DE69938168T2 - Erysipelothrix rhusiopathiae Antigene und Impfstoff-Zusammensetzungen - Google Patents

Erysipelothrix rhusiopathiae Antigene und Impfstoff-Zusammensetzungen Download PDF

Info

Publication number
DE69938168T2
DE69938168T2 DE69938168T DE69938168T DE69938168T2 DE 69938168 T2 DE69938168 T2 DE 69938168T2 DE 69938168 T DE69938168 T DE 69938168T DE 69938168 T DE69938168 T DE 69938168T DE 69938168 T2 DE69938168 T2 DE 69938168T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
rhusiopathiae
antigen
culture
vaccine
adjuvant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69938168T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69938168D1 (de
Inventor
David Stewart Philadelphia Roberts
Brian Thomas Lincoln Suiter
Leroy Allen Waterford Swearingin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pfizer Products Inc
Original Assignee
Pfizer Products Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pfizer Products Inc filed Critical Pfizer Products Inc
Publication of DE69938168D1 publication Critical patent/DE69938168D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE69938168T2 publication Critical patent/DE69938168T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02Bacterial antigens
    • A61K39/08Clostridium, e.g. Clostridium tetani
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00Drugs for dermatological disorders
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04Antibacterial agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12Antivirals
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02Immunomodulators
    • A61P37/04Immunostimulants
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511Organic adjuvants
    • A61K2039/55566Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511Organic adjuvants
    • A61K2039/55577Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft Antigenzusammensetzungen und Vakzinformulierungen, um eine Erysipelothrix rhusiopathiae-Infektion (Erysipel) zu verhindern oder zu kontrollieren bzw. zu bekämpfen, und Verfahren zum Herstellen und Verwenden jener Antigenzusammensetzungen und Vakzinformulierungen.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Erysipel hat eine weltweite Verbreitung und ist von ökonomischer Wichtigkeit überall in Europa, Asien, Australien und Nord- und Südamerika. Schweine im Alter von 3 Monaten bis zu 3 Jahren sind am anfälligsten für Erysipel. Betroffene Schweine haben häufig geschwollene und steife Gelenke und sie nehmen nicht effizient an Gewicht zu. Auch werden ihre Schlachtkörper häufig durch Inspektoren in Abpackungsbetrieben beschnitten oder verworfen.
  • Etwa vor 10 Jahren wurde gezeigt, dass die konventionelle Praxis des Herstellens von E. rhusiopathiae-Vakzinen aus abgetöteten Gesamtkulturen unnötig war. Ein Bakterium-freies Filtrat funktionierte ebenso gut beim Schützen von sowohl Schweinen als auch Mäusen gegen eine Virusprovokation („virulent challenge"). Nachfolgend veröffentlichte Forschungen von japanischen und U.S.-Wissenschaftlern bestätigten diesen Befund und zeigten, dass E. rhusiopathiae in das Kulturmedium ein Antigen freisetzt, das dahingehend ein Universalimmunogen ist, dass es Schweine gegen alle E. rhusiopathiae-Stämme immunisiert (Sawada und Takahashi, 1987, Am. J. Vet. Res. 48: 239–242; Groschup et al., 1991, Epidemiol. Infect. 107: 637–649). Groschup et al. zeigten, dass ein 64 bis 66 kDa-Protein in der Kultur Mäuse gegen eine Provokation mit virulentem E. rhusiopathiae schützte. Nachdem gezeigt wurde, dass ein derartiges Protein auch Schweine schützt, stellt die USDA einen monoklonalen Antikörper (mAb) gegen dieses Protein zur Verwendung beim Untersuchen dieses Proteins für Vakzinhersteller bereit.
  • Sato et al., (1995), Veterinary Microbiology, 43, 173–182, offenbaren die Herstellung einer antigenen Zusammensetzung, umfassend eine flüssige Fraktion des Kulturfiltrats von Erysipelothrix rhusiopathiae.
  • Timoney et al., (1993), Veterinary Microbiology, 37, 381–387, erwähnen eine Vakzinzusammensetzung zum Schutz von Schweinen, umfassend die flüssige Fraktion des Kulturmediums von E. rhusiopathiae, adsorbiert an Alaun, und mit Formaldehyd behandelte („formalized") Bakterien.
  • Obwohl eine wirksame Vakzine zum Verhindern von Erysipel bei Schweinen sehr wünschenswert ist, stellt keine der vielen herkömmlichen Erysipel-Vakzinen einen annehmbaren Schutz für abgesetzte bzw. entwöhnte Schweine bereit. Das Problem ist das Fehlen der Dauer von Immunität. Die Schweineindustrie benötigt eine Vakzine, die, gegeben beim Absetzen, die Schweine gegen diese tödliche, verheerende Krankheit bis zum Schlachtalter, d. h. etwa 6 Mona te, schützen wird. Die USDA spezifizierte diese Anforderung als einen Standard für die Zulassung neuer Vakzinen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Es wird daher eine Antigenzusammensetzung bereitgestellt, umfassend eine flüssige Fraktion aus einer E. rhusiopathiae-Kultur und ein Stabilisierungsmittel, wobei die E. rhusiopathiae-Kultur mit Formalin oder mit beta-Propiolacton und einem Stabilisierungsmittel inaktiviert ist, wobei das Stabilisierungsmittel ein Metallhydroxid, ein Metallphosphat, ein Aluminiumhydroxidgel, ein Aluminiumphosphatgel, ein Calciumphosphatgel, ein Zinkhydroxid/Calciumhydroxid-Gel oder ein Alaun ist, wobei die Antigenzusammensetzung frei von E. rhusiopathiae ist.
  • Es wird daher eine Vakzinzusammensetzung bereitgestellt, umfassend eine Antigenzusammensetzung, umfassend eine flüssige Fraktion aus einer E. rhusiopathiae-Kultur und ein Stabilisierungsmittel, wobei die E. rhusiopathiae-Kultur inaktiviert ist, und eine Adjuvans-Zusammensetzung.
  • Es wird daher ein Verfahren zum Herstellen einer Antigenzusammensetzung, umfassend das Zugeben eines Stabilisierungsmittels zu einer flüssigen Fraktion aus einer E. rhusiopathiae-Kultur, wobei die E. rkusiopathiae-Kultur inaktiviert ist, bereitgestellt.
  • Es wird daher die Verwendung einer Antigenzusammensetzung, umfassend eine flüssige Fraktion aus einer E. rhusiopathiae-Kultur und ein Stabilisierungsmittel, wobei die E. rhusiopathiae-Kultur inaktiviert ist, zur Herstellung einer Vakzine zum Schutze eines Tieres gegen Erysipel, wobei das Tier vorzugsweise ein Säuger oder ein Vogel und am stärksten bevorzugt ein Schwein, ein Lamm, ein Hund, ein Pferd, eine Kuh oder ein Mensch ist, bereitgestellt.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Jeder beliebige Stamm von E. rhusiopathiae kann die Quelle der Antigene für die Erfindung sein, z. B. die in dem U.S. Patent Nr. 5,625,038 beschriebenen Stämme. Die Kultur, aus der die Antigene isoliert werden können, kann in einer Vielfalt von Weisen bereitgestellt werden. Zum Beispiel kann die Kultur rein oder im Wesentlichen rein sein. Stärker bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Antigene aus einem Überstand oder Filtrat einer E. rhusiopathiae-Kultur erhalten. In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Antigene aus dem Überstand oder Filtrat einer reinen oder im Wesentlichen reinen Flüssigkultur von E. rhusiopathiae erhalten.
  • E. rhusiopathiae kann in einer Vielfalt von Weisen kultiviert werden, wie im Fachgebiet bekannt ist. Siehe die U.S. Patente mit den Nm. 5,625,038 , 5,616,328 , 5,417,971 , 5,225,194 , 4,981,685 , welche die Kultivierung von Bakterien diskutieren. Zum Beispiel kann E. rhusiopathiae, wie in den unten bereitgestellten veranschaulichenden Beispielen beschrieben, kultiviert werden. E. rhusiopathiae kann auch, wie bei Sawada und Takahashi, 1987, Am. J. Vet. Res., 48: 239–242 und bei Groschup et al., 1991, Epidemiol. Infect., 107: 637–649, beschrieben, kultiviert werden. Allgemeine Hintergrundinformation über das Kultivieren und Verarbeiten von prokaryotischen Zellen wird bei Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene publishing Associates and Wiley Interscience, NY; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, bereitgestellt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Kultur durch Zugeben von Formalin (Endkonzentration etwa 0,5% V/V) inaktiviert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die Antigene für die Erfindung aus dem Überstand oder Filtrat einer E. rhusiopathiae-Kultur erhalten. Ein Kulturüberstand oder Filtrat wird in einer bevorzugten Ausführungsform 3-bis 10fach (vorzugsweise etwa 10fach) konzentriert und Aluminiumhydroxidgel (vorzugsweise REHYDRAGELTM) wird zu dem konzentrierten Überstand oder Filtrat bis zu einer Endkonzentration von etwa 30% V/V zur Stabilisierung des Antigens zugegeben. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird eine Vakzinzusammensetzung formuliert, umfassend das Antigen und ein Adjuvans, wobei das Adjuvans z. B. etwa 25% V/V der Vakzinzusammensetzung umfasst. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird Thimerosal (Endkonzentration etwa 0,01% V/V) mit EDTA (Endkonzentration etwa 0,07% V/V) zu den Antigenen als Konservierungsmittel zugegeben. Ein bevorzugtes Adjuvans, hierin als „Nr.1-Adjuvans" bezeichnet, umfasst etwa 2% V/V Lecithin, etwa 18% V/V Mineralöl und etwa 8% V/V oberflächenaktives Mittel (z. B. etwa 5,6% V/V Tween 80 und etwa 2,4% V/V Span 80), wobei das verbleibende Volumen eine Salzlösung (z. B. Dulbecco-PBS) ist. Dieses Adjuvans wird in dem U.S. Patent Nr. 6,572,861 , eingereicht am 24. Januar 2000, mit dem Titel „Adjuvants for Use in Vaccines" beschrieben.
