CN107648599A - 一种猪丹毒、猪细小病毒二联灭活疫苗的制备方法 - Google Patents

一种猪丹毒、猪细小病毒二联灭活疫苗的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种猪丹毒、猪细小病毒二联灭活疫苗的制备方法，该方法在制备过程中，猪丹毒杆菌采用发酵的方式制备菌液，菌液发酵过程中严格控制发酵液的pH值，有效地保证了猪丹毒杆菌抗原的免疫原性，不需要过高的猪丹毒杆菌菌体数量即可达到90％以上的保护率。猪丹毒、猪细小病毒二联灭活疫苗制备过程中，猪细小病毒通过生物反应器悬浮培养IBRS‑2细胞的方式繁殖病毒，能够明显提高毒液的效价，病毒繁殖过程中通过溶氧、pH、转速等的设定，保证了批间毒液的均一性，消除了转瓶培养过程中操作繁杂、工作强度大、易污染等缺点，有效的提升了猪细小病毒灭活疫苗质量的稳定性。

Description

一种猪丹毒、猪细小病毒二联灭活疫苗的制备方法
技术领域
本发明涉及疫苗技术领域，进一步涉及多联疫苗的制备技术，具体涉及一种猪丹毒、猪细小病毒二联灭活疫苗的制备方法。
背景技术
猪丹毒(Swine erysipelas,SE)是由红斑丹毒丝菌(Brysipelothrixrhusiopathiae)引起的一种急型、热性传染病，又被称为红热病(red fever)，又叫“打火印”。临床上以高热、皮疹和关节炎为主要特征。我国将此病列为二类疫病。该病平静了三十年后，近几年出现散在发病或规模发病。
猪对本菌最为敏感，病猪和带菌猪是主要传染源，消化道是主要传播途径，该菌可通过皮肤伤口感染给人，称为“类丹毒”。本病主要感染3-6月龄猪，其他阶段猪只发病较少，猪丹毒多发于其后较暖和的初夏和晚秋季节，具有一定的季节性，呈散发或地方流行。
根据菌体抗原结构不同，目前为止，猪丹毒丝菌一共有26个血清型，包括1a、1b、2、3-24和N型，我国主要是1a和2型，1型菌株多分离于急性败血型猪丹毒病例，毒力较强，可作为攻毒菌种，2型菌株多分离于疹块型或关节炎病猪，毒力较弱，免疫原性好，可作为制苗菌种。
猪细小病毒病(Porcine parvovirus infection)是由猪细小病毒(Porcineparvovirus，PPV)引起的猪繁殖障碍性疾病，主要感染母猪，特别是初产母猪，使母猪产出死胎、畸形胎、木乃伊胎、流产及病弱仔猪，而母猪本身并无明显临床症状。按照毒力可把PPV分为强毒株和弱毒株，按照基因型可把PPV分为PPV1、PPV2、PPV3、PPV4，我国有检测出PPV1和PPV4的研究报道，其他两型未见报道。
传统猪细小病毒灭活疫苗是采用转瓶培养猪睾丸(ST)传代细胞繁殖病毒，转瓶培养的生产工艺ST细胞增殖速度缓慢，由于培养过程中PH值、溶氧和培养基营养的不可检测等条件限制，难以实现对细胞生长密度的最优控制，从而导致病毒滴度较低，生产过程中劳动强度大，批间差异大，产品的质量很难达到稳定。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种猪丹毒、猪细小病毒二联灭活疫苗的制备方法，以解决现有技术的疫苗产品难以实现一次接种即可同时免疫上述两种病原的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是猪丹毒抗原、猪细小病毒抗原在同一疫苗中混配时，难以保证抗原的免疫效果。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种猪丹毒、猪细小病毒二联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1)培养猪丹毒杆菌2型C43-5菌株，制备得到活菌液；
2)采用稀释或离心的方式将步骤1)得到的猪丹毒杆菌2型C43-5活菌液中抗原浓度调整至109-1010CFU/mL；
3)利用甲醛将步骤2)调整浓度后的猪丹毒杆菌2型C43-5菌液进行灭活；
4)繁殖猪细小病毒BJ-2株，制备得到活毒液；
