CN111467488A - 一种水溶性复合免疫佐剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种水溶性复合免疫佐剂以及一种口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗。所述水溶性复合免疫佐剂包括0.5‑0.6％卡波姆，1％‑3％左旋咪唑，1‑2％海藻糖、0.3‑2％棉子糖、0.5‑1.5％葡聚糖、0.5‑1.5％山梨醇、0.5‑1％甘露醇、0.5‑1.5％木糖醇、0.2‑2％聚乙二醇3350、1‑5％聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯(TPGS)。该水溶性复合免疫佐剂不含矿物油，机体易于吸收，组织损伤与应激反应小。本发明还涉及口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗和冻干疫苗联合免疫的应用。

Description

一种水溶性复合免疫佐剂及其应用
技术领域
本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及一种水溶性复合免疫佐剂，包含该水溶性复合免疫佐剂的口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗，及其在与冻干疫苗联合免疫中的应用。
背景技术
口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdisease virus，FMDV)引起的偶蹄动物烈性接触性传染病，主要危害牛、羊、猪、骆驼等，发病率极高，传播速度极快，对各国的畜牧业有着巨大的危害。口蹄疫病毒属于小RNA病毒科，口蹄疫病毒属。目前已知有7个血清型，A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3、Asia1，每个血清型又有很多亚型。我国流行3个血清型，这三个血清型也是致病力最强、分布最广泛的，分别为O型、A型以及Asia1型。
目前，口蹄疫的防控措施主要是以广泛的大面积免疫预防为主，配合以扑杀疫区内的病畜和易感动物并在周围10公里范围内进行环形预防注射。疫苗接种是特异性预防FMD的有效手段，制备安全有效的疫苗是成功地预防、控制乃至最终消灭FMD的先决条件。FMD灭活疫苗具有良好的免疫原性，在预防和控制FMD的过程中发挥着重要作用。
佐剂是制备兽用疫苗的重要组成成分。佐剂加强免疫反应的机理非常复杂，至今尚未完全清楚。佐剂的作用主要包括：①改变正常免疫机能，吸引大量抗原呈递细胞加工处理抗原；②改变抗原的构型，使抗原物质降解并加强其免疫原性；③延长抗原在组织内的贮存时间，使抗原缓慢降解和释放，并发挥免疫系统的细胞间协同作用(抗原呈递细胞与T细胞，T细胞与B细胞)(参见CN107375922A)。
佐剂有油佐剂，水性佐剂，微生物佐剂等。
微生物作为佐剂能够增强机体免疫应答很早之前就有报道。20世纪50年代，革兰氏阴性菌的脂多糖被证实具有免疫佐剂的功效。随着对微生物类佐剂研究的不断深入，越来越多的微生物被证实具有佐剂功效，目前已被发现具有佐剂功效的微生物类佐剂大致有:分枝杆菌及某些百日咳杆菌、绿脓杆菌、布氏杆菌、大肠杆菌、魏氏梭菌的脂多糖及结核杆菌素等；革兰氏阳性菌有葡萄球菌、短小棒状杆菌、链球菌、乳杆菌等。实验表明，当这些微生物或其产物与免疫疫苗同时注入时，具有明显增强机体特异性免疫应答的功效。
口蹄疫灭活疫苗通常用ISA 206油佐剂。这类免疫佐剂可以促进多种抗原诱导生物机体产生高效价的抗体，使抗原连续刺激的时间相对延长，抗原接种的剂量减少，抗原接种的次数降低，在动物疫苗中得到了广泛的应用，但是这种佐剂在生物机体内起作用的同时也会伴随着一些安全隐患和副作用，如造成组织损伤、应激反应、矿物油的残留，以及可能致癌等，影响肉类品质与动物食品安全。因此需要一种新的口蹄疫灭活疫苗佐剂来避免或减少目前的口蹄疫油佐剂灭活疫苗免疫后的安全隐患和副作用。
