TW546146B - Erysipelothrix rhusiopathiae antigens and vaccine compositions - Google Patents

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A7 B7 ¢46146 五、發明說明（1 ) 發明範圍 本發明係關於可預防或控制紅斑丹毒絲菌感染（丹毒 絲菌）之抗原組合物與疫苗調製劑及此類抗原組合物與疫 苗調製劑之製作和使用方法。 發明背景 丹毒絲菌之分佈廣汎，在歐洲、亞洲、澳洲、北美洲 以及南美洲的經濟上非常重要。年齡在3個月至3年的豬 隻最易感染丹毒絲菌。感染的豬隻常呈現關節腫脹及硬化 ，其體重增加率差。同時其畜體在包裝廠亦常遭檢驗員切 除或拋棄。 約1 0年前發現可不須要以死菌製作紅斑丹毒絲菌疫 苗。無細菌之濾液即使豬隻及老鼠免於劇毒的刺激。其後 曰本以及美國的科學家均曾發表文獻確認此一發現，同時 顯示紅斑丹毒絲菌在培養液中所釋放的抗原屬於一般抗原 ，其可使豬隻對所有的紅斑丹毒絲菌品系免疫（Sawada and Takahashi, 1 987, Am. J. Vet. Res. 48:239-242; Groschup et al, 1991，Epidemiol. Infect. 107:637-649)° Groschup et al發現在培養液中有一種6 4至6 6 kD a蛋 白質可使老鼠對抗劇毒的紅斑丹毒絲菌之刺激。此蛋白質 亦可保護豬隻，U S DA已提供抗此蛋白質之單株抗體（ m A b )疫苗標記物用於測定此蛋白質。 雖然非常須要能預防豬隻丹毒絲菌的有效疫苗，許多 傳統的丹毒絲菌疫苗尙無法令人滿意的保護斷奶的豬隻。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------^--------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ϋ ϋ ϋ ϋ n I n n n —φ I · -4 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 546146 A7 _ _ B7 五、發明說明（2 ) 其問題乃在於缺少持久免疫力。養豬工業須要一種從斷奶 時起即能保護豬隻對抗此種致命性、破壞性極大的疾病之 疫苗，直至屠宰年齡爲止（大約6個月）°USDA己依 此特定之須求頒布新疫苗之標準。 發明摘要 本發明係關於一種紅斑丹毒絲菌之抗原組合物及製作 此抗原組合物之方法。本發明亦關於含紅斑丹毒絲菌與輔 助劑抗原組合物之疫苗調製劑。本發明進一步的係關於使 用本發明抗原組合物之方法接種動物，較佳者爲哺乳類或 鳥類。尤其是，本發明係關於以本發明抗原接種豬、羊、 狗、馬、牛或人類之方法。 具體實施例之一中，穩定的抗原係來自以紅斑丹毒絲 培養菌之液體溶析份。其特色之一是在紅斑丹毒絲培養菌 上淸液或濾液（較佳者爲濃縮上淸液或濾液）中添加安定 劑。安定劑是一種能吸附抗原之藥劑。安定劑的非限制性 實施例爲氫氧化鋁凝膠、磷酸鋁凝膠、磷酸鈣凝膠、氫氧 化鋅/氫氧化鈣凝膠及明礬。在較佳的特色中，氫氧化鋁 凝膠是添加在濃縮上淸液中，氫氧化鋁凝膠之最終濃度約 10% v / V (即1 〇 %體積/體積濃度，例如混合9 倍體積之上淸液與1倍體積之氫氧化鋁凝膠）至約4 0 % v/v，更佳者約30% v/v。 另一特色中，調製疫苗組合物抗原時，內含濃縮紅斑 丹毒絲培養菌上淸液或濾液和安定劑之抗原係稀釋成約 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） • ϋ I n n I n ϋ ϋ ·ϋ ϋ ϋ ϋ · ϋ i m n n I I 一一 0, a^i I I ϋ ϋ —ϋ I ^^1 · ϋ ϋ ϋ m —ϋ 1 n ϋ n n n ! ϋ ϋ I — ϋ~ϋ ϋ ϋ ^1 ϋ _ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1546146 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（3 ) 1〇倍至約3 0倍，較佳者約2 0倍，因此在疫苗組合物 中安定劑濃度降至低於約5 % v / v。 另一具體實施例中，培養紅斑丹毒絲菌並製作得到包 含紅斑丹毒絲菌抗原之上淸液或濾液。另一特色中，將紅 斑丹毒絲培養菌去活性’例如添加福馬林或3 一丙內酯。 在另一特色中係自細菌中分離出紅斑丹毒絲菌培養液，例 如離心。另一特色中，將上淸液濃縮約1 〇倍，例如分子 過濾。 在本發明另一具體實施例中，抗原中係添加保存劑， 例如硫羥酸酯（merthiolate )，含或不含伸乙基二胺四乙 酸（EDTA)。本發明進一步的具體實施例中，本發明 抗原與輔助劑合并，輔助劑例如包括卵磷脂、油以及一種 或多種界面活性劑。本發明另一具體實施例中，本發明說 明之抗原以及疫苗方法係用以接種動物。 發明之詳細說明 本發明係關於一種可預防或控制丹毒絲菌之組合物及 方法。具體實施例之一中，本發明係關於紅斑丹毒絲菌抗 原以及製作此抗原之方法。本發明進一步的係關於一種可 含本發明抗原之疫苗調製劑。本發明進一步關於一種使用 紅斑丹毒絲菌抗原接種動物之方法，較佳者爲哺乳類、或 鳥類。最佳的特色中，哺乳類係選自：豬、羊、狗、馬、 牛或人類。 本發明係關於取自紅斑丹毒絲菌培養液之抗原。任何 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I ϋ n l / i ϋ— n ϋ I n ϋ * n an n ϋ ϋ ϋ· 一°J ϋ ί I ϋ n H I 1 n I n n «ϋ n ϋ n ϋ ϋ ϋ -.· ϋ n n-ϋ n ϋ ϋ . (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -6 - 546146 A7 B7 五、發明說明（4 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 紅斑丹毒絲菌品系均可爲本發明之抗原來源，例如描述於 U.S. Patent No. 5,6 2 5,03 8之品系。取自該培養液之抗原可 用各種方法分離。例如，培養液可經純化或實質上純化。 更佳者，本發明之抗原係取自紅斑丹毒絲菌培養液之上淸 液或濾液。最佳的具體實施例中，本發明抗原係取自紅斑 丹毒絲菌培養液之純化或實質上純化之上淸液或濾液。 紅斑丹毒絲菌可用技藝上已知的各種方法培養。參見 U.S. Patent Nos. 5,625,03 8; 5,6 1 6,3 2 8 ; 5,4 1 7,9 7 1; 5,225,1 94 ;4,9 8 1,68 5中有關細菌培養之討論部分。例如紅斑丹毒絲 菌可用描述於以下的說明實施例培養。紅斑丹毒絲菌亦可 用描述於 Sawada and Takahashi，1987，Am. J. Vet. Res. 48:239-242 以及 Groschup et al，1991，Epiderniol. Infect. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 07:63 7-649的方法培養。培養之背景知識以及原核細胞的 處理可參見 Maniatis，et al，1982，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY;Ausubel, et al, 1 989, Current Protocols in Molecular Biology Greene publishing Associates and Wiley Interscience, NY ;Sambrook et al, 1 989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2d. ed.,

Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY，全文在此倂入參考文獻。 在較佳的具體實施例中，培養物中可添加福馬林（最 終濃度約0 . 5 % v / v )以去活性。在另一較佳的具 體實施例中，本發明抗原可取自紅斑丹毒絲菌培養液之上 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 546146 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（5 ) 淸液或濾液。將培養上淸液或濾液（較佳的具體實施例）濃 縮約1 0倍’添加氫氧化鋁凝膠（較佳者REHYDRAGEL τ M )於濃縮上淸液或濾液中使其最終濃度約3 Ο % ν / ν 以穩定抗原。在另一較佳的具體實施例中，疫苗組合物係 調製成內含抗原和輔助劑，輔助劑中包含例如約2 5 % ν / ν之疫苗組合物。另一較佳的具體實施例中，抗原中 添加局部抗菌劑（最終濃度約〇 . 〇 1 % V / V )及 E D Τ Α (最終濃度約〇 · 〇 7 % ν / ν )作爲防腐劑 。較佳的輔助劑（本文中稱爲'' Ν 〇 . 1輔助劑〃）包含 約2 % ν / ν卵磷脂、約1 8 % ν / ν礦物油，以及 約8 % ν / ν之界面活性劑（例如約5 . 6 % ν / ν

Tween 80 以及約 2 .4% v / v Span 80 )，其他 之體積爲生理食鹽水溶液（例如D u 1 b e c c ο P B S)。此輔助劑 描述於 U.S. Patent Application Serial No. filed January 29 ，1999，entitled '、Adjuvants for Use in Vaccines "，全文 在此倂入參考文獻。 紅斑丹毒絲菌去活性 本發明抗原係用技藝上已知的方法取自紅斑丹毒絲菌 ，例如培養液。本發明較佳的具體實施例中，將由紅斑丹 毒絲菌培養液中分離出之抗原於製成疫苗調製劑之前先去 活性。在最佳的具體實施例中，紅斑丹毒絲菌培養液係在 分離液體溶析份前先去活性。去活化紅斑丹毒絲菌培養液 可用各種方法進行，例如殺死細菌或去活化蛋白酶或保存 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） —^----j.--------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -8- 546146 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（6 ) 抗原。 內含本發明抗原之培養液可用各種技藝上已知的方法 去活性。例如培養菌可與去活性劑（即能殺死紅斑丹毒絲 菌之藥劑）接觸。本發明使用之去活性劑可使本發明抗原 活化動物之免疫反應以保護該動物免於感染丹毒絲菌。技 藝上已知的適用活化藥劑，例如：福馬林（甲醛）、/3 -丙內酯或其他具有與此類藥劑性質相似的化學藥劑。去活 化細菌的適當化學藥劑可爲一般熟悉此技藝的專業人士所 測定，例如將細菌接觸特定的化學品後測定細菌是否死亡 ，並測定抗原是否仍能活化產生保護抗體的能力，例如用 處理過的細菌接種老鼠，參見U.S. Patent No. 5,225，194中 對細菌去活化之討論。 分離以及濃縮紅斑丹毒絲菌培養液 在較佳的具體實施例中，本發明抗原係取自紅斑丹毒 絲菌培養液體溶析份。紅斑丹毒絲菌可經培養並從培養液 中與細菌分離，例如離心或過濾培養液。於紅斑丹毒絲菌 培養液中分離本發明抗原可用任何技藝上已知的方法。例 如紅斑丹毒絲菌可於培養液中生長’使細菌快速生長，即 對數相。在較佳的具體實施例中，用以製備本發明抗原培 養液者爲對數相，更佳者爲對數相晚期，此時可開始處理 培養液。 在較佳的具體實施例中，被處理之紅斑丹毒絲菌培養 液已與培養液中生長之所有細菌分離。例如約9 0 %之細 表紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) _ ^ 1--------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 546146 A7 B7 五、發明說明（7 ) 菌已自培養液中移除，更佳者約移除9 5 %之細菌，更佳 者至少移除約9 8 %之細菌。可用任何技藝上已知的方法 分離培養液中之紅斑丹毒絲菌。例如離心分離培養液中之 紅斑丹毒絲菌。任何技藝上已知的能沈澱紅斑丹毒絲菌細 菌之離心方法均適於分離培養液中之細胞。例如連續流動 離心法等均可使用。從培養液中移除細菌之基本知識可參 見 Maniatis，et al，1 982，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY;Ausubel, et al, 1 989, Current Protocols in Molecular Biology Greene publishing Associates and Wiley Interscience, NY;Sambrook et al, 1 989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d. ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor, NY o 另一特色中，紅斑丹毒絲菌可用能過濾細菌而非本發 明抗原之濾膜過濾以便自培養液中移除。許多技藝上已知 的濾膜均適用於自培養液中分離細菌及抗原。例如用以分 離液體溶析份中細菌之濾膜其平均孔徑約〇 · 1微米至約 〇· 5微米，更佳者約〇 . 2微米。 上述取自紅斑丹毒絲菌培養液之液體溶析份（、' 液體 溶析份〃）可加以濃縮。在具體實施例之一中，液體溶析 份可濃縮約3倍至約3 0倍，例如約3倍，或約6倍，或 約1 0倍，或約1 5倍，或約2 0倍，或約3 0倍。液體 溶析份可用任何技藝上已知的方法濃縮。在較佳的具體實 施例中，液體溶析份可使用中空纖維過濾濃縮。特色之一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） „ Γ--------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -10- 546146 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（8 ) 中，進行中空纖維過濾之分子量截點爲約5 ，〇 〇 〇千道 爾頓至約5 0 ，0 〇 0千道爾頓，更佳者約1 0 ，0 0〇 千道爾頓至約3 0，0 0 0千道爾頓。參見亦U.S. Patent No. 5 ，2 2 5 ，1 9 4，討論細菌培養液之液體溶析份 濃度之部分。 液體溶析份亦可用冷凍乾燥法濃縮。另一特色中，可 將液體溶析份中之蛋白質以及多肽沈澱，接著再懸浮沈澱 物並加以濃縮。液體溶析份中之蛋白質可用任何技藝上已 知的方法沈澱，例如聚乙二醇、乙醇或硫酸銨沈澱。沈澱 後，沈澱物可再懸浮於任何適於製備疫苗調製劑之溶液， 例如生理食鹽水溶液。 穩定的紅斑丹毒絲菌抗原 取自液體溶析份之紅斑丹毒絲菌培養液抗原爲使動物 免於或控制丹毒絲菌感染的有效抗原。但是，去除細菌後 使用此類抗原作爲疫苗組合物的嚴重問題是此抗原缺少穩 定性。本發明發現在紅斑丹毒絲菌培養液之液體溶析份中 添加安定劑可穩定抗原，因而解決此一問題。 任何技藝上已知的安定劑均可用以穩定本發明之抗原 。在較佳的具體實施例中，安定劑能吸附紅斑丹毒絲菌培 養液溶析份中之抗原。去除細菌後適當的安定劑可維持紅 斑丹毒絲菌培養液體溶析份中之免疫能力或減緩免疫能力 降低。此藥劑之安定效應可用實驗測定。例如可將兩種去 活性的紅斑丹毒絲菌培養液之液體溶析份樣品在3 7 °C下 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -Π - —^----^--------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 546146 A7 _____ _ B7 五、發明說明（9 ) 反應一段時間，例如約1 4至約2 8天，一個樣品含作爲 安定劑的待測試化學藥劑，另一個樣品則否。然後依據標 準老鼠效能測試（9 C F R 113.119(c)) 接種老鼠測試樣品，使用輔助劑，例如Ν ο . I輔助劑。 化學藥劑處理過之疫苗較未處理過之疫苗或未接種疫苗的 對照組動物有較高比例的保護作用顯示化學處理的疫苗其 抗原被穩定化。 上述的實驗說明在較一般儲存溫度高的溫度（3 7 °C )下加快穩定性測試。一般抗原製劑係儲存於低溫，例如 約2 °C至約8 °C。3 7 °C下2 8天之穩定性代表在正常的 低溫儲存下穩定期會更長，即數年。具體實施例之一中， 依據本發明之抗原在低溫下之穩定期多至約5年，更特定 地在低溫下之穩定期多至約3年。另一具體實施例中，依 據本發明之抗原在低溫下之穩定期至少一年。 技藝上已知的各種藥劑均能吸附抗原，例如：氫氧化 鋁凝膠、磷酸鋁凝膠、磷酸鈣凝膠、氫氧化鋅/氫氧化鈣 凝膠以及明礬（例如碳酸鉀明礬），均爲有用之安定劑。 較佳的具體實施例之一中係用氫氧化鋁凝膠（例如， REHYDRAGEL 丁 M )作爲安定齊ij。（參見 U . S . P a t e n t N o s. 5，6 1 6,328以及5,23 2，690，金屬凝膠以及其用途之討論） 具體實施例之一中，金屬氫氧化物凝膠，例如氫氧化 鋁凝膠（例如REHYDRAGEL τ M )，添加之最終濃度約爲抗 原製劑之1 0 % v / ν至約4 0 % v / ν，例如約 10% v/v ，或約 20% v/v ，或約 3 0% 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1----7------------^--訂----------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -12- 546146 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（1〇） v / V ，或約4 0 % V / V。較佳的具體實施例中，氫 氧化錕膠（例如’ REHYDRAGELTM )添加之最終濃度約爲 抗原製劑之30% v/v。 內含安定劑之抗原製劑均可作爲疫苗組合物調製劑， 例如添加輔助劑及稀釋劑（例如生理食鹽水），因而稀釋 抗原製劑及安定劑。此稀釋有助於避免或實質上避免疫苗 調製劑對動物產生不必要的副作用。例如內含金屬氫氧化 物凝膠（例如氫氧化鋁凝膠，例如REHYDRAGELTM )之抗 原調製劑在加入疫苗調製劑後被稀釋約5倍，或約1 〇倍 ，或約1 5倍，或約2 0倍，或約2 5倍，或約3 0倍。 較佳的具體實施例之一中，內含氫氧化鋁凝膠（例如 REHYDRAGEL τ M )之抗原調製劑最終濃度約3 0 % v / v，添加入疫苗調製劑後被稀釋約2 〇倍，得到最終 之氫氧化鋁凝膠濃度約1 % 5 %。 含紅斑丹毒絲菌抗原之疫苗組合物 本發明抗原均可作爲疫苗組合物接種免疫動物。具體 實施例之一中，疫苗組合物含本發明抗原以及輔助劑。在 較佳的具體實施例中’用於本發明疫苗組合物之輔助劑包 含卵磷脂、油、以及界面活性劑。疫苗組合物調製劑之較 佳輔助劑內含卵磷脂約0 · 2 5 %至約1 2 . 5 % v / v，更佳者約〇 · 5 %至約5 %，以及最佳者約 〇 · 5 %至約1 · 2 5 % v / v，含油約1 1 %至約 2 3 % v / v，更佳者約3 · 5 %至約1 0 %以及最佳 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ^ ------^--訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 546146 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（11) 者約4 · 5 %，以及含兩性界面活性劑約1 · 5 %至約 6 % v / v，更佳者約1 · 5 %至約4 %以及最佳者約 2 % v / v。較佳之輔助劑具有兩個兩性界面活性劑， 例如Tween以及Span界面活性劑，一個主要在疫苗組合物 之水相（例如：Tween 80 )以及一個在油相（例如，

Span 80)。較佳者當用Tween 80以及Span 80作爲界面活 性劑時，T w e e η 8 0之濃度高於S p a η 8 0之濃度約1 . 5至 約3倍，較佳者約2倍。較佳的輔助劑含水溶性載體溶液 ，例如磷酸鹽緩衝的生理食鹽水（P B S )(例如， D u 1 b e c c ◦ P B S )。疫苗組合物中之卵磷脂以及適當的油類 輔助劑爲卵磷脂與DRAKEOLTM 5 Lt礦物油之混合物。卵磷 脂係取自 Central Soya, Fort Wayne, Indiana。亦可參見 U.S. Patent No. 5,084,269中討論之輔助劑組合物。Tween 以及S p a η界面活性劑係取自V a n W a t e r s a n d R 〇 g e r s，

Omaha, Nebraska ° 另一具體實施例中，本發明之疫苗調製劑均可使用技 藝上已知的輔助劑，例如：油性乳狀液、氫氧化鋁、胞壁 基（muramyl )二肽類、氫氧化鈣鋅、亞弗丁（ avndine ) 、鋁氫氧化物、油以及皂角素，如描述於U.S. Patent Nos. 5,846,5 27; 5,417,971; 5,232,690 中討論之輔助劑。 較佳的疫苗組合物係用約1 0 %至約5 0 %之組合物 體積的輔助劑調製，更佳者約1 5 %至約3 5 %，更佳者 約2〇％至3〇％，最佳者約2 5 %。 疫苗調製劑可直接地或以醫藥學或治療組合物的形式 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） —^----p--------------訂----------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -14- 546146 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（12) 投用給患者。內含抗原之醫藥學組合物可用常見的混合、 溶解、造粒、製作糖衣藥九、均勻攪拌、乳化、封包、補 陷或冷凍乾燥方法生產。調製醫藥學組合物時可用常見的 方法使用一種或多種生理上可接受的載體、稀釋劑、賦形 劑或輔助劑，以有助於本發明抗原製成醫藥學用途之製劑 。適當的調製劑視選擇之投藥路徑而定。 全身調製劑包括注射投藥，例如皮下的、真皮內的、 肌肉內的或腹腔內的注射。 注射時，抗原可調製成水溶液，較佳者爲生理相容的 緩衝溶液，例如H a n k s' s溶液、R i n g e r' s溶液、隣酸鹽緩衝 的生理食鹽水、或任何其他生理食鹽水緩衝溶液。溶液可 含配方藥劑，例如：懸浮、安定及/或分散劑。蛋白質可 爲於使用前與適當的載劑（例如滅菌之無熱原水）重組之 粉末形式。 除上述之配方外，抗原亦可調製成儲藏製劑。此長效 調製劑之投用可爲植入（例如皮下的或肌肉內的）或肌肉 內的注射。因此抗原可與適當的聚合的或疏水性的材料（ 例如可接受的油之乳狀液）或離子交換樹脂、或作成微溶 衍生物，例如微溶鹽類加以調製。 此外，亦可使用其他醫藥學的傳遞系統。微脂粒以及 乳狀液爲傳遞載劑之實施例，均可用以傳送抗原。某些有 機溶劑，例如二甲基亞硕雖有較大之毒性但亦可使用。此 外，抗原可用長效釋放系統傳送’例如內含治療或接種藥 劑的固體聚合物半滲透基質。對熟悉此技藝的專業人士而 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -15- ： τ ------_--訂----------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 546146 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（13) 言各種長效釋放材料已經建立且廣爲熟知。長效釋放膠囊 可視其化學性質，在數天至多至1 0 0天釋放抗原。視化 學性質以及生物藥劑的穩定性，可運用其他的抗原穩定策 略。 對測定熟悉此技藝的專業人士而言能測定投藥抗原之 有效量，尤其是依本文詳細之揭示。 有效的劑量可從活體外測定開始。例如，可使用技藝 上已知的技藝在動物模式調製劑量以誘發免疫反應。一般 熟悉此技藝的專業人士可輕易地依本文描述的結果最適化 所有物種之投藥。劑量以及投藥時間可個別的調整。例如 作爲疫苗時，本發明抗原可在約2 - 3 6週內投用約1至 約3劑量。其後可週期性的再行接種。個別的動物可適當 的改變接種方法。投用上述抗原之適當劑量是能在至少4 至1 2個月內使免疫的動物引起免疫反應保護動物免於紅 斑丹毒絲菌感染。 劑量中之抗原量係爲去活化培養物在光學密度（ E 6 2 5 )下之不透明度單位。即使不透明度來源之細菌細 胞已移除，去活化下光學密度4 . 0 (例如1毫升之培養 上淸液或濾液）的培養製劑含4不透明度單位，0 . 5毫 升則含2不透明度單位等。上淸液內含，例如5不透明度 單位/毫升，濃縮1 2倍後（分子過濾）濃縮液體之數値 爲6 0不透明度單位/毫升。一般而言疫苗之抗原劑量介 於約1至約1 2不透明度單位，較佳者約2至約4不透明 度單位。當的劑量體積視注射路徑以及寄主大小而異，一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --^----r------------^--訂----------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -16- 146 146

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ______B7 五、發明說明（I4) 般爲〇 · 1至約5毫升。較佳者，當寄主是豬時至少有兩 週大。 實施例 以下之接種硏究顯示本文描述之疫苗與Ν〇·1輔助 劑投用至大約3以及6週年齡之小豬時，2 -劑量療程可 在第二次接種後2 0週後對劇毒的刺激提供顯著的保護。 血淸E L I S A滴定濃度顯示於抗原與Ν ο · 1輔助劑在 接種後二週亦會引發顯著的抗體反應，但在刺激下此類滴 定濃度減小，及個別的滴定濃度不會對動物提供相關的保 護。相同之抗原與皂角素輔助劑在相同方法投用後會引發 低的E L I S A滴定濃度，以_及在第二次接種後2 0週後 對豬隻無法提供適當的保護避免劇毒的刺激。 刺激模式非常良好，所有對照組豬隻在刺激下均有丹 毒絲菌之臨床症狀（表2 )。三隻豬隻體溫上升，其他五 隻爲紅斑丹毒絲菌培養正性。剩下的兩隻對照組豬隻則無 上述之症狀；但是彼在人道死亡前沮喪數天，並有遷移性 的皮膚損害疾病之特徵。相反的內含Ν ο · 1輔助劑疫苗 接種的2 0隻豬中有1 5隻被完整的保護（表3 )。 本發明內含紅斑丹毒絲菌抗原與Ν ο · 1輔助劑之實 驗疫苗投用在大約3至6週年齡的小豬時，於2 -劑量療 程的第二次接種2 0週後對豬隻提供顯著的保護，在劇毒 的刺激下可避免臨床丹毒絲菌症狀之發生，參見表3 ’此 外，相似的含皂角素輔助劑的實驗疫苗，依上述療程投用 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂---------| -17- 546146 A7 B7 五、發明說明（15) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 至小豬時則無法保護小豬在劇毒的剌激下無法避免臨床丹 毒絲菌症狀之發生。最後接種內含本發明抗原時，不論是 否使用輔助劑，在第二次接種後二週均會顯著的引發血淸 反應之高峰。 本發明以下描述之實施例係用以說明而非限制本發明 之範圍。 . 實施例1 · 培養紅斑丹毒絲菌 紅斑丹毒絲囷品系CN 3 3 4 2係培養在內含Difco Proteose蛋白腺（濃度爲2 · 7 5 % ) 、Difco酵母菌萃取 物（0 · 55%) 、 Tween80 (〇· 2%) 、K2HP〇4 (〇· 217%)以及 KH2P〇4 (0 · 061%)之去 離子水之培養液。培養液之pH用5N Na〇H調至 7 · 2。培養液至少在12 2 t下滅菌3 0至9 0分鐘。 滅菌後，加入滅菌之5 0 %葡萄糖溶液最終濃度爲3 % w / y ° 工作種子培養菌液的製備係將冷凍管冷凍儲存（ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 - 7 0 °C )之種子快速退凍，以及在無菌下地移至含培養 液之燒瓶。燒瓶在3 7 t下搖動反應1 2至3 6小時，以 及用革蘭氏染色測定純度。一旦測定其純度之後，將1毫 升之培養菌液與滅菌之甘油（1 0 % )混合，分裝至冷凍 管冷凍儲存。將內含生產培養液之種子容器接種〇 .〇1 至2 %之主要的或工作種子。使用種子發酵槽時，內含 1〇至1 0 0公升之生產培養液，接種1至5%來自種子 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -18- 546146 A7 __________ B7 五、發明說明（16) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 燒瓶之培養菌液。生產發酵槽內含200至1〇 ’ 〇〇〇 公升之生產培養液，接種〇 . 5至5 %來自種子發酵槽之 培養菌液。 生產培養係設定在3 7 ± 2 °C下攪拌反應。反應時間 爲4至2 4小時。培養期間添加入滅菌之1 0 N氫氧化鈉 溶液維持p Η爲7 · 2 + 0 · 1。生長相期間，週期性的 添加入葡萄糖。 收穫前’用顯微鏡檢視培養之純度、細胞形態學、以 及革蘭氏反應。生長係用6 2 5 n m測量培養液之光學密 度加以監控。6 2 5 nm下光學密度爲4 · 〇或較高時收 穫培養液。 實施例2 · 製備紅斑丹毒絲菌疫苗 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將福馬林溶液添加至培養液，最終濃度爲〇 · 5 % ( v / v )以去活化培養液。將培養液轉移至滅菌之發酵槽 ’置於3 7 ± 2 °C下之培養箱在固定的攪拌下最少2 4小 時（最多6 0小時）。培養液不直接處理，儲存在2至8 °C下多至7天。去活化的培養液用連續流動離心使之分離 。液體溶析份則進行進一步的處理，拋棄細菌。 在一項實驗中，將去活化的（最終濃度0 . 1 % v / v的/3丙內酯（B P L 〃 ）或最終濃度〇 · 2 % v / v的福馬林在3 7 °C下反應至少2 4小時）紅斑丹毒 絲菌培養液濾液濃縮1 〇倍。用酵素聯結免疫吸收劑測定 法（E L I S A )測定紅斑丹毒絲菌之培養液濾液中專一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -19- 546146 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（17 ) 性的 6 4 至 6 6 k D a 蛋白質（Groschup et aL，1991， Epiderniol. Infect. 1 07:637-649 以及 U.S. Patent No. 5,625,03 8 )以決定去活化之效應以及6 4至6 6 k D a蛋 白質之穩定性。早期的硏究發現福馬林去活化培養液後會 降低E L I S A之蛋白質測定値，B P L濃縮物之測定値 約爲福馬林濃縮物之4倍。在3 7 °C下反應1 4天後， B P L濃縮物喪失約8 0 %，福馬林濃縮物喪失至約4〇 %。此二例子中若先添加REHYDRAGEL τ M ) (30% v / v )作爲安定劑（參見下文）則可預防大多數之喪失 ，以及幾乎所有福馬林製劑之喪失。小規模的豬隻硏究顯 示對於保護豬隻對抗劇毒的紅斑丹毒絲菌刺激，福馬林去 活化的培養液體溶析份較B P L去活化的培養液有效。 液體係用中空纖維過濾（分子量截取爲1 〇，〇 〇 〇 千道爾頓）濃縮（6 X至2 0 X，一般約1 0 X )後離心 。液體濃縮後添加入氫氧化鋁凝膠加以穩定。 爲了穩定抗原，濃縮液體中緩慢的攪拌添加入氫氧化 鋁凝膠至最終3 0 % ( v / v ) ( 3 0份體積之凝膠比 7 0份體積之濃縮物）。疫苗中濃縮物稀釋2 0倍後鋁凝 膠含量僅約1 · 5 %，不會在注射位點引起負面的反應。 在十倍濃縮之紅斑丹毒絲菌培養液溶析份用滴定的方式測 定吸附保護蛋白質須要的鋁凝膠量，顯示在3 2 % v / v REHYDRAGEL τ M ( Reheis, Berkeley Heights,

New Jersey )下大於9 5 %被吸附。產物中加入局部抗菌 齊(1 (即 MERTHIOLATE τ M ) ( Dimportex, Spain，由 Flavine 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） .^---------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -20- 546146 A7 _________ B7 五、發明說明（18) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) I n c ·，K1 〇 s t e r s，N e w J e r s e y進口）作保存齊彳，最終濃度大 約Ο . Ο 1 % ( w / ν )。局部抗菌劑約以〇 · 〇 1 % w/ ν之濃度保存於抗原組合物及內含本發明抗原之疫苗 組合物。添加E D T A之最終濃度大約〇 · 〇 7 % ( w / v ) ( Sigma, St. Louis, Missouri ) 〇

