CN107753942A - 一种pcv2、prrsv、猪肺炎支原体三联灭活疫苗制备方法 - Google Patents

一种pcv2、prrsv、猪肺炎支原体三联灭活疫苗制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种PCV2、PRRSV、猪肺炎支原体三联灭活疫苗制备方法，该技术方案基于三种微生物的生长特性及抗原物质的理化特征从培养、灭活、复配等层面设计了全新的制备方法。该方法中PCV2、PRRSV均采用生物反应器方式进行制备，抗原制备过程中严格控制发酵液的pH值，有效地保证了病毒的免疫原性；猪支原体通过细菌发酵罐生产菌种，菌种繁殖过程中通过溶氧、pH、转速等的设定，保证了批间菌液的均一性，消除了转瓶培养过程中操作繁杂、工作强度大、易污染等缺点，有效的提升了猪支原体灭活疫苗质量的稳定性。实验验证表明，本发明所制备的三联灭活疫苗对PCV2、PRRSV、猪肺炎支原体保护率均超过80％，满足了三种病原的防治需求。

Description

一种PCV2、PRRSV、猪肺炎支原体三联灭活疫苗制备方法
技术领域
本发明涉及兽用生物制品技术领域，进一步涉及多联疫苗的制备技术，具体涉及一种PCV2、PRRSV、猪肺炎支原体三联灭活疫苗制备方法。
背景技术
猪圆环病毒2型(PCV2)被认为是引起以严重消瘦、淋巴结肿大和呼吸道症状为特征，断奶仔猪多系统消瘦衰竭综合征(PMWS)的病因。猪圆环病毒感染主要特征还表现为体质下降、消瘦、贫血、黄疸、生长发育不良、腹泻、呼吸困难、母猪泛指障碍、内脏器官及皮肤的广泛病变，特别是肾、脾脏及全身淋巴结的高度重大、出血、坏死等症状，给养猪业带来巨大的经济损失。PCV2和其他病原的混合感染经常被报道，例如猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒和副猪嗜血杆菌、猪链球菌等，危害严重。目前市场上广泛应用的灭活苗毒株有PCV2WH株、LG株、DBN-SX07株、ZJ/C株和SH株。自从2006年PCV2疫苗应用以来，很多临床研究明确地展示了疫苗的良好效果，相比较于非免疫的猪群，疫苗应用能显著提高猪群平均日增重(ADG)和饲料转化率(FCR)，并且减少了死亡率和淘汰率。
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)也是严重影响全球养猪业的重要病原，可致母猪繁殖障碍、生长猪的呼吸道疾病和细菌继发感染。目前在大多猪场都有该病毒感染和病原存在，该病毒由于引起免疫抑制、高度变异性、病毒的增殖呈现抗体依赖性增强，引起典型的生殖道与呼吸道症状，并容易造成继发感染与混合感染，损失较重。猪繁殖与呼吸综合征使用的活疫苗被分为两种：一种是自然致弱的活疫苗，比如R98、Ch-1a、VR2332株；另一种是在通过连续传代致弱的HP-PRRSV基础上研制的活疫苗，例如JX-1a、HuN4、TJM-F92和GDr-180株。猪蓝耳病的预防策略是根据养猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒情况制定的，该病的弱毒疫苗免疫预防是一把双刃剑，阴性猪场是不必要进行疫苗接种的，而爆发过猪蓝耳病的猪场则必须接种，而灭活疫苗主要的优点是安全，不会传染给其他猪只，同时也不会遇到毒力返强的情况。
猪支原体肺炎是一种低死亡率、高发病率的慢性细菌性疾病。疾病的发生发展与Mhp的毒力强弱及在气管、支气管粘膜上的感染程度相关，通过电子显微原观察到，在感染的早期支原体主要存在器官、支气管和细支气管的粘膜表面，而支气管末端及肺泡内则少见。支原体表面有粘附素，最先粘附于气管纤毛表面，随着纤毛的蚕食和脱落，支原体进入气管末端和肺泡中，逐渐形成肺肉变或胰样变，最后使肺脏功能遭到破坏出现呼吸系统症状。该病不仅影响猪的生长性能，如平均日增重和饲料转化率，而且能够提高继发性肺炎的易感性。疫苗接种被用来提前免疫，灭活疫苗对猪安全，无副作用，可使免疫猪肺炎程度下降40％及以上。
现有技术中，针对上述病原的疫苗产品普遍为单成分疫苗或二联疫苗，因此难以实现同时免疫猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒以及猪支原体肺炎三种病原的目的。有研究者尝试利用上述三种抗原制备三联疫苗，但由于三种微生物的生物学特性不同，抗原的物质基础不同，因此采用常规制备方法难以保证产品三种免疫原性均达到较高水平，而且，鉴于三种抗原溶液的成分不同，后续复配工艺需要考虑到全部的大分子杂质类别以及三种抗原的自身特性。对于以上问题，现有技术尚未取得理想的研究成果，因此现有技术中上述三联疫苗在保护效力、不良反应等方面仍有待改善。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种PCV2、PRRSV、猪肺炎支原体三联灭活疫苗制备方法，以解决现有技术中缺乏一种能同时免疫猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒以及猪支原体肺炎三种病原的疫苗的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是，在以PCV2、PRRSV、猪肺炎支原体为抗原的三联疫苗制备过程中，如何产品的保护效力、降低不良反应发生率。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种PCV2、PRRSV、猪肺炎支原体三联灭活疫苗制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)制备病毒含量≥107.9TCID50/mL的猪圆环病毒2型病毒液，在搅拌状态下向其中加入终浓度为0.05％(w/v)的β-丙内酯，置2～8℃条件下搅拌灭活48小时，然后置37℃水解2小时，得到灭活的猪圆环病毒2型病毒液；
2)制备病毒含量≥107.0TCID50/0.1mL的猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒液，在震荡条件下向其中加入甲醛溶液至其中甲醛终浓度为0.3％(v/v)，于37℃保持48小时，过程中振摇3～4次，得到灭活的猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒液；
3)制备菌体含量为109～1010CCU/mL的猪肺炎支原体溶液，在震荡条件下向其中加入甲醛溶液至其中甲醛终浓度为0.3％(v/v)，于37℃保持48小时，过程中振摇3～4次，得到灭活的猪肺炎支原体溶液；
4)将步骤1)所述灭活的猪圆环病毒2型病毒液、步骤2)所述灭活的猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒液、步骤3)所述灭活的猪肺炎支原体溶液三者等体积混合，得到混合抗原溶液，将所述混合抗原溶液与油佐剂按7:3的体积比混合，而后以500～800r/min的转速搅拌30～40分钟，在终止搅拌前加入终浓度为0.01％(w/v)的硫柳汞，混匀，即得到所述PCV2、PRRSV、猪肺炎支原体三联灭活疫苗。
作为优选，步骤1)中所述猪圆环病毒2型病毒液是通过以下方法制备的：
将微载体悬浮培养的PK15细胞，经过消化反应器，去除培养上清，留微载体细胞，用PBS反复洗2次，然后加入含0.02％EDTA-0.05％胰酶消化液，37℃作用30～45分钟，消化分散均匀，用含5％新生牛血清的PKD生长液制成细胞悬液，接种到含有2g/L微载体、5％新生牛血清的PKD培养液中，使其中细胞终浓度为3×105～5×105个细胞/mL，按细胞生长液的1％比例同步接种生产用毒种，以pH 7.2、溶氧40～60％、搅拌速度60rpm、培养温度37℃的条件培养；
培养48h时更换50％的无血清PKD培养液，72h时更换50％无血清PKD培养液，培养96h时，收获冻融微载体细胞及培养液，置-20℃下保存备用。
作为优选，步骤2)中所述猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒液是通过以下方法制备的：
将Marc145细胞种子液经消化、计数后，在无菌条件下接种至生物反应器的灌注袋中，以40rpm、60rpm、90rpm、120rpm各循环30min，使细胞贴壁，以搅拌转速40～60rpm、温度36～37℃、pH7.2～7.4，溶氧30～60％的条件培养细胞；
当Marc145细胞密度达到200～500万个/mL时，更换成病毒维持液，以0.01-0.1MOI的接种量接种猪繁殖与呼吸综合征病毒，而后以温度36～37℃，溶氧35～60％、搅拌转速40～60rpm的条件培养。
作为优选，Marc145细胞的培养过程中，当培养液残糖量降至2g/L时，向培养液中补糖或补加培养基。
作为优选，所述病毒维持液是含2％血清的DMEM；其pH为7.1～7.4。
作为优选，步骤3)所述猪肺炎支原体溶液是通过以下方法制备的：按发酵罐体积的70％向其中加入RPH液体培养基，121℃灭菌20分钟，待培养基温度冷却至37℃时，加入8-15％猪血清，搅拌均匀；然后按照培养基总量的10％接种猪肺炎支原体，以37℃、100r/min的搅拌转速培养3～7日，待pH值由降至6.8时收获菌液。
作为优选，步骤4)所述油佐剂是由法国赛比克公司出品的、商品名为MontanideIMS 1313 NPR的疫苗佐剂。
作为优选，该制备方法中病毒含量是通过以下方法测定的：用含2％胎牛血清的DMEM维持液将病毒的细胞培养物样品做10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9六个滴度，每个滴度接种96孔细胞板上生长的宿主细胞单层8孔，每孔0.1ml；同时设病毒对照和细胞对照孔，置37℃、5％CO2培养箱继续培养，观察7日，记录细胞病变情况，根据Reed-Muench法计算TCID50。
作为优选，病毒含量的检测对象为猪圆环病毒2型病毒，所述宿主细胞为PK15细胞。
作为优选，病毒含量的检测对象为猪繁殖与呼吸综合征病毒，所述宿主细胞为Marc145细胞。
本发明提供了一种PCV2、PRRSV、猪肺炎支原体三联灭活疫苗制备方法，该技术方案基于三种微生物的生长特性及抗原物质的理化特征从培养、灭活、复配等层面设计了全新的制备方法。该方法限定了灭活前的病原微生物浓度，在该特定浓度及相应灭活条件下，产品的三种免疫原性均达到较高水平。实验验证表明，本发明所制备的三联灭活疫苗与市售的猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪肺炎支原体灭活单苗在保护力上无明显差异，保护率均在80％以上。
此外，猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均采用生物反应器方式进行制备，抗原制备过程中严格控制发酵液的pH值，有效地保证了猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原的免疫原性。猪支原体通过细菌发酵罐生产菌种，菌种繁殖过程中通过溶氧、pH、转速等的设定，保证了批间菌液的均一性，消除了转瓶培养过程中操作繁杂、工作强度大、易污染等缺点，有效的提升了猪支原体灭活疫苗质量的稳定性。
而且，本发明采用SEPPIC佐剂Montanide IMS 1313NPR，免疫后免疫部位不会引起红肿发热的副反应，不会影响免疫后猪的精神及采食情况，有效提升了免疫猪只的免疫效果以及生产性能。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
实施例1
一种PCV2、PRRSV、猪肺炎支原体三联灭活疫苗制备方法，包括以下步骤：
1、生产种子制备
1.1猪圆环病毒生产种子制备
1.1.1细胞繁殖
将PK15细胞复苏，加入细胞营养液，37℃培养24-48小时，生成良好细胞单层后进行传代。传代时弃净营养液，加入EDTA-胰酶消化液，作用数分钟，消化分散均匀制成细胞悬液。然后分装于细胞培养瓶中，置37℃培养24小时，按现行《中国兽药典》附录进行无菌、支原体及外源病毒检验，应符合规定。
1.1.2毒种繁殖
PK-15细胞接种到细胞培养基中，调整浓度至20万-30万/mL，与PCV2孵育37℃18-20小时。感染细胞形成单层，弃掉细胞培养液，300mM D-葡萄糖胺处理15-20分钟。用无血清培养基洗涤。洗涤过的感染细胞单层加入细胞培养基孵育37℃3～5日。最后，收获感染培养液-80℃保存作为生产种子批。
1.2猪繁殖与呼吸综合征病毒生产种子制备
1.2.1细胞繁殖
将Marc145细胞复苏，加入细胞营养液，37℃培养24-48小时，生成良好细胞单层后进行传代。传代时弃净营养液，加入EDTA-胰酶消化液，作用数分钟，消化分散均匀制成细胞悬液。然后分装于细胞培养瓶中，置37℃培养24小时，按现行《中国兽药典》附录进行无菌、支原体及外源病毒检验，应符合规定。
1.2.2毒种繁殖
将生长良好的Marc145细胞，倒去生长液，换以含有5％毒种的细胞维持液，置37℃继续培养，每日观察细胞病变情况，在36-72小时出现细胞病变，当病变达到90％以上时即可收获。定量分装于瓶中，冷冻保存或加适宜稳定剂，冷冻真空干燥后保存。注明收获日期、数量、毒种代数等。
1.3猪支原体生产种子制备
1.3.1一级种子繁殖
将冻干菌种接种至RPH液体培养基，37℃培养3～7日，待pH值由7.5降至6.8时收获，经纯粹检验合格后，作为一级生产种子，在-20℃保存，不得超过1个月。
1.3.2二级种子繁殖
取一级种子按10％接种量接种RPH液体培养基，37℃培养3～7日，待pH值由7.5降至6.8时，活菌液中抗原浓度调整至109-1010CCU/mL，收获菌液。按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验，合格后作为二级种子，-20℃保存。
2、制苗用抗原制备
2.1制苗用猪圆环病毒2型抗原制备
2.1.1 PK15细胞培养
将扩大培养的微载体悬浮培养PK15细胞，经过消化反应器，去除培养上清，留微载体细胞，用PBS反复洗2次，然后加入含0.02％EDTA-0.05％胰酶消化液，37℃作用30～45分钟，消化分散均匀，用含5％新生牛血清的PKD专用生长液制成细胞悬液，接种含有2g/L微载体、5％新生牛血清的PKD培养液中，使细胞悬液终浓度为3～5×105个细胞/mL，按细胞生长液的1％比例同步接种生产用毒种，设定参数pH：7.2，溶氧(DO)：40～60％，搅拌速度：60rpm/min，培养温度：37℃。
2.1.2病毒接种与培养
接种后每日观察1～2次，48小时后更换50％的无血清PKD培养液，72h继续更换50％无血清PKD培养液，继续培养至96h，收获冻融微载体细胞及培养液，置-20℃下保存备用。生物反应器设定病毒繁殖参数为温度36-37℃，溶氧35-60％、搅拌速度为40-60rpm。接种后每隔一定时间取生物反应器中的微载体，用显微镜观察细胞病变情况，及细胞脱落情况，并检测样品病毒含量。
2.1.3病毒含量检测
用2％胎牛血清的DMEM维持液将病毒的细胞培养物样品做10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9六个滴度，每个滴度接种96孔细胞板上生长良好的PK15细胞单层8孔，每孔0.1ml。同时设病毒对照和细胞对照孔，置37℃、5％CO2培养箱继续培养，观察7日，记录细胞病变情况，根据Reed-Muench法计算TCID50，病毒含量应≥107.9TCID50/ml。
2.1.4病毒液灭活
将检验合格的病毒液置于灭活容器中，在搅拌状态下按1:2000比例缓慢加入β-丙内酯，置2-8℃条件下搅拌灭活48小时，然后置37℃水解2小时。按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌生长。
2.2制苗用猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原制备
2.2.1 Marc145细胞培养
制苗用细胞的悬浮培养：首先准备生物反应器，检漏激流袋和灌注袋；采用灭菌PBS浸泡微载体过夜；校正温度电极、pH电极和溶氧电极并进行高压灭菌；组装生物反应器，注入培养液，循环24小时进行系统的无菌检验。验证合格后，将培养好的种子细胞消化、计数，无菌条件下接种至灌注袋中，以40rpm、60rpm、90rpm、120rpm各循环30min，使细胞贴壁，搅拌速度为40～60rpm，培养条件为温度36～37℃，pH7.2～7.4，DO 30％～60％。培养过程中适时测定糖耗，当残糖量至2g/L时，进行补糖或补加培养液。
2.2.2病毒接种与培养
当上述制苗用细胞密度达到200-500万/mL，更换成病毒维持液，接种猪繁殖与呼吸综合征病毒，病毒接种量为0.01-0.1MOI，病毒维持液为含2％血清的DMEM，pH值7.1-7.4，生物反应器设定病毒繁殖参数为温度36-37℃，溶氧35-60％、搅拌速度为40-60rpm。接种后每隔一定时间取生物反应器中的微载体，用显微镜观察细胞病变情况，及细胞脱落情况，并检测样品病毒含量。
2.2.3病毒含量测定
用2％胎牛血清的DMEM维持液将病毒的细胞培养物样品做10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9六个滴度，每个滴度接种96孔细胞板上生长良好的Marc-145细胞单层8孔，每孔0.1ml。同时设病毒对照和细胞对照孔，置37℃、5％CO2培养箱继续培养，观察7日，记录细胞病变情况，根据Reed-Muench法计算TCID50，病毒含量应≥107.0TCID50/0.1ml。
2.2.4病毒液灭活
将检验合格的病毒液混合过滤于无菌容器内，加40％甲醛溶液进行灭活，边加边混合，使混合液中甲醛溶液浓度为0.3％，然后置37℃作用48小时，期间振摇3-4次，灭活后取样，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌生长。2.3制苗用猪支原体抗原制备
2.3.1菌液制备
按发酵罐体积的70％加入RPH液体培养基，121℃灭菌20分钟，待培养基温度冷却至37℃时，加入8-15％猪血清，搅拌均匀；然后按照培养基总量的10％接种二级生产种子，37℃条件下100r/min搅拌培养3～7日，待pH值由7.5降至6.8时收获菌液。发酵完成后进行纯粹检验和活菌计数，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应纯粹。
2.3.2菌体抗原浓度调整
将检验合格的菌液根据计数结果调整菌液浓度，将其调整至109-1010CCU/mL；按现行《中国兽药典》附录进行检验，应纯粹。
2.3.3菌体抗原灭活
将检验合格的猪支原体菌液混合过滤于无菌容器内，加40％甲醛溶液进行灭活，边加边混合，使混合液中甲醛溶液浓度为0.3％，然后置37℃作用48小时，期间振摇3-4次，灭活后取样，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌生长。
3、疫苗的制备
将灭活的猪圆环病毒2型、灭活的猪繁殖与呼吸综合征病毒、灭活的猪肺炎支原体，按体积比1∶1∶1混匀，再将抗原液与SEPPIC Montanide IMS 1313 NPR按70∶30的体积比混合，以500～800r/min的转速下搅拌30～40分钟。在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液(终浓度为0.01％)，充分混匀，分装后在2～8℃保存。最终使疫苗中含灭活前PCV2 107.9TCID50/ml，含猪繁殖与呼吸综合征病毒107.0TCID50/ml，含猪肺炎支原体1×109CCU/ml。
4、无菌检验
取上述疫苗按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌生长。
实施例2 实施例1中制备的疫苗安全性研究
取实施例1中的疫苗，按瓶签注明头份(2mL/头份)，肌肉注射5头份断奶后1.5-2月龄猪(猪瘟中和抗体阴性，猪PCV2ELISA抗体阴性，猪PRRSVELISA抗体阴性，猪支原体ELISA抗体阴性)5头，对照组5头不免疫，逐日观察21日，应无因注射疫苗而引起的局部或全身不良反应。结果见表1。
表1安全性研究结果
安全性试验结果显示：猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪肺炎支原体三联灭活疫苗对断奶仔猪安全。
实施例3 实施例1中制备的疫苗疫苗效力研究
1.1猪圆环病毒2型疫苗免疫与攻毒
用14～21日龄PCV2ELISA抗体阴性、PCV2抗原阴性、PRRSV ELISA抗体阴性(商品化注册的ELISA抗体试剂盒检测)的健康易感仔猪15头，随机分成3组，每组5头。第1组为猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪肺炎支原体三联灭活疫苗免疫组，肌注疫苗2mL/头；第2组为PCV2疫苗免疫组，第3组为不接种空白对照。于接种疫苗后28日攻毒，攻毒前，每头猪称重。第1组接种PCV2(107.0TCID50/ml)，其中每头猪滴鼻4.0mL、颈部肌肉注射2.0mL/头，攻毒后第4、7日，分别对第1组和第2组所有猪接种弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白(KLH/ICFA，1mg/ml)，于每头猪的两侧腋下及两侧臀部共接种4个点，每个点接种0.5ml，同时腹腔注射巯基乙酸培养基10ml/头，攻毒后第11、19日，对第1、2组试验猪再次腹腔注射巯基乙酸培养基，10ml/头，连续测温观察至攻毒后第28日。免疫猪应至少4头保护，空白对照组应至少4头为发病。
表2：PCV2免疫与攻毒
1.2猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗免疫与攻毒
用14～21日龄PCV2ELISA抗体阴性、PCV2抗原阴性、PRRSV ELISA抗体阴性(商品化注册的ELISA抗体试剂盒检测)的健康易感仔猪15头，随机分成3组，每组5头。第1组为猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪肺炎支原体三联灭活疫苗免疫组，肌注疫苗2mL/头；第2组为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗单苗对照组，肌注疫苗2mL/头，第3组作空白对照；28d后所有猪肌肉注射检验用强毒的病毒培养液(≥107.0TCID50)3ml/头，每日观察动物发病情况并记录；对照组猪5头发病，免疫猪应至少4头保护。
表3：猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗免疫与攻毒
1.3猪支原体疫苗免疫与攻毒
用3～4周龄健康易感仔猪15头，随机均分为3组(5头/组)。第1组各颈部肌肉注射猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪肺炎支原体三联灭活疫苗2mL/头，2组注射猪肺炎支原体单价疫苗，3组作为攻毒对照。同条件下饲养，接种后28日，连同对照猪5头，各气管注射100MID的猪肺炎支原体济南系强毒CVCC354肺组织毒悬液10ml(含组织毒0.4g)，观察25-30日，扑杀全部试验猪，按Goodwin氏55分法对试验猪的肺部病变进行评分。免疫组试验猪的肺部病变减少率应不低于60％。
表4：猪支原体免疫与攻毒
以上实验结果表明，实施例1所制备的三联疫苗对PCV2、PRRSV、猪肺炎支原体三种病原均具有防治作用，可用于猪对上述三种病原的免疫接种，同时能够实现一针多防的作用。
实施例4
一种PCV2、PRRSV、猪肺炎支原体三联灭活疫苗制备方法，包括以下步骤：
1)制备病毒含量≥107.9TCID50/mL的猪圆环病毒2型病毒液，在搅拌状态下向其中加入终浓度为0.05％(w/v)的β-丙内酯，置2℃条件下搅拌灭活48小时，然后置37℃水解2小时，得到灭活的猪圆环病毒2型病毒液；
2)制备病毒含量≥107.0TCID50/0.1mL的猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒液，在震荡条件下向其中加入甲醛溶液至其中甲醛终浓度为0.3％(v/v)，于37℃保持48小时，过程中振摇3次，得到灭活的猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒液；
3)制备菌体含量为109CCU/mL的猪肺炎支原体溶液，在震荡条件下向其中加入甲醛溶液至其中甲醛终浓度为0.3％(v/v)，于37℃保持48小时，过程中振摇3次，得到灭活的猪肺炎支原体溶液；
4)将步骤1)所述灭活的猪圆环病毒2型病毒液、步骤2)所述灭活的猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒液、步骤3)所述灭活的猪肺炎支原体溶液三者等体积混合，得到混合抗原溶液，将所述混合抗原溶液与油佐剂按7:3的体积比混合，而后以500r/min的转速搅拌30分钟，在终止搅拌前加入终浓度为0.01％(w/v)的硫柳汞，混匀，即得到所述PCV2、PRRSV、猪肺炎支原体三联灭活疫苗。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤1)中所述猪圆环病毒2型病毒液是通过以下方法制备的：将微载体悬浮培养的PK15细胞，经过消化反应器，去除培养上清，留微载体细胞，用PBS反复洗2次，然后加入含0.02％EDTA-0.05％胰酶消化液，37℃作用30分钟，消化分散均匀，用含5％新生牛血清的PKD生长液制成细胞悬液，接种到含有2g/L微载体、5％新生牛血清的PKD培养液中，使其中细胞终浓度为3×105个细胞/mL，按细胞生长液的1％比例同步接种生产用毒种，以pH 7.2、溶氧40％、搅拌速度60rpm、培养温度37℃的条件培养；培养48h时更换50％的无血清PKD培养液，72h时更换50％无血清PKD培养液，培养96h时，收获冻融微载体细胞及培养液，置-20℃下保存备用。
步骤2)中所述猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒液是通过以下方法制备的：将Marc145细胞种子液经消化、计数后，在无菌条件下接种至生物反应器的灌注袋中，以40rpm、60rpm、90rpm、120rpm各循环30min，使细胞贴壁，以搅拌转速40rpm、温度36℃、pH7.2，溶氧30％的条件培养细胞；当Marc145细胞密度达到200万个/mL时，更换成病毒维持液，以0.01MOI的接种量接种猪繁殖与呼吸综合征病毒，而后以温度36℃，溶氧35％、搅拌转速40rpm的条件培养。
Marc145细胞的培养过程中，当培养液残糖量降至2g/L时，向培养液中补糖或补加培养基。
所述病毒维持液是含2％血清的DMEM；其pH为7.1。
步骤3)所述猪肺炎支原体溶液是通过以下方法制备的：按发酵罐体积的70％向其中加入RPH液体培养基，121℃灭菌20分钟，待培养基温度冷却至37℃时，加入8％猪血清，搅拌均匀；然后按照培养基总量的10％接种猪肺炎支原体，以37℃、100r/min的搅拌转速培养3日，待pH值由降至6.8时收获菌液。
步骤4)所述油佐剂是由法国赛比克公司出品的、商品名为Montanide IMS1313NPR的疫苗佐剂。
该制备方法中病毒含量是通过以下方法测定的：用含2％胎牛血清的DMEM维持液将病毒的细胞培养物样品做10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9六个滴度，每个滴度接种96孔细胞板上生长的宿主细胞单层8孔，每孔0.1ml；同时设病毒对照和细胞对照孔，置37℃、5％CO2培养箱继续培养，观察7日，记录细胞病变情况，根据Reed-Muench法计算TCID50。
病毒含量的检测对象为猪圆环病毒2型病毒，所述宿主细胞为PK15细胞。
实施例5
一种PCV2、PRRSV、猪肺炎支原体三联灭活疫苗制备方法，包括以下步骤：
1)制备病毒含量≥107.9TCID50/mL的猪圆环病毒2型病毒液，在搅拌状态下向其中加入终浓度为0.05％(w/v)的β-丙内酯，置8℃条件下搅拌灭活48小时，然后置37℃水解2小时，得到灭活的猪圆环病毒2型病毒液；
2)制备病毒含量≥107.0TCID50/0.1mL的猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒液，在震荡条件下向其中加入甲醛溶液至其中甲醛终浓度为0.3％(v/v)，于37℃保持48小时，过程中振摇4次，得到灭活的猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒液；
3)制备菌体含量为1010CCU/mL的猪肺炎支原体溶液，在震荡条件下向其中加入甲醛溶液至其中甲醛终浓度为0.3％(v/v)，于37℃保持48小时，过程中振摇4次，得到灭活的猪肺炎支原体溶液；
4)将步骤1)所述灭活的猪圆环病毒2型病毒液、步骤2)所述灭活的猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒液、步骤3)所述灭活的猪肺炎支原体溶液三者等体积混合，得到混合抗原溶液，将所述混合抗原溶液与油佐剂按7:3的体积比混合，而后以800r/min的转速搅拌40分钟，在终止搅拌前加入终浓度为0.01％(w/v)的硫柳汞，混匀，即得到所述PCV2、PRRSV、猪肺炎支原体三联灭活疫苗。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤1)中所述猪圆环病毒2型病毒液是通过以下方法制备的：将微载体悬浮培养的PK15细胞，经过消化反应器，去除培养上清，留微载体细胞，用PBS反复洗2次，然后加入含0.02％EDTA-0.05％胰酶消化液，37℃作用45分钟，消化分散均匀，用含5％新生牛血清的PKD生长液制成细胞悬液，接种到含有2g/L微载体、5％新生牛血清的PKD培养液中，使其中细胞终浓度为5×105个细胞/mL，按细胞生长液的1％比例同步接种生产用毒种，以pH 7.2、溶氧60％、搅拌速度60rpm、培养温度37℃的条件培养；培养48h时更换50％的无血清PKD培养液，72h时更换50％无血清PKD培养液，培养96h时，收获冻融微载体细胞及培养液，置-20℃下保存备用。
步骤2)中所述猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒液是通过以下方法制备的：将Marc145细胞种子液经消化、计数后，在无菌条件下接种至生物反应器的灌注袋中，以40rpm、60rpm、90rpm、120rpm各循环30min，使细胞贴壁，以搅拌转速60rpm、温度37℃、pH7.4，溶氧60％的条件培养细胞；当Marc145细胞密度达到500万个/mL时，更换成病毒维持液，以0.1MOI的接种量接种猪繁殖与呼吸综合征病毒，而后以温度37℃，溶氧60％、搅拌转速60rpm的条件培养。
所述病毒维持液是含2％血清的DMEM；其pH为7.4。
步骤3)所述猪肺炎支原体溶液是通过以下方法制备的：按发酵罐体积的70％向其中加入RPH液体培养基，121℃灭菌20分钟，待培养基温度冷却至37℃时，加入15％猪血清，搅拌均匀；然后按照培养基总量的10％接种猪肺炎支原体，以37℃、100r/min的搅拌转速培养7日，待pH值由降至6.8时收获菌液。
该制备方法中病毒含量是通过以下方法测定的：用含2％胎牛血清的DMEM维持液将病毒的细胞培养物样品做10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9六个滴度，每个滴度接种96孔细胞板上生长的宿主细胞单层8孔，每孔0.1ml；同时设病毒对照和细胞对照孔，置37℃、5％CO2培养箱继续培养，观察7日，记录细胞病变情况，根据Reed-Muench法计算TCID50。
病毒含量的检测对象为猪繁殖与呼吸综合征病毒，所述宿主细胞为Marc145细胞。
实施例6
一种PCV2、PRRSV、猪肺炎支原体三联灭活疫苗制备方法，包括以下步骤：
1)制备病毒含量为107.9TCID50/mL的猪圆环病毒2型病毒液，在搅拌状态下向其中加入终浓度为0.05％(w/v)的β-丙内酯，置5℃条件下搅拌灭活48小时，然后置37℃水解2小时，得到灭活的猪圆环病毒2型病毒液；
2)制备病毒含量为107.0TCID50/0.1mL的猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒液，在震荡条件下向其中加入甲醛溶液至其中甲醛终浓度为0.3％(v/v)，于37℃保持48小时，过程中振摇3次，得到灭活的猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒液；
3)制备菌体含量为5×109CCU/mL的猪肺炎支原体溶液，在震荡条件下向其中加入甲醛溶液至其中甲醛终浓度为0.3％(v/v)，于37℃保持48小时，过程中振摇4次，得到灭活的猪肺炎支原体溶液；
4)将步骤1)所述灭活的猪圆环病毒2型病毒液、步骤2)所述灭活的猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒液、步骤3)所述灭活的猪肺炎支原体溶液三者等体积混合，得到混合抗原溶液，将所述混合抗原溶液与油佐剂按7:3的体积比混合，而后以650r/min的转速搅拌35分钟，在终止搅拌前加入终浓度为0.01％(w/v)的硫柳汞，混匀，即得到所述PCV2、PRRSV、猪肺炎支原体三联灭活疫苗。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种PCV2、PRRSV、猪肺炎支原体三联灭活疫苗制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)制备病毒含量≥107.9TCID50/mL的猪圆环病毒2型病毒液，在搅拌状态下向其中加入终浓度为0.05％(w/v)的β-丙内酯，置2～8℃条件下搅拌灭活48小时，然后置37℃水解2小时，得到灭活的猪圆环病毒2型病毒液；
2)制备病毒含量≥107.0TCID50/0.1mL的猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒液，在震荡条件下向其中加入甲醛溶液至其中甲醛终浓度为0.3％(v/v)，于37℃保持48小时，过程中振摇3～4次，得到灭活的猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒液；
3)制备菌体含量为109～1010CCU/mL的猪肺炎支原体溶液，在震荡条件下向其中加入甲醛溶液至其中甲醛终浓度为0.3％(v/v)，于37℃保持48小时，过程中振摇3～4次，得到灭活的猪肺炎支原体溶液；
4)将步骤1)所述灭活的猪圆环病毒2型病毒液、步骤2)所述灭活的猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒液、步骤3)所述灭活的猪肺炎支原体溶液三者等体积混合，得到混合抗原溶液，将所述混合抗原溶液与油佐剂按7:3的体积比混合，而后以500～800r/min的转速搅拌30～40分钟，在终止搅拌前加入终浓度为0.01％(w/v)的硫柳汞，混匀，即得到所述PCV2、PRRSV、猪肺炎支原体三联灭活疫苗。
2.根据权利要求1所述的一种PCV2、PRRSV、猪肺炎支原体三联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤1)中所述猪圆环病毒2型病毒液是通过以下方法制备的：
将微载体悬浮培养的PK15细胞，经过消化反应器，去除培养上清，留微载体细胞，用PBS反复洗2次，然后加入含0.02％EDTA-0.05％胰酶消化液，37℃作用30～45分钟，消化分散均匀，用含5％新生牛血清的PKD生长液制成细胞悬液，接种到含有2g/L微载体、5％新生牛血清的PKD培养液中，使其中细胞终浓度为3×105～5×105个细胞/mL，按细胞生长液的1％比例同步接种生产用毒种，以pH 7.2、溶氧40～60％、搅拌速度60rpm、培养温度37℃的条件培养；
培养48h时更换50％的无血清PKD培养液，72h时更换50％无血清PKD培养液，培养96h时，收获冻融微载体细胞及培养液，置-20℃下保存备用。
3.根据权利要求1所述的种PCV2、PRRSV、猪肺炎支原体三联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤2)中所述猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒液是通过以下方法制备的：
将Marc145细胞种子液经消化、计数后，在无菌条件下接种至生物反应器的灌注袋中，以40rpm、60rpm、90rpm、120rpm各循环30min，使细胞贴壁，以搅拌转速40～60rpm、温度36～37℃、pH7.2～7.4，溶氧30～60％的条件培养细胞；
当Marc145细胞密度达到200～500万个/mL时，更换成病毒维持液，以0.01-0.1MOI的接种量接种猪繁殖与呼吸综合征病毒，而后以温度36～37℃，溶氧35～60％、搅拌转速40～60rpm的条件培养。
4.根据权利要求3所述的一种PCV2、PRRSV、猪肺炎支原体三联灭活疫苗制备方法，其特征在于Marc145细胞的培养过程中，当培养液残糖量降至2g/L时，向培养液中补糖或补加培养基。
5.根据权利要求3所述的一种PCV2、PRRSV、猪肺炎支原体三联灭活疫苗制备方法，其特征在于所述病毒维持液是含2％血清的DMEM；其pH为7.1～7.4。
6.根据权利要求1所述的一种PCV2、PRRSV、猪肺炎支原体三联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤3)所述猪肺炎支原体溶液是通过以下方法制备的：按发酵罐体积的70％向其中加入RPH液体培养基，121℃灭菌20分钟，待培养基温度冷却至37℃时，加入8-15％猪血清，搅拌均匀；然后按照培养基总量的10％接种猪肺炎支原体，以37℃、100r/min的搅拌转速培养3～7日，待pH值由降至6.8时收获菌液。
7.根据权利要求1所述的一种PCV2、PRRSV、猪肺炎支原体三联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤4)所述油佐剂是由法国赛比克公司出品的、商品名为Montanide IMS 1313NPR的疫苗佐剂。
8.根据权利要求1所述的一种PCV2、PRRSV、猪肺炎支原体三联灭活疫苗制备方法，其特征在于该制备方法中病毒含量是通过以下方法测定的：用含2％胎牛血清的DMEM维持液将病毒的细胞培养物样品做10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9六个滴度，每个滴度接种96孔细胞板上生长的宿主细胞单层8孔，每孔0.1ml；同时设病毒对照和细胞对照孔，置37℃、5％CO2培养箱继续培养，观察7日，记录细胞病变情况，根据Reed-Muench法计算TCID50。
9.根据权利要求8所述的一种PCV2、PRRSV、猪肺炎支原体三联灭活疫苗制备方法，其特征在于病毒含量的检测对象为猪圆环病毒2型病毒，所述宿主细胞为PK15细胞。
10.根据权利要求8所述的一种PCV2、PRRSV、猪肺炎支原体三联灭活疫苗制备方法，其特征在于病毒含量的检测对象为猪繁殖与呼吸综合征病毒，所述宿主细胞为Marc145细胞。
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