5)利用甲醛将步骤4)中猪细小病毒BJ-2株毒液进行灭活；
6)将步骤3)灭活后的猪丹毒杆菌2型C43-5菌液、步骤5)灭活后的细小病毒BJ-2株毒液以(1～2):(1～2)的体积比混匀，即得到混合的抗原溶液；
7)将步骤6)得到的混合抗原溶液与佐剂混合，即得到猪丹毒、猪细小病毒二联灭活疫苗。
作为优选，步骤1)中对猪丹毒杆菌的培养是利用发酵罐实施的。
作为优选，步骤2)中调整菌液浓度是通过生理盐水稀释实现的。
作为优选，步骤4)所述活毒液中猪细小病毒BJ-2株病毒含量≥107.0TCID50。
作为优选，步骤7)中所述佐剂为SEPPIC IMS 1313N VG佐剂。
作为优选，步骤1)具体包括以下操作：按培养基总量的1％-2％接种菌株，同时按1％-2％加入裂解血球全血，或0.1％吐温-80和0.5％葡萄糖，混匀，在发酵罐中37℃发酵，溶氧量设定10％-15％，用氢氧化钠调节pH，pH设定为7.5-7.6，发酵10-11小时。
作为优选，步骤3)所述灭活是按菌液体积加0.3％甲醛溶液，37℃灭活18～24小时，期间每隔2～3小时搅拌一次，每次3～5分钟。
作为优选，步骤4)具体包括以下操作：将IBRS-2细胞接种到含有培养液和微载体的反应器内，并将细胞与微载体混合均匀，启动贴附程序，使细胞贴附在微载体上；细胞接种密度为10-20万/mL，所用微载体为Cytodex系列微载体，微载体的使用密度为2-10g/L，所用生物反应器为搅拌式生物反应器，生物反应器容积为14L；生物反应器设定参数为：pH7.0-7.3、温度36-37℃、溶氧30％-50％、搅拌速度为40-60rpm；当细胞密度达到200-500万/mL，更换成病毒维持液，接种猪细小病毒，病毒接种量为0.01-0.1MOI，病毒维持液为含2％血清的DMEM，pH值7.1-7.4，生物反应器设定病毒繁殖参数为温度36-37℃，溶氧35-60％、搅拌速度为40-60rpm。
作为优选，步骤5)所述灭活是在无菌容器内，向病毒液中加入甲醛溶液直至其中甲醛浓度为0.3％(w/w)，然后在37℃作用48小时，期间振摇3-4次。
作为优选，步骤7)中混合抗原溶液与佐剂混合的体积比为1:1，所述混合，是在室温下，以500rpm的转速搅拌3分钟。
在以上技术方案中，所述SEPPIC IMS 1313N VG佐剂，是指由SEPPIC公司出品的、型号为IMS 1313N VG的疫苗佐剂，可自市面购得。
本发明提供了一种猪丹毒、猪细小病毒二联灭活疫苗的制备方法，所得到的疫苗免疫母猪，能起到一针多防的作用，填补了市场上目前缺少猪丹毒、猪细小病毒二联灭活疫苗的空白。
该制备方法采用SEPPIC佐剂IMS1313NVG，免疫后免疫部位不会引起红肿发热的副反应，不会影响免疫后猪的精神及采食情况，有效提升了免疫猪只的免疫效果以及生产性能。与市售的猪丹毒灭活疫苗及猪细小病毒灭活疫苗在保护力上无明显差异，保护率均在80％以上。该方法在制备过程中，猪丹毒杆菌采用发酵的方式制备菌液，菌液发酵过程中严格控制发酵液的pH值，有效地保证了猪丹毒杆菌抗原的免疫原性，不需要过高的猪丹毒杆菌菌体数量即可达到90％以上的保护率。猪丹毒、猪细小病毒二联灭活疫苗制备过程中，猪细小病毒通过生物反应器悬浮培养IBRS-2细胞的方式繁殖病毒，能够明显提高毒液的效价，病毒繁殖过程中通过溶氧、pH、转速等的设定，保证了批间毒液的均一性，消除了转瓶培养过程中操作繁杂、工作强度大、易污染等缺点，有效的提升了猪细小病毒灭活疫苗质量的稳定性。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
实施例1
一种猪丹毒、猪细小病毒二联灭活疫苗制备方法，其步骤如下：
1生产种子制备
1.1猪丹毒杆菌生产种子制备
1.1.1一级种子繁殖
将猪丹毒杆菌冻干菌种启封后，加入马丁肉汤稀释后划线接种于血琼脂斜面，37℃培养24小时，于10％血清马丁琼脂平板划线，培养24-36小时，挑选典型均一菌落若干，接种鲜血琼脂斜面，37℃培养24小时，做为一级种子。
1.1.2二级种子繁殖
