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Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft Antigenzusammensetzungen und Vakzinformulierungen,
um eine Erysipelothrix rhusiopathiae-Infektion (Erysipel) zu verhindern
oder zu kontrollieren bzw. zu bekämpfen, und Verfahren zum Herstellen
und Verwenden jener Antigenzusammensetzungen und Vakzinformulierungen.
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Hintergrund der Erfindung
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Erysipel
hat eine weltweite Verbreitung und ist von ökonomischer Wichtigkeit überall in
Europa, Asien, Australien und Nord- und Südamerika. Schweine im Alter
von 3 Monaten bis zu 3 Jahren sind am anfälligsten für Erysipel. Betroffene Schweine
haben häufig
geschwollene und steife Gelenke und sie nehmen nicht effizient an
Gewicht zu. Auch werden ihre Schlachtkörper häufig durch Inspektoren in Abpackungsbetrieben
beschnitten oder verworfen.
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Etwa
vor 10 Jahren wurde gezeigt, dass die konventionelle Praxis des
Herstellens von E. rhusiopathiae-Vakzinen aus abgetöteten Gesamtkulturen
unnötig
war. Ein Bakterium-freies Filtrat funktionierte ebenso gut beim
Schützen
von sowohl Schweinen als auch Mäusen
gegen eine Virusprovokation („virulent
challenge"). Nachfolgend
veröffentlichte
Forschungen von japanischen und U.S.-Wissenschaftlern bestätigten diesen
Befund und zeigten, dass E. rhusiopathiae in das Kulturmedium ein
Antigen freisetzt, das dahingehend ein Universalimmunogen ist, dass
es Schweine gegen alle E. rhusiopathiae-Stämme immunisiert (Sawada und
Takahashi, 1987, Am. J. Vet. Res. 48: 239–242; Groschup et al., 1991,
Epidemiol. Infect. 107: 637–649).
Groschup et al. zeigten, dass ein 64 bis 66 kDa-Protein in der Kultur
Mäuse gegen
eine Provokation mit virulentem E. rhusiopathiae schützte. Nachdem
gezeigt wurde, dass ein derartiges Protein auch Schweine schützt, stellt
die USDA einen monoklonalen Antikörper (mAb) gegen dieses Protein
zur Verwendung beim Untersuchen dieses Proteins für Vakzinhersteller
bereit.
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Sato
et al., (1995), Veterinary Microbiology, 43, 173–182, offenbaren die Herstellung
einer antigenen Zusammensetzung, umfassend eine flüssige Fraktion
des Kulturfiltrats von Erysipelothrix rhusiopathiae.
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Timoney
et al., (1993), Veterinary Microbiology, 37, 381–387, erwähnen eine Vakzinzusammensetzung
zum Schutz von Schweinen, umfassend die flüssige Fraktion des Kulturmediums
von E. rhusiopathiae, adsorbiert an Alaun, und mit Formaldehyd behandelte
(„formalized") Bakterien.
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Obwohl
eine wirksame Vakzine zum Verhindern von Erysipel bei Schweinen
sehr wünschenswert
ist, stellt keine der vielen herkömmlichen Erysipel-Vakzinen
einen annehmbaren Schutz für
abgesetzte bzw. entwöhnte
Schweine bereit. Das Problem ist das Fehlen der Dauer von Immunität. Die Schweineindustrie
benötigt eine
Vakzine, die, gegeben beim Absetzen, die Schweine gegen diese tödliche,
verheerende Krankheit bis zum Schlachtalter, d. h. etwa 6 Mona te,
schützen
wird. Die USDA spezifizierte diese Anforderung als einen Standard
für die
Zulassung neuer Vakzinen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Es
wird daher eine Antigenzusammensetzung bereitgestellt, umfassend
eine flüssige
Fraktion aus einer E. rhusiopathiae-Kultur und ein Stabilisierungsmittel,
wobei die E. rhusiopathiae-Kultur mit Formalin oder mit beta-Propiolacton
und einem Stabilisierungsmittel inaktiviert ist, wobei das Stabilisierungsmittel
ein Metallhydroxid, ein Metallphosphat, ein Aluminiumhydroxidgel,
ein Aluminiumphosphatgel, ein Calciumphosphatgel, ein Zinkhydroxid/Calciumhydroxid-Gel
oder ein Alaun ist, wobei die Antigenzusammensetzung frei von E.
rhusiopathiae ist.
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Es
wird daher eine Vakzinzusammensetzung bereitgestellt, umfassend
eine Antigenzusammensetzung, umfassend eine flüssige Fraktion aus einer E.
rhusiopathiae-Kultur und ein Stabilisierungsmittel, wobei die E.
rhusiopathiae-Kultur inaktiviert ist, und eine Adjuvans-Zusammensetzung.
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Es
wird daher ein Verfahren zum Herstellen einer Antigenzusammensetzung,
umfassend das Zugeben eines Stabilisierungsmittels zu einer flüssigen Fraktion
aus einer E. rhusiopathiae-Kultur,
wobei die E. rkusiopathiae-Kultur inaktiviert ist, bereitgestellt.
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Es
wird daher die Verwendung einer Antigenzusammensetzung, umfassend
eine flüssige
Fraktion aus einer E. rhusiopathiae-Kultur und ein Stabilisierungsmittel,
wobei die E. rhusiopathiae-Kultur inaktiviert ist, zur Herstellung
einer Vakzine zum Schutze eines Tieres gegen Erysipel, wobei das
Tier vorzugsweise ein Säuger oder
ein Vogel und am stärksten
bevorzugt ein Schwein, ein Lamm, ein Hund, ein Pferd, eine Kuh oder
ein Mensch ist, bereitgestellt.
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Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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Jeder
beliebige Stamm von E. rhusiopathiae kann die Quelle der Antigene
für die
Erfindung sein, z. B. die in dem
U.S.
Patent Nr. 5,625,038 beschriebenen Stämme. Die Kultur, aus der die
Antigene isoliert werden können,
kann in einer Vielfalt von Weisen bereitgestellt werden. Zum Beispiel
kann die Kultur rein oder im Wesentlichen rein sein. Stärker bevorzugt
werden die erfindungsgemäßen Antigene
aus einem Überstand
oder Filtrat einer E. rhusiopathiae-Kultur erhalten. In einer am
stärksten
bevorzugten Ausführungsform
werden die erfindungsgemäßen Antigene
aus dem Überstand
oder Filtrat einer reinen oder im Wesentlichen reinen Flüssigkultur
von E. rhusiopathiae erhalten.
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E.
rhusiopathiae kann in einer Vielfalt von Weisen kultiviert werden,
wie im Fachgebiet bekannt ist. Siehe die
U.S. Patente mit den Nm. 5,625,038 ,
5,616,328 ,
5,417,971 ,
5,225,194 ,
4,981,685 , welche die Kultivierung
von Bakterien diskutieren. Zum Beispiel kann E. rhusiopathiae, wie
in den unten bereitgestellten veranschaulichenden Beispielen beschrieben,
kultiviert werden. E. rhusiopathiae kann auch, wie bei Sawada und Takahashi,
1987, Am. J. Vet. Res., 48: 239–242
und bei Groschup et al., 1991, Epidemiol. Infect., 107: 637–649, beschrieben,
kultiviert werden. Allgemeine Hintergrundinformation über das
Kultivieren und Verarbeiten von prokaryotischen Zellen wird bei
Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al.,
1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene publishing
Associates and Wiley Interscience, NY; Sambrook et al., 1989, Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY, bereitgestellt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird die Kultur durch Zugeben von Formalin (Endkonzentration etwa
0,5% V/V) inaktiviert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
werden die Antigene für
die Erfindung aus dem Überstand
oder Filtrat einer E. rhusiopathiae-Kultur erhalten. Ein Kulturüberstand
oder Filtrat wird in einer bevorzugten Ausführungsform 3-bis 10fach (vorzugsweise
etwa 10fach) konzentriert und Aluminiumhydroxidgel (vorzugsweise
REHYDRAGEL
TM) wird zu dem konzentrierten Überstand
oder Filtrat bis zu einer Endkonzentration von etwa 30% V/V zur
Stabilisierung des Antigens zugegeben. In einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform
wird eine Vakzinzusammensetzung formuliert, umfassend das Antigen
und ein Adjuvans, wobei das Adjuvans z. B. etwa 25% V/V der Vakzinzusammensetzung
umfasst. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird Thimerosal
(Endkonzentration etwa 0,01% V/V) mit EDTA (Endkonzentration etwa
0,07% V/V) zu den Antigenen als Konservierungsmittel zugegeben.
Ein bevorzugtes Adjuvans, hierin als „Nr.1-Adjuvans" bezeichnet, umfasst
etwa 2% V/V Lecithin, etwa 18% V/V Mineralöl und etwa 8% V/V oberflächenaktives
Mittel (z. B. etwa 5,6% V/V Tween 80 und etwa 2,4% V/V Span 80),
wobei das verbleibende Volumen eine Salzlösung (z. B. Dulbecco-PBS) ist.
Dieses Adjuvans wird in dem
U.S.
Patent Nr. 6,572,861 , eingereicht am 24. Januar 2000, mit
dem Titel „Adjuvants
for Use in Vaccines" beschrieben.
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Inaktivierung von E. rhusiopathiae
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Die
Antigene für
die Erfindung werden von E. rhusiopathiae erhalten, wobei dies auf
Weisen bereitgestellt werden kann, die im Fachgebiet bekannt sind,
z. B. in Ftüssigkultur.
In der Erfindung wird eine E. rhusiopathiae-Kultur, aus welcher
ein Antigen isoliert wird, vor der Verwendung des Antigens in einer
Vakzinformulierung inaktiviert. In einer bevorzugten Ausführungsform
wird die E. rhusiopathiae-Kultur vor dem Abtrennen der flüssigen Fraktion
von den Bakterien inaktiviert. Die Inaktivierung der E. rhusiopathiae-Kultur
wird für
eine Vielfalt von Zwecken, z. B. zum Abtöten der Bakterien oder zum
Inaktivieren von Proteasen oder zum Erhalten des Antigens, durchgeführt.
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Eine
Kultur, die Antigene für
die Erfindung enthält,
kann in einer Vielfalt von Weisen, die im Fachgebiet bekannt sind,
inaktiviert werden. Zum Beispiel kann die Kultur einem inaktivierenden
Agens ausgesetzt werden, d. h. einem Agens bzw. Mittel, das zum
Abtöten
von E. rhusiopathiae befähigt
ist. Ein inaktivierendes Agens, das in der Praxis der Erfindung
zweckmäßig ist,
ermöglicht
es dem erfindungsgemäßen Antigen,
eine Immunreaktion bei einem Tier auszulösen, um dieses Tier vor Erysipel
zu schützen.
Inaktivierende Agenzien, die im Fachgebiet bekannt sind, können verwendet
werden, z. B. Formalin (Formaldehyd), beta-Propiolacton oder andere
chemische Agenzien mit Eigenschaften, die denjenigen dieser Agenzien
bzw. Mittel ähnlich
sind. Geeignete chemische Agenzien zur Inaktivierung von Bakterien
können
durch einen Fachmann mit gewöhnlichem
Kenntnisstand auf dem Gebiet bestimmt werden, z. B. durch In-Kontakt-Bringen
der Bakterien mit einer speziellen Chemikalie und Bestimmen, ob
die Bakterien abgetötet
werden und die Antigene dabei bezüglich ihrer Fähigkeit,
einen schützenden
Antikörper
zu erzeugen, aktiv bleiben, z. B. durch Vakzinieren von Mäusen mit
den behandelten Bakterien. Siehe auch
U.S.
Patent Nr. 5,225,194 , welches die Inaktivierung von Bakterien diskutiert.
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Abtrennung und Konzentrierung der E. rhusiopathiae-Kulturflüssigkeit
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Antigene
für die
Erfindung werden aus der flüssigen
Fraktion einer E. rhusiopathiae-Kultur
erhalten. E. rhusiopathiae kann kultiviert werden und die Bakterien
können
aus der Kulturbrühe
z. B. durch Zentrifugieren oder Filtrieren einer Flüssigkultur
abgetrennt werden. Eine Kultur von E. rhusiopathiae, die für die Isolierung eines
Antigens für
die Erfindung zweckmäßig ist,
kann in einer beliebigen Weise, die im Fachgebiet bekannt ist, bereitgestellt
werden. Zum Beispiel kann E. rhusiopathiae in einer Bouillon oder
in einem Medium wachsen gelassen werden, so dass sich die Bakterien
rasch vervielfältigen,
d. h. log-Phase. In einer bevorzugten Ausführungsform befindet sich die
zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Antigens verwendete Kultur
zum Zeitpunkt, wenn die Verarbeitung der Kultur begonnen wird, in
der log-Phase, stärker
bevorzugt in der späten log-Phase.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird die E. rhusiopathiae-Kultur so verarbeitet, dass alle oder im
Wesentlichen alle Bakterien von der Bouillon oder dem Medium, in
der/dem sie wachsen gelassen wurden, abgetrennt werden. Zum Beispiel
können
etwa 90% der Bakterien aus der Bouillon oder dem Medium entfernt werden,
stärker
bevorzugt werden etwa 95% der Bakterien entfernt, stärker bevorzugt
werden mindestens etwa 98% der Bakterien entfernt. E. rhusiopathiae
kann aus der Kulturbrühe
oder dem Medium in jeder beliebigen Weise, die im Fachgebiet bekannt
ist, entfernt werden. Zum Beispiel kann die E. rhusiopathiae-Kultur zentrifugiert
werden, um die Bakterien aus der Bouillon oder dem Medium abzutrennen.
Jegliche im Fachgebiet bekannte Zentrifuge, die zum Sedimentieren
der E. rhusiopathiae-Bakterien befähigt ist, ist zum Abtrennen der
Zellen von der Bouillon oder dem Medium geeignet. Zum Beispiel kann
eine Zentrifuge mit kontinuierlichem Fluss bzw. eine Durchlaufzentrifuge
verwendet werden. Hintergrundinformationen darüber, wie Bakterien aus einem
Kulturmedium zu entfernen sind, werden bei Maniatis et al., 1982,
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., 1989 Current Protocols
in Molecular Biology, Greene publishing Associates and Wiley Interscience,
NY; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,
2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY, bereitgestellt.
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In
einem anderen Aspekt kann E. rhusiopathiae aus dem Kulturmedium
oder der -brühe
durch Filtration durch einen Filter, der die Bakterien zurückhält, aber
das erfindungsgemäße Antigen
nicht zurückhält, entfernt
werden. Es sind viele Filter, die zum Abtrennen der Bakterien von
dem Antigen in der Bouillon oder dem Medium geeignet sind, im Fachgebiet
bekannt. Zum Beispiel hat ein Filter, der zur Abtrennung der Bakterien aus
der flüssigen
Fraktion zweckmäßig ist,
einen mittleren Porendurchmesser von etwa 0,1 μm bis etwa 0,5 μm, stärker bevorzugt
etwa 0,2 μm.
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Die
aus einer Kultur von E. rhusiopathiae („flüssige Fraktion") erhaltene flüssige Fraktion,
wie oben beschrieben, kann konzentriert werden. In einer Ausführungsform
kann die flüssige
Fraktion 3fach bis 30fach, z. B. etwa 3fach oder etwa 6fach oder
etwa 10fach oder etwa 15fach oder etwa 20fach oder etwa 30fach konzentriert
werden. Die flüssige
Fraktion kann auf jede Weise, die im Fachgebiet bekannt ist, konzentriert
werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die flüssige Fraktion
unter Verwendung einer Hohlfaserfraktion konzentriert werden. In
einem Aspekt wird die Hohlfasernfiltration mit einem Molekulargewichtsausschluss von
etwa 5000 Kilodalton bis etwa 50000 Kilodalton, stärker bevorzugt
von etwa 10000 Kilodalton bis etwa 30000 Kilodalton, durchgeführt. Siehe
auch
U.S. Patent Nr. 5,225,194 ,
welches die Konzentrierung einer flüssigen Fraktion einer Bakterienkultur
diskutiert.
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Die
flüssige
Fraktion kann auch mittels Gefriertrocknen oder Lyophilisierung
konzentriert werden. In einem anderen Aspekt kann die flüssige Fraktion
durch Präzipitation
der Proteine und Polypeptide in der flüssigen Fraktion, gefolgt von
Resuspendieren des Präzipitats,
konzentriert werden. Proteine können
aus der flüssigen
Fraktion unter Verwendung jedes beliebigen Verfahrens, das im Fachgebiet
bekannt ist, präzipitiert
werden, z. B. durch Präzipitation
mittels Polyethylenglykol, Ethanol oder Ammoniumsulfat. Nach der
Präzipitation kann
das Sediment in jeder beliebigen Lösung, die zur Herstellung einer
Vakzinformulierung geeignet ist, z. B. einer Salzlösung, resuspendiert
werden.
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Stabilisierung von E. rhusiopathiae-Antigen
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Antigene,
die aus einer flüssigen
Fraktion einer E. rhusiopathiae-Kultur erhalten wurden, sind wirksame
Immunogene, um Erysipel bei einem Tier zu verhindern oder zu kontrollieren
bzw. zu bekämpfen.
Jedoch ist der Mangel an Stabilität dieser Antigene nach dem
Entfernen der Bakterien ein ernstes Problem, wenn diese Antigene
in einer Vakzinzusammensetzung verwendet werden. Die Erfindung löst dieses
Problem und basiert teilweise auf der Entdeckung, dass Antigene
in einer flüssigen
Fraktion einer E. rhusiopathiae-Kultur durch Zugeben eines Stabilisierungsmittels
stabilisiert werden können.
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Jedes
beliebiges Stabilisierungsmittel, das im Fachgebiet bekannt ist,
kann verwendet werden, um die Antigene für die Erfindung zu stabilisieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform
ist ein Stabilisierungsmittel zum Adsorbieren eines Antigens aus
einer flüssigen
Fraktion einer E. rhusiopathiae-Kultur befähigt. Ein geeignetes Stabilisierungsmittel
kann das antigene Potenzial einer flüssigen Fraktion einer E. rhusiopathiae-Kultur aufrechterhalten
oder anderweitig den Abbau ihres antigenen Potenzials nach dem Entfernen
der Bakterien verlangsamen. Eine derartige stabilisierende Wirkung
eines Mittels bzw. Agens kann experimentell bestimmt wer den. Zum
Beispiel kann man zwei Proben einer flüssigen Fraktion einer inaktivierten
E. rhusiopathiae-Kultur bei 37°C
für eine
Zeitdauer, z. B. von etwa 14 bis etwa 28 Tagen, inkubieren, eine
Probe mit und eine ohne ein chemisches Mittel, das hinsichtlich
seiner Verwendung als Stabilisierungsmittel getestet wird. Die Proben werden
dann in einer Vakzinierung von Mäusen
gemäß dem Standard-Maus-Potenz-Test
bzw. -Wirksamkeits-Test („standard
mouse potency test")(9
CFR 113.119(c)) unter Verwendung eines Adjuvans, zum Beispiel Nr.
1-Adjuvans, getestet. Ein höherer
Anteil geschützter
Tiere in der Gruppe, der die Vakzine verabreicht wurde, welche mit
dem chemischen Mittel behandelt worden war, als in der Gruppe, der
die unbehandelte Vakzine gegeben worden war, oder bei den nicht-vakzinierten
Kontrolltieren zeigt an, dass das Antigen in der chemisch behandelten
Vakzine stabilisiert wurde.
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Das
oben beschriebene Experiment veranschaulicht einen beschleunigten
Stabilitätstest
bei einer höheren
Temperatur (37°C),
als sie normalerweise für
die Lagerung verwendet wird. Normalerweise werden Antigenzubereitungen
bei kalten Temperaturen, z. B. von etwa 2°C bis etwa 8°C, gelagert. Eine Stabilität von 28 Tagen
bei 37°C
zeigt eine Stabilität
für eine
längere
Zeitdauer bei normaler kalter Lagerung, d. h. für eine Dauer von mehreren Jahren,
an. In einer Ausführungsform
wird das Antigen bei kalten Temperaturen für bis zu etwa 5 Jahre gemäß der vorliegenden
Erfindung, spezieller für
bis zu etwa 3 Jahre, bei kalten Temperaturen, stabilisiert. In einer
weiteren Ausführungsform
wird das Antigen für
mindestens ein Jahr bei kalten Temperaturen gemäß der vorliegenden Erfindung
stabilisiert.
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Eine
Vielfalt von Mitteln ist im Fachgebiet bekannt, die zum Adsorbieren
eines Antigens befähigt
sind, zum Beispiel ein Aluminiumhydroxidgel, ein Aluminiumphosphatgel,
ein Calciumphosphatgel, ein Zinkhydroxid/Calciumhydroxid-Gel und
ein Alaun (z. B. ein Kalialaun) sind als Stabilisierungsmittel zweckmäßig. In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird Aluminiumhydroxidgel, z. B. REHYDRAGEL
TM,
als ein Stabilisierungsmittel verwendet. (Siehe
U.S. Patente mit den Nrn. 5,616,328 und
5,232,690 , welche die Metallgele
und ihre Verwendungen diskutieren.)
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In
einer Ausführungsform
wird ein Metallhydroxidgel, z. B. ein Aluminiumhydroxidgel (z. B.
REHYDRAGELTM) bis zu einer Endkonzentration
von etwa 10% V/V bis zu etwa 40% V/V, zum Beispiel etwa 10% V/V oder
etwa 20% V/V oder etwa 30% V/V oder etwa 40% V/V, in der Antigenzubereitung
zugegeben. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Aluminiumhydroxidgel
(z. B. REHYDRAGELTM) bis zu einer Endkonzentration
von etwa 30% V/V in der Antigenzubereitung zugegeben.
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Eine
Antigenzubereitung, die das Stabilisierungsmittel enthält, kann
verwendet werden, um eine Vakzinzusammensetzung zu formulieren,
z. B. durch Zugeben eines Adjuvans und eines Verdünnungsmittels,
wie Salzlösung,
so dass die Antigenzubereitung und das Stabilisierungsmittel verdünnt werden.
Eine derartige Verdünnung
kann hilfreich dabei sein, unerwünschte
Nebenwirkungen der Vakzinformulierung bei dem Tier zu vermeiden
oder im Wesentlichen zu vermeiden. Zum Beispiel wird eine Antigenformulierung,
die ein Metallhydroxidgel, z. B. Alu miniumhydroxidgel (z. B. REHYDRAGELTM) enthält,
beim Zugeben zu einer Vakzinformulierung um das 5fache oder etwa
10fache oder etwa 15fache oder etwa 20fache oder etwa 25fache oder
etwa 30fache verdünnt.
In einer bevorzugten Ausführungsform
wird die Antigenformulierung, die Aluminiumhydroxidgel (z. B. REHYDRAGELTM) in einer Endkonzentration von etwa 30%
V/V enthält,
durch Zugabe zu der Vakzinformulierung um das etwa 20fache verdünnt, was
eine Aluminiumhydroxidgel-Endkonzentration von etwa 1,5% ergibt.
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Vakzinzusammensetzungen, die Antigene
von E. rhusiopathiae umfassen
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Eine
erfindungsgemäße Antigenzusammensetzung
kann in einer Vakzinzusammensetzung verwendet werden, um ein Tier
zu immunisieren. In einer Ausführungsform
enthält
die Vakzinzusammensetzung eine erfindungsgemäße Antigenzusammensetzung und
ein Adjuvans. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein Adjuvans,
das für
eine erfindungsgemäße Vakzinzusammensetzung
zweckmäßig ist,
ein Lecithin, ein Öl
und ein oberflächenaktives
Mittel. Eine Vakzinzusammensetzung, die mit einem bevorzugten Adjuvans
formuliert ist, enthält
ein Lecithin mit von 0,25% bis 12,5% V/V, stärker bevorzugt von etwa 0,5%
bis etwa 5% und am stärksten
bevorzugt von etwa 0,5% bis etwa 1,25% V/V, ein Öl mit von 1% bis 23% V/V, stärker bevorzugt von
etwa 3,5% bis etwa 10% und am stärksten
bevorzugt etwa 4,5%, und ein amphiphiles oberflächenaktives Mittel mit von
1,5% bis 8% V/V, stärker
bevorzugt von etwa 1,5% bis etwa 4% und am stärksten bevorzugt etwa 2% V/V.
Vorzugsweise weist das Adjuvans zwei amphiphile oberflächenaktive
Mittel auf, z. B. die oberflächenaktiven
Mittel Tween und Span, von denen eines vorherrschend in der wässrigen
Phase (z. B. Tween 80) der Vakzinzusammensetzung und das andere
in der Ölphase
(z. B. Span 80) vorliegt. Wenn Tween 80 und Span 80 als die oberflächenaktiven
Mittel verwendet werden, ist vorzugsweise die Konzentration von
Tween 80 etwa 1 1/2 bis etwa 3 mal so groß wie die Konzentration von
Span 80, vorzugsweise etwa 2 mal. Ein bevorzugtes Adjuvans enthält eine
wässrige
Trägerlösung, z.
B. Phosphat-gepufferte Salzlösung
(„phosphate-buffered
saline")(PBS)(z.
B. Dulbecco-PBS). Ein Lecithin und ein Öl, die für ein Adjuvans für die Vakzinzusammensetzungen
geeignet sind, ist ein Gemisch von Lecithin in DRAKEOL
TM 5
Lt Mineralöl.
Lecithin kann von Central Soya, Fort Wayne, Indiana, erhalten werden.
Siehe auch
U.S. Patent Nr. 5,084,269 ,
welches Adjuvans-Zusammensetzungen
diskutiert. Die oberflächenaktiven
Mittel Tween und Span können
von Van Waters and Rogers, Omaha, Nebraska, erhalten werden.
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In
einer weiteren Ausführungsform
können
Adjuvantien, die im Fachgebiet bekannt sind, zum Beispiel Ölemulsionen,
Aluminiumhydroxid, Muramyldipeptide, Zink/Calciumhydroxid, Avidin,
Aluminiumhydroxid, Öle und
Saponine, in einer erfindungsgemäßen Vakzinformulierung
verwendet werden, wie in den
U.S.
Patenten mit den Nm. 5,846,527 ,
5,417,971 ,
5,232,690 beschrieben, welche Adjuvantien
diskutieren.
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Eine
bevorzugte Vakzinzusammensetzung wird so formuliert, dass von etwa
10% bis etwa 50% ihres Volumens eine Adjuvans-Zusammensetzung ist,
stärker
bevorzugt von etwa 15% bis etwa 35%, stärker bevorzugt von etwa 20%
bis 30% und am stärksten
bevorzugt etwa 25%.
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Eine
Vakzinformulierung kann an ein Subjekt per se oder in Form einer
pharmazeutischen oder therapeutischen Zusammensetzung verabreicht
werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend die Antigene,
können
mittels konventioneller Verfahren des Mischens, Auflösens, Granulierens,
Dragierens bzw. Herstellen von Dragees, Verreiben, Emulgieren, Verkapseln,
Einschließen
oder Lyophilisieren hergestellt werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen
können
in konventioneller Weise unter Verwendung von einem oder mehreren
physiologisch annehmbaren Träger/n,
Verdünnungsmittel/n,
Exzipiens/Exzipienzien oder Hilfsstoff/en, welche das Verarbeiten
der erfindungsgemäßen Antigene
in Zubereitungen, welche pharmazeutisch verwendet werden können, erleichtern
bzw. ermöglichen,
formuliert werden. Die geeignete Formulierung ist von dem gewählten Verabreichungsweg
abhängig.
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Systemische
Formulierungen schließen
jene ein, die für
die Verabreichung mittels Injektion, z. B. subkutane, intradermale,
intramuskuläre
oder intraperitoneale Injektion, konzipiert wurden.
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Zur
Injektion können
die Antigene in wässrigen
Lösungen,
vorzugsweise in physiologisch kompatiblen Puffer, wie Hanks-Lösung, Ringer-Lösung, Phosphat-gepufferter
Salzlösung
oder einem beliebigen anderen physiologischen Salzlösungspuffer,
formuliert werden. Die Lösung
kann Formulierungshilfsmittel („formulatory agents"), wie Suspendier-,
Stabilisierungs- und/oder
Dispergiermittel, enthalten. Alternativ können die Proteine in Pulverform
zur Rekonstitution („constitution") mit einem geeigneten
Vehikel, z. B. steriles pyrogenfreies Wasser, vor der Verwendung
vorliegen.
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Zusätzlich zu
den zuvor beschriebenen Formulierungen können die Antigene auch als
Depotzubereitung formuliert werden. Derartige lang wirkende Formulierungen
können
mittels Implantation (z. B. subkutan oder intramuskulär) oder
mittels intramuskulärer
Injektion verabreicht werden. Somit können die Antigene z. B. mit
geeigneten polymeren oder hydrophoben Materialien (z. B. als eine
Emulsion in einem annehmbaren Öl) oder
Ionenaustauscherharzen oder als schwer lösliche Derivate, z. B. als
ein schwer lösliches
Salz, formuliert werden.
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Alternativ
können
andere pharmazeutische Abgabesysteme eingesetzt werden. Liposomen
und Emulsionen sind gut bekannte Beispiele für Abgabevehikel, die verwendet
werden können,
um ein Antigen abzugeben. Bestimmte organische Lösungsmittel, wie Dimethylsulfoxid,
können
ebenfalls verwendet werden, obwohl gewöhnlich auf Kosten einer größeren Toxizität. Zusätzlich können die
Antigene unter Verwendung eines Systems zur verzögerten bzw. verlängerten
Freisetzung („sustained
release"), wie semipermeable
Matrices fester Polymere, die das therapeutische oder vakzinierende
Mittel enthalten, abgegeben werden. Verschiedene Materialien mit
verzögerter
bzw. verlängerter
Freisetzung wurden etabliert und sind den Fachleuten auf dem Gebiet
gut bekannt. Kapseln mit verzögerter
bzw. verlängerter
Freisetzung können
in Abhängigkeit
von ihrer chemischen Beschaffenheit, die Antigene für wenige
Wochen bis zu über
100 Tage freisetzen. In Abhängigkeit
von der chemischen Beschaffenheit und der biologischen Stabilität des Mittels
können
zusätzliche
Strategien zur Antigenstabilisierung eingesetzt werden.
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Die
Bestimmung einer effektiven Menge des Antigens zur Verabreichung
liegt gut innerhalb der Fähigkeiten
der Fachleute auf dem Gebiet, insbesondere im Licht der detaillierten
Offenbarung, die hierin bereitgestellt wird.
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Eine
wirksame Dosis kann anfänglich
aus In vitro-Assays bestimmt werden. Zum Beispiel kann eine Dosis
in Tiermodellen formuliert werden, um eine Induktion einer Immunreaktion
unter Verwendung von Techniken, die im Fachgebiet gut bekannt sind,
zu erreichen. Ein Fachmann mit gewöhnlichem Kenntnisstand auf dem
Fachgebiet könnte
die Verabreichung, basierend auf den hierin beschriebenen Ergebnissen,
leicht für
alle Tierspezies optimieren. Die Dosierungsmenge und das -intervall
können
individuell angepasst werden. Wenn sie als eine Vakzine verwendet
werden, können
die erfindungsgemäßen Antigene
z. B. in etwa 1 Dosis bis zu etwa 3 Dosen über eine Dauer von etwa 2–36 Wochen
verabreicht werden. Auffrischungsvakzinierungen bzw. Booster-Vakzinierungen
können
periodisch danach gegeben werden. Alternative Protokolle können für einzelne
Tiere angemessen sein. Eine geeignete Dosis ist eine Menge an Antigen,
die, wenn wie oben beschrieben verabreicht, zum Erzeugen einer Immunreaktion
in einem immunisierten Tier befähigt
ist, die ausreicht, um das Tier vor einer E. rhusiopathiae-Infektion für mindestens
4 bis 12 Monate zu schützen.
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Die
Menge an Antigen in einer Dosis wird als optische Dichte (E625) der Kultur bei der Inaktivierung, als Trübungseinheiten,
spezifiziert. Wenn die optische Dichte bei der Inaktivierung z.
B. 4,0 ist, wird ein ml des Kulturüberstands oder Filtrats, hergestellt
aus der Kultur, vier Trübungseinheiten
enthalten, 0,5 ml werden 2 Trübungseinheiten
enthalten etc., obgleich die Quelle der Trübung, die Bakterienzellen,
entfernt wurden. Wenn eine Überstandsflüssigkeit,
die z. B. 5 Trübungseinheiten
pro ml enthält,
durch Molekularfiltration 12fach konzentriert wird, wird die konzentrierte
Flüssigkeit
einen Wert von 60 Trübungseinheiten
pro ml aufweisen. Im Allgemeinen kann die Menge an Antigen in einer
Dosis der Vakzine von etwa 1 bis zu etwa 12 Trübungseinheiten, vorzugsweise
von etwa 2 bis etwa 4 Trübungseinheiten,
reichen. Ein geeignetes Dosisvolumen wird mit dem Injektionsweg
und der Größe des Wirts
typischerweise von 0,1 bis etwa 5 ml variieren. Wenn der Wirt ein Schwein
ist, ist das Schwein vorzugsweise mindestens zwei Wochen alt.
-
Beispiele
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Die
unten dargestellte Vakzinierungsstudie zeigte, dass eine Vakzine,
wie hierin beschrieben, mit Nr. 1-Adjuvans, wenn sie in einem 2-Dosen-Regime
im Alter von etwa 3 und 6 Wochen an Ferkel verabreicht wird, einen
signifikanten Schutz gegen Virusprovokation 20 Wochen nach einer
zweiten Vakzinierung bereitstellte. Das Antigen mit Nr. 1-Adjuvans
induzierte auch wesentliche Antikörperreaktionen, wie mittels
Serum-ELISA-litern bei zwei Wochen nach der Vakzinierung gezeigt,
aber zum Zeitpunkt der Provokation hatten diese Titer abgenommen und
die einzelnen bzw. individuellen Titer korrelierten nicht eng mit
dem Schutz. Das gleiche Antigen in Saponin-Adjuvans und auf dem
gleichen Weg verabreicht induzierte geringere ELISA-Titer und erwies sich
als inadäquat
beim Schutz von Schweinen vor Virusprovokation 20 Wochen nach einer
zweiten Vakzinierung.
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Das
Provokationsmodell funktionierte dahingehend sehr gut, dass alle
10 Kontrollschweine klinische Zeichen von Erysipel nach der Provokation
entwickelten (Tabelle 2). Drei Schweine erfüllten das Kriterium der erhöhten Temperatur
und weitere fünf
waren E. rhusiopathiae-Kultur-positiv. Die verbleibenden zwei Kontrollschweine
erfüllten
keines der obigen Kriterien; jedoch waren sie für mehrere Tage deprimiert und
sie wiesen metastatische Hautläsionen
auf, die für
die Krankheit charakteristisch sind, und sie wurden daher in humaner Weise
getötet.
Im Gegensatz dazu waren in der Gruppe, die mit der Vakzine, enthaltend
Nr. 1-Adjuvans,
vakziniert worden waren, 15 der 20 Schweine vollständig geschützt (Tabelle
3).
-
Eine
experimentelle Vakzine, enthaltend ein erfindungsgemäßes Antigen
von E. rhusiopathiae mit Nr. 1-Adjuvans, stellte, wenn sie in einem
2-Dosen-Regime etwa im Alter von 3 und 6 Wochen an Ferkel abgegeben
wurde, einen signifikanten Schutz gegen die Entwicklung von klinischem
Erysipel nach Virusprovokation 20 Wochen nach einer zweiten Vakzinierung
bereit, siehe Tabelle 3, infra. Darüber hinaus schützte eine ähnliche
experimentelle Vakzine mit Saponin-Adjuvans, wenn sie Ferkeln gemäß dem gleichen
Regime gegeben wurde, nicht gegen die Entwicklung von klinischem
Erysipel nach Virusprovokation 20 Wochen nach einer zweiten Vakzinierung.
Schließlich
induzierte eine Vakzinierung, enthaltend ein erfindungsgemäßes Antigen, ungeachtet
des verwendeten Adjuvans, eine substantielle serologische Reaktion,
deren Höhepunkt
zwei Wochen nach der zweiten Vakzinierung erfolgte.
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Beispiel 1. E. rhusiopathiae-Kultur
-
Der
E. rhusiopathiae-Stamm CN 3342 wird in einem Medium, enthaltend
Proteose-Pepton
von Difco mit einer Konzentration von 2,75%, Hefeextrakt von Difco
(0,55%), Tween 80 (0,2%), K2HPO4 (0,217%)
und KH2PO4 (0,061%)
in deionisiertem Wasser, kultiviert. Der pH des Mediums wird mit
5 N NaOH auf 7,2 eingestellt. Das Medium wird bei einem Minimum
von 122°C
30 bis 90 Minuten lang dampfsterilisiert. Nach dem Autoklavieren
wird sterile 50%ige Dextroselösung
bis zu einer Endkonzentration von 3% G/V zugegeben.
-
Arbeitsanimpfkulturen
(„working
seed cultures")
werden hergestellt, indem ein Kryoröhrchen der Master-Animpfcharge
(„master
seed lot") aus der
gefrorenen Lagerung (–70°C) entfernt
wurde, indem es rasch aufgetaut wurde und indem der Inhalt aseptisch
in einen Kolben mit Medium überführt wurde.
Der Kolben wird bei 37°C
12 bis 36 Stunden unter Schütteln
inkubiert und mittels Gram-Färbung
auf Reinheit überprüft. Wenn
festgestellt wurde, dass die Kultur rein war, wurde sie mit sterilem
Glycerin (10%) gemischt, in 1 ml-Mengen in Kryoröhrchen verteilt und gefroren
gelagert.
-
Animpfgefäße bzw.
Herführungsgefäße („seed vessels"), die Produktionsmedium
enthalten, werden mit 0,01 bis 2% Master- oder Arbeits-Animpf(Kultur)
inokuliert. Animpffermenter bzw. Herführungsfermenter („seed fermenters"), die, wenn sie
verwendet werden, 10 bis 100 Liter Produktionsmedium enthalten,
werden mit 1 bis 5% Kultur aus einem Animpfkolben bzw. Herführungskolben
(„seed
flask") inokuliert.
Ein Produktionsfermenter, der 200 bis 10000 Liter Produktionsmedium
enthält,
wird mit 0,5 bis 5% Kultur aus dem Herführungsfermenter inokuliert.
-
Produktionskulturen
werden bei einem Sollwert von 37 ± 2°C unter Rühren inkubiert. Die Inkubationszeiten
variieren von 4 bis 24 Stunden. Sterile 10N-Natriumhydroxidlösung wird
während
der gesamten Inkubationsdauer hindurch zu der Kultur zugegeben,
um einen pH von 7,2 ± 0,1
aufrechtzuerhalten. Während
der Wachstumsphase werden periodische Zugaben von Dextrose gemacht.
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Vor
dem Ernten wird die Kultur mikroskopisch auf Reinheit, Zellmorphologie
und Gram-Reaktion untersucht. Das Wachstum wird durch Messen der
optischen Dichte der Kultur bei 625 nm überwacht. Die Kulturen werden
geerntet, wenn sie eine optische Dichte von 4,0 oder höher bei
625 nm aufweisen.
-
Beispiel 2. Herstellung der E. rhusiopathiae-Vakzine
-
Eine
Formalinlösung
wurde zu den Kulturen bis zu einer Endkonzentration von 0,5% (V/V)
zugegeben, um die Kultur zu inaktivieren. Die Kultur wurde dann
in einen sterilen Tank überführt und
in einem Inkubator mit 37 ± 2°C für ein Minimum
von 24 Stunden (und ein Maximum von 60 Stunden) unter konstantem
Rühren platziert.
Die nicht sofort verarbeiteten Kulturen wurden für bis zu 7 Tage bei 2 bis 8°C gelagert.
Die inaktivierte Kultur wurde mittels Passage durch eine Durchlaufzentrifuge
geklärt.
Die flüssige
Fraktion wurde zur weiteren Verarbeitung zurückgehalten und die Bakterien
wurden verworfen.
-
In
einem Versuch wurden 10x-Konzentrate bei einem Filtrat von E. rhusiopathiae-Kulturen hergestellt, die
entweder mit beta-Propiolacton („BPL"), Endkonzentration 0,1% V/V, oder mit
Formalin, Endkonzentration 0,2% V/V, (bei 37°C für mindestens 24 Stunden) inaktiviert
worden waren. Eine Enzym-gekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA),
spezifisch für
das 64 bis 66 kDa-Protein, das in dem Kulturfiltrat von E. rhusiopathiae
gefunden worden war (Groschup et al., 1991, Epidemiol. Infect. 107:
637–649
und
U.S. Patent Nr. 5,625,038 ),
wurde durchgeführt,
um die Wirkung der Inaktivierung und Stabilisierung auf das Vorhandensein des
64 bis 66 kDa-Proteins zu bestimmen. In Übereinstimmung mit früheren Befunden,
dass die Formalininaktivierung der Kultur den (Mess)-Wert des Proteins
im ELISA-Assay verringerte, wies das BPL-Konzentrat einen Assay-Wert
von etwa dem 4fachen desjenigen des Formalinkonzentrates auf. Nach
Inkubation bei 37°C für 14 Tage
hatte das BPL-Konzentrat etwa 80% seines Wertes verloren, verglichen
mit etwa 40% bei dem Formalinkonzentrat. In beiden Fällen verhinderte
jedoch die vorausgehende Zugabe von REHYDRAGEL
TM, 30%
V/V, als Stabilisierungsmittel, siehe unten, das meiste des Verlustes
und nahezu alles davon im Fall der Formalinzubereitung. Eine kleine
Studie bei Schweinen deutete darauf hin, dass die flüssige Fraktion
der Formalin-inaktivierten Kulturen beim Schutz von Schweinen gegen
Provokation mit virulentem E. rhusiopathiae wirksamer war als diejenige
von Kulturen, die mit BPL inaktiviert worden waren.
-
Die
Flüssigkeiten
wurden mittels Hohlfaserfiltration (nomineller Molekulargewichtsausschluss × 10000 Kilodalton)
nach Zentrifugation 6X bis 20X (gewöhnlich etwa 10X) konzentriert.
Die Flüssigkeiten
wurden nach der Konzentrierung durch Zugabe von Aluminiumhydroxidgel
stabilisiert.
-
Um
das Immunogen zu stabilisieren, wurde Aluminiumhydroxidgel langsam
unter Rühren
zu den konzentrierten Flüssigkeiten
bis zu letztendlich 30% (V/V)(30 Volumenteile Gel zu 70 Volumenteile
Konzentrat) zugegeben. Nach 20facher Verdünnung des Konzentrats in der
Vakzine betrug der Al-Gel-Gehalt nur etwa 1,5%, was nicht ausreichend
ist, um negative Reaktionen an der Injektionsstelle zu verursachen.
Eine Titration zum Bestimmen der Menge an Al-Gel, die erforderlich ist, um das gesamte
schützende
Protein in der flüssigen Fraktion
einer E. rhusiopathiae-Kultur, die 10fach konzentriert ist, zu adsorbieren,
zeigte, dass mehr als 95% durch 32% V/V REHYDRAGELTM (Reheis,
Berkeley Heights, New Jersey) adsorbiert wurden. Thimerosal (d. h.
MERTHIOLATETM)(Dimportex, Spanien, importiert
durch Flavine Inc., Klosters, New Jersey) wurde als Konservierungsmittel
zu dem Produkt in einer Endkonzentration von etwa 0,01% (G/V) zugegeben.
Die Konzentration von Thimerosal wurde bei etwa 0,01% G/V in der
Antigenzusammensetzung und in einer Vakzinzusammensetzung, die das
erfindungsgemäße Antigen
enthielt, gehalten. EDTA wurde bis zu einer Endkonzentration von
etwa 0,07% (G/V)(Sigma, St. Louis, Missouri) zugegeben.
-
Das
verwendete Adjuvans war Nr. 1-Adjuvans. 1000 ml Nr. 1-Adjuvans wurden
aus 200 ml sterilfiltrierter Lecithin-Öl-Lösung (10% Lecithin in DRAKEOLTM Mineralöl), autoklaviertem Tween 80
(56 ml) und Span 80 (24 ml) und Phosphat-gepufferter Salzlösung (Dulbecco-PBS)(720 ml) hergestellt.
Die Lecithin-Öl-Lösung und Span
80 wurden kombiniert und in einem sterilen Gefäß für mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur
gemischt, bis die Emulgierung vollständig war. Die Salzlösung und
Tween 80 wurden kombiniert und in einem sterilen Gefäß für mindestens
1 Stunde bei Raumtemperatur gemischt. Das Ölgemisch wurde mit dem wässrigen
Gemisch unter Verwendung eines Ross-Emulgators bzw. einer Ross-Emulgiervorrichtung
emulgiert. Die Emulgierung wurde mittels Rückführung fortgesetzt, bis das
gesamte Adjuvans in die Salzlösung
zugegeben war. Die Emulsion wurde dann zweimal durch eine Gaulin-Presse
bei Raumtemperatur hindurchgeleitet. Das Adjuvans wurde bei 2 bis
8°C gelagert.
-
5
l der Vakzine wurden hergestellt, indem 11 Adjuvans zu 31 wässriger
Phase zugegeben wurde. Die wässrige
Phase bestand aus ausreichend stabilisiertem Konzentrat, um einen
Antigen-Endgehalt von 3,2 Trübungseinheiten
pro 2 ml Vakzindosis zu ergeben, plus ausreichend Salzlösung, um
das Volumen auf 5 1 aufzufüllen.
Trübungseinheiten
sind definiert als die optische Dichte (E625)
bei der Ernte, multipliziert mit dem Konzentrationsfaktor.
-
Beispiel 3. E. rhusiopathiae-Vakzinierung
und Provokation der Schweine
-
Die
achte Subkultur (MS + 8) von E. rhusiopathiae, Stamm CN3342, wurde
verwendet, um die Vakzinen herzustellen. Ein Dosislevel von stabilisiertem,
geklärtem
E. rhusiopathiae-Antigen
(3,2 Trübungseinheiten („opacity
units” [„OU"]) wurde verwendet,
wie aus der optischen Dichte (OD) der Kultur bei der Inaktivierung berechnet.
Eine OU war äquivalent
zu 1 ml Flüssigkeit
mit einer OD (bestimmt bei 625 nm) von eins. Nr. 1-Adjuvans oder
Saponin (0,05% G/V, erhalten von Berghausen Chemical Company, Cincinnati,
Ohio), wurde als Adjuvans verwendet. Speziell wurde eine Kultur
von E. rhusiopathiae, Stamm CN3342, bis zu einer OD von 5,28 wachsen
gelassen. Die Kultur wurde 24 Stunden lang mit 0,5% Formalin inaktiviert.
Nach der Inaktivierung wurden die Bakterien mittels Zentrifugation
entfernt. Die flüssige
Fraktion wurde dann unter Verwendung einer Ultrafiltrationseinheit
mit einem nominellen Molekulargewichtsauschluss von 10000 Kilodalton
konzentriert. Die flüssige
Fraktion wurde etwa 13,4fach konzentriert. Das Antigen wurde durch
Zugeben von REHYDRAGEL
TM (30% V/V) zu dem
konzentrierten Material stabilisiert. Das adsorbierte Konzentrat
wurde bei 4°C
bis zur Vakzinformulierung gelagert. Die Vakzinen wurden mit Nr.
1-Adjuvans oder 0,05% Saponin als Adjuvans formuliert. Das stabilisierte
Antigen wurde in Salzlösung
(150 mM Natriumchlorid und 4 mM Phosphat) bis zum Erreichen der
Endkonzentration verdünnt.
Ethylendiaminotetraacetat (EDTA, 0,07%) und Thimerosal (0,01%) wurden
in den letztendlichen Vakzinformulierungen zugegeben. Phosphat-gepufferte
Salzlösung
wurde als Placebo verwendet. Tabelle 1 fasst die Behandlungsgruppen,
Vakzinbehandlungen und Anzahlen von Ferkeln, die vakziniert und
provoziert wurden, zusammen. Tabelle 1. Vakzinierte und provokzierte
Ferkel nach Behandlungs-(Vakzine)-Gruppe
Behandlungsgruppe | Antigen | Adjuvans | Anzahl
der vakzinierten Ferkel | Anzahl
der provozierten Ferkel |
T01 | Placebo | keines | 16 | 10 |
T02 | 3,2
OU | Nr.
1-Adjuvans | 26 | 20 |
16 | 3,2
OU | Saponin | T03 | 10 |
-
Eine
zufriedenstellende Provokation wurde bei den Kontrollen durch eine
hohe Körpertemperatur (40,9°C [105,6°F] oder höher an mindestens
zwei aufeinanderfolgenden Tagen), durch Kultur bei der Nekropsie
und/oder durch klinische Zeichen, die für eine Infektion mit E. rhusiopathiae
charakteristisch sind, nachgewiesen. Klinische Zeichen, die als
charakteristisch für
diese Erkrankung angesehen wurden, schlossen plötzlichen Tod, Depression, Hyperämie des
Abdomens und der Ohren, metastatische Hautläsionen und Steifheit oder Gelenkinvolvierung
ein. Schweine, die klinische Zeichen aufwiesen, die aber das Temperaturkriterium nicht
erfüllten,
wurden getötet,
und Blut, Milz und Leber wurden in Versuchen, E. rhusiopathiae zu
isolieren, in Kultur genommen.
-
Der
exakte Test nach Fisher wurde verwendet, um zu bestimmen, ob es
einen Unterschied (P < 0,05) in
dem Prozentsatz der Tiere, die mit verschiedenen Vakzinen geschützt wurden,
gab. A priori-Unterschiede wurden konstruiert, um jede Dosisgruppe
mit Kontrollen zu vergleichen, und um jede Gruppe mit Durchschnitt aller
anderen Dosisgruppen zu vergleichen. Die Beziehungen zwischen dem
gegebenen Vakzintyp und den serologischen Reaktionen in jeder Gruppe
von Ferkeln wurden unter Verwendung logistischer Regression für Blutabnahmen
(„bleedings") im Alter von 2
Monaten, im Alter von 3 Monaten, im Alter von 4 Monaten, im Alter von
5 Monaten und vor der Provokation erstellt. Die Beziehung zwischen
Vakzineinduzierten Titern zum Zeitpunkt der Provokation und dem
Erkrankungszustand (geschützt/nicht-geschützt) wurde
unter Verwendung logistischer Regression beurteilt. Das 5%-Signifikanzniveau
wurde verwendet, um die Beziehung als real zu erklären.
-
Zwanzig
trächtige
Säue/Jungsäue mit niedrigen
serologischen Titern gemäß ELISA
(#800) gegenüber E.
rhusiopathiae wurden von Riddell Farms, Albert City, IA, erhalten
und in Isolationsräumen
an der University of Nebraska, Department of Veterinary and Biological
Sciences, gehalten.
-
Die
serologischen Titer gemäß ELISA
wurden in einem ELISA mit direkter Antigenbindung mit ganzen Zellen
wie folgt bestimmt. Siehe
U.S.
Patent Nr. 4,918,163 , welches die Herstellung von Antigen-beschichteten Platten
und einen ELISA unter Verwendung derartiger Platten beschreibt.
Zuerst wurden E. rhusiopathiae, wie in Beispiel 1 beschrieben, wachsen
gelassen und aus einer Kultur in der log-Phase geerntet. Die optische
Dichte bei 640 nm wurde aufgezeichnet und in Zellen/ml unter Verwendung
einer Tabelle, etabliert durch Zählungen von
Bakterien aus Lösungen
mit verschiedenen optischen Dichten, umgewandelt. Die lebenden Bakterien
wurden in PBS (Dulbecco-PBS, Sigma, St. Louis, Missouri) bis zu
einer Dichte von etwa 1,1 × 10
9 Zellen/ml verdünnt. Die in PBS verdünnten lebenden
Bakterien wurden an Platten für
den ELISA gebunden. Um die Platten herzustellen, wurden 100 μl 0,1%iges
(V/V) Glutaraldehyd (Sigma, St. Louis, Missouri) in PBS in jedes
Well zugegeben, die Wells wurden abgedeckt und die Platten wurden
bei 37°C
1 Stunde lang inkubiert. Der Glutaraldehyd in PBS wurde aus jedem
Well entfernt und die Wells wurden mit absorbierenden Tüchern getrocknet. 100 μl der lebenden
Bakterien in PBS mit einer Dichte von 1,1 × 10
9 Zellen/ml
wurden zu jedem Well zugegeben. Die Platten wurden bei 2000 UpM
5 Minuten lang bei 22°C
zentrifugiert. Anschließend
wurden 200 μl
1% Polyvinylalkohol (Aldrich, Milwaukee, Wisconsin) in PBS (PVA/PBS)
zu jedem Well zugegeben, die Wells wurden abgedeckt und die Platten
wurden über
Nacht bei 4°C
gehalten. Die Inhalte der Wells der Platten wurden in eine bakterizide
Lösung überführt und
die Wells wurden mit PBS gewaschen. Die Wells wurden mit Gaze abgedeckt
und bei Raumtemperatur (etwa 1 Stunde) getrocknet.
-
Die
ELISA-Vorgehensweise wurde wie folgt unter Verwendung der Platten
mit gebundenem bakteriellem Ganzzellantigen durchgeführt. Zuerst
wurden die Schweine-Seren verdünnt,
einschließlich
einer Positivkontrolle, und zwar in 1% PVA/PBS. Alle unbekannten
Seren wur den 1:50 verdünnt
und die verwendete Positivkontrolle 1:200. 200 μl jeder Probe wurden zu einem
Well in einer Reihe A-Spalte zugegeben. 100 μl von 1% PVA/PBS wurden in die
verbleibenden Wells zugegeben. 2fache serielle Verdünnungen
(„two-fold
serial dilutions")
jeder Probe wurden in den Reihen B-H abgearbeitet („run"). Die Wells wurden
abgedeckt und 1 Stunde bei 37°C
inkubiert. Anschließend
wurden die Wells 3 mal mit PEST gewaschen. 100 μl einer 1:2000-Verdünnung von
Ziege-Anti-Schwein-IgG (H & L)-Peroxidase-Konjugat
(Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, Maryland), hergestellt in 1%
PVA/PBS, wurden zu jedem Well zugegeben. Die Wells wurden erneut
abgedeckt und 1 Stunde bei 37°C
inkubiert. Die Wells wurden 3 mal mit PEST gewaschen. 100 μl ABTS-Substrat
(2,2'-Azinodi-(3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure), erhalten
von Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, Maryland) wurden zu jedem
Well zugegeben und die Platten wurden bei Raumtemperatur 10 Minuten
inkubiert. Die Platten wurden 10 Sekunden lang auf einem Mikrotiterplattenschüttler vor
dem Ablesen der Absorption jedes Wells bei 405–490 nm unter Verwendung eines
Plattenlesegerät-Blindwertes
(„plate
reader blanked")
geschüttelt.
Der Endpunkttiter jedes unbekannten Serums war die Verdünnung des
Serums, bei welcher die Absorption größer als die Absorption einer
1:3200-Verdünnung
der Positivkontrolle war.
-
Den
Sauen wurde 0 bis 10 Tage vor dem Abferkeln Blut abgenommen („were bled"), um ihre E. rhusiopathiae-Antikörpertiter
zu bestimmen. Die Ferkel wurden auf Basis der serologischen Titer
der Sauen und den Abferkeldaten randomisiert. Achtundfünfzig (58)
Ferkeln, die von diesen Sauen/Jungsauen abstammten, wurde Blut abgenommen
und sie wurden im Alter von etwa 3 Wochen mit einer der zwei experimentellen
E. rhusiopathiae-Vakzinen oder dem Placebo (Gruppen aufgelistet
in Tabelle 1) vakziniert. Im Alter von etwa 4 Wochen wurden die
Ferkel entwöhnt.
Im Alter von etwa 6 Wochen wurde den Ferkeln Blut abgenommen und
sie wurden erneut mit der gleichen Vakzine vakziniert. Im Alter
von etwa 2 Monaten, 3 Monaten, 4 Monaten und 5 Monaten wurde allen
Schweinen Blut abgenommen. Im Alter von etwa 5 1/2 Monaten wurden
alle Reserverschweine aus der Studie entfernt. Im Alter von etwa
6 Monaten (20 Wochen nach der zweiten Vakzinierung) wurde den Schweinen
Blut abgenommen und 40 Schweine wurden intramuskulär mit 2
ml einer virulenten Kultur von E. rhusiopathiae (237 Maus-LD50, 1,74 × 109 koloniebildende
Einheiten/ml), wachsen gelassen aus einer Kultur, die von dem National
Veterinary Services Laboratory bereitgestellt wurde, provoziert.
Die Tiere wurden hinsichtlich der Zeichen einer klinischen Erkrankung
und über
die rektale Temperatur für
2 Tage vor der Provokation, am Tag der Provokation und die 7 Tage
nach der Provokation überwacht.
Jedes Kontrolltier, das das Kriterium bezüglich der erhöhten rektalen
Temperatur (40,9°C)
erfüllte,
wurde aus der Studie genommen und mit injizierbarem Penicillin behandelt.
Jedes Kontrolltier, das klinische Zeichen einer Erkrankung aufwies, aber
das Kriterium der erhöhten
rektalen Temperatur nicht erfüllte,
wurde in humaner Weise getötet,
nekropsiert und Vollblut-, Milz- und Leberproben wurden bezüglich E.
rhusiopathiae in Kultur genommen. Jedes Kontrolltier, das starb,
wurde nekropsiert und Milz- und Leberproben wurden bezüglich E. rhusiopathiae
in Kultur genommen. Jedes vakzinierte Tier, das das Kriterium der
erhöhten
rektalen Temperatur (40,9°C)
und/oder der klinischen Zeichen einer Erkrankung erfüllte, wurde
aus der Studie genommen und mit injizierbarem Penicillin behandelt.
Jedes vakzinierte Tier, das nach der Provokation starb, wurde nekropsiert
und Milz- und Leberproben wurden bezüglich E. rhusiopathiae in Kultur
genommen. Antikörpertiter
gegen E. rhusiopathiae wurden mittels des oben beschriebenen ELISA
bestimmt und die Korrelation der Antikörpertiter mit dem klinischen Schutz
wurde erstellt.
-
ELISA-Titer
wurden an den Seren aus der einzelnen Blutprobe, die von den Sauen
erhalten worden war, und allen Blutproben der 7 Probenzeiträume von
den Ferkeln bestimmt. Aerobe Bakterienkulturen (48 Stunden, 37°C, Blutagar)
wurden bei den Proben von Blut und/oder Milz und Leber, die von
Schweinen erhalten worden waren, die gestorben waren oder mittels
letaler Injektion getötet
worden waren, durchgeführt.
-
Ergebnisse:
-
Die
Ergebnisse der E. rhusiopathiae-Provokation der Kontrollschweine
sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Alle 10 Schweine waren positiv
auf Erysipel. Tabelle 2: Kontrollschweine (T01), provoziert
mit E. rhusiopathiae
Schwein Nummer | Rektale
Temperatur (40,9°C) | Klinische Zeichen** | Behandelt (T), gestorben (D) oder auf humane
Weise getötet
(K) | Ergebnisse der E. rhusiopathiae-Isolierung |
2
Tage* | nur
1 Tag |
3017 | | ja | ja | K | negativ |
3022 | | | ja | D | positiv |
3031 | ja | | ja | T | keine
Proben |
3046 | | | ja | K | negativ |
3063 | | ja | ja | K | positiv |
3073 | ja | | ja | T | keine
Proben |
3085 | ja | | - | T | keine
Proben |
3090 | | ja | ja | K | positiv |
3103 | | ja | ja | K | positiv |
3110 | | | ja | D | positiv |
- * 2 Tage – Erhöhung bei der rektalen Temperatur über 40,9°C an 2 aufeinanderfolgenden
Tagen
- ** Klinische Zeichen – Klinische
Zeichen schlossen Depression und/oder metastatische Hautläsionen ein.
-
Die
Ergebnisse der E. rhusiopathiae-Provokation von Schweinen, denen
die Vakzine mit Nr. 1-Adjuvans gegeben wurde (T02), sind in Tabelle
3 zusammengefasst. 15 der 20 Schweine (75%) waren vollständig geschützt. Tabelle 3: Ergebnisse der E. rhusiopathiae-Provokation
von Schweinen, denen Vakzine mit Nr. 1-Adjuvans gegben wurde (T02)
Schwein Nummer | Rektale
Temperatur (40,3°C) | Klinische Zeichen** | Behandelt (T), gestorben (D) oder auf
humane Weise getötet
(K) | Ergebnisse der E. rhusiopathiae-Isolierung |
2
Tage* | nur
1 Tag |
3006 | - | ja | - | - | keine
Proben |
3010 | ja | - | ja | T | keine
Proben |
3011 | - | ja | ja | T | keine
Proben |
3025 | - | - | - | - | keine
Proben |
3029 | - | ja | - | - | keine
Proben |
3030 | - | - | - | - | keine
Proben |
3033 | - | - | - | - | keine
Proben |
3038 | - | - | - | - | keine
Proben |
3047 | - | - | - | - | keine
Proben |
3052 | - | - | - | - | keine
Proben |
3059 | - | - | - | - | keine
Proben |
3071 | - | - | - | - | keine
Proben |
3088 | - | - | - | - | keine
Proben |
3093 | - | - | - | - | keine
Proben |
3098 | ja | - | ja | T | keine
Proben |
3100 | - | - | - | - | keine
Proben |
3112 | - | - | - | - | keine
Proben |
3114 | ja | - | ja | T | keine
Proben |
3115 | - | ja | - | - | keine
Proben |
3140 | - | ja | ja | D | positiv |
- * 2 Tage – Erhöhung bei der rektalen Temperatur über 40,3°C an 2 aufeinanderfolgenden
Tagen
- ** Klinische Zeichen – Klinische
Zeichen schlossen Depression und/oder metastatische Hautläsionen ein.
-
Die
Ergebnisse der E. rhusiopathiae-Provokation von Schweinen, denen
die Vakzine mit Saponin-Adjuvans gegeben wurde (T03), sind in Tabelle
4 zusammengefasst. Nur ein Schwein war geschützt. Tabelle 4: Ergebnisse der E. rhusiopathiae-Provokation
von Schweinen, denen die Vakzine mit Saponin-Adjuvans gegeben wurde
(T03)
Schwein Nummer | Rektale
Temperatur (40,3°C) | Klinische Zeichen** | Behandelt (T), gestorben (D) oder auf
humane Weise getötet
(K) | Ergebnisse der E. rhusiopathiae-Isolierung |
2
Tage* | nur
1 Tag |
3014 | ja | - | ja | T | keine
Proben |
3024 | - | ja | ja | T | keine
Proben |
3034 | ja | - | ja | T | keine
Proben |
3041 | ja | - | ja | T | keine
Proben |
3048 | ja | - | ja | T | keine
Proben |
3062 | - | ja | ja | T | keine
Proben |
3075 | - | ja | - | - | keine
Proben |
3095 | ja | - | ja | T | keine
Proben |
3102 | - | ja | ja | T | keine
Proben |
3106 | - | ja | ja | T | keine
Proben |
- * 2 Tage – Erhöhung bei der rektalen Temperatur über 40,3°C an 2 aufeinanderfolgenden
Tagen
- ** Klinische Zeichen – Klinische
Zeichen schlossen Depression und/oder metastatische Hautläsionen ein.
-
Die
geometrischen Mittel der ELISA-Titer („geometric mean ELISA titers")(„GMT"s) der Ferkelgruppen sind
in Tabelle 5 aufgelistet. Tabelle 5: Geometrische Mittel der ELISA-Titer
aller Behandlungsgruppen
Behandlungsgruppe* | Zeit (nährungsweise)
des Serumerhalts |
Vor
der Vakzinierung 1 | Vor
der Vakzinierung 2 | 2 Monate | 3
Monate | 4
Monate | 5
Monate | Vor
der Provokation |
01 | 33,5 | 35,9 | 108,8 | 153,9 | 88,4 | 329,8 | 233,2 |
02 | 40,0 | 259,6 | 8903,9 | 1871,8 | 519,2 | 596,4 | 556,5 |
03 | 28,7 | 162,3 | 1712,9 | 527,2 | 199,8 | 302,8 | 459,0 |
- * 01-Placebo
03–3,2 Trübungseinheiten von Antigen
in Nr. 1-Adjuvans
03–3,2
Trübungseinheiten
von Antigen in Saponin-Adjuvans
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Die
Ferkel wiesen zum Zeitpunkt der ersten Vakzinierung sehr geringe
für E.
rhusiopathiae spezifische Antikörpertiter
auf. Diese Titer reichten von weniger als 50 bis 200. Bei den Kontrollferkeln
erhöhten
sich die GMT leicht während
des Verlaufs der Studie, was darauf hindeutete, dass der ELISA bei älteren Schweinen weniger
spezifisch war.
-
Die
Vakzinen mit entweder Nr. 1-Adjuvans oder Saponin als Adjuvans induzierten
eine statistisch signifikante (P = 0,0001) serologische Reaktion,
die zwei Wochen nach der zweiten Vakzinierung (im Alter von etwa
2 Monaten) den Höhepunkt
erreichte. Die Titer nahmen bei beiden Gruppen über die Zeit (bis etwa zum Alter
von 5 Monaten) ab, wobei die GMT der Ferkel, die Antigen in Nr.
1-Adjuvans erhielten, zu allen Zeitpunkten merklich höher waren
als die GMT von Ferkeln, die Antigen in Saponin-Adjuvans erhielten.
Zum Zeitpunkt der Provokation waren die GMT von Schweinen, die Antigen
in Nr. 1-Adjuvans erhielten, um etwas mehr als das 2fache höher als
die GMT der Kontrollen, während
die GMT von Schweinen, die Antigen in Saponin-Adjuvans erhielten,
um etwas weniger als das 2fache höher waren als bei den Kontrollen.
Der Schutz vor der klinischen Erkrankung nach der Provokation korrelierte
nicht mit dem individuellen ELISA-Titer (P > 0,05). Eine interessante Beobachtung
war jedoch ein Spitzentiter, der zwei Wochen nach der zweiten Vakzinierung
bei Schweinen beobachtet wurde, denen Antigen in Nr. 1-Adjuvans
gegeben wurde. Von den 20 Ferkeln, die mit Antigen in Nr. 1-Adjuvans vakziniert
worden waren, hatten acht Spitzentiter von größer als oder gleich 2800 (8/8
geschützt
vor der Provokation), acht hatten Spitzentiter von 6400 (6/8 geschützt vor
der Provokation) und 4 hatten Spitzentiter von 3200 (1/4 geschützt vor
der Provokation), was nahe legt, dass ein Titer, der 6400 oder größer betrug,
ein Indikator eines anhaltenden Schutzes war.
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Zusammenfassend
gesagt, wurden alle 10 nicht-vakzinierten Kontrollen infiziert.
Bei der Gruppe von Schweinen, welcher die Vakzine mit Nr. 1-Adjuvans
gegeben wurde, waren 15 von 20 geschützt. Bei der Gruppe von Schweinen,
welcher die Vakzine mit Saponin als Adjuvans gegeben wurde, war
nur eines von 10 geschützt.
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Beispiel 4. Antigenstabilisierung mit
Al-Gel
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Eine
Vakzine wurde gemäß den Beispielen
1–3 hergestellt,
einschließlich
des Behandelns des Antigens mit Al-Gel, wie beschrieben. Die Vakzine
wurde auf ihre Wirksamkeit bei Schweinen getestet. Schweine wurden
mit 2 ml-Dosen, die intramuskulär
(IM) gegeben wurden, vakziniert und zwar mit einer Dosis bei etwa 3
Wochen (Entwöhnung)
und der zweiten Dosis 3 Wochen später. Die Kontrollen erhielten
Phosphat-gepufferte Salzlösung
als Placebo. Die Immunität
wurde mittels der IM-Injektion von virulentem E. rhusiopathiae im
Alter von etwa 9 Wochen getestet („challenged"). Wie in Tabelle
6 gezeigt, war der Schutz aufgrund der Vakzinierung bei 9 Wochen
100%. Diese Vakzine war zu dem Zeitpunkt, an dem die Schweine vakziniert
wurden, bereits 12 Monate alt. Das Ergebnis bestätigt, dass das schützende Antigen
erfolgreich stabilisiert wurde. Tabelle 6: Schutz der Schweine gegen Erysipel
Alter
bei Provokation | Kontrollen
(Geschützt/Provoziert) | Impflinge
(Geschützt/Provoziert) |
9
Wochen | 0/10 | 19/19 |
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Anmerkung:
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Das
20. Schwein wurde ausgeschlossen. Ein sehr widerspenstiges Tier,
es wehrte sich so heftig bei Behandlung, dass seine Ruhetemperatur
nicht bestimmt werden konnte. Nach der Provokation blieb dieses Schwein
vollständig
gesund.