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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine neue Impfstoffzubereitung
gegen einen Mikroorganismus, z.B. Mycobacterium tuberculosis. Der
bevorzugte Verabreichungsweg ist über die Schleimhäute.
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Hintergrund
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Die
frühesten
beschriebenen Immunisierungsversuche wurden in China vor über 900
Jahren durchgeführt,
wobei eine intranasale Impfung mit getrockneten und gemahlenen Pockenpusteln
durchgeführt
wurde. In der klassischen Immunologie und in Kombination mit einer
Impfung gegen verschiedene Typen von infektiösen Agentien, z.B. Bakterien,
Viren oder Parasiten, ist das vorherrschende Dogma, den Impfstoff
subkutan oder intramuskulär
zu verabreichen. Während
der letzten Jahre hat die Forschung jedoch gezeigt, dass der Körper ein
sehr effektives immunologisches System hat, das sich in der Schleimhaut
befindet. Es wurde auch gezeigt, dass man Impfstoffe nasal, oral,
rektal und vaginal verabreichen kann. Genauso wie bei der klassischen
Immunisierung wurde gezeigt, dass auch bei der mucosalen Impfung
die Notwendigkeit besteht, die immunologische Antwort durch die
Zugabe von Adjuvantien zu verstärken.
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Der
intranasale Weg hat wegen der größeren Wirksamkeit
bei der Induktion von mucosalen Immunantworten als bei den herkömmlicheren
Vorschriften der parenteralen Immunisierung erhöhte Aufmerksamkeit erregt.
Weiterhin hat die Erkenntnis, dass sich ungefähr 80% des Immunsystems in
der Schleimhaut befinden, zusammen mit der Tatsache, dass ebenfalls
80% der bekannten Pathogene über
die Schleimhäute
in unseren Körper
eindringen, das Interesse auf die Anwendung der mucosalen Immunisierung
gelenkt.
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Es
wurde auch gezeigt, dass parenterale Impfstoffe an Schleimhautstellen
keine Immunantwort induzieren. Es ist also auch klar, dass eine
geeignete Stimulierung einer Schleimhautstelle, wie der Nase oder
dem Darm, eine Immunantwort an anderen Schleimhautstellen erzeugen
kann. Zum Beispiel ist es möglich,
einen Impfstoff in die Nase zu applizieren und eine Immunantwort
in der Vagina zu erhalten. Weiterhin ist die mucosale Immunantwort
sehr schnell und setzt bereits Stunden nach der Stimulation durch
ein Pathogen ein, während
die parenterale Immunität
eine Antwortzeit von mehreren Tagen hat.
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Tuberkulose
(TB) ist eine der Hauptursachen von Morbidität in der Welt mit einer geschätzten Zahl
von ungefähr
3 Millionen Todesopfern pro Jahr. Es wird geschätzt, dass 1/3 der Weltbevölkerung
mit TB infiziert ist. Weitgehend ist TB ein Problem, das man im
Wesentlichen nicht in den Griff bekommt, obwohl seit mehr als 75
Jahren der BCG-Impfstoff (Bacille Calmette-Guérin) verwendet wird.
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Der
BCG-Impfstoff besteht aus einem abgeschwächten Stamm eines Tuberkulosebakteriums,
das 1908 von einer Kuh entnommen wurde. Die Originalbakterien, die
heute verwendet werden, wurden 13 Jahre lang kultiviert, um ihre
pathogenen Merkmale zu schwächen,
damit sie als Lebendbakterien für
die parenterale Impfung von Menschen verwendet werden können. Im
Grunde derselbe Stamm wird heute als einziger gegen TB verfügbarer Impfstoff
verwendet. Mehrere pharmazeutische Firmen auf der ganzen Welt erzeugen
den BCG-Impfstoff. Die heute verwendete BCG-Zubereitung besteht
aus gefriergetrocknetem abgeschwächtem
lebensfähigem
BCG-Impfstoff in einem Behälter
und einem anderen Behälter
mit einem physiologisch annehmbaren Suspensionsmedium. Vor der Verabreichung
wird das gefriergetrocknete BCG suspendiert und dem Patienten anschließend durch
Injektion verabreicht. Dieses Verfahren, das unmittelbar in Verbindung
mit der Impfung durchgeführt
werden muss, erfordert ausgebildetes Personal und entsprechend ausgerüstete Einrichtungen,
um eine Kontamination zu vermeiden. Unglücklicherweise sind diese Kriterien
in den Entwicklungsländern
nur schwer zu erfüllen.