使用之輔助劑爲N o · 1輔助劑。使用1 〇 〇 〇 m L 之Ν ο · 1輔助劑，其製作係混合2 0 0 m L濾膜滅菌之 卵磷脂一油溶液（1 0 %卵磷脂之DRAKEOL τ M礦物油） 、高壓滅菌之 Tween 80 ( 5 6 m 1 )以及 Span 80 ( 2 4 m 1 )、以及磷酸鹽緩衝的生理食鹽水（Dulbecco PBS ) (7 2 0 m 1 )。合并卵磷脂—油溶液以及Span 80，混合 物在室溫下、滅菌之容器中混合至少1小時至乳化完全爲 止。合并生理食鹽水以及Tween 80，混合物在室溫下、滅 菌之容器中混合至少1小時。油混合物與水溶性混合物係 以R 〇 s s乳化劑加以乳化。乳化以循環的方式持續進行 至所有的輔助劑加至生理食鹽水中爲止。然後乳狀液在室 溫下通過葛式加壓器（Gaulin press )兩次。輔助劑儲存在 2 至 8 °C。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 製作5 L疫苗係將1 L輔助劑加入3 L水相。水相內 含足量之穩定的濃縮物以生成最終之抗原含量爲每2 m 1 疫苗劑量含3 . 2不透明度單位，加入生理食鹽水使體積 成爲5 L。不透明度單位之定義爲收穫時之光學密度（ E 6 2 5 )乘以濃度因子。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -21 - 546146 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明說明（19) 實施例3 . 接種紅斑丹毒絲菌以及刺激豬隻 用次培養（M S + 8 )第八次之紅斑丹毒絲菌（ C Ν 3 3 4 2 )生產疫苗。穩定的單一劑量係用澄淸的紅 斑丹毒絲菌抗原（3 · 2不透明度單位〔〇U〕），在去 活化下估算培養液之光學密度（〇 D ) 。1〇U相當於1 mL之液體其〇d (625nm下測定）爲1 QNo . 1 輔助劑或皂角素（〇 · 〇 5% w / v，取自Berghausen Chemical Company, Cincinnati, Ohio )作爲輔助劑。明確 的說’將紅斑丹毒絲菌（C N 3 3 4 2 )培養生長至〇D 爲5 · 2 8。培養液用〇 · 5 %福馬林去活化2 4小時。 去活化後離心移除細菌。然後使用超過濾單位濃縮液體溶 析份（分子量截取爲1 〇，〇 〇 〇 k D a )。液體溶析份 大約濃縮1 3 · 4倍。濃縮材料中加入REHYDRAGEL τ M ( 3 〇 % v / v )以穩定抗原。吸附的濃縮物儲存在4 t： 下至接種疫苗調製劑爲止。疫苗用Ν ο · 1輔助劑或 〇· 〇 5 %皂角素作爲輔助劑加以調製。穩定的抗原在生 理食鹽水（1 5 0 m Μ氯化鈉以及4 m Μ磷酸鹽）中稀釋 至最終濃度。疫苗調製劑中加入伸乙基二胺基四乙酸鹽（ EDTA，〇 · 07%)以及局部抗菌劑（0 · 01%) 。磷酸-緩衝的生理食鹽水作爲安慰劑。表1爲治療組、 疫苗治療、以及接種以及刺激的小豬數目。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ^ ：------裝------·--訂---------線 0^- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -22- 546146 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（20) 憲1 . 處理（疫苗)組接種以及刺激小豬 處理組 抗原 輔助劑 接種之小豬數目 刺激之小猪數目 T01 安慰劑 Μ j \ \\ 16 10 T02 3.20U Ν 〇. 1輔助劑 26 20 T03 3.20U 皂角素 16 10 滿意的刺激可在對照組上發現高體溫（4 0 · 9 °C〔 1 0 5 . 6 °F〕或至少連續兩天有較高的體溫）、屍體檢 驗培養、及/或感染紅斑丹毒絲菌之臨床症候。疾病臨床 症候的特徵包括萃死、沮喪、腹部以及耳朵充血、遷移性 的皮膚損害、及涉及關節硬化。未有高體溫臨床症候之豬 隻則將其殺死進行血液、脾臟、以及肝臟培養以分離紅斑 丹毒絲菌。 用Fisher’s精確測試測定動物用不同之疫苗其保護百分 比是否不同（P < 〇 · 〇 5 )。與先前相反比較各劑量組 與對照組以及比較各劑量組與所有其他劑量組之平均。使 用符號邏輯的回歸分析2 —個月大、3個月大、4個月大 ' 5個月大、前刺激血淸中給予疫苗之類型與各組小豬血 淸反應間之關係。隨著刺激時間，疫苗引發的滴定濃度與 疾病狀況（經保護的/未經保護的）間之關係係使用符號 邏輯的回歸評ί古。5 %程度之顯著性表示關係存在。 二十隻懷孕的牝豬（低（# 8 0 0 ) E L I S Α紅斑 丹毒絲菌血淸滴定濃度）購自R i d d e 11 F a r m s，A1 b e r t C11 y， IA，並關在 University of Nebraska Department of 本紙尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） " -23- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ---訂---------線 546146 A7 B7 五、發明說明（21 )

Veterinary and Biological Sciences 之隔離房。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 整個細胞之E L I S A血淸滴定濃度係直接用下述之 抗原結合 E L I S A。參見 U.S· Patent No. 4,918，163 描述 之製備抗原塗覆的平板以及使用此E L I S A平板。首先 如描述於實施例1培養紅斑丹毒絲菌以及在對數相收穫。 記錄6 4 0 n m之光學密度以及使用溶液不同之光學密度 對細菌數目之對照表轉換成細胞/ m L。活細菌用P B S 稀釋（Dulbecco PBS，Sigma，St. Louis, Missouri )至密度 約1 · 1 x 1 0 9細胞/ m L。將P B S稀釋之活細菌結 合的EL I SA平板。爲了製備平板，各孔中加入1〇〇 u 1 0*1% v/v 戊二醛（Sigma, St. Louis，

Mnsoim )之P B S，覆蓋各孔以及將平板在3 7°C下反應 1小時。從各孔中移除戊二醛之P B S，各孔用吸水紙吸 乾。各孔中添加入1 0 0 u 1活細菌之P B S，密度約 1·1 X 1 0 9細胞/m L 。平板在2〇〇〇r p m、 22 t：下離心5分鐘。各孔中添加入200u 1 1%聚 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 乙稀基醇（Aldrich, Milwaukee，Wisconsin )之 P B S ( PVA/PBS)，覆蓋各孔，平板在4 °C靜置過夜。將 平板各孔之內含量轉移至無菌的溶液，各孔用P B S淸洗 。各孔用紗布覆蓋以及在室溫下乾燥（約1小時）。 進行E L I S A之方法如下，使用結合細菌全部抗原 的平板。首先用1% PVA/PBS稀釋豬血淸，包括 正性對照組。所有未知的血淸均以1 : 5 0稀釋以及，正 性對照組爲1 : 2 0 0。將2 0 0 u 1之各樣品添加至欄 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -24- 546146 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（22) A這一列。l〇〇ul 1 % PVA/PBS加到其餘 的孔洞。各樣品從B - Η列作2倍系列稀釋。覆蓋各孔， 在3 7 °C下反應1小時。各孔用p B S Τ淸洗三次。各孔 中添加入l〇〇ul 1-2 0 0 0 1 % PVA/ P B S稀釋製備之聯結過氧化酶山羊抗一豬I g G ( Η & L ) ( Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, Maryland )。再度覆蓋各孔，在3 7 t下反應1小時。各孔用 PBST淸洗三次。各孔中添加入l〇〇u1 ABTS 受質（2 ，2 / —次偶氮基一二一（3乙基苯并噻唑啉磺 酸）’取自 Kirkegaard and Perry，Gaithersburg，Maryland )，平板在室溫下反應10分鐘。各孔在405 — 490 n m計讀吸光前，平板在微盤搖動上搖動1 〇秒，使用平 板計讀背景値。吸光大於正性對照組1 : 3 2 0 0稀釋之 各未知血淸，將血淸稀釋測得終點滴定濃度。 牝豬在產小豬前0至1 0天放血測定其紅斑丹毒絲菌 抗體滴定濃度。依牝豬*血淸滴定濃度將小豬隨機分組。 將源自此類牝豬/ gilts之5 8隻小豬放血以及在大約3週 接種兩種實驗的紅斑丹毒絲菌疫苗之一或安慰劑（參見表 1 )。小豬在大約4週時斷奶。小豬在大約6週時放血以 及再接種相同的疫苗。大約2個月，3個月，4個月以及 5個月時將所有豬隻放血。大約5 1 / 2個月大時，從 硏究中移除多餘之豬隻。大約6個月大時（第二次接種後 2〇週）將豬隻放血以及將4 0緖隻用來自National V e t e r 1 n a r y S e r v 1 c e s L a b 〇 r a t 〇 r y 之 2 m L 劇毒的紅斑丹毒絲 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ^ Ί --------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -25- 546146 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（23) 菌培養液（237老鼠LD50， 1.74 x 101® 落形成單位/ m L )進行肌肉內的刺激。觀察動物之臨床 疾病症候以及刺激前、刺激後直腸的溫度2天，以及刺激 後7天直腸的溫度2天。任何直腸的溫度（4 0 · 9 °C ) 上升之對照組動物即停止硏究並注射青黴素治療。任何具 有疾病臨床症候而無直腸溫度上升之對照組動物，均加以 人道死亡、驗屍、以及採取全血、脾臟、以及肝臟樣品進 行紅斑丹毒絲菌培養。任何死亡之對照組動物均加以驗屍 以及採取脾臟以及肝臟樣品進行紅斑丹毒絲菌培養。任何 接種的動物具有直腸溫度上升（$ 4 0 · 9 °C )及/或疾 病臨床症候即停止硏究並注射青黴素治療。任何刺激後死 亡之接種動物均加以驗屍以及以及採取脾臟以及肝臟樣品 進行紅斑丹毒絲菌培養。紅斑丹毒絲菌抗體滴定濃度用上 述之E L I S A測定，以及分析抗體滴定濃度與臨床保護 之相關性。 E L I S A滴定濃度係測定取自牝豬單一的血液樣品 之血淸以及從小豬的7個取樣點採得之所有血液樣品。將 取自致命注射致死或死亡的豬隻的血液及/或脾臟及肝臟 樣品進行有氧的細菌培養（4 8小時，3 7 °C，血液瓊脂 )° 結果。對照組豬隻之紅斑丹毒絲菌刺激結果示於表2 。所有1 0隻豬隻均爲丹毒絲菌陽性。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --T-------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -26- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 546146 A7 B7 五、發明說明（24) 表2 :— 降制組豬隻 (T〇1 )戶 目紅斑丹毒絲菌刺激之結果 豬隻數目 月工溫 (40.9 °C) 臨床的症狀** 治療(T)、死亡(D) 或人道死亡(K) 分離紅斑丹毒 絲菌之結果 ______— 2天* 僅1天 3017 是 是 K 陰性 3022 _ _ - 是 D 陽性 3031 是 • 是 T 無樣品 3046 • - 是 K 陰性 3063 是 是 K 陽性 .—>——- 3073 是 是 T 無樣品 3085 是 - - T 無樣品 3090 是 是 K 陽性 3103 是 是 K 陽性/ 3110 - - 是 D 陽性

* 2天一連繪2天直腸的溫度局於4 0 · 9 C * *臨床的症候一臨床的症候包括沮喪及/或遷移性的皮膚 損害 接種疫苗/ Ν ο · 1輔助劑（T 〇 2 )之豬隻用紅斑 丹毒絲菌刺激之結果示於表3 ° 2 0隻_隻中有1 5隻（ 7 5 % )完全被保護。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） -27- Γ---?------------^--訂 *---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 546146 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（25) 表3 :疫苗與Ν ο · 1 5輔助劑（T 0 2 )組豬隻用紅斑 丹毒絲菌刺激之結1 3 豬隻數目 肛溫 (40.3 °〇 臨床的症狀** 治療(T)、死亡(D)或 人道死亡(K) 分離紅斑丹毒絲菌 之結果 2天* 僅1天 3006 - 是 - - 無樣品 3010 是 - 是 T 無樣品 3011 - 是 是 T 無樣品 3025 - - - 無樣品 3029 - 是 - 一 無樣品 3030 - - - 無樣品 3033 - - - 無樣品 3038 一 - - - 無樣品 3047 - • - • 無樣品 3052 - - - 無樣品 3059 - - - - 無樣品 3071 - 一 - - 無樣品 3088 - - - - 無樣品 3093 響 - - - 無樣品 3098 是 - 是 T 無樣品 3100 - 二 - - 無樣品 3112 - - - - 無樣品 3114 是 - 是 丁 無樣品 3115 • 是 - - 無樣品 3140 - 是 是 D 陽性

* 2天一連續2天直腸的溫度高於4 0 · 3 °C * *臨床的症候-臨床的症候包括沮喪及/或遷移性的皮膚 損害 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---------------IT.·--------Aw (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -28- 546146 A7 B7 五、發明說明（26) 給予疫苗與皂角素輔助劑（T 〇 3 )之豬隻紅斑丹毒 絲菌刺激之結果示於表4。僅一隻豬隻被保護。 表4 :疫苗與皂角素輔助劑（T 0 3 )組豬隻用紅斑丹毒 絲园刺激之結果 豬隻數目 肛溫(40.3 °C) 臨床的症狀** 治療(T)、死亡(D) 或人道死亡(K) 分離紅斑丹毒絲 菌之結果 2天* 僅1天 3014 是 是 T 無樣品 3024 _ 是 是 T 無樣品 3034 是 一 是 T 無樣品 3041 是 一 是 T 無樣品 3048 是 - 是 T 無樣品 3062 是 是 τ 1 無樣品 3075 • 是 _ • 無樣品 3095 是 是 T 無樣品 3102 • 是 是 T 無樣品 3106 是 是 T 無樣品 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

* 2天—連續2天直腸的溫度高於4 0 . 3 °C * *臨床的症候-臨床的症候包括沮喪及/或遷移性的皮膚 損害 小豬組之幾何平均E L I S A滴定濃度（”GIVIT”s ) 列於表5。 本紙張尺度適用中國國家標準瞻4規格mo,酬） 546146 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（27) 表5 :所有治療組之幾何平均E： L I S A滴定濃度 處理組* 採血淸之時間(大約） 接種前1 接種前2 2個月 3個月 4個月 5個月 刺激前 01 33.5 35.9 108.8 153.9 88.4 329.8 233.2 02 40.0 259.6 8903.9 1871.8 519.2 596.4 556.5 03 28.7 162.3 1712.9 527.2 199.8 302.8 459.0 〇1 —安慰劑 0 2 — 3 · 2不透明度單位之抗原/ Ν ο · 1輔助劑 〇3—3·2不透明度單位之抗原/皂角素輔助劑 第一次接種後小豬對紅斑丹毒絲菌的專一抗體滴定濃 度很低。此類滴定濃度少於5 0至2 0 0。在硏究過程中 對照組小豬的G Μ T緩慢上升顯示E L I S A對較老的豬 隻專一性較差。 以Ν 〇 . 1輔助劑或皂角素作爲輔助劑之疫苗會引發 統計上地顯著的血淸反應（P = 0 · 0 0 0 1 )，其高峰 期在第二次接種後二週（大約2個月大）。此二組之滴定 濃度隨著時間穩定的下降（至大約5個月大），在所有時 間點接受抗原/ Ν 〇 . 1輔助劑小豬之G Μ T明顯的高於 接受抗原/皂角素輔助劑小豬之G Μ Τ。刺激時，接受抗 原/ Ν ο · 1輔助劑豬隻之G Μ Τ高於對照組G Μ 丁之 2倍強，接受抗原/皂角素輔助劑豬隻之G Μ Τ高於對照 組G Μ Τ之2倍弱。刺激後對臨床疾病之保護與個別的 E L I S Α滴定濃度（Ρ > 0 · 0 5 )無關。但是，第二 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） i - --------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -30- 546146 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明說明（28) 次接種抗原/ Ν ο · 1輔助劑之豬隻於二週後出現高峰滴 定濃度。接種/抗原/ Ν ο · 1輔助劑的2 0隻小豬中’ 8隻高峰滴定濃度大於或等於2 8 0 〇 ( 8 / 8在刺激下 被保護），8隻高峰滴定濃度爲6 4 0 〇 ( 6 / 8在刺激 下被保護），以及4隻高峰滴定濃度爲3200 (1/4 在刺激下被保護）顯示滴定濃度爲6 4 0 0或較大時爲延 長保護之指標。 總之，所有1 0隻未接種的對照組均被感染的。給予 疫苗及No · 1輔助劑的2 0隻豬隻中有15隻被保護。 給予疫苗及皂角素輔助劑之1 〇隻豬隻中僅有1隻豬隻被 保護。 實施例4 · 用鋁凝膠穩定抗原 依據實施例1 - 3製備的疫苗，包括用鋁凝膠處理抗 原。測試疫苗對豬隻之功效。將豬隻接種兩個肌肉內的（ I Μ ) 2 m L劑量，一個劑量約在斷奶後3週以及第二個 劑量則在3週後進行。控制組接種磷酸鹽緩衝的生理食鹽 水作爲安慰劑。免疫的動物在9週大時以I Μ注射劇毒的 紅斑丹毒絲菌進行刺激。如表6所示，在9週時疫苗接種 之保護爲1 0 0%。此疫苗在接種豬隻前已儲存了 1 2個 月。結果證實抗原已成功的被穩定保護。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---7---«--------------訂 ---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) • 31 - 546146 A7 B7 五、發明說明（29) 表6 :保護豬隻對抗丹毒絲菌 刺激年齡 控制組（保護/刺激） 接種(保護/刺激） 9週 0/10 19/19 註記：第二十隻豬被刪除。它是非常難處理的動物 操作時猛烈爭扎，故其靜止溫度無法測定 激後此豬隻依然完全健康。 刺 本發明並不僅限於說明本發明單一特色之示範的具體 實施例，任何功能相當量地抗原以及疫苗組合物均屬於本 發明之範圍。熟悉此技藝的專業人士經本文上述之描述後 可對本發明作出各種修飾。此類修飾均屬於以下申請專利 範圍之範圍內。 所有引用之文獻，全文在此并入參考文獻。 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 頁 I 訂· 線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -32-

Claims (1)

1. 546146 A8 B8 C8 D8 夂、申請專利範圍 附件2( A ) 第88 1 20004號專利申請案（修正後無劃線} 中文申請專利範圍替換-本---------'I : 於\丫 i 民國I摘唪如正 . ------*一- 1 · 一種具有長期貯存抗原活性之紅斑丹毒絲菌（ E r y s i p e 1 〇 t h 1· i X r h u s i 〇 p a t h i a e )抗原組合物，其包含經安定 劑處理之紅斑丹毒絲菌培養液之液體溶析份。 2 ·如申請專利範圍第1項之抗原組合物，其中該安 定劑是金屬氫氧化物、金屬磷酸鹽、氫氧化錦凝膠、磷酸 鋁凝膠、磷酸鈣凝膠、氫氧化鋅/氫氧化鈣凝膠或明-。 3 .如申請專利範圍第1項之抗原組合物，其‘中該紅 斑丹毒絲菌培養液係去活性。 4 .如申請專利範圍第3項之抗原組合物，其中該紅 斑丹毒絲菌培養液係藉由福馬林或-丙內酯去活性。 5 .如申請專利範圍第1項之抗原組合物，其中該液 體溶析份係濃縮約3倍至約3 0倍。 6 · —種用於預防或控制紅斑丹毒絲菌之感染的疫苗 組合物，其包含申請專利範圍第1項之抗原組合物和佐劑 組合物。 7 ·如申請專利範圍第6項之疫苗組合物，其中該佐 劑組合物於該疫苗組合物中包含約0 . 2 5 %至約 12.5% v / v之卵磷脂、約1 %至約2 3 %· v / v之油及約1 . 5 %至約6 % v / v之兩性界面活 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _.訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 546146 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 方加 之添 物中 合份 組析 原溶 抗體 之液 項之 1液 第養 圍培 範菌 利絲 專毒 請丹 申斑 作紅 製在 種由 一 藉 . 係 。 。 8 其劑 劑，定 性法安 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）