CN1917900A - 猪红斑丹毒丝菌－副猪嗜血菌疫苗及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种组合物和一种改进的抗猪红斑丹毒丝菌的单剂量疫苗以及一种改进的抗猪红斑丹毒丝菌和副猪嗜血菌的单剂量疫苗，这种疫苗具有以下一种或多种功效：1)赋予抗猪红斑丹毒丝菌和/或副猪嗜血菌的有效免疫力；2)降低出现猪红斑丹毒丝菌和/或副猪嗜血菌感染临床病征的风险；3)诱导抗猪红斑丹毒丝菌和/或副猪嗜血菌的免疫应答；和4)具有至少4个月的抗猪红斑丹毒丝菌和/或副猪嗜血菌的DOI。所述组合物或猪红斑丹毒丝菌疫苗以及猪红斑丹毒丝菌－副猪嗜血菌联合组合物或疫苗分别含有灭活的猪红斑丹毒丝菌细菌组分和合适的佐剂。所述猪红斑丹毒丝菌－副猪嗜血菌联合组合物或疫苗还含有一定量的副猪嗜血菌抗原。所述疫苗可以任何方便的方式给予动物。肌内给药的剂量宜小于5ml。各剂量中猪红斑丹毒丝菌和/或副猪嗜血菌抗原的量应足以在接受该疫苗或组合物的动物内诱导免疫应答，并赋予有效免疫力持续适当时间和降低出现猪红斑丹毒丝菌和/或副猪嗜血菌感染所导致的临床病征的风险。

Description

猪红斑丹毒丝菌-副猪嗜血菌疫苗及其使用方法

                              发明背景

发明领域

本发明涉及猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix Rhusiopathiae，E.rhusiopathiae)疫苗和副猪嗜血菌(Haemophilus Parasuis，H.parasuis)疫苗。更具体地说，本发明涉及能赋予抗猪红斑丹毒丝菌和副猪嗜血菌有效免疫力的疫苗以及这种疫苗的制造方法。再具体地说，本发明涉及可以单剂量施用并提供所需长时间免疫力(DOI)的疫苗。再具体地说，本发明涉及一种单剂量疫苗，其提供的DOI等于接受该疫苗的动物的平均寿命。

现有技术描述

猪红斑丹毒丝菌是一种可导致50多种脊椎动物和非脊椎动物发病的革兰氏阳性菌，其中包括猪、绵羊、羔羊、牛、鸭、火鸡和人。副猪嗜血菌是一种导致许多动物尤其是猪发病的革兰氏阴性菌。抗猪红斑丹毒丝菌和副猪嗜血菌的疫苗通常是分开的疫苗，在动物一生中需给予多剂量才能提供抵抗猪红斑丹毒丝菌和副猪嗜血菌的有效免疫力。现有的抗副猪嗜血菌的疫苗可以单剂量给予，但仍需单独给予抗猪红斑丹毒丝菌的免疫接种。如本领域所熟知，需要多次剂量接种的疫苗的问题包括需要追踪动物接受了第一次和/或第二次或后续剂量的时间和费用，追踪第一次剂量给予的时间和费用，进行实际免疫接种所需的时间和费用，给予第一此剂量和后续剂量期间动物体积的增加，对动物和对给予后续剂量疫苗的人造成损伤的风险增加，以及与提供多次剂量有关的费用。

本领域需要的是一种可赋予接受免疫接种的动物有效免疫力的一次剂量方案，该疫苗提供的DOI长于目前疫苗的时间。还需要只给予一次剂量而能提供约6个月的COI的抗猪红斑丹毒丝菌疫苗。还需要抗猪红斑丹毒丝菌和副猪嗜血菌的疫苗，在给予这种疫苗一次剂量后可提供约6个月的DOI。