  • Inaktivierung von E. rhusiopathiae
  • Die Antigene für die Erfindung werden von E. rhusiopathiae erhalten, wobei dies auf Weisen bereitgestellt werden kann, die im Fachgebiet bekannt sind, z. B. in Ftüssigkultur. In der Erfindung wird eine E. rhusiopathiae-Kultur, aus welcher ein Antigen isoliert wird, vor der Verwendung des Antigens in einer Vakzinformulierung inaktiviert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die E. rhusiopathiae-Kultur vor dem Abtrennen der flüssigen Fraktion von den Bakterien inaktiviert. Die Inaktivierung der E. rhusiopathiae-Kultur wird für eine Vielfalt von Zwecken, z. B. zum Abtöten der Bakterien oder zum Inaktivieren von Proteasen oder zum Erhalten des Antigens, durchgeführt.
  • Eine Kultur, die Antigene für die Erfindung enthält, kann in einer Vielfalt von Weisen, die im Fachgebiet bekannt sind, inaktiviert werden. Zum Beispiel kann die Kultur einem inaktivierenden Agens ausgesetzt werden, d. h. einem Agens bzw. Mittel, das zum Abtöten von E. rhusiopathiae befähigt ist. Ein inaktivierendes Agens, das in der Praxis der Erfindung zweckmäßig ist, ermöglicht es dem erfindungsgemäßen Antigen, eine Immunreaktion bei einem Tier auszulösen, um dieses Tier vor Erysipel zu schützen. Inaktivierende Agenzien, die im Fachgebiet bekannt sind, können verwendet werden, z. B. Formalin (Formaldehyd), beta-Propiolacton oder andere chemische Agenzien mit Eigenschaften, die denjenigen dieser Agenzien bzw. Mittel ähnlich sind. Geeignete chemische Agenzien zur Inaktivierung von Bakterien können durch einen Fachmann mit gewöhnlichem Kenntnisstand auf dem Gebiet bestimmt werden, z. B. durch In-Kontakt-Bringen der Bakterien mit einer speziellen Chemikalie und Bestimmen, ob die Bakterien abgetötet werden und die Antigene dabei bezüglich ihrer Fähigkeit, einen schützenden Antikörper zu erzeugen, aktiv bleiben, z. B. durch Vakzinieren von Mäusen mit den behandelten Bakterien. Siehe auch U.S. Patent Nr. 5,225,194 , welches die Inaktivierung von Bakterien diskutiert.
  • Abtrennung und Konzentrierung der E. rhusiopathiae-Kulturflüssigkeit
  • Antigene für die Erfindung werden aus der flüssigen Fraktion einer E. rhusiopathiae-Kultur erhalten. E. rhusiopathiae kann kultiviert werden und die Bakterien können aus der Kulturbrühe z. B. durch Zentrifugieren oder Filtrieren einer Flüssigkultur abgetrennt werden. Eine Kultur von E. rhusiopathiae, die für die Isolierung eines Antigens für die Erfindung zweckmäßig ist, kann in einer beliebigen Weise, die im Fachgebiet bekannt ist, bereitgestellt werden. Zum Beispiel kann E. rhusiopathiae in einer Bouillon oder in einem Medium wachsen gelassen werden, so dass sich die Bakterien rasch vervielfältigen, d. h. log-Phase. In einer bevorzugten Ausführungsform befindet sich die zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Antigens verwendete Kultur zum Zeitpunkt, wenn die Verarbeitung der Kultur begonnen wird, in der log-Phase, stärker bevorzugt in der späten log-Phase.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die E. rhusiopathiae-Kultur so verarbeitet, dass alle oder im Wesentlichen alle Bakterien von der Bouillon oder dem Medium, in der/dem sie wachsen gelassen wurden, abgetrennt werden. Zum Beispiel können etwa 90% der Bakterien aus der Bouillon oder dem Medium entfernt werden, stärker bevorzugt werden etwa 95% der Bakterien entfernt, stärker bevorzugt werden mindestens etwa 98% der Bakterien entfernt. E. rhusiopathiae kann aus der Kulturbrühe oder dem Medium in jeder beliebigen Weise, die im Fachgebiet bekannt ist, entfernt werden. Zum Beispiel kann die E. rhusiopathiae-Kultur zentrifugiert werden, um die Bakterien aus der Bouillon oder dem Medium abzutrennen. Jegliche im Fachgebiet bekannte Zentrifuge, die zum Sedimentieren der E. rhusiopathiae-Bakterien befähigt ist, ist zum Abtrennen der Zellen von der Bouillon oder dem Medium geeignet. Zum Beispiel kann eine Zentrifuge mit kontinuierlichem Fluss bzw. eine Durchlaufzentrifuge verwendet werden. Hintergrundinformationen darüber, wie Bakterien aus einem Kulturmedium zu entfernen sind, werden bei Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., 1989 Current Protocols in Molecular Biology, Greene publishing Associates and Wiley Interscience, NY; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, bereitgestellt.
  • In einem anderen Aspekt kann E. rhusiopathiae aus dem Kulturmedium oder der -brühe durch Filtration durch einen Filter, der die Bakterien zurückhält, aber das erfindungsgemäße Antigen nicht zurückhält, entfernt werden. Es sind viele Filter, die zum Abtrennen der Bakterien von dem Antigen in der Bouillon oder dem Medium geeignet sind, im Fachgebiet bekannt. Zum Beispiel hat ein Filter, der zur Abtrennung der Bakterien aus der flüssigen Fraktion zweckmäßig ist, einen mittleren Porendurchmesser von etwa 0,1 μm bis etwa 0,5 μm, stärker bevorzugt etwa 0,2 μm.
  • Die aus einer Kultur von E. rhusiopathiae („flüssige Fraktion") erhaltene flüssige Fraktion, wie oben beschrieben, kann konzentriert werden. In einer Ausführungsform kann die flüssige Fraktion 3fach bis 30fach, z. B. etwa 3fach oder etwa 6fach oder etwa 10fach oder etwa 15fach oder etwa 20fach oder etwa 30fach konzentriert werden. Die flüssige Fraktion kann auf jede Weise, die im Fachgebiet bekannt ist, konzentriert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die flüssige Fraktion unter Verwendung einer Hohlfaserfraktion konzentriert werden. In einem Aspekt wird die Hohlfasernfiltration mit einem Molekulargewichtsausschluss von etwa 5000 Kilodalton bis etwa 50000 Kilodalton, stärker bevorzugt von etwa 10000 Kilodalton bis etwa 30000 Kilodalton, durchgeführt. Siehe auch U.S. Patent Nr. 5,225,194 , welches die Konzentrierung einer flüssigen Fraktion einer Bakterienkultur diskutiert.
  • Die flüssige Fraktion kann auch mittels Gefriertrocknen oder Lyophilisierung konzentriert werden. In einem anderen Aspekt kann die flüssige Fraktion durch Präzipitation der Proteine und Polypeptide in der flüssigen Fraktion, gefolgt von Resuspendieren des Präzipitats, konzentriert werden. Proteine können aus der flüssigen Fraktion unter Verwendung jedes beliebigen Verfahrens, das im Fachgebiet bekannt ist, präzipitiert werden, z. B. durch Präzipitation mittels Polyethylenglykol, Ethanol oder Ammoniumsulfat. Nach der Präzipitation kann das Sediment in jeder beliebigen Lösung, die zur Herstellung einer Vakzinformulierung geeignet ist, z. B. einer Salzlösung, resuspendiert werden.
  • Stabilisierung von E. rhusiopathiae-Antigen
  • Antigene, die aus einer flüssigen Fraktion einer E. rhusiopathiae-Kultur erhalten wurden, sind wirksame Immunogene, um Erysipel bei einem Tier zu verhindern oder zu kontrollieren bzw. zu bekämpfen. Jedoch ist der Mangel an Stabilität dieser Antigene nach dem Entfernen der Bakterien ein ernstes Problem, wenn diese Antigene in einer Vakzinzusammensetzung verwendet werden. Die Erfindung löst dieses Problem und basiert teilweise auf der Entdeckung, dass Antigene in einer flüssigen Fraktion einer E. rhusiopathiae-Kultur durch Zugeben eines Stabilisierungsmittels stabilisiert werden können.