So wird geschätzt,
dass jedes Jahr weltweit Kosten von etwa 500 Millionen US-Dollar
entstehen, weil diese Maßstäbe nicht
eingehalten werden. Folglich könnten
riesige Einsparungen sowohl von Geld als auch in Bezug auf die Produktsicherheit
gemacht werden, wenn ein System zur Verfügung stünde, bei dem kein Mischen von
Impfstoffen notwendig ist und bei dem Injektionen vermieden werden
könnten,
so dass die Notwendigkeit von hochausgebildetem Personal und sterilen
Bedingungen entfällt.
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In
klinischen Versuchen auf der ganzen Welt wurde gezeigt, dass die
Schutzwirkung des BCG-Impfstoffs zwischen –50% und +80% variiert. Dies
bedeutet, dass bestimmte klinische Studien gezeigt haben, dass man
nach der Impfung tatsächlich
ein erhöhtes
anstatt gesenktes Risiko hat, die Krankheit zu bekommen.
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Der
BCG-Impfstoff funktioniert gut bei Kindern, hat jedoch mehr oder
weniger keine Wirkung auf Erwachsene. Folglich werden große Anstrengungen
unternommen, um einen Impfstoff gegen TB für die erwachsene Bevölkerung
zu erreichen. Bisher gibt es in der Literatur jedoch keine Berichte über einen
TB-Impfstoff, der
besser ist als BCG.
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Tuberkulose
wird durch engen Kontakt zwischen Personen durch infektiöse Aerosole
verbreitet (Tröpfcheninfektion).
Bei seltenen Gelegenheiten kann die Krankheit auch durch Ingestion
oder Hautverletzungen erworben werden. Dies bedeutet, dass das erste
Organ, das bei einer normalen Infektion mit den Bakterien in Kontakt
kommt, die Schleimhautoberflächen
in den Lungen sind.
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Adjuvantien
sind eine heterogene Gruppe von Substanzen, die die immunologische
Antwort gegen ein Antigen, das gleichzeitig verabreicht wird, verstärken.
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Fast
alle Adjuvantien, die heute zur Verstärkung der Immunantwort gegen
Antigene verwendet werden, sind Teilchen oder bilden zusammen mit
dem Antigen Teilchen. In dem Buch "Vaccine Design – the subunit and adjuvant
approach" (Hrsg.:
Powell & Newman,
Plenum Press, 1995) sind fast alle bekannten Adjuvantien sowohl
in Bezug auf ihre immunologische Aktivität als auch in Bezug auf ihre
chemischen Merkmale beschrieben. Wie in dem Buch beschrieben ist,
sind mehr als 80% der heutzutage getesteten Adjuvantien Teilchen
oder Polymere, die zusammen mit den Antigenen (in den meisten Fällen Proteine)
Teilchen bilden. Die Art von Adjuvantien, die keine Teilchen bilden,
sind eine Gruppe von Substanzen, die als immunologische Signalsubstanzen
wirken und die unter normalen Bedingungen aus den Substanzen bestehen,
die vom Immunsystem als Folge der immunologischen Aktivierung nach
Verabreichung von teilchenförmigen
Adjuvanssystemen gebildet werden.
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Wenn
man teilchenförmige
Systeme als Adjuvantien verwendet, sind die Antigene mit einer Matrix
assoziiert oder gemischt, welche die Eigenschaft hat, langsam biologisch
abbaubar zu sein. Von großer
Bedeutung bei der Verwendung solcher Matrixsysteme ist, dass die
Matrices keine toxischen Metabolite bilden. Wählt man sie unter diesem Gesichtspunkt
aus, so sind die Hauptmatrixtypen, die verwendet werden können, hauptsächlich Substanzen,
die aus einem Körper
stammen. Vor diesem Hintergrund stehen nur wenige Systeme zur Verfügung, die
diese Anforderungen erfüllen:
Milchsäurepolymere,
Polyaminosäuren
(Proteine), Kohlenhydrate, Lipide und biokompatible Polymere mit
geringer Toxizität.
Kombinationen dieser Substanzgruppen, die aus einem Körper stammen,
oder Kombinationen von Substanzen, die aus einem Körper stammen,
mit biokompatiblen Polymeren können
ebenfalls verwendet werden. Lipide sind die bevorzugten Substanzen,
da sie Strukturen aufweisen, aufgrund derer sie biologisch abbaubar
sind, und da sie die wichtigsten Bestandteile in allen biologischen
Membranen bilden.
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Beschreibung
der Erfindung
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Lipide
werden als polar oder unpolar charakterisiert. Die Lipide, die in
der vorliegenden Erfindung von größter Bedeutung sind, sind die
polaren Lipide, da sie die Fähigkeit
haben, in Wasser miteinander zu wechselwirken und teilchenförmige Systeme
zu bilden. Eine andere Art, diese Lipide zu definieren, ist als
amphiphil, und zwar aufgrund ihrer chemischen Struktur mit einem
hydrophoben und einem hydrophilen Bestandteil im Molekül, wodurch
sie als grenzflächenaktive
Substanzen verwendet werden können.
Beispiele für
Hauptgruppen von polaren Lipiden sind Monoglyceride, Fettsäuren, Phospholipide
und Glycosphin golipide. Diese Hauptgruppen können weiterhin in Abhängigkeit
von der Länge
der Acylkette und dem Sättigungsgrad
der Acylkette charakterisiert werden. Da die Zahl der Kohlenstoffatome
in der Acylkette im Bereich von 6 bis 24 liegen kann und die Zahl
der ungesättigten
Bindungen variiert werden kann, gibt es eine fast unendliche Zahl
von Kombinationen bezüglich
der chemischen Zusammensetzung des Lipids.
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Teilchenförmige Lipidsysteme
können
weiter in die verschiedenen Gruppen unterteilt werden, wie sie in
der wissenschaftlichen Literatur diskutiert werden, wie Liposomen,
Emulsionen, Cubosomen, Cochleate, Micellen und dergleichen.
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In
mehreren Systemen können
die Lipide spontan stabile Systeme bilden oder zu ihrer Bildung
gezwungen werden. Unter bestimmten Umständen jedoch müssen andere
grenzflächenaktive
Substanzen eingeführt
werden, um Stabilität
zu erreichen. Solche grenzflächenaktiven
Systeme können
Nicht-Lipid-Charakter haben, aber sie besitzen die Merkmale der
polaren Lipide, da sie hydrophobe und hydrophile Teile in ihrer
molekularen Struktur aufweisen.
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Ein
weiterer Faktor, von dem gezeigt wurde, dass er von Bedeutung ist,
ist die Tatsache, dass Lipide verschiedene physikalisch-chemische
Phasen aufweisen, und in verschiedenen Testsystemen wurde gezeigt, dass
diese Phasen die Aufnahme von biologischen Substanzen nach der Verabreichung
an Schleimhäute
verstärken.
Beschriebene Beispiele für
solche physikalisch-chemischen Phasen sind L2, lamellare, hexagonale, kubische
Phase und L3.
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Genauso
wie in der klassischen Immunologie, wo Impfstoffe (Antigene) parenteral
verabreicht werden, besteht auch bei der mucosalen Immunisierung
großes
Interesse daran, die immunologische Antwort auf die Entwicklung
einer humoralen und/oder zellulären
Antwort hin zu lenken. Wenn man eine humorale Antwort erhält, wäre es wichtig,
die Antwort so zu steuern, dass man eine bestimmte Klasse von Antikörpern erhalten würde. Um
dieses Ziel zu erreichen, können
spezifische immunstimulierende Agentien zu der Zubereitung aus Antigenen
und Adjuvantien gegeben werden.
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Eine
Zubereitung, die diese Ziele erreicht, ist in WO-A-97/47320 beschrieben.
Die offenbarte Zubereitung umfasst Monoglyceride und Fettsäuren. Die
Monoglyceride umfassen eine oder mehrere Substanzen, die aus Monoglyceriden
ausgewählt
sind, wobei die Acylgruppe 6 bis 24 Kohlenstoffatome, vorzugsweise
8 bis 20 Kohlenstoffatome, besonders bevorzugt 14 bis 20 Kohlenstoffatome
enthält
und wobei die Acylkette ungesättigte
Bindungen enthalten kann.
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Die
Acylkette der Fettsäure
kann zwischen 4 und 22, vorzugsweise 8 bis 18, variiert werden,
wobei die Acylkette eine oder mehrere ungesättigte Bindungen enthalten
kann. Es zeigte sich, dass eine Kombination des Monoglycerids Monoolein
mit Ölsäure eine
L3-Phase bildet, die als schwammartige Struktur beschrieben werden
kann, im Gegensatz zu Liposomen, die zwiebelartige lamellare Strukturen
bilden.
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Diese
Kombination von Monoglyceriden und Fettsäuren kann weiter durch die
Zugabe eines biokompatiblen und biologisch abbaubaren Öls zubereitet
werden, so dass eine Öl-in-Wasser-
(o/w-) oder w/o/w-Emulsion entsteht. In der Literatur wurde gezeigt,
dass solche Emulsionen nach Verabreichung an ein Tier sehr effektiv
die zelluläre
Antwort gegen ein Antigen verstärken
(M. Singh et al., 1997, Vaccine 15, 1773–78). Es wird allgemein angenommen,
dass eine zelluläre
Immunantwort benötigt
wird, um einen annehmbaren Impfstoff gegen TB zu erhalten.
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Es
besteht also ein Bedürfnis
nach einer einfachen Methode der Verabreichung eines Impfstoffs
in Kombination mit einem Antigen, dass sich leicht dokumentieren
und zubereiten lässt.
Eine Methode, ein solches System zu produzieren, wäre die Verwendung
von antigenen Oberflächenkomponenten
von Bakterien, die die Fähigkeit
hätten,
in einem Körper
eine Immunantwort zu provozieren, vorzugsweise eine schützende Immunität gegen
das Pathogen zu erzeugen, von dem das Antigen stammt. Mehrere solche
Systeme stehen heute zur Verfügung,
doch die Mehrzahl davon beruhen auf Membrankomponenten, die Proteine
sind.
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Die
meisten virulenten Bakterien weisen Kohlenhydrate, wie Lipopolysaccharide
und Kapselpolysaccharide, auf ihrer Oberfläche auf. Antikörper, die
gegen Kapselpolysaccharide gerichtet sind, sorgen unter anderem
für eine
verstärkte
Phagozytose und ein verstärktes
Abtöten
von Bakterienzellen. Gewöhnlich
gibt es mehrere Serotypen einer gegebenen Bakterienspezies, zum
Beispiel gibt es mehr als 80 bekannte Serotypen von Streptococcus
pneumoniae, die sich auf ihre Kohlenhydratkapselstrukturen beziehen.
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Bakterielle
Polysaccharide sind klassische Beispiele für Antigene, die nicht von T-Helferzellen
abhängig
sind, und wenn sie daher überhaupt
immunogen sind, induzieren sie hauptsächlich die IgM-Antikörperklasse.
Dies ist der Fall, weil nur B-Zellen auf sie reagieren, und B-Zellen
können
nicht die Gedächtnisfunktion
vermitteln, im Gegensatz zu den T-Zellen, die auch immunologische
Auffrischungswirkungen vermitteln.
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Es
ist bekannt, dass Polysaccharide bei immunologisch unreifen kleinen
Kindern, älteren
und immunsupprimierten Personen schlechte Immunogene oder überhaupt
nicht immunogen sind.
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Daher
sind Polysaccharid-Antigene, die chemisch mit Trägern konjugiert sind, die T-Zell-Epitope
umfassen, auch bei den oben genannten immunologisch unreifen Kindern
und immunsupprimierten Erwachsenen als Impfstoffe wirksam.
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Die
impfstofferzeugende Industrie hat lange nach einem allgemeinen Verfahren
gesucht, um Impfstoffe des Konjugattyps zu erzeugen. Ein allgemeines
und einfaches Verfahren zur Herstellung solcher Impfstoffe wäre nicht
nur praktischer, sondern würde
auch die Prozess- und Qualitätskontrolle
leichter machen.
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Ein
Verfahren, das ein allgemeines Verfahren zur Herstellung von immunogenen
Produkten liefert, die antigen aktive Kohlenhydrat-Struktureinheiten
und immunologisch aktive Träger
umfassen, wobei geeignete immunisierende Komponenten in Impfstoffen
des Konjugattyps hergestellt werden, ist in WO 97/35613 beschrieben.
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In
der internationalen Anmeldung ist ein Verfahren zur Herstellung
eines immunogenen Produkts beschrieben, das aus antigen aktiven
Kohlenhydrat-Struktureinheiten
besteht, die jeweils kovalent über
identische, näher
angegebene zweiwertige Brückengruppen
an immunologisch aktive Träger,
die Aminogruppen enthalten, gekoppelt sind.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung stammen die antigen aktiven Kohlenhydrat-Struktureinheiten
der immunogenen Produkte von bakteriellen O-Polysacchariden und/oder
Kapselpolysacchariden. Spezielle Beispiele für solche Saccharide sind solche,
die von den Salmonella-Serotypen BO und/oder DO oder von verschiedenen
Serotypen von Streptococcus-pneumoniae-Kapselpolysacchariden oder von
Haemophilus-influenzae-Kapselpolysacchariden stammen.
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Eine
weitere Kohlenhydrat-Struktureinheit, die von großer Bedeutung
ist, ist das Oberflächenkohlenhydrat
von M. tuberculosis. Dieses Kohlenhydrat besteht aus Lipoarabinomannan
(LAM) und ist das antigen dominierende Oberflächenantigen von Mycobakterien
und macht bis zu 15 mg/g des Bakteriengewichts aus. LAM hat tiefgreifende
biologische Wirkungen; daher wurde berichtet, dass LAM die von gamma-Interferon
vermittelte Aktivierung von Makrophagen stört, toxische Sauerstoffradikale
abfängt,
die Protein-Kinase-Aktivität hemmt
und die Expression von frühen
Genen von Makrophagen induziert. LAM wurde lange Zeit eingehend als
mögliches
Antigen in Impfstoffzubereitungen getestet, doch nur durch parenterale
Verabreichung, was in Tierexperimenten zu einem schlechten Schutz
führte.
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Die
immunologisch aktiven Träger
des immunogenen Produkts des Konjugats der Erfindung sind vorzugsweise
von Polypeptiden abgeleitet. In einer bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich bei dem Polypeptid um Tetanus-Toxoid, Diphtherie-Toxoid,
Cholera-Untereinheit B oder Protein D von H. influenzae.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Impfstoffzubereitung gegen ein
Mycobakterium, die Folgendes umfasst: als Adjuvans eine oder mehrere
Substanzen, die ausgewählt
sind aus
- a) Monoglyceridpräparaten mit einem Monoglyceridgehalt
von wenigstens 80% und mit der allgemeinen Formel wobei R1 und
R2 = H sind und R3 eine
Acylgruppe ist, die 6 bis 24 Kohlenstoffatome enthält, und
wobei die Acylketten eine oder mehrere ungesättigte Bindungen enthalten
können;
und
- b) Fettsäuren
mit 6 bis 24 Kohlenstoffatomen, wobei die Acylgruppe der Fettsäuren gesättigt oder
ungesättigt
ist; und
als immