006).

La ruta de Ess de Staphylococcus aureus se puede ver como un módulo de secreción equipado con componentes de transporte especializados (Ess), factores auxiliares (Esa) y sustratos de secreción afines (Esx). EssA, EssB y EssC son necesarios para la secreción de EsxA y EsxB. Debido a que se ha predicho que EssA, EssB y EssC son proteínas transmembrana, se contempla que estas proteínas formen un aparato de secreción. Algunas de las proteínas en el grupo de genes ess pueden transportar de manera activa sustratos secretados (que actúan como motoras) mientras que otras pueden regular el transporte (reguladoras). Se puede lograr regulación, pero sin limitación, mediante mecanismos transcripcionales o postraduccionales para polipéptidos secretados, clasificación de sustratos específicos en ubicaciones definidas (p. ej., medio extracelular o células hospedadoras) o el momento de los acontecimientos de secreción durante la infección. En este punto, no está claro si todas las proteínas Esx secretadas actúan como toxinas o contribuyen indirectamente a la patogenia.

Los estafilococos se basan en la adhesión mediada por proteínas de superficie a células hospedadoras o la invasión de tejidos como estrategia para escapar de las defensas inmunitarias. Asimismo, S. aureus utiliza proteínas de superficie para secuestrar hierro del hospedador durante la infección. La mayoría de las proteínas de superficie implicadas en la patogenia estafilocócica portan señales de clasificación C-terminales, es decir, están unidas covalentemente a la envoltura de la pared celular por sortasa. Además, las cepas estafilocócicas que carecen de los genes necesarios para el anclaje de proteínas de superficie, es decir, sortasa A y B, presentan un defecto considerable en la virulencia en varios modelos diferentes de enfermedad en ratones. Por tanto, los antígenos proteicos de superficie representan una diana de vacuna validada ya que los genes correspondientes son esenciales para el desarrollo de la enfermedad estafilocócica y pueden aprovecharse. La superfamilia de la enzima sortasa son las transpeptidasas grampositivas responsables de anclar factores de virulencia de la proteína de superficie a la capa de la pared celular de peptidoglucano. Se han identificado dos isoformas de sortasa en Staphylococcus aureus, SrtA y SrtB. Se ha mostrado que estas enzimas reconocen un motivo LPXTG en proteínas del sustrato. La isoforma SrtB parece ser importante en la adquisición de hierro hemo y la homeostasis del hierro, mientras que la isoforma SrtA desempeña una función crítica en la patogenia de las bacterias grampositivas al modular la capacidad de la bacteria para adherirse al tejido hospedador a través del anclaje covalente de adhesinas y otras proteínas al peptidoglucano de la pared celular. Las variantes de coagulasa, en particular, uno o más dominios de coagulasa 1-2 descritos en el presente documento pueden usarse en combinación con otras proteínas estafilocócicas tales como proteínas Coa, Eap, Ebh, Emp, EsaC, EsaB, EsxA, EsxB, Hla, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, IsdC, SasF, vWbp y/o vWh.

Se desvelan métodos y composiciones con respecto a composiciones proteicas que incluyen polipéptidos, péptidos o ácido nucleico que codifica variantes de coagulasa, en particular, uno o más dominios 1-2 de coagulasa descritos en el presente documento y otros antígenos estafilocócicos tales como otras proteínas transportadas por la ruta de Ess o sustratos de sortasa. Estas proteínas pueden modificarse mediante supresión, inserción y/o sustitución.

Los polipéptidos Esx incluyen la secuencia de aminoácidos de las proteínas Esx de bacterias del género Staphylococcus. La secuencia de Esx puede ser de una especie de estafilococo en particular, tal como Staphylococcus aureus, y puede ser de una cepa en particular, tal como Newman. En determinada divulgación, la secuencia de EsxA es SAV0282 de la cepa Mu50 (que es la misma secuencia de aminoácidos para Newman) y se puede acceder a ella usando el número de referencia de Genbank Q99WU4 (gi|68565539). En otra divulgación, la secuencia de EsxB es SAV0290 de la cepa Mu50 (que es la misma secuencia de aminoácidos para Newman) y se puede acceder a ella usando el número de referencia de Genbank Q99WT7 (gi|68565532). En otra divulgación, se pueden usar otros polipéptidos transportados por la ruta de Ess, cuyas secuencias pueden ser identificadas por un experto en la materia utilizando bases de datos y recursos accesibles por internet.

Los polipéptidos de sustrato de sortasa incluyen la secuencia de aminoácidos de proteínas SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, IsdC o SasF de bacterias del género Staphylococcus. La secuencia polipeptídica de sustrato de sortasa puede ser de una especie de estafilococo en particular, tal como Staphylococcus aureus, y puede ser de una cepa en particular, tal como Newman. En determinada divulgación, la secuencia SdrD es de la cepa N315 y se puede acceder a ella usando el número de referencia de Genbank NP_373773.1 (gi|15926240). En otra divulgación, la secuencia SdrE es de la cepa N315 y se puede acceder a ella usando el número de referencia de Genbank NP_373774.1 (gi|15926241). En otra divulgación, la secuencia de IsdA es SAV1130 de la cepa Mu50 (que es la misma secuencia de aminoácidos para Newman) y se puede acceder a ella usando el número de referencia de Genbank NP_371654.1 (gi| 15924120). En otra divulgación, la secuencia de IsdB es SAV1129 de la cepa Mu50 (que es la misma secuencia de aminoácidos para Newman) y se puede acceder a ella usando el número de referencia de Genbank NP_371653.1 (gi|15924119). En otra divulgación, se pueden utilizar otros polipéptidos transportados por la ruta de Ess o procesados por sortasa, cuyas secuencias pueden ser identificadas por un experto en la materia utilizando bases de datos y recursos accesibles por internet.

Se pueden identificar ejemplos de diversas proteínas que se pueden usar en el contexto de la presente invención mediante el análisis de envíos de bases de datos de genomas bacterianos, incluyendo los números de referencia NC_002951 (GI: 57650036 y GenBank CP000046), NC_002758 (GI: 57634611 y GenBank BA000017), NC_002745 (GI: 29165615 y GenBank BA000018), NC_003923 (GI: 21281729 y GenBank BA000033), NC_002952 (GI: 49482253 y GenBank BX571856), NC_002953 (GI: 49484912 y GenBank BX571857), NC_007793 (GI: 87125858 y GenBank CP000255), NC_007795 (GI: 87201381 y GenBank CP000253).

Como se usa en el presente documento, una "proteína" o un "polipéptido" se refiere a una molécula que comprende al menos diez restos de aminoácidos. En algunas realizaciones, se emplea una versión de tipo silvestre de una proteína o un polipéptido, sin embargo, en muchas realizaciones de la invención, se emplea una proteína o un polipéptido modificado para generar una respuesta inmunitaria. Los términos descritos anteriormente pueden usarse indistintamente. Una "proteína modificada" o "polipéptido modificado" o una "variante" se refiere a una proteína o un polipéptido cuya estructura química, en particular su secuencia de aminoácidos, está alterada con respecto a la proteína o el polipéptido de tipo silvestre. En algunas realizaciones, una proteína o un polipéptido modificado/variante tiene al menos una actividad o función modificada (que reconoce que las proteínas o los polipéptidos pueden tener múltiples actividades o funciones). Se contempla específicamente que una proteína o un polipéptido modificado/variante puede alterarse con respecto a una actividad o función pero conservar una actividad o función de tipo silvestre en otros aspectos, tales como inmunogenicidad.

En determinadas realizaciones, el tamaño de una proteína o un polipéptido (de tipo silvestre o modificado) puede comprender 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500 moléculas de amino o más, y cualquier intervalo derivable de las mismas, o derivado de una secuencia de amino correspondiente descrita o a la que se hace referencia en el presente documento. Se contempla que los polipéptidos pueden mutarse mediante truncamiento, haciéndolos más cortos que su forma de tipo silvestre correspondiente, pero también podrían alterarse fusionando o conjugando una secuencia proteica heteróloga con una función en particular (p. ej., para direccionamiento o localización, para mayor inmunogenicidad, para fines de purificación, etc.).

Como se usa en el presente documento, una "molécula de amino" se refiere a cualquier aminoácido, derivado de aminoácido o mimético de aminoácido conocido en la técnica. En determinadas realizaciones, los restos de la molécula proteica son secuenciales, sin ninguna molécula no amino que interrumpa la secuencia de restos de moléculas amino. En otras realizaciones, la secuencia puede comprender uno o más restos de moléculas no amino. En realizaciones particulares, la secuencia de restos de la molécula proteica puede ser interrumpida por uno o más restos de moléculas no amino.

En consecuencia, la expresión "composición proteica" abarca secuencias de moléculas de amino que comprenden al menos uno de los 20 aminoácidos comunes en proteínas sintetizadas de manera natural o al menos un aminoácido modificado o inusual.

Se pueden preparar composiciones proteicas mediante cualquier técnica conocida por los expertos en la materia, incluyendo (i) la expresión de proteínas, polipéptidos o péptidos a través de técnicas convencionales de biología molecular, (ii) el aislamiento de compuestos proteicos a partir de fuentes naturales o (iii) la síntesis química de materiales proteicos. Las secuencias de nucleótidos, así como las de proteínas, polipéptidos y péptidos para diversos genes se han desvelado previamente y se pueden encontrar en las bases de datos informatizadas reconocidas. Una de esas bases de datos son las bases de datos Genbank y GenPept del Centro Nacional de Información Biotecnológica (en Internet en ncbi.nlm.nih.gov/). Las regiones codificantes para estos genes pueden amplificarse y/o expresarse usando las técnicas desveladas en el presente documento o como conocerían los expertos en la materia.

Las variantes de secuencias de aminoácidos de coagulasas, en particular, de los dominios 1-2 de coagulasa, SpA y otros polipéptidos de la invención pueden ser variantes de sustitución, inserción o supresión. Una variación en un polipéptido de la invención puede afectar a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 o más aminoácidos no contiguos o contiguos del polipéptido, en comparación con el tipo silvestre. Una variante puede comprender una secuencia de aminoácidos que sea al menos 80 % o 90 %, incluyendo todos los valores e intervalos entre ellos, idéntica, a cualquier secuencia proporcionada o a la que se hace referencia en el presente documento, p. ej., una secuencia de la TABLA DE SECUENCIAS N.° 1 (SEQ ID NO: 33-37) o de la TABLA DE SECUENCIAS N.° 2 (SEQ ID NO: 38-41). Una variante puede incluir 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más aminoácidos sustitutos. Un polipéptido procesado o secretado por la ruta de Ess u otras proteínas de superficie (véase la tabla 1) o sustratos de sortasa de cualquier especie y cepa de estafilococo, se contemplan para su uso en las composiciones y los métodos desvelados en el presente documento.

Las variantes de supresión normalmente carecen de uno o más restos de la proteína nativa o de tipo silvestre. Se pueden suprimir restos individuales o se pueden suprimir varios aminoácidos contiguos. Se puede introducir un codón de parada (mediante sustitución o inserción) en una secuencia de ácido nucleico codificante para generar una proteína truncada. Los mutantes de inserción implican normalmente la adición de material en un punto no terminal en el polipéptido. Esto puede incluir la inserción de uno o más restos. También se puede generar adiciones terminales, denominadas proteínas de fusión. Estas proteínas de fusión incluyen multímeros o concatámeros de uno o más péptidos o polipéptidos descritos o a los que se hace referencia en el presente documento.

Las variantes de sustitución contienen normalmente el intercambio de un aminoácido por otro en uno o más sitios dentro de la proteína y pueden diseñarse para modular una o más propiedades del polipéptido, con o sin la pérdida de otras funciones o propiedades. Las sustituciones pueden ser conservadoras, es decir, se sustituye un aminoácido con uno de una forma y carga similar. Las sustituciones conservadoras son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, los cambios de: alanina a serina; arginina a lisina; asparagina a glutamina o histidina; aspartato a glutamato; cisteína a serina; glutamina a asparagina; glutamato a aspartato; glicina a prolina; histidina a asparagina o glutamina; isoleucina a leucina o valina; leucina a valina o isoleucina; lisina a arginina; metionina a leucina o isoleucina; fenilalanina a tirosina, leucina o metionina; serina a treonina; treonina a serina; triptófano a tirosina; tirosina a triptófano o fenilalanina; y valina a isoleucina o leucina. Como alternativa, las sustituciones pueden ser no conservativas de modo que se vea afectada una función o actividad del polipéptido. Los cambios no conservadores normalmente implican la sustitución de un resto con uno que es químicamente diferente, tal como un aminoácido polar o con carga para un aminoácido no polar o sin carga, y viceversa.

Tabla 2. Proteínas de su erficie ilustrativas de ce as de S. aureus.

continuación

Las proteínas de las composiciones de la invención pueden ser recombinantes o sintetizadas in vitro. Como alternativa, una proteína no recombinante o recombinante puede aislarse de bacterias. Se desvela que una bacteria que contiene dicha variante puede implementarse en composiciones y métodos. Por consiguiente, no es necesario aislar una proteína.

La expresión "codón funcionalmente equivalente" se usa en el presente documento para referirse a codones que codifican el mismo aminoácido, tales como los seis codones para arginina o serina, y también se refiere a codones que codifican aminoácidos biológicamente equivalentes (véase tabla 3, a continuación).

Tabla 3 Tabla de codones

También se entenderá que las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos pueden incluir restos adicionales, tales como aminoácidos N o C terminales adicionales, o secuencias 5' o 3', respectivamente, y aún ser esencialmente como se expone en una de las secuencias desveladas en el presente documento, siempre que la secuencia cumpla los criterios expuestos anteriormente, incluyendo el mantenimiento de la actividad biológica de proteínas (p. ej., inmunogenicidad) en lo que respecta a la expresión de proteínas. La adición de secuencias terminales se aplica en particular a secuencias de ácido nucleico que pueden, por ejemplo, incluir diversas secuencias no codificantes que flanquean una de las partes 5' o 3' de la región codificante.

Lo siguiente es un análisis basado en el cambio de los aminoácidos de una proteína para crear un polipéptido o péptido variante. Por ejemplo, determinados aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos en una estructura proteica con o sin pérdida apreciable de la capacidad de unión interactiva con estructuras tales como, por ejemplo, regiones de unión a antígeno de anticuerpos o sitios de unión en moléculas de sustrato. Ya que es la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína lo que define la actividad funcional de esa proteína, se pueden realizar determinadas sustituciones de aminoácidos en una secuencia de proteínas y en su secuencia codificante de

ADN subyacente y, no obstante, producir una proteína con una propiedad deseable. Por tanto, los inventores contemplan que se pueden realizar diversos cambios en las secuencias de ADN de los genes.

Se contempla que, en las composiciones de la invención, hay entre aproximadamente 0,001 mg y aproximadamente

10 mg de polipéptido, péptido y/o proteína total por ml. La concentración de proteína en una composición puede ser de aproximadamente, al menos aproximadamente o como máximo aproximadamente 0,001, 0,010, 0,050, 0,1, 0,2,

0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5,

10,0 mg/ml o más (o cualquier intervalo derivable de los mismos). De esta, aproximadamente, al menos aproximadamente o como máximo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,

21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59,

60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 % puede ser un dominio 1-2 de coa coagulasa o su variante y se puede usar en combinación con otros péptidos o polipéptidos, tales como otros péptidos y/o antígenos bacterianos.

La presente invención contempla la administración de dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica o variantes de los mismos para su uso para efectuar una terapia preventiva o un efecto terapéutico contra el desarrollo de una enfermedad o afección asociada con la infección por un patógeno estafilocócico.

En determinados aspectos, se utilizan combinaciones de antígenos estafilocócicos en la producción de una composición inmunogénica que es eficaz en el tratamiento o la prevención de la infección estafilocócica. Las infecciones estafilocócicas avanzan a través de varias etapas diferentes. Por ejemplo, el ciclo de vida estafilocócico implica colonización comensal, inicio de la infección accediendo a tejidos adyacentes o al torrente sanguíneo y/o multiplicación anaerobia en la sangre. La interacción entre los determinantes de la virulencia de S. aureus y los mecanismos de defensa del hospedador puede inducir complicaciones tales como endocarditis, formación de abscesos metastásicos y síndrome de septicemia. Diferentes moléculas en la superficie de la bacteria están implicadas en diferentes etapas del ciclo de infección. Las combinaciones de determinados antígenos pueden inducir una respuesta inmunitaria que protege contra múltiples etapas de la infección estafilocócica. La eficacia de la respuesta inmunitaria se puede medir en ensayos con modelos animales y/o utilizando un ensayo opsonofagocítico.

B. Polipéptidos y producción de polipéptidos

La presente divulgación describe polipéptidos, péptidos y proteínas y fragmentos inmunogénicos de los mismos, para su uso en composiciones inmunógenas de la presente invención. Por ejemplo, los polipéptidos específicos se analizan con respecto a o se usan para inducir una respuesta inmunitaria. En realizaciones específicas, todas o parte de las proteínas de la composición inmunógena de la invención, también se pueden sintetizar en solución o sobre un soporte sólido de acuerdo con técnicas convencionales. Se encuentran disponibles en el mercado diversos sintetizadores automáticos y pueden usarse de acuerdo con protocolos conocidos. Véase, por ejemplo, Stewart y Young, (1984); Tam et al., (1983); Merrifield, (1986); y Barany y Merrifield (1979).

Como alternativa, Se puede emplear tecnología de ADN recombinante en donde se inserta una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido en un vector de expresión, se transforma o se transfecta en una célula hospedadora adecuada y se cultiva en condiciones adecuadas para la expresión.

Se desvela el uso de transferencia génica a células, incluyendo microorganismos, para la producción y/o presentación de polipéptidos o péptidos. El gen para el polipéptido o péptido de interés puede transferirse a células hospedadoras adecuadas seguido de cultivo de células en las condiciones adecuadas. La generación de vectores de expresión recombinantes, y los elementos incluidos en los mismos, son bien conocidos en la técnica y se analizan brevemente en el presente documento. Como alternativa, la proteína que se va a producir puede ser una proteína endógena sintetizada de manera normal por la célula que se aísla y se purifica.

Se desvela el uso de líneas celulares de linfocitos B autólogas, que se transfectan con un vector vírico que expresa un producto inmunógeno y, más específicamente, una proteína que tiene actividad inmunógena. Otros ejemplos de líneas celulares hospedadoras de mamíferos incluyen células Vero y HeLa, otras líneas de linfocitos B y T, tales como CEM, 721.221, H9, Jurkat, Raji, así como líneas celulares de ovario de hámster chino, W138, BHK, COS-7,

293, HepG2, 3T3, RIN y células ^m D^c K. Además, se puede seleccionar una cepa de células hospedadoras que module la expresión de las secuencias insertadas o que modifique y procese el producto génico de la manera deseada. Dichas modificaciones (p. ej., glucosilación) y procesamiento (p. ej., escisión) de productos proteicos pueden ser importantes para la función de la proteína. Diferentes células hospedadoras tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y la modificación postraduccional de las proteínas. Se pueden seleccionar líneas celulares o sistemas hospedadores adecuados para garantizar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína extraña expresada.

Se pueden usar varios sistemas de selección, incluyendo genes de timidina cinasa, hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa y adenina fosforribosiltransferasa de VHS, en células tk-, hgprt- o aprt-, respectivamente. Además, puede usarse resistencia antimetabolitos como base de la selección: para dhfr, que confiere resistencia a trimetoprim y metotrexato; gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico; neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G418; e higro, que confiere resistencia a la higromicina.

Las células animales pueden propagarse in vitro en dos modos: como células no dependientes del anclaje que crecen en suspensión a lo largo de la mayor parte del cultivo o como células dependientes del anclaje que requieren unión a un sustrato sólido para su propagación (es decir, un tipo de crecimiento celular en monocapa).

Los cultivos no dependientes de anclaje o en suspensión a partir de líneas celulares continuas establecidas son los medios más ampliamente utilizados de producción a gran escala de células y productos celulares. Sin embargo, las células cultivadas en suspensión tienen limitaciones, tales como potencial tumorigénico y menor producción de proteínas que las células adherentes.

Cuando una proteína se menciona específicamente en el presente documento, es preferentemente una referencia a una proteína nativa o recombinante u opcionalmente una proteína en la que se ha eliminado cualquier secuencia señal. La proteína puede aislarse directamente de la cepa estafilocócica o producirse mediante técnicas de ADN recombinante. Los fragmentos inmunogénicos de la proteína pueden incorporarse en la composición inmunogénica de la invención. Estos son fragmentos que comprenden al menos 10 aminoácidos, 20 aminoácidos, 30 aminoácidos, 40 aminoácidos, 50 aminoácidos o 100 aminoácidos, incluyendo todos los valores e intervalos entre ellos, tomados de manera contigua de la secuencia de aminoácidos de la proteína. Además, dichos fragmentos inmunógenos son inmunológicamente reactivos con anticuerpos generados contra las proteínas estafilocócicas o con anticuerpos generados por infección de un hospedador mamífero con estafilococos. Los fragmentos inmunógenos también incluyen fragmentos que cuando se administran a una dosis eficaz, (ya sean solos o como un hapteno unido a un vehículo), inducen una respuesta inmunitaria protectora o terapéutica contra infección estafilocócica y pueden ser protectores contra infección por S. aureus y/o S. epidermidis. Dicho fragmento inmunógeno puede incluir, por ejemplo, la proteína que carece de una secuencia líder N-terminal y/o un dominio transmembrana y/o un dominio de anclaje C-terminal. En una divulgación, el fragmento inmunógeno comprende sustancialmente todo el dominio extracelular de una proteína que tiene al menos 80 % de identidad, al menos 85 % de identidad, al menos 90 % de identidad, al menos 95 % de identidad o al menos 97-99 % de identidad, incluyendo todos los valores e intervalos entre ellos, a un segmento de secuencia seleccionada de un polipéptido descrito en el presente documento.

También se incluyen en composiciones inmunógenas de la invención proteínas de fusión compuestas por una o más proteínas estafilocócicas o fragmentos inmunógenos de proteínas estafilocócicas. Dichas proteínas de fusión pueden prepararse de manera recombinante y pueden comprender una parte de al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 proteínas o segmentos estafilocócicos. Como alternativa, una proteína de fusión puede comprender múltiples partes de al menos I, 2, 3, 4 o 5 proteínas estafilocócicas. Estas pueden combinar diferentes proteínas estafilocócicas y/o múltiples de la misma proteína o fragmento proteico, o fragmentos inmunógenos en la misma proteína (formando un multímero o un concatámero). Como alternativa, la invención también incluye proteínas de fusión individuales de proteínas estafilocócicas o fragmentos inmunógenos de las mismas, como una proteína de fusión con secuencias heterólogas, tales como un proveedor de epítopos de linfocitos T o marcadores de purificación, por ejemplo: p-galactosidasa, glutatión-S-transferasa, proteínas verdes fluorescentes (GFP), marcadores epitópicos tales como FLAG, marcador de myc, polihistidina o proteínas de superficie vírica tales como hemaglutinina del virus de la gripe o proteínas bacterianas tales como toxoide tetánico, toxoide diftérico o CRM197.

II. ÁCIDOS NUCLEICOS

La presente divulgación se refiere a polinucleótidos recombinantes que codifican las proteínas, los polipéptidos y los péptidos de la divulgación. Las secuencias de ácido nucleico para coagulasas, dominios 1-2 de coagulasas, SpA y otras proteínas bacterianas pueden usarse para preparar péptidos o polipéptidos.

Como se usa en la presente solicitud, el término "polinucleótido" se refiere a una molécula de ácido nucleico que es recombinante o se ha aislado sin ácido nucleico genómico total. Dentro del término "polinucleótido" se incluyen oligonucleótidos (ácidos nucleicos de 100 restos o menos de longitud), vectores recombinantes, incluyendo, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fago, virus y similares. Los polinucleótidos incluyen, en determinados aspectos, secuencias reguladoras, aisladas sustancialmente de sus genes de origen natural o secuencias codificantes de proteínas. Los polinucleótidos pueden ser monocatenarios (codificantes o antisentido) o bicatenarios y pueden ser ARN, ADN (genómico, ADNc o sintético), análogos de los mismos o una combinación de los mismos. Dentro de un polinucleótido, pueden estar presentes secuencias codificantes o no codificantes adicionales, pero no es necesario. En este sentido, la expresión "gen", "polinucleótido", o "ácido nucleico" se usa para hacer referencia a un ácido nucleico que codifica una proteína, un polipéptido o un péptido (incluyendo cualquier secuencia necesaria para transcripción, modificación postraduccional o ubicación adecuadas). Como entenderán los expertos en la materia, esta expresión abarca secuencias genómicas, casetes de expresión, secuencias de ADNc y segmentos de ácido nucleico modificados por ingeniería genética más pequeños que expresan, o pueden adaptarse para expresar, proteínas, polipéptidos, dominios, péptidos, proteínas de fusión y mutantes. Un ácido nucleico que codifica todo o parte de un polipéptido puede contener una secuencia contigua de ácido nucleico de: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1095, 1100, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 9000, 10000 o más nucleótidos, nucleósidos o pares de bases, incluyendo todos los valores e intervalos entre ellos, de un polinucleótido que codifica una o más secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento. También se contempla que un polipéptido en particular puede estar codificado por ácidos nucleicos que contienen variaciones que tienen secuencias de ácido nucleico ligeramente diferentes pero, no obstante, codifican la misma proteína o una proteína sustancialmente similar (véase tabla 3 anterior).

La divulgación se refiere a segmentos de ácido nucleico aislados y vectores recombinantes que incorporan secuencias de ácido nucleico que codifican uno o más dominios 1-2 de coagulasa o variantes de los mismos. El término "recombinante" puede usarse junto con un polinucleótido o polipéptido y se refiere en general a un polipéptido o polinucleótido producido y/o manipulado in vitro o que es un producto de replicación de dicha molécula.

La divulgación se refiere a segmentos de ácido nucleico aislados y vectores recombinantes que incorporan secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido o péptido de coagulasa o una variante del mismo para generar una respuesta inmunitaria en un sujeto. Los ácidos nucleicos pueden usarse en vacunas genéticas.

Los segmentos de ácido nucleico se pueden combinar con otras secuencias de ácido nucleico, tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios de enzimas de restricción adicionales, sitios de clonación múltiples, otros segmentos codificantes y similares, de modo que su longitud total puede variar considerablemente. Por lo tanto, se contempla que se puede emplear un fragmento de ácido nucleico de casi cualquier longitud, estando la longitud total preferentemente limitada por la facilidad de preparación y uso en el protocolo de ácido nucleico recombinante previsto. En algunos casos, una secuencia de ácido nucleico puede codificar una secuencia polipeptídica con secuencias codificantes heterólogas adicionales, por ejemplo, para permitir la purificación del polipéptido, transporte, secreción, modificación postraduccional o para beneficios terapéuticos tales como direccionamiento o eficacia. Como se ha analizado anteriormente, se puede añadir un marcador u otro polipéptido heterólogo a la secuencia codificante del polipéptido modificado, en donde "heterólogo" se refiere a un polipéptido que no es el mismo que el polipéptido modificado.

La divulgación se refiere a segmentos de ácido nucleico aislados y a vectores recombinantes que incluyen, dentro de su secuencia, una secuencia contigua de ácido nucleico que codifica una de las secuencias de la TABLA DE SECUENCIAS N.° 1 (SEQ ID NO: 33-37) o de la TABLA DE SECUENCIAS N.° 2 (SEQ ID NO: 38-41) o cualquier otra secuencia de ácido nucleico que codifique coagulasas u otros factores de virulencia secretados y/o proteínas de superficie, incluyendo proteínas transportadas por la ruta de Ess o procesadas por sortasa.

La presente divulgación proporciona variantes de polinucleótidos que tienen identidad sustancial con las secuencias desveladas en el presente documento; las que comprenden al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o mayor identidad de secuencia, incluyendo todos los valores e intervalos entre ellos, en comparación con una secuencia polinucleotídica usando los métodos descritos en el presente documento (p. ej., análisis BLAST usando parámetros convencionales).

La divulgación también contempla el uso de polinucleótidos que son complementarios de todos los polinucleótidos descritos anteriormente.

A. Vectores

Los polipéptidos pueden estar codificados por una molécula de ácido nucleico comprendida en un vector. El término "vector" se usa para hacer referencia a una molécula de ácido nucleico portadora en la que se puede insertar una secuencia de ácido nucleico heteróloga para su introducción en una célula donde se pueda replicar y expresar. Una secuencia de ácido nucleico puede ser "heteróloga", lo que significa que está en un contexto extraño a la célula en la que se introduce el vector o al ácido nucleico en el que se incorpora, que incluye una secuencia homóloga de una secuencia en la célula o ácido nucleico pero en una posición dentro de la célula hospedadora o ácido nucleico donde no se encuentra habitualmente. Los vectores incluyen ADN, ARN, plásmidos, cósmidos, virus (bacteriófago, virus animales y virus vegetales) y cromosomas artificiales (p. ej., YAC). Un experto en la materia estaría bien equipado para construir un vector mediante técnicas recombinantes convencionales (por ejemplo, Sambrook et al., 2001; Ausubel et al., 1996). Además de codificar uno o más dominios 1-2 de coagulasa o una variante de los mismos, el vector puede codificar otras secuencias polipeptídicas, tales como uno o más péptidos bacterianos adicionales, un marcador o un péptido potenciador de la inmunogenicidad. Los vectores útiles que codifican dichas proteínas de fusión incluyen vectores pIN (Inouye et al., 1985), vectores que codifican un tramo de histidinas y vectores pGEX, para su uso en la generación de proteínas de fusión solubles de glutatión S-transferasa (GST) para su posterior purificación y separación o escisión.

La expresión "vector de expresión" se refiere a un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos parte de un producto génico capaz de transcribirse. En algunos casos, las moléculas de ARN se traducen después a una proteína, un polipéptido o un péptido. Los vectores de expresión pueden contener diversas "secuencias de control", que se refieren a secuencias de ácido nucleico necesarias para la transcripción y posiblemente la traducción de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo hospedador en particular. Además de las secuencias de control que rigen la transcripción y la traducción, los vectores y los vectores de expresión pueden contener secuencias de ácido nucleico que también cumplen otras funciones y se describen en el presente documento.

1. Promotores y potenciadores

Un "promotor" es una secuencia de control. El promotor es normalmente una región de una secuencia de ácido nucleico en la que se controla el inicio y la velocidad de transcripción. Puede contener elementos genéticos a los que se pueden unir proteínas y moléculas reguladoras, tales como ARN polimerasa y otros factores de transcripción. Las expresiones "situado/a operativamente", "unido/a operativamente", "bajo control" y "bajo control transcripcional" significan que un promotor está en una ubicación y/u orientación funcional correctas en relación con una secuencia de ácido nucleico para controlar el inicio de la transcripción y/o la expresión de esa secuencia. Un promotor puede usarse o no junto con un "potenciador", que se refiere a una secuencia reguladora de acción en cis implicada en la activación de la transcripción de una secuencia de ácido nucleico.

Naturalmente, puede ser importante emplear un promotor y/o potenciador que dirija eficazmente la expresión del segmento de ADN en el tipo celular u organismo elegido para la expresión. En general, los expertos en la materia de la biología molecular conocen el uso de promotores, potenciadores y combinaciones de tipos celulares para la expresión de proteínas (véase Sambrook et al., 2001). Los promotores empleados pueden ser constitutivos, específicos de tejido o inducibles y pueden dirigir expresión de alto nivel del segmento de ADN introducido en condiciones específicas, tales como producción a gran escala de proteínas o péptidos recombinantes.

Se pueden emplear diversos elementos/promotores para regular la expresión de un gen. Los ejemplos de dichos elementos inducibles, que son regiones de una secuencia de ácido nucleico que pueden activarse en respuesta a un estímulo específico, incluyen la cadena pesada de inmunoglobulina (Banerji et al., 1983; Gilles et al., 1983; Grosschedl et al., 1985; Atchinson et al., 1986, 1987; Imler et al., 1987; Weinberger et al., 1984; Kiledjian et al., 1988; Porton et al.; 1990), cadena ligera de inmunoglobulina (Queen et al., 1983; Picard et al., 1984), receptor de linfocitos T (Luria et al., 1987; Winoto et al., 1989; Redondo et al.; 1990), HLA DQ a y/o DQ p (Sullivan et al., 1987), interferón p (Goodbourn et al., 1986; Fujita et al., 1987; Goodbourn et al., 1988), interleucina-2 (Greene et al., 1989), receptor de interleucina-2 (Greene et al., 1989; Lin et al., 1990), MHC de clase II 5 (Koch et al., 1989), MHC de clase II HLA-DRa (Sherman et al., 1989), p-actina (Kawamoto et al., 1988; Ng et al.; 1989), creatina cinasa muscular (MCK) (Jaynes et al., 1988; Horlick et al., 1989; Johnson et al., 1989), prealbúmina (transtiretina) (Costa et al., 1988), elastasa I (Ornitz et al., 1987), metalotioneína (MTII) (Karin et al., 1987; Culotta et al., 1989), colagenasa (Pinkert et al., 1987; Angel et al., 1987), albúmina (Pinkert et al., 1987; Tronche et al., 1989, 1990), a-fetoproteína (Godbout et al., 1988; Campere et al., 1989), Y-globina (Bodine et al., 1987; Pérez-Stable et al., 1990), p-globina (Trudel et al., 1987), c-fos (Cohen et al., 1987), c-Ha-Ras (Triesman, 1986; Deschamps et al., 1985), insulina (Edlund et al., 1985), molécula de adhesión de células neurales (NCAM) (Hirsh et al., 1990), a1-antitripaína (Latimer et al., 1990), histona H2B (TH2B) (Hwang et al., 1990), colágeno de ratón y/o de tipo I (Ripe et al., 1989), proteínas reguladas por glucosa (GRP94 y GRP78) (Chang et al., 1989), hormona del crecimiento de rata (Larsen et al., 1986), amiloide A de suero humano (SAA) (Edbrooke et al., 1989), troponina I (TN I) (Yutzey et al., 1989), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) (Pech et al. 1989), distrofia muscular de Duchenne (Klamut et al., 1990), SV40 (Banerji et al., 1981; Moreau et al., 1981; Sleigh et al., 1985; Firak et al., 1986; Herr et al., 1986; Imbra et al., 1986; Kadesch et al., 1986; Wang et al., 1986; Ondek et al., 1987; Kuhl et al., 1987; Schaffner et al., 1988), polioma (Swartzendruber et al., 1975; Vasseur et al., 1980; Katinka et al., 1980, 1981; Tyndell et al., 1981; Dandolo et al., 1983; de Villiers et al., 1984; Hen et al., 1986; Satake et al., 1988; Campbell et al., 1988), retrovirus (Kriegler et al., 1982, 1983; Levinson et al., 1982; Kriegler et al., 1983, 1984a, b, 1988; Bosze et al., 1986; Miksicek et al., 1986; Celander et al., 1987; Thiesen et al., 1988; Celander et al., 1988; Choi et al., 1988; Reisman et al., 1989), virus del papiloma (Campo et al., 1983; Lusky et al., 1983; Spandidos y Wilkie, 1983; Spalholz et al., 1985; Lusky et al., 1986; Cripe et al., 1987; Gloss et al., 1987; Hirochika et al., 1987; Stephens et al., 1987), virus de la hepatitis B (Bulla et al., 1986; Jameel et al., 1986; Shaul et al., 1987; Spandau et al., 1988; Vannice et al., 1988), virus de la inmunodeficiencia humana (Muesing et al., 1987; Hauber et al., 1988; Jakobovits et al., 1988; Feng et al., 1988; Takebe et al., 1988; Rosen et al., 1988; Berkhout et al., 1989; Laspia et al., 1989; Sharp et al., 1989; Braddock et al., 1989), citomegalovirus (CMV) IE (Weber et al., 1984; Boshart et al., 1985; Foecking et al., 1986), virus de la leucemia del gibón (Holbrook et al., 1987; Quinn et al., 1989).

Los elementos inducibles incluyen MT II - éster de forbol (TFA)/metales pesados (Palmiter et al., 1982; Haslinger et al., 1985; Searle et al., 1985; Stuart et al., 1985; Imagawa et al., 1987, Karin et al., 1987; Angel et al., 1987b; McNeall et al., 1989); MMTV (virus de tumor mamario de ratón) - glucocorticoides (Huang et al., 1981; Lee et al., 1981; Majors et al., 1983; Chandler et al., 1983; Lee et al., 1984; Ponta et al., 1985; Sakai et al., 1988); interferón p -poli(rl)x/poli(rc) (Tavernier et al., 1983); adenovirus 5 E2 - E1A (Imperiale et al., 1984); colagenasa - éster de forbol (TPA) (Angel et al., 1987a); estromelisina - éster de forbol (TPA) (Angel et al., 1987b); SV40 - éster de forbol (TPA) (Angel et al., 1987b); gen MX murino - interferón, virus de la enfermedad de Newcastle (Hug et al., 1988); gen GRP78 - A23187 (Resendez et al., 1988); a-2-macroglobulina - IL-6 (Kunz et al., 1989); vimentina - suero (Rittling et al., 1989); gen H del MHC de clase I-2Kb - interferón (Blanar et al., 1989); HSP70 - antígeno T grande E1A/SV40 (Taylor et al., 1989, 1990a, 1990b); proliferina - éster de forbol/TPA (Mordacq et al., 1989); factor de necrosis tumoral - PMA (Hensel et al., 1989); y gen a de hormona estimulante del tiroides - hormona tiroidea (Chatterjee et al., 1989). No se cree que el promotor particular que se emplea para controlar la expresión de polinucleótidos codificantes de péptidos o proteínas sea crítico, siempre que sea capaz de expresar el polinucleótido en una célula diana, preferentemente una célula bacteriana. Cuando la diana es una célula humana, es preferible situar la región codificante de polinucleótidos adyacente a y bajo el control de un promotor que sea capaz de expresarse en una célula humana. Hablando en general, dicho promotor podría incluir un promotor bacteriano, humano o vírico.

En los casos en que se administra un vector a un sujeto para la expresión de la proteína, se contempla que un promotor deseable para su uso con el vector sea uno que no esté regulado negativamente por citocinas o uno que sea lo suficientemente fuerte para que, incluso si está regulado negativamente, produzca una cantidad eficaz de al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes para inducir una respuesta inmunitaria. Son ejemplos de estos IE de CMV y LTR de VSR. Se pueden usar promotores específicos de tejido, en particular si la expresión está en células en las que es deseable la expresión de un antígeno, tales como una célula dendrítica o macrófagos. Los promotores de MHC I y MHC II de mamíferos son ejemplos de dichos promotores específicos de tejido.

2. Señales de inicio y sitios de unión a ribosomas internos (IRES)

También puede ser necesaria una señal de inicio específica para la traducción eficaz de secuencias codificantes. Estas señales incluyen el codón de inicio ATG o secuencias adyacentes. Puede ser necesario proporcionar señales de control de la traducción exógenas, incluyendo el codón de inicio ATG. Un experto habitual en la materia sería capaz de determinar esto y proporcionar las señales necesarias.

En una divulgación determinada, se utilizan elementos de los sitios internos de entrada al ribosoma (IRES) para crear mensajes multígenos o policistrónicos. Los elementos IRES pueden evitar el modelo de exploración de ribosomas de la traducción dependiente de caperuza metilada □ en 5' y comenzar la traducción en sitios internos (Pelletier y Sonenberg, 1988; Macejak y Sarnow, 1991). Los elementos IRES se pueden ligar a marcos abiertos de lectura heterólogos. Se pueden transcribir juntos múltiples marcos abiertos de lectura, cada uno separado por un IRES, creando mensajes policistrónicos. Se pueden expresar múltiples genes de manera eficaz usando un único promotor/potenciador para transcribir un solo mensaje (véanse las patentes de los Estados Unidos n.° 5.925.565 y 5.935.819).

3. Marcadores seleccionables y detectables

En una divulgación determinada, pueden identificarse células que contienen una construcción de ácido nucleico in vitro o in vivo codificando un marcador seleccionable o detectable en el vector de expresión. Cuando se transcribe y se traduce, un marcador confiere un cambio identificable a la célula permitiendo una fácil identificación de células que contienen el vector de expresión. En general, un marcador seleccionable es uno que confiere una propiedad que permite la selección. Un marcador seleccionable positivo es uno en el que la presencia del marcador permite su selección, mientras que un marcador seleccionable negativo es uno en el que su presencia impide su selección. Un ejemplo de un marcador seleccionable positivo es un marcador de resistencia a fármacos.

B. Células hospedadoras

Como se usa en el presente documento, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" pueden usarse indistintamente. Todas estas expresiones también incluyen su descendencia, que es todas y cada una de las generaciones posteriores. Se entiende que toda la descendencia puede no ser idéntica debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. En el contexto de la expresión de una secuencia de ácido nucleico heteróloga, "célula hospedadora" se refiere a una célula procariota o eucariota e incluye cualquier organismo transformable que sea capaz de replicar un vector o expresar un gen heterólogo codificado por un vector. Una célula hospedadora puede utilizarse, y se ha utilizado, como receptor de vectores o virus. Una célula hospedadora puede ser "transfectada" o "transformada", que se refiere a un proceso por el que el ácido nucleico exógeno, tal como una secuencia codificante de proteína recombinante, se transfiere o se introduce en la célula hospedadora. Una célula transformada incluye la célula objeto principal y su descendencia.

Pueden obtenerse células hospedadoras de procariotas o eucariotas, incluyendo bacterias, células de levadura, células de insecto y células de mamífero para la replicación del vector o la expresión de parte o la totalidad de la o las secuencias de ácido nucleico. Numerosas líneas celulares y cultivos están disponibles para su uso como célula hospedadora y se pueden obtener a través de la colección americana de cultivos tipo (ATCC), que es una organización que actúa como un archivo para cultivos vivos y materiales genéticos (www.atcc.org).

C. Sistemas de expresión

Existen numerosos sistemas de expresión que comprenden al menos una parte o la totalidad de las composiciones analizadas anteriormente. Pueden emplearse sistemas basados en procariotas y/o eucariotas para producir secuencias de ácido nucleico o sus polipéptidos, proteínas y péptidos afines. Muchos de estos sistemas están disponibles en el mercado y de manera extendida.

El sistema de células de insecto/baculovirus puede producir un alto nivel de expresión de proteínas de un segmento de ácido nucleico heterólogo, tal como se describe en las patentes de los Estados Unidos 5.871.986 y 4.879.236, y que se pueden adquirir, por ejemplo, con el nombre MaxBac® 2.0 de Invitrogen® y sistema de expresión de baculovirus BacPack™ de Clontech®.

Además de los sistemas de expresión desvelados, otros ejemplos de sistemas de expresión incluyen el sistema de expresión de mamíferos inducible COMPLETE CONTROL™ de STRATAGENE®, que incluye un receptor sintético inducible por ecdisona, o su sistema de expresión de pET, un sistema de expresión de E. coli. Otro ejemplo de un sistema de expresión inducible está disponible en INVITROGEN®, que porta el sistema T-Rex™ (expresión regulada por tetraciclina), un sistema de expresión de mamífero inducible que utiliza el promotor de CMV de longitud completa. INVITROGEN® también proporciona un sistema de expresión de levadura denominado sistema de expresión de Pichia methanolica, que está diseñado para la producción a alto nivel de proteínas recombinantes en la levadura metilotrófica Pichia methanolica. Un experto en la materia sabría cómo expresar un vector, tal como una construcción de expresión, para producir una secuencia de ácido nucleico o su polipéptido, proteína o péptido afín. III. POLISACÁRIDOS

Las composiciones inmunógenas de la invención pueden comprender además polisacáridos capsulares que incluyen uno o más de PIA (también conocido como PNAG) y/o polisacárido capsular de tipo V y/o tipo VIII de S. aureus y/o polisacárido capsular de tipo I y/o tipo II y/o tipo III de S. epidermidis.

A. PIA (PNAG)

Ahora está claro que las diversas formas de polisacáridos de superficie estafilocócicos identificados como PS/A, PIA y SAA son la misma entidad química: PNAG (Maira-Litran et al., 2004). Por lo tanto, el término PIA o PNAG abarca todos estos polisacáridos u oligosacáridos derivados de ellos.

PIA es una adhesina intercelular de polisacárido y está compuesta de un polímero de glucosamina con enlaces p (1 ^ 6) sustituida con constituyentes de N-acetilo y O-succinilo. Este polisacárido está presente tanto en S. aureus como en S. epidermidis y puede aislarse de cualquier fuente (Joyce et al., 2003; Maira-Litran et al., 2002). Por ejemplo, PNAG puede aislarse de la cepa de S. aureus MN8m (documento WO04/43407). PIA aislado de S. epidermidis es un constituyente integral de la biopelícula. Es responsable de mediar en la adhesión célula-célula y probablemente también actúe para proteger la colonia en crecimiento de la respuesta inmunitaria del hospedador. Recientemente se ha mostrado que el polisacárido anteriormente conocido como poli-N-succinil-p-(1 ^ 6)-glucosamina (PNSG) no tiene la estructura esperada ya que la identificación de N-succinilación era incorrecta (Maira-Litran et al., 2002). Por lo tanto, el término PIA también abarca el polisacárido conocido formalmente como PNSG y que ahora se ha descubierto que es PNAG.

PIA (o PNAG) puede ser de diferentes tamaños que varían de más de 400 kDa a entre 75 y 400 kDa a entre 10 y 75 kDa para oligosacáridos compuestos de hasta 30 unidades repetidas (de glucosamina con enlaces p-(1 ^ 6) sustituida con constituyentes de N-acetilo y O-succinilo). Se puede usar cualquier tamaño de polisacárido u oligosacárido PIA en una composición inmunógena de la invención, en un aspecto, el polisacárido tiene más de 40 kDa. Se puede lograr dimensionamiento mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, por microfluidificación, irradiación ultrasónica o por escisión química (documentos WO 03/53462, EP497524, EP497525). En determinados aspectos, PIA (PNAG) es al menos o como máximo 40-400 kDa, 40-300 kDa, 50-350 kDa, 60­ 300 kDa, 50-250 kDa y 60-200 kDa.

PIA (PNAG) puede tener diferentes grados de acetilación debido a la sustitución de los grupos amino por acetato. PIA producido in vitro está casi completamente sustituido en grupos amino (95-100 %). Como alternativa, se puede usar un PIA desacetilado (PNAG) que tenga menos de 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 % de acetilación. Se prefiere el uso de un PIA desacetilado (PNAG), ya que los epítopos no acetilados de PNAG son eficaces para mediar en la destrucción opsónica de bacterias grampositivas, preferentemente S. aureus y/o S. epidermidis. En determinados aspectos, el PIA (PNAG) tiene un tamaño entre 40 kDa y 300 kDa y está desacetilado de modo que menos del 60 %, 50 %, 40 %, 30 % o 20 % de los grupos amino están acetilados.

La expresión PNAG desacetilado (dPNAG) se refiere a un polisacárido u oligosacárido de PNAG en el que menos del 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 % o 10 % de los grupos amino están acetilados. En determinados aspectos, PNAG se desacetila para formar dPNAG tratando químicamente el polisacárido nativo. Por ejemplo, el PNAG nativo se trata con una solución básica de modo que el pH aumenta a más de 10. Por ejemplo, el PNAG se trata con NaOH, KOH o NH4OH 0,1-5 M, 0,2-4 M, 0,3-3 M, 0,5-2 M, 0,75-1,5 M o 1 M. El tratamiento es durante al menos 10 a 30 minutos, o 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 o 20 horas a una temperatura de 20-100, 25-80, 30-60 o 30-50 o 35-45 °C. El dPNAG se puede preparar como se describe en el documento WO 04/43405.

El o los polisacáridos pueden conjugarse o no conjugarse con una proteína transportadora.

B. Polisacáridos de tipo 5 y tipo 8 de S. aureus

La mayoría de las cepas de S. aureus que provocan infección en el hombre contienen polisacáridos de tipo 5 o tipo 8. Aproximadamente 60 % de las cepas humanas son de tipo 8 y aproximadamente 30 % son de tipo 5. Las estructuras de los antígenos de polisacáridos capsulares de tipo 5 y tipo 8 se describen en Moreau et al., (1990) y Fournier et al., (1984). Ambos tienen FucNAcp en su unidad de repetición, así como ManNAcA que puede utilizarse para introducir un grupo sulfhidrilo. Las estructuras son:

Tipo 5

^4)-p-D-ManNAcA(3OAc)-(1^4)-a-L-FucNAc(1^3)-p-D-FucNAc-(1^

Tipo 8

^3)-p-D-ManNAcA(4OAc)-(1^3)-p-D-FucNAc-(1^3)-p-D-FucNAc-(1^

Recientemente (Jones, 2005), la espectroscopia de RMN ha revisado las estructuras para:

Tipo 5

^4)-p-D-ManNAcA(1^4)-a-L-FucNAc(3OAc)-(1^3)-p-D-FucNAc-(1^

Tipo 8

^3)-p-D-ManNAcA(4OAc)-(1^3)-a-L-FucNAc(1^3)-a-D-FucNAc(1^

Se pueden extraer polisacáridos de la cepa adecuada de S. aureus utilizando un método bien conocido por los expertos en la materia, Véase patente de los Estados Unidos 6.294.177. Por ejemplo, ATCC 12902 es una cepa de S. aureus de tipo 5 y ATCC 12605 es una cepa de S. aureus de tipo 8.

Los polisacáridos son de tamaño nativo o, como alternativa, pueden dimensionarse, por ejemplo, mediante microfluidificación, irradiación ultrasónica o mediante tratamiento químico. La invención también abarca oligosacáridos derivados de los polisacáridos de tipo 5 y 8 de S. aureus. Los polisacáridos de tipo 5 y 8 incluidos en la composición inmunógena de la invención se conjugan preferentemente con una proteína transportadora como se describe a continuación o, como alternativa, no se conjugan. Las composiciones inmunógenas de la invención contienen como alternativa polisacárido de tipo 5 o de tipo 8.

C. Antígeno 336 de S. aureus

La composición inmunógena de la invención puede comprender el antígeno 336 de S. aureus descrito en la patente de los Estados Unidos 6.294.177. El antígeno 336 comprende hexosamina con enlaces p, no contiene grupos O-acetilo y se une específicamente con anticuerpos contra S. aureus tipo 336 depositados en ATCC 55804. El antígeno 336 puede ser un polisacárido que es de tamaño nativo o, como alternativa, puede dimensionarse, por ejemplo, mediante microfluidificación, irradiación ultrasónica o mediante tratamiento químico. La invención también abarca oligosacáridos derivados del antígeno 336. El antígeno 336 puede estar conjugado o no con una proteína transportadora.

D. Polisacáridos de tipo I, II y III de S. epidermidis

Entre los problemas asociados con el uso de polisacáridos en la vacunación, está el hecho de que los polisacáridos en sí mismos son malos inmunógenos. Se prefiere que los polisacáridos estén unidos a un vehículo proteico que proporciona ayuda de linfocitos T espectadores para mejorar la inmunogenicidad.

Los ejemplos de dichos vehículos que pueden conjugarse con inmunógenos de polisacáridos incluyen los toxoides de la difteria y el tétanos (DT, DT CRM197 y TT respectivamente), hemocianina de lapa californiana (KLH) y el derivado proteico purificado de la tuberculina (PPD), exoproteína A de Pseudomonas aeruginosa (rEPA), proteína D de Haemophilus influenzae, neumolisina o fragmentos de cualquiera de los anteriores. Los fragmentos adecuados para su uso incluyen fragmentos que abarcan epítopos T auxiliares. En particular, el fragmento de proteína D de H. influenza contendrá preferentemente el tercio N-terminal de la proteína. La proteína D es una proteína de unión a IgD de Haemophilus influenzae (documento EP 0594 610 B1) y es un inmunógeno potencial. Además, se pueden usar proteínas estafilocócicas como una proteína transportadora en los conjugados de polisacáridos.

Una proteína transportadora que sería particularmente ventajosa para usar en el contexto de una vacuna estafilocócica es el toxoide alfa estafilocócico. La forma nativa puede conjugarse con un polisacárido ya que el proceso de conjugación reduce la toxicidad. Preferentemente, se utilizan toxinas alfa destoxificadas genéticamente tales como las variantes His35Leu o His35Arg como vehículos, ya que la toxicidad residual es menor. Como alternativa, la toxina alfa se destoxifica químicamente mediante tratamiento con un reactivo de reticulación, formaldehído o glutaraldehído. Una toxina alfa destoxificada genéticamente opcionalmente se destoxifica químicamente, preferentemente mediante tratamiento con un reactivo de reticulación, formaldehído o glutaraldehído para reducir adicionalmente la toxicidad.

Los polisacáridos se pueden unir a la proteína o proteínas transportadoras por cualquier método conocido (por ejemplo, los métodos descritos en las patentes de los Estados Unidos n.° 4.372.945, 4.474.757 y 4.356.170). Preferentemente, se lleva a cabo química de conjugación de CDAP (véase el documento WO95/08348). En CDAP, se utiliza preferentemente el reactivo de cianilación tetrafluoroborato de 1-ciano-dimetilaminopiridinio (CDAP) para la síntesis de conjugados de polisacárido-proteína. La reacción de cianilación se puede realizar en condiciones relativamente suaves, lo que evita la hidrólisis de los polisacáridos sensibles a alcalinidad. Esta síntesis permite el acoplamiento directo a una proteína transportadora.

La conjugación implica preferentemente producir un enlace directo entre la proteína transportadora y el polisacárido. Opcionalmente, se puede introducir un espaciador (tal como dihidruro adípico (ADH)) entre la proteína transportadora y el polisacárido.

IV. RESPUESTA Y ENSAYOS INMUNITARIOS

Como se ha analizado anteriormente, la invención se refiere a evocar o inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto contra una coagulasa o uno o más dominios 1-2 de coagulasa o variantes de los mismos. En una realización, la respuesta inmunitaria puede proteger contra o tratar a un sujeto que tiene, se sospecha que tiene o está en riesgo de desarrollar una infección o enfermedad relacionada, en particular, las relacionadas con estafilococos. Un uso de las composiciones inmunógenas de la invención es prevenir infecciones nosocomiales mediante la inoculación de un sujeto antes de someterse a procedimientos en un hospital u otro entorno que tenga un mayor riesgo de infección. A. Inmunoensayos

La presente divulgación incluye la implementación de ensayos serológicos para evaluar si las composiciones de la invención inducen o provocan una respuesta inmunitaria y en qué medida. Existen muchos tipos de inmunoensayos que se pueden implementar. Los inmunoensayos abarcados por la presente divulgación incluyen los descritos en la patente de los Estados Unidos 4.367.110 (ensayo doble de anticuerpos monoclonales de tipo sándwich) y patente de los Estados Unidos 4.452.901 (transferencia de western). Otros ensayos incluyen inmunoprecipitación de ligandos marcados e inmunocitoquímica, tanto in vitro como in vivo.

Los inmunoensayos son en general ensayos de unión. Determinados inmunoensayos preferidos son los diversos tipos de ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) y radioinmunoensayos (RIA) conocidos en la técnica. La detección inmunohistoquímica con el uso de secciones tisulares también es particularmente útil. En un ejemplo, los anticuerpos o antígenos se inmovilizan en una superficie seleccionada, tal como un pocillo en una placa de microtitulación de poliestireno, tira reactiva o soporte de columna. Después, se añade a los pocillos una composición de prueba que se sospecha que contiene el antígeno o anticuerpo deseado, tal como una muestra clínica. Después de unir y lavar para eliminar los complejos inmunitarios unidos de manera inespecífica, se puede detectar el antígeno o anticuerpo unido. En general, se logra detección mediante la adición de otro anticuerpo, específico para el antígeno o anticuerpo deseado, que está ligado a un marcador detectable. Este tipo de ELISA se conoce como "ELISA de tipo sándwich". También se puede lograr detección mediante la adición de un segundo anticuerpo específico para el antígeno deseado, seguido de la adición de un tercer anticuerpo que tenga afinidad de unión por el segundo anticuerpo, estando el tercer anticuerpo ligado a un marcador detectable.

Los ELISA de competición también son posibles implementaciones en las que las muestras de prueba compiten por unirse con cantidades conocidas de antígenos o anticuerpos marcados. La cantidad de especies reactivas en la muestra desconocida se determina mezclando la muestra con las especies marcadas conocidas antes o durante la incubación con pocillos recubiertos. La presencia de especies reactivas en la muestra actúa para reducir la cantidad de especies marcadas disponibles para unirse al pocillo y, por tanto, reduce la señal final. Independientemente del formato empleado, los ELISA tienen determinadas características en común, tales como el recubrimiento, la incubación o la unión, el lavado para eliminar especies unidas de manera inespecífica y detección de los complejos inmunitarios unidos.

El antígeno o los anticuerpos también pueden estar ligados a un soporte sólido, tal como en forma de placa, perlas, tira reactiva, membrana o matriz de columna, y la muestra para analizar se aplica al antígeno o anticuerpo inmovilizado. Al recubrir una placa con antígeno o anticuerpo, en general se incuban los pocillos de la placa con una solución del antígeno o anticuerpo, ya sea durante una noche o durante un periodo específico. Los pocilios de la placa se lavarán después para eliminar el material adsorbido de manera incompleta. Cualquier superficie disponible restante de los pocillos se "recubre" después con una proteína inespecífica que es antigénicamente neutra con respecto a los antisueros de prueba. Estos incluyen seroalbúmina bovina (BSA), caseína y soluciones de leche en polvo. El recubrimiento permite el bloqueo de sitios de adsorción inespecíficos en la superficie de inmovilización y, por tanto, reduce la actividad de fondo provocada por la unión inespecífica de antisueros a la superficie.

B. Diagnóstico de infección bacteriana

Además del uso de proteínas, polipéptidos y/o péptidos, así como anticuerpos que se unen a estos polipéptidos, proteínas y/o péptidos, para tratar o prevenir la infección como se ha descrito anteriormente, la presente divulgación contempla el uso de estos polipéptidos, proteínas, péptidos y/o anticuerpos de diversas maneras, incluyendo la detección de la presencia de estafilococos para diagnosticar una infección, ya sea en un paciente o en un equipo médico que también puede infectarse. De acuerdo con la divulgación, un método preferido para detectar la presencia de infecciones implica las etapas de obtener una muestra que se sospecha que está infectada por una o más especies o cepas de bacterias estafilocócicas, tal como una muestra tomada de un individuo, por ejemplo, de la sangre, saliva, tejidos, hueso, músculo, cartílago o piel de uno. Tras el aislamiento de la muestra, pueden llevarse a cabo ensayos de diagnóstico que utilizan los polipéptidos, proteínas, péptidos y/o anticuerpos para detectar la presencia de estafilococos y dichas técnicas de ensayo para determinar dicha presencia en una muestra son bien conocidas por los expertos en la materia e incluyen métodos tales como radioinmunoensayo, análisis de transferencia de Western y ensayos ELISA. En general, se contempla un método para diagnosticar una infección en donde a una muestra que se sospecha que está infectada con estafilococos se le ha añadido el polipéptido, proteína, péptido, anticuerpo o anticuerpo monoclonal y los estafilococos están indicados por la unión del anticuerpo a los polipéptidos, proteínas y/o péptidos, o polipéptidos, proteínas y/o péptidos que se unen con los anticuerpos en la muestra.

En consecuencia, pueden utilizarse anticuerpos para la prevención de la infección por bacterias estafilocócicas (es decir, inmunización pasiva), para el tratamiento de una infección en curso o para su uso como herramientas de investigación. El término "anticuerpos" como se usa en el presente documento incluye anticuerpos monoclonales, policlonales, quiméricos, monocatenarios, biespecíficos, simianizados y humanizados o primatizados, así como fragmentos Fab, tales como los fragmentos que mantienen la especificidad de unión de los anticuerpos, incluyendo los productos de una biblioteca de expresión de inmunoglobulina Fab. En consecuencia, la divulgación contempla el uso de cadenas individuales tales como las cadenas pesadas y ligeras variables de los anticuerpos. La generación de cualquiera de estos tipos de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos es bien conocida por los expertos en la materia. Se pueden encontrar ejemplos específicos de la generación de un anticuerpo contra una proteína bacteriana en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos n.° 20030153022.

Cualquiera de los polipéptidos, proteínas, péptidos y/o anticuerpos descritos anteriormente pueden marcarse directamente con un marcador detectable para la identificación y cuantificación de bacterias estafilocócicas. Los marcadores para su uso en inmunoensayos son generalmente conocidos por los expertos en la materia e incluyen enzimas, radioisótopos y sustancias fluorescentes, luminiscentes y cromógenas, incluyendo partículas de colores tales como oro coloidal o perlas de látex. Los inmunoensayos adecuados incluyen ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA).

C. Inmunidad protectora

Las composiciones proteicas pueden conferir inmunidad protectora a un sujeto. La inmunidad protectora se refiere a la capacidad del cuerpo para montar una respuesta inmunitaria específica que protege al sujeto de desarrollar una enfermedad o afección en particular que implique al agente contra el que hay una respuesta inmunitaria. Una cantidad inmunogénicamente eficaz es capaz de conferir inmunidad protectora al sujeto.

Como se usa en el presente documento en la memoria descriptiva y en la sección de reivindicaciones a continuación, el término polipéptido o péptido se refiere a un tramo de aminoácidos unidos covalentemente entre sí a través de enlaces peptídicos. Diferentes polipéptidos tienen diferentes funcionalidades según la presente invención. Aunque según un aspecto, un polipéptido se obtiene de un inmunógeno diseñado para inducir una respuesta inmunitaria activa en un receptor, según otro aspecto, un polipéptido se obtiene de un anticuerpo que resulta después de la inducción de una respuesta inmunitaria activa en, por ejemplo, un animal, y que puede servir para inducir una respuesta inmunitaria pasiva en el receptor. En ambos casos, sin embargo, el polipéptido está codificado por un polinucleótido según cualquier posible uso codónico.

Como se usa en el presente documento, la expresión "respuesta inmunitaria" o su equivalente "respuesta inmunológica" se refiere al desarrollo de una respuesta humoral (mediada por anticuerpos), celular (mediada por linfocitos T específicos de antígeno o sus productos de secreción) o tanto humoral como celular dirigida contra una proteína, péptido, carbohidrato o polipéptido en un paciente receptor. Dicha respuesta puede ser una respuesta activa inducida por la administración de inmunógeno o una respuesta pasiva inducida por la administración de un anticuerpo, material que contiene anticuerpos o linfocitos T sensibilizados. La presentación de epítopos polipeptídicos en asociación con moléculas del MHC de clase I o clase II induce una respuesta inmunitaria celular, para activar linfocitos T auxiliares CD4 (+) específicos de antígeno y/o linfocitos T citotóxicos CD8 (+). La respuesta también puede implicar la activación de monocitos, macrófagos, linfocitos NK, basófilos, células dendríticas, astrocitos, células de la microglía, eosinófilos u otros componentes de la inmunidad innata. Como se usa en el presente documento, la "inmunidad activa" se refiere a cualquier inmunidad conferida a un sujeto mediante la administración de un antígeno.

Como se usa en el presente documento, la "inmunidad pasiva" se refiere a cualquier inmunidad conferida a un sujeto sin administración de un antígeno al sujeto. Por lo tanto, la "inmunidad pasiva" incluye la administración de efectores inmunitarios activados que incluyen mediadores celulares o mediadores de proteínas (p. ej., anticuerpos monoclonales y/o policlonales) de una respuesta inmunitaria. Se puede usar una composición de anticuerpo monoclonal o policlonal en la inmunización pasiva para la prevención o el tratamiento de la infección por organismos que portan el antígeno reconocido por el anticuerpo. Una composición de anticuerpos puede incluir anticuerpos que se unen a diversos antígenos que a su vez pueden estar asociados con diversos organismos. El componente de anticuerpo puede ser un antisuero policlonal. En determinados aspectos, el anticuerpo o anticuerpos se purifican por afinidad a partir de un animal o segundo sujeto que se ha expuesto a un antígeno o antígenos. Como alternativa, se puede usar una mezcla de anticuerpos, que es una mezcla de anticuerpos monoclonales y/o policlonales contra antígenos presentes en microbios u organismos iguales, relacionados o diferentes, tales como bacterias grampositivas, bacterias gramnegativas, incluyendo bacterias estafilococos.

Se puede transmitir inmunidad pasiva a un paciente o sujeto mediante la administración al paciente de inmunoglobulinas (Ig) y/u otros factores inmunitarios obtenidos de un donante u otra fuente distinta de paciente que tenga una inmunorreactividad conocida. En otros aspectos, una composición antigénica de la presente invención se puede administrar a un sujeto que después actúa como fuente o donante de globulina, producida en respuesta a la exposición con la composición antigénica ("globulina hiperinmunitaria"), que contiene anticuerpos dirigidos contra Staphylococcus u otro organismo. Un sujeto tratado de este modo donaría plasma del que después se obtendría globulina hiperinmunitaria, mediante metodología convencional de fraccionamiento de plasma, y que se administraría a otro sujeto para transmitir resistencia contra o tratar la infección por estafilococos. Las globulinas hiperinmunitarias son particularmente útiles para individuos inmunodeprimidos, para individuos que se someten a procedimientos invasivos o donde el tiempo no permite que el individuo produzca sus propios anticuerpos en respuesta a la vacunación. Véase patentes de los Estados Unidos 6.936.258, 6.770.278, 6.756.361, 5.548.066, 5.512.282, 4.338.298 y 4.748.018 para métodos y composiciones ilustrativos relacionados con la inmunidad pasiva.

Para los fines de la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las expresiones "epítopo" y "determinante antigénico" se usan indistintamente para hacer referencia a un sitio en un antígeno al que los términos B y/o T responden o reconocen. Los epítopos de linfocitos B pueden formarse tanto a partir de aminoácidos contiguos como a partir de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante el plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos normalmente están conservados frente a la exposición a disolventes desnaturalizantes mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario normalmente se pierden tras el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo incluye normalmente al menos 3 y, más habitualmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única. Los métodos para determinar la conformación espacial de los epítopos incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos x y resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, p. ej., Epitope Mapping Protocols (1996). Pueden identificarse anticuerpos que reconocen el mismo epítopo en un inmunoensayo sencillo que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana. Los linfocitos T reconocen epítopos continuos de aproximadamente nueve aminoácidos para células CD8 o aproximadamente 13-15 aminoácidos para células CD4. Los linfocitos T que reconocen el epítopo pueden identificarse mediante ensayos in vitro que miden la proliferación dependiente de antígeno, según lo determinado mediante incorporación de 3H-timidina por linfocitos T sensibilizados en respuesta a un epítopo (Burke et al., 1994), mediante destrucción dependiente de antígeno (ensayo de linfocitos T citotóxicos, Tigges et al., 1996) o mediante secreción de citocinas.

La presencia de una respuesta inmunológica mediada por células se puede determinar mediante ensayos de proliferación (linfocitos T CD4 (+)) o ensayos de CTL (linfocitos T citotóxicos). Las contribuciones relativas de las respuestas humorales y celulares al efecto protector o terapéutico de un inmunógeno se pueden distinguir aislando por separado IgG y linfocitos T de un animal singénico inmunizado y midiendo el efecto protector o terapéutico en un segundo sujeto.

Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones, los términos "anticuerpo" o "inmunoglobulina" se usan indistintamente y se refieren a cualquiera de varias clases de proteínas relacionadas estructuralmente que actúan como parte de la respuesta inmunitaria de un animal o receptor, proteínas que incluyen IgG, IgD, IgE, IgA, IgM y proteínas relacionadas.

En condiciones fisiológicas normales, se encuentran anticuerpos en el plasma y otros líquidos corporales y en la membrana de determinadas células y son producidos por linfocitos del tipo denominado linfocitos B o su equivalente funcional. Los anticuerpos de la clase IgG están compuestos por cuatro cadenas polipeptídicas unidas entre sí por enlaces disulfuro. Las cuatro cadenas de moléculas de IgG intactas son dos cadenas pesadas idénticas denominadas cadenas H y dos cadenas ligeras idénticas denominadas cadenas L.

Para producir anticuerpos policlonales, un hospedador, tal como un conejo o una cabra, se inmuniza con el antígeno o fragmento de antígeno, en general con un adyuvante y, si es necesario, acoplado a un vehículo. Se recogen posteriormente anticuerpos contra el antígeno de los sueros del hospedador. El anticuerpo policlonal puede purificarse por afinidad contra el antígeno haciéndolo monoespecífico.

Se pueden producir anticuerpos monoclonales mediante hiperinmunización de un donante adecuado con el antígeno o ex vivo mediante el uso de cultivos primarios de células esplénicas o líneas celulares procedentes del bazo (Anavi, 1998; Huston et al., 1991; Johnson et al., 1991; Mernaugh et al., 1995).

Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones, la expresión "una parte inmunológica de un anticuerpo" incluye un fragmento Fab de un anticuerpo, un fragmento Fv de un anticuerpo, una cadena pesada de un anticuerpo, una cadena ligera de un anticuerpo, un heterodímero que consiste en una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo, un fragmento variable de una cadena ligera de un anticuerpo, un fragmento variable de una cadena pesada de un anticuerpo y una variante de cadena sencilla de un anticuerpo, que también se conoce como scFv. Además, el término incluye inmunoglobulinas quiméricas que son los productos de expresión de genes fusionados procedentes de diferentes especies, una de las especies puede ser un ser humano, en cuyo caso se dice que una inmunoglobulina quimérica está humanizada. Normalmente, una parte inmunológica de un anticuerpo compite con el anticuerpo intacto del que se obtuvo por la unión específica a un antígeno.

Opcionalmente, un anticuerpo o preferentemente una parte inmunológica de un anticuerpo, puede conjugarse químicamente, o expresarse como, una proteína de fusión con otras proteínas. Para los fines de la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, todas estas proteínas fusionadas se incluyen en la definición de anticuerpos o una parte inmunológica de un anticuerpo.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "agente inmunógeno" o "inmunógeno" o "antígeno" se usan indistintamente para describir una molécula capaz de inducir una respuesta inmunológica contra sí misma tras su administración a un receptor, ya sea sola, junto con un adyuvante o presentada en un vehículo de presentación. D. Métodos de tratamiento

Un método de la presente divulgación incluye el tratamiento de una enfermedad o afección provocada por un patógeno estafilococo. Se puede administrar un polipéptido inmunógeno para inducir una respuesta inmunitaria en una persona infectada con estafilococo o que se sospecha que ha estado expuesta a estafilococo. Se pueden emplear métodos con respecto a individuos que han dado resultado positivo para exposición al estafilococo o que se consideran en riesgo de infección en función de una posible exposición. La presente invención se refiere a una cantidad eficaz de una composición de la invención para su uso en un método para tratar o prevenir una infección estafilocócica en un sujeto. En una realización preferida, el sujeto se trata en función de una prueba que indica infección estafilocócica.

En particular, se desvela un método de tratamiento para la infección estafilocócica, en particular, infecciones nosocomiales adquiridas en el hospital. Las composiciones inmunógenas y las vacunas de la invención son particularmente ventajosas para usar en casos de cirugía programada. Dichos pacientes conocerán la fecha de la cirugía por adelantado y podrían ser inoculados con anticipación. Las composiciones inmunógenas y las vacunas de la invención también son ventajosas para usar para inocular a profesionales sanitarios.

En algunas realizaciones de la composición inmunogénica para su uso, el tratamiento se administra en presencia de adyuvantes o vehículos u otros antígenos estafilocócicos. Asimismo, en algunos ejemplos, el tratamiento comprende la administración de otros agentes utilizados habitualmente contra la infección bacteriana, tales como uno o más antibióticos.

El uso de péptidos para la vacunación puede requerir, aunque no necesariamente, la conjugación del péptido con una proteína transportadora inmunógena, tal como el antígeno de superficie de la hepatitis B, hemocianina de lapa californiana o seroalbúmina bovina. Se conocen bien en la técnica métodos para realizar esta conjugación.

V. VACUNA Y OTRAS COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y ADMINISTRACIÓN

A. Vacunas

La presente invención incluye métodos para prevenir o aliviar infecciones estafilocócicas, en particular infecciones nosocomiales adquiridas en el hospital. La presente invención se refiere a una cantidad eficaz de una composición de la invención para su uso en un método para tratar o prevenir una infección estafilocócica en un sujeto. Como tal, la invención contempla vacunas para su uso en realizaciones de inmunización tanto activa como pasiva. Las composiciones inmunógenas, que se ha propuesto que son adecuadas para su uso como vacuna, pueden prepararse a partir de coagulasas inmunógenas o un fragmento de las mismas o una variante de las mismas como se especifica en las reivindicaciones. Las coagulasas, un fragmento de las mismas o una variante de las mismas, pueden usarse en combinación con otras proteínas de virulencia secretadas, proteínas de superficie o fragmentos inmunógenos de las mismas. En determinados aspectos, el material antigénico se dializa ampliamente para eliminar las moléculas de pequeño peso molecular no deseadas y/o se liofiliza para una formulación más fácil en un vehículo deseado.

Otras opciones para una vacuna basada en proteínas/péptidos implican la introducción de ácidos nucleicos que codifican el o los antígenos como vacunas de ADN. A este respecto, informes recientes han descrito la construcción de virus vaccinia recombinantes que expresan 10 epítopos contiguos mínimos de CTL (Thomson, 1996) o una combinación de epítopos de linfocitos B, linfocitos T citotóxicos (CTL) y T auxiliares (Th) de varios microbios (An, 1997), y el uso exitoso de dichas construcciones para inmunizar ratones para preparar respuestas inmunitarias protectoras. Por tanto, existen abundantes pruebas en la bibliografía para la utilización exitosa de péptidos, células presentadoras de antígenos (APC) con pulsos de péptidos y construcciones que codifican péptidos para una sensibilización in vivo eficaz de las respuestas inmunitarias protectoras. El uso de secuencias de ácido nucleico como vacunas se ilustra en las patentes de los Estados Unidos 5.958.895 y 5.620.896.

La preparación de vacunas que contienen secuencia o secuencias de polipéptidos o péptidos como principios activos generalmente se entiende bien en la técnica, como se ilustra en las patentes de los Estados Unidos 4.608.251; 4.601.903; 4.599.231; 4.599.230; 4.596.792; y 4.578.770. Normalmente, dichas vacunas se preparan como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas: también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido, antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse. El principio activo inmunógeno se mezcla con frecuencia con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el principio activo. Son excipientes adecuados, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la vacuna puede contener cantidades de sustancias adyuvantes tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes del pH o adyuvantes que mejoran la eficacia de las vacunas. En realizaciones específicas, las vacunas se formulan con una combinación de sustancias, como se describe en las patentes de los Estados Unidos 6.793.923 y 6.733.754.

Las vacunas pueden administrarse convencionalmente por vía parenteral, mediante inyección, por ejemplo, por vía subcutánea o por vía intramuscular. Las formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios y, en algunos casos, formulaciones orales. Para los supositorios, los aglutinantes y vehículos tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialquilenglicoles o triglicéridos: dichos supositorios se pueden formar a partir de mezclas que contienen el principio activo en el intervalo de aproximadamente 0,5 % a aproximadamente 10 %, preferentemente de aproximadamente 1 % a aproximadamente 2 %. Las formulaciones orales incluyen excipientes normalmente empleados tales como, por ejemplo, usos farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones adoptan la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos y contienen de aproximadamente 10 % a aproximadamente 95 % de principio activo, preferentemente de aproximadamente 25 % a aproximadamente 70 %.

Los polipéptidos y las construcciones de ADN codificantes de polipéptidos pueden formularse en una vacuna como formas neutras o salinas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácidos (formadas con los grupos amino libres del péptido) y las que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares.

Normalmente, las vacunas se administran de manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz e inmunógena. La cantidad para administrar depende del sujeto que se va a tratar, incluyendo la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos y el grado de protección deseado. Las cantidades precisas de principio activo que es necesario administrar dependen del criterio del facultativo. Sin embargo, los intervalos de dosificación adecuados son del orden de varios cientos de microgramos de principio activo por vacunación. Los regímenes adecuados para la administración inicial y las dosis de refuerzo también son variables, pero se tipifican por una administración inicial seguida de inoculaciones posteriores u otras administraciones.

La forma de aplicación puede variar ampliamente. Se puede utilizar cualquiera de los métodos convencionales para la administración de una vacuna. Se cree que estos incluyen la aplicación oral dentro de una base sólida fisiológicamente aceptable o en una dispersión fisiológicamente aceptable, por vía parenteral, por inyección y similares. La dosificación de la vacuna dependerá de la vía de administración y variará según el tamaño y la salud del sujeto.

En determinados casos, será deseable tener múltiples administraciones de la vacuna, p. ej., 2, 3, 4, 5, 6 o más administraciones. Las vacunas pueden ser a intervalos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 a 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 semanas, incluyendo todos los intervalos entre ellos. Los refuerzos periódicos a intervalos de 1-5 años serán deseables para mantener los niveles protectores de los anticuerpos. La evolución de la inmunización puede seguirse mediante ensayos de anticuerpos contra los antígenos, como se describe en las patentes de los Estados Unidos 3.791.932; 4.174.384 y 3.949.064.

1. Vehículos

Una composición dada puede variar en su inmunogenicidad. Por lo tanto, es con frecuencia necesario reforzar el sistema inmunitario del hospedador, como se puede lograr mediante el acoplamiento de un péptido o polipéptido a un vehículo. Son vehículos ilustrativos y preferidos la hemocianina de lapa californiana (KLH) y la seroalbúmina bovina (BSA). También se pueden usar otras albúminas tales como ovoalbúmina, seroalbúmina de ratón o seroalbúmina de conejo como vehículos. Se conocen bien en la técnica medios para conjugar un polipéptido con una proteína transportadora e incluyen glutaraldehído, éster de m-maleimidobencoil-W-hidroxisuccinimida, carbodiimida y bencidina bis-biazotizada.

2. Adyuvantes

La inmunogenicidad de composiciones de polipéptidos o péptidos se puede mejorar mediante el uso de estimulantes inespecíficos de la respuesta inmunitaria, conocidos como adyuvantes. Los adyuvantes adecuados incluyen todos los compuestos inmunoestimulantes aceptables, tales como citocinas, toxinas o composiciones sintéticas. Se pueden usar varios adyuvantes para mejorar la respuesta de anticuerpos contra una coagulasa y/o su variante, tales como uno o más dominios 1-2 de coagulasa, o cualquier otra proteína bacteriana o combinación contemplada en el presente documento. Los adyuvantes pueden (1) inmovilizar el antígeno en el cuerpo para provocar una liberación lenta; (2) atraer células implicadas en la respuesta inmunitaria al sitio de administración; (3) inducir la proliferación o activación de células del sistema inmunitario; o (4) mejorar la propagación del antígeno por todo el cuerpo del sujeto. Los adyuvantes incluyen emulsiones de aceite en agua, emulsiones de agua en aceite, sales minerales, polinucleótidos y sustancias naturales. Los adyuvantes específicos que pueden usarse incluyen IL-1, IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, interferón ^y, GMCSP, BCG, sales de aluminio, tales como hidróxido de aluminio u otro compuesto de aluminio, compuestos de Md P, tales como thur-MDP y nor-MDP, CGP (MTP-PE), lípido A y monofosforil lípido A (MPL). RIBI, que contiene tres componentes extraídos de bacterias, MPL, dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de la pared celular (CWS) en una emulsión de escualeno/Tween 80 al 2 %. Se pueden usar incluso antígenos del MHC. Otros adyuvantes o métodos se ilustran en las patentes de los Estados Unidos 6.814.971, 5.084.269, 6.656.462).

Diversos métodos para lograr el efecto adyuvante de la vacuna incluyen el uso de agentes tales como hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio (alumbre), utilizados habitualmente como una solución de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,1 % en solución salina tamponada con fosfato, mezcla con polímeros sintéticos de azúcares (Carbopol®) utilizados como una solución de aproximadamente 0,25 %, agregación de la proteína en la vacuna mediante tratamiento térmico con temperaturas que varían entre aproximadamente 70 ° y aproximadamente 101 °C durante un periodo de 30 segundos a 2 minutos, respectivamente. Para producir un efecto adyuvante, también puede emplearse agregación mediante reactivación con anticuerpos (Fab) tratados con pepsina contra la albúmina; una mezcla con células bacterianas (p. ej., C. parvum), componentes de endotoxinas o lipopolisacáridos de bacterias gramnegativas; una emulsión en vehículos oleaginosos fisiológicamente aceptables (p. ej., mono-oleato de manida (Aracel A)); o una emulsión con una solución al 20 % de un perfluorocarburo (Fluosol-DA®) utilizada como sustituto en bloque.

Los adyuvantes ilustrativos y, con frecuencia, preferidos incluyen adyuvante completo de Freund (un estimulante inespecífico de la respuesta inmunitaria que contiene Mycobacterium tuberculosis muerta), adyuvantes incompletos de Freund e hidróxido de aluminio.

En algunos aspectos, se prefiere que el adyuvante se seleccione para ser un inductor preferencial de un tipo de respuesta Th1 o Th2. Niveles altos de citocinas de tipo Th1 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunitarias mediadas por células a un antígeno dado, mientras que niveles altos de citocinas de tipo Th2 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunitarias humorales al antígeno.

La distinción de la respuesta inmunitaria de tipo Th1 y Th2 no es absoluta. En realidad, un individuo apoyará una respuesta inmunitaria que se describe como predominantemente Th1 o predominantemente Th2. Sin embargo, con frecuencia es conveniente considerar las familias de citocinas con respecto a lo descrito en clones de linfocitos T CD4+ murinas por Mosmann y Coffman (Mosmann y Coffman, 1989). Tradicionalmente, las respuestas de tipo Th1 están asociadas con la producción de las citocinas INF-^y e IL-2 por linfocitos T. Otras citocinas con frecuencia directamente asociadas con la inducción de respuestas inmunitarias de tipo Th1 no son producidas por linfocitos T, tales como IL-12. Por el contrario, las respuestas de tipo Th2 están asociadas con la secreción de IL-4, IL-5, IL-6, IL-10.

Además de los adyuvantes, puede ser deseable administrar conjuntamente modificadores de la respuesta biológica (BRM) para mejorar las respuestas inmunitarias. Se ha mostrado que los BRM regulan positivamente la inmunidad de linfocitos T o regulan negativamente la actividad de células supresoras. Dichos BRM incluyen cimetidina (ClM; 1200 mg/d) (Smith/Kline, PA); o dosis bajas de ciclofosfamida (CYP; 300 mg/m2) (Johnson/Mead, NJ) y citocinas tales como interferón ^y, IL-2 o IL-12 o genes que codifican proteínas implicadas en funciones inmunitarias auxiliares, tales como B-7.

B. Componentes y restos lipídicos

En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden uno o más lípidos asociados con un ácido nucleico o un polipéptido/péptido. Un lípido es una sustancia que es insoluble en agua y extraíble con un disolvente orgánico. Un experto en la materia entiende los compuestos distintos de los descritos específicamente en el presente documento como lípidos y estos están abarcados por las composiciones de la presente invención. Un componente lipídico y uno no lipídico pueden estar unidos entre sí, de manera covalente o no covalente.

Un lípido puede ser un lípido de origen natural o un lípido sintético. Sin embargo, un lípido es habitualmente una sustancia biológica. Se conocen bien en la técnica lípidos biológicos e incluyen, por ejemplo, grasas neutras, fosfolípidos, fosfoglicéridos, esteroides, terpenos, lisolípidos, glucoesfingolípidos, glucolípidos, sulfatidas, lípidos con éter y ácidos grasos con enlaces de éster y lípidos polimerizables, y combinaciones de los mismos.

Una molécula de ácido nucleico o un polipéptido/péptido, asociado con un lípido, puede dispersarse en una solución que contenga un lípido, disolverse con un lípido, emulsionarse con un lípido, mezclarse con un lípido, combinarse con un lípido, unirse covalentemente a un lípido, estar contenido como una suspensión en un lípido o asociado de otra manera con un lípido. Una composición asociada a lípidos o poxvirus-lípidos no está limitada a ninguna estructura en particular. Por ejemplo, también puede estar simplemente intercalada en una solución, posiblemente formando agregados que no son uniformes en cuanto a su tamaño o forma. En otro ejemplo, pueden estar presente en una estructura de bicapa, como micelas, o con una estructura "colapsada". En otro ejemplo, también se contempla un complejo de lipofectamina (Gibco BRL)-poxvirus o Superfect (Qiagen)-poxvirus.

En determinadas realizaciones, una composición puede comprender aproximadamente 1 %, aproximadamente 2 %, aproximadamente 3 %, aproximadamente 4 %, aproximadamente 5 %, aproximadamente 6 %, aproximadamente 7 %, aproximadamente 8 %, aproximadamente 9 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 11 %, aproximadamente 12 %, aproximadamente 13 %, aproximadamente 14 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 16 %, aproximadamente 17 %, aproximadamente 18 %, aproximadamente 19 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 21 %, aproximadamente 22 %, aproximadamente 23 %, aproximadamente 24 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 26 %, aproximadamente 27 %, aproximadamente 28 %, aproximadamente 29 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 31 %, aproximadamente 32 %, aproximadamente 33 %, aproximadamente 34 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 36 %, aproximadamente 37 %, aproximadamente 38 %, aproximadamente 39 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 41 %, aproximadamente 42 %, aproximadamente 43 %, aproximadamente 44 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 46 %, aproximadamente 47 %, aproximadamente 48 %, aproximadamente 49 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 51 %, aproximadamente 52 %, aproximadamente 53 %, aproximadamente 54 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente 56 %, aproximadamente 57 %, aproximadamente 58 %, aproximadamente 59 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 61 %, aproximadamente 62 %, aproximadamente 63 %, aproximadamente 64 %, aproximadamente 65 %, aproximadamente 66 %, aproximadamente 67 %, aproximadamente 68 %, aproximadamente 69 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 71 %, aproximadamente 72 %, aproximadamente 73 %, aproximadamente 74 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 76 %, aproximadamente 77 %, aproximadamente 78 %, aproximadamente 79 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 81 %, aproximadamente 82 %, aproximadamente 83 %, aproximadamente 84 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 86 %, aproximadamente 87 %, aproximadamente 88 %, aproximadamente 89 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 % o cualquier intervalo entre ellos, de un lípido, tipo de lípido o componente no lipídico particular, tal como un adyuvante, antígeno, péptido, polipéptido, azúcar, ácido nucleico u otro material desvelado en el presente documento o como conocería un experto en la materia. Una composición puede comprender de aproximadamente 10 % a aproximadamente 20 % de lípidos neutros y de aproximadamente 33 % a aproximadamente 34 % de un cerebrósido, y aproximadamente 1 % de colesterol. Un liposoma puede comprender de aproximadamente 4 % a aproximadamente 12 % de terpenos, en donde aproximadamente 1 % de la micela es específicamente licopeno, dejando de aproximadamente 3 % a aproximadamente 11 % del liposoma que comprende otros terpenos; y de aproximadamente 10 % a aproximadamente 35 % de fosfatidilcolina y aproximadamente 1 % de un componente no lipídico. Por tanto, se contempla que las composiciones de la presente invención pueden comprender cualquiera de los lípidos, tipos de lípidos u otros componentes, en cualquier combinación o intervalo de porcentajes.

C. Terapia combinada

Las composiciones de la presente invención, en particular para su uso en la administración de un factor de virulencia secretado o proteína de superficie, incluyendo un dominio 1-2 de coagulasa o una variante del mismo, y/u otros péptidos o proteínas bacterianos para un paciente/sujeto, también se pueden utilizar en combinación con la administración de terapias tradicionales. Estas incluyen la administración de antibióticos tales como estreptomicina, ciprofloxacina, doxiciclina, gentamicina, cloranfenicol, trimetoprim, sulfametoxazol, ampicilina, tetraciclina o diversas combinaciones de antibióticos.

En un aspecto, se contempla que una vacuna polipeptídica se use junto con un tratamiento antibacteriano. Como alternativa, la terapia puede preceder o seguir al tratamiento del otro agente en intervalos que varían de minutos a semanas. En realizaciones donde los otros agentes y/o proteínas o polinucleótidos se administran por separado, se garantizaría, en general, que no pasara un periodo de tiempo significativo entre el momento de cada suministro, de manera que el agente y la composición antigénica aún pudieran ejercer un efecto combinado ventajoso en el sujeto. En dichos casos, se contempla que se puedan administrar ambas modalidades en un intervalo de aproximadamente 12-24 h entre sí o en un intervalo de aproximadamente 6-12 h entre sí. En algunas situaciones, puede ser conveniente prolongar de manera significativa el periodo de tiempo de la administración, cuando transcurren de varios días (2, 3, 4, 5, 6 o 7) a varias semanas (1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) entre las administraciones respectivas.

Se pueden emplear diversas combinaciones, por ejemplo, la terapia con antibióticos es "A" y la molécula inmunógena administrada como parte de un régimen de inmunoterapia, tal como un antígeno, es "B":

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B

B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A

B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A

La administración de las composiciones inmunógenas de la presente invención a un paciente/sujeto, seguirá protocolos generales para la administración de dichos compuestos, teniendo en cuenta la toxicidad, si la hubiera, de la composición de los dominios 1-2 de coagulasa u otras composiciones descritas en el presente documento. Se espera que los ciclos de tratamiento se repitan según sea necesario. También se contempla que diversas terapias convencionales, tales como hidratación, puedan aplicarse en combinación con la terapia descrita.

D. Composiciones farmacéuticas generales

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se administran a un sujeto. Diferentes aspectos de la presente invención implican administrar una cantidad eficaz de una composición a un sujeto. En algunas realizaciones de la presente invención, antígenos estafilocócicos, miembros de la ruta de Ess, incluyendo polipéptidos o péptidos de la clase Esa o Esx y/o miembros de sustratos de sortasa pueden administrarse al paciente para proteger contra la infección por uno o más patógenos de estafilococos. Como alternativa, un vector de expresión que codifica uno o más de dichos polipéptidos o péptidos puede administrarse a un paciente como tratamiento preventivo. Adicionalmente, dichos compuestos pueden administrarse en combinación con un antibiótico o un antibacteriano. Dichas composiciones se disolverán o dispersarán en general en un vehículo o medio acuoso farmacéuticamente aceptable.

Además de los compuestos formulados para administración parenteral, tales como los de inyección intravenosa o intramuscular, otras formas farmacéuticamente aceptables incluyen, p. ej., comprimidos u otros sólidos para administración oral; cápsulas de liberación temporalizada; y cualquier otra forma usada en la actualidad, incluyendo cremas, lociones, enjuagues bucales, inhalantes y similares.

Los compuestos activos pueden formularse para administración parenteral, p. ej., formulados para inyección por las vías intravenosa, intramuscular, subcutáneas o incluso intraperitoneales. Los expertos en la materia conocerán la preparación de una composición acuosa que contiene un compuesto o compuestos que aumentan la expresión de una molécula del MHC de clase I a la luz de la presente divulgación. Normalmente, dichas composiciones pueden prepararse como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para su uso para preparar soluciones o suspensiones tras la adición de un líquido antes de la inyección; y las preparaciones también pueden emulsionarse.

Pueden prepararse soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables en agua mezclada adecuadamente con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y mezclas de los mismos, y en aceites.

En condiciones habituales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles; formulaciones que incluyen aceite de sésamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso; y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que pueda inyectarse fácilmente. Debería ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos.

Las composiciones proteicas pueden formularse en forma neutra o salina. Las sales farmacéuticamente aceptables, incluyen las sales de adición de ácidos (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden obtenerse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio o hidróxidos férricos, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares.

El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede proporcionarse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. Puede proporcionarse absorción prolongada de las composiciones inyectables mediante el uso en las composiciones de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Se preparan soluciones inyectables estériles incorporando los compuestos activos en la cantidad necesaria en el disolvente adecuado con otros diversos ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración. En general, se preparan dispersiones incorporando los diversos principios activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son técnicas de secado al vacío y liofilización, que producen un polvo del principio activo, más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución previamente esterilizada por filtración del mismo.

La administración de las composiciones según la presente invención será normalmente a través de cualquier vía común. Esto incluye la administración oral, nasal o bucal. Como alternativa, la administración puede ser mediante inyección ortotópica, intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intranasal o intravenosa. En determinadas realizaciones, se puede inhalar una composición de vacuna (p. ej., patente de los Estados Unidos 6.651.655). Dichas composiciones se administrarían normalmente como composiciones farmacéuticamente aceptables que incluyen vehículos, tampones u otros excipientes fisiológicamente aceptables. Como se usa en el presente documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a los compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que son, dentro del alcance del criterio médico razonable, adecuados para el contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica u otras complicaciones problemáticas proporcionales a una relación razonable de beneficio/riesgo. La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable", significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una carga líquida o sólida, diluyente, excipiente, disolvente o material de encapsulación, implicado en portar o transportar un agente químico.

Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debería estar adecuadamente tamponada, si es necesario, y el diluyente líquido se vuelve en primer lugar isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los medios acuosos estériles que pueden emplearse serán conocidos por los expertos en la materia a la luz de la presente divulgación. Por ejemplo, una dosificación podría disolverse en solución de NaCl isotónica y añadirse a líquido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio propuesto de infusión, (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 1990). Se producirá necesariamente alguna variación en la dosificación dependiendo de la afección del objeto. La persona responsable de la administración, en cualquier caso, determinará la dosis adecuada para el sujeto individual.

Se determina una cantidad eficaz de composición terapéutica o profiláctica en función del objetivo previsto. La expresión "dosis unitaria" o "dosificación" se refiere a unidades físicamente separadas que son adecuadas para su uso en un sujeto, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de la composición calculada para producir las respuestas deseadas analizadas anteriormente en asociación con su administración, es decir, la vía y el régimen adecuados. La cantidad para administrar, tanto según el número de tratamientos como según la dosis unitaria, depende de la protección deseada.

Las cantidades exactas de la composición también dependen del criterio del facultativo y son peculiares para cada individuo. Los factores que influyen en la dosis incluyen el estado físico y clínico del sujeto, la vía de administración, el objetivo del tratamiento previsto (alivio de los síntomas frente a cura) y la fuerza, estabilidad y toxicidad de la composición en particular.

Tras la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéutica o profilácticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en diversas formas de dosificación, tales como el tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente.

E. Administración in vitro, ex vivo o in vivo

Como se usa en el presente documento, la expresión administración in vitro se refiere a manipulaciones realizadas en células extraídas de un sujeto o fuera de un sujeto, incluyendo células en cultivo. La expresión administración ex vivo se refiere a células que se han manipulado in vitro y posteriormente se administran a un sujeto. La expresión administración in vivo incluye todas las manipulaciones realizadas dentro de un sujeto.

En determinados aspectos de la presente invención, las composiciones pueden administrarse bien in vitro, ex vivo o in vivo. En determinadas realizaciones in vitro, se incuban líneas celulares de linfocitos B autólogas con un vector de virus durante 24 a 48 horas o con un dominio 1-2 de cogaulasa y/o una variante del mismo y/o cualquier otra composición descrita en el presente documento durante dos horas. Las células transducidas se pueden usar después para análisis in vitro o, como alternativa para administración ex vivo. Las patentes de los Estados Unidos 4.690.915 y 5.199.942 desvelan métodos para manipulación ex vivo de células mononucleares de sangre y células de médula ósea para su uso en aplicaciones terapéuticas.

F. Anticuerpos e inmunización pasiva

Se describe un método para preparar una inmunoglobulina para su uso en la prevención o el tratamiento de la infección estafilocócica que comprende las etapas de inmunizar a un receptor o donante con la vacuna de la invención y aislar inmunoglobulina del receptor o donante. Se desvela una inmunoglobulina preparada por este método. Una composición farmacéutica que comprende la inmunoglobulina y un vehículo farmacéuticamente aceptable es un aspecto adicional de la divulgación que podría usarse en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una enfermedad estafilocócica. Se desvela un método para el tratamiento o la prevención de la infección estafilocócica que comprende una etapa de administrar a un paciente una cantidad eficaz de la preparación farmacéutica.

Se preparan inóculos para la producción de anticuerpos policlonales normalmente dispersando la composición antigénica en un diluyente fisiológicamente tolerable tal como solución salina u otros adyuvantes adecuados para su uso humano para formar una composición acuosa. Se administra una cantidad inmunoestimulante de inóculo a un mamífero y el mamífero inoculado se mantiene durante un tiempo suficiente para que la composición antigénica induzca anticuerpos protectores.

Los anticuerpos pueden aislarse en la medida deseada por técnicas bien conocidas tales como cromatografía de afinidad (Harlow y Lane, 1988). Los anticuerpos pueden incluir preparaciones de antisuero de diversos animales utilizados habitualmente, p. ej., cabras, primates, burros, cerdos, caballos, cobayas, ratas o seres humanos.

Una inmunoglobulina producida de acuerdo con la presente divulgación puede incluir anticuerpos completos, fragmentos o subfragmentos de anticuerpos. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas completas de cualquier clase (p. ej., IgG, IgM, IgA, IgD o IgE), anticuerpos quiméricos o anticuerpos híbridos con especificidad doble para dos o más antígenos. También pueden ser fragmentos (p. ej., F(ab')2, Fab', Fab, Fv y similares) incluyendo fragmentos híbridos. Una inmunoglobulina también incluye proteínas naturales, sintéticas o modificadas por ingeniería genética que actúan como un anticuerpo al unirse a antígenos específicos para formar un complejo. Se puede administrar una vacuna de la presente invención a un receptor que después actúa como fuente de inmunoglobulina, producida en respuesta a la exposición de la vacuna específica. Un sujeto tratado de este modo donaría plasma a partir del cual se obtendría globulina hiperinmunitaria mediante metodología convencional de fraccionamiento de plasma. La globulina hiperinmunitaria se administraría a otro sujeto para transmitir resistencia contra o tratar la infección estafilocócica. Las globulinas hiperinmunitarias son particularmente útiles para el tratamiento o la prevención de la enfermedad estafilocócica en lactantes, individuos inmunodeprimidos o donde sea necesario tratamiento y no haya tiempo para que el individuo produzca anticuerpos en respuesta a la vacunación. Se desvela una composición farmacéutica que comprende dos de más anticuerpos monoclonales (o fragmentos de los mismos; preferentemente humanos o humanizados) reactivos contra al menos dos constituyentes de la composición inmunógena de la invención, que podría usarse para tratar o prevenir la infección por bacterias grampositivas, preferentemente estafilococos, más preferentemente S. aureus o S. epidermidis. Dichas composiciones farmacéuticas comprenden anticuerpos monoclonales que pueden ser inmunoglobulinas completas de cualquier clase, anticuerpos quiméricos o anticuerpos híbridos con especificidad para dos o más antígenos. También pueden ser fragmentos (p. ej., F(ab')2, Fab', Fab, Fv y similares) incluyendo fragmentos híbridos.

Se conocen bien en la técnica métodos para preparar anticuerpos monoclonales y pueden incluir la fusión de esplenocitos con células de mieloma (Kohler y Milstein, 1975; Harlow y Lane (1988). Como alternativa, se pueden obtener fragmentos monoclonales de Fv explorando una biblioteca de presentación en fagos adecuada (Vaughan et al., 1998). Los anticuerpos monoclonales pueden ser humanizados o parcialmente humanizados por métodos conocidos.

VI. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan con el fin de ilustrar diversas realizaciones de la invención y no se pretende que limiten la presente invención de ninguna manera. Un experto en la materia apreciará fácilmente que la presente invención está bien adaptada para llevar a cabo los objetos y obtener los fines y ventajas mencionados, así como esos objetos, fines y ventajas inherentes en el presente documento. Los presentes ejemplos, junto con los métodos descritos en el presente documento son actualmente representativos de realizaciones preferidas, son ilustrativos y no se pretende que sean limitaciones en el alcance de la invención.

Ejemplo 1

COAGULASAS COMO DETERMINANTES DE RESPUESTAS INMUNITARIA PROTECTORAS CONTRA STAPHYLOCOCCUS AUREUS

A. RESULTADOS

Anticuerpos contra dominios de coagulasa Se inmunizaron conejos con Coa marcada con His purificada por afinidad derivada del gen de coagulasa de S. aureus Newman (Coa^{N M} ). El inmunosuero se examinó mediante ELISA, que reveló respuestas de anticuerpos IgG en suero al antígeno (fig. 1A-1B). Para analizar las respuestas de anticuerpos contra subdominios específicos, se sometieron proteínas recombinantes purificadas por afinidad (D1^{e o a} , D2^{o o a} , D12^{o o a} , L^{o o a} y CT^{o o a} ) a ELISA (fig. 1B). El inmunosuero albergaba anticuerpos contra cada uno de los dominios probados (fig. 1B). Cabe observar que los anticuerpos contra L^{o o a} fueron más abundantes que los anticuerpos que reconocieron el dominio de repetición (CT^{c oa} ) (L^{c oa} frente a CT^{o o a} , P < 0,05). Los anticuerpos contra D12^{c o a} fueron más abundantes que los que reconocieron el dominio de repetición, pero esta diferencia no alcanzó significación estadística (D12^{c o a} frente a CT^{o o a} , P = 0,066). Para explorar la función biológica de los anticuerpos en el inmunosuero, los inventores usaron cantidades variables de anticuerpos de Coa^NM purificados por afinidad para alterar la asociación de D12^{c o a} con protrombina humana o la asociación de CT^{o o a} con fibrinógeno (fig. 1C). Los inventores calcularon que IgG a-Coa 120 nM bloqueó la unión de D12^{c o a} a la protrombina, mientras que IgG a-Coa 1,7 |jM bloqueó la asociación de CT^{o o a} con fibrinógeno (fig. 1C).

Se sometió inmunosuero de Coa^NM de conejo a cromatografía de afinidad usando Coa^NM de longitud completa (a-Coa^{N M} ), D12^{c o a} (a-D12^{c o a} ) o CT^{o o a} (a-CT^{c o a} ). Se añadieron cantidades equimolares de IgG purificada por afinidad a muestras de sangre con citrato obtenidas de ratones BALB/c sin exposición previa, que posteriormente se inocularon con S. aureus CC8 cepa Newman (Baba 2007). En comparación con las muestras de control sin anticuerpo, IgG tanto a-Coa^NM como a-D12^{c o a} provocó un retardo significativo en el tiempo de coagulación, mientras que a-CT^{c o a} no (fig. 1D). Por tanto, los conejos responden a la inmunización con Coa^NM generando moléculas de IgG específicas de antígeno que se dirigen predominantemente contra D12Coa y L^{c o a} e interfieren con la actividad de coagulación de Coa secretada. Por el contrario, se generan anticuerpos contra CT^{o o a} en menor abundancia y no interfieren con coagulación in vitro de la sangre por S. aureus Newman.

Inhibición específica de tipo y de protección cruzada de la coagulación por S. aureus Para examinar la capacidad de a-Coa^NM para bloquear la coagulación de otras cepas aisladas de infecciones humanas, se añadió IgG específica de antígeno a muestras de sangre con citrato de ratones sin exposición previa que posteriormente se inocularon con S. aureus 85/2082 (CC8), MW2 (CC1), MSSA476 (CC1), N315 (CC5), Mu50 (CC5), MRSA252 (CC30), Cowan I (CC30), WIS (CC45) y USA600 (^c C45) (tabla 4). IgG específica de Coa^NM retardó la coagulación de S. aureus Newman (CC8), 85/2082 (CC8) y MW2 (CC1), pero no de MSSA476 (CC1), N315 (CC5), Mu50 (CC1), MRSA252 (CC30), Cowan (CC3), WIS (CC45) y USA600 (CC45) (tabla 4). Estos resultados sugirieron que los anticuerpos contra Coa^NM interfieren no solo con la coagulación de cepas de S. aureus del mismo tipo de Ce (o tipo de Coa), sino que también pueden interferir con la coagulación de cepas de otros tipos (MW2 y MSSA476). El patrón observado de protección cruzada no es universal, ya que cepas del mismo M^lST (^o tipo de Coa) no se vieron afectadas en la coagulación por anticuerpos contra Coa^{N M} . Para examinar la generalidad de la inhibición específica de tipo y de protección cruzada, se purificaron Coa^85/2082, Coa^{M W 2} , Coa^{N 3 i5} , Coa^{M RSA252} y Coa^{w IS} y se generaron inmunosueros de conejo (tabla 4). IgG específica de Coa^85/2082 inhibió la coagulación de S. aureus Newman (CC8) y 85/2082 (CC8) y, en menor grado, la de N315 (CC5) y Mu50 (CC5). Los anticuerpos dirigidos contra Coa^{N 3 i5} inhibieron la coagulación de S. aureus N315 (c C5), Mu50 (Cc 5), Newman (CC8) y 85/2082 (CC8), así como MRSA252 (CC30); sin embargo, estos anticuerpos no afectaron a la coagulación de S. aureus Cowan I (el otro aislado de CC30) o de las cepas CC1 y CC45. Los anticuerpos contra Coa^{M RSA252} inhibieron la coagulación de las cepas de S. aureus CC1 y c C5 pero no afectaron a la coagulación de los aislados CC30 o CC45. Los anticuerpos contra el aislado CC45 (WIS) inhibieron la coagulación de las cepas de S. aureus CC1 pero no afectaron a la coagulación de las cepas CC1, CC5, CC30 o CC45. En resumen, la coagulación de sangre de ratón por cepas de S. aureus fue inhibida invariablemente por anticuerpos inducidos contra la Coa correspondiente (aislados CC8, CC5, CC1 y CC30). Se observa neutralización cruzada de la coagulación para los anticuerpos dirigidos contra las dos coagulasas de las cepas CC8 y para cada una de las coagulasas de las cepas CC1 y CC5. Finalmente, los anticuerpos dirigidos contra Coa de las cepas CC1, CC5, CC8, CC30 y CC45 no neutralizaron la coagulación de las cepas de S. aureus CC45 o de Cowan I (CC30). Se supone que la coagulación de la sangre en estos aislados puede depender de otro factor, por ejemplo, vWbp (véase posteriormente).

Tabla 4. Inhibición específica de tipo o de protección cruzada de la coagulación estafilocócica por anticuerpos de ____________________________________________Coa____________________________________________

Anticuerpos específicos de Coa inducidos contra coagulasas de diferentes cepas de S. aureus

S. aureus Tipo de CC a-CoaNewman a-Coa86/2082 a-CoaMW2 a-CoaN315 a-CoaMRSA252 _CoaWIS Newman 8 1,7 1,5 1,7 1,9 1,7 1,7 85/2082 8 1,5 1,8 1,3 1,5 1,6 1,4 MW2 1 1,2 1,1 1,1 0,8 1,1 1,0 MSSA476 1 1,0 1,1 1,2 0,9 1,4 1,2 N315 5 1,1 1,2 1,3 1,2 1,3 1,2 Mu50 5 1,0 1,2 1,2 1,2 1,1 0,9 MRSA252 30 0,9 1,2 1,2 1,3 1,0 0,9 Cowan I 30 0,9 1,0 1,0 0,9 1,0 0,8 WIS 45 1,1 1,2 1,2 0,8 1,2 0,9 USA600 45 0,8 1,0 1,2 1,2 0,8 0,8

Anticuerpos de coagulasa y su efecto protector sobre la enfermedad estafilocócica Se emulsionaron CoaNM, D12Coa o CTCoa purificados y se inyectaron como un régimen de sensibilización-refuerzo en ratones BALB/c (n = 10). Se examinaron sueros de animales inmunizados de manera simulada (PBS) o con CoaNM, D12Coa y CTCoa mediante ELISA con respecto a las respuestas de IgG al antígeno, lo que reveló respuestas inmunitarias específicas en animales vacunados pero no en ratones de control (fig. 2A-2B). Cabe observar que la inmunización de ratones con CoaNM indujo predominantemente anticuerpos contra D12Coa y, en menor grado, anticuerpos que se dirigían contra CTCoa (fig. 2A). La inmunización con D12ooa aumentó los anticuerpos de alto título que reaccionaron con CoaNM de longitud completa (fig. 26A). Por el contrario, La inmunización con CTCoa generó respuestas de anticuerpos débiles (fig. 2A). Los ratones se expusieron mediante inyección intravenosa a S. aureus Newman y se usó un periodo de observación de 10 días para evaluar la protección contra septicemia letal (fig. 2B). En comparación con los animales inmunizados de manera simulada, la vacunación con CoaNM, D12ooa o CTCoa dio lugar a mayor tiempo transcurrido hasta la muerte (CoaNM frente a PBS, P < 0,001; D12Coa frente a PBS, P < 0,01; CTCoa frente a PBS, P < 0,05). Las respuestas inmunitarias contra CoaNM no superaron significativamente la vacunación con D12Coa o CTCoa en la generación de protección contra exposición a S. aureus letal (CoaNM frente a CTCoa, P > 0,05; D12Coa frente a CTCoa, P > 0,05).

Se probó si los anticuerpos dirigidos contra D12Coa o CTCoa proporcionan protección contra exposición letal a S. aureus. Se inyectó IgG de conejo purificada por afinidad en la cavidad peritoneal de ratones BALB/c sin exposición previa a una concentración de 5 mg/kg de peso corporal (fig. 2C). Veinticuatro horas después, los animales se expusieron mediante inyección intravenosa de S. aureus Newman (fig. 2C). En comparación con los anticuerpos de control [IgG (a-V10) específicos para el antígeno protector de la peste V10 (DeBord 2006)], IgG dirigidas contra CoaNM, D12Coa o CTCoa provocaron cada una un retardo en el tiempo transcurrido hasta la muerte para la cohorte correspondiente de animales expuestos (todas las vacunas frente a PBS, P < 0,05) (fig. 2C). No se detectaron diferencias significativas en la protección contra la enfermedad entre los anticuerpos dirigidos contra D12Coa, CTCoa o CoaNM de longitud completa (fig. 2C). Por tanto, en comparación con D12Coa y LCoa, la inmunización con el dominio de TCCoa induce bajas respuestas de anticuerpos, sin embargo, la transferencia pasiva de anticuerpos contra D12Coa y CTCoa proporciona niveles similares de protección contra exposición letal a S. aureus. Estos datos sugieren que la neutralización mediada por anticuerpos de la actividad coagulasa de S. aureus Newman no es un requisito para la protección contra la enfermedad. Después de la exposición a CoaNM de longitud completa, los ratones BALB/c montan respuestas inmunitarias robustas contra D12Coa y LCoa, pero generan pocos anticuerpos contra CTCoa.

Anticuerpos contra dominios de proteína de unión al factor de von Willebrand Se inmunizaron conejos con vWbp marcado con His purificado por afinidad derivado del gen vwb de S. aureus Newman (vWbpNM). El inmunosuero se examinó mediante ELISA, que reveló respuestas de anticuerpos IgG en suero al antígeno (fig. 3A-3B). Para analizar las respuestas de anticuerpos contra subdominios específicos, se sometieron D1vWbp, D2vWbp, D12vWbp, LvWbp y CTvWbp purificados por afinidad a ELISA (fig. 3B). El inmunosuero albergaba anticuerpos contra cada uno de los subdominios probados (fig. 3B). Cabe observar que los anticuerpos contra los D1vWbp y D2vWbp eran menos abundantes que los anticuerpos que reconocían estos dos dominios juntos (D12vWbp). En comparación con las respuestas inmunitarias contra D12vWbp, los anticuerpos dirigidos contra el CTvWbp fueron 30 % menos abundantes (D12vWbp frente a CTvWbp, P > 0,05). Para explorar la función biológica de los anticuerpos en el inmunosuero, los inventores usaron cantidades variables de IgG específica de vWbpNM para alterar la asociación de D12vWbp con protrombina humana y la asociación de CTvWbp con fibrinógeno (fig. 3C-3D). Los inventores calcularon que IgG avWbp 1,3 |^jM bloqueó la unión de D12vWbp a la protrombina, mientras que IgG a-vWbp 1,3 ^j M bloqueó la asociación de CTvWbp con fibrinógeno (fig. 3D).

Se añadieron cantidades equimolares de IgG purificada por afinidad a muestras de sangre con citrato obtenidas de ratones BALB/c sin exposición previa, que posteriormente se inocularon con una coa mutante procedente de S.

aureus Newman (Cheng 2010). En comparación con las muestras de control sin anticuerpo, tanto a-vWbp como a-D12vWbp provocaron pequeños retardos en el tiempo de coagulación, mientras que a-CTvWbp no retardó el tiempo de coagulación (fig. 3D). Por tanto, los conejos responden a la inmunización con vWbpNM mediante la generación de moléculas de IgG específicas de antígeno que se dirigen contra D12vWbp, LvWbp y CTvWbp. Los anticuerpos contra D12vWbp interfieren con la coagulación mediada por vWbp de sangre de ratón in vitro.

Anticuerpos contra vWbp y su efecto protector sobre la enfermedad estafilocócica Se emulsionaron vWbpNM, D12vWbp o CTvWbp purificados y se inyectaron como un régimen de sensibilización-refuerzo en ratones BALB/c (n = 10). Se examinaron sueros de animales inmunizados de manera simulada (PBS) o con vWbpNM, D12vWbp y CTvWbp mediante ELISA con respecto a las respuestas de IgG al antígeno, lo que reveló respuestas inmunitarias específicas en animales vacunados pero no en ratones de control (fig. 4A-4B). Cabe observar que la inmunización de ratones con vWbpNM indujo predominantemente anticuerpos contra D12ooa y, en menor grado, anticuerpos que se dirigían contra CTvWbp (fig. 4A). La inmunización con D12vWbp aumentó los anticuerpos de alto título que reaccionaron con vWbpNM de longitud completa (fig. 4A). Por el contrario, la inmunización con CTvWbp generó respuestas de anticuerpos débiles (fig. 28A). Los ratones se expusieron mediante inyección intravenosa a S. aureus Newman y se usó un periodo de observación de 10 días para evaluar la protección contra septicemia letal (fig. 4B). En comparación con los animales inmunizados de manera simulada, la vacunación con vWbpNM, D12vWbp o CTvWbp dio lugar a mayor tiempo transcurrido hasta la muerte (vWbpNM frente a PBS, P < 0,01; D12vWbp frente a PBS, P < 0,05; CTvWbp frente a PBS, P < 0,05). Las respuestas inmunitarias contra vWbpNM superaron la vacunación con D12vWbp pero no CTvWbp en la generación de protección contra exposición a S. aureus letal (vWbpNM frente a D12vWbp, P < 0,05; vWbpNM frente a CTvWbp, P > 0,05) (fig. 4B).

Se examinó si los anticuerpos dirigidos contra D12vWbp o CTvWbp proporcionan protección contra exposición letal a S. aureus. Se inyectó IgG de conejo purificada por afinidad en la cavidad peritoneal de ratones BALB/c sin exposición previa a una concentración de 5 mg/kg de peso corporal (fig. 4C). Veinticuatro horas después, los animales se expusieron mediante inyección intravenosa de S. aureus Newman (fig. 4C). En comparación con los anticuerpos de control (a-V10), IgG dirigidas contra vWbpNM, D12vWbp o CTvWbp provocaron cada una un retardo en el tiempo transcurrido hasta la muerte para la cohorte correspondiente de animales expuestos (todas las vacunas frente a PBS, P < 0,05) (fig. 4C). No se detectaron diferencias significativas en la protección contra la enfermedad entre los anticuerpos dirigidos contra D12vWbp, CTvWbp o vWbpNM de longitud completa (fig. 4C). Por tanto, en contraste con D12vWbp, la inmunización con el dominio de CTvWbp induce bajas respuestas de anticuerpos. La transferencia pasiva de anticuerpos contra D12vWbp y CTvWbp proporciona niveles similares de protección contra exposición letal a S. aureus Newman. Estos datos sugieren que la neutralización mediada por anticuerpos de vWbp de S. aureus Newman, que puede producirse por anticuerpos dirigidos contra D12vWbp o CTvWbp, se correlaciona con la protección contra la enfermedad. Después de la exposición a vWbpNM de longitud completa, los ratones BALB/c montan respuestas inmunitarias robustas contra D12vWbp y LvWbp, pero generan pocos anticuerpos contra CTvWbp.

Atributos de protección cruzada de la vacuna de CoaNM/vWbpNM CoaNM y vWbpNM recombinantes purificadas se emulsionaron y se inyectaron en ratones BALB/c (n = 10) como un régimen de inmunización de sensibilizaciónrefuerzo. Se examinaron sueros de animales inmunizados de manera simulada (PBS) y con CoaNM/vWbpNM mediante ELISA con respecto a respuestas de IgG a CoaNM así como vWbpNM, lo que reveló respuestas inmunitarias específicas de antígeno en ratones vacunados pero no en ratones de control (fig. 5A). Se usaron inyección intravenosa de ratones con S. aureus y un periodo de observación de 10 días para evaluar la protección de la vacuna contra la exposición letal con diversas cepas (fig. 5). Como control, la inmunización con CoaNM/vWbpNM aumentó la protección contra S. aureus Newman (CC8) (Cheng 2010) (datos no mostrados) y USA300 (CC8), pero no contra MW2 (CC1) o N315 (CC5) (fig. 5B-5D). No obstante, la inmunización con CoaNM/vWbpNM generó protección contra la exposición con S. aureus Cowan I (CC30) y WIS (CC45). En conjunto, estos datos indican que la vacuna de CoaNM/vWbpNM proporcionó inmunidad específica de tipo, así como protección cruzada contra algunas de, pero no todas, las cepas de tipo coagulasa (fig. 5E-5F).

Respuestas inmunitarias inducidas por la vacuna Coa4/vWbp2 El polipéptido modificado por ingeniería genética Coa4 alberga los dominios D12 de CoaMRSA252, CoaMW2, CoaN315 y CoauSA300 de longitud completa además de marcadores His6 N-terminal y STREP C-terminal (fig. 6A). Coa4 se purificó mediante cromatografía de afinidad en StrepTactinsepharose (fig. 6b ). Cuando se analizó mediante SDS-PAGE teñida con Coomassie, la Coa purificada por afinidad4 se reveló como un polipéptido de 190 kDa (fig. 30B). Coa4 abarca los dominios D12 de los aislados de S. aureus de tipo coagulasa más frecuentes de pacientes norteamericanos (CC1, CC5, CC8, CC30, CC45) (DeLeo 2010). El polipéptido vWbp2 abarca el dominio D12 de vWbpN315 y vWbpuSA300 de longitud completa además de marcadores His6 N-terminal y STREP C-terminal (fig. 6A). vWbp2 se purificó mediante cromatografía de afinidad, lo que produjo un polipéptido que migraba con la masa esperada de 85 kDa en SDS-PAGE teñida con Coomassie (fig. 6^b ). Se inmunizaron ratones (n = 5) con un régimen de sensibilización-refuerzo de CoaNM/vWbpNM o Coa4/vWbp2 y se examinaron las respuestas inmunitarias a diversos tipos de proteínas de unión al factor de von-Willebrand y coagulasa mediante ELISA (fig. 6C-6D). La vacuna CoaNM/vWbpNM indujo anticuerpos en ratones que se unieron a las coagulasas de las cepas CC8 pero presentaron poca reactividad cruzada hacia CoaN315, CoaMRSA252, CoaMW2 o CoaWIS. En comparación, la inmunización con Coa4 indujo anticuerpos de título mayor no solo contra coagulasas de tipo CC8, sino también contra las coagulasas de las cepas CC1, CC5, CC30 y CC45. En comparación con vWbpNM, vWbp2 indujo anticuerpos de título alto contra vWbp de las cepas CC5 y CC8 (fig. 6D).

Atributos de protección cruzada de la vacuna de Coa4/vWbp2 Se emulsionó Coa4/vWbp2 recombinante purificada y se inyectó en ratones BALB/c (n = 10) como un régimen de inmunización de sensibilización-refuerzo. Se examinaron sueros de animales inmunizados de manera simulada (PBS) y con Coa4/vWbp2 mediante ELISA con respecto a respuestas de IgG a Coa4 así como vWbp2, lo que reveló respuestas inmunitarias específicas de antígeno en ratones vacunados pero no en ratones de control (fig. 7A). Se usaron inyección intravenosa de ratones con S. aureus y un periodo de observación de 10 días para evaluar la protección de la vacuna contra la exposición letal con diversas cepas (fig. 7). Como cabía esperar, la inmunización con Coa4/vWbp2 indujo protección contra la cepa de S. aureus CC8 USA300 (Cheng 2010). De manera similar a la inmunización con CoaNM/vWbpNM, la vacuna de Coa4/vWbp2 indujo protección contra exposición a S. aureus Cowan I (CC30) y WIS (CC45). A diferencia de CoaNM/vWbpNM, Coa4/vWbp2 protegió a los ratones contra la exposición letal con S. aureus N315 (CC5) o MW2 (CC1) (figs. 7B-7D). En conjunto, estos datos indican que la vacuna de CoaNM/vWbpNM proporcionó inmunidad específica de tipo, así como protección cruzada contra algunas de, pero no todas, las cepas de tipo coagulasa (fig.

7E-7F). Además, la vacuna de Coa4/vWbp2 protegió a los animales contra una exposición con los tipos de CC de S. aureus relevantes aislados de pacientes norteamericanos con enfermedad estafilocócica.

Los inventores también examinaron si la inmunización con Coa4/vWbp2 puede proteger a los ratones contra la formación de abscesos estafilocócicos. Los ratones BALB/c se inmunizaron con un régimen de sensibilizaciónrefuerzo de Coa4/vWbp2 o control simulado y se expusieron mediante inoculación intravenosa de una dosis subletal de las cepas de S. aureus USA300, N315, MW2 o Cowan I. Cinco días después de la exposición, se sacrificaron los animales, se les realizó una necropsia y se extrajeron sus riñones. Se fijaron los tejidos para uno de los dos riñones de cada ratón, se cortaron en secciones delgadas y se tiñeron con hematoxilina/eosina para su posterior análisis histopatológico (tabla 5). Los tejidos de los otros riñones se homogeneizaron y se extendieron sobre placas de agar para enumerar la carga estafilocócica como unidades formadoras de colonias (tabla 5). La inmunización con Coa4/vWbp2 afectó a la carga bacteriana en tejidos renales de ratones infectados con diversas cepas de S. aureus, lo que condujo a una reducción significativa para S. aureus MW2 y Cowan I, pero no para USA300 y N315. Este es un resultado esperado, ya que los anticuerpos específicos de Coa o vWbp no promueven la destrucción opsonofagocítica de bacterias, sino que interfieren con la formación de abscesos estafilocócicos, reduciendo de este modo la capacidad de los estafilococos para replicarse dentro del entorno protector de estas lesiones (Cheng 2010). En comparación con los animales inmunizados de manera simulada, la inmunización con Coa4/vWbp2 redujo la formación de abscesos estafilocócicos en los tejidos renales cinco días después de la exposición con las cepas de S. aureus USA300, Cowan I, MW2 o N315 (tabla 5).

Tabla 5. Inmunización activa de ratones con Coa4/vWbp2 y protección contra la exposición con las cepas de S. aureus USA300, N315, MW2 o Cowan I

Vacuna Carga estafilocócica en tejido renal Formación de abscesos alog10UFCg-1 DSignificación CReducción (log10 aNúmero de eSignificación (ETM) (valor de P) UFCg-1) lesiones (valor de P) S. aureus USA300

Simulado 7,31 (0,37) 8,8 (1,72)

Coa4/vWbp2 6,48 (0,41) 0,150 0,835 4,3 (1,11) 0,0434 S. aureus N315

Simulado 7,25 (0,13) 16,6 (1,49)

Coa4/vWbp2 7,10 (0,24) 0,805 0,151 11,3 (0,84) 0,0205 S. aureus MW2

Simulado 8,04 (0,25) 66,5 (8,41)

Coa4/vWbp2 7,25 (0,20) 0,029 0,789 27,5 (4,39) 0,0011 S. aureus Cowan I

Simulado 6,94 (0,16) 7,9 (1,27)

Coa4/vWbp2 5,59 (0,51) 0,028 1,35 4,6 (0,73) 0,0279

Los primeros trabajos sobre la coagulasa demostraron que, después de la infección por S. aureus, los seres humanos así como los animales generan anticuerpos específicos de Coa (Tager 1948; Lominski, 1946). Cuando se transfieren a conejos sin exposición previa, estos anticuerpos pueden neutralizar la coagulación por S. aureus y, al menos en algunos casos, puede conferir inmunidad a la exposición con S. aureus (Lominski, 1949; Lominski, 1962). La inmunización activa de conejos con preparaciones que contienen coagulasa podría prolongar la vida de los conejos que se habían expuesto mediante inoculación intravenosa con dosis letales de S. aureus (Boake, 1956). La comparación de diferentes aislados de S. aureus (de tipo fago) para la inhibición de la coagulación del plasma por el antisuero de coagulasa reveló neutralización tanto específica como inespecífica del tipo de fago (Lominski 1946; Lominski 1962; Rammelkamp 1950; Duthie 1952; Harrison 1964). Estos datos apoyaron un concepto general para la existencia de tipos serológicos de Coa, que no están estrictamente vinculados a tipos de fago de S. aureus (Rammelkamp 1956).

Toxoide de coagulasa purificado, que abarca Coa purificada de las cepas de S. aureus M1 y Newman adsorbidas en fosfato de aluminio, se examinó para determinar la inmunización terapéutica de 71 pacientes con furunculosis crónica (Harrison 1963). En comparación con el placebo, la inmunización contra la coagulasa generó un aumento en los títulos de anticuerpos específicos de coagulasa, pero no logró mejorar el resultado clínico de la furunculosis crónica (Harrison 1963). Cabe observar que no se examinó el desarrollo de anticuerpos neutralizantes o la posibilidad de inmunidad específica de tipo (Harrison 1963). Por tanto, aunque los primeros trabajos revelaron la eficacia preclínica de las vacunas de subunidades de coagulasa, los estudios clínicos no consiguieron demostrar la eficacia en un ensayo en seres humanos. Ya que la mayoría de estos estudios se realizaron entre 1945 y 1965, se deben considerar las herramientas limitadas para el aislamiento de coagulasas muy purificadas, así como la incapacidad para tipificar cepas de S. aureus o preparaciones de vacunas de coagulasa en función de su secuencia de nucleótidos. Además, se han realizado estudios anteriores sin conocimiento de vWbp o de los mecanismos moleculares de la activación de protrombina mediada por Coa y vWbp y la escisión de fibrinógeno (Friedrich 2003; Kroh 2009). Los inventores han observado recientemente que ambas coagulasas secretadas por S. aureus Newman, CoaNM y vWbpNM, son suficientes para que la capacidad de esta cepa provoque formación de abscesos y bacteriemia letal rápida en ratones (Cheng 2010). En experimentos de inmunización activa y pasiva, fueron necesarios anticuerpos tanto contra CoaNM como contra vWbpNM para conferir protección contra la formación de abscesos o bacteriemia letal (Cheng 2010). En función de estas observaciones, los inventores plantean la hipótesis de que las coagulasas pueden actuar como antígenos protectores que inducen respuestas de anticuerpos contra Coa y vWbp, que protegen a los animales y a los seres humanos contra enfermedad por S. aureus (Cheng 2010). De acuerdo con este modelo, la expresión de coa y vwb es un rasgo universal de cepas de S. aureus (Cheng 2011). Cabe observar que el gen coa de aislados de S. aureus es variable (McCarthy 2010), con mayor variación en la secuencia de aminoácidos incluso que las repeticiones en tándem del gen de la proteína A (spa); la variación en spa se utiliza para experimentos de tipificación epidemiológica (Watanabe 2009; Koreen 2004). Aún no se han aislado mutantes de S. aureus que no pueden expresar coa de seres humanos con enfermedad estafilocócica manifiesta. El gen vwb es menos variable (McCarthy 2010). Analizando secuencias del genoma de S. aureus disponibles en la actualidad para determinar la homología de vwb, se identificaron tres alelos. Dos de los alelos de vwb variaron en su secuencia codificante para el dominio D12 (S. aureus N315 y USA300 son representativos de estos alelos), mientras que el tercer alelo albergaba una supresión de nucleótido en el codón 102, que crea un desplazamiento de marco que da lugar a una mutación sin sentido en el codón 107 (S. aureus MRSA252).

Gracias a estas observaciones, se informa aquí de que la inmunización con Coa y vWbp de conejos o ratones generó predominantemente anticuerpos contra el dominio D12 de CoaNM o vWbpNM. Los anticuerpos específicos de D12 neutralizaron las actividades coagulasa de S. aureus Newman y, cuando se transfirieron a animales sin exposición previa, confirieron protección contra bacteriemia letal. Se produjo neutralización y protección contra enfermedades de anticuerpos específicos de CoaNM y vWbpNM de una manera específica de tipo, de manera similar a la inmunidad específica de tipo indicada para proteínas M de Streptococcus pyogenes (Lancefield 1928; Lancefield 1962) o los antígenos de pilus (T) de S. pyogenes y Streptococcus agalactiae (Mora 2005; Nuccitelli 2011). A la luz del enfoque de vacunación estructural para antígenos de pilus (Nuccitelli 2011; Schneewind 2011), los inventores diseñaron dos polipéptidos que abarcan los dominios D12 de los principales tipos de Coa y vWbp de los aislados de S. aureus norteamericanos: cepas CC1, CC5, CC8, CC30 y CC45 (Tenover 2012). Los productos purificados, Coa4 y vWbp2, se usaron como antígenos e indujeron respuestas de anticuerpos contra los dominios D12 de cada tipo de Coa y vWbp examinado. La inmunización de ratones con Coa4/vWbp2 proporcionó protección contra la exposición de bacteriemia letal con cepas de S. aureus CC1, CC5, CC8, CC30 y ^c C45 representativas. Por tanto, los criterios de diseño de la vacuna de Coa4/vWbp2, para generar respuestas inmunitarias universales contra Coa y vWbp contra S. aureus clínicamente relevante, se han cumplido.

Además de la neutralización específica de tipo de Coa y vWbp a través de anticuerpos dirigidos contra el dominio D12, los anticuerpos contra los dominios R (Coa) y CT (vWbp) también proporcionaron protección contra enfermedad por S. aureus. Ya que los anticuerpos contra los dominios R y CT no afectan a la coagulación de la fibrina a través de los complejos de protrombina Coa y protrombina vWbp secretados, se supone que estos mecanismos inmunitarios adaptativos se dirigen a coagulasas a través de otro mecanismo. En la actualidad no se aprecia cómo los anticuerpos contra el dominio R de Coa o el dominio CT de vWbp proporcionan protección. Parece plausible que estos anticuerpos puedan mediar en la eliminación de Coa y vWbp de la circulación mediante la unión de complejos inmunitarios a receptores de Fc en macrófagos. Hasta que se revele el mecanismo molecular de protección, no se puede apreciar el valor general de una estrategia de vacuna que se dirige a los dominios R y CT de Coa y vWbp.

B. MATERIALES Y MÉTODOS

Cepas bacterianas y crecimiento de cultivos Se cultivaron cepas de S. aureus en agar o caldo de soja tríptico a 37 °C. Se cultivaron cepas de E. coli DH5a y BL21 (DE3) en agar o caldo Luria Bertani a 37 °C. Se usó ampicilina (100 |jg/ml) para la selección de pET15b y pGEX2tk. Los cebadores utilizados para la amplificación del ADN estafilocócico se encuentran en la tabla 6.

Coa4 y vWbp2 Para generar las proteínas híbridas, se amplificaron por PCR coa y vwb de la cepa USA300. El cebador 5' incluía el sitio de restricción (NcoI) para insertar en el vector (pET15b), así como una enzima de restricción adicional (AvrII) para uso futuro. El cebador 3' incluía el sitio de restricción (BamHI) para inserción del vector. Los insertos se clonaron en la cepa de E. coli DH5a. En cada ciclo de clonación posterior, el D12 del siguiente alelo se añadió al vector 5' en el inserto anterior. En cada caso, el cebador 5' incluía el sitio del vector (NcoI) y un sitio de enzima de restricción adicional para uso futuro. El cebador 3' para cada inserto secuencial contenía el sitio de restricción (AvrII para N315) incluido en el cebador 5' para el inserto anterior. La región promotora y el promotor de His se restauraron en un ciclo posterior de clonación y se añadió un marcador STREP C-terminal en otro ciclo de clonación. Se secuenció el vector completo para verificar la calidad de la secuencia de ADN. Finalmente, cada vector se transformó en la cepa de E. coli BL21 para la expresión y purificación de proteínas.

Purificación de proteínas Se cultivaron E. coli BL21 (DE3) que albergaban vectores de expresión que contenían coa de S. aureus Newman; vwb de las cepas de S. aureus Newman, USA3000 y N315; o los subdominios de coa y vwb; y vectores de expresión que contienen la secuencia genética para las proteínas híbridas Coa4 y vWbp2, a 37 °C y se indujeron con ipTG 100 mM durante una noche a temperatura ambiente. Debido a la degradación durante la purificación de Coa, se utilizaron vectores de expresión pGEX2tk en E. coli Dh5a para expresar coa de USA300, N315, MW2, MRSA252, 85/2082 y WIS como construcciones marcadas con ^g S^t . Tres horas después de la inducción, las células se centrifugaron a 7.000 x g, se suspendieron en tampón de columna 1x (Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,5 M) y se lisaron en una prensa de French a 985,18 kg/cm2 (14.000 lb/in2). Los lisados se sometieron a ultracentrifugación a 40.000 x g durante 30 min. El sobrenadante de las construcciones pET15b se sometió a cromatografía Ni-NTA, se lavó con tampón de columna e imidazol 10 mM y se eluyó con imidazol 500 mM. Para proteínas marcadas con strep, los sobrenadantes de lisado se sometieron a cromatografía sobre StrepTactin Sepharose (GE Healthcare), se lavaron en tampón de lavado strep 1x (Tris-HCl 0,1 M, pH 8, NaCl 0,150 M, EDTA 0,1 M) y se eluyeron en tampón de lavado strep 1x que contenía destiobiotina 2,5 mM. Para proteínas marcadas con GST, el sobrenadante de lisados clarificados se sometió a cromatografía de glutatión-sepharose. Para eliminar el marcador de GST, después del lavado con tampón de columna, el tampón de columna se cambió a tampón de escisión de proteasa PreScission que contenía DTT 10 mM y la columna se incubó con proteasa PreScission (GE Healthcare) durante una noche en la definición de unidad proporcionada por GE. Se recogió después proteína liberada que carecía del marcador de GST con tampón de escisión de proteasa adicional. Los eluidos se dializaron frente a PBS. Para eliminar la endotoxina, se añadió Triton-X114 1:100 y la solución se enfrió durante 10 minutos, se incubó a 37 °C durante 10 min y se centrifugó a 13.000 x g. Esto se repitió dos veces. El sobrenadante se cargó en una columna de desalación HiTrap para eliminar los restos de Triton-XI 14.

Anticuerpos de conejo La concentración de proteína se determinó usando un equipo BCA (Pierce). La pureza se verificó mediante análisis de SDS-PAGE y tinción con azul brillante de Coomassie. Para la inmunización inicial, hembas de conejos blancos de Nueva Zelanda de seis meses de vida, se inmunizaron con 500 |jg de proteína emulsionada en CFA (Difco) o con IFA para inmunizaciones de refuerzo los días 24 y 48. El día 60, se tomó sangre de los conejos y se recuperó el suero para experimentos de inmunotransferencia o transferencia pasiva. Para la purificación de anticuerpos, se unió covalentemente His6-Coa, His6-vWbp o His6-ClfA recombinante (5 mg) a columnas HP activadas por NHS HiTrap (GE Healthcare). Esta matriz de antígeno se usó después para cromatografía de afinidad de 10-20 ml de suero de conejo a 4 °C. La matriz cargada se lavó con 50 volúmenes de columna de PBS, los anticuerpos se eluyeron con tampón de elución (glicina 1 M pH 2,5, NaCl 0,5 M) y se neutralizaron inmediatamente con Tris-HCl 1 M (pH 8,5). Los anticuerpos purificados se dializaron durante una noche frente a PBS, NaCl 0,5 M a 4 °C.

Ensayo de coagulación Se diluyeron cultivos de una noche de cepas estafilocócicas 1:100 en TSB nuevo y se cultivaron a 37 °C hasta que alcanzaron una DO6000,4. Se centrifugó un ml de cultivo y los estafilococos se lavaron y se suspendieron en 1 ml de PBS estéril para generar una suspensión de 1 x 108 UFC/ml. Se recogió sangre completa de ratones BALB/c sin exposición previa y se añadió citrato de sodio a una concentración final de 1 % (p/v). Para evaluar la actividad de coagulación sanguínea bacteriana en presencia de anticuerpos, se mezclaron 10 j l del cultivo bacteriano de reserva con 10 j l de PBS que contenía 30 jM de una mezcla de anti-Coa y anti-vWbp en un tubo de ensayo de plástico estéril (BD Falcon) y se incubaron durante quince minutos. A cada tubo, se añadieron 80 j l de sangre de ratón anticoagulada en un tubo de ensayo de plástico estéril (BD falcon), para lograr una concentración final de 1 x 107 UFC/ml. Los tubos de ensayo se incubaron a 37 °C y se verificó la coagulación de la sangre inclinando los tubos a ángulos de 45° a intervalos programados. Para experimentos con sangre humana, se tomaron muestras sanguíneas de 10 ml de individuos que dieron su consentimiento, que se trataron con citrato de sodio a una concentración final de 1 % (p/v). Después se analizó la sangre de la manera descrita anteriormente. Todos los experimentos se repitieron en al menos dos experimentos independientes.

Inmunización activa Ratones BALB/c de tres semanas de vida (n = 10), recibieron una inyección de 50 jg de proteína emulsionada en 60 j l de adyuvante incompleto de Freund y 40 j l de adyuvante completo de Freund. Once días después de la vacunación, estos ratones se reforzaron con 50 jg de proteína cada una emulsionada en 100 j l de adyuvante incompleto de Freund. El día 21, los ratones se anestesiaron con ketamina/xilazina y se recogió sangre mediante sangrado retroorbital utilizando tubos capilares de microhematocrito (Fisher) en microtubos Z-Gel (Sarstedt) para determinar los títulos semimáximos. Los tubos se centrifugaron a 10.000 x g durante tres minutos y se recogió el suero. Los títulos de anticuerpos semimáximos se midieron mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

Transferencia pasiva de anticuerpos Seis horas antes de la infección, se inyectaron en ratones BALB/c de seis semanas de edad (n = 10) por vía intraperitoneal anticuerpos purificados por afinidad contra construcciones de longitud completa o de subdominio de Coa o vWbp o de V10 (IgG de control específica para el antígeno de la peste LcrV) a una dosis de 5 mg/kg de peso corporal.

Septicemia Se diluyeron cultivos de una noche de cepas estafilocócicas 1:100 en TSB nuevo y se cultivaron a hasta que alcanzaron una DO600 0,4. Las bacterias se centrifugaron a 7.000 x g, se lavaron y se suspendieron en un décimo del volumen de PBS. Ratones hembra BALB/c de seis semanas de vida (n = 15) (Charles River), recibieron mediante inyección por vía retroorbital, suspensiones de 1 x 108 UFC (S. aureus Newman, N315, Cowan I y WIS), 5 x 107 UFC (S. aureus USA300) o 2 x 108 UFC (S. aureus MW2) en 100 pl de PBS. Los ratones se supervisaron para determinar la supervivencia durante 10 días.

Absceso renal Se prepararon cepas de S. aureus como se describe para la septicemia pero, después del lavado, los sedimentos bacterianos se resuspendieron en un mismo volumen, lo que dio lugar a un log menos de UFC en comparación con la septicemia. Para enumerar la carga estafilocócica en el tejido renal cinco días después de la infección, los ratones se sacrificaron mediante asfixia con CO2 y se extrajeron los riñones durante la necropsia. Se homogeneizó un riñón por ratón en PBS, Triton X-100 al 1 %. Se extendieron diluciones en serie de homogeneizado sobre TSA y se incubaron para la formación de colonias. La carga bacteriana en el tejido se analizó en comparaciones por pares entre cepas mutantes y de tipo silvestre con la prueba de t de Student de dos colas para datos independientes. Para histopatología, el riñón alternativo se fijó en formol al 10 % durante 24 horas a temperatura ambiente. Los tejidos se incluyeron en parafina, se cortaron en secciones delgadas, se tiñeron con hematoxilina y eosina y se examinaron mediante microscopia óptica para enumerar las lesiones patológicas por órgano. Los datos se analizaron en comparaciones por pares entre cepas mutantes y de tipo silvestre con la prueba de t de Student de dos colas para datos independientes.

Medición de la actividad coagulasa Se preincubó protrombina M 5 x 10-8 (Innovative Research) durante 10 minutos con una cantidad equimolar de Coa funcional a temperatura ambiente, seguido de la adición de S-2238 (un sustrato cromógeno) a una concentración final de 1 mM en un tampón de reacción total de 100 pl de PBS. El cambio de la absorbancia se midió a 450 nm durante 10 minutos en un espectrofotómetro, se representó en función del tiempo y se ajustó a una curva lineal. La pendiente de la curva (dA/dt) se interpretó como la velocidad de hidrólisis de S-2238 y, por tanto, refleja la función enzimática. El ensayo se repitió en presencia de anticuerpos policlonales añadidos a 5 x 10-9 M y los datos se normalizaron con respecto a la actividad promedio sin inhibición. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.

Actividad coagulasa. Se mezclaron Coa o vWbp recombinante purificada (100 nM) con protrombina humana (Innovative Research) en citrato de sodio al 1 %/PBS. Después de una lectura inicial, se añadió fibrinógeno (3 pM) (Sigma) y se midió la conversión de fibrinógeno en fibrina como un aumento de la turbidez a 450 nm en un lector de placas (BioTek) a intervalos de 2,5 minutos. Como controles, se midió la actividad enzimática de la alfa-trombina humana (Innovative Research) o de la protrombina sola.

Tabla de secuencias 1:

Dominios D1-2 de Coa de la cepa MRSA252:

IVTKDYSKES RVNENSKYDT PIPDWYLGSI LNRLGDQIYY AKELTNKYEY 50 GEKEYKQAID KLMTRVLGED HYLLEKKKAQ YEAYKKWFEK HKSENPHSSL 100 KKIKFDDFDL YRLTKKEYNE LHQSLKEAVD EFNSEVKNIQ SKQKDLLPYD 150 EATENRVTNG IYDFVCEIDT LYAAYFNHSQ YGHNAKELRA KLDIILGDAK 200 DPVRITNERI RKEMMDDLNS IIDDFFMDTN MNRPLNITKF NPN1HDYTNK 250 PENRDNFDKL VKETREAIAN ADESWKTRTV N (SEQ ID I 0: 33)

Dominios D1-2 de Coa de la cepa MW2:

IVTKDYSGKS QVNAGSKNGK QIADGYYWGI IENLENQFYN IFHLLDQHKY 50

AEKEYKDAVD KLKTRVLEED QYLLERKKEK YEIYKELYKK YKKENPNTQV 100

KMKAFDKYDL GDLTMEEYND LSKLLTKALD NFKLEVKKIE SENPDLKPYS 150

ESEERTAYGK IDSLVDQAYS VYFAYVTDAQ HKTEALNLRA KIDLILGDEK 200

DPIRVTNQRT EKEMIKDLES IIDDFFIETK LNRPKHITRY DGTKHDYHKH 250

KDGFDALVKE TREAVAKADE SWKNKTVKK (SEQ ID NO: 34)

Dominios D1-2 de Coa de la cepa WIS:

IVTKDYSGKS QVNAGSKNGK QIADGYYWGI IENLENQFYN IFHLLDQHKY 50 AEKEYKDALD KLKTRVLEED QYLLERKKEK YEIYKELYKK YKKENPNTQV 100 KMKAFDKYDL GDLTMEEYND LSKLLTKALD NFKLEVKKIE SENPDLRPYS 150 ESEERTAYGK IDSLVDQAYS VYFAYVTDAQ HKTEALNLRA KIDLILGDEK 200 DPIRVTNQRT EKEMIKDLES IIDDFFIETK LNRPQHITRY DGTKHDYHKH 250 KDGFDALVKE TREAVSKADE SWKTKTVKK (SEQ ID NO: 35)

Dominios D1-2 de Coa de la cepa N315:

IVTKDYSKES RVNEKSKKGA TVSDYYYWKI IDSLEAQFTG AIDLLEDYKY 50 GDPIYKEAKD RLMTRVLGED QYLLKKKIDE YELYKKWYKS SNKNTNMLTF 100 HKYNLYNLTM NEYNDIFNSL KDAVYQFNKE VKEIEHKNVD LKQFDKDGED 150 KATKEVYDLV SEIDTLVVTY YADKDYGEHA KELRAKLDLI LGDTDNPHKI 200 TNERIKKEMI DDLNSIIDDF FMETKQNRPN SITKYDPTKH NFKEKSENKP 250 NFDKLVEETK KAVKEADESW KNKTVKK (SEQ ID NO: 36)

Dominios D1-2 de Coa de la cepa USA300:

IVTKDYSGKS QVNAGSKNGT LIDSRYLNSA LYYLEDYIIY AIGLTNKYEY 50 GDNIYKEAKD RLLEKVLRED QYLLERKKSQ YEDYKQWYAN YKKENPRTDL 100 KMANFHKYNL EELSMKEYNE LQDALKRALD DFHREVKDIK DKNSDLKTFN 150 AAEEDKATKE VYDLVSEIDT LVVSYYGDKD YGEHAKELRA KLDLILGDTD 200 NPHKITNERI KKEMIDDLNS IIDDFFMETK QNRPKSITKY NPTTHNYKTN 250 SDNKPNFDKL VEETKKAVKE ADDSWKKKTV KK (SEQ ID NO: 37)

Tabla de secuencias n.° 2

Dominios D1-2 de vWbp de la cepa N315:

VVSGEKNPYV SKALELKDKS NKSNSYENYR DSLESLISSL SFADYEKYEE 50 PEYEKAVKKY QQKFMAEDDA LKNFLNEEKK IKNADISRKS NNLLGLTHER 100 YSYIFDTLKK NKQEFLKDIE EIQLKNSDLK DFNNT (SEQ ID NO: 38)

Dominios D1-2 de vWbp de la cepa MW2:

VVSGEKNPYV SESLKLTNNK NKSRTVEEYK KSLDDLIWSF PNLDNERFDN 50 PEYKEAMKKY QQRFMAEDEA LKKFFSEEKK IKNGNTDNLD YLGLSHERYE 100 SVFNTLKKQS EEFLKEIEDI KKDNPELKDF NE (SEQ ID NO: 39)

Dominios D1-2 Dominios L y Fgb de la cepa USA300

VVSGEKNPYV SESLKLTNNK NKSRTVEEYK KSLDDLIWSF PNLDNERFDN 50 PEYKEAMKKY QQRFMAEDEA LKKFFSEEKK IKNGNTDNLD YLGLSHERYE 100 SVFNTLKKQS EEFLKEIEDI KKDNPELKDF NEEEQLKCDL ELNKLENQIL 150 MLGKTFYQNY RDDVESLYSK LDLIMGYKDE ERANKKAVNK RMLENKKEDL 200 ETIIDEFFSD IDKTRPNNIP VLEDEKQEEK NHKNMAQLKS DTEAAKSDES 250 KRSKRSKRSL NTQNHKPASQ EVSEQQKAEY DKRAEERKAR FLDNQKIKKT 300 PVVSLEYDFE HKQRIDNEND KKLVVSAPTK KPTSPTTYTE TTTQVPMPTV 350 ERQTQQQIIY NAPKQLAGLN GESHDFTTTH QSPTTSNHTH NNVVEFEETS 400 ALPGRKSGSL VGISQIDSSH LTEREKRVIK REHVREAQKL VDNYKDTHSY 450 KDRINAQQKV NTLSEGHQKR FNKQINKVYN GK (SEQ ID NO: 40)

Secuencias adicionales:

Dominios D1-2 y L de Coa de la cepa N315:

IVTKDYSKES RVNEKSKKGA TVSDYYYWKI IDSLEAQFTG AIDLLEDYKY 50 GDPIYKEAKD RLMTRVLGED QYLLKKKIDE YELYKKWYKS SNKNTNMLTF 100 HKYNLYNLTM NEYNDIFNSL KDAVYQFNKEVKEIEHKNVD LKQFDKDGED 150 KATKEVYDLV SEIDTLVVTY YADKDYGEHA KELRAKLDLI LGDTDNPHKI 200 TNERIKKEMI DDLNSIIDDF FMETKQNRPN SITKYDPTKH NFKEKSENKP 250 NFDKLVEETK KAVKEADESW KNKTVKKYEE TVTKSPVVKE EKKVEEPQLP 300 KVGNQQEVKT TAGKAEETTQ PVAQPLVKIPQETIYGETVK GPEYPTMENK 350 TLQGEIVQGP DFLTMEQNRP SLSDNYTQPT TPNPILEGLE GSSSKLEIKP 400 QGTESTLKGI QGESSDIEVK PQATETTEAS QYGP (SEQ ID NO: 41) Polipéptido de Coa de longitud completa:

Cepa USA300

MKKQIISLGA LAVASSLFTW DNKADAIVTK DYSGKSQVNA GSKNGTLIDS 50 RYLNSALYYL EDYIIYAIGL TNKYEYGDNI YKEAKDRLLE KVLREDQYLL 100 ERKKSQYEDY KQWYANYKKE NPRTDLKMAN FHKYNLEELS MKEYNELQDA 150 LKRALDDFHR EVKDIKDKNS DLKTFNAAEE DKATKEVYDL VSEIDTLVVS 200

YYGDKDYGEH AKELRAKLDL ILGDTDNPHK ITNERIKKEM IDDLNSIIDD 250 FFMETKQNRP KSITKYNPTT HNYKTNSDNK PNFDKLVEET KKAVKEADDS 300 WKKKTVKKYG ETETKSPVVK EEKKVEEPQA PKVDNQQEVK TTAGKAEETT 350 QPVAQPLVKI PQGTITGEIV KGPEYPTMEN KTVQGEIVQG PDFLTMEQSG 400 PSLSNNYTNP PLTNPILEGL EGSSSKLEIK PQGTESTLKG TQGESSDIEV 450 KPQATETTEA SQYGPRPQFN KTPKYVKYRD AGTGIREYND GTFGYEARPR 500 FNKPSETNAY NVTTHANGQV SYGARPTQNK PSKTNAYNVT THGNGQVSYG 550 ARPTQNKPSK TNAYNVTTHA NGQVSYGARP TYKKPSKTNA YNVTTHADGT 600 ATYGPRVTK (SEQ ID NO: 42)

Secuencias adicionales de ácido nucleico de COA (se indican los dominios)

USA300

D1

ATAGTAACAAAGGATTATAGTGGGAAATCACAAGTTAATGCTGGGAGTAAAAATGGG ACATTAATAGATAGCAGATATTTAAATTCAGCTCTATATTATTTGGAAGACTATATAATTTA TGCTATAGGATTAACTAATAAATATGAATATGGAGATAATATTTATAAAGAAGCTAAAGATA GGTTGTTGGAAAAGGTATTAAGGGAAGATCAATATCTTTTGGAGAGAAAGAAATCTCAATAT GAAGATTATAAACAATGGTATGCAAATTATAAAAAAGAAAATCCTCGTACAGATTTAAAAAT GGCTAATTTTCATAAATATAATTTAGAAGAACTTTCGATGAAAGAATACAATGAACTACAGG ATGCATTAAAGAGAGCACTGGATGATTTTCACAGAGAAGTTAAAGATATTAAGGATAAGAAT TCAGACTTGAAAACTTTT (SEQ ID NO: 43)

D2-AATGCAGCAGAAGAAGATAAAGCAACTAAGGAAGTATACGATCTCGTATCTGAAATT GATACATTAGTTGTATCATATTATGGTGATAAGGATTATGGGGAGCACGCGAAAGAGTTACG AGCAAAACTGGACTTAATCCTTGGAGATACAGACAATCCACATAAAATTACAAATGAACGTA TTAAAAAAGAAATGATTGATGACTTAAATTCAATTATTGATGATTTCTTTATGGAAACTAAA CAAAATAGACCGAAATCTATAACGAAATATAATCCTACAACACATAACTATAAAACAAATAG TGATAATAAACCTAATTTTGATAAATTAGTTGAAGAAACGAAAAAAGCAGTTAAAGAAGCAG ATGATTCTTGGAAAAAGAAAACTGTCAAAAAA (SEQ ID NO: 44)

L-TACGGAGAAACTGAAACAAAATCGCCAGTAGTAAAAGAAGAGAAGAAAGTTGAAGAA CCTCAAGCACCTAAAGTTGATAACCAACAAGAGGTTAAAACTACGGCTGGTAAAGCTGAAGA AACAACACAACCAGTTGCACAACCATTAGTTAAAATTCCACAGGGCACAATTACAGGTGAAA TTGTAAAAGGTCCGGAATATCCAACGATGGAAAATAAAACGGTACAAGGTGAAATCGTTCAA GGTCCCGATTTTCTAACAATGGAACAAAGCGGCCCATCATTAAGCAATAATTATACAAACCC ACCGTTAACGAACCCTATTTTAGAAGGTCTTGAAGGTAGCTCATCTAAACTTGAAATAAAAC CACAAGGTACTGAATCAACGTTAAAAGGTACTCAAGGAGAATCAAGTGATATTGAAGTTAAA CCTCAAGCAACTGAAACAACAGAAGCTTCTCAATATGGTCCG (SEQ ID NO: 45)

R

AGACCGCAATTTAACAAAACACCTAAATATGTTAAATATAGAGATGCTGGTACAGGTATCCG TGAATACAACGATGGAACATTTGGATATGAAGCGAGACCAAGATTCAATAAGCCATCAGAAA CAAATGCATATAACGTAACAACACATGCAAATGGTCAAGTATCATACGGAGCTCGTCCGACA CAAAACAAGCCAAGCAAAACAAACGCATATAACGTAACAACACATGGAAACGGCCAAGTATC ATATGGCGCTCGCCCAACACAAAACAAGCCAAGCAAAACAAATGCATACAACGTAACAACAC ATGCAAACGGTCAAGTGTCATACGGAGCTCGCCCGACATACAAGAAGCCAAGTAAAACAAAT GCATACAATGTAACAACACATGCAGATGGTACTGCGACATATGGGCCTAGAGTAACAAAATA

A (SEQ ID NO: 46)

N315

D1-ATGAAAAAGCAAATAATTTCGCTAGGCGCATTAGCAGTTGCATCTAGCTTATTTACA TGGGATAACAAAGCAGATGCGATAGTAACAAAGGATTATAGTAAAGAATCAAGAGTGAATGA GAAAAGTAAAAAGGGAGCTACTGTTTCAGATTATTACTATTGGAAAATAATTGATAGTTTAG AGGCACAATTTACTGGAGCAATAGACTTATTGGAAGATTATAAATATGGAGATCCTATCTAT AAAGAAGCGAAAGATAGATTGATGACAAGAGTATTAGGAGAAGACCAGTATTTATTAAAGAA AAAGATTGATGAATATGAGCTTTATAAAAAGTGGTATAAAAGTTCAAATAAGAACACTAATA TGCTTACTTTCCATAAATATAATCTTTACAATTTAACAATGAATGAATATAACGATATTTTT AACTCTTTGAAAGATGCAGTTTATCAATTTAATAAAGAAGTTAAAGAAATAGAGCATAAAAA TGTTGACTTGAAGCAGTTT (SEQ ID NO: 47)

D2-GATAAAGATGGAGAAGACAAGGCAACTAAAGAAGTTTATGACCTTGTTTCTGAAATT GATACATTAGTTGTAACTTATTATGCTGATAAGGATTATGGGGAGCATGCGAAAGAGTTACG AGCAAAACTGGACTTAATCCTTGGAGATACAGACAATCCACATAAAATTACAAATGAGCGTA TAAAAAAAGAAATGATCGATGACTTAAATTCAATTATAGATGATTTCTTTATGGAGACTAAA CAAAATAGACCGAATTCTATAACAAAATATGATCCAACAAAACACAATTTTAAAGAGAAGAG TGAAAATAAACCTAATTTTGATAAATTAGTTGAAGAAACAAAAAAAGCAGTTAAAGAAGCAG ACGAATCTTGGAAAAATAAAACTGTCAAAAAA (SEQ ID NO: 48)

L

TACGAGGAAACTGTAACAAAATCTCCTGTTGTAAAAGAAGAGAAGAAAGTTGAAGAA CCTCAATTACCTAAAGTTGGAAACCAGCAAGAGGTTAAAACTACGGCTGGTAAAGCTGAAGA AACAACACAACCAGTGGCACAGCCATTAGTAAAAATTCCACAAGAAACAATCTATGGTGAAA CTGTAAAAGGTCCAGAATATCCAACGATGGAAAATAAAACGTTACAAGGTGAAATCGTTCAA GGTCCCGATTTTCTAACAATGGAACAAAACAGACCATCTTTAAGCGATAATTATACTCAACC GACGACACCGAACCCTATTTTAGAAGGTCTTGAAGGTAGCTCATCTAAACTTGAAATAAAAC CACAAGGTACTGAATCAACGTTGAAAGGTATTCAAGGAGAATCAAGTGATATTGAAGTTAAA CCTCAAGCAACTGAAACAACAGAAGCTTCTCAATATGGTCCG (SEQ ID NO: 49)

R-AGACCGCAATTTAACAAAACACCTAAGTATGTGAAATATAGAGATGCTGGTACAGGT ATCCGTGAATACAACGATGGAACATTTGGATATGAAGCGAGACCAAGATTCAACAAGCCAAG TGAAACAAATGCATACAACGTAACGACAAATCAAGATGGCACAGTATCATACGGAGCTCGCC CAACACAAAACAAGCCAAGTGAAACAAACGCATATAACGTAACAACACATGCAAATGGTCAA GTATCATACGGTGCTCGCCCAACACAAAAAAAGCCAAGCAAAACAAATGCATACAACGTAAC AACACATGCAAATGGTCAAGTATCATATGGCGCTCGCCCGACACAAAAAAAGCCAAGCAAAA CAAATGCATATAACGTAACAACACATGCAAATGGTCAAGTATCATACGGAGCTCGCCCGACA TACAAGAAGCCAAGCGAAACAAATGCATACAACGTAACAACACATGCAAATGGTCAAGTATC ATATGGCGCTCGCCCGACACAAAAAAAGCCAAGCGAAACAAACGCATATAACGTAACAACAC ATGCAGATGGTACTGCGACATATGGGCCTAGAGTAACAAAATAA (SEQ ID NO: 50)

Cepa MW2

D1-ATGAAAAAGCAAATAATTTCGCTAGGCGCATTAGCAGTTGCATCTAGCTTATTTACA TGGGATAACAAAGCAGATGCGATAGTAACAAAGGATTATAGTGGGAAATCACAAGTTAATGC TGGGAGTAAAAATGGGAAACAAATTGCAGATGGATATTATTGGGGAATAATTGAAAATCTAG AAAACCAGTTTTACAATATTTTTCATTTACTGGATCAGCATAAATATGCAGAAAAAGAATAT AAAGATGCAGTAGATAAATTAAAAACTAGAGTTTTAGAGGAAGACCAATACCTGCTAGAAAG AAAAAAAGAAAAATACGAAATTTATAAAGAACTATATAAAAAATACAAAAAAGAGAATCCTA ATACTCAAGTTAAAATGAAAGCATTTGATAAATACGATCTTGGCGATTTAACTATGGAAGAA TACAATGACTTATCAAAATTATTAACAAAAGCATTGGATAACTTTAAGTTAGAAGTAAAGAA AATTGAATCAGAGAATCCAGATTTAAAACCATAT (SEQ ID NO: 51)

D2

TCTGAAAGCGAAGAAAGAACAGCATATGGTAAAATAGATTCACTTGTTGATCAAGCATATAG TGTATATTTTGCCTACGTTACAGATGCACAACATAAAACAGAAGCATTAAATCTTAGGGCGA AAATTGATTTGATTTTAGGTGATGAAAAAGATCCAATTAGAGTTACGAATCAACGTACTGAA AAAGAAATGATTAAAGATTTAGAATCTATTATTGATGATTTCTTCATTGAAACCAAGTTGAA TAGACCTAAACACATTACTAGGTATGATGGAACTAAACATGATTACCATAAACATAAAGATG GATTTGATGCTCTAGTTAAAGAAACAAGAGAAGCGGTTGCAAAGGCTGACGAATCTTGGAAA AATAAAACTGTCAAAAAA (SEQ ID NO: 52)

L TACGAGGAAACTGTAACAAAATCTCCAGTTGTAAAAGAAGAGAAGAAAGTTGAAGAA CCTCAATCACCTAAATTTGATAACCAACAAGAGGTTAAAATTACAGTTGATAAAGCTGAAGA AACAACACAACCAGTGGCACAGCCATTAGTTAAAATTCCACAGGGCACAATTACAGGTGAAA TTGTAAAAGGTCCGGAATATCCAACGATGGAAAATAAAACGTTACAAGGTGAAATCGTTCAA GGTCCAGATTTCCCAACAATGGAACAAAACAGACCATCTTTAAGCGATAATTATACTCAACC GACGACACCGAACCCTATTTTAGAAGGTCTTGAAGGTAGCTCATCTAAACTTGAAATAAAAC CACAAGGTACTGAATCAACGTTAAAAGGTACTCAAGGAGAATCAAGTGATATTGAAGTTAAA CCTCAAGCATCTGAAACAACAGAAGCATCACATTATCCAGCAAGACCTCAATTTAACAAAAC ACCTAAATATGTTAAATATAGAGATGCTGGTACAGGTATCCGTGAATACAACGATGGAACAT TTGGATATGAA (SEQ ID NO: 53)

R-GCGAGACCAAGATTCAATAAGCCATCAGAAACAAACGCATACAACGTAACGACAAATCAAGA

TGGCACAGTAACATATGGCGCTCGCCCAACACAAAACAAACCAAGCAAAACAAATGCATACA ACGTAACAACACATGCAAATGGTCAAGTATCATATGGCGCTCGCCCGACACAAAACAAGCCA AGCAAAACAAATGCATATAACGTAACAACACATGCAAATGGTCAAGTATCATACGGAGCTCG CCCGACACAAAACAAGCCAAGCAAAACAAATGCATATAACGTAACAACACACGCAAACGGTC AAGTGTCATACGGAGCTCGCCCGACATACAAGAAGCCAAGTAAAACAAATGCATACAATGTA ACAACACATGCAGATGGTACTGCGACATATGGGCCTAGAGTAACAAAATAA (SEQ ID NO: 54)

Cepa MRSA252

D1

ATGAAAAAGCAAATAATTTCGCTAGGCGCATTAGCAGTTGCATCTAGCTTATTTACATGGGA TAACAAAGCAGATGCGATAGTAACTAAAGATTATAGTAAAGAATCAAGAGTGAATGAGAACA GTAAATACGATACACCAATTCCAGATTGGTATCTAGGTAGTATTTTAAACAGATTAGGGGAT CAAATATACTACGCTAAGGAATTAACTAATAAATACGAATATGGTGAGAAAGAGTATAAGCA AGCGATAGATAAATTGATGACTAGAGTTTTGGGAGAAGATCATTATCTATTAGAAAAAAAGA AAGCACAATATGAAGCATACAAAAAATGGTTTGAAAAACATAAAAGTGAAAATCCACATTCT AGTTTAAAAAAGATTAAATTTGACGATTTTGATTTATATAGATTAACGAAGAAAGAATACAA TGAGTTACATCAATCATTAAAAGAAGCTGTTGATGAGTTTAATAGTGAAGTGAAAAATATTC AATCTAAACAAAAGGATTTATTACCTTAT (SEQ ID NO: 55)

D2-GATGAAGCAACTGAAAATCGAGTAACAAATGGAATATATGATTTTGTTTGCGAGATTGACAC ATTATACGCAGCATATTTTAATCATAGCCAATATGGTCATAATGCTAAAGAATTAAGAGCAA AGCTAGATATAATTCTTGGTGATGCTAAAGATCCTGTTAGAATTACGAATGAAAGAATAAGA AAAGAAATGATGGATGATTTAAATTCTATTATTGATGATTTCTTTATGGATACAAACATGAA TAGACCATTAAACATAACTAAATTTAATCCGAATATTCATGACTATACTAATAAGCCTGAAA ATAGAGATAACTTCGATAAATTAGTCAAAGAAACAAGAGAAGCAATCGCAAACGCTGACGAA TCTTGGAAAACAAGAACCGTCAAAAAT (SEQ ID NO: 56)

L-

TACGGTGAATCTGAAACAAAATCTCCTGTTGTAAAAGAAGAGAAGAAAGTTGAAGAACCTCA ATTACCTAAAGTTGGAAACCAGCAAGAGGATAAAATTACAGTTGGTACAACTGAAGAAGCAC

CATTACCAATTGCGCAACCACTAGTTAAAATTCCACAGGGCACAATTCAAGGTGAAATTGTA AAAGGTCCGGAATATCTAACGATGGAAAATAAAACGTTACAAGGTGAAATCGTTCAAGGTCC AGATTTCCCAACAATGGAACAAAACAGACCATCTTTAAGCGATAATTATACTCAACCGACGA CACCGAACCCTATTTTAAAAGGTATTGAAGGAAACTCAACTAAACTTGAAATAAAACCACAA GGTACTGAATCAACGTTAAAAGGTACTCAAGGAGAATCAAGTGATATTGAAGTTAAACCTCA AGCAACTGAAACAACAGAAGCATCACATTATCCAGCGAGACCTCAATTTAACAAAACACCTA AGTATGTGAAATATAGAGATGCTGGTACAGGTATCCGTGAATACAACGATGGAACATTTGGA TATGAA (SEQ ID NO: 57)

R

GCGAGACCAAGATTCAACAAGCCAAGCGAAACAAATGCATACAACGTAACGACAAATCAAGA TGGCACAGTATCATATGGCGCTCGCCCGACACAAAACAAGCCAAGCGAAACAAACGCATATA ACGTAACAACACATGCAAACGGCCAAGTATCATACGGAGCTCGTCCGACACAAAACAAGCCA AGCGAAACGAACGCATATAACGTAACAACACATGCAAACGGTCAAGTGTCATACGGAGCTCG CCCAACACAAAACAAGCCAAGTAAAACAAATGCATACAATGTAACAACACATGCAGATGGTA CTGCGACATATGGTCCTAGAGTAACAAAATAA (SEQ ID NO: 58)

Cepa WIS

D1-

ATAGTAACAAAGGATTATAGTGGGAAATCACAAGTTAATGCTGGGAGTAAAAATGGG AAACAAATTGCAGATGGATATTATTGGGGAATAATTGAAAATCTAGAGAACCAGTTTTACAA TATTTTTCATTTATTGGATCAGCATAAATATGCAGAAAAAGAATATAAAGATGCATTAGATA AATTAAAAACTAGAGTTTTAGAGGAAGACCAATACCTGCTAGAAAGAAAAAAAGAAAAATAC GAAATTTATAAAGAACTATATAAAAAATACAAAAAAGAGAATCCTAATACTCAGGTTAAAAT GAAAGCATTTGATAAATACGATCTTGGCGATTTAACTATGGAAGAATACAATGACTTATCAA AATTATTAACAAAAGCATTGGATAACTTTAAGTTAGAAGTAAAGAAAATTGAATCAGAGAAT CCAGATTTAAGACCATAT (SEQ ID NO: 59)

D2-

TCTGAAAGTGAAGAGAGAACAGCATATGGTAAAATAGATTCACTTGTTGATCAAGCATATAG TGTATATTTTGCCTACGTTACAGATGCTCAACATAAAACAGAAGCATTAAATCTTAGGGCAA AAATAGATTTGATTTTAGGTGATGAAAAAGATCCAATTAGAGTGACGAATCAACGTACTGAA AAAGAAATGATTAAAGATTTAGAATCTATTATTGATGATTTCTTCATTGAAACAAAGTTGAA

TAGACCTCAACACATTACTAGATATGATGGAACTAAACATGATTACCATAAACATAAAGATG GATTTGATGCTTTAGTTAAAGAAACAAGAGAAGCGGTTTCTAAGGCTGACGAATCTTGGAAA ACTAAAACTGTCAAAAAA (SEQ ID NO: 60)

L

TACGGGGAAACTGAAACAAAATATCCTGTTGTAAAAGAAGAGAAGAAAGTTGAAGAACCTCA ATCACCTAAAGTTTCTGAAAAAGTGGATGTTCAGGAAACGGTTGGTACAACTGAAGAAGCAC CATTACCAATTGCGCAACCACTAGTTAAATTACCACAAATTGGGACTCAAGGCGAAATTGTA AAAGGTCCCGACTATCCAACTATGGAAAATAAAACGTTACAAGGTGTAATTGTTCAAGGTCC AGATTTCCCAACAATGGAACAAAACAGACCATCTTTAAGTGACAATTATACACAACCATCTG TGACTTTACCGTCAATTACAGGTGAAAGTACACCAACGAACCCTATTTTAAAAGGTATTGAA GGAAACTCATCTAAACTTGAAATAAAACCACAAGGTACTGAATCAACGTTGAAAGGTATTCA AGGAGAATCAAGTGATATTGAAGTTAAACCTCAAGCAACTGAAACAACAGAAGCATCACATT ATCCAGCGAGACCGCAATTTAACAAAACACCTAAATATGTGAAATATAGAGATGCTGGTACA GGTATTCGTGAATACAACGATGGAACTTTTGGATATGAA (SEQ ID NO: 61)

R GCGAGACCAAGATTCAACAAGCCATCAGAAACAAACGCATACAACGTAACGACAAATCAAGA TGGCACAGTATCATATGGGGCTCGCCCAACACAAAACAAGCCAAGCAAAACAAATGCATATA ACGTAACAACACATGCAAACGGCCAAGTATCATATGGCGCTCGCCCGACATACAACAAGCCA AGTGAAACAAATGCATACAACGTAACGACAAATCGAGATGGCACAGTATCATATGGCGCTCG CCCGACACAAAACAAGCCAAGCGAAACGAATGCATATAACGTAACAACACACGGAAATGGCC AAGTATCATATGGCGCTCGTCCGACACAAAAGAAGCCAAGCAAAACAAATGCATATAACGTA ACAACACATGCAAACGGCCAAGTATCATATGGCGCTCGTCCGACATACAACAAGCCAAGTAA AACAAATGCATACAATGTAACAACACATGCAGATGGTACTGCGACATATGGTCCTAGAGTAA CAAAATAA (SEQ ID NO: 62)

MU50

D1-

GATTGGGCAATTACATTTTGGAGGAATTAAAAAATTATGAAAAAGCAAATAATTTCGCTAGG CGCATTAGCAGTTGCATCTAGCTTATTTACATGGGATAACAAAGCAGATGCGATAGTAACAA AGGATTATAGTAAAGAATCAAGAGTGAATGAGAAAAGTAAAAAGGGAGCTACTGTTTCAGAT TATTACTATTGGAAAATAATTGATAGTTTAGAGGCACAATTTACTGGAGCAATAGACTTATT GGAAGATTATAAATATGGAGATCCTATCTATAAAGAAGCGAAAGATAGATTGATGACAAGAG TATTAGGAGAAGACCAGTATTTATTAAAGAAAAAGATTGATGAATATGAGCTTTATAAAAAG TGGTATAAAAGTTCAAATAAGAACACTAATATGCTTACTTTCCATAAATATAATCTTTACAA TTTAACAATGAATGAATATAACGATATTTTTAACTCTTTGAAAGATGCAGTTTATCAATTTA ATAAAGAAGTTAAAGAAATAGAGCATAAAAATGTTGACTTGAAGCAGTTT (SEQ ID NO: 63)

D2-

GATAAAGATGGAGAAGACAAGGCAACTAAAGAAGTTTATGACCTTGTTTCTGAAATT GATACATTAGTTGTAACTTATTATGCTGATAAGGATTATGGGGAGCATGCGAAAGAGTTACG AGCAAAACTGGACTTAATCCTTGGAGATACAGACAATCCACATAAAATTACAAATGAGCGTA TAAAAAAAGAAATGATCGATGACTTAAATTCAATTATAGATGATTTCTTTATGGAGACTAAA CAAAATAGACCGAATTCTATAACAAAATATGATCCAACAAAACACAATTTTAAAGAGAAGAG TGAAAATAAACCTAATTTTGATAAATTAGTTGAAGAAACAAAAAAAGCAGTTAAAGAAGCAG ACGAATCTTGGAAAAATAAAACTGTCAAAAAA (SEQ ID NO: 64)

L

TACGAGGAAACTGTAACAAAATCTCCTGTTGTAAAAGAAGAGAAGAAAGTTGAAGAACCTCA ATTACCTAAAGTTGGAAACCAGCAAGAGGTTAAAACTACGGCTGGTAAAGCTGAAGAAACAA CACAACCAGTGGCACAGCCATTAGTAAAAATTCCACAAGAAACAATCTATGGTGAAACTGTA AAAGGTCCAGAATATCCAACGATGGAAAATAAAACGTTACAAGGTGAAATCGTTCAAGGTCC CGATTTTCTAACAATGGAACAAAACAGACCATCTTTAAGCGATAATTATACTCAACCGACGA CACCGAACCCTATTTTAGAAGGTCTTGAAGGTAGCTCATCTAAACTTGAAATAAAACCACAA GGTACTGAATCAACGTTGAAAGGTATTCAAGGAGAATCAAGTGATATTGAAGTTAAACCTCA AGCAACTGAAACAACAGAAGCTTCTCAATATGGTCCG (SEQ ID NO: 65)

R

AGACCGCAATTTAACAAAACACCTAAGTATGTGAAATATAGAGATGCTGGTACAGGTATCCG TGAATACAACGATGGAACATTTGGATATGAAGCGAGACCAAGATTCAACAAGCCAAGTGAAA CAAATGCATACAACGTAACGACAAATCAAGATGGCACAGTATCATACGGAGCTCGCCCAACA CAAAACAAGCCAAGTGAAACAAACGCATATAACGTAACAACACATGCAAATGGTCAAGTATC ATACGGTGCTCGCCCAACACAAAAAAAGCCAAGCAAAACAAATGCATACAACGTAACAACAC ATGCAAATGGTCAAGTATCATATGGCGCTCGCCCGACACAAAAAAAGCCAAGCAAAACAAAT GCATATAACGTAACAACACATGCAAATGGTCAAGTATCATACGGAGCTCGCCCGACATACAA

GAAGCCAAGCGAAACAAATGCATACAACGTAACAACACATGCAAATGGTCAAGTATCATATG GCGCTCGCCCGACACAAAAAAAGCCAAGCGAAACAAACGCATATAACGTAACAACACATGCA GATGGTACTGCGACATATGGGCCTAGAGTAACAAAATAA (SEQ ID NO: 66)

/2082

D1-

ATAGTAACTAAAGATTATAGTAAAGAATCAAGAGTGAATGAGAACAGTAAATACGATACACC AATTCCAGATTGGTATCTAGGTAGTATTTTAAACAGATTAGGGGATCAAATATACTACGCTA AGGAATTAACTAATAAATACGAATATGGTGAGAAAGAGTATAAGCAAGCGATAGATAAATTG ATGACTAGAGTTTTGGGAGAAGATCATTATCTATTAGAAAAAAAGAAAGCACAATATGAAGC ATACAAAAAATGGTTTGAAAAACATAAAAGTGAAAATCCACATTCTAGTTTAAAAAAGATTA AATTTGACGATTTTGATTTATATAGATTAACGAAGAAAGAATACAATGAGTTACATCAATCA TTAAAAGAAGCTGTTGATGAGTTTAATAGTGAAGTGAAAAATATTCAATCTAAACAAAAGGA TTTATTACCTTAT (SEQ ID NO: 67)

D2-

GATGAAGCAACTGAAAATCGAGTAACAAATGGAATATATGATTTTGTTTGCGAGATTGACAC ATTATACGCAGCATATTTTAATCATAGCCAATATGGTCATAATGCTAAAGAATTAAGAGCAA AGCTAGATATAATTCTTGGTGATGCTAAAGATCCTGTTAGAATTACGAATGAAAGAATAAGA AAAGAAATGATGGATGATTTAAATTCTATTATTGATGATTTCTTTATGGATACAAACATGAA TAGACCATTAAACATAACTAAATTTAATCCGAATATTCATGACTATACTAATAAGCCTGAAA ATAGAGATAACTTCGATAAATTAGTCAAAGAAACAAGAGAAGCAGTCGCAAACGCTGACGAA TCTTGGAAAACAAGAACCGTCAAAAAT (SEQ ID NO: 68)

L

TACGGTGAATCTGAAACAAAATCTCCTGTTGTAAAAGAAGAGAAGAAAGTTGAAGAACCTCA ATTACCTAAAGTTGGAAACCAGCAAGAGGATAAAATTACAGTTGGTACAACTGAAGAAGCAC CATTACCAATTGCGCAACCACTAGTTAAAATTCCACAGGGCACAATTCAAGGTGAAATTGTA AAAGGTCCGGAATATCTAACGATGGAAAATAAAACGTTACAAGGTGAAATCGTTCAAGGTCC AGATTTCCCAACAATGGAACAAAACAGACCATCTTTAAGCGATAATTATACTCAACCGACGA CACCGAACCCTATTTTAAAAGGTATTGAAGGAAACTCAACTAAACTTGAAATAAAACCACAA GGTACTGAATCAACGTTAAAAGGTACTCAAGGAGAATCAAGTGATATTGAAGTTAAACCTCA AGCAACTGAAACAACAGAAGCATCACATTATCCAGCGAGACCTCAATTTAACAAAACACCTA

AGTATGTGAAATATAGAGATGCTGGTACAGGTATCCGTGAATACAACGATGGAACATTTGGA TATGAA (SEQ ID NO: 69)

R-GCGAGACCAAGATTCAACAAGCCAAGCGAAACAAATGCATACAACGTAACGACAAATCAAGA TGGCACAGTATCATATGGCGCTCGCCCGACACAAAACAAACCAAGCGAAACAAATGCATACA ACGTAACAACACATGCAAACGGCCAAGTATCATATGGCGCCCGCCCAACATACAAGAAGCCA AGCGAAACAAACGCATACAACGTAACGACAAATCAAGATGGCACAGTATCATATGGCGCTCG CCCGACACAAAACAAGCCAAGCGAAACAAACGCATATAACGTAACAACACATGCAAACGGCC AAGTATCATACGGAGCTCGTCCGACACAAAACAAGCCAAGCGAAACGAACGCATATAACGTA ACAACACATGCAAACGGTCAAGTGTCATACGGAGCTCGCCCAACACAAAACAAGCCAAGTAA AACAAATGCATACAATGTAACAACACATGCAGATGGTACTGCGACATATGGTCCTAGAGTAA CAAAATAA (SEQ ID NO: 70)

Newman

D1

atgaaaaagcaaataatttcgctaggcgcattagcagttgcatctagcttatttacatggga taacaaagcagatgcgatagtaacaaaggattatagtgggaaatcacaagttaatgctggga gtaaaaatgggacattaatagatagcagatatttaaattcagctctatattatttggaagac tatataatttatgctataggattaactaataaatatgaatatggagataatatttataaaga agctaaagataggttgttggaaaaggtattaagggaagatcaatatcttttggagagaaaga aatctcaatatgaagattataaacaatggtatgcaaattataaaaaagaaaatcctcgtaca gatttaaaaatggctaattttcataaatataatttagaagaactttcgatgaaagaatacaa tgaactacaggatgcattaaagagagcactggatgattttcacagagaagttaaagatatta aggataagaattcagacttgaaaactttt (SEQ ID NO: 71)

D2-

aatgcagcagaagaagataaagcaactaaggaagtatacgatctcgtatctgaaattgatac attagttgtatcatattatggtgataaggattatggggagcacgcgaaagagttacgagcaa aactggacttaatccttggagatacagacaatccacataaaattacaaatgaacgtattaaa aaagaaatgattgatgacttaaattcaattattgatgatttctttatggaaactaaacaaaa tagaccgaaatctataacgaaatataatcctacaacacataactataaaacaaatagtgata

ataaacctaattttgataaattagttgaagaaacgaaaaaagcagttaaagaagcagatgat tcttggaaaaagaaaactgtcaaaaaa (SEQ ID NO? 72)

L-

tacggagaaactgaaacaaaatcgccagtagtaaaagaagagaagaaagttgaagaacctca agcacctaaagttgataaccaacaagaggttaaaactacggctggtaaagctgaagaaacaa cacaaccagttgcacaaccattagttaaaattccacagggcacaattacaggtgaaattgta aaaggtccggaatatccaacgatggaaaataaaacggtacaaggtgaaatcgttcaaggtcc cgattttctaacaatggaacaaagcggcccatcattaagcaataattatacaaacccaccgt taacgaaccctattttagaaggtcttgaaggtagctcatctaaacttgaaataaaaccacaa ggtactgaatcaacgttaaaaggtactcaaggagaatcaagtgatattgaagttaaacctca agcaactgaaacaacagaagcttctcaatatggtccg (SEQ ID NO: 73)

R

agaccgcaatttaacaaaacacctaaatatgttaaatatagagatgctggtacaggtatccg tgaatacaacgatggaacatttggatatgaagcgagaccaagattcaataagccatcagaaa caaatgcatataacgtaacaacacatgcaaatggtcaagtatcatacggagctcgtccgaca tacaagaagccaagcgaaacgaatgcatacaatgtaacaacacatgcaaacggccaagtatc atacggagctcgtccgacacaaaacaagccaagcaaaacaaacgcatataacgtaacaacac atggaaacggccaagtatcatatggcgctcgcccaacacaaaacaagccaagcaaaacaaat gcatacaacgtaacaacacatgcaaacggtcaagtgtcatacggagctcgcccgacatacaa gaagccaagtaaaacaaatgcatacaatgtaacaacacatgcagatggtactgcgacatatg ggcctagagtaacaaaataa (SEQ ID NO: 74)

Polipéptido de vWbp de longitud completa de la cepa USA 300

mknkllvlsl galcvsqiwe snrasavvsg eknpyvsesl kltnnknksr tveeykksld dliwsfpnld nerfdnpeyk eamkkyqqrf maedealkkf fseekkikng ntdnldylgl sheryesvfn tlkkqseef1 keiedikkdn pelkdfneee qlkcdlelnk lenqilmlgk tfyqnyrddv eslyskldli mgykdeeran kkavnkrmle nkkedletii deffsdidkt rpnnipvled ekqeeknhkn maqlksdtea aksdeskrsk rskrslntqn hkpasqevse qqkaeydkra eerkarfldn qkikktpvvs leydfehkqr idnendkklv vsaptkkpts pttytetttq vpmptverqt qqqiiynapk qlaglngesh dfttthqspt tsnhthnnvv efeetsalpg rksgslvgis qidsshlter

ekrvikrehv reaqklvdny kdthsykdri naqqkvntls eghqkrfnkq inkvyngk (SEQ ID NO: 75)

Secuencias adicionales de vWbp:

USA300

GTGGTTTCTGGGGAGAAGAATCCATATGTATCTGAGTCGTTGAAACTGACTAATAATAAAAATAAATCT AGAACAGTAGAAGAGTATAAGAAAAGCTTGGATGATTTAATATGGTCCTTTCCAAACTTAGATAATGAAAGATTT GATAATCCTGAATATAAAGAAGCTATGAAAAAATATCAACAGAGATTTATGGCTGAAGATGAGGCTTTGAAGAAA TTTTTTAGTGAAGAGAAAAAAATAAAAAATGGAAATACTGATAATTTAGATTATCTAGGATTATCTCATGAAAGA TATGAAAGTGTATTTAATACTTTGAAAAAACAAAGTGAGGAGTTCTTAAAAGAAATTGAAGATATAAAAAAAGAT AACCCTGAATTGAAAGACTTTAATGAAGAGGAGCAATTAAAGTGCGACTTAGAATTAAACAAATTAGAAAATCAG ATATTAATGTTAGGTAAAACATTTTATCAAAACTATAGAGATGATGTTGAAAGTTTATATAGTAAGTTAGATTTA ATTATGGGATATAAAGATGAAGAAAGAGCAAATAAAAAAGCAGTTAACAAAAGGATGTTAGAAAATAAAAAAGAA GACTTAGAAACCATAATTGATGAATTTTTTAGTGATATAGATAAAACAAGACCTAATAATATTCCTGTTTTAGAA GATGAAAAACAAGAAGAGAAAAATCATAAAAATATGGCTCAATTAAAATCTGACACTGAAGCAGCAAAAAGTGAT GAATCAAAAAGAAGCAAGAGAAGTAAAAGAAGTTTAAATACTCAAAATCACAAACCTGCATCTCAAGAAGTTTCT GAACAACAAAAAGCTGAATATGATAAAAGAGCAGAAGAAAGAAAAGCGAGATTTTTGGATAATCAAAAAATTAAG AAAACACCTGTAGTGTCATTAGAATATGATTTTGAGCATAAACAACGTATTGACAACGAAAACGACAAGAAACTT GTGGTTTCTGCACCAACAAAGAAACCAACATCACCGACTACATATACTGAAACAACGACACAGGTACCAATGCCT ACAGTTGAGCGTCAAACTCAGCAACAAATTATTTATAATGCACCAAAACAATTGGCTGGATTAAATGGTGAAAGT CATGATTTCACAACAACGCATCAATCACCAACAACTTCAAATCACACGCATAATAATGTTGTTGAATTTGAAGAA ACGTCTGCTTTACCTGGTAGAAAATCAGGATCACTGGTTGGTATAAGTCAAATTGATTCTTCTCATCTAACTGAA CGTGAGAAGCGTGTAATTAAGCGTGAACACGTTAGAGAAGCTCAAAAGTTAGTTGATAATTATAAAGATACACAT AGTTATAAAGACCGAATAAATGCACAACAAAAAGTAAATACTTTAAGTGAAGGTCATCAAAAACGTTTTAATAAA ^{CAAATCAATAAAGTATATAATGGCAAATAA} (SEQ ID NO: ^{76 )}

N315

GTGGTTTCTGGGGAGAAGAATCCATATGTATCAAAAGCTTTAGAATTGAAAGATAAAAGTAATAAATCC AATTCTTACGAAAATTATAGAGATAGTTTAGAAAGTTTGATTTCATCATTATCTTTTGCTGATTATGAAAAATAT GAAGAGCCAGAATATGAAAAGGCTGTAAAAAAATATCAACAAAAATTTATGGCTGAAGATGATGCATTAAAAAAT TTTTTAAATGAAGAAAAGAAGATAAAAAATGCAGATATTAGCAGAAAATCGAATAATTTATTAGGTTTAACACAT GAAAGATATTCTTATATTTTTGATACATTAAAGAAAAATAAACAAGAGTTTTTAAAAGATATTGAAGAAATACAA CTGAAAAATAGTGATTTAAAGGACTTTAACAATACAGAGCAACATAATGCCGACGTAGAAATAAACAATTTAGAA AATAAAGTATTAATGGTAGGGTATACATTCTATAATACAAATAAGGACGAAGTTGAAGAATTATATAGTGAGTTA GATTTGATTGTTGGAGAAGTTCAAGATAAGTCGGATAAAAAAAGAGCAGTAAATCAAAGGATGTTAAATAGAAAA AAAGAGGATTTAGAATTTATTATAGATAAATTTTTTAAAAAAATTCAACAAGAACGTCCAGAGAGTATACCAGCA TTAACTAGTGAAAAAAATCATAATCAGACTATGGCATTAAAGTTAAAAGCAGATACAGAAGCTGCTAAAAATGAC GTATCAAAAAGAAGTAAAAGAAGTTTAAATACTCAAAATAATAAATCTACAACACAAGAAATTTCTGAAGAACAA AAAGCTGAATATCAAAGAAAGTCAGAGGCATTAAAAGAAAGATTTATAAACAGACAAAAATCTAAAAATGAGTCT GTGGTTTCACTAATCGATGACGAAGACGACAACGAAAACGACAGGCAACTTGTGGTTTCTGCGCCATCAAAGAAA CCAACAACACCGACTACATATACTGAAACAACGACTCAGGTACCAATGCCTACAGTTGAGCGTCAAACTCAGCAA CAAATCGTTTACAAAACACCAAAACCATTAGCTGGATTAAATGGTGAAAGTCATGATTTCACAACAACGCATCAA TCACCAACAACTTCAAATCATACGCATAATAATGTTGTTGAATTTGAAGAAACGTCTGCTTTACCTGGTAGAAAA TCAGGATCACTGGTTGGTATAAGTCAAATTGATTCTTCTCATCTAACTGAACGTGAGAAGCGTGTAATCAAGCGT GAACACGTTAGAGAAGCTCAAAAGTTAGTTGATAATTATAAAGATACACATAGTTATAAAGACCGATTAAATGCA CAACAAAAAGTAAATACTTTAAGTGAAGGTCATCAAAAACGTTTTAATAAACAAATCAATAAAGTATACAATGGC ^AAATAA (SEQ ID NO: 77)

MRSA252

GTGGTTTCTGGGGAGGAGAATCCATATAAATCTGAGTCATTGAAATTAAATGGGAAAAGAAGTACTACA ATAACTAGTGATAAATATGAAGAAAATTTAGATATGTTAATATCGTCATTATCATTTGCAGATTATGAAAAATAT GAGGAACCAGAATACAAAGAAGCAGTTAAAAAGTATCAACAAAAATTTATGGCTGAAGATGATGCATTAAAAAAT TTTTTAGTGAAGAGAAAAAAATAAAAAATAGAAATACTAATACATCAAATTATCTGGGATTAACACACGAAAGAT ATGAGTCAATTTATAATTCATTAAAAAATCATCGTGAAGAATTTTCAAAAGAAATCGAAGAAATTAATAATAAAA ATCCAGTGTTAAAAGAATATAACAATGAGGAACAAACTAAAGCTGATACGGAATTAAACACTCTTGAAAATCAAG TACTAATGATAGGTTATACATTTTATCACTCGAATAAAAATGAAGTAGAAGATTTATATAACAAATTAGATATGA TTCTTGGTTATAAAGATGAAGAGAGAAAAAAGAAGAGGGCTACCAATCAAAGAATGTTCAATAATAAAAAAGAGG ATTTAGAAACTATTATTGATGAATTCTTTGGAGAAATTGGACAACAAAGGCCAACATCTATACCAACATTAGCGC CTAAAGAAGAAAAAGAAACAAATATAAAAAATGCAAATAAATTAAAATCTGACACTGAAGCAGCAAAAAATGATG AAGCAAAAAGAAGTTTAAATACCCACAATCACAAATCTGTATCTCAAGAAGTCTCTGAACAACAAAAAGCTGACT ACGAAAGAAAAGCTGAAGAAAGAAAAGCGAGATTTTTAGATAAGCAAAAAAATAAGAAAACTCCTGTAGTTTCAT TAGAATATGATTTTGAACATAAACAACGTGTTGACAACGAAAACGACAAGCAACTTGTGGTTTCTGAGCCATCAA AGAAACCAACAACACCGCCTACATACACTGAAACAACCACACAGCTACCAATGCCTACAGTTGAGCGTCAAACAC AGCAACAAATCGTTTACAAAGCACCAAAACCATTAGCTGGATTAAATGGTGAAAGTCATGATTTCACAACAACGC ATCAATCACCAACTACTTCAAATCACACGCATAATCATCTTATTGAAATTGAAGAAACATCTGCTTTACCTGGTA GAAAGACAGGTTCATTGGTTGGTTTGAGTCAAATTGATTCTTCGCATTTAACTGAACGTGAGAAGCGCGTGATTA AACGTGAACACGTGAGAGAAGCTCAAAAGTTAGTTGATAATTATAAAGATACACATAGTTATAAAGACCGATTAA ATGCCCAACAAAAAGTAAATACTTTAAGTGCAGGTCATCAAAAACGTTTTAATAAACAAATTAATAAAGTATATA ATGGCAAATAATTAATGCATGGCTGCAAAGGAAATAATGAGTTTGCCGTAAAAATAACAACATTTTAAACTAGCA ATAAATAATATCAAAGTCATCATTTCAATGATGCAATCTAGTATAGTCCACATTCTAAACAGGTGTGGACTATTA CTTTTTTCACTTTATATTACGAAAAAATTATTATGCTTAACTATCAATATCAATAATTAATTTTAAGCTGAAAAA

CAATAAAAATGTTAAGACAACGTTTACTTCAAGTTAATTATTATACTGAAAATTCTGGTATATAATGCTGTTAGT GAATATAACAGGAAAATTAAATTGGTTATGATATTGAGTCTATATAAAGGAGAAATAACAGATGAAAAAGAAATT ATTAGTTTTAACTATGAGCACGCTATTTGCTACACAATTTATGAATTCAAATCACGCTAATGCATCAACAGAAAG TGTTGATAAAAACTTTGTAGTTCCAGAATCGGGTATTAATAAAATTATTCCAACTTACGATGAATTTAAAAAAGC ACCAAAAGTAAATGTTAGTAATTTAGCTGACAACAAAAACTTTGTAGCTTCTGAAGATAAATTGAATAAGATTGC AGATCCATCGGCAGCTAGTAAAATTGTAGATAAAAACTTTGCCGTACCAGAATCAAAATTAGGAATCATTGTACC AGAGTATAAAGAAATCAATAATCGAGTGAATGTAACAACAAACAATCCAGCTTCAAAACAAGTTGACAAGCAAAT TGTTGCTAAAGACCCAGAGGTGAATAGATTTATTACGCAAAATAAAGTAAACCATCGTTTCATTACTACGCAAAC CCACTATAAGAAAGTTATTACTTCATACAAATCAACACATGTACATAAACATGTAAACCATGCAACATCTTCTAT CCATCATCACTTTACTATTAAACCATCAGAAGCACCTAGATATACACACCCATCTCAATCTCAATCGTTAATTAT AAATCATCATTTTGCAGTTCCTGGATACCATGGTCATAAAGTTGTAACACCAGGACAAGCTAGTATTAGAATTCA TCACTTTTGTGCTGTACCTCAAATAAATAGTTTTAAGGTCATTCCATCATATGGTCACAATTCACATCGTATGCA TGTACCAAGTTTCCAAAATAACACAACAGCAACACATCAAAATGCAAAAGTAAATAAAACTTATAACTATAAATA TTTTTATACTTATAAAGTAGTCAAAGGTGTAAAAAAACATTTCTCATTTTCAAAATCACATGGTTGTAAAATTGT TAAACCAGCATTAAACATCAAAAATGTAAATTATCAATATGCTGTTCCAAGTAATAGCCCTACACACGTTGTTCC TGAGTTTCAGGGTATCTTACCAGCACCACGAGTATAAAAATTGACATTAAGTTTACGAGATATGATAAATACCTA TTATTTTAAACATAGTCTGCAATCTATGAGGTTGTAGGCTATGTTTTTTGCAGTTTATCAATAAACACCCATCAA CAAATTATACCGTTTTTCTACTTTAAAAGTTGGAAGTAACATAATCTTAAATAAATATATTATTAATTAAGATAA ATATAAGACTCGAGATTATTGTTAATAGTTTGTTCATCGCAAGTTAATTATTGTTTCTAAAATATTGGTATATAA TTTTCAATGGCGAAGAAAACAGGGTAAAAAAGTCGGTTTTTAAATCAAAGCAAATAAGGAGTAAAAAATGAAAAG GAAAGTACTAGTATTAACAATGGGCGTACTTTGTGCGACACAATTATGGCAAACGAATAATGCAAAAGCTTTAGT GACAGAGAGTGGCGTTAATGATACTAAGCAATTTACTGAAGTAACATCGGAAGAAAAAGTTATAAAAGATGCTAT TTCGAAAGTCAATGAAAGCTTTATTTACTATCCCCAAAATGATTTGAAGGGATTAGGTGGAGAACACAACGATTA CGAAAAAATTACATATAGCACTTCTTCTAATAATGTTTTAGAATTATCAATGAGTTCAAAATACGTAGGCGGTAA ATCAGGAGCTATGGTTGGTTATAGTGAAATTTACTCATCACATTTCACAGACCGCGACAAACGTGCTATCAGACG TGATCATGTTAAAGAAGCACAAAACTTGATTAATGATTATAAATATACGCAAATATATGAAGACTTTGCTAAAGC TACTGCAAAGGTAAGTACACTTAGTCAGTCTCACCAAAATTATTTAAATAAACAAATTGATAAAGTGAATAATAA ^{GATAGAGAAAACTGAAAAACGCTAA} (SEQ ID NO: 78)

MW2

D1D2-

GTGGTTTCTGGGGAGAAGAATCCATATGTATCTGAGTCGTTGAAACTGACTAATAATAAAAATAAATCTAGAACA GTAGAAGAGTATAAGAAAAGCTTGGATGATTTAATATGGTCCTTTCCAAACTTAGATAATGAAAGATTTGATAAT CCTGAATATAAAGAAGCTATGAAAAAATATCAACAGAGATTTATGGCTGAAGATGAGGCTTTGAAGAAATTTTTT AGTGAAGAGAAAAAAATAAAAAATGGAAATACTGATAATTTAGATTATCTAGGATTATCTCATGAAAGATATGAA AGTGTATTTAATACTTTGAAAAAACAAAGTGAGGAGTTCTTAAAAGAAATTGAAGATATAAAAAAAGATAACCCT ^{GAATTGAAAGACTTTAATGAATAG} (SEQ ID NO: 79)

>USA300_vWbp

WSGEKNPYVSESLKLTNNKNKSRTVEEYKKSLDDLIWSFPNLDNERFDNPEYKEAMKKYQQRFMAEDE ALKKFFSEEKKIKNGNTDNLDYLGLSHERYESVFNTLKKQSEEFLKEIEDIKKDNPELKDFNEEEQLKCDLELNK LENQILMLGKTFYQNYRDDVESLYSKLDLIMGYKDEERANKKAVNKRMLENKKEDLETIIDEFFSDIDKTRPNNI

PVLEDEKQEEKNHKNMAQLKSDTEAAKSDESKRSKRSKRSLNTQNHKPASQEVSEQQKAEYDKRAEERKARFLDN

^{QKIKKTPWSLEYDFEHKQRIDNEND} (SEQ ID NO: 80)

KKLWSAPTKKPTSPTTYTETTTQVPMPTVERQTQQQIIYNAPKQLAGLNGESHDFTTTHQSPTTSNHT HNNWEFEETSALPGRKSGSLVGISQIDSSHLTEREKRVIKREHVREAQKLVDNYKDTHSYKDRINAQQKVNTLS ^{EGHQKRFNKQI NKVYNGK} (SEQ ID NO: 81)

>N315_vWbp

WSGEKNPYVSKALELKDKSNKSNSYENYRDSLESLISSLSFADYEKYEEPEYEKAVKKYQQKFMAEDD ALKNFLNEEKKIKNADISRKSNNLLGLTHERYSYIFDTLKKNKQEFLKDIEEIQLKNSDLKDFNNTEQHNADVEI NNLENKVLMVGYTFYNTNKDEVEELYSELDLIVGEVQDKSDKKRAVNQRMLNRKKEDLEFIIDKFFKKIQQERPE SIPALTSEKNHNQTMALKLKADTEAAKNDVSKRSKRSLNTQNNKSTTQEISEEQKAEYQRKSEALKERFINRQKS ^{KNESWSLIDDEDDNENDRQLWSAP} (SEQ ID NO: 82)

SKKPTTPTTYTETTTQVPMPTVERQTQQQIVYKTPKPLAGLNGESHDFTTTHQSPTTSNHTHNNWEFE ETSALPGRKSGSLVGISQIDSSHLTEREKRVIKREHVREAQKLVDNYKDTHSYKDRLNAQQKVNTLSEGHQKRFN ^KQINKVYNGK (SEQ ID NO: 83)

>MRSA252_vWbp

WSGEENPYKSESLKLNGKRSTTITSDKYEENLDMLISSLSFADYEKYEEPEYKEAVKKYQQKFMAEDD ^ALKNFLVKRKK (SEQ ID NO: 84)

>MW2_vWbp

WSGEKNPYVSESLKLTNNKNKSRTVEEYKKSLDDLIWSFPNLDNERFDNPEYKEAMKKYQQRFMAEDE ^{ALKKFFSEEKKIKNGNTDNLDYLGLSHERYESVFNTLKKQSEEFLKEIEDIKKDNPELKDFNE (} SEQ ID NO: 85)

>Newman_vWbp

WSGEKNPYVSESLKLTNNKNKSRTVEEYKKSLDDLIWSFPNLDNERFDNPEYKEAMKKYQQRFMAEDE ALKKFFSEEKKIKNGNTDNLDYLGLSHERYESVFNTLKKQSEEFLKEIEDIKKDNPELKDFNEEEQLKCDLELNK LENQILMLGKTFYQNYRDDVESLYSKLDLIMGYKDEERANKKAVNKRMLENKKEDLETIIDEFFSDIDKTRPNNI PVLEDEKQEEKNHKNMAQLKSDTEAAKSDESKRSKRSKRSLNTQNHKPASQEVSEQQKAEYDKRAEERKARFLDN ^{QKIKKTPWSLEYDFEHKQRIDNEND} (SEQ ID NO: 86)

KKLWSAPTKKPTSPTTYTETTTQVPMPTVERQTQQQIIYNAPKQLAGLNGESHDFTTTHQSPTTSNHTHNNWE FEETSALPGRKSGSLVGISQIDSSHLTEREKRVIKREHVREAQKLVDNYKDTHSYKDRINAQQKVNTLSEGHQKR ^FNKQINKVYNGK (SEQ ID NO: ^{87 )}

REFERENCIAS

Patente de los Estados Unidos 3.791.932

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Patente de los Estados Unidos 4.367.110

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Patente de los Estados Unidos 4.474.757

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Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Una composición inmunógena que comprende al menos dos dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes, en donde cada uno de los al menos dos dominios 1-2 es al menos 80 % idéntico en secuencia a un dominio 1-2 de la SEQ ID NO: 33-41 y en donde al menos uno del dominio 1-2 está comprendido en una proteína de coagulasa de longitud inferior a la completa que carece de todo un dominio conector (dominio L), dominio de repetición (dominio R) o dominio de unión a fibrinógeno (dominio Fgb).

2. La composición de la reivindicación 1, en donde la proteína de coagulasa de longitud inferior a la completa, carece de todo el segmento de dominio conector (L) o repetido (R).

3. La composición de la reivindicación 1, en donde la proteína de coagulasa de longitud inferior a la completa, carece de todo el segmento de dominio conector (L) o de unión a fibrinógeno (Fgb).

4. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde uno de los dominios 1-2 es de una cepa de 5. aureus Newman, 85/2082, MW2, MSSA476, N315, Mu50, MRSA252, Cowan I, WIS o USA300.

5. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde uno de los dominios 1-2 es un dominio 1-2 de Coa al menos 80 % idéntico en secuencia a una SEQ ID NO identificada en las SEQ ID NO: 33-37 y 41.

6. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde uno de los dominios 1-2 es un dominio 1-2 de la proteína de unión al factor de von Willebrand (vWbp) al menos 80 % idéntico en secuencia a una SEQ ID NO identificada en las SEQ ID NO: 38-40.

7. Una cantidad eficaz de una composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para su uso en un método para tratar o prevenir una infección estafilocócica en un sujeto.

8. Una cantidad eficaz de una composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para su uso en un método según la reivindicación 7, en donde el sujeto se trata en función de una prueba que indica infección estafilocócica.

9. Una cantidad eficaz de una composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para su uso en un método según la reivindicación 7 u 8, en donde la composición o el polipéptido se administra por vía intravenosa, por vía intramuscular, por vía intravascular, por vía intratraqueal, por vía intratecal, por vía intraocular, por vía intraperitoneal, por vía tópica, por vía oral, mediante inyección, mediante infusión o mediante embolada.

10. Una cantidad eficaz de una composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para su uso en un método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde dicho método comprende además administrar al sujeto uno o más antibióticos.

11. Una cantidad eficaz de una composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para su uso en un método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en donde el sujeto es inmunodeficiente, está inmunodeprimido, está hospitalizado, se somete a un procedimiento médico invasivo, tiene una infección respiratoria, está infectado con el virus de la gripe o está usando un respirador.

12. Una cantidad eficaz de una composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para su uso en un método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en donde el sujeto presenta un absceso cutáneo, un divieso o un forúnculo.

13. La composición inmunógena de la reivindicación 1, que comprende al menos seis dominios 1-2 de coagulasa estafilocócica diferentes, en donde la composición comprende al menos los dominios 1-2 de Coa estafilocócica de las cepas MRSA252, MW2, N315 y USA300 y los dominios 1-2 de la proteína de unión al factor de von Willebrand (vWbp) de S. aureus N315 y USA300.