  • Jedes beliebiges Stabilisierungsmittel, das im Fachgebiet bekannt ist, kann verwendet werden, um die Antigene für die Erfindung zu stabilisieren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Stabilisierungsmittel zum Adsorbieren eines Antigens aus einer flüssigen Fraktion einer E. rhusiopathiae-Kultur befähigt. Ein geeignetes Stabilisierungsmittel kann das antigene Potenzial einer flüssigen Fraktion einer E. rhusiopathiae-Kultur aufrechterhalten oder anderweitig den Abbau ihres antigenen Potenzials nach dem Entfernen der Bakterien verlangsamen. Eine derartige stabilisierende Wirkung eines Mittels bzw. Agens kann experimentell bestimmt wer den. Zum Beispiel kann man zwei Proben einer flüssigen Fraktion einer inaktivierten E. rhusiopathiae-Kultur bei 37°C für eine Zeitdauer, z. B. von etwa 14 bis etwa 28 Tagen, inkubieren, eine Probe mit und eine ohne ein chemisches Mittel, das hinsichtlich seiner Verwendung als Stabilisierungsmittel getestet wird. Die Proben werden dann in einer Vakzinierung von Mäusen gemäß dem Standard-Maus-Potenz-Test bzw. -Wirksamkeits-Test („standard mouse potency test")(9 CFR 113.119(c)) unter Verwendung eines Adjuvans, zum Beispiel Nr. 1-Adjuvans, getestet. Ein höherer Anteil geschützter Tiere in der Gruppe, der die Vakzine verabreicht wurde, welche mit dem chemischen Mittel behandelt worden war, als in der Gruppe, der die unbehandelte Vakzine gegeben worden war, oder bei den nicht-vakzinierten Kontrolltieren zeigt an, dass das Antigen in der chemisch behandelten Vakzine stabilisiert wurde.
  • Das oben beschriebene Experiment veranschaulicht einen beschleunigten Stabilitätstest bei einer höheren Temperatur (37°C), als sie normalerweise für die Lagerung verwendet wird. Normalerweise werden Antigenzubereitungen bei kalten Temperaturen, z. B. von etwa 2°C bis etwa 8°C, gelagert. Eine Stabilität von 28 Tagen bei 37°C zeigt eine Stabilität für eine längere Zeitdauer bei normaler kalter Lagerung, d. h. für eine Dauer von mehreren Jahren, an. In einer Ausführungsform wird das Antigen bei kalten Temperaturen für bis zu etwa 5 Jahre gemäß der vorliegenden Erfindung, spezieller für bis zu etwa 3 Jahre, bei kalten Temperaturen, stabilisiert. In einer weiteren Ausführungsform wird das Antigen für mindestens ein Jahr bei kalten Temperaturen gemäß der vorliegenden Erfindung stabilisiert.
  • Eine Vielfalt von Mitteln ist im Fachgebiet bekannt, die zum Adsorbieren eines Antigens befähigt sind, zum Beispiel ein Aluminiumhydroxidgel, ein Aluminiumphosphatgel, ein Calciumphosphatgel, ein Zinkhydroxid/Calciumhydroxid-Gel und ein Alaun (z. B. ein Kalialaun) sind als Stabilisierungsmittel zweckmäßig. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Aluminiumhydroxidgel, z. B. REHYDRAGELTM, als ein Stabilisierungsmittel verwendet. (Siehe U.S. Patente mit den Nrn. 5,616,328 und 5,232,690 , welche die Metallgele und ihre Verwendungen diskutieren.)
  • In einer Ausführungsform wird ein Metallhydroxidgel, z. B. ein Aluminiumhydroxidgel (z. B. REHYDRAGELTM) bis zu einer Endkonzentration von etwa 10% V/V bis zu etwa 40% V/V, zum Beispiel etwa 10% V/V oder etwa 20% V/V oder etwa 30% V/V oder etwa 40% V/V, in der Antigenzubereitung zugegeben. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Aluminiumhydroxidgel (z. B. REHYDRAGELTM) bis zu einer Endkonzentration von etwa 30% V/V in der Antigenzubereitung zugegeben.
  • Eine Antigenzubereitung, die das Stabilisierungsmittel enthält, kann verwendet werden, um eine Vakzinzusammensetzung zu formulieren, z. B. durch Zugeben eines Adjuvans und eines Verdünnungsmittels, wie Salzlösung, so dass die Antigenzubereitung und das Stabilisierungsmittel verdünnt werden. Eine derartige Verdünnung kann hilfreich dabei sein, unerwünschte Nebenwirkungen der Vakzinformulierung bei dem Tier zu vermeiden oder im Wesentlichen zu vermeiden. Zum Beispiel wird eine Antigenformulierung, die ein Metallhydroxidgel, z. B. Alu miniumhydroxidgel (z. B. REHYDRAGELTM) enthält, beim Zugeben zu einer Vakzinformulierung um das 5fache oder etwa 10fache oder etwa 15fache oder etwa 20fache oder etwa 25fache oder etwa 30fache verdünnt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Antigenformulierung, die Aluminiumhydroxidgel (z. B. REHYDRAGELTM) in einer Endkonzentration von etwa 30% V/V enthält, durch Zugabe zu der Vakzinformulierung um das etwa 20fache verdünnt, was eine Aluminiumhydroxidgel-Endkonzentration von etwa 1,5% ergibt.
  • Vakzinzusammensetzungen, die Antigene von E. rhusiopathiae umfassen
  • Eine erfindungsgemäße Antigenzusammensetzung kann in einer Vakzinzusammensetzung verwendet werden, um ein Tier zu immunisieren. In einer Ausführungsform enthält die Vakzinzusammensetzung eine erfindungsgemäße Antigenzusammensetzung und ein Adjuvans. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein Adjuvans, das für eine erfindungsgemäße Vakzinzusammensetzung zweckmäßig ist, ein Lecithin, ein Öl und ein oberflächenaktives Mittel. Eine Vakzinzusammensetzung, die mit einem bevorzugten Adjuvans formuliert ist, enthält ein Lecithin mit von 0,25% bis 12,5% V/V, stärker bevorzugt von etwa 0,5% bis etwa 5% und am stärksten bevorzugt von etwa 0,5% bis etwa 1,25% V/V, ein Öl mit von 1% bis 23% V/V, stärker bevorzugt von etwa 3,5% bis etwa 10% und am stärksten bevorzugt etwa 4,5%, und ein amphiphiles oberflächenaktives Mittel mit von 1,5% bis 8% V/V, stärker bevorzugt von etwa 1,5% bis etwa 4% und am stärksten bevorzugt etwa 2% V/V. Vorzugsweise weist das Adjuvans zwei amphiphile oberflächenaktive Mittel auf, z. B. die oberflächenaktiven Mittel Tween und Span, von denen eines vorherrschend in der wässrigen Phase (z. B. Tween 80) der Vakzinzusammensetzung und das andere in der Ölphase (z. B. Span 80) vorliegt. Wenn Tween 80 und Span 80 als die oberflächenaktiven Mittel verwendet werden, ist vorzugsweise die Konzentration von Tween 80 etwa 1 1/2 bis etwa 3 mal so groß wie die Konzentration von Span 80, vorzugsweise etwa 2 mal. Ein bevorzugtes Adjuvans enthält eine wässrige Trägerlösung, z. B. Phosphat-gepufferte Salzlösung („phosphate-buffered saline")(PBS)(z. B. Dulbecco-PBS). Ein Lecithin und ein Öl, die für ein Adjuvans für die Vakzinzusammensetzungen geeignet sind, ist ein Gemisch von Lecithin in DRAKEOLTM 5 Lt Mineralöl. Lecithin kann von Central Soya, Fort Wayne, Indiana, erhalten werden. Siehe auch U.S. Patent Nr. 5,084,269 , welches Adjuvans-Zusammensetzungen diskutiert. Die oberflächenaktiven Mittel Tween und Span können von Van Waters and Rogers, Omaha, Nebraska, erhalten werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform können Adjuvantien, die im Fachgebiet bekannt sind, zum Beispiel Ölemulsionen, Aluminiumhydroxid, Muramyldipeptide, Zink/Calciumhydroxid, Avidin, Aluminiumhydroxid, Öle und Saponine, in einer erfindungsgemäßen Vakzinformulierung verwendet werden, wie in den U.S. Patenten mit den Nm. 5,846,527 , 5,417,971 , 5,232,690 beschrieben, welche Adjuvantien diskutieren.
  • Eine bevorzugte Vakzinzusammensetzung wird so formuliert, dass von etwa 10% bis etwa 50% ihres Volumens eine Adjuvans-Zusammensetzung ist, stärker bevorzugt von etwa 15% bis etwa 35%, stärker bevorzugt von etwa 20% bis 30% und am stärksten bevorzugt etwa 25%.
  • Eine Vakzinformulierung kann an ein Subjekt per se oder in Form einer pharmazeutischen oder therapeutischen Zusammensetzung verabreicht werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend die Antigene, können mittels konventioneller Verfahren des Mischens, Auflösens, Granulierens, Dragierens bzw. Herstellen von Dragees, Verreiben, Emulgieren, Verkapseln, Einschließen oder Lyophilisieren hergestellt werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen können in konventioneller Weise unter Verwendung von einem oder mehreren physiologisch annehmbaren Träger/n, Verdünnungsmittel/n, Exzipiens/Exzipienzien oder Hilfsstoff/en, welche das Verarbeiten der erfindungsgemäßen Antigene in Zubereitungen, welche pharmazeutisch verwendet werden können, erleichtern bzw. ermöglichen, formuliert werden. Die geeignete Formulierung ist von dem gewählten Verabreichungsweg abhängig.
  • Systemische Formulierungen schließen jene ein, die für die Verabreichung mittels Injektion, z. B. subkutane, intradermale, intramuskuläre oder intraperitoneale Injektion, konzipiert wurden.
  • Zur Injektion können die Antigene in wässrigen Lösungen, vorzugsweise in physiologisch kompatiblen Puffer, wie Hanks-Lösung, Ringer-Lösung, Phosphat-gepufferter Salzlösung oder einem beliebigen anderen physiologischen Salzlösungspuffer, formuliert werden. Die Lösung kann Formulierungshilfsmittel („formulatory agents"), wie Suspendier-, Stabilisierungs- und/oder Dispergiermittel, enthalten. Alternativ können die Proteine in Pulverform zur Rekonstitution („constitution") mit einem geeigneten Vehikel, z. B. steriles pyrogenfreies Wasser, vor der Verwendung vorliegen.
  • Zusätzlich zu den zuvor beschriebenen Formulierungen können die Antigene auch als Depotzubereitung formuliert werden. Derartige lang wirkende Formulierungen können mittels Implantation (z. B. subkutan oder intramuskulär) oder mittels intramuskulärer Injektion verabreicht werden. Somit können die Antigene z. B. mit geeigneten polymeren oder hydrophoben Materialien (z. B. als eine Emulsion in einem annehmbaren Öl) oder Ionenaustauscherharzen oder als schwer lösliche Derivate, z. B. als ein schwer lösliches Salz, formuliert werden.
  • Alternativ können andere pharmazeutische Abgabesysteme eingesetzt werden. Liposomen und Emulsionen sind gut bekannte Beispiele für Abgabevehikel, die verwendet werden können, um ein Antigen abzugeben. Bestimmte organische Lösungsmittel, wie Dimethylsulfoxid, können ebenfalls verwendet werden, obwohl gewöhnlich auf Kosten einer größeren Toxizität. Zusätzlich können die Antigene unter Verwendung eines Systems zur verzögerten bzw. verlängerten Freisetzung („sustained release"), wie semipermeable Matrices fester Polymere, die das therapeutische oder vakzinierende Mittel enthalten, abgegeben werden. Verschiedene Materialien mit verzögerter bzw. verlängerter Freisetzung wurden etabliert und sind den Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt. Kapseln mit verzögerter bzw. verlängerter Freisetzung können in Abhängigkeit von ihrer chemischen Beschaffenheit, die Antigene für wenige Wochen bis zu über 100 Tage freisetzen. In Abhängigkeit von der chemischen Beschaffenheit und der biologischen Stabilität des Mittels können zusätzliche Strategien zur Antigenstabilisierung eingesetzt werden.
  • Die Bestimmung einer effektiven Menge des Antigens zur Verabreichung liegt gut innerhalb der Fähigkeiten der Fachleute auf dem Gebiet, insbesondere im Licht der detaillierten Offenbarung, die hierin bereitgestellt wird.
  • Eine wirksame Dosis kann anfänglich aus In vitro-Assays bestimmt werden. Zum Beispiel kann eine Dosis in Tiermodellen formuliert werden, um eine Induktion einer Immunreaktion unter Verwendung von Techniken, die im Fachgebiet gut bekannt sind, zu erreichen. Ein Fachmann mit gewöhnlichem Kenntnisstand auf dem Fachgebiet könnte die Verabreichung, basierend auf den hierin beschriebenen Ergebnissen, leicht für alle Tierspezies optimieren. Die Dosierungsmenge und das -intervall können individuell angepasst werden. Wenn sie als eine Vakzine verwendet werden, können die erfindungsgemäßen Antigene z. B. in etwa 1 Dosis bis zu etwa 3 Dosen über eine Dauer von etwa 2–36 Wochen verabreicht werden. Auffrischungsvakzinierungen bzw. Booster-Vakzinierungen können periodisch danach gegeben werden. Alternative Protokolle können für einzelne Tiere angemessen sein. Eine geeignete Dosis ist eine Menge an Antigen, die, wenn wie oben beschrieben verabreicht, zum Erzeugen einer Immunreaktion in einem immunisierten Tier befähigt ist, die ausreicht, um das Tier vor einer E. rhusiopathiae-Infektion für mindestens 4 bis 12 Monate zu schützen.
  • Die Menge an Antigen in einer Dosis wird als optische Dichte (E625) der Kultur bei der Inaktivierung, als Trübungseinheiten, spezifiziert. Wenn die optische Dichte bei der Inaktivierung z. B. 4,0 ist, wird ein ml des Kulturüberstands oder Filtrats, hergestellt aus der Kultur, vier Trübungseinheiten enthalten, 0,5 ml werden 2 Trübungseinheiten enthalten etc., obgleich die Quelle der Trübung, die Bakterienzellen, entfernt wurden. Wenn eine Überstandsflüssigkeit, die z. B. 5 Trübungseinheiten pro ml enthält, durch Molekularfiltration 12fach konzentriert wird, wird die konzentrierte Flüssigkeit einen Wert von 60 Trübungseinheiten pro ml aufweisen. Im Allgemeinen kann die Menge an Antigen in einer Dosis der Vakzine von etwa 1 bis zu etwa 12 Trübungseinheiten, vorzugsweise von etwa 2 bis etwa 4 Trübungseinheiten, reichen. Ein geeignetes Dosisvolumen wird mit dem Injektionsweg und der Größe des Wirts typischerweise von 0,1 bis etwa 5 ml variieren. Wenn der Wirt ein Schwein ist, ist das Schwein vorzugsweise mindestens zwei Wochen alt.
  • Beispiele
  • Die unten dargestellte Vakzinierungsstudie zeigte, dass eine Vakzine, wie hierin beschrieben, mit Nr. 1-Adjuvans, wenn sie in einem 2-Dosen-Regime im Alter von etwa 3 und 6 Wochen an Ferkel verabreicht wird, einen signifikanten Schutz gegen Virusprovokation 20 Wochen nach einer zweiten Vakzinierung bereitstellte. Das Antigen mit Nr. 1-Adjuvans induzierte auch wesentliche Antikörperreaktionen, wie mittels Serum-ELISA-litern bei zwei Wochen nach der Vakzinierung gezeigt, aber zum Zeitpunkt der Provokation hatten diese Titer abgenommen und die einzelnen bzw. individuellen Titer korrelierten nicht eng mit dem Schutz. Das gleiche Antigen in Saponin-Adjuvans und auf dem gleichen Weg verabreicht induzierte geringere ELISA-Titer und erwies sich als inadäquat beim Schutz von Schweinen vor Virusprovokation 20 Wochen nach einer zweiten Vakzinierung.
  • Das Provokationsmodell funktionierte dahingehend sehr gut, dass alle 10 Kontrollschweine klinische Zeichen von Erysipel nach der Provokation entwickelten (Tabelle 2). Drei Schweine erfüllten das Kriterium der erhöhten Temperatur und weitere fünf waren E. rhusiopathiae-Kultur-positiv. Die verbleibenden zwei Kontrollschweine erfüllten keines der obigen Kriterien; jedoch waren sie für mehrere Tage deprimiert und sie wiesen metastatische Hautläsionen auf, die für die Krankheit charakteristisch sind, und sie wurden daher in humaner Weise getötet. Im Gegensatz dazu waren in der Gruppe, die mit der Vakzine, enthaltend Nr. 1-Adjuvans, vakziniert worden waren, 15 der 20 Schweine vollständig geschützt (Tabelle 3).
  • Eine experimentelle Vakzine, enthaltend ein erfindungsgemäßes Antigen von E. rhusiopathiae mit Nr. 1-Adjuvans, stellte, wenn sie in einem 2-Dosen-Regime etwa im Alter von 3 und 6 Wochen an Ferkel abgegeben wurde, einen signifikanten Schutz gegen die Entwicklung von klinischem Erysipel nach Virusprovokation 20 Wochen nach einer zweiten Vakzinierung bereit, siehe Tabelle 3, infra. Darüber hinaus schützte eine ähnliche experimentelle Vakzine mit Saponin-Adjuvans, wenn sie Ferkeln gemäß dem gleichen Regime gegeben wurde, nicht gegen die Entwicklung von klinischem Erysipel nach Virusprovokation 20 Wochen nach einer zweiten Vakzinierung. Schließlich induzierte eine Vakzinierung, enthaltend ein erfindungsgemäßes Antigen, ungeachtet des verwendeten Adjuvans, eine substantielle serologische Reaktion, deren Höhepunkt zwei Wochen nach der zweiten Vakzinierung erfolgte.
  • Beispiel 1. E. rhusiopathiae-Kultur
  • Der E. rhusiopathiae-Stamm CN 3342 wird in einem Medium, enthaltend Proteose-Pepton von Difco mit einer Konzentration von 2,75%, Hefeextrakt von Difco (0,55%), Tween 80 (0,2%), K2HPO4 (0,217%) und KH2PO4 (0,061%) in deionisiertem Wasser, kultiviert. Der pH des Mediums wird mit 5 N NaOH auf 7,2 eingestellt. Das Medium wird bei einem Minimum von 122°C 30 bis 90 Minuten lang dampfsterilisiert. Nach dem Autoklavieren wird sterile 50%ige Dextroselösung bis zu einer Endkonzentration von 3% G/V zugegeben.
  • Arbeitsanimpfkulturen („working seed cultures") werden hergestellt, indem ein Kryoröhrchen der Master-Animpfcharge („master seed lot") aus der gefrorenen Lagerung (–70°C) entfernt wurde, indem es rasch aufgetaut wurde und indem der Inhalt aseptisch in einen Kolben mit Medium überführt wurde. Der Kolben wird bei 37°C 12 bis 36 Stunden unter Schütteln inkubiert und mittels Gram-Färbung auf Reinheit überprüft. Wenn festgestellt wurde, dass die Kultur rein war, wurde sie mit sterilem Glycerin (10%) gemischt, in 1 ml-Mengen in Kryoröhrchen verteilt und gefroren gelagert.
  • Animpfgefäße bzw. Herführungsgefäße („seed vessels"), die Produktionsmedium enthalten, werden mit 0,01 bis 2% Master- oder Arbeits-Animpf(Kultur) inokuliert. Animpffermenter bzw. Herführungsfermenter („seed fermenters"), die, wenn sie verwendet werden, 10 bis 100 Liter Produktionsmedium enthalten, werden mit 1 bis 5% Kultur aus einem Animpfkolben bzw. Herführungskolben („seed flask") inokuliert. Ein Produktionsfermenter, der 200 bis 10000 Liter Produktionsmedium enthält, wird mit 0,5 bis 5% Kultur aus dem Herführungsfermenter inokuliert.
  • Produktionskulturen werden bei einem Sollwert von 37 ± 2°C unter Rühren inkubiert. Die Inkubationszeiten variieren von 4 bis 24 Stunden. Sterile 10N-Natriumhydroxidlösung wird während der gesamten Inkubationsdauer hindurch zu der Kultur zugegeben, um einen pH von 7,2 ± 0,1 aufrechtzuerhalten. Während der Wachstumsphase werden periodische Zugaben von Dextrose gemacht.
  • Vor dem Ernten wird die Kultur mikroskopisch auf Reinheit, Zellmorphologie und Gram-Reaktion untersucht. Das Wachstum wird durch Messen der optischen Dichte der Kultur bei 625 nm überwacht. Die Kulturen werden geerntet, wenn sie eine optische Dichte von 4,0 oder höher bei 625 nm aufweisen.
  • Beispiel 2. Herstellung der E. rhusiopathiae-Vakzine
  • Eine Formalinlösung wurde zu den Kulturen bis zu einer Endkonzentration von 0,5% (V/V) zugegeben, um die Kultur zu inaktivieren. Die Kultur wurde dann in einen sterilen Tank überführt und in einem Inkubator mit 37 ± 2°C für ein Minimum von 24 Stunden (und ein Maximum von 60 Stunden) unter konstantem Rühren platziert. Die nicht sofort verarbeiteten Kulturen wurden für bis zu 7 Tage bei 2 bis 8°C gelagert. Die inaktivierte Kultur wurde mittels Passage durch eine Durchlaufzentrifuge geklärt. Die flüssige Fraktion wurde zur weiteren Verarbeitung zurückgehalten und die Bakterien wurden verworfen.
  • In einem Versuch wurden 10x-Konzentrate bei einem Filtrat von E. rhusiopathiae-Kulturen hergestellt, die entweder mit beta-Propiolacton („BPL"), Endkonzentration 0,1% V/V, oder mit Formalin, Endkonzentration 0,2% V/V, (bei 37°C für mindestens 24 Stunden) inaktiviert worden waren. Eine Enzym-gekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA), spezifisch für das 64 bis 66 kDa-Protein, das in dem Kulturfiltrat von E. rhusiopathiae gefunden worden war (Groschup et al., 1991, Epidemiol. Infect. 107: 637–649 und U.S. Patent Nr. 5,625,038 ), wurde durchgeführt, um die Wirkung der Inaktivierung und Stabilisierung auf das Vorhandensein des 64 bis 66 kDa-Proteins zu bestimmen. In Übereinstimmung mit früheren Befunden, dass die Formalininaktivierung der Kultur den (Mess)-Wert des Proteins im ELISA-Assay verringerte, wies das BPL-Konzentrat einen Assay-Wert von etwa dem 4fachen desjenigen des Formalinkonzentrates auf. Nach Inkubation bei 37°C für 14 Tage hatte das BPL-Konzentrat etwa 80% seines Wertes verloren, verglichen mit etwa 40% bei dem Formalinkonzentrat. In beiden Fällen verhinderte jedoch die vorausgehende Zugabe von REHYDRAGELTM, 30% V/V, als Stabilisierungsmittel, siehe unten, das meiste des Verlustes und nahezu alles davon im Fall der Formalinzubereitung. Eine kleine Studie bei Schweinen deutete darauf hin, dass die flüssige Fraktion der Formalin-inaktivierten Kulturen beim Schutz von Schweinen gegen Provokation mit virulentem E. rhusiopathiae wirksamer war als diejenige von Kulturen, die mit BPL inaktiviert worden waren.
  • Die Flüssigkeiten wurden mittels Hohlfaserfiltration (nomineller Molekulargewichtsausschluss × 10000 Kilodalton) nach Zentrifugation 6X bis 20X (gewöhnlich etwa 10X) konzentriert. Die Flüssigkeiten wurden nach der Konzentrierung durch Zugabe von Aluminiumhydroxidgel stabilisiert.
  • Um das Immunogen zu stabilisieren, wurde Aluminiumhydroxidgel langsam unter Rühren zu den konzentrierten Flüssigkeiten bis zu letztendlich 30% (V/V)(30 Volumenteile Gel zu 70 Volumenteile Konzentrat) zugegeben. Nach 20facher Verdünnung des Konzentrats in der Vakzine betrug der Al-Gel-Gehalt nur etwa 1,5%, was nicht ausreichend ist, um negative Reaktionen an der Injektionsstelle zu verursachen. Eine Titration zum Bestimmen der Menge an Al-Gel, die erforderlich ist, um das gesamte schützende Protein in der flüssigen Fraktion einer E. rhusiopathiae-Kultur, die 10fach konzentriert ist, zu adsorbieren, zeigte, dass mehr als 95% durch 32% V/V REHYDRAGELTM (Reheis, Berkeley Heights, New Jersey) adsorbiert wurden. Thimerosal (d. h. MERTHIOLATETM)(Dimportex, Spanien, importiert durch Flavine Inc., Klosters, New Jersey) wurde als Konservierungsmittel zu dem Produkt in einer Endkonzentration von etwa 0,01% (G/V) zugegeben. Die Konzentration von Thimerosal wurde bei etwa 0,01% G/V in der Antigenzusammensetzung und in einer Vakzinzusammensetzung, die das erfindungsgemäße Antigen enthielt, gehalten. EDTA wurde bis zu einer Endkonzentration von etwa 0,07% (G/V)(Sigma, St. Louis, Missouri) zugegeben.
  • Das verwendete Adjuvans war Nr. 1-Adjuvans. 1000 ml Nr. 1-Adjuvans wurden aus 200 ml sterilfiltrierter Lecithin-Öl-Lösung (10% Lecithin in DRAKEOLTM Mineralöl), autoklaviertem Tween 80 (56 ml) und Span 80 (24 ml) und Phosphat-gepufferter Salzlösung (Dulbecco-PBS)(720 ml) hergestellt. Die Lecithin-Öl-Lösung und Span 80 wurden kombiniert und in einem sterilen Gefäß für mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur gemischt, bis die Emulgierung vollständig war. Die Salzlösung und Tween 80 wurden kombiniert und in einem sterilen Gefäß für mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur gemischt. Das Ölgemisch wurde mit dem wässrigen Gemisch unter Verwendung eines Ross-Emulgators bzw. einer Ross-Emulgiervorrichtung emulgiert. Die Emulgierung wurde mittels Rückführung fortgesetzt, bis das gesamte Adjuvans in die Salzlösung zugegeben war. Die Emulsion wurde dann zweimal durch eine Gaulin-Presse bei Raumtemperatur hindurchgeleitet. Das Adjuvans wurde bei 2 bis 8°C gelagert.
  • 5 l der Vakzine wurden hergestellt, indem 11 Adjuvans zu 31 wässriger Phase zugegeben wurde. Die wässrige Phase bestand aus ausreichend stabilisiertem Konzentrat, um einen Antigen-Endgehalt von 3,2 Trübungseinheiten pro 2 ml Vakzindosis zu ergeben, plus ausreichend Salzlösung, um das Volumen auf 5 1 aufzufüllen. Trübungseinheiten sind definiert als die optische Dichte (E625) bei der Ernte, multipliziert mit dem Konzentrationsfaktor.
  • Beispiel 3. E. rhusiopathiae-Vakzinierung und Provokation der Schweine
  • Die achte Subkultur (MS + 8) von E. rhusiopathiae, Stamm CN3342, wurde verwendet, um die Vakzinen herzustellen. Ein Dosislevel von stabilisiertem, geklärtem E. rhusiopathiae-Antigen (3,2 Trübungseinheiten („opacity units” [„OU"]) wurde verwendet, wie aus der optischen Dichte (OD) der Kultur bei der Inaktivierung berechnet. Eine OU war äquivalent zu 1 ml Flüssigkeit mit einer OD (bestimmt bei 625 nm) von eins. Nr. 1-Adjuvans oder Saponin (0,05% G/V, erhalten von Berghausen Chemical Company, Cincinnati, Ohio), wurde als Adjuvans verwendet. Speziell wurde eine Kultur von E. rhusiopathiae, Stamm CN3342, bis zu einer OD von 5,28 wachsen gelassen. Die Kultur wurde 24 Stunden lang mit 0,5% Formalin inaktiviert. Nach der Inaktivierung wurden die Bakterien mittels Zentrifugation entfernt. Die flüssige Fraktion wurde dann unter Verwendung einer Ultrafiltrationseinheit mit einem nominellen Molekulargewichtsauschluss von 10000 Kilodalton konzentriert. Die flüssige Fraktion wurde etwa 13,4fach konzentriert. Das Antigen wurde durch Zugeben von REHYDRAGELTM (30% V/V) zu dem konzentrierten Material stabilisiert. Das adsorbierte Konzentrat wurde bei 4°C bis zur Vakzinformulierung gelagert. Die Vakzinen wurden mit Nr. 1-Adjuvans oder 0,05% Saponin als Adjuvans formuliert. Das stabilisierte Antigen wurde in Salzlösung (150 mM Natriumchlorid und 4 mM Phosphat) bis zum Erreichen der Endkonzentration verdünnt. Ethylendiaminotetraacetat (EDTA, 0,07%) und Thimerosal (0,01%) wurden in den letztendlichen Vakzinformulierungen zugegeben. Phosphat-gepufferte Salzlösung wurde als Placebo verwendet. Tabelle 1 fasst die Behandlungsgruppen, Vakzinbehandlungen und Anzahlen von Ferkeln, die vakziniert und provoziert wurden, zusammen. Tabelle 1. Vakzinierte und provokzierte Ferkel nach Behandlungs-(Vakzine)-Gruppe
    Behandlungsgruppe Antigen Adjuvans Anzahl der vakzinierten Ferkel Anzahl der provozierten Ferkel
    T01 Placebo keines 16 10
    T02 3,2 OU Nr. 1-Adjuvans 26 20
    16 3,2 OU Saponin T03 10
  • Eine zufriedenstellende Provokation wurde bei den Kontrollen durch eine hohe Körpertemperatur (40,9°C [105,6°F] oder höher an mindestens zwei aufeinanderfolgenden Tagen), durch Kultur bei der Nekropsie und/oder durch klinische Zeichen, die für eine Infektion mit E. rhusiopathiae charakteristisch sind, nachgewiesen. Klinische Zeichen, die als charakteristisch für diese Erkrankung angesehen wurden, schlossen plötzlichen Tod, Depression, Hyperämie des Abdomens und der Ohren, metastatische Hautläsionen und Steifheit oder Gelenkinvolvierung ein. Schweine, die klinische Zeichen aufwiesen, die aber das Temperaturkriterium nicht erfüllten, wurden getötet, und Blut, Milz und Leber wurden in Versuchen, E. rhusiopathiae zu isolieren, in Kultur genommen.
  • Der exakte Test nach Fisher wurde verwendet, um zu bestimmen, ob es einen Unterschied (P < 0,05) in dem Prozentsatz der Tiere, die mit verschiedenen Vakzinen geschützt wurden, gab. A priori-Unterschiede wurden konstruiert, um jede Dosisgruppe mit Kontrollen zu vergleichen, und um jede Gruppe mit Durchschnitt aller anderen Dosisgruppen zu vergleichen. Die Beziehungen zwischen dem gegebenen Vakzintyp und den serologischen Reaktionen in jeder Gruppe von Ferkeln wurden unter Verwendung logistischer Regression für Blutabnahmen („bleedings") im Alter von 2 Monaten, im Alter von 3 Monaten, im Alter von 4 Monaten, im Alter von 5 Monaten und vor der Provokation erstellt. Die Beziehung zwischen Vakzineinduzierten Titern zum Zeitpunkt der Provokation und dem Erkrankungszustand (geschützt/nicht-geschützt) wurde unter Verwendung logistischer Regression beurteilt. Das 5%-Signifikanzniveau wurde verwendet, um die Beziehung als real zu erklären.
  • Zwanzig trächtige Säue/Jungsäue mit niedrigen serologischen Titern gemäß ELISA (#800) gegenüber E. rhusiopathiae wurden von Riddell Farms, Albert City, IA, erhalten und in Isolationsräumen an der University of Nebraska, Department of Veterinary and Biological Sciences, gehalten.
  • Die serologischen Titer gemäß ELISA wurden in einem ELISA mit direkter Antigenbindung mit ganzen Zellen wie folgt bestimmt. Siehe U.S. Patent Nr. 4,918,163 , welches die Herstellung von Antigen-beschichteten Platten und einen ELISA unter Verwendung derartiger Platten beschreibt. Zuerst wurden E. rhusiopathiae, wie in Beispiel 1 beschrieben, wachsen gelassen und aus einer Kultur in der log-Phase geerntet. Die optische Dichte bei 640 nm wurde aufgezeichnet und in Zellen/ml unter Verwendung einer Tabelle, etabliert durch Zählungen von Bakterien aus Lösungen mit verschiedenen optischen Dichten, umgewandelt. Die lebenden Bakterien wurden in PBS (Dulbecco-PBS, Sigma, St. Louis, Missouri) bis zu einer Dichte von etwa 1,1 × 109 Zellen/ml verdünnt. Die in PBS verdünnten lebenden Bakterien wurden an Platten für den ELISA gebunden. Um die Platten herzustellen, wurden 100 μl 0,1%iges (V/V) Glutaraldehyd (Sigma, St. Louis, Missouri) in PBS in jedes Well zugegeben, die Wells wurden abgedeckt und die Platten wurden bei 37°C 1 Stunde lang inkubiert. Der Glutaraldehyd in PBS wurde aus jedem Well entfernt und die Wells wurden mit absorbierenden Tüchern getrocknet. 100 μl der lebenden Bakterien in PBS mit einer Dichte von 1,1 × 109 Zellen/ml wurden zu jedem Well zugegeben. Die Platten wurden bei 2000 UpM 5 Minuten lang bei 22°C zentrifugiert. Anschließend wurden 200 μl 1% Polyvinylalkohol (Aldrich, Milwaukee, Wisconsin) in PBS (PVA/PBS) zu jedem Well zugegeben, die Wells wurden abgedeckt und die Platten wurden über Nacht bei 4°C gehalten. Die Inhalte der Wells der Platten wurden in eine bakterizide Lösung überführt und die Wells wurden mit PBS gewaschen. Die Wells wurden mit Gaze abgedeckt und bei Raumtemperatur (etwa 1 Stunde) getrocknet.
  • Die ELISA-Vorgehensweise wurde wie folgt unter Verwendung der Platten mit gebundenem bakteriellem Ganzzellantigen durchgeführt. Zuerst wurden die Schweine-Seren verdünnt, einschließlich einer Positivkontrolle, und zwar in 1% PVA/PBS. Alle unbekannten Seren wur den 1:50 verdünnt und die verwendete Positivkontrolle 1:200. 200 μl jeder Probe wurden zu einem Well in einer Reihe A-Spalte zugegeben. 100 μl von 1% PVA/PBS wurden in die verbleibenden Wells zugegeben. 2fache serielle Verdünnungen („two-fold serial dilutions") jeder Probe wurden in den Reihen B-H abgearbeitet („run"). Die Wells wurden abgedeckt und 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Wells 3 mal mit PEST gewaschen. 100 μl einer 1:2000-Verdünnung von Ziege-Anti-Schwein-IgG (H & L)-Peroxidase-Konjugat (Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, Maryland), hergestellt in 1% PVA/PBS, wurden zu jedem Well zugegeben. Die Wells wurden erneut abgedeckt und 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Wells wurden 3 mal mit PEST gewaschen. 100 μl ABTS-Substrat (2,2'-Azinodi-(3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure), erhalten von Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, Maryland) wurden zu jedem Well zugegeben und die Platten wurden bei Raumtemperatur 10 Minuten inkubiert. Die Platten wurden 10 Sekunden lang auf einem Mikrotiterplattenschüttler vor dem Ablesen der Absorption jedes Wells bei 405–490 nm unter Verwendung eines Plattenlesegerät-Blindwertes („plate reader blanked") geschüttelt. Der Endpunkttiter jedes unbekannten Serums war die Verdünnung des Serums, bei welcher die Absorption größer als die Absorption einer 1:3200-Verdünnung der Positivkontrolle war.
  • Den Sauen wurde 0 bis 10 Tage vor dem Abferkeln Blut abgenommen („were bled"), um ihre E. rhusiopathiae-Antikörpertiter zu bestimmen. Die Ferkel wurden auf Basis der serologischen Titer der Sauen und den Abferkeldaten randomisiert. Achtundfünfzig (58) Ferkeln, die von diesen Sauen/Jungsauen abstammten, wurde Blut abgenommen und sie wurden im Alter von etwa 3 Wochen mit einer der zwei experimentellen E. rhusiopathiae-Vakzinen oder dem Placebo (Gruppen aufgelistet in Tabelle 1) vakziniert. Im Alter von etwa 4 Wochen wurden die Ferkel entwöhnt. Im Alter von etwa 6 Wochen wurde den Ferkeln Blut abgenommen und sie wurden erneut mit der gleichen Vakzine vakziniert. Im Alter von etwa 2 Monaten, 3 Monaten, 4 Monaten und 5 Monaten wurde allen Schweinen Blut abgenommen. Im Alter von etwa 5 1/2 Monaten wurden alle Reserverschweine aus der Studie entfernt. Im Alter von etwa 6 Monaten (20 Wochen nach der zweiten Vakzinierung) wurde den Schweinen Blut abgenommen und 40 Schweine wurden intramuskulär mit 2 ml einer virulenten Kultur von E. rhusiopathiae (237 Maus-LD50, 1,74 × 109 koloniebildende Einheiten/ml), wachsen gelassen aus einer Kultur, die von dem National Veterinary Services Laboratory bereitgestellt wurde, provoziert. Die Tiere wurden hinsichtlich der Zeichen einer klinischen Erkrankung und über die rektale Temperatur für 2 Tage vor der Provokation, am Tag der Provokation und die 7 Tage nach der Provokation überwacht. Jedes Kontrolltier, das das Kriterium bezüglich der erhöhten rektalen Temperatur (40,9°C) erfüllte, wurde aus der Studie genommen und mit injizierbarem Penicillin behandelt. Jedes Kontrolltier, das klinische Zeichen einer Erkrankung aufwies, aber das Kriterium der erhöhten rektalen Temperatur nicht erfüllte, wurde in humaner Weise getötet, nekropsiert und Vollblut-, Milz- und Leberproben wurden bezüglich E. rhusiopathiae in Kultur genommen. Jedes Kontrolltier, das starb, wurde nekropsiert und Milz- und Leberproben wurden bezüglich E. rhusiopathiae in Kultur genommen. Jedes vakzinierte Tier, das das Kriterium der erhöhten rektalen Temperatur (40,9°C) und/oder der klinischen Zeichen einer Erkrankung erfüllte, wurde aus der Studie genommen und mit injizierbarem Penicillin behandelt. Jedes vakzinierte Tier, das nach der Provokation starb, wurde nekropsiert und Milz- und Leberproben wurden bezüglich E. rhusiopathiae in Kultur genommen. Antikörpertiter gegen E. rhusiopathiae wurden mittels des oben beschriebenen ELISA bestimmt und die Korrelation der Antikörpertiter mit dem klinischen Schutz wurde erstellt.
  • ELISA-Titer wurden an den Seren aus der einzelnen Blutprobe, die von den Sauen erhalten worden war, und allen Blutproben der 7 Probenzeiträume von den Ferkeln bestimmt. Aerobe Bakterienkulturen (48 Stunden, 37°C, Blutagar) wurden bei den Proben von Blut und/oder Milz und Leber, die von Schweinen erhalten worden waren, die gestorben waren oder mittels letaler Injektion getötet worden waren, durchgeführt.
  • Ergebnisse:
  • Die Ergebnisse der E. rhusiopathiae-Provokation der Kontrollschweine sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Alle 10 Schweine waren positiv auf Erysipel. Tabelle 2: Kontrollschweine (T01), provoziert mit E. rhusiopathiae
    Schwein Nummer Rektale Temperatur (40,9°C) Klinische Zeichen** Behandelt (T), gestorben (D) oder auf humane Weise getötet (K) Ergebnisse der E. rhusiopathiae-Isolierung
    2 Tage* nur 1 Tag
    3017 ja ja K negativ
    3022 ja D positiv
    3031 ja ja T keine Proben
    3046 ja K negativ
    3063 ja ja K positiv
    3073 ja ja T keine Proben
    3085 ja - T keine Proben
    3090 ja ja K positiv
    3103 ja ja K positiv
    3110 ja D positiv
    • * 2 Tage – Erhöhung bei der rektalen Temperatur über 40,9°C an 2 aufeinanderfolgenden Tagen
    • ** Klinische Zeichen – Klinische Zeichen schlossen Depression und/oder metastatische Hautläsionen ein.
  • Die Ergebnisse der E. rhusiopathiae-Provokation von Schweinen, denen die Vakzine mit Nr. 1-Adjuvans gegeben wurde (T02), sind in Tabelle 3 zusammengefasst. 15 der 20 Schweine (75%) waren vollständig geschützt. Tabelle 3: Ergebnisse der E. rhusiopathiae-Provokation von Schweinen, denen Vakzine mit Nr. 1-Adjuvans gegben wurde (T02)
    Schwein Nummer Rektale Temperatur (40,3°C) Klinische Zeichen** Behandelt (T), gestorben (D) oder auf humane Weise getötet (K) Ergebnisse der E. rhusiopathiae-Isolierung
    2 Tage* nur 1 Tag
    3006 - ja - - keine Proben
    3010 ja - ja T keine Proben
    3011 - ja ja T keine Proben
    3025 - - - - keine Proben
    3029 - ja - - keine Proben
    3030 - - - - keine Proben
    3033 - - - - keine Proben
    3038 - - - - keine Proben
    3047 - - - - keine Proben
    3052 - - - - keine Proben
    3059 - - - - keine Proben
    3071 - - - - keine Proben
    3088 - - - - keine Proben
    3093 - - - - keine Proben
    3098 ja - ja T keine Proben
    3100 - - - - keine Proben
    3112 - - - - keine Proben
    3114 ja - ja T keine Proben
    3115 - ja - - keine Proben
    3140 - ja ja D positiv
    • * 2 Tage – Erhöhung bei der rektalen Temperatur über 40,3°C an 2 aufeinanderfolgenden Tagen
    • ** Klinische Zeichen – Klinische Zeichen schlossen Depression und/oder metastatische Hautläsionen ein.
  • Die Ergebnisse der E. rhusiopathiae-Provokation von Schweinen, denen die Vakzine mit Saponin-Adjuvans gegeben wurde (T03), sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Nur ein Schwein war geschützt. Tabelle 4: Ergebnisse der E. rhusiopathiae-Provokation von Schweinen, denen die Vakzine mit Saponin-Adjuvans gegeben wurde (T03)
    Schwein Nummer Rektale Temperatur (40,3°C) Klinische Zeichen** Behandelt (T), gestorben (D) oder auf humane Weise getötet (K) Ergebnisse der E. rhusiopathiae-Isolierung
    2 Tage* nur 1 Tag
    3014 ja - ja T keine Proben
    3024 - ja ja T keine Proben
    3034 ja - ja T keine Proben
    3041 ja - ja T keine Proben
    3048 ja - ja T keine Proben
    3062 - ja ja T keine Proben
    3075 - ja - - keine Proben
    3095 ja - ja T keine Proben
    3102 - ja ja T keine Proben
    3106 - ja ja T keine Proben
    • * 2 Tage – Erhöhung bei der rektalen Temperatur über 40,3°C an 2 aufeinanderfolgenden Tagen
    • ** Klinische Zeichen – Klinische Zeichen schlossen Depression und/oder metastatische Hautläsionen ein.
  • Die geometrischen Mittel der ELISA-Titer („geometric mean ELISA titers")(„GMT"s) der Ferkelgruppen sind in Tabelle 5 aufgelistet. Tabelle 5: Geometrische Mittel der ELISA-Titer aller Behandlungsgruppen
    Behandlungsgruppe* Zeit (nährungsweise) des Serumerhalts
    Vor der Vakzinierung 1 Vor der Vakzinierung 2 2 Monate 3 Monate 4 Monate 5 Monate Vor der Provokation
    01 33,5 35,9 108,8 153,9 88,4 329,8 233,2
    02 40,0 259,6 8903,9 1871,8 519,2 596,4 556,5
    03 28,7 162,3 1712,9 527,2 199,8 302,8 459,0
    • * 01-Placebo 03–3,2 Trübungseinheiten von Antigen in Nr. 1-Adjuvans 03–3,2 Trübungseinheiten von Antigen in Saponin-Adjuvans
  • Die Ferkel wiesen zum Zeitpunkt der ersten Vakzinierung sehr geringe für E. rhusiopathiae spezifische Antikörpertiter auf. Diese Titer reichten von weniger als 50 bis 200. Bei den Kontrollferkeln erhöhten sich die GMT leicht während des Verlaufs der Studie, was darauf hindeutete, dass der ELISA bei älteren Schweinen weniger spezifisch war.
  • Die Vakzinen mit entweder Nr. 1-Adjuvans oder Saponin als Adjuvans induzierten eine statistisch signifikante (P = 0,0001) serologische Reaktion, die zwei Wochen nach der zweiten Vakzinierung (im Alter von etwa 2 Monaten) den Höhepunkt erreichte. Die Titer nahmen bei beiden Gruppen über die Zeit (bis etwa zum Alter von 5 Monaten) ab, wobei die GMT der Ferkel, die Antigen in Nr. 1-Adjuvans erhielten, zu allen Zeitpunkten merklich höher waren als die GMT von Ferkeln, die Antigen in Saponin-Adjuvans erhielten. Zum Zeitpunkt der Provokation waren die GMT von Schweinen, die Antigen in Nr. 1-Adjuvans erhielten, um etwas mehr als das 2fache höher als die GMT der Kontrollen, während die GMT von Schweinen, die Antigen in Saponin-Adjuvans erhielten, um etwas weniger als das 2fache höher waren als bei den Kontrollen. Der Schutz vor der klinischen Erkrankung nach der Provokation korrelierte nicht mit dem individuellen ELISA-Titer (P > 0,05). Eine interessante Beobachtung war jedoch ein Spitzentiter, der zwei Wochen nach der zweiten Vakzinierung bei Schweinen beobachtet wurde, denen Antigen in Nr. 1-Adjuvans gegeben wurde. Von den 20 Ferkeln, die mit Antigen in Nr. 1-Adjuvans vakziniert worden waren, hatten acht Spitzentiter von größer als oder gleich 2800 (8/8 geschützt vor der Provokation), acht hatten Spitzentiter von 6400 (6/8 geschützt vor der Provokation) und 4 hatten Spitzentiter von 3200 (1/4 geschützt vor der Provokation), was nahe legt, dass ein Titer, der 6400 oder größer betrug, ein Indikator eines anhaltenden Schutzes war.
  • Zusammenfassend gesagt, wurden alle 10 nicht-vakzinierten Kontrollen infiziert. Bei der Gruppe von Schweinen, welcher die Vakzine mit Nr. 1-Adjuvans gegeben wurde, waren 15 von 20 geschützt. Bei der Gruppe von Schweinen, welcher die Vakzine mit Saponin als Adjuvans gegeben wurde, war nur eines von 10 geschützt.
  • Beispiel 4. Antigenstabilisierung mit Al-Gel
  • Eine Vakzine wurde gemäß den Beispielen 1–3 hergestellt, einschließlich des Behandelns des Antigens mit Al-Gel, wie beschrieben. Die Vakzine wurde auf ihre Wirksamkeit bei Schweinen getestet. Schweine wurden mit 2 ml-Dosen, die intramuskulär (IM) gegeben wurden, vakziniert und zwar mit einer Dosis bei etwa 3 Wochen (Entwöhnung) und der zweiten Dosis 3 Wochen später. Die Kontrollen erhielten Phosphat-gepufferte Salzlösung als Placebo. Die Immunität wurde mittels der IM-Injektion von virulentem E. rhusiopathiae im Alter von etwa 9 Wochen getestet („challenged"). Wie in Tabelle 6 gezeigt, war der Schutz aufgrund der Vakzinierung bei 9 Wochen 100%. Diese Vakzine war zu dem Zeitpunkt, an dem die Schweine vakziniert wurden, bereits 12 Monate alt. Das Ergebnis bestätigt, dass das schützende Antigen erfolgreich stabilisiert wurde. Tabelle 6: Schutz der Schweine gegen Erysipel
    Alter bei Provokation Kontrollen (Geschützt/Provoziert) Impflinge (Geschützt/Provoziert)
    9 Wochen 0/10 19/19
  • Anmerkung:
  • Das 20. Schwein wurde ausgeschlossen. Ein sehr widerspenstiges Tier, es wehrte sich so heftig bei Behandlung, dass seine Ruhetemperatur nicht bestimmt werden konnte. Nach der Provokation blieb dieses Schwein vollständig gesund.

Claims (7)

  1. Antigenzusammensetzung, umfassend i) eine flüssige Fraktion aus einer E. rhusiopathiae-Kultur, welche mit Formalin oder mit beta-Propiolacton inaktiviert ist; und ii) ein Stabilisierungsmittel, wobei das Stabilisierungsmittel ein Metallhydroxid, ein Metallphosphat, ein Aluminiumhydroxidgel, ein Aluminiumphosphatgel, ein Calciumphosphatgel, ein Zinkhydroxid/Calciumhydroxid-Gel oder ein Alaun ist, wobei die Antigenzusammensetzung frei von E. rhusiopathiae ist.
  2. Antigenzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die flüssige Fraktion 3-fach bis 30-fach konzentriert ist.
  3. Vakzinzusammensetzung, umfassend die Antigenzusammensetzung nach Anspruch 1 und eine Adjuvans-Zusammensetzung.
  4. Vakzinzusammensetzung gemäß Anspruch 3, wobei die Adjuvans-Zusammensetzung von 0,25% bis 12,5% V/V eines Lecithins, von 1% bis 23% V/V Öl und von 1,5% bis 8% V/V eines amphiphilen oberflächenaktiven Mittels in der Vakzinzusammensetzung umfasst.
  5. Verfahren zum Herstellen einer Antigenzusammensetzung, umfassend das Zugeben eines Stabilisierungsmittels zu einer flüssigen Fraktion aus einer E. rhusiopathiae-Kultur, wobei die E. rhusiopathiae-Kultur inaktiviert wird und die Bakterien aus der Nährbouillon oder dem Medium entfernt werden und die flüssige Fraktion zurückgehalten wird und die Bakterien verworfen werden.
  6. Verwendung der Antigenzusammensetzung nach Anspruch 1 zur Herstellung einer Vakzine zum Schutz eines Tieres gegen Erysipel.
  7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei das Tier ein Schwein ist.
DE69938168T 1999-01-29 1999-11-18 Erysipelothrix rhusiopathiae Antigene und Impfstoff-Zusammensetzungen Expired - Lifetime DE69938168T2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11770499P 1999-01-29 1999-01-29
US117704P 1999-01-29

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69938168D1 DE69938168D1 (de) 2008-04-03
DE69938168T2 true DE69938168T2 (de) 2009-02-26

Family

ID=22374369

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69938168T Expired - Lifetime DE69938168T2 (de) 1999-01-29 1999-11-18 Erysipelothrix rhusiopathiae Antigene und Impfstoff-Zusammensetzungen

Country Status (17)

Country Link
EP (1) EP1027895B1 (de)
JP (3) JP3535436B2 (de)
CN (1) CN1210062C (de)
AR (1) AR020022A1 (de)
AT (1) ATE386540T1 (de)
AU (1) AU776847B2 (de)
BR (1) BR9905853B1 (de)
CA (1) CA2290078C (de)
CY (1) CY1107910T1 (de)
DE (1) DE69938168T2 (de)
DK (1) DK1027895T3 (de)
ES (1) ES2301230T3 (de)
HK (1) HK1029062A1 (de)
NZ (1) NZ501128A (de)
PT (1) PT1027895E (de)
TW (1) TW546146B (de)
ZA (1) ZA997138B (de)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8637047B2 (en) * 2003-10-30 2014-01-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Erysipelothrix rhusiopathiae-haemophilus parasuis vaccine and methods of using the same
CN107496913A (zh) * 2017-09-15 2017-12-22 天津瑞普生物技术股份有限公司 猪丹毒、猪细小病毒、猪流感病毒三联灭活疫苗制备方法
CN107648599A (zh) * 2017-09-18 2018-02-02 天津瑞普生物技术股份有限公司 一种猪丹毒、猪细小病毒二联灭活疫苗的制备方法
CN110812473A (zh) * 2019-12-10 2020-02-21 广东君睿生物技术研究有限公司 一种副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪多杀性巴氏杆菌病三联灭活疫苗及其制备方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0294071A3 (de) * 1987-06-03 1990-08-01 Merck & Co. Inc. Impfstoffe gegen Hepatitis B hergestellt mit vorherhergestellten Aluminiumhydroxydengelen und Verfahren zu deren Herstellung
US5695769A (en) * 1990-06-13 1997-12-09 Pfizer Inc. Pasteurella multocida toxoid vaccines
ES2194841T3 (es) * 1991-11-15 2003-12-01 Pfizer Procedimiento de produccion de vacunas bacterianas gram negativas.
US5690942A (en) * 1995-06-02 1997-11-25 American Home Products Corporation Adjuvants for viral vaccines
JP3072345B1 (ja) * 1999-03-31 2000-07-31 農林水産省家畜衛生試験場長 豚丹毒菌の組換えサブユニットワクチン

Also Published As

Publication number Publication date
BR9905853A (pt) 2000-11-14
ATE386540T1 (de) 2008-03-15
CA2290078A1 (en) 2000-07-29
AR020022A1 (es) 2002-03-27
CY1107910T1 (el) 2013-09-04
DE69938168D1 (de) 2008-04-03
JP2000219637A (ja) 2000-08-08
JP4714167B2 (ja) 2011-06-29
JP2003160507A (ja) 2003-06-03
AU776847B2 (en) 2004-09-23
ES2301230T3 (es) 2008-06-16
BR9905853B1 (pt) 2011-11-01
AU5944599A (en) 2000-08-03
PT1027895E (pt) 2008-03-18
ZA997138B (en) 2001-05-16
TW546146B (en) 2003-08-11
JP3535436B2 (ja) 2004-06-07
NZ501128A (en) 2001-12-21
JP2007119499A (ja) 2007-05-17
DK1027895T3 (da) 2008-06-09
CN1262129A (zh) 2000-08-09
EP1027895A2 (de) 2000-08-16
EP1027895A3 (de) 2001-07-18
CN1210062C (zh) 2005-07-13
EP1027895B1 (de) 2008-02-20
CA2290078C (en) 2013-01-22
HK1029062A1 (en) 2001-03-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60117164T2 (de) Impfstoffe mit erhöhter immunantwort und verfahren zur deren herstellung
JP5167469B2 (ja) ワクチンにおいて使用するためのアジュバント
DE68928432T2 (de) Legionellosis-impfstoffe und verfahren zur herstellung
US10772954B2 (en) Dual adjuvant vaccine compositions, preparation and uses
DE3604109A1 (de) Impfstoff-system
DE69232969T2 (de) Methode zur herstellung von gram-negativen bakteriellen vakzinen
DE69910253T2 (de) Verfahren zur herstellung von inaktivierten, w/ö emulsion adjuvierten, impfstoffen
DE69021761T3 (de) Impfstoff gegen Tinea.
JPH02149530A (ja) 水酸化亜鉛または水酸化鉄をアジュバントとして含有する抗原溶液
DE69938168T2 (de) Erysipelothrix rhusiopathiae Antigene und Impfstoff-Zusammensetzungen
DE69131525T2 (de) Pasteurella multocida toxoid enthaltende impfstoffe
DE69636001T2 (de) Multikomponentimpfstoff aus niedrigdosierten Clostridien und Nicht-Clostridien-Organismen
KR100195571B1 (ko) 수산화아연/수산화칼슘 겔, 레시틴 및 폴리알파올레핀으로 처리된 항원용액 및 이의 제조방법
DE60213785T2 (de) Saponin inaktivierte mykoplasma impfstoffe
US7172762B1 (en) Erysipelothrix rhusiopathiae antigens and vaccine compositions
DE191752C (de)
DE2141901C3 (de) Steriler Impfstoff, der abgetötete Organismen des genus Fusiformis nodosus enthält
MXPA00000173A (en) Erysipelothrix rhusiopathiae antigens and vaccine compositions
IE48464B1 (en) A method for the prevention or reduction of fly strike in sheep
DE1148703B (de) Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes gegen Brucellose
DE3026044A1 (de) Parenteraler impfstoff fuer rinder gegen infektioese rinderrhinotracheitis
US20030124148A1 (en) Method for producing autogenous vaccines for treating chlamydial infections in mammals and humans
DE2121237B2 (de) Verwendung einer Zellinie zur Züchtung von Viren
MXPA00001152A (en) Adjuvants for use in vaccines

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition