CN1210062C - 猪红斑丹毒丝菌抗原及其疫苗组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及猪红斑丹毒丝菌的稳定化的抗原组合物以及包含这种抗原组合物的疫苗制剂。本发明的抗原在为动物体提供长期抗丹毒保护作用上是有效的。

Description

猪红斑丹毒丝菌抗原及其疫苗组合物
发明所属技术领域
本发明涉及用于预防和治疗猪红斑丹毒丝菌感染(丹毒)的抗原组合物和疫苗制剂，以及制作和使用这些抗原组合物和疫苗制剂的方法。
发明背景
猪红斑丹毒丝菌在整个世界范围内都有所分布，并且在整个欧洲、亚洲、澳大利亚以及南、北美洲具有重要的经济意义。3个月到3年大的猪最易受丹毒感染。被感染的猪经常是身体肿胀和关节僵硬，体重不能有效增加，在包装房内检查员也经常修整或处理其屠体。
大约10年以前，有结果表明，传统做法-从整个杀死的培养物中制作猪红斑丹毒丝菌疫苗是不必要的。无菌滤液就能保护猪和小鼠抵抗毒性的挑战。随后日本和美国科学家发表的研究结果证明了这一发现，并且表明猪红斑丹毒丝菌释放到培养基中的抗原是一种普遍免疫原，因此它使猪对所有的猪红斑丹毒丝菌菌株具有免疫性(Sawada和Takahashi，1987，美国兽医学杂志，48：239-242；Groschup等，1991，流行病传染病，107：637-649)。Groschup等表明培养基中的64-66kDa蛋白质保护小鼠免受猪红斑丹毒丝菌的侵袭。也有结果表明有一种蛋白质能够保护猪，美国农业部提供给疫苗制作者一种抵抗该种蛋白质的单克隆抗体(mAb)，用于分析该种蛋白质。
虽然预防猪体丹毒的有效疫苗是非常合乎需要的，但许多传统丹毒疫苗中，没有一种能够为断奶小猪提供合意的保护作用。问题是免疫缺乏持续性。猪饲养工业需求一种疫苗，在断奶时接种该种疫苗，其将一直保护猪抵抗这种致命性的、毁灭性的疾病到可以被屠宰的年龄，也就是大约6个月的时间。美国农业部已规定将这种要求作为给新疫苗发放许可证的标准。
发明概述
本发明涉及一种猪红斑丹毒丝菌抗原组合物及制作这种抗原组合物的方法。本发明也涉及一种含有猪红斑丹毒丝菌抗原组合物和佐剂的疫苗制剂。本发明还涉及利用本发明的抗原组合物给动物(优选哺乳动物或鸟类)接种的方法。特别是，本发明涉及用本发明的抗原给猪，羊，狗，马，牛或者人接种的方法。
在一实施方案中，描述了取自猪红斑丹毒丝菌培养物液体部分的稳定化的抗原。一方面，将稳定剂加到猪红斑丹毒丝菌培养物的上清液或滤液中，优选浓缩的上清液或滤液。稳定剂是抗原的吸附剂。稳定剂的非限定性例子有氢氧化铝凝胶，磷酸铝凝胶，磷酸钙凝胶，氢氧化锌/氢氧化钙凝胶和明矾。优选的一方面，将氢氧化铝凝胶加至浓缩的上清液，使氢氧化铝凝胶的最终浓度在10％(也就是每单位体积含10％的氢氧化铝凝胶，例如将9倍体积的上清液和1倍体积的氢氧化铝凝胶混合)到40％(v/v)的范围内，最好为大约30％(v/v)。
另一方面，将含有浓缩的猪红斑丹毒丝菌培养物上清液或滤液及稳定剂的抗原稀释大约10倍到30倍，更好是大约20倍，这样当用抗原配制疫苗组合物时，疫苗组合物中稳定剂的浓度就降低到大约5％以下。
在另一个实施方案中，培养和处理猪红斑丹毒丝菌以便获得包含猪红斑丹毒丝菌抗原的上清液或滤液。一方面，灭活猪红斑丹毒丝菌培养物，例如，通过加入福尔马林或者β-丙内酯。另一方面，从细菌中分离猪红斑丹毒丝菌培养肉汤，例如，通过离心法。再一方面，浓缩上清液大约10倍，例如，通过分子过滤。
在本发明的另一个实施方案中，在抗原中加入了防腐剂，例如，含有或不含有乙二胺四乙酸(EDTA)的硫柳汞。在本发明的又一实施方案中，本发明的抗原与佐剂结合，例如，一种包含卵磷脂、油及一种或多种表面活性剂的佐剂。在本发明的另一实施方案中，描述了用本发明的抗原和疫苗给动物接种的方法。
发明详述
本发明涉及预防或治疗丹毒的组合物及方法。在一实施方案中，本发明涉及猪红斑丹毒丝菌抗原及制作该种抗原的方法。本发明还涉及含有本发明抗原的疫苗制剂。本发明还涉及用猪红斑丹毒丝菌抗原给动物(优选哺乳动物或鸟类)接种的方法。从最优选角度考虑，哺乳动物选自下列群组：猪，羊，狗，马，牛或人。
本发明涉及从猪红斑丹毒丝菌培养物获得的抗原。猪红斑丹毒丝菌的任何菌株都可以作为本发明抗原的来源，例如在美国第5,625,038号专利中描述的菌株。培养物(用于分离抗原)可能通过各种方法提供。例如，培养物可以是纯的或者基本上是纯的。更优选的情况是，从猪红斑丹毒丝菌培养物的上清液或滤液获得本发明抗原。在最优选的实施方案中，本发明抗原获自纯的或者基本上纯的液态猪红斑丹毒丝菌培养物的上清液或滤液。
猪红斑丹毒丝菌可通过本领域已知的不同方法来培养。参见美国第5,625,038；5,616,328；5,417,971；5,225,194；4,981,685号专利(讨论细菌培养)。例如，猪红斑丹毒丝菌可通过以下的说明例子中描述的方法培养。猪红斑丹毒丝菌也可通过以下两篇文章中描述的方法培养：Sawada和Takahashi，1987，美国兽医研究杂志，48：239-242；Groschup等，1991，流行性传染病，107：637-649。关于原核细胞培养和加工的一般背景知识在以下资料中有所描述：Maniatis等，1982，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY；Ausubel等，1989，分子生物学当前方案，Greene publishing Associates andWiley Interscience，NY；Sambrook等，1989，分子克隆，实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY，这里所引用的所有文献以其整体一并参考。
在一个优选的实施方案中，通过加入福尔马林(终浓度大约0.5％(v/v))灭活培养物。在另一个优选的实施方案中，从猪红斑丹毒丝菌培养物的上清液或滤液获得本发明抗原。在一个优选的实施方案中，浓缩培养物上清液或滤液大约10倍，向浓缩的上清液或滤液中加入氢氧化铝凝胶(优选REHYDRAGELTM)至终浓度大约为30％(v/v)以稳定抗原。在另一个优选的实施方案中，配制了含有抗原和佐剂的疫苗组合物，例如，佐剂大约占疫苗组合物的25％(v/v)。在另一个优选的实施方案中，将具有EDTA(终浓度大约为0.07％(v/v))的乙基汞硫代水杨酸钠(终浓度大约为0.01％(v/v))作为防腐剂加入到抗原中。一种优选的佐剂，这里称作“一号佐剂”，包含大约2％(v/v)卵磷脂，大约18％(v/v)矿物油，以及约8％(v/v)表面活性剂(例如，约5.6％(v/v)吐温80和约2.4％(v/v)斯潘80)，余量为6％食盐水(例如，DulbeccoPBS)。
猪红斑丹毒丝菌的灭活
本发明的抗原从猪红斑丹毒丝菌获得，猪红斑丹毒丝菌可通过本领域已知的方法提供，例如液体培养物。在本发明的一个优选实施方案中，在将抗原用于疫苗配制之前，首先灭活用来分离抗原的猪红斑丹毒丝菌培养物。在一最优选的实施方案中，在从细菌分离液体组分之前，首先灭活猪红斑丹毒丝菌培养物。灭活猪红斑丹毒丝菌培养物是为了各种不同的目的，例如为了杀死细菌或者灭活蛋白酶或者保存抗原。
灭活含本发明抗原的培养物可通过本领域已知的各种方法。例如，可将培养物暴露于灭活剂，也就是能够杀死猪红斑丹毒丝菌的药剂。实践中对本发明有效的灭活剂能使本发明的抗原在动物体内引起免疫反应，从而保护所说的动物抵抗丹毒。可使用的本领域已知的灭活剂有：例如，福尔马林(甲醛)，β-丙内酯或者其它具有类似性质的化学药剂。用于细菌灭活的合适的化学试剂可由本领域的普通技术人员来确定，例如可通过使细菌与特殊的化学药品相接触，并且确定是否已杀死细菌以及其中的抗原是否仍具有活性以产生保护性抗体(例如，通过用处理过的细菌给小鼠接种来确定。参见美国第5,225,194号专利(讨论细菌的灭活)。
分离和浓缩猪红斑丹毒丝菌培养物的液体
在一个优选的实施方案中，本发明的抗原获自猪红斑丹毒丝菌培养物的液体部分。培养猪红斑丹毒丝菌，从培养肉汤中分离细菌，例如通过离心或过滤液体培养物。用来分离本发明抗原的有效猪红斑丹毒丝菌培养物可通过本领域已知的任何方法提供。例如，猪红斑丹毒丝菌可在肉汤或培养基中培养，以使细菌迅速繁殖，即呈现对数期。在一个优选的实施方案中，用于制备本发明抗原的培养基处于对数期，更优选的是在对数期的晚期，在这时候开始培养物的处理。
在一个优选的实施方案中，处理猪红斑丹毒丝菌培养物，以便从细菌生长的培养肉汤或培养基中分离所有的或几乎所有的细菌。例如，从肉汤或培养基中除去大约90％的细菌，更好的是除去大约95％的细菌，再好就是除去大约98％的细菌。可通过本领域知道的任何方法，将猪红斑丹毒丝菌从培养肉汤或培养基中分离。例如，可离心猪红斑丹毒丝菌培养物将细菌从肉汤或培养基中分离。本领域知道的任何能够沉淀猪红斑丹毒丝菌细菌的离心机都适用于将细胞从肉汤或培养基中分离。例如，可使用连续流动离心机。如何从培养基中移取细菌的背景技术由以下资料提供：Maniatis等，1982，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY；Ausubel等，1989，分子生物学当前方案，Greene Publishing Associates和WileyInterscience，NY；Sambrook等，1989，分子克隆，实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY。
另一方面，可通过过滤法将猪红斑丹毒丝菌从肉汤或培养基中除去，所用过滤器能够保留细菌但不能保留本发明的抗原。本领域都已知道许多适合把细菌与肉汤或培养基中的抗原分离的过滤器。例如，适用于分离细菌和液体组分的过滤器平均孔径为大约0.1微米到大约0.5微米，更好是大约0.2微米。
可将如上所述方法从猪红斑丹毒丝菌培养物中获得的液体组分(“液体部分”)浓缩。在一实施方案中，液体组分被浓缩大约3倍到大约30倍，例如，大约3倍，或大约6倍，或大约10倍，或大约15倍，或大约20倍，或大约30倍。可通过本领域知道的任何方法将液体组分浓缩。在一个优选的实施方案中，利用空纤维过滤法浓缩液体组分。一方面，空纤维过滤法适用于分子量截断值为大约5,000Kd到大约50,000Kd，优选为大约10,000Kd到大约30,000Kd。也参见美国第5,225,194号专利(讨论如何浓缩细菌培养物的液体组分)。
液体组分也可通过冷冻干燥法或冻干法浓缩。另一方面，液体组分可通过先沉淀其中的蛋白质与多肽，随后再悬浮沉淀物的方法浓缩。可利用本领域知道的任何方法，例如，通过聚乙二醇，乙醇或者硫酸铵沉淀从液体组分中沉淀蛋白质。紧跟沉淀之后，可将沉淀物再悬浮于任何一种适于制备疫苗制剂的溶液，例如，6％食盐水中。
稳定猪红斑丹毒丝菌抗原
从猪红斑丹毒丝菌培养物液体组分获得的抗原是动物体内预防和治疗丹毒的有效免疫原。然而，那些除去细菌之后的抗原缺乏稳定性，当将其用于免疫组合物时，是一个严重的问题。本发明解决这个问题，部分是基于以下的发现，即通过加入稳定剂可稳定猪红斑丹毒丝菌培养物液体组分中的抗原。
本领域知道的任何稳定剂都可用来稳定本发明的抗原。在一个优选的实施方案中，稳定剂能够吸附猪红斑丹毒丝菌培养物液体组分中的抗原。合适的稳定剂可保持猪红斑丹毒丝菌培养物液体组分的抗原潜力或者以其它方式在除去细菌之后减慢抗原潜力的降解。稳定剂的这种稳定效果可通过实验确定。例如，可在37℃条件下，培养两个已灭活的猪红斑丹毒丝菌培养物液体组分样品一段时间，例如从大约14天到大约28天，一个样品含有作为稳定剂的可检测的化学药剂，一个样品不含有这样的稳定剂。然后利用佐剂，例如1号佐剂，按照标准的小鼠滴度试验(9 CFR 113.119(C))在小鼠的免疫接种中测试样品。用化学药剂处理过的疫苗接种的一组小鼠，其中得到保护的动物比例高于用未处理疫苗接种的一组或未进行免疫接种的对照组，表明化学处理过的疫苗中的抗原已得到稳定。
上述的实验说明了在较高温度(37℃)下(高于通常储存温度)的加速稳定性试验。通常，抗原制备物存储在低温下，例如从大约2℃到大约8℃。37℃下28天的稳定性表明，在通常冷存储情况下具有较长时间，也就是几年时间的稳定性。在一个实施方案中，按照本发明，抗原在低温下稳定长达大约5年，更具体地说在低温下稳定长达大约3年。在另一实施方案中，按照本发明，在低温下可使抗原稳定至少一年。
本领域知道的各种能够吸附抗原的试剂，例如，氢氧化铝凝胶，磷酸铝凝胶，磷酸钙凝胶，氢氧化锌/氢氧化钙凝胶以及明矾(例如钾矾)，作为稳定剂都是有效的。在一个优选的实施方案中，将氢氧化铝凝胶，例如，REHYDRAGELTM用作为稳定剂。(参见美国第5,616,328和5,232,690号专利(讨论金属凝胶及其用途))。
在一实施方案中，加入一种金属氢氧化物凝胶，例如，氢氧化铝凝胶(例如REHYDRAGELTM)，其在抗原制备物中的终浓度从大约10％(v/v)到大约40％(v/v)，例如，大约10％(v/v)，或者大约20％(v/v)，或者大约30％(v/v)，或者大约40％(v/v)。在一个优选的实施方案中，加入的氢氧化铝凝胶(例如，REHYDRAGELTM)在抗原制备物中的终浓度为大约30％(v/v)。
一种包含稳定剂的抗原制备物可用来配制疫苗组合物，例如通过加入一种佐剂和一种稀释剂(如盐水)，这样可稀释抗原制备物和稳定剂。这样稀释可能有益于避免或大体上避免疫苗制剂在动物体内引起不期望的副作用。例如，含金属氢氧化物凝胶，例如，氢氧化铝凝胶(例如REHYDRAGELTM)的抗原制剂经加入到疫苗制剂中而稀释大约5倍，或者大约10倍，或者大约15倍，或者大约20倍，或者大约25倍，或者大约30倍。在一个优选的实施方案中，含氢氧化铝凝胶终浓度为大约30％(v/v)的抗原配制物(例如REHYDRAGELTM)，通过加入免疫制剂中而稀释大约20倍，使得氢氧化铝凝胶的终浓度大约为1.5％。
含猪红斑丹毒丝菌抗原的疫苗组合物
本发明的抗原可用于疫苗组合物而使动物具免疫性。在一实施方案中，疫苗组合物含有本发明的抗原和佐剂。在一个优选的实施方案中，对本发明的疫苗组合物有用的佐剂包含卵磷脂，油，以及表面活性剂。用优选的佐剂配制而成的疫苗组合物含卵磷脂从大约0.25％到大约12.5％(v/v)，更好是从大约0.5％到大约5％，最好是从大约0.5％到大约1.25％(v/v)；油的含量从大约1％到大约23％(v/v)，更好是从大约3.5％到大约10％，最好大约4.5％；以及两亲性表面活性剂的含量从大约1.5％到大约6％(v/v)，更好是从大约1.5％到大约4％，最好大约2％(v/v)。优选的情况是佐剂含有两种两亲性表面活性剂，例如吐温和斯潘表面活性剂，其中一种主要在疫苗组合物的水相中(例如吐温80)，另一种在油相中(例如斯潘80)。更好的是，当用吐温80和斯潘80作为表面活性剂时，前者的浓度是后者浓度的大约1.5到大约3倍，最好是大约2倍。优选的佐剂含有一种水载体溶液，例如，磷酸盐缓冲盐水(PBS)(例如Dulbecco PBS)。适合用于疫苗组合物的佐剂的卵磷脂和油是卵磷脂在DRAKEOLTM 5 Lt矿物油中的混合物。卵磷脂可从Central Soya，Fort Wayne，Indiana获得。参见美国第5,084,269号专利(讨论佐剂组合物)。吐温和斯潘表面活性剂可从VanWaters和Rogers，Omaha，Nebraska获得。
在另一个实施方案中，本领域知道的佐剂，例如，油乳剂，氢氧化铝，胞壁酰二肽，氢氧化锌钙，avridine，氢氧化铝，油类以及皂草苷类都可用于本发明的疫苗组合物，如美国第5,846,527；5,417,971；5,232,690号专利(讨论佐剂)中所述。
一种优选的疫苗制剂，其佐剂组合物的体积含量是从大约10％到大50％，更好的是从大约15％到大约35％，再好的是从大约20％到大约30％，最好是大约25％。
疫苗制剂可以药物或治疗组合物形式施用于患者本身。含抗原的药物组合物通过常规的混合，溶解，制粒，包糖衣，磨碎，乳化，做成胶囊，包封或冻干过程制造。药物组合物可用传统的方法配制，利用一种或多种生理上可接受的载体，稀释剂，赋形剂或者辅助剂，这些都有利于加工本发明的抗原成为能够进行药用的制备物。适当的制剂取决于所选择的施药途径。
系统制剂包括专为注射施用，例如皮下，真皮内，肌内或者腹膜内注射而设计的制剂。
为了注射，可将抗原配制在水溶液中，更好的是配制在生理上相容的缓冲液，诸如Hanks溶液，Ringer溶液，磷酸盐缓冲的盐水，或者任何其它生理盐水缓冲液中。溶液可含有配制剂诸如悬浮剂，稳定剂和/或分散剂。或者，为了使其在使用之前能用合适的载体，例如，用无菌无热原水组配，可将蛋白质制作成粉末状。
除了前面所描述的制剂外，也可将抗原制成贮存制剂。这种长时间作用的配制品可通过植入(例如皮下植入或肌内植入)或肌内注射的方式施用。这样，例如，抗原可与合适的聚合或疏水材料(例如作为可接受油中的乳剂)或者离子交换树脂配制在一起，或者作为少量可溶性衍生物，例如作为少量可溶性盐。
或者，也可以使用其它的药物送递系统。脂质体和乳剂是可用于传送抗原的送递载体的公知的例子。虽然通常使用有机溶剂时要付出代价(毒性较大)，某些有机溶剂如二甲基亚砜也可以使用。另外，可利用持续释放系统(例如包含治疗剂或接种剂的固体聚合物的半透性基质)传送抗原。本领域技术人员已确定了各种持续释放物质。取决于持续释放物质的化学性质，持续释放胶囊剂在几周到超过100天的时间内释放抗原。取决于药剂的化学性质和生物稳定性，可以采用一些使抗原稳定的附加策略。
本领域技术人员完全有能力确定施用抗原的有效量，特别是按照这里详尽公开的内容。
估计有效剂量最初是从体外测定做起。例如，选择一定剂量，利用本领域十分熟悉的技术去诱导动物模型中的免疫反应。本领域普通技术人员都能按照这里所描述的结果，很容易给出各种动物种类的最佳施用剂量。剂量和时间间隔可进行个别调整。例如，当用作为疫苗时，在大约2-36周时间内可施用本发明抗原大约1-3剂。随后可进行定期的加强免疫接种。可选择的方案适用于个别动物。合适剂量的抗原是指一定量的抗原按如上所述方法施用时，能够在被免疫的动物体内引起免疫反应，并且足以保护动物在至少4到12个月内免受猪红斑丹毒丝菌感染。
按照灭活时培养物的光密度(E625)，规定一剂中抗原的量为一浊度单位。如果在灭活时，光密度是4.0，那么，例如，从培养物制备的1ml的培养物上清液或滤液将含有4个浊度单位，0.5ml将含有2个浊度单位等，尽管引起浑浊的原因-细菌细胞已被除去。如果一种上清液，例如，其每毫升包含5个浊度单位，将其通过分子过滤浓缩12倍，则每毫升浓缩液就有60个浊度单位。一般来说，在一剂疫苗中抗原的含量范围是大约1到大约12个浊度单位，更好是从大约2到大约4个浊度单位。合适的剂量多少将随着注射途径和宿主的大小而变化，典型是从0.1到大约5ml。更可取的是，当宿主是猪时，猪的年龄至少应有两周。
实施例
以下所示的接种研究证明：具有1号佐剂的疫苗(如这里所述)，当以2剂的用法施用于大约3和6周大的小猪时，能够在进行第二次接种之后20周提供显著的保护作用-抵抗毒性的攻击。在第二次接种后的两周内，具1号佐剂的抗原也诱发了如血清酶联免疫吸附测定滴度所示的实质上的抗体反应，但在毒性攻击期，这些滴度有所减少并且个别滴度不与保护作用密切相关。在皂苷佐剂中的相同抗原以相同的方法施用引起更低的酶联免疫吸附测定滴度，证明在第二次接种后20周抗原不足以保护小猪免受毒性攻击。
毒性攻击模型作用十分明显，因为在毒性攻击后所有10头对照猪都产生了丹毒的临床症状(表2)。三头猪体温达到了高的温度标准，另外五头猪呈猪红斑丹毒丝菌培养物阳性。余下的两头猪无上述的任一症状；然而，它们在几天内情绪抑郁，并且出现了该疾病的损害特征一转移性皮肤损伤，因此被人为地杀死。相反，用含1号佐剂的疫苗接种的一组，20头猪中有15头得到完全的保护(表3)。
具有1号佐剂的含有本发明的猪红斑丹毒丝茵抗原的实验疫苗，当以2剂的用法施用于大约3和6周大的小猪时，能够在进行第二次接种后的20周提供显著的保护作用，免受毒性攻击一避免临床性丹毒的产生，见下文表3。此外，一种具有皂苷佐剂的类似实验疫苗，当按照相同的用法施用于小猪时，在进行第二次接种后的20周没有保护小猪免受毒性攻击以避免临床性丹毒的产生。最后，包含本发明抗原的接种疫苗，不论使用什么佐剂，都引起实质上的血清学反应，该反应在第二次接种后两周达到高峰。
以下列说明性但非限制性的实施例描述本发明。
实施例1.猪红斑丹毒丝菌培养物
猪红斑丹毒丝菌菌株CN3342在含Difco 蛋白胨(浓度为2.75％)、Difco酵母提取液(0.55％)、吐温80(0.2％)、K2HPO4(0.217％)及KH2PO4(0.061％)(在去离子水中)的培养基中培养。用5N NaOH调节培养基pH值到7.2。培养基在至少122℃温度下蒸汽灭菌30-90分钟。在高压灭菌后，加入50％的无菌葡萄糖溶液至其终浓度为3％(w/v)。
制备工作种子培养物，先从冷冻存储处(-70℃)移取一低温管的菌种，迅速融化，无菌操作转移至装有培养基的三角瓶中。在37℃条件下培养三角瓶12到36小时，随时摇动，并通过革兰氏染色检查纯度。当发现纯培养物时，将培养物与无菌甘油(10％)混合，每1ml分装在一低温管中，冷冻存储。
含生产培养基的种子容器用0.01-2％的主种子或工作种子接种。装有10到100升生产培养基的种子发酵罐，当使用时，用种子瓶中1-5％的培养物接种。装有200-10,000升生产培养基的生产发酵罐用0.5-5％的培养物接种。
在37±2℃条件下搅拌温育生产培养物。温育时间从4-24小时不等。在整个温育期将无菌氢氧化钠溶液(10N)加至培养物中，以保持pH值为7.2±0.1。在生长期内，定期加入葡萄糖。
在收获之前，要用显微镜检查培养物的纯度，细胞形态，以及革兰氏反应。通过测定培养物在625nm处的光密度来监视细菌生长。当培养物在625nm处的光密度为4.0或更高时，将其收获。
实施例2.猪红斑丹毒丝菌疫苗的制备
将福尔马林溶液加至培养物中，终浓度为0.5％(v/v)用于灭活培养物。将培养物转移到无菌罐中，放置在37±2℃的温箱中至少24小时(最多60小时)，并不断搅拌。不进行立即处理的培养物在2-8℃下储存可达7天。已灭活的培养物通过连续流动离心机澄清。保留液体组分用于进一步加工，弃去细菌。
在实验中，制作猪红斑丹毒丝菌培养物滤液的10倍浓缩液，培养物用终浓度为0.1％(v/v)的β-丙内酯(“BPL”)或者终浓度为0.2％(v/v)的福尔马林灭活(在37℃下至少24小时)。进行对猪红斑丹毒丝菌培养物滤液中发现的64-66kDa蛋白质(Groschup等，1991，流行性传染病，107：637-649以及美国第5,625,038号专利)特异的酶联免疫吸附测定(ELISA)以确定在64-66kDa蛋白质存在条件下灭活及稳定的效果。与早期的研究结果一致，用福尔马林灭活培养物降低了蛋白质的酶联免疫吸附测定(ELISA)值，BPL浓缩液具有大约4倍于福尔马林浓缩液的测定值。在37℃下培养14天后，BPL浓缩液大约失去其值的80％，相比之下福尔马林浓缩液大约是40％。然而，两种情况下，作为稳定剂预先加入30％(v/v)REHYDRAGELTM(参见以下内容)，阻止了大部分该种损失的发生，对于福尔马林制剂来说实际上阻止了所有损失的发生。用猪作的一次小的研究结果表明，在保护猪抵抗毒性猪红斑丹毒丝菌攻击方面，用福尔马林灭活的培养物液体组分比用BPL灭活的培养物液体组分更有效。
在离心之后通过空纤维过滤(标称分子量截断值X10,000千道尔顿)浓缩液体6倍到20倍(通常大约为10倍)。浓缩后再通过加入氢氧化铝凝胶稳定液体。
为了稳定免疫原，边搅拌边慢慢加入氢氧化铝凝胶至浓缩液，使其终浓度为30％(v/v)(30体积的凝胶至70体积的浓缩液中)。稀释浓缩液20倍后铝凝胶在疫苗中含量仅大约1.5％，不足以在注射部位造成负反应。一种确定铝凝胶量的滴定法，需要吸附浓缩10倍的猪红斑丹毒丝菌培养物液体组分中的所有保护性蛋白，结果表明超过95％的蛋白由32％(v/v)REHYDRAGELTM(Reheis，Berkeley Heights，新泽西)吸附。将乙基汞硫代水杨酸钠(也就是MERTHIOLATETM)(Dimportex，西班牙，通过Flavine公司，Klosters，新泽西进口)作为防腐剂加至产物中，其终浓度为大约0.01％(w/v)。乙基汞硫代水杨酸钠在抗原组合物中以及含本发明抗原的疫苗组合物中的浓度保持在大约0.01％(w/v)。加入EDTA至终浓度大约为0.07％(w/v)(Sigma，St.Louis，密苏里)。
使用的佐剂是1号佐剂。1000ml的1号佐剂由200ml过滤灭菌的卵磷脂-油溶液(DRAKEOLTM矿物油中的10％卵磷脂)，高压灭菌的吐温80(56ml)和斯潘80(24ml)，以及磷酸盐缓冲的盐水(DulbeccoPBS)(720ml)制得。卵磷脂-油溶液和斯潘80混合于一无菌罐中，室温下放置至少1小时直到完全乳化。盐水和吐温80混合于一无菌罐中，室温下放置至少1小时。用Ross乳化剂将油混合液和水混合液乳化。通过再循环过程继续乳化直到所有的佐剂都已加入到盐水中。然后在室温下将乳化液两次通过Gaulin压机。佐剂在2-8℃下存储。
5L的疫苗，通过将1L的佐剂加入到3L的水相制作而成。水相包括足够的稳定浓缩液，使抗原的终含量为每2ml剂量的疫苗为3.2个浊度单位，附加足够的盐水使体积达到5L。浊度单位被定义为收获时的光密度(E625)乘以浓缩因子。
实施例3.猪的猪红斑丹毒丝菌接种和攻击
使用猪红斑丹毒丝菌的第八代传代培养物(MS+8)，菌株CN3342生产疫苗。使用一剂量水平的稳定的、澄清的猪红斑丹毒丝菌抗原(3.2个浊度单位[“OU”])，正如从培养物灭活时的光密度(OD)计算而来的结果。一OU等于1ml OD(在625nm处测定)为1的液体。用1号佐剂或者皂苷(0.05％(w/v)，从Berghausen化学公司，Cincinnati，俄亥俄获得)作为佐剂。具体地说，使猪红斑丹毒丝菌培养物，菌株CN3342，生长至OD为5.28。用0.5％福尔马林灭活培养物24小时。灭活之后，通过离心去除细菌。液体部分以标称分子量截断值为10,000kDa的超滤单位浓缩，大约被浓缩13.4倍。通过加入REHYDRAGELTM(30％(v/v))至浓缩物中而稳定化抗原。将吸附的浓缩物在4℃下存储直到用于配制疫苗。疫苗与1号佐剂或者作为佐剂的0.05％皂苷配制在一起。将稳定化的抗原稀释至盐水(150mM氯化钠和4mM磷酸盐)中达到终浓度。将乙二胺四乙酸(EDTA，0.07％)和乙基汞硫代水杨酸钠(0.01％)加入到最后的疫苗配制物中。磷酸盐缓冲的盐水用作为安慰剂。表1总结了治疗组(疫苗治疗)及接种和受攻击的小猪数。
表1.治疗(疫苗)组接种和受感染的小猪数
    治疗组     抗原     佐剂   接种的小猪数   受攻击的小猪数
    T01     安慰剂     无     16     10
    T02     3.2OU     1号佐剂     26     20
    T03     3.2OU     皂苷     16     10
对照组结果令人满意，感染效果由高体温(至少在连续两天内体温为40.9℃[105.6°F]或更高)，验尸时的培养物和/或感染猪红斑丹毒丝菌后所特有的临床症状明显可见。考虑该疾病所特有的临床症状包括突然死亡，抑郁症，腹部和耳部充血，转移性皮肤损伤，或者关节僵硬以及与关节有关的病症。杀死那些具有临床症状但体温并未达高温标准的猪，培养其血液，脾，和肝试图从中分离猪红斑丹毒丝菌。
按照Fisher的准确测定法，确定是否得到保护的猪的比例因不同疫苗而有所区别(P＜0.05)。构造一优化对照实验，将每一剂量组与对照组相比以及将每一组与其它所有剂量组的平均值相比。利用逻辑回归来求疫苗种类与每一组小猪的血清学反应之间的关系，实验分别对2个月，3个月，4个月，5个月大以及预先攻击出血的小猪进行。攻击时疫苗诱导的滴度与疾病状况(得到保护/未得到保护)之间的关系用逻辑回归来估计。用5％的显著性水平表明这种相互关系是真的。
从IA，Albert市，Riddeli农场获得二十头对猪红斑丹毒丝菌的酶联免疫吸附测定血清学滴度比较低(800#)的怀孕母猪/小母猪，将其圈放在内布拉斯加州大学兽医和生物科学系的隔离房间中。在如下的全细胞直接抗原结合酶联免疫吸附测定中确定血清学滴度。参见美国第4,918,163号专利，该专利描述了如何制备有抗原涂层的平板以及如何在ELISA中利用这样的平板。首先，如实施例1中描述的方法培养猪红斑丹毒丝菌，从对数期培养物将其收获。记录其在640nm处的光密度，通过不同光密度的溶液中细菌数目建立的表格，将记录的光密度值转换成细胞/ml。将活细菌稀释在PBS(Dulbecco PBS，Sigma，St.Louis，密苏里)中至密度大约为1.1×109细胞/ml。稀释在FBS中的活细菌结合在平板上用于ELISA。为了制备平板，将PBS中100μl的0.1％(v/v)戊二醛(Sigma，St.Louis，密苏里)加入到每一孔中，盖住各孔，同时将平板在37℃温育1小时。从每一孔中除去PBS中的戊二醛，用毛巾吸干各孔。将PBS中100μl的活细菌(密度大约为1.1×109细胞/ml)加至每一孔中。平板在22℃条件下以2000rpm的速度离心5分钟。然后，将PBS(FVA/PBS)中200μl的1％聚乙烯醇(Aldrich，密尔沃基，威斯康星)加至每一孔中，覆盖各孔，将平板在4℃下放置过夜。转移平板上孔中内容物到一杀菌溶液中，同时用PBS冲洗各孔。用纱布覆盖孔，在室温下干燥(大约1小时)。
如下所述，利用带有结合细菌整个细胞抗原的平板进行ELISA过程。首先，将猪血清稀释到1％PVA/PBS中，包括阳性对照血清。所有未知血清按1∶50稀释，1∶200时作为阳性对照。将每一种样品的200μl加至一连串的孔(A列)中。余下的孔中加入100μl的1％FVA/FBS。将连续稀释2倍的每一种样品的稀释液浇至B-H行。覆盖孔并在37℃温育1小时。然后，用PBST冲洗孔三次。将100μl在1％PVA/PBS中制备的1∶2000的山羊抗猪IgG(H & L)过氧化物酶缀合物(Kirkegaardand Ferry，Gaithersburg，Maryland)加入到每一孔中，再次覆盖各孔，在37℃温育1小时。用PBST冲洗孔三次。将100μl的从Kirkegaard andFerry，Gaithersburg，Maryland获得的ABTS底物(2，2′-连氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)加至各孔中，在室温下温育平板10分钟。在微型平板振荡器上摇动平板10秒，利用平板读数器读取每一孔在405-490nm处的吸收值。每一种未知血清的终点滴度是血清的稀释度，其中吸收值大于阳性对照的1∶3200稀释液的吸收值。
在母猪分娩前0-10天抽取血样，以确定它们的猪红斑丹毒丝菌抗体滴度。基于母猪的血清学滴度及分娩日期，随机选取小猪。抽取由这些母猪/小母猪生产的五十八(58)头小猪的血样，并在其3周大时猪红斑丹毒丝菌两种实验用疫苗之一或安慰剂(表1中所列组)为其接种。大约4周大时给小猪断奶。大约6周大时抽取小猪的血样，用相同的疫苗接种。在大约2个月，3个月，4个月和5个月大时抽取所有猪的血样。在大约5 1/2月大时，从研究中移出所有余下的猪。在大约6个月大时(第二次接种后20周)抽取猪的血样，用2ml的猪红斑丹毒丝菌毒性培养物(237小鼠LD50，1.74×109菌落形成单位/ml)对40头猪进行肌内攻击，猪红斑丹毒丝菌毒性培育物来自国家兽医服务机构实验室提供的培养物。通过攻击前2天，攻击当天，以及攻击后7天动物的直肠温度来监测动物疾病的临床症状。从研究中取出任何达到升高的直肠温度标准(40.9℃)的对照动物，用注射用青霉素治疗。任何有疾病临床症状，但并未达到升高直肠温度标准的对照动物都被人为地杀死，验尸，培养全血，脾和肝的样品研究猪红斑丹毒丝菌。对任何死亡的对照动物进行验尸，培养脾和肝的样品研究猪红斑丹毒丝菌。从研究中取出任何达到升高的直肠温度标准(40.9℃)和/或具有疾病临床症状的接种的动物，用注射用青霉素治疗。对任何攻击后死去的接种的动物进行验尸并培养脾和肝样品用于研究猪红斑丹毒丝菌。通过上述的ELISA确定对猪红斑丹毒丝菌抗体滴度，并确立了抗体滴度与临床保护之间的相互关系。
确定血清的ELISA滴度，该血清来自取自母猪的单一血液样品和取自小猪的7个取样期的所有血清样品。对血液和/或死猪或致死注射杀死的猪的肝和脾的样品进行好氧细菌的培养(48小时，37℃，血液琼脂)。
结果：对照猪的猪红斑丹毒丝菌攻击结果总结于表2。所有的10头猪都呈猪红斑丹毒丝菌阳性。
表2：用猪红斑丹毒丝菌攻击的对照猪(T01)
猪的数量        直肠温度(40.9℃) 临床症状**   治疗的(T)，死亡的(D)或人为杀死的(K)   猪红斑丹毒丝菌分离结果
    两天*     仅一天
    3017     -     是     是     K     阴性
    3022     -     -     是     D     阳性
    3031     是     -     是     T     无样品
    3046     -     -     是     K     阴性
    3063     -     是     是     K     阳性
    3073     是     -     是     T     无样品
    3085     是     -     -     T     无样品
    3090     -     是     是     K     阳性
    3103     -     是     是     K     阳性
    3110     -     -     是     D     阳性
*两天-连续两天内直肠温度升高超过40.9℃
**临床症状-临床症状包括情绪抑郁和/或转移性皮肤损伤
用猪红斑丹毒丝菌攻击用含有1号佐剂的疫苗接种的猪(T02)的结果总结于表3。20头猪中15头(75％)得到完全的保护。
表3：猪红斑丹毒丝菌攻击用含有1号佐剂的疫苗接种的猪的结果
  猪的数量       直肠温度(40.3℃) 临床症状**   治疗的(T)，死亡的(D)或人为杀死的(K)   猪红斑丹毒丝菌分离结果
    两天*     仅一天
    3006     -     是     -     -     无样品
    3010     是     -     是     T     无样品
    3011     -     是     是     T     无样品
    3025     -     -     -     -     无样品
    3029     -     是     -     -     无样品
    3030     -     -     -     -     无样品
    3033     -     -     -     -     无样品
    3038     -     -     -     -     无样品
    3047     -     -     -     -     无样品
    3052     -     -     -     -     无样品
    3059     -     -     -     -     无样品
    3071     -     -     -     -     无样品
    3088     -     -     -     -     无样品
    3093     -     -     -     -     无样品
    3098     是     -     是     T     无样品
    3100     -     -     -     -     无样品
    3112     -     -     -     -     无样品
    3114     是     -     是     T     无样品
    3115     -     是     -     -     无样品
    3140     -     是     是     D     阳性
*两天-连续两天内直肠温度升高超过40.3℃
**临床症状-临床症状包括情绪抑郁和/或转移性皮肤损伤
用猪红斑丹毒丝菌攻击用具有皂苷佐剂的疫苗接种的猪(T03)的结果总结于表4。只有一头猪得到保护。
表4：用猪红斑丹毒丝菌攻击用具有皂苷佐剂的疫苗接种的猪(T03)的结果
  猪的数量       直肠温度(40.9℃) 临床症状**   治疗的(T)，死亡的(D)或人为杀死的(K)   猪红斑丹毒丝菌分离结果
    两天*   仅一天
    3014     是     -     是     T     无样品
    3024     -     是     是     T     无样品
    3034     是     -     是     T     无样品
    3041     是     -     是     T     无样品
    3048     是     -     是     T     无样品
    3062     -     是     是     T     无样品
    3075     -     是     -     -     无样品
    3095     是     -     是     T     无样品
    3102     -     是     是     T     无样品
    3106     -     是     是     T     无样品
*两天-连续两天内直肠温度升高超过40.3℃
**临床症状-临床症状包括情绪抑郁和/或转移性皮肤损伤
小猪各组ELISA滴度的几何均值如表5中所列。
表5：所有治疗组ELISA滴度的几何均值
  治疗组                             血清获得时间(大约时间)
预先接种1 预先接种2   2个月   3个月     4个月   5个月     攻击前
    01     33.5     35.9   108.8   153.9     88.4   329.8     233.2
    02     40.0     259.6   8903.9   1871.8     519.2   596.4     556.5
    03     28.7     162.3   1712.9   527.2     199.8   302.8     459.0
*01-安慰剂
02-在1号佐剂中抗原的浊度单位为3.2
03-皂苷佐剂中抗原的浊度单位为3.2
在第一次接种时小猪对猪红斑丹毒丝菌特异的抗体滴度较低。这些滴度的范围从小于50到200。在对照小猪中，研究期间GMT略微有所增长，表明ELISA对老猪的特异性差些。
以1号佐剂或者皂苷作为佐剂的疫苗都引发了统计学上显著的(P＝0.0001)血清学反应，反应在第二次接种后两周(小猪大约2个月大)时达到高峰。两组的滴度都随时间稳步降低(直到大约5个月大时)，接收1号佐剂中抗原的小猪的GMT显著高于接收皂苷中抗原的小猪的GMT。在对小猪进行攻击的时候，接收1号佐剂中抗原的小猪的GMT高于对照组小猪的GMT两倍多，而接收皂苷中抗原的小猪的GMT低于对照组的GMT不到两倍。小猪受攻击后得到保护(免于临床疾病)与个体ELISA滴度无关(P＞0.05)。然而，令人感兴趣的观察结果是，接收1号佐剂中抗原的小猪在第二次接种后两周达到峰滴度。在用1号佐剂中的抗原接种的20头小猪中，八头猪的峰滴度大于或等于2800(8/8得到保护免受攻击)，八头猪的峰滴度为6400(6/8得到保护免受攻击)，还有4头猪的峰滴度为3200(1/4得到保护免受攻击)，这表明滴度为6400或更大是延长的保护作用的标志。
总的来说，所有10头未接种的对照猪均受到感染。用具有1号佐剂的疫苗接种的20头猪中，15头得到保护。用具有皂苷佐剂的疫苗接种的10头猪中，只有一头得到了保护。
实施例4.用铝凝胶稳定化抗原
按照实施例1-3所述的方法制备疫苗，包括用铝凝胶处理抗原。在猪身上进行疫苗功效试验。猪断奶大约3周时以一剂2ml的剂量对其进行肌内(IM)接种，三周后进行第二剂接种。对照组接收磷酸盐缓冲的盐水作为安慰剂。在猪大约9周大时通过肌内注射毒性猪红斑丹毒丝菌检验免疫性。如表6中所示，在9周大时进行接种可得到100％的保护。在给猪接种时此疫苗已有12个月之久。结果证明保护性抗原已得到成功稳定。
表6：保护猪抵抗丹毒
攻击时年龄 对照组(得到保护的/受攻击的) 接种组(得到保护的/受攻击的)
9周 0/10  19/19
注释：第20头猪除外。一头十分倔强的动物，当对其进行处理时它反抗非常强烈，以致于在其休息时也未能测得其体温。这头猪在受到攻击后保持完全健康状态。
本发明并不只限于实施例的实施方案，实施例是用来说明本发明单一方面的，任何具有同等功效的抗原及疫苗组合物都属于本发明范围。的确，除这里所描述的一些对本发明的改进之外，基于前面的描述本领域技术人员可明显看出对本发明的各种改进。这样的改进方案应落在附加的权利要求范围之内。
这里所引用的出版物以其全部内容作为本文的参考。

Claims (11)

1.一种抗原组合物，该组合物包含一种来自猪红斑丹毒丝菌培养物的液体组分和一种稳定剂，其中所说的猪红斑丹毒丝菌培养物是灭活的。
2.权利要求1的抗原组合物，其中所说的稳定剂是一种金属氢氧化物或金属磷酸盐。
3.权利要求1的抗原组合物，其中所说的稳定剂是氢氧化铝凝胶，磷酸铝凝胶，磷酸钙凝胶，氢氧化锌/氢氧化钙凝胶或者明矾。
4.权利要求1的抗原组合物，其中所说的猪红斑丹毒丝菌培养物是用福尔马林或者β-丙内酯灭活的。
5.权利要求1的抗原组合物，其中所说的液体组分经浓缩3倍到30倍。
6.一种疫苗组合物，该组合物包含权利要求1的抗原组合物和佐剂组合物。
7.按照权利要求6的疫苗组合物，其中在所说的疫苗组合物中所说的佐剂组合物包含0.25％-12.5％(v/v)的卵磷脂，1％-23％(v/v)的油以及1.5％-6％(v/v)的两亲性表面活性剂。
8.一种制作抗原组合物的方法，该方法包括添加稳定剂至来自猪红斑丹毒丝菌培养物的液体组分中，其中所说的猪红斑丹毒丝菌培养物是灭活的。
9.权利要求1的抗原组合物在制造用于保护动物使之免受猪红斑丹毒丝菌感染的药物中的应用。
10.权利要求9的应用，其中所说的动物是猪。
11.权利要求6的疫苗组合物在制造用于保护动物使之免受猪红斑丹毒丝菌感染的药物中的应用。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8637047B2 (en) * 2003-10-30 2014-01-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Erysipelothrix rhusiopathiae-haemophilus parasuis vaccine and methods of using the same
CN107496913A (zh) * 2017-09-15 2017-12-22 天津瑞普生物技术股份有限公司 猪丹毒、猪细小病毒、猪流感病毒三联灭活疫苗制备方法
CN107648599A (zh) * 2017-09-18 2018-02-02 天津瑞普生物技术股份有限公司 一种猪丹毒、猪细小病毒二联灭活疫苗的制备方法
CN110812473A (zh) * 2019-12-10 2020-02-21 广东君睿生物技术研究有限公司 一种副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪多杀性巴氏杆菌病三联灭活疫苗及其制备方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0294071A3 (en) * 1987-06-03 1990-08-01 Merck & Co. Inc. Hepatitis b vaccines made with pre-formed aluminum hydroxide gels, and processes thereof
US5695769A (en) * 1990-06-13 1997-12-09 Pfizer Inc. Pasteurella multocida toxoid vaccines
CA2123222C (en) * 1991-11-15 2001-02-27 Donald A. Dearwester Gram-negative bacterial vaccines
US5690942A (en) * 1995-06-02 1997-11-25 American Home Products Corporation Adjuvants for viral vaccines
JP3072345B1 (ja) * 1999-03-31 2000-07-31 農林水産省家畜衛生試験場長 豚丹毒菌の組換えサブユニットワクチン

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