取一级种子接种于马丁肉汤中，37℃培养24小时，再接种于大量的肉肝胃消化汤或马丁肉汤中，培养24小时，按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验，合格后作为二级种子。
1.2猪细小病毒生产种子繁殖
1.2.1细胞增殖
将仔猪肾传代细胞(IBRS-2)复苏，加入细胞营养液，37℃培养24-48小时，生成良好细胞单层后进行传代。传代时弃净营养液，加入EDTA-胰酶消化液，作用数分钟，消化分散均匀制成细胞悬液。然后分装于细胞培养瓶中，置37℃培养24小时，按现行《中国兽药典》附录进行无菌、支原体及外源病毒检验，应符合规定。
1.2.2毒种繁殖
将生长良好的单层IBRS-2细胞，倒去生长液，换以含有5％毒种的细胞维持液，置37℃继续培养，每日观察细胞病变情况，在36-72小时出现细胞病变，当病变达到90％以上时即可收获。定量分装于瓶中，冷冻保存或加适宜稳定剂，冷冻真空干燥后保存。注明收获日期、数量、毒种代数等。
2制苗用抗原制备
2.1制苗用猪丹毒杆菌抗原制备
2.1.1菌液制备
按培养基总量的1％-2％接种二级种子，同时按1％-2％加入裂解血球全血，或0.1％吐温-80和0.5％葡萄糖，混匀，在发酵罐中37℃发酵，溶氧量设定10％-15％，用氢氧化钠调节pH，pH设定为7.5-7.6，发酵10-11小时。发酵完成后进行纯粹检验和活菌计数，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应纯粹。
2.1.2菌体抗原浓度调整
将检验合格的菌液根据计数结果调整菌液浓度，将其调整至109-1010CFU/mL；按现行《中国兽药典》附录进行检验，应纯粹。
2.1.3菌体抗原灭活
将检验合格的菌液，按菌液体积加0.3％甲醛溶液，37℃灭活18～24小时，期间每隔2～3小时搅拌一次，每次3～5分钟，灭活后取样，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌生长。
2.2制苗用猪细小病毒抗原制备
2.2.1制苗用细胞培养
将IBRS-2细胞接种到含有培养液和微载体的反应器内，并将上述细胞与微载体混合均匀，启动贴附程序，使细胞贴附在微载体上。细胞接种密度为10-20万/mL，所用微载体为Cytodex系列微载体，微载体的使用密度为2-10g/L，所用生物反应器为搅拌式生物反应器，生物反应器容积为14L。生物反应器设定参数为：pH7.0-7.3、温度36-37℃、溶氧30％-50％、搅拌速度为40-60rpm。
2.2.2病毒接种与培养
当上述制苗用细胞密度达到200-500万/mL，更换成病毒维持液，接种猪细小病毒，病毒接种量为0.01-0.1MOI，病毒维持液为含2％血清的DMEM，pH值7.1-7.4，生物反应器设定病毒繁殖参数为温度36-37℃，溶氧35-60％、搅拌速度为40-60rpm。接种后每隔一定时间取生物反应器中的微载体，用显微镜观察细胞病变情况，及细胞脱落情况，并检测样品TCID50。病毒含量达到107.0TCID50/mL即可收获病毒液。
2.2.3病毒液灭活
将检验合格的病毒液混合过滤于无菌容器内，加40％的甲醛溶液，边加边混合，使混合液中甲醛溶液浓度为0.3％，然后置37℃作用48小时，期间振摇3-4次，灭活后取样，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌生长。
3疫苗的制备
将灭活的猪丹毒杆菌2型C43-5菌株和灭活的猪细小病毒BJ-2抗原按体积比1:1:1混匀，混合后的抗原混合液按体积比1:1加入SEPPIC IMS 1313N VG，在室温下，低剪切力的螺旋搅拌器(500rpm)中3分钟，制备稳定疫苗乳液。
4无菌检验
取上述疫苗按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌生长。
实施例2实施例1中制备的疫苗安全性研究
取实施例1中的疫苗，按瓶签注明头份(2mL/头份)，肌肉注射5头份断奶后1.5-2月龄猪(猪瘟中和抗体阴性，猪细小病毒HI抗体效价<8)5头，对照组5头不免疫，逐日观察21日，应无因注射疫苗而引起的局部或全身不良反应。结果见表1。
表1安全性研究结果
安全性试验结果显示：猪丹毒、猪细小病毒二联灭活疫苗对断奶仔猪安全。
实施例3疫苗效力研究
1试验设计
1.1疫苗免疫
取实施例1制备的疫苗，按瓶签注明头份，每头份2mL，肌肉注射1头份断奶后1-2个月体重20kg以上的的健康易感猪10头，首免21日后二免，免疫剂量及方法同一免，同时设对照组10头，不免疫。
购买市售的猪丹毒灭活疫苗(C43-5)，猪细小病毒灭活疫苗(CP-99)，分别按其说明书注射方法及注射剂量注射断奶后1-2个月体重20kg以上的健康易感猪。
表2疫苗免疫分组
疫苗分组 疫苗名称 免疫头数 对照头数
1 猪丹毒、猪细小病毒灭活疫苗 10 10
2 猪丹毒灭活疫苗 5 5
3 猪细小病毒灭活疫苗 5 5
1.2攻毒
免疫后3周，猪丹毒、猪细小病毒二联灭活疫苗及猪丹毒灭活疫苗免疫组及对照组各5头，各静脉注射1MLD的猪丹毒杆菌1型和2型(各1株)强毒菌的混和菌液；免疫后4周，猪丹毒、猪细小病毒二联灭活疫苗及猪细小病毒灭活疫苗组及对照组各5头，各滴鼻攻毒4mL的105.0TCID50/mL的毒液。攻毒分组如下表。
表3攻毒分组
1.3效力检验结果
猪丹毒杆菌、猪细小病毒攻毒后观察14日，记录免疫组合对照组临床症状及动物死亡头数。结果见下表。
表4效力检验结果
实施例4
一种猪丹毒、猪细小病毒二联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1)培养猪丹毒杆菌2型C43-5菌株，制备得到活菌液；
2)采用稀释或离心的方式将步骤1)得到的猪丹毒杆菌2型C43-5活菌液中抗原浓度调整至109CFU/mL；
3)利用甲醛将步骤2)调整浓度后的猪丹毒杆菌2型C43-5菌液进行灭活；
4)繁殖猪细小病毒BJ-2株，制备得到活毒液；
5)利用甲醛将步骤4)中猪细小病毒BJ-2株毒液进行灭活；
6)将步骤3)灭活后的猪丹毒杆菌2型C43-5菌液、步骤5)灭活后的细小病毒BJ-2株毒液以1:2的体积比混匀，即得到混合的抗原溶液；
7)将步骤6)得到的混合抗原溶液与佐剂混合，即得到猪丹毒、猪细小病毒二联灭活疫苗。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤1)中对猪丹毒杆菌的培养是利用发酵罐实施的。
步骤2)中调整菌液浓度是通过生理盐水稀释实现的。
步骤4)所述活毒液中猪细小病毒BJ-2株病毒含量为107.0TCID50。
步骤7)中所述佐剂为SEPPIC IMS 1313N VG佐剂。
实施例5
一种猪丹毒、猪细小病毒二联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1)培养猪丹毒杆菌2型C43-5菌株，制备得到活菌液；
2)采用稀释或离心的方式将步骤1)得到的猪丹毒杆菌2型C43-5活菌液中抗原浓度调整至1010CFU/mL；
3)利用甲醛将步骤2)调整浓度后的猪丹毒杆菌2型C43-5菌液进行灭活；
4)繁殖猪细小病毒BJ-2株，制备得到活毒液；
5)利用甲醛将步骤4)中猪细小病毒BJ-2株毒液进行灭活；
6)将步骤3)灭活后的猪丹毒杆菌2型C43-5菌液、步骤5)灭活后的细小病毒BJ-2株毒液以2:1的体积比混匀，即得到混合的抗原溶液；
7)将步骤6)得到的混合抗原溶液与佐剂混合，即得到猪丹毒、猪细小病毒二联灭活疫苗。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种猪丹毒、猪细小病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)培养猪丹毒杆菌2型C43-5菌株，制备得到活菌液；
2)采用稀释或离心的方式将步骤1)得到的猪丹毒杆菌2型C43-5活菌液中抗原浓度调整至109-1010CFU/mL；
3)利用甲醛将步骤2)调整浓度后的猪丹毒杆菌2型C43-5菌液进行灭活；
4)繁殖猪细小病毒BJ-2株，制备得到活毒液；
5)利用甲醛将步骤4)中猪细小病毒BJ-2株毒液进行灭活；
6)将步骤3)灭活后的猪丹毒杆菌2型C43-5菌液、步骤5)灭活后的细小病毒BJ-2株毒液以(1～2):(1～2)的体积比混匀，即得到混合的抗原溶液；
7)将步骤6)得到的混合抗原溶液与佐剂混合，即得到猪丹毒、猪细小病毒二联灭活疫苗。
2.根据权利要求1所述的一种猪丹毒、猪细小病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于步骤1)中对猪丹毒杆菌的培养是利用发酵罐实施的。
3.根据权利要求1所述的一种猪丹毒、猪细小病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于步骤2)中调整菌液浓度是通过生理盐水稀释实现的。
4.根据权利要求1所述的一种猪丹毒、猪细小病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于步骤4)所述活毒液中猪细小病毒BJ-2株病毒含量≥107.0TCID50。
5.根据权利要求1所述的一种猪丹毒、猪细小病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于步骤7)中所述佐剂为SEPPIC IMS 1313N VG佐剂。
6.根据权利要求1所述的一种猪丹毒、猪细小病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于步骤1)具体包括以下操作：按培养基总量的1％-2％接种菌株，同时按1％-2％加入裂解血球全血，或0.1％吐温-80和0.5％葡萄糖，混匀，在发酵罐中37℃发酵，溶氧量设定10％-15％，用氢氧化钠调节pH，pH设定为7.5-7.6，发酵10-11小时。
7.根据权利要求1所述的一种猪丹毒、猪细小病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于步骤3)所述灭活是按菌液体积加0.3％甲醛溶液，37℃灭活18～24小时，期间每隔2～3小时搅拌一次，每次3～5分钟。
8.根据权利要求1所述的一种猪丹毒、猪细小病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于步骤4)具体包括以下操作：将IBRS-2细胞接种到含有培养液和微载体的反应器内，并将细胞与微载体混合均匀，启动贴附程序，使细胞贴附在微载体上；细胞接种密度为10-20万/mL，所用微载体为Cytodex系列微载体，微载体的使用密度为2-10g/L，所用生物反应器为搅拌式生物反应器，生物反应器容积为14L；生物反应器设定参数为：pH7.0-7.3、温度36-37℃、溶氧30％-50％、搅拌速度为40-60rpm；
当细胞密度达到200-500万/mL，更换成病毒维持液，接种猪细小病毒，病毒接种量为0.01-0.1MOI，病毒维持液为含2％血清的DMEM，pH值7.1-7.4，生物反应器设定病毒繁殖参数为温度36-37℃，溶氧35-60％、搅拌速度为40-60rpm。
9.根据权利要求1所述的一种猪丹毒、猪细小病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于步骤5)所述灭活是在无菌容器内，向病毒液中加入甲醛溶液直至其中甲醛浓度为0.3％(w/w)，然后在37℃作用48小时，期间振摇3-4次。
10.根据权利要求1所述的一种猪丹毒、猪细小病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于步骤7)中混合抗原溶液与佐剂混合的体积比为1:1，所述混合，是在室温下，以500rpm的转速搅拌3分钟。
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