                          发明概述

本发明克服了现有技术的缺点并显著超越了该技术的现状。具体地说，本发明提供了一种以一次剂量给予的疫苗，所述疫苗提供了以下一种或多种功效：1)赋予抗猪红斑丹毒丝菌的有效免疫力；2)降低出现猪红斑丹毒丝菌感染临床病征的风险；3)诱导抗猪红斑丹毒丝菌的免疫应答；和4)具有至少4个月，更优选至少约5个月，最优选至少约6个月的DOI。本发明还提供了一种联合疫苗，该疫苗可提供以下一种或多种功效：1)赋予抗猪红斑丹毒丝菌和/或副猪嗜血菌的有效免疫力；2)降低出现猪红斑丹毒丝菌和/或副猪嗜血菌感染临床病征的风险；3)诱导抗猪红斑丹毒丝菌和/或副猪嗜血菌的免疫应答；和4)具有至少4个月，优选至少约132天，更优选至少5个月，最优选至少约6个月或至少约162天的的抗猪红斑丹毒丝菌和/或副猪嗜血菌的DOI。有些是，所述联合疫苗也优选以一次剂量给予。

猪红斑丹毒丝菌疫苗含有灭活的猪红斑丹毒丝菌细菌组分和合适的佐剂。所述佐剂可根据给药方法来选择，可包括矿物油基佐剂如如弗氏完全和不完全佐剂，Montanide不完全Seppic佐剂如ISA，水包油型乳液佐剂如Ribi佐剂系统，含有胞壁酰二肽的syntax佐剂配方，或铝盐佐剂。优选地，所述佐剂是矿物油基佐剂，最优选ISA206(SEPPIC，巴黎，法国)。所述组合物还可含有任何一种药学上可接受的载体或赋形剂或其组合，其中包括但不限于缓冲剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂和增溶剂。该疫苗被给予易受猪红斑丹毒丝菌感染的动物，优选哺乳动物，更优选猪，可以任何方便的方式给药，其中包括口服、鼻内、肌内、淋巴结内、真皮下、腹膜内、皮下及其组合，但最优选通过肌内(IM)注射给药。肌内给药的剂量优选至多约为5ml，更优选为1-3ml，最优选约为2ml。

猪红斑丹毒丝菌-副猪嗜血菌联合疫苗含有灭活的猪红斑丹毒丝菌和副猪嗜血菌细菌组分以及合适的佐剂。优选所述佐剂是矿物油基佐剂，最优选ISA206。该疫苗被给予易受猪红斑丹毒丝菌和/或副猪嗜血菌感染的动物，优选哺乳动物，更优选猪，可以任何常规方式给药，其中包括口服、鼻内、肌内、淋巴结内、真皮下、腹膜内、皮下及其组合，但最优选通过肌内(IM)注射给药。当选择IM注射作为给药途径时，优选的剂量至多约为5ml，更优选为1-3ml，最优选约为2ml。各个剂量中猪红斑丹毒丝菌抗原的量应足以为用这种疫苗免疫接种的动物提供有效抵抗和降低出现猪红斑丹毒丝菌感染导致的临床病征的风险的免疫力。猪红斑丹毒丝菌抗原的量优选应至多约为5ml，更优选约为0.2-3ml，再优选约为0.3-1.5ml，更优选约为0.4-0.8ml，再优选约为0.6ml。各个剂量中副猪嗜血菌抗原的量应至多约为5ml，更优选约为0.1-3ml，再优选约为0.15-1.5ml，更优选约为0.2-0.6ml，再优选约为0.4ml。用不同的测定方法，各个剂量中副猪嗜血菌抗原的量应含有至少1.5×10⁷cfu/剂，更优选约为1.5×10⁸-1.5×10¹⁰cfu/剂，再优选约为1.5×10⁹cfu/剂。在特别优选的2ml的剂量中，猪红斑丹毒丝菌抗原约0.6ml，佐剂约1.0ml，副猪嗜血菌抗原约0.4ml。优选所述细菌用常规灭活技术尤其是常规的福尔马林灭活技术灭活的。

本发明的疫苗和组合物通常作为免疫应答-刺激治疗或预防疫苗以诱导动物的免疫应答。优选地，给予本发明的组合物或疫苗导致保护用各种途径接种疫苗的动物的免疫应答，包括减轻猪红斑丹毒丝菌和/或副猪嗜血菌感染的严重性或延迟临床病征的发作。再优选地，给予所述组合物或疫苗导致发生猪红斑丹毒丝菌和/或副猪嗜血菌感染临床病征的风险降低，即使接触猪红斑丹毒丝菌和/或副猪嗜血菌毒株攻击后亦是如此。在特别优选的形式中，给予所述组合物或疫苗导致完全可以预防这些临床病征。

可用各种常规方法来确定是否在动物体内诱导出免疫应答。例如，可用猪红斑丹毒丝菌和/或副猪嗜血菌的毒株攻击接受所述组合物或疫苗的动物并观察攻击后的一段时间内出现的感染的临床病征。测定给予所述组合物或疫苗是否诱导出免疫应答的另一种方法是检测该动物的生物样品中抗猪红斑丹毒丝菌和/或副猪嗜血菌抗原的一种或多种抗体。这种方法在本领域是常见的，且可由精通本领域的技术人员确定合适的抗体测定法。

                        优选实施方案详述

以下实施例列出了本发明的优选实施方案。应理解，这些实施例只是为了阐述而不是要限制本发明的范围。

                            实施例1

该实施例提供了在给予优选的一次剂量副猪嗜血菌-猪红斑丹毒丝菌疫苗之后产生的抗毒性猪红斑丹毒丝菌免疫力的效果和持续时间。

材料和方法

该实施例一种研究了37只3-4周龄的猪，没有一只曾接种过丹毒丝菌属的菌苗或疫苗。在整个研究中为动物提供足以满足其体重、年龄和其它身体特征的食物。随意饮水。将动物关养在全部或部分板条地板、机械通风和适合该年龄动物的补充加热和光照的封闭猪圈中。

研究前2天对所有的猪进行一次健康检查并接种假狂犬病病毒。在研究的第1天将猪分成两组。组1有23只猪，它们在第1天在左颈接受了一次副猪嗜血菌-猪红斑丹毒丝菌菌苗和佐剂ISA 206(″HPE″)(Boehringer Ingelheim Vetmedica，Inc.，St.Joseph，MO)的2mL的肌内剂量。每种剂量中猪红斑丹毒丝菌抗原的含量为0.6mL收获抗原。对照组组2的14只猪根本未接受过任何治疗。在研究的第21、54和161天采集所有动物的血液以监测疫苗接种后的血清阳转。

在该实施例的第162天用猪红斑丹毒丝菌的强毒株EL-6P攻击所有的猪(但在第162天之前已经死于偶然原因的3只猪除外)。然后观察所有猪7天内的一般健康和猪红斑丹毒丝菌的临床病征。攻击后的第7天对所有的动物实施安乐死并对哪些显示出持久临床病征和/或如9CFR 113.67中所列猪红斑丹毒丝菌典型症状的连续2天体温升高的动物进行尸体剖检。对实验期间死亡的所有动物也进行尸体剖检。评估并记录可见病损，收集组织并送实验室作细菌培养。

上述过程的概述列于表1。

                             表1

天	工作
		1	将猪随机分组。组1的猪接受HPE，组2接受未接种疫苗的对照处理
21	采集所有猪的血液
		54	采集所有猪的血液
160-169	在攻击前2天到攻击后7天每天观察并测量体温
		161	采集所有猪的血液
162	用猪红斑丹毒丝菌EL-6P#3攻击猪
		169	实验结束

结果和讨论：

组2的所有13只猪都被感染并显示出体温升高超过106.5，这是猪红斑丹毒丝菌感染的临床病征，或是用猪红斑丹毒丝菌强毒株攻击之后死亡。从组2的13只猪中的9只以及攻击后死亡的组2的13只猪中的6只中回收到猪红斑丹毒丝菌。相反，组1的21只猪中有20只仍是健康的并且可在接种疫苗162天后免遭猪红斑丹毒丝菌强毒株攻击的影响。从组1中唯一一只攻击之后不健康的猪中未回收到猪红斑丹毒丝菌。表2包括发病率结果和分析，表3包括死亡率结果。

                      表2-发病率

	受猪红斑丹毒丝菌感染的猪的数目	未受猪红斑丹毒丝菌感染的猪的数目	猪的总数
				组1	1	20	21
组2	13	0	13

	卡方	P值
			未校正的：	23.2	.0000014
Mantel-Haenszel：	22.4	.0000022
			Yate校正的：	19.7	.000009

                            表3-死亡率

	攻击后死亡的猪的数目	攻击后存活的猪的数目	猪的总数
				组1	0	21	21
组2	6	7	13

	卡方	P值
			未校正的：	11.7	.0006
Mantel-Haenszel：	11.4	.0007
			Yate校正的：	8.8	.0029

与对照相比，接种疫苗162天后用猪红斑丹毒丝菌强毒株攻击的免疫接种动物受到很好保护。未接种疫苗的对照动物100％都发病了并有46％在攻击之后死亡。相反，单剂量HPE保护了95％受攻击的猪且接受疫苗的猪在攻击之后无一死亡。该研究结果证实，一次剂量的HPE方案在3周龄或更大的幼猪中诱导了持续时间至少为162天的预防和控制丹毒发生的免疫力。

                           实施例2

该实施例显示了优选的一次剂量疫苗在接种后诱导了抗副猪嗜血菌强毒株的免疫力持续时间。

材料和方法：

该实施例一种研究了36只3-4周龄的猪，无一只猪曾接种过副猪嗜血菌的菌苗或疫苗。在整个研究中为动物提供足以满足其体重、年龄和其它身体特征的食物。随意饮水。

在该实施例的第1天将猪分成两组。组1有23只猪，它们在第1天接受了一次副猪嗜血菌菌苗和佐剂ISA 206(″HPB″)(Boehringer Ingelheim Vetmedica，Inc.，St.Joseph，MO)的2mL的肌内剂量。每种剂量中副猪嗜血菌抗原的含量为1.5×10⁹cfu/剂。对照组组2包含13只根本未接受任何处理的动物。

在该实施例的第132天，组2的11只猪和组1的17只猪是健康的并适合用副猪嗜血菌的强毒株攻击。未接受攻击的8只猪(6只来自组1，2只来自组2)不健康，或者死于与接种无关的原因。然后观察7天所有猪的一般健康和副猪嗜血菌的临床病征。必要时对实验期间死亡的所有动物进行尸体剖检并取出组织进行死因的细菌确认。攻击后的第7天对所有的动物实施安乐死并对哪些显示出持久临床病征和/或作为副猪嗜血菌典型症状的连续2天体温升高的动物进行尸体剖检。评估并记录可见病损，收集组织送实验室作细菌培养。

上述过程的概述列于表4。

                           表4

天	工作
		1	将猪随机分组。组1的猪接受HPB，组2接受未接种疫苗的对照处理
130-139	在攻击前2天到攻击后7天每天观察并测量体温
		132	用副猪嗜血菌攻击猪
139	实验结束

结果和讨论：

对照组的11只猪中的8只显示出副猪嗜血菌感染的临床病征，尸体剖检显示这11只猪中有7只具有副猪嗜血菌典型的算后检查损伤。总共有6只对照猪在攻击后死亡，其中有5只具有副猪嗜血菌典型的可见病损。在至少2只猪中出现了一些导致最终侧卧(recumbency)的严重的临床病征。在尸体剖检时这些猪还具有副猪嗜血菌典型的损伤。在8只受到感染的对照猪中，6只的细菌培养呈副猪嗜血菌阳性。其余的3只猪未显示任何副猪嗜血菌所致疾病的病征。

相反，组1的17只猪中有16在接种疫苗132天后免遭副猪嗜血菌强毒株攻击的影响。组1中有1只猪在攻击后死亡。从组1中唯一一只攻击后死亡的猪中未回收到副猪嗜血菌，然而，其算后检查损伤与该病的出现相一致。表5包括发病率结果和分析，表6包括死亡率结果。

                      表5-发病率

	受副猪嗜血菌感染的猪的数目	未副猪嗜血菌感染的猪的数目	猪的总数
				组1	1	16	17
组2	8	3	11

	卡方	P值
			未校正的：	13.6	.0002
Mantel-Haenszel：	13.1	.0003
			Yate校正的：	6.0	.0139

                         表6-死亡率

	攻击后死亡的猪的数目	攻击后存活的猪的数目	猪的总数
				组1	1	16	17
组2	6	5	11

	卡方	P值
			未校正的：	8.4	.0037
Mantel-Haenszel：	8.1	.0043
			Yate校正的：	6.0	.0139

与对照相比，接种疫苗132天后用副猪嗜血菌强毒株攻击的免疫接种动物受到很好保护。未接种疫苗的对照动物在攻击之后有73％发病并有55％死亡。相比较，一次剂量HPB保护了94％受攻击的猪。与对照相比，免疫接种的动物具有统计学上显著降低的副猪嗜血菌死亡率。该研究结果证实，一次剂量HPB方案在3周龄或更大幼猪中的免疫力持续时间至少为132天。

                            实施例3

该实施例描述了制备本发明疫苗的优选方法。

材料和方法

猪红斑丹毒丝菌-副猪嗜血菌菌苗组合物分别含有猪红斑丹毒丝菌和副猪嗜血菌的菌株SE-9和Z-1517。这些菌株已经保藏于ATCC并被分别指定保藏号为PTA-6261和PTS-6262。每种的种子菌株(seed material)可通过特征性生长模式、革兰氏染色反应和生化试验来鉴定。可通过能否杀死小鼠和/或在易感猪中造成临床病征来确定种子菌株的毒力。

猪红斑丹毒丝菌生长培养基的组成列于表7。副猪嗜血菌生长培养基的组成列于表8。

                      表7

	成分	含量
			VPI盐溶液	无水氯化钙	0.2g
	无水硫酸镁	0.2g
				磷酸二氢钾	1.0g
	碳酸氢钠	10.0g
				氯化钠	2.0g
	RO水  加至	1000.0mL
			25％葡萄糖溶液
	葡萄糖	250.g
				RO水  加至	1000.0mL
生产用种菌和产品培养基
				牛肉糊	2.0g
	朊蛋白胨3	20.0g
				七水硫酸钠	8.0g
	细菌用酵母	40.0g
				葡萄糖	8.167g
	吐温80	1.36mL
				RO水  加至	1000.0mL

(注意：为制备种子产品和培养基产品，应加入10N NaOH或5N HCl将pH调至8.6并且应该是经热力灭菌的)

                                    表8

	成分	含量
			5％NAD培养基原液
	B-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸	5.0g
				L-半胱氨酸	1.0g
	RO水        加至	100.0mL
			2M Tris溶液
	TRIS(羟甲基)氨基甲烷	121.14.g
				RO水        加至	500.0mL
生产用种菌培养基
				胰蛋白酶大豆肉汤	5.7g
	3.6％SAG 730防沫剂溶液	1.8mL
				RO水	842.2mL
热力灭菌并无菌添加：
				含有非必需氨基酸的无菌10X极限必需培养基	95.0mL
	15％无菌新鲜酵母提取液	9.6mL
				5％NAD原液	9.6mL
	证明合格的新生小牛血清	38.0mL
				2M Tris溶液	2.2mL

(注意：5％NAD原液应通过0.2微米滤器无菌过滤并冷冻储存。2M Tris溶液应经热力灭菌并低温储存。)

猪红斑丹毒丝菌和副猪嗜血菌种菌培养物的菌株都应生长在500-20,000mL的容器中。它们的生产培养物生长在20-1000L的容器中。这两种菌株的主种菌和工作种菌应在-60℃以下储存。

为制备用来接种的猪红斑丹毒丝菌悬液，使主种菌(Master seed)回到液相并将1-2mL接种到工作种菌培养基中。然后使培养物在34-38℃静态生长6-24小时。然后通过在5％羊血琼脂培养基上的集落表现、细胞形态和革兰氏染色检测培养物的纯度。加入等体积的稳定剂并分散到冷冻管(cryotube)中供储存。

为制备用来接种的副猪嗜血菌悬液，使主种菌回到液相并接种到工作种菌培养基中。然后使培养物在34-38℃搅拌生长12-18小时。然后通过在5％羊血琼脂培养基上的集落表现、细胞形态和革兰氏染色检测培养物的纯度。加入等体积的稳定剂并分散到冷冻管中供储存。

为接种猪红斑丹毒丝菌，将1-12mL工作种菌(Working Seed)接种到含有500-18,000mL培养基的玻璃容器中以制备生产用种菌(Production Seed)。最多将5％(v/v)生产用种菌接种到在20-1000L容器内的15-750L培养基中以制备生产培养物(Production Culture)。通过在5％羊血琼脂培养基上划线、在34-38℃培育24-48小时并观察集落形态来检测生产培养物的纯度。

为接种副猪嗜血菌，将1-10mL工作种菌接种到含有500-18,000mL培养基的玻璃容器中以制备生产用种菌。最多将7％(v/v)生产用种菌接种到在20-1000L容器内的14-750L培养基中以制备生产培养物。通过在5％羊血琼脂培养基上划线、在34-38℃培育18-24小时并观察集落形态来检测生产培养物的纯度。

为培育猪红斑丹毒丝菌，将种菌培养物(Seed Culture)在34-38℃需氧培育34-38小时。将生产培养物在34-38℃需氧培育6-12小时，可任选搅拌。为培育副猪嗜血菌，将种子和生产培养物在34-38℃搅拌培育6-18小时，期间可任选喷射压缩空气。

在猪红斑丹毒丝菌的生长期中，用2M Tris控制pH，并在培育期间用肉眼观察培养物以了解异常生长或污染征兆。接种前培养基是混浊的。随着生长增加，将观察到沉淀物。然后取出样品以确定透光度％。通过在5％羊血琼脂培养基上的集落形态和/或革兰氏染色确定纯度。肉眼观察到非常混浊说明已经可以收获培养物了。这将在接种生产培养物后6-12小时发生。

对于副猪嗜血菌，在培育期间用肉眼观察培养物以了解异常生长或污染征兆。取出样品直接计数。通过在添加有NAD划线的5％羊血琼脂培养基上的集落形态和/或革兰氏染色确定纯度。肉眼观察到非常混浊及pH降低(＜7.0)说明已经可以收获培养物了。这将在接种生产培养物后6-12小时发生。

对于这两种菌株，对每种生产培养物取样进行纯度检测和确定百分透光度，并为每种生产培养物准备灭活用的容器。对于猪红斑丹毒丝菌，生产培养物必需显示出所述典型生长，620nm的百分透光度＜40％，且无污染证据。对于副猪嗜血菌，生产培养物的显微镜计数为≥25×10⁷细菌/mL且无任何污染证据。

通过在所述生产培养物中加入福尔马林至0.5％(v/v)来灭活这两种菌株。灭活在20-38℃下进行12-72小时，可任选搅拌。灭活的产品然后储存于2-7℃。通过标准技术来证实灭活。

佐剂ISA 206的加入量为30-65％(w/v)。通过与ISA 206一起均质(homgenization)来乳化灭活的培养物。可在组分或产品中加入35％的亚硫酸氢钠溶液以中和游离的甲醛。可在组分中加入甲醛溶液或与产品混合使其在最终产品中的浓度不超过0.2％。

然后在截止分子量为100,000的利用中空纤维过滤的无菌闭环系统中浓缩所得产品，或通过无菌倾析静置过的培养物来浓缩，以使浓度最高达到2×10¹⁰细菌/mL。

用百分透光度和浓度来标准化猪红斑丹毒丝菌。用直接生物计数来标准化副猪嗜血菌。

                           实施例4

该实施例证实了不同疫苗组分组装成的本发明的优选疫苗。

材料和方法

本发明的疫苗可将90,000mL猪红斑丹毒丝菌培养物(代表90,000mL透光度为40％的猪红斑丹毒丝菌培养物)、56,250mL副猪嗜血菌培养物(代表56,250mL每毫升含有4×10⁹细菌的副猪嗜血菌培养物)、2,250mL无菌RO水、150,000mL ISA 206和1,500mL 35％的无菌亚硫酸氢钠溶液混合制成。如果需要还可用35％的无菌亚硫酸氢钠溶液来中和甲醛的水平使其成为0.2％的甲醛溶液。通过加入10N氢氧化钠或5N盐酸将所得混合物的pH调至6.2-7.2。

这种混合物可提供的猪红斑丹毒丝菌浓度与0.3-0.9mL透光度为40％的收获培养物相等，且每2mL剂量中有至少1.5×10⁹个副猪嗜血菌。

Claims (41)

1.一种组合物，所述组合物含有：

一定量的猪红斑丹毒丝菌抗原；

一定量的副猪嗜血菌抗原；和

佐剂。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物中所述猪红斑丹毒丝菌抗原的量为，当给予易受猪红斑丹毒丝菌感染的动物时可有效降低出现猪红斑丹毒丝菌感染临床病征的风险的量。

3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述猪红斑丹毒丝菌抗原的有效量至多约为5ml。

4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述副猪嗜血菌抗原的量为，当给予易受副猪嗜血菌感染的动物时可有效降低出现副猪嗜血菌感染临床病征的风险的量。

5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述副猪嗜血菌抗原的有效量至多约为5ml。

6.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述副猪嗜血菌抗原的有效量含有至少1.5×10⁷cfu/剂。

7.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述佐剂含有矿物油基底。

8.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物可有效诱导抵抗选自副猪嗜血菌、猪红斑丹毒丝菌及其组合的病原体感染的免疫应答。

9.一种以单次剂量给予后能有效降低出现猪红斑丹毒丝菌感染临床病征风险的疫苗，其特征在于，所述疫苗含有：

一定量的猪红斑丹毒丝菌抗原；和

佐剂。

10.如权利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗还含有一定量的副猪嗜血菌抗原。

11.如权利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述猪红斑丹毒丝菌抗原的量至多约为5ml。

12.如权利要求10所述的疫苗，其特征在于，所述副猪嗜血菌抗原的量为有效降低出现副猪嗜血菌感染临床病征的风险的量。

13.如权利要求10所述的疫苗，其特征在于，所述副猪嗜血菌抗原的量至多约为5ml。

14.如权利要求10所述的疫苗，其特征在于，所述副猪嗜血菌抗原的有效量含有至少1.5×10⁷cfu/剂。

15.如权利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述佐剂含有矿物油基底。

16.如权利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗在给予后至少4个月内可降低出现猪红斑丹毒丝菌感染临床病征的风险。

17.如权利要求10所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗在给予后至少4个月内可降低出现副猪嗜血菌感染临床病征的风险。

18.如权利要求10所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗可有效诱导抵抗选自副猪嗜血菌、猪红斑丹毒丝菌及其组合的病原体感染的免疫应答。

19.一种降低动物出现由于选自副猪嗜血菌、猪红斑丹毒丝菌及其组合的病原体感染导致的临床病征的风险的方法，所述方法包括：

给予易受副猪嗜血菌或猪红斑丹毒丝菌感染的动物一种组合物，所述组合物包含一定量的猪红斑丹毒丝菌抗原、一定量的副猪嗜血菌抗原以及佐剂。

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述给药步骤通过肌内注射进行。

21.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述猪红斑丹毒丝菌抗原的量至多约为5ml。

22.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述副猪嗜血菌抗原的量至多约为5ml。

23.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述副猪嗜血菌抗原的量含有至少1.5×10⁷cfu/剂。

24.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述佐剂含有矿物油基底。

25.如权利要求19所述的方法，其特征在于，降低所述动物出现副猪嗜血菌或猪红斑丹毒丝菌感染临床病征的风险可持续至少132天。

26.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述给药步骤降低动物出现由于副猪嗜血菌和猪红斑丹毒丝菌感染导致的临床病征的风险。

27.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：用副猪嗜血菌或猪红斑丹毒丝菌的有毒菌株攻击动物来验证所述动物患病风险的降低以及监测所述动物出现所述临床病征。

28.一种诱导针对副猪嗜血菌或猪红斑丹毒丝菌感染的免疫应答的方法，所述方法包括：

给予易受副猪嗜血菌或猪红斑丹毒丝菌感染的动物一种组合物，所述组合物包含一定量的猪红斑丹毒丝菌抗原、一定量的副猪嗜血菌抗原以及佐剂。

29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述给药步骤通过肌内注射进行。

30.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述猪红斑丹毒丝菌抗原的量至多约为5ml。

31.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述副猪嗜血菌抗原的量至多约为5ml。

32.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述副猪嗜血菌抗原的量含有至少1.5×10⁷cfu/剂。

33.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述佐剂含有矿物油基底。

34.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述动物针对副猪嗜血菌或猪红斑丹毒丝菌感染的免疫应答持续至少4个月。

35.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述给药步骤诱导抵抗副猪嗜血菌和猪红斑丹毒丝菌感染的免疫应答。

36.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：用副猪嗜血菌或猪红斑丹毒丝菌的有毒菌株攻击动物来验证所述动物的免疫应答以及检测所述免疫应答。

37.一种制备组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

混合一定量的副猪嗜血菌抗原、一定量的猪红斑丹毒丝菌抗原以及佐剂，来制备混合物；和乳化所述混合物。

38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述方法还包括灭活所述副猪嗜血菌抗原和猪红斑丹毒丝菌抗原来源菌株的步骤。

39.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述副猪嗜血菌抗原来自Z-1517菌株。

40.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述猪红斑丹毒丝菌抗原来自SE-9菌株。

41.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述方法还包括标准化所述组合物以提供已知有效量的副猪嗜血菌和猪红斑丹毒丝菌抗原的步骤。