CN101914144B - 金黄色葡萄球菌荚膜多糖和蛋白质偶联物及制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种金黄色葡萄球菌荚膜多糖和蛋白质偶联物及制备方法和用途。以鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白或聚赖氨酸鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白为载体，将金黄色葡萄球菌荚膜多糖经过化学修饰后和载体蛋白进行化学偶联。由于鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白和聚赖氨酸鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白具有免疫佐剂功能，新形成的偶联物可以使免疫原性很低的金黄色葡萄球菌荚膜多糖获得较高的免疫原性，并在免疫注射时载体蛋白发挥免疫佐剂作用，使被免疫动物产生针对金黄色葡萄球菌荚膜多糖的特异性免疫反应增强。本发明在抗金黄色葡萄球菌感染的疫苗制备方面具有广泛的用途。

Description

金黄色葡萄球菌荚膜多糖和蛋白质偶联物及制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种金黄色葡萄球菌荚膜多糖和蛋白质偶联物及制备方法和用途。

背景技术

乳房炎是乳腺组织的一种炎症，通常由微生物感染引起，是奶牛的重要疾病之一。据美国乳房炎研究会(National Mastitis Council，NMC)1996年统计，每年因为乳房炎造成的经济损失约17亿美元。在我国，奶牛乳房炎的发病率高，个别地方高达85％[1]，每年给养牛者造成巨大的经济损失。由于抗生素治疗容易造成乳制品中药物残留，危害消费者的身体健康，因此，注射疫苗对奶牛进行免疫预防是一种安全的防范措施。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是奶牛乳房炎的主要病原。该菌可以从许多患乳房炎奶牛的乳汁中分离到[2，3]。这些分离菌株中有94％～100％含荚膜多糖(Capsular polysaccharide，CP)[4]。目前为止，已经发现金黄色葡萄球菌有11个荚膜多糖血清型[5，6]。研究表明，有70％～80％金黄色葡萄球菌可以产生5-型(CP5)或8-型(CP8)荚膜多糖。CP5和CP8具有抗中性粒细胞吞噬的作用，帮助金黄色葡萄球菌逃逸吞噬细胞的攻击[7]。

抗CP的特异性抗体具有调理素作用[8]。但从金黄色葡萄球菌分离、纯化得到的CP难以诱导动物产生免疫应答[9]。这是由于CP的分子量小，是一种半抗原，免疫原性差。如果CP以共价偶联蛋白载体分子，就可提高免疫原性，诱导动物产生高水平的抗CP抗体。已经有人用金黄色葡萄球菌的CP5和CP8共价偶联蛋白质，合成CP5和CP8结合物，它们可以诱导鼠、奶牛和人产生抗CP5和CP8抗体，对吞噬起调理作用，促进吞噬细胞对细菌的吞噬。例如，Fattom[10]等用CP5和CP8结合绿脓杆菌膜外蛋白A并注射小鼠，使小鼠产生抗CP5和CP8的抗体。

CP和蛋白质载体的结合常采用化学偶联的方法，主要有：1.溴化氰活化法。溴化氰活化法是最常用的活化方法之一，活化过程主要是生成亚胺碳酸活性基团，它可以和伯氨基(NH2)反应，主要生成异脲衍生物。2.环氧乙烷基活化法。这类方法活化后的基质都含有环氧乙烷基。如在含有NaBH4的碱性条件下，1，4-丁二醇-双缩水甘油醚的一个环氧乙烷基可以与羟基反应，而将另一个环氧乙烷基结合在基质上。另外也可以用环氧氯丙烷活化，将环氧乙烷基结合在基质上。3.CDAP活化法。CDAP是一种蛋白质巯基氰基化试剂和碳水化合物羟基活化剂。该方法先在多糖羟基上形成氰酸酯，通过异脲键将多糖与载体蛋白连接起来。CDAP法可在较宽的碱性范围(最适pH值为9～10)中进行多糖活化，在弱碱性(pH7～9)条件下可不用间隔基进行活化多糖与蛋白的直接结合。有资料表明，CDAP法能快速有效地活化葡聚糖和23型肺炎球菌多糖[11]、白假丝酵母(Candida albicans)、和郎比可假丝酵母(Candida lambica)细胞表面的甘露聚糖[12]。此外，Shafer[13]等还发现，在pH值为5的条件下，CDAP活化的多糖即可与蛋白质进行偶联，因此，CDAP可应用于对pH值非常敏感的多糖和蛋白质之间的偶联。

目前所用的蛋白质载体主要有牛血清蛋白、绿脓杆菌外毒素A、破伤风类毒素和白喉毒素等[14-16]。但由于所采用的载体蛋白为免疫惰性载体，用于制备疫苗免疫动物时，不能诱导动物产生理想的免疫的反应。

主要参考文献：

[1]李力.简介几种奶牛隐性乳房炎快速诊断方法.宁夏农林科技2005(002)：21-2.

[2]陈莹铨，周建民.乳牛乳房炎.福建畜牧兽医2001；23(5).

[3]以金，嘎尔迪.奶牛隐性乳房炎的发生规律及其致病菌的分离鉴别与药物敏感性试验.内蒙古农业大学学报：自然科学版2001；22(001)：18-23.

[4]Chambers H.The changing epidemiology of Staphylococcus aureus？EmergingInfectious Diseases 2001；7(2)：178.

[5]Honeyman A，Friedman H，Bendinelli M.Staphylococcus aureus infection anddisease：Kluwer Academic/Plenum Press，New York；London，2001.

[6]Luong T，Lee C.Overproduction of type 8 capsular polysaccharide augmentsStaphylococcus aureus virulence.Infection and immunity 2002；70(7)：3389.

[7]Poutrel B，Sutra L.Type 5 and 8 capsular polysaccharides are expressed byStaphylococcus aureus isolates from rabbits，poultry，pigs，and horses.Journal ofclinical microbiology 1993；31(2)：467.

[8]Xu S，Arbeit R，Lee J.Phagocytic killing of encapsulated and microencapsulatedStaphylococcus aureus by human polymorphonuclear leukocytes.Infection andimmunity 1992；60(4)：1358.

[9]Arbeit R，Dunn R.Expression of capsular polysaccharide during experimentalfocal infection with Staphylococcus aureus.The Journal of infectious diseases1987；156(6)：947-52.

[10]Fattom A，Schneerson R，Watson D，Karakawa W，Fitzgerald D，Pastan I，et al.Laboratory and clinical evaluation of conjugate vaccines composed ofStaphylococcus aureus type 5 and type 8 capsular polysaccharides bound toPseudomonas aeruginosa recombinant exoprotein A.Infection and immunity1993；61(3)：1023.

[11]Bystricky S，Machova′E，Bartek P，Kolarova N，Kogan G.Conjugation ofyeast mannans with protein employing cyanopyridinium agent(CDAP)-an effectiveroute of antifungal vaccine preparation.Glycoconjugate Journal 2000；17(10)：677-80.

[12]Bystrick S，PauloviováE，MachováE.Candida albicans mannan-proteinconjugate as vaccine candidate.Immunology letters 2003；85(3)：251-5.

[13]Shafer D，Toll B，Schuman R，Nelson B，Mond J，Lees A.Activation ofsoluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate(CDAP)for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunologicalreagents.II.Selective crosslinking of proteins to CDAP-activated polysaccharides.Vaccine 2000；18(13)：1273-81.

[14]Ho M，Bolgiano B，Martino A，Kairo S，Corbel M.Preclinical laboratoryevaluation of a bivalent Staphylococcus aureus saccharide-exotoxin A proteinconjugate vaccine.Human vaccines；2(3)：89.

[15]Alexander J，Guercio M，Frame B，Maewal A，Sette A，Nahm M，et al.Development of experimental carbohydrate-conjugate vaccines composed ofStreptococcus pneumoniae capsular polysaccharides and the universal helperT-lymphocyte epitope(PADREo).Vaccine 2004；22(19)：2362-7.

[16]Berkin A，Coxon B，Pozsgay V.Towards a Synthetic Glycoconjugate VaccineAgainst Neisseria meningitidis A.Chemistry-A European Journal2002；8(19)：4424-33.

发明内容

本发明目的是克服现有技术的不足，提供一种金黄色葡萄球菌荚膜多糖和蛋白质偶联物及制备方法和用途。

金黄色葡萄球菌荚膜多糖和蛋白质偶联物的制备方法包括如下步骤：

(1)聚赖氨酸鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的制备

通过重叠延伸PCR法在鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白基因的上游引入6个连续编码的赖氨基密码子DNA片段为：AAAAAGAAAAAGAAAAAG，该DNA片段连接至表达载体pET-His上，获得的载体pET-His-6×Lys-Flic转化至大肠杆菌，得到表达聚赖氨酸鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的工程菌。目的蛋白的表达量达到细菌总蛋白的15～25％；

(2)金黄色葡萄球菌荚膜多糖的化学修饰

将金黄色葡萄球菌荚膜多糖配成4～6mg/ml的生理盐水溶液。在每毫升该溶液中，加入己二酸二酰肼0.03～0.07g，混匀，在每毫升该溶液中，加入1-乙基-1-3-(3-二甲基氨基-丙基)-碳化二亚胺0.005～0.02g，混匀，用盐酸溶液调节该溶液的pH值至3.7～5.6，在室温下置2～4小时；

(3)去除未被结合的己二酸二酰肼和1-乙基-1-3-(3-二甲基氨基-丙基)-碳化二亚胺

将上述反应物装于透析袋中，截止分子量为5KD～10KD，在0.2M的NaCl溶液中于4℃透析1～2小时，以除去己二酸二酰肼和1-乙基-1-3-(3-二甲基氨基-丙基)-碳化二亚胺；

(4)荚膜多糖和蛋白载体的偶联

在每毫升上述经过化学修饰的荚膜多糖溶液中加入鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白或者聚赖氨酸鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白0.5～2mg，震荡混匀，用盐酸调节混合物溶液的pH值至3.7～5.6，然后在每毫升溶液中加入0.001～0.004g 1-乙基-1-3-(3-二甲基氨基-丙基)-碳化二亚胺，震荡混匀，用盐酸溶液再次调节pH值至3.7～5.6，放置4℃反应10～14小时；

(5)偶联物的收集和纯化

将偶联物原液经10000～20000rpm离心2分钟，取上清过凝胶柱，采用蛋白纯化系统在206nm和280nm处收集洗脱液，用生理盐水平衡与洗脱凝胶柱，柱子的平衡和洗脱流速为2～4ml/分。

金黄色葡萄球菌荚膜多糖和蛋白质偶联物作为疫苗用于预防金黄色葡萄球菌的感染。

本发明的细菌鞭毛蛋白具有佐剂作用，可以通过激活TLR5提高免疫反应。本发明以鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白Flic或聚赖氨酸鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白Lys-Flic为载体，将其和金黄色葡萄球菌荚膜多糖进行偶联，一方面在物理上形成一个含荚膜多糖完全抗原，使不具有免疫原性的荚膜多糖获得免疫原性；另一方面Flic或Lys-Flic本身具有很强的佐剂功能，将该偶联物用作疫苗注射动物后，可促进动物对荚膜多糖产生免疫反应。

附图说明

图1是PCR产物与重组表达载体的酶切鉴定分析图，(M：DL5,000，1：PCR获得的Flic目的基因结果，2：BamH对构建的表达载体(pET-His-Flic)单酶切结果，3：BamHI和NheI对构建的表达载体(pET-His-Flic)双酶切结果)；

图2是Flic融合蛋白表达纯化的SDS-PAGE分析图，(M：蛋白质分子量标准，1、2：分别为转化菌诱导前和诱导后总蛋白，3：转化菌菌体裂解物上清，4：转化菌菌体裂解物沉淀，5：纯化后的重组蛋白)；

图3是PCR产物与重组表达载体的酶切鉴定分析图，(M：DL5,000，1：PCR获得的6×Lys-Flic目的基因结果，2：BamH对构建的表达载体(pET-His-6×Lys-Flic)单酶切结果，3：BamHI和NheI对构建的表达载体(pET-His-6×Lys-Flic)双酶切结果)；

图4是6×Lys-Flic融合蛋白表达纯化的SDS-PAGE分析图，(M：蛋白质分子量标准，1、2：分别为转化菌诱导前和诱导后总蛋白，3：转化菌菌体裂解物上清，4：转化菌菌体裂解物沉淀，5：纯化后的重组蛋白)；

图5是透析去除CP5多糖修饰过程中多余的ADH和EDAC图，(A：ADH；B：EDAC；C：CP5+ADH+EDAC透析前；D：CP5+ADH+EDAC透析后)；

图6是FliC蛋白偶联CP5多糖产物过柱纯化图。

图7是透析去除CP5多糖修饰过程中多余的ADH和EDAC图，(A：ADH；B：EDAC；C：CP5+ADH+EDAC透析前；D：CP5+ADH+EDAC透析后)；

图8是6×Lys-Flic蛋白偶联CP5多糖产物过柱纯化图。

图9是透析去除CP8多糖修饰过程中多余的ADH和EDAC图，(A：ADH；B：EDAC；C：CP8+ADH+EDAC透析前；D：CP8+ADH+EDAC透析后)；

图10是FliC蛋白偶联CP8多糖产物过柱纯化图。

图11是透析去除CP8多糖修饰过程中多余的ADH和EDAC图，(A：ADH；B：EDAC；C：CP8+ADH+EDAC透析前；D：CP8+ADH+EDAC透析后)；

图12是6×Lys-Flic蛋白偶联CP8多糖产物过柱纯化图。

图13是CP5偶联物对血清IgG抗体水平的影响(注：图中字母相同及不标表示差异不显著P＞0.05，字母不同表示差异显著P＜0.05)；

图14是CP5偶联物对血清IgG亚类水平的影响(注：图中字母相同及不标表示差异不显著P＞0.05，字母不同表示差异显著P＜0.05)；

图15是CP5偶联物对血清IgM抗体水平的影响(注：图中字母相同及不标表示差异不显著P＞0.05，字母不同表示差异显著P＜0.05)；

图16是CP5偶联物对体外淋巴细胞增殖的影响(注：图中字母相同及不标表示差异不显著P＞0.05，字母不同表示差异显著P＜0.05)；

图17是CP5偶联物对小鼠的攻毒保护作用；

图18是CP8偶联物对血清IgG抗体水平的影响(注：图中字母相同及不标表示差异不显著P＞0.05，字母不同表示差异显著P＜0.05)；

图19是CP8偶联物对血清IgG亚类水平的影响(注：图中字母相同及不标表示差异不显著P＞0.05，字母不同表示差异显著P＜0.05)；

图20是CP8偶联物对血清IgM抗体水平的影响(注：图中字母相同及不标表示差异不显著P＞0.05，字母不同表示差异显著P＜0.05)

图21是CP8偶联物对体外淋巴细胞增殖的影响(注：图中字母相同及不标表示差异不显著P＞0.05，字母不同表示差异显著P＜0.05)；

图22是CP8偶联物对小鼠的攻毒保护作用。

具体实施方式

金黄色葡萄球菌荚膜多糖和蛋白质偶联物的制备方法包括如下步骤：

(1)聚赖氨酸鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的制备

通过重叠延伸PCR法在鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白基因的上游引入6个连续编码的赖氨基密码子DNA片段为：AAAAAGAAAAAGAAAAAG，该DNA片段连接至表达载体pET-His上，获得的载体pET-His-6×Lys-Flic转化至大肠杆菌，得到表达聚赖氨酸鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的工程菌。目的蛋白的表达量达到细菌总蛋白的15～25％；

(2)金黄色葡萄球菌荚膜多糖的化学修饰

将金黄色葡萄球菌荚膜多糖配成4～6mg/ml的生理盐水溶液。在每毫升该溶液中，加入己二酸二酰肼0.03～0.07g，混匀，在每毫升该溶液中，加入1-乙基-1-3-(3-二甲基氨基-丙基)-碳化二亚胺0.005～0.02g，混匀，用盐酸溶液调节该溶液的pH值至3.7～5.6，在室温下置2～4小时；

(3)去除未被结合的己二酸二酰肼和1-乙基-1-3-(3-二甲基氨基-丙基)-碳化二亚胺

将上述反应物装于透析袋中，截止分子量为5KD～10KD，在0.2M的NaCl溶液中于4℃透析1～2小时，以除去己二酸二酰肼和1-乙基-1-3-(3-二甲基氨基-丙基)-碳化二亚胺；

(4)荚膜多糖和蛋白载体的偶联

在每毫升上述经过化学修饰的荚膜多糖溶液中加入鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白或者聚赖氨酸鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白0.5～2mg，震荡混匀，用盐酸调节混合物溶液的pH值至3.7～5.6，然后在每毫升溶液中加入0.001～0.004g 1-乙基-1-3-(3-二甲基氨基-丙基)-碳化二亚胺，震荡混匀，用盐酸溶液再次调节pH值至3.7～5.6，放置4℃反应10～14小时；

(5)偶联物的收集和纯化

将偶联物原液经10000～20000rpm离心2分钟，取上清过凝胶柱，采用蛋白纯化系统在206nm和280nm处收集洗脱液，用生理盐水平衡与洗脱凝胶柱，柱子的平衡和洗脱流速为2～4ml/分。

金黄色葡萄球菌荚膜多糖和蛋白质偶联物作为疫苗用于预防金黄色葡萄球菌的感染。

实施例1鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白(Flic)的制备

1.材料

鼠伤寒沙门氏菌基因DNA由浙江省疾控中心惠赠；大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)、DH5α、质粒pMD-18T、原核表达载体pET-his，由本实验室保存；DNA凝胶回收试剂盒子、λ-EcoT14 I digest DNA标准、限制性内切酶EcoR I，BamHI和Nhe I，T4DNA连接酶购自大连宝生物公司；IPTG、Pfu DNA聚合酶购自上海生工；蛋白纯化柱HisTrapTMFFcrude购自美国GE公司；氨苄青霉素(Amp)，Agarose II购于北京普博生物科技有限公司。

2.克隆Flic基因

2.1鞭毛蛋白(Flic)的克隆

鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白(Flic)全基因的扩增参考Genbank(AY353373.1)序列，采用Premier 5.0软件设计引物。

Flic-f：5’---CGC GGA TCCATG GCA CAA GTC ATT AAT ACA A----3’

Flic-r：3’---G CAG GAG AGA AAT GAC GCA ATT CGATCG ATC----5’

PCR扩增反应条件为95℃预变性3min后，94℃变性30S，56℃退火30S，72℃延伸2min，进行35个循环，最后72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，紫外灯下观察结果并拍照。

2.2目的基因Flic片段的回收与纯化

(1)灌制一块1％的琼脂糖凝胶，将DNA样品与加样缓冲液混合，加入点样孔进行电泳。以DL5,000作为分子量标准；

(2)电泳完毕后在紫外灯下，用干净的刀片切下尽量少的含有目的DNA的凝胶，转入一干净的1.5ml离心管(注：在紫外灯下照射的时间尽量短)。

(3)按照DNA凝胶回收试剂盒说明书纯化PCR产物；

(4)取3μl作1％琼脂糖凝胶电泳，观察纯化结果，并大致估计DNA浓度。

2.3TA克隆及测序

由于使用保真酶扩增的PCR产物不像利用Taq酶能够使PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A尾巴，所以需要先将纯化的PCR产物在Tag酶和dNTP的作用下加上A尾巴，再经过DNA纯化，然后在连接酶作用下，可以快速一步到位地把PCR产物直接插入到T载体，主要用于PCR产物的克隆和测序。

表1产物加A反应体系

反应条件：72℃30min。

表2连接反应体系

反应条件：16℃4h以上。

2.4T克隆连接产物的转化

(1)取-70℃冻存的感受态细胞(DH5a)于冰上融化后，加入连接产物5μl，轻轻混匀，冰浴30min。

(2)42℃水浴热激90s，再迅速放回冰上2min。

(3)加入400μl LB液体培养基，37℃200r-220rpm振荡培养45min，以恢复质粒的抗性。

(4)4℃4000rpm离心5min，弃去上清400μl，将剩余的100μl菌液混匀后涂氨苄平板，37℃培养30min(平皿正放)，待菌液吸收完全，再将平皿倒置培养约12h-16h，至单菌落出现。

2.5质粒pMD18-Flic的抽提

(1)用灭菌牙签挑取单菌落于5ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养12h-16h。

(2)用1.5ml离心管收集3-5ml菌液，12000rpm离心1min，弃尽上清。

(3)加入250μl溶液I/RNase A，充分振荡悬浮。

(4)加入250μl溶液II，温和颠倒混匀4-6次，使细菌裂解，室温放置2min。使菌液变清亮。

(5)加入350μl溶液III，反复颠倒混匀6-10次直至出现白色絮状物，12000rpm离心10min。

(6)将离心后的上清液全部转移到HB离心柱，12000rpm离心1min。

(7)弃掉收集管中的液体，向HB离心柱内加入500μl Buffer HB，室温12000rpm离心1min。

(8)弃掉收集管中的液体，向HB离心柱内加入700μl DNA Wash Buffer，12000rpm离心1min。

(9)重复步骤8一次。

(10)12000rpm空管离心2min。

(11)将HB离心管柱置于新的1.5mlEp管中，向柱中加入50-100μl的dd水，

12000rpm离心1min，管底即为质粒DNA。-20度保存备用。

(12)1％琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

将以上质粒酶切鉴定正确的送交上海生物工程公司测序。

3.重组表达载体的构建

3.1表达载体pET-His与重组T载体双酶切

将测序正确的表达载体和表达载体pET-His都分别进行BamHI或BamHI/NheI单或双酶切，酶切反应体系如下(所加质粒量根据质粒浓度调整)：

表3表达载体酶切体系

16℃反应过夜，参照2.1.2(凝胶电泳回收与纯化PCR产物)的方法回收和纯化酶切产物。

3.2目的基因分别与表达载体pET-His表达载体的连接反应在1.5mL离心管中建立目的基因与载体的连接反应体系如下：

表4连接反应体系

反应管于16℃孵育过夜，次日用于直接转化。

3.3连接产物转化步骤同1.2.4，感受态细胞为BL21(DE3)；

3.4表达载体质粒的抽提步骤同1.2.5；

4.重组融合蛋白的诱导表达、提取和纯化

4.1含有表达质粒的重组细菌的诱导表达

(1)将重组质粒和对照载体分别转化的BL21(DE3)感受态细胞，接种于平板培养基，待长出菌落后在转化的平皿中各挑取一个单菌落接种于3ml含Amp的LB液体培养基中，37℃培养过夜。

(2)将培养的细菌按1∶50比例加入到5ml含Amp的新鲜LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.4-1.0(最好0.6，大约需3h)。

(3)取1ml菌液作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度为1mM作为实验组，两组继续37℃振荡培养。

(4)分别在2h，3h，4h，5h取菌液1ml于1.5mlEp管中，12000g离心30s，收获菌体。

(5)用100μl无菌去离子水将菌体吹散混匀，然后加凝胶加样缓冲液稀释到合适浓度，混匀后沸水浴5min。

(6)通过SDS-PAGE电泳检测外源蛋白的表达情况：

4.2融合蛋白的提取

(1)对诱导后的菌液4℃，4000rpm，20min离心，彻底弃去上清；

(2)细菌沉淀用Binding Buffer(无尿素，20mM咪唑)悬浮；

(3)将菌液装入100ml烧杯中，于冰浴状态下200～300W超声破碎，2s×99次，间隔停顿2s，如此循环3次以上，直至菌悬液澄清透亮；

(4)诱导的菌液经超声破碎后4℃，4000rpm，20min离心分别收集上清和沉淀。

4.3融合蛋白的纯化

吸取pET-His转化诱导前总蛋白、pET-His-Flic转化诱导前后蛋白、化菌菌体裂解物沉淀及上清纯化后的Flic融合蛋白加样品缓冲液稀释到合适浓度(突变体Flic-m融合蛋白做相同处理)，沸水浴中煮5min使蛋白变性后进行SDS-PAGE鉴定；将上述上清过0.22μm膜后，用His标签亲和层析柱在AKTA Explorer蛋白自动纯化系统(Pharmacia)回收目的蛋白。BCA法测定蛋白质浓度，冷冻干燥，-20℃保存备用。

5.结果

5.1重组表达载体的酶切鉴定分析

图1为重组表达载体及其诱导前后产物的质粒pET-his-Flic经过BamHI单酶切和EcoR/NheI双酶切电泳分析，证明Flic基因已经分别连入pET-His载体中，表达载体构建正确。

2.2重组蛋白的SDS-PAGE电泳分析

图2分别为pET-his-Flic表达菌总蛋白的SDS-PAGE(12％)分析蛋白条带，从图可以看出重组表达菌株诱导出了蛋白条带；融合蛋白Flic主要以可溶性形式存在于细菌破碎后的上清中，泳道5为大量诱导表达后AKTA Explorer蛋白纯化系统纯化后得到的蛋白。

实施例2聚赖氨酸鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白(6×Lys-Flic)的制备

1.材料与方法

聚赖氨基鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白(Lys-Flic)引物为在鞭毛蛋白N端引入了6个赖氨酸密码子(AAA或AAG)，即

Lys-Flic-f：5’----CGCGGATCCAAAAAGAAAAAGAAAAAGGCACAAGTCATTAATACAAAC AGC C----3’

Lys-Flic-r：3‘----CGTTTTGCAGGAGAGAAATGACGCAATTCGATCGATC----5’

聚赖氨基鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的制备过程和实施例1中Flic基因的克隆表达和纯化过程一样。

2.结果

2.1重组表达载体的酶切鉴定分析

图3为重组表达载体及其诱导前后产物的质粒pET-his-6Lys-Flic经过BamHI单酶切和EcoR/NheI双酶切电泳分析，证明Flic基因已经分别连入pET-His载体中，表达载体构建正确。

2.2重组蛋白的SDS-PAGE电泳分析

图4分别为pET-His-6×Lys-Flic表达菌总蛋白的SDS-PAGE(12％)分析蛋白条带，从图可以看出重组表达菌株诱导出了蛋白条带；融合蛋白Flic主要以可溶性形式存在于细菌破碎后的上清中，泳道5为大量诱导表达后AKTAExplorer蛋白纯化系统纯化后得到的蛋白。

实施例3鞭毛蛋白-细菌荚膜多糖5型偶联物(Flic-CP5)的制备

1.材料

己二酸二酰肼(Adipic acid dihydrazide，ADH)，Sigma公司产品；1-乙基-1-3-(3-二甲基氨基-丙基)-碳化二亚胺(Hydrochloride，EDAC)，美国BIO BASIC INC公司产品；鞭毛蛋白(Flic)，实施例1制备；薄层层析展开剂(a液(氯仿∶乙酸乙酯＝2.8∶1)：b液(甲醇∶水＝2.5∶1)＝3∶2；)；硅胶板(青岛海洋化工厂)；固体碘，(上海生工)。

2.制备方法

2.1.荚膜多糖(5型)的化学修饰

将金黄色葡萄球菌荚膜多糖(5型，新疆畜牧兽医研究所提供)配成5mg/ml的生理盐水溶液。取该溶液1ml，加入己二酸二酰肼(ADH)0.05g，混匀。加入1-乙基-1-3-(3-二甲基氨基-丙基)-碳化二亚胺(EDAC)0.01g，混匀。用1M的盐酸溶液调节该溶液的pH值至5.6，室温下反应3小时。

2.2.去除多糖中自由的AHD和EDAC

荚膜多糖被ADH和EDAC修饰后，采用5KD孔径透析膜对修饰多糖进行透析处理(生理盐水中透析，4℃透析)。采用薄层层析法检测自由的ADH和EDAC分子是否透析去除干净，取3μl样品点样至薄层层析板上，置展层剂中展层15分钟后，至80℃干燥层析板，然后至碘缸显色10分钟后观察是否有ADH和EDAC条带。

2.3.荚膜多糖(5型)和鞭毛蛋白载体的偶联

在每毫升上述经过化学修饰的荚膜多糖溶液中加入鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白(实施例1制备)1mg，震荡混匀。用1M的HCl调节混合物溶液的pH值至5.6，然后每毫升溶液中加入0.002g 1-乙基-1-3-(3-二甲基氨基-丙基)-碳化二亚胺(EDAC)，震荡混匀。用1M的HCl再次调节pH值至5.6。置4℃反应12小时后。

2.4.鞭毛蛋白-细菌荚膜多糖5型偶联物(CP5+Flic)的纯化和收集将偶联物原液经14000rpm离心2min，取上清过Separose CL-6B凝胶柱，用过膜生理盐水洗脱，洗脱液以206nm、280nm同时进行紫外光谱扫描，收集多糖与蛋白重叠的洗脱峰。

实施例4聚赖氨酸鞭毛蛋白-细菌荚膜多糖5型偶联物(CP5-6×Lys-Flic)的制备

1.材料

己二酸二酰肼(Adipic acid dihydrazide，ADH)，Sigma公司产品；1-乙基-1-3-(3-二甲基氨基-丙基)-碳化二亚胺(Hydrochloride，EDAC)，美国BIO BASIC INC公司产品；鞭毛蛋白(Flic)，实施例1制备；薄层层析展开剂(a液(氯仿∶乙酸乙酯＝2.8∶1)：b液(甲醇∶水＝2.5∶1)＝3∶2；)；硅胶板(青岛海洋化工厂)；固体碘，(上海生工)。

2.制备方法

2.1.荚膜多糖(5型)的化学修饰

将金黄色葡萄球菌荚膜多糖(5型，新疆畜牧兽医研究所提供)配成5mg/ml的(生理盐水)溶液。取该溶液1ml，加入己二酸二酰肼(ADH)0.05g，混匀。加入1-乙基-1-3-(3-二甲基氨基-丙基)-碳化二亚胺(EDAC)0.01g，混匀。用1M的盐酸溶液调节该溶液的pH值至5.6，室温下反应3小时。

2.2.去除多糖中自由的AHD和EDAC

荚膜多糖被ADH和EDAC修饰后，采用5KD孔径透析膜对修饰多糖进行透析处理(生理盐水中透析，4℃透析)。采用薄层层析法检测自由的ADH和EDAC分子是否透析去除干净，取3μl样品点样至薄层层析板上，置展层剂中展层15分钟后，至80℃干燥层析板，然后至碘缸显色10分钟后观察是否有ADH和EDAC条带。

2.3.荚膜多糖(5型)和聚赖氨酸鞭毛蛋白载体的偶联

在每毫升上述经过化学修饰的荚膜多糖溶液中加入聚赖氨酸鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白(实施例1制备)1mg，震荡混匀。用1M的HCl调节混合物溶液的pH值至5.6，然后每毫升溶液中加入0.002g 1-乙基-1-3-(3-二甲基氨基-丙基)-碳化二亚胺(EDAC)，震荡混匀。用1M的HCl再次调节pH值至5.6，置4℃反应12小时。

2.4.聚赖氨酸鞭毛蛋白-细菌荚膜多糖5型偶联物(CP5+6×Lys-Flic)的收集和纯化

将偶联物原液经14000rpm离心2min，取上清过Separose CL-6B凝胶柱，用过膜生理盐水洗脱，洗脱液以206nm、280nm同时进行紫外光谱扫描，收集多糖与蛋白重叠的洗脱峰。

实施例5鞭毛蛋白-细菌荚膜多糖8型偶联物(Flic-CP8)的制备

1.材料

己二酸二酰肼(Adipic acid dihydrazide，ADH)，Sigma公司产品；1-乙基-1-3-(3-二甲基氨基-丙基)-碳化二亚胺(Hydrochloride，EDAC)，美国BIO BASIC INC公司产品；鞭毛蛋白(Flic)，实施例1制备；薄层层析展开剂(a液(氯仿∶乙酸乙酯＝2.8∶1)：b液(甲醇∶水＝2.5∶1)＝3∶2；)；硅胶板(青岛海洋化工厂)；固体碘，(上海生工)。

2.制备方法

2.1.荚膜多糖(8型)的化学修饰

将金黄色葡萄球菌荚膜多糖(8型，新疆畜牧兽医研究所提供)配成5mg/ml的(生理盐水)溶液。取该溶液1ml，加入己二酸二酰肼(ADH)0.05g，混匀。加入1-乙基-1-3-(3-二甲基氨基-丙基)-碳化二亚胺(EDAC)0.01g，混匀。用1M的盐酸溶液调节该溶液的pH值至5.6，室温下反应3小时。

2.2.快速去除多糖中自由的AHD和EDAC

荚膜多糖被ADH和EDAC修饰后，采用5KD孔径透析膜对修饰多糖进行透析处理(生理盐水中透析，4℃透析)。采用薄层层析法检测自由的ADH和EDAC分子是否透析去除干净，取3μl样品点样至薄层层析板上，置展层剂中展层15分钟后，至80℃干燥层析板，然后至碘缸显色10分钟后观察是否有ADH和EDAC条带。

2.3.荚膜多糖(8型)和鞭毛蛋白载体的偶联

在每毫升上述经过化学修饰的荚膜多糖溶液中加入鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白(实施例1制备)1mg，震荡混匀。用1M的HCl调节混合物溶液的pH值至5.6，然后每毫升溶液中加入0.002g 1-乙基-1-3-(3-二甲基氨基-丙基)-碳化二亚胺(EDAC)，震荡混匀。用1M的HCl再次调节pH值至5.6，4℃反应12小时。

2.4.鞭毛蛋白-细菌荚膜多糖8型偶联物(Flic-CP8)的收集和纯化

将偶联物原液经14000rpm离心2min，取上清过Separose CL-6B凝胶柱，用过膜生理盐水洗脱，洗脱液以206nm、280nm同时进行紫外光谱扫描，收集多糖与蛋白重叠的洗脱峰。

实施例6聚赖氨酸鞭毛蛋白-细菌荚膜多糖8型偶联物(CP8-6×Lys-Flic)的制备

1.材料

己二酸二酰肼(Adipic acid dihydrazide，ADH)，Sigma公司产品；1-乙基-1-3-(3-二甲基氨基-丙基)-碳化二亚胺(Hydrochloride，EDAC)，美国BIO BASIC INC公司产品；鞭毛蛋白(Flic)，实施例1制备；薄层层析展开剂(a液(氯仿∶乙酸乙酯＝2.8∶1)：b液(甲醇∶水＝2.5∶1)＝3∶2；)；硅胶板(青岛海洋化工厂)；固体碘，(上海生工)。

2.制备方法

2.1.荚膜多糖(8型)的化学修饰

将金黄色葡萄球菌荚膜多糖(5型，新疆畜牧兽医研究所提供)配成5mg/ml的(生理盐水)溶液。取该溶液1ml，加入己二酸二酰肼(ADH)0.05g，混匀。加入1-乙基-1-3-(3-二甲基氨基-丙基)-碳化二亚胺(EDAC)0.01g，混匀。用1M的盐酸溶液调节该溶液的pH值至5.6，室温下置3小时。

2.2.快速去除多糖中自由的AHD和EDAC

荚膜多糖被ADH和EDAC修饰后，采用5KD孔径透析膜对修饰多糖进行透析处理(生理盐水中透析，4℃透析)。采用薄层层析法检测自由的ADH和EDAC分子是否透析去除干净，取3μl样品点样至薄层层析板上，置展层剂中展层15分钟后，至80℃干燥层析板，然后至碘缸显色10分钟后观察是否有ADH和EDAC条带。

2.3.荚膜多糖(8型)和聚赖氨酸鞭毛蛋白载体的偶联

在每毫升上述经过化学修饰的荚膜多糖溶液中加入聚赖氨酸鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白(实施例1制备)1mg，震荡混匀。用1M的HCl调节混合物溶液的pH值至5.6，然后每毫升溶液中加入0.002g 1-乙基-1-3-(3-二甲基氨基-丙基)-碳化二亚胺(EDAC)，震荡混匀。用1M的HCl再次调节pH值至5.6，4℃反应12小时。

2.4.聚赖氨酸鞭毛蛋白-细菌荚膜多糖8型偶联物(CP8+6×Lys-Flic)的收集和纯化

将偶联物原液经14000rpm离心2min，取上清过Separose CL-6B凝胶柱，用过膜生理盐水洗脱，洗脱液以206nm、280nm同时进行紫外光谱扫描，收集多糖与蛋白重叠的洗脱峰。

实施例7细菌荚膜多糖5型(CP5)、牛血清白蛋白-CP5偶联物(BSA-CP5)、鞭毛蛋白-CP5偶联物(Flic-CP5)、聚赖氨酸鞭毛蛋白-CP5偶联物(Lys-Flic-CP5)免疫原性的比较

材料与方法

1.1.试验动物和分组

雌性ICR小鼠(7W)，购自上海试验动物中心，选取120只ICR雌性小鼠随机分成6组，每组20只，饲养于洁净环境。环境温度控制在24±1℃，湿度为50±10％。

1.2.免疫接种和采样

每只皮下注射0.1ml用生理盐水稀释的偶联物或多糖。各组分别于试验的0、14、28d注射，全程共免疫三次，分别于第二次免疫后的第二周和第三次免疫后的第二周进行小鼠眼眶采血，分离血清后-20℃保存备用。

表5动物分组情况

1.3.血清IgG和IgG亚类检测

(1)包板：用2.5μg/m(结合多糖含量)的CP5-OVA包被酶标板(以0.05mol/L的碳酸盐缓冲液稀释)，每孔100μl，4℃过夜；

(2)封闭：倒出孔中的液体，将微孔倒置在吸水纸上拍打，以完全除去孔内的液体。加入300μl PBST洗板再倒掉微孔中的液体，如此每隔3min快速洗板一次，洗完3次后，用3％的脱脂乳，37℃封闭2h；

(3)一抗孵育：PBST洗板3次后加入1∶100倍稀释的血清，每孔100μl，37℃反应1h；

(4)二抗孵育：洗板后，加入辣根过氧化酶标山羊抗鼠IgG(1∶1000)，37℃反应1h后，洗板；

(4)显色：加入TMB底物溶液显色，每孔100μl，37℃15min；

(5)终止：每孔加入50μl的2M H2SO4终止反应；

(6)读值：酶标仪450nm测定OD值；

IgM及抗体亚类的测定方法类似(二抗都采用1∶1000)；

1.4.脾淋巴细胞转化试验

(1)将小鼠脱颈处死，置于75％的酒精中浸泡15min，置超净台中操作，取出小鼠脾脏，置蒸发皿中研碎，用Hank’s洗破碎的组织，然后过200目铜网，转入离心管中，标记，冰盒中保存。

(2)1500rpm，10min离心；弃上清，加入Hank’s液6ml，震荡重悬后，1500rpm，5min离心。

(3)弃上清，加入配好的培养液(1640细胞培养液+10％的小牛血清FCS)4ml，震荡重悬后，置冰盒中保存备用。

(4)取震荡混匀的细胞悬液100μl，加入3.9ml 1.5％的冰醋酸中，震荡混匀后，取6μl悬液加入血细胞计数板上，显微镜下记录淋巴细胞数N(相当于N×10⁵)。

(5)将计数好的细胞悬液用配好的培养基进行浓度调整，浓度统一调整为1×10⁷。

(6)96孔板加入用培养液稀释的刺激物(ConA、Lps、多糖、灭火细菌)和空白对照(不加刺激物的培养液)。每孔100μl，然后每孔加入调整好细胞浓度的样品100μl，做三个复孔，使ConA、Lps、多糖、灭活细菌的终浓度分别为5μg/ml、7.5μg/ml、0.35mg/ml和3.3×108cfu(灭菌的PBS洗涤)。

(7)将加完样品的96孔培养板置于5％的CO₂培养箱中，37℃培养(刺激物为ConA、Lps的培养48h，抗原刺激为72h)。

(8)在结束培养4h前，96孔板每孔加入50μlMTT(2mg/ml)，继续培养。

(9)结束培养后，1800rpm离心5min，以沉淀细胞，倾去培养液上清，轻轻倒扣用纸巾吸干。

(10)每孔加入150μlDMSO工作液，避光轻微震荡15min，于490nm读取OD值，计算淋巴细胞刺激指数(Stimulation index，SI)。

SI＝(刺激空OD值-空白孔OD值)/(未刺激空OD值-空白孔OD值)。

1.5.小鼠金黄色葡萄球菌攻毒试验

1.5.1细菌悬液的制备

攻毒试验使用金葡菌CP5菌株。CP5接入普通肉汤培养基中，37℃，250rpm振荡培养过夜，4000rpm离心15min，使用灭菌PBS(pH 7.2)洗涤菌体3次，再用PBS(pH7.2)悬浮菌体。

2.5.2小鼠半数致死量的确定

将40只未免疫的健康小鼠分成A、B、C和D四组，每组10只，分别腹腔注射0.5ml CP5菌液，细菌数分别为5×10⁸cfu、1×10⁹cfu、5×10⁹cfu、1×10¹⁰cfu(以600nm的吸光值计算)。观察一周记录小鼠存活情况，确定小鼠的半数致死量为5×109cfu[86]。

2.5.3小鼠攻毒试验

将三免后两周的小鼠用5×10⁹cfu PBS悬浮的CP5菌液每只腹腔注射0.5ml，观察并记录小鼠存活情况。

1.7.统计学检验

试验结果采用平均值±标准差(S.D)，采用统计软件SPSS13.0对数据统计分析，并选Bonferroni函数进行组间比较，P值小于0.05的认为组间有显著差异。

2.结果

2.1.血清IgG和IgG亚类检测

图13为CP5偶联物对血清IgG抗体水平的影响，由图可知，二免后Lys-Flic-CP5组和Flic-CP5组诱导产生的IgG抗体水平显著高于BSA-CP5组，Lys-Flic-CP5的IgG抗体水平高于Flic-CP5组；三免后Lys-Flic-CP5组和Flic-CP5组产生的IgG抗体水平显著高于BSA-CP5组，Lys-Flic-CP5的IgG抗体水平显著高于Flic-CP5组(P＜0.05)。二免和三免后CP5偶联物组与多糖和生理盐水对照组IgG抗体水平差异显著(P＜0.05)，多糖组与生理盐水组差异不显著(P＞0.05)。三免后IgG抗体水平较二免后显著提高。

图14为小鼠三免后CP5偶联物对血清IgG亚类水平的影响。由图可知，三免后Lys-Flic-CP5和Flic-CP5组IgG1、IgG2a抗体水平显著高于BSA-CP5组(P＜0.05)，IgG2b、IgG3抗体水平高于或显著高于BSA-CP5组；Lys-Flic-CP5组IgG1、IgG2a水平显著高于Flic-CP5组，IgG2b、IgG3水平高于Flic-CP5组；偶联物组IgG亚类水平显著高于多糖和生理盐水对照组，多糖组与生理盐水组差异不显著(P＞0.05)。

2.2.血清IgM检测

图15为CP5偶联物对血清IgM抗体水平的影响，由图可知，二免后Lys-Flic-CP5组和Flic-CP5组诱导产生的IgM抗体水平高于BSA-CP5组，Lys-Flic-CP5的IgM抗体水平显著高于Flic-CP5组(P＜0.05)；三免后Lys-Flic-CP5组和Flic-CP5组产生的IgM抗体水平显著高于或高于BSA-CP5组，Lys-Flic-CP5的IgM抗体水平显著高于Flic-CP5组(P＜0.05)。二免和三免后CP5偶联物组与多糖和生理盐水对照组IgM抗体水平差异显著(P＜0.05)，多糖组与生理盐水组差异不显著(P＞0.05)。

2.3.脾淋巴细胞转化试验

图16为小鼠免疫后的淋巴细胞在体外受ConA、LPS、CP5和灭活的CP5细菌刺激对淋巴细胞增殖能力的影响，由图可知，小鼠淋巴细胞受刺激物刺激后，单独的多糖和多糖偶联物均能促进淋巴细胞增殖，偶联物组刺激指数高于或显著高于单独的多糖对照组；Lys-Flic-CP5和Flic-CP5组小鼠淋巴细胞刺激指数高于或显著高于BSA-CP5组；Lys-Flic-CP5组高于或显著的高于Flic-CP5组。

2.4.小鼠金黄色葡萄球菌攻毒试验

由图17为三免后两周小鼠攻毒保护试验结果，由图中可以看出，用不同的CP5偶联物免疫的小鼠与多糖及生理盐水对照组相比，在攻毒之后CP5偶联物对小鼠均有一定的保护作用，其中Lys-Flic-CP5组小鼠成活率明显高于对照组，为0.9，其次为Flic-CP5组小鼠，为0.8，BSA-CP5组和Flic-m-CP5组小鼠的成活率也分别达到了0.7，而生理盐水和多糖对照组的成活率仅为0.5和0.4，表明用多糖和蛋白偶联物免疫小鼠后产生的抗体对小鼠产生了保护作用，尤其是Lys-Flic-CP5的保护效果最为明显，因此可以应用Lys-Flic-CP5来抵抗5-型金黄色葡萄球菌引起的感染。

结论：本研究证实，注射BAS-CP5、Flic-CP5、Lys-Flic-CP5均能提高ICR小鼠的抗CP5的特异性IgG水平，IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3抗体效价，以及淋巴细胞转化能力，产生免疫应答和免疫记忆反应，此外用偶联物免疫小鼠能有效提高小鼠抵抗金黄色葡萄球菌感染的能力。注射Flic-CP5的小鼠抗体明显高于注射BAS-CP5的小鼠，说明鞭毛蛋白能增强体液免疫反应；而CP5-Lys-Flic组抗体水平明显高于CP5-Flic组，表明都载体蛋白赖氨酸的优化是很重要的。通过淋巴细胞转化试验可知，CP5偶联物能够使小鼠产生T细胞依赖的免疫应答，其中CP5与Lys-Flic的偶联物组小鼠的淋巴细胞增殖能力高于或显著高于BSA-CP5组，说明Flic能够促进细胞免疫应答，从攻毒保护结果可知，偶联物对小鼠均有一定的攻毒保护作用，其中Lys-Flic-CP5对小鼠的攻毒保护率最高，因此Lys-Flic和Flic可以作为一个理想的金黄色葡萄球菌CP5的载体蛋白和免疫佐剂。

实施例8细菌荚膜多糖8型(CP8)、牛血清白蛋白-CP8偶联物(BSA-CP8)、鞭毛蛋白-CP8偶联物(Flic-CP8)、聚赖氨酸鞭毛蛋白-CP8偶联物(Lys-Flic-CP8)免疫原性的比较

1材料与方法

1.1.试验动物和分组

雌性ICR小鼠(7W)，购自上海试验动物中心，选取120只ICR雌性小鼠随机分成6组，每组20只，饲养于洁净环境。环境温度控制在24±1℃，湿度为50±10％。整个关于小鼠试验的过程都按照国家试验动物管理条例执行。

1.2.免疫接种和采样

将120只18～22的ICR雌性小鼠随机分成6组，每组20只，每只皮下注射0.1ml生理盐水稀释的偶联物及多糖。各组分别于试验的0、14、28d进行皮下注射免疫，全程共免疫三次，于第二次免疫后的第二周和第三次免疫后的第二周进行小鼠眼眶采血，分离血清后-20℃保存备用。

表6动物分组情况

1.3.血清IgG和IgG亚类检测

(1)包板：用2.5μg/m(结合多糖含量)的CP8-OVA包被酶标板(以0.05mol/L的碳酸盐缓冲液稀释)，每孔100μl，4℃过夜；

(2)封闭：倒出孔中的液体，将微孔倒置在吸水纸上拍打，以完全除去孔内的液体。加入300μl PBST洗板再倒掉微孔中的液体，如此每隔3min快速洗板一次，洗完3次后，用3％的脱脂乳，37℃封闭2h；

(3)一抗孵育：PBST洗板3次后加入1∶100倍稀释的血清，每孔100μl，37℃反应1h；

(4)二抗孵育：洗板后，加入辣根过氧化酶标山羊抗鼠IgG(1∶1000)，37℃反应1h后，洗板；

(4)显色：加入TMB底物溶液显色，每孔100μl，37℃15min；

(5)终止：每孔加入50μl的2M H2SO4终止反应；

(6)读值：酶标仪450nm测定OD值；

IgM及抗体亚类的测定方法类似(二抗都采用1∶1000)；

1.4.脾淋巴细胞转化试验

(1)将小鼠脱颈处死，置于75％的酒精中浸泡15min，置超净台中操作，取出小鼠脾脏，置蒸发皿中研碎，用Hank’s洗破碎的组织，然后过200目铜网，转入离心管中，标记，冰盒中保存。

(2)1500rpm，10min离心；弃上清，加入Hank’s液6ml，震荡重悬后，1500rpm，5min离心。

(3)弃上清，加入配好的培养液(1640细胞培养液+10％的小牛血清FCS)4ml，震荡重悬后，置冰盒中保存备用。

(4)取震荡混匀的细胞悬液100μl，加入3.9ml 1.5％的冰醋酸中，震荡混匀后，取6μl悬液加入血细胞计数板上，显微镜下记录淋巴细胞数N(相当于N×105)。

(5)将计数好的细胞悬液用配好的培养基进行浓度调整，浓度统一调整为1×107。

(6)96孔板加入用培养液稀释的刺激物(ConA、Lps、多糖、灭火细菌)和空白对照(不加刺激物的培养液)。每孔100μl，然后每孔加入调整好细胞浓度的样品100μl，做三个复孔，使ConA、LPS、多糖、灭活细菌的终浓度分别为5μg/ml、7.5μg/ml、0.35mg/ml和3.3×108cfu(灭菌的PBS洗涤)。

(7)将加完样品的96孔培养板置于5％的CO2培养箱中，37℃培养(刺激物为ConA、Lps的培养48h，抗原刺激为72h)。

(8)在结束培养4h前，96孔板每孔加入50μlMTT(2mg/ml)，继续培养。

(9)结束培养后，1800rpm离心5min，以沉淀细胞，倾去培养液上清，轻轻倒扣用纸巾吸干。

(10)每孔加入150μlDMSO工作液，避光轻微震荡15min，于490nm读取OD值，计算淋巴细胞刺激指数(Stimulation index，SI)。

SI＝(刺激空OD值-空白孔OD值)/(未刺激空OD值-空白孔OD值)。

1.5.小鼠金黄色葡萄球菌攻毒试验

1.5.1细菌悬液的制备

同前。

1.5.2小鼠半数致死量的确定

将40只未免疫的健康小鼠分成A、B、C和D四组，每组10只，分别腹腔注射0.5ml CP5菌液，菌数分别为3×10¹²cfu、1.5×10¹³cfu、4.5×10¹³cfu、1×10¹⁴cfu(以600nm的吸光值计算)。观察一周记录小鼠存活情况，确定小鼠的半数致死量为1.5×1013cfu。

1.5.3疫苗对小鼠的免疫攻毒保护作用

将三免后两周的小鼠用1.5×10¹³cfu的CP5菌液腹腔攻毒，每只0.5ml，观察并记录小鼠存活情况。

1.6.统计学检验

试验结果采用平均值±标准差(S.D)，采用统计软件SPSS13.0对数据统计分析，并选Bonferroni函数进行组间比较，P值小于0.05的认为组间有显著差异。

2.结果

2.1.血清IgG和IgG亚类检测

图18为CP8偶联物对血清IgG抗体水平的影响，由图可知，二免后Lys-Flic-CP8组和Flic-CP8组诱导产生的IgG抗体水平显著高于或显著高于BSA-CP8组，Lys-Flic-CP8的IgG抗体水平高于Flic-CP8组；三免后Lys-Flic-CP8组和Flic-CP8组产生的IgG抗体水平显著高于BSA-CP8组，Lys-Flic-CP8的IgG抗体水平显著高于Flic-CP8组(P＜0.05)。二免和三免后CP8偶联物组IgG抗体水平显著高于与多糖和生理盐水对照组(P＜0.05)，多糖组与生理盐水组差异不显著(P＞0.05)。三免后IgG抗体水平较二免后显著升高。

图19为小鼠三免后CP8偶联物对血清IgG亚类水平的影响。由图可知，三免后Lys-Flic-CP8和Flic-CP8组IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体水平显著高于BSA-CP8组，；Lys-Flic-CP8组IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3水平高于或显著高于Flic-CP8组，偶联物组IgG亚类水平显著高于多糖和生理盐水对照组，多糖组与生理盐水组差异不显著(P＞0.05)。

2.2.血清IgM检测

图20为CP8偶联物对血清IgM抗体水平的影响，由图可知，二免后Lys-Flic-CP8组和Flic-CP8组IgM抗体水平显著高于BSA-CP8组(P＜0.05)，Lys-Flic-CP8的IgM抗体水平高于Flic-CP8组；三免后Lys-Flic-CP8组和Flic-CP8组产生的IgM抗体水平显著高于BSA-CP5组，Lys-Flic-CP8的IgM抗体水平显著高于Flic-CP8组(P＜0.05)。二免和三免后CP8偶联物组与多糖和生理盐水对照组IgM抗体水平差异显著(P＜0.05)，多糖组与生理盐水组差异不显著(P＞0.05)。

2.3.脾淋巴细胞转化试验

图21为小鼠免疫后的淋巴细胞在体外受ConA、Lps、CP8和灭活的CP8细菌刺激对淋巴细胞增殖能力的影响，由图可知，小鼠淋巴细胞受刺激物刺激后，单独的多糖和多糖偶联物均能促进淋巴细胞增殖，偶联物组刺激指数高于或显著高于单独的多糖对照组；Lys-Flic-CP8和Flic-CP8组小鼠淋巴细胞刺激指数高于或显著高于BSA-CP8组；Lys-Flic-CP8组高于或显著的高于Flic-CP8组。

2.4.小鼠金黄色葡萄球菌攻毒试验

由图22为三免后两周小鼠攻毒保护试验结果，由图中可以看出，用不同的CP8偶联物免疫的小鼠与多糖及生理盐水对照组相比，在攻毒之后CP8偶联物对小鼠均有一定的保护作用，其中Lys-Flic-CP8组小鼠成活率明显高于对照组，为0.9，其次为Flic-CP8和BSA-CP8组小鼠，为0.8，生理盐水和多糖对照组的成活率仅为0.4，表明用多糖和蛋白偶联物免疫小鼠后产生的抗体对小鼠产生了保护作用，尤其是Lys-Flic-CP8的保护效果最为明显，因此可以应用Lys-Flic-CP8来抵抗8-型金黄色葡萄球菌引起的感染。

结论：本研究证实，注射BAS-CP8、Flic-CP8、Lys-Flic-CP8均能提高ICR小鼠的抗CP8的特异性IgG水平，IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3抗体效价，以及淋巴细胞转化能力，产生免疫应答和免疫记忆反应，此外用偶联物免疫小鼠能有效提高小鼠抵抗金黄色葡萄球菌感染的能力。注射Flic-CP8的小鼠抗体明显高于注射BAS-CP8的小鼠，说明鞭毛蛋白能增强体液免疫反应；而CP8-Lys-Flic组抗体水平明显高于CP8-Flic组，表明都载体蛋白赖氨酸的优化是很重要的。通过淋巴细胞转化试验可知，CP8偶联物能够使小鼠产生T细胞依赖的免疫应答，其中CP8与Lys-Flic的偶联物组小鼠的淋巴细胞增殖能力高于或显著高于BSA-CP5组，说明Flic能够促进细胞免疫应答，从攻毒保护结果可知，偶联物对小鼠均有一定的攻毒保护作用，其中Lys-Flic-CP8对小鼠的攻毒保护率最高，因此Lys-Flic和Flic同样可以作为一个理想的金黄色葡萄球菌CP8的载体蛋白和免疫佐剂。

Claims (1)

1.一种金黄色葡萄球菌荚膜多糖和蛋白质偶联物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)聚赖氨酸鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的制备

通过重叠延伸PCR法在鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白基因的上游引入6个连续编码的赖氨酸密码子，所述6个连续编码的赖氨酸密码子的序列为：AAAAAGAAAAAGAAAAAG，该连接了6个赖氨酸密码子的鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白基因序列被引入载体pET-His后，获得表达载体pET-His-6×Lys-Flic，并转化至大肠杆菌，得到表达聚赖氨酸鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的工程菌，目的蛋白的表达量达到细菌总蛋白的15～25％；

(2)金黄色葡萄球菌荚膜多糖的化学修饰

将金黄色葡萄球菌荚膜多糖配成4～6mg/ml的生理盐水溶液，在每毫升该溶液中，加入己二酸二酰肼0.03～0.07g，混匀，在每毫升该溶液中，加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)-碳化二亚胺0.005～0.02g，混匀，用盐酸溶液调节该溶液的pH值至3.7～5.6，在室温下置2～4小时；

(3)去除未被结合的己二酸二酰肼和1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)-碳化二亚胺

将上述反应物装于透析袋中，截止分子量为5KD～10KD，在0.2M的NaCl溶液中于4℃透析1～2小时，以除去己二酸二酰肼和1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)-碳化二亚胺；

(4)荚膜多糖和蛋白载体的偶联

在每毫升上述经过化学修饰的荚膜多糖溶液中加入鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白或者聚赖氨酸鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白0.5～2mg，震荡混匀，用盐酸调节混合物溶液的pH值至3.7～5.6，然后在每毫升溶液中加入0.001～0.004g 1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)-碳化二亚胺，震荡混匀，用盐酸溶液再次调节pH值至3.7～5.6，放置4℃反应10～14小时；

(5)偶联物的收集和纯化

将偶联物原液经10000～20000rpm离心2分钟，取上清过凝胶柱，采用蛋白纯化系统在206nm和280nm处收集洗脱液，用生理盐水平衡与洗脱凝胶柱，柱子的平衡和洗脱流速为2～4ml/分。 

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