随着疫病防控意识的提高，当前畜牧养殖业对细菌引起的相关疾病已经由药物治疗转为疫苗免疫防控，因此动物需要免疫的疫苗种类随之增加，这不仅增加了兽医工作量，使劳动成本提高，也会导致动物频繁的应激反应，降低动物生长速度。例如，口蹄疫疫苗是国家强制性免疫疫苗的一种，猪牛羊均需要免疫此疫苗；大多数细菌疫苗多为冻干苗，使用前需要稀释后再进行肌肉注射，如梭菌冻干苗，链球菌冻干苗，布鲁氏菌冻干苗等。因此急需要一种可以一针多免的联合免疫方法，可以将例如口蹄疫疫苗和细菌冻干苗联合免疫，以便降低劳动成本与动物应激反应，提高经济效益。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的不足，提供一种水溶性复合免疫佐剂(或称复方水佐剂)。本发明的另一目的在于提供上述水溶性复合免疫佐剂在制备疫苗特别是口蹄疫灭活疫苗中的应用，及上述水溶性复合免疫佐剂的口蹄疫灭活疫苗与冻干苗特别是细菌冻干苗联合免疫的应用方法。
本发明涉及一种水溶性复合免疫佐剂，其中组分及含量为：0.5～0.6％卡波姆，1～3％左旋咪唑，1～2％海藻糖、0.3～2％棉子糖、0.5～1.5％葡聚糖、0.5～1.5％山梨醇、0.5～1％甘露醇、0.5～1.5％木糖醇、0.2～2％聚乙二醇3350、1～5％聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯(TPGS)。
作为本发明的一种实施方式，本发明的水溶性复合免疫佐剂包含0.55％卡波姆，2％左旋咪唑，1.5％海藻糖、1％棉子糖、1％葡聚糖、1％山梨醇、0.8％甘露醇、0.8％木糖醇、0.5％聚乙二醇3350、2％TPGS。
本发明的水溶性复合免疫佐剂能保证口蹄疫灭活病毒抗原的稳定性，在4℃条件下12个月的时间灭活病毒抗原的含量几乎没有下降，能使口蹄疫病毒抗原保存时间延长，在生产过程和冷链运输过程中保护口蹄疫病毒146S抗原稳定；有利于建立口蹄疫病毒抗原库，提高口蹄疫病毒抗原液中146S抗原低温储存的稳定性。本发明提供的口蹄疫病毒抗原保护剂的配方简单，配比合理，易于大规模生产的操作。
本发明还涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括本发明的水溶性复合免疫佐剂和免疫原；优选地，所述免疫原为口蹄疫病毒抗原。
本发明还涉及一种口蹄疫(复方)水佐剂灭活疫苗，其中，所述口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗包括本发明的水溶性复合免疫佐剂。该口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗包括口蹄疫灭活病毒抗原，该口蹄疫灭活病毒抗原选自A型、O型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型、或Asia1型口蹄疫灭活病毒抗原；所述口蹄疫灭活病毒抗原含量≥108.0TCID50/mL。
作为本发明的一种实施方式，本发明的口蹄疫灭活疫苗中，所述口蹄疫灭活病毒抗原为猪口蹄疫病毒O/Mya98/XJ/2010株灭活全病毒抗原，或牛口蹄疫病毒A/AKT-Ⅲ株灭活全病毒抗原。
O/Mya98/XJ/2010株和A/AKT-Ⅲ株可商业上获得，例如从中国农业科学院兰州兽医研究所(兰兽研)和新疆维吾尔自治区畜牧科学院兽医研究所商购。
本发明的一个方面，涉及本发明的水溶性复合免疫佐剂在制备疫苗中的应用，优选地所述疫苗为兽用疫苗；更优选地，所述疫苗为口蹄疫灭活疫苗。
本发明的一个方面，还涉及本发明的水溶性复合免疫佐剂在制备与冻干疫苗联合免疫的口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗中的应用。其中，所述口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗的口蹄疫灭活病毒抗原为A型、O型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型、或Asia1型口蹄疫灭活病毒抗原；所述口蹄疫灭活病毒抗原含量为≥108.0TCID50/mL，优选地，所述口蹄疫灭活病毒抗原为猪口蹄疫病毒O/Mya98/XJ/2010株灭活全病毒抗原，或牛口蹄疫病毒A/AKT-Ⅲ株灭活全病毒抗原。在口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗中口蹄疫抗原146S含量为2-6μg/mL。
本发明的一个方面，还涉及本发明的水溶性复合免疫佐剂在制备口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗与冻干疫苗联合免疫的药物中的应用。换句话说，本发明的水溶性复合免疫佐剂用于口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗与冻干疫苗的联合免疫。
本发明还涉及口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗与冻干苗联合免疫，口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗的抗原选自A型、O型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型、或Asia1型口蹄疫灭活病毒抗原，优选地选自猪口蹄疫病毒O/Mya98/XJ/2010株灭活全病毒抗原或牛口蹄疫病毒A/AKT-Ⅲ株灭活全病毒抗原，能在免疫后第8周即产生1:1024的ELISA抗体效价，远早于同样抗原含量的油佐剂灭活疫苗。该冻干苗为细菌冻干苗，可以为结核冻干苗或布鲁氏菌冻干苗或魏氏梭菌或羊梭菌疫苗或猪链球菌冻干苗。
本发明的水溶性复合免疫佐剂不含矿物油，机体易于吸收，组织损伤与应激反应小。本发明的用于口蹄疫疫苗的水溶性复合免疫佐剂，既可以用于口蹄疫疫苗，又可以用于冻干疫苗的稀释注射，这不仅可以达到一针多免的目的，细菌冻干苗也可以起到增强口蹄疫疫苗免疫效果的作用。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1本发明口蹄疫疫苗的制备
1灭活抗原的制备
1.1病毒液的制备
1.1.1A型口蹄疫病毒液的制备
10000L生物反应器全悬浮培养BHK-21细胞，细胞密度达到3-5×106个/毫升时，按照病毒感染复数MOI 0.01-0.1接种口蹄疫病毒细胞适应株(牛口蹄疫病毒A/AKT-Ⅲ株，内蒙古必威安泰生物科技有限公司制备)，制备病毒原液，搅拌速度不超过40rpm，培养8-12h收获病毒液。
1.1.2O型口蹄疫病毒液的制备
10000L生物反应器全悬浮培养BHK-21细胞，细胞密度达到3-5×106个/毫升时，按照病毒感染复数MOI 0.01-0.1接种口蹄疫病毒细胞适应株(猪口蹄疫病毒O/Mya98/XJ/2010株，内蒙古必威安泰生物科技有限公司制备)，制备病毒原液，搅拌速度不超过40rpm，培养8-12h收获病毒液。
1.2病毒液的浓缩
将实施例1.1.1和1.1.2制备的病毒液分别经离心，并进行浓缩，使用制备型低速连续流离心机离心除去细胞碎片，同时收获上清和沉淀，沉淀在0.2％Triton-X-100存在的条件下裂解口蹄疫病毒感染细胞和细胞膜碎片，反复冻融3次后、超声3次；用制备型低速连续流离心机离心收集上清液，合并上清液，其中口蹄疫病毒滴度为≥108.0TCID50/mL。
1.3病毒液的纯化
1.3.1经深层过滤装置处理，即：病毒细胞培养液与深层过滤装置接触，以300L/m2/hr～500L/m2/hr的流速过滤具有约0.5pm～200pm的粒径分布的细胞碎片和颗粒，分离目的抗原与细胞碎片和颗粒；
1.3.2用中空纤维超滤系统或膜包浓缩纯化1.3.1初步纯化的抗原液；
1.3.3按照上一步纯化浓缩方法获得的抗原经过DEAE-Sepharose FF和Sephawse6FF两步层析柱；
1.3.4用二乙烯亚胺处理1.3.3步骤处理的抗原液进行灭活，硫代硫酸钠进行阻断。
1.4灭活抗原检验
将1.3制成的纯化口蹄疫病毒灭活抗原进行无菌检验，结果无菌生长。
2疫苗的制备
2.1水溶性复合免疫佐剂组分的筛选与制备
发明人经试验发现，海藻糖、棉子糖、葡聚糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、聚乙二醇3350、TPGS对口蹄疫灭活抗原有保护其降解的作用，可做水溶性复合免疫佐剂(即复方水佐剂)的候选试剂。
利用方阵法将海藻糖、棉子糖、葡聚糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、聚乙二醇3350、TPGS、卡波姆、左旋咪唑进行随机组合制备成复方水佐剂，再与1.4检验合格的口蹄疫病毒灭活抗原充分混匀制备不同复方水佐剂的口蹄疫灭活疫苗，其中口蹄疫抗原146S含量2-6μg/mL。用不同复方水佐剂的口蹄疫灭活疫苗，免疫BALB/C小鼠，并设立206油佐剂口蹄疫灭活疫苗对照组，每组10只，每只皮下注射复方水佐剂疫苗0.5ml，28天后摘取小鼠眼球采集外周血，并采集脾脏，制备脾细胞悬液，用T淋巴细胞亚群试剂盒(江苏江莱生物科技有限公司)对外周血淋巴细胞和脾脏进行T淋巴细胞亚群检测，计算淋巴细胞亚群CD4+/CD8+比值(平均值±标准差)。筛选适用于口蹄疫灭活疫苗的复方水佐剂的组方。选取淋巴细胞亚群CD4+/CD8+比值高于对照组的复方水佐剂疫苗对应的组方作为口蹄疫灭活疫苗的复方水佐剂，筛选结果见表1，复方水佐剂各组分见表2，复方水佐剂3疫苗免疫小鼠后检测外周血和脾脏的淋巴细胞亚群CD4+/CD8+比值均极显著高于对照组，复方水佐剂3为口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗中复方水佐剂的优选浓度。
表1淋巴细胞亚群检测
Figure BDA0002456415360000071
表2复方水佐剂各组分浓度
Figure BDA0002456415360000081
2.2口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗制备
将1.4检验合格的纯化后的口蹄疫病毒灭活抗原与表2中的复方水佐剂3，充分混匀制备口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗(疫苗中口蹄疫病毒灭活抗原146S含量2-6μg/mL)。
制备方法：称取卡波姆50g，加至9700mL去离子水中，静置4-8h待自然吸水充分溶胀后，看不到表面有白色粉，115℃高压灭菌30min，室温放置卡波姆胶冻物，使用前缓慢加入中和剂(灭菌的氢氧化钠溶液)调整pH值为7.4，用分散机低速搅拌均匀，使卡波姆胶冻物转化为水溶性状，加入PBS缓冲液配置的海藻糖、棉子糖、葡聚糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、聚乙二醇3350、TPGS、左旋咪唑无菌溶液(pH值为7.4)，使其终浓度满足复方水佐剂3的浓度，加入步骤1.4制备的检验合格的纯化后的无菌口蹄疫病毒灭活抗原，使其终浓度口蹄疫病毒灭活抗原146S含量为2-6μg/mL，加PBS缓冲液至1L，充分搅拌混匀，2～8℃保存，不宜超过12个月。
3疫苗的安全性和效力检验
3.1安全性试验
实施例1中2.2制备的口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗参照《中国兽药典》(2015年版四部)进行疫苗安全性检验，结果见表3-4。
表3 O/Mya98/XJ/2010株口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗安全性检验
Figure BDA0002456415360000091
表4 A/AKT-Ⅲ株口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗安全性检验
Figure BDA0002456415360000092
实施例2口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗效力检测
用6月龄FMDV抗体为阴性的犊牛，10头，每只颈部肌肉注射A/AKT-Ⅲ株口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗2mL，在第28天静脉采血，其血清进行液相阻断ELISA试验，通过测定抗体滴度判断疫苗的保护性。
用40kg左右，FMDV抗体为阴性的猪10头，每只耳后肌肉注射O/Mya98/XJ/2010株口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗2mL，在第21天静脉采血，其血清进行液相阻断ELISA试验，通过测定抗体滴度判断保护性。猪与牛的FMDV抗体效价均大于1：128，说明99％保护。
实施例3本发明的口蹄疫复方水佐剂疫苗的免疫效果监测
稀释后的口蹄疫灭活抗原与206佐剂按(V/V)46:54的比例混合乳化制成口蹄疫油佐剂疫苗。可以参照发明名称为《一种口蹄疫疫苗的制备方法》的专利申请(申请号201510236068.4)。
将制备的O型口蹄疫油佐剂疫苗(O/Mya98/XJ/2010株)和实施例1中2.2制备的O型口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗分别以常规剂量免疫30-45kg，FMDV抗体为阴性的猪8只。将所制备的A型口蹄疫油佐剂疫苗(A/AKT-Ⅲ株)和A型口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗分别以常规剂量免疫6月龄，FMDV抗体为阴性的牛8只。
分别于免疫后4周、8周、10周、12周、16周、18周、20周，ELISA测定FMDV抗体效价。
结果，常规的免疫剂量(146S含量为2-6μg/mL)口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗免疫猪在第8周后FMDV抗体效价均能达到1:1024，在第18周FMDV抗体效价均能处于大于1:1024的水平，而油佐剂疫苗直到16周才能实现免疫猪的FMDV抗体效价均达到1:1024，在第18周之后就下降到≤1:720，使用口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗免疫牛表现出相似的效果。因此本发明的口蹄疫水佐剂疫苗比油佐剂疫苗效价上升快，且持续时间更长(比较结果参见表5～8)。
表5 O型口蹄疫油佐剂灭活疫苗(O/Mya98/XJ/2010株)免疫效果监测
Figure BDA0002456415360000101
表6 O型口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗(O/Mya98/XJ/2010株)免疫效果监测
Figure BDA0002456415360000111
表7 A型口蹄疫油佐剂灭活疫苗(A/AKT-Ⅲ株)免疫效果监测
Figure BDA0002456415360000112
表8 A型口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗(A/AKT-Ⅲ株)免疫效果监测
Figure BDA0002456415360000121
实施例4口蹄疫复方水佐剂疫苗在4℃储存时间
为检测本发明水佐剂对口蹄疫抗原的保护作用，在4℃条件下，于2个月、4个月、6个月、8个月、12个月，根据专利申请CN102998378A公开方法检测添加了水佐剂和油佐剂的口蹄疫纯化抗原液146S含量。
具体检测结果见表9：
表9添加水佐剂和油佐剂的口蹄疫抗原纯化液抗原含量下降对比
Figure BDA0002456415360000122
从表9的结果可知，添加本发明水佐剂的口蹄疫抗原纯化液，4℃储存12个月后146S含量仍能达到77.86μg/mL，降解率仅为1.393％，添加油佐剂的口蹄疫纯化抗原液降解率为23.720％，远远高于添加了本发明水佐剂的口蹄疫抗原纯化液的降解率，说明本发明的复方水佐剂有保护口蹄疫抗原以减缓其降解的作用，可作为抗原库保护剂使用。
实施例5
口蹄疫复方水佐剂疫苗分别与布鲁氏菌疫苗(布氏菌病活疫苗(S2株)购自金宇保灵生物药品有限公司)和羊梭菌疫苗(多联必应—羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症四联干粉灭活疫苗购自哈药集团生物疫苗有限公司)联合免疫或者单独免疫。
40只口蹄疫抗体阴性、布鲁氏菌抗体阴性和羊梭菌抗体阴性的羊分5组进行免疫，第1组免疫实施例1中2.2制备的口蹄疫复方水佐剂疫苗，第2组免疫布鲁氏菌疫苗，第3组免疫羊梭菌疫苗，第4组口蹄疫复方水佐剂疫苗与布鲁氏菌疫苗联合免疫(一针多免方式)，第5组口蹄疫复方水佐剂疫苗与羊梭菌疫苗联合免疫(一针多免方式)。分别于免疫后4周、8周、10周、12周、16周、18周、20周进行采血检测。用口蹄疫病毒A型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒(购置中国农业科学院兰州兽医研究所)检测免疫口蹄疫复方水佐剂疫苗动物的口蹄疫抗体的效价；按照国家标准(GB T 18646-2018动物布鲁氏菌病诊断技术)规定中的虎红平板凝集试验(RBPT)方法检测免疫布鲁氏菌疫苗后动物血清中布鲁氏菌抗体情况。(布鲁氏菌虎红平板凝集试验抗原、布鲁氏菌阴阳性血清购自北京威瑞谷生物技术有限公司)。用羊梭菌病抗体试剂盒(购置北京绿源伯德生物科技有限公司)检测免疫羊梭菌疫苗动物的羊梭菌抗体的效价。结果，口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗单独免疫和联合免疫的羊在第8周后FMDV抗体效价均能达到1:1024，但联合免疫的抗体持续期到20周仍为1:1024，联合免疫方式也不会影响羊梭菌疫苗和布鲁氏菌疫苗的免疫效果。本发明的口蹄疫复方水佐剂疫苗单独使用和与羊梭菌疫苗或布鲁氏菌疫苗联合免疫的抗体效价上升均较快，但联合免疫持续时间更长，结果见表10-14。
表10 A型口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗(A/AKT-Ⅲ株)免疫效果监测
Figure BDA0002456415360000141
表11布鲁氏杆菌抗体虎红平板凝集检测
Figure BDA0002456415360000142
表12羊梭菌抗体检测
Figure BDA0002456415360000143
注：7/8表示8只免疫羊中有7只检测到抗体阳性。
表13 A型口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗(A/AKT-Ⅲ株)与布氏菌病活疫苗(S2株)联合免疫效果监测
Figure BDA0002456415360000144
Figure BDA0002456415360000151
表14 A型口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗(A/AKT-Ⅲ株)与羊梭菌疫苗联合免疫效果监测
Figure BDA0002456415360000152
Figure BDA0002456415360000161
实施例6
口蹄疫复方水佐剂疫苗与猪链球菌疫苗(科链净猪链球菌活疫苗(SS2-RD株购自武汉科前生物股份有限公)联合免疫。
24只口蹄疫抗体阴性，猪链球菌抗体阴性的猪分3组单独免疫，第1组免疫实施例1中2.2制备的口蹄疫复方水佐剂疫苗，第2组免疫猪链球菌疫苗，第3组进行口蹄疫复方水佐剂疫苗与猪链球菌疫苗联合免疫(一针多免方式)，分别于免疫后4周、8周、10周、12周、16周、18周、20周进行采血检测。用口蹄疫病毒O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒(购置中国农业科学院兰州兽医研究所)检测免疫口蹄疫复方水佐剂疫苗动物的口蹄疫抗体的效价；用猪链球菌2型ELISA抗体检测试剂盒(购置武汉科前生物股份有限公司)检测免疫猪链球菌疫苗动物的猪链球菌抗体的效价。结果，口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗单独免疫和联合免疫猪在第8周后FMDV抗体效价均能达到1:1024，一直持续到第18周，在第20周下降至1:720或1:360；但联合免疫的抗体效价持续到20周仍为1:1024，联合免疫也不会影响猪链球菌疫苗的免疫效果。对于本发明的口蹄疫复方水佐剂疫苗单独使用和联合免疫猪链球菌疫苗，两者的抗体效价上升均较快，但对于联合免疫，抗体效价≥1:1024的持续时间更长，结果见表15-17。
表15 O型口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗(O/Mya98/XJ/2010株)免疫效果监测
Figure BDA0002456415360000162
Figure BDA0002456415360000171
表16猪链球菌抗体检测
Figure BDA0002456415360000172
表17 O型口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗(O/Mya98/XJ/2010株)与猪链球菌冻干苗联合免疫效果监测
Figure BDA0002456415360000173
Figure BDA0002456415360000181
本发明的优点还在于：本发明创制的新型复方水佐剂比进口油佐剂成本降低1/3,大大降低了防控成本。本发明的口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗抗原含量高，免疫效果好，并且不含有任何油性成分，副作用最低。避免了因油佐剂疫苗粘稠引起的注射部位肉芽肿，有效提高养殖户的经济效益。该复方水佐剂口蹄疫灭活疫苗还可与多种细菌的冻干疫苗联合免疫(一针多免方式，就是用口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗溶解冻干疫苗，同时免疫)，降低劳动成本与动物应激反应，提高经济效益。
以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种兽用疫苗的水溶性复合免疫佐剂，其中，所述水溶性复合免疫佐剂包括0.5～0.6％卡波姆，1～3％左旋咪唑，1～2％海藻糖、0.3～2％棉子糖、0.5～1.5％葡聚糖、0.5～1.5％山梨醇、0.5～1％甘露醇、0.5～1.5％木糖醇、0.2～2％聚乙二醇3350、1～5％聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯。
2.根据权利要求1所述的水溶性复合免疫佐剂，其中，所述水溶性复合免疫佐剂包括0.55％卡波姆，2％左旋咪唑，海藻糖1.5％、棉子糖1％、葡聚糖1％、山梨醇1％、甘露醇0.8％、木糖醇0.8％、0.5％聚乙二醇3350、2％聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯。
3.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括权利要求1或2所述的水溶性复合免疫佐剂和免疫原。
4.一种口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗，其中，所述口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗包括权利要求1或2所述的水溶性复合免疫佐剂。
5.根据权利要求4所述的口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗，其中，所述疫苗包括口蹄疫灭活病毒抗原，所述口蹄疫灭活病毒抗原选自A型、O型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型、或Asia1型口蹄疫灭活病毒抗原；所述口蹄疫灭活病毒抗原含量为≥108.0TCID50/mL；
优选地，所述口蹄疫灭活病毒抗原为猪口蹄疫病毒O/Mya98/XJ/2010株灭活全病毒抗原，或牛口蹄疫病毒A/AKT-Ⅲ株灭活全病毒抗原。
6.权利要求1或2所述的水溶性复合免疫佐剂在制备疫苗中的应用。
7.权利要求1或2所述的水溶性复合免疫佐剂在制备与冻干疫苗联合免疫的口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其中，所述口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗的口蹄疫灭活病毒抗原选自A型、O型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型、或Asia1型口蹄疫灭活病毒抗原；所述口蹄疫灭活病毒抗原含量为≥108.0TCID50/mL，优选地，所述口蹄疫灭活病毒抗原为猪口蹄疫病毒O/Mya98/XJ/2010株灭活全病毒抗原，或牛口蹄疫病毒A/AKT-Ⅲ株灭活全病毒抗原。
9.一种水溶性复合免疫佐剂在制备口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗与冻干疫苗联合免疫的药物中的应用，其中所述口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗是权利要求4或5所述的口蹄疫复方水佐剂灭活疫苗。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的应用，其中所述冻干疫苗是细菌冻干疫苗，优选地所述冻干疫苗选自布鲁氏菌疫苗、羊梭菌疫苗、猪链球菌冻干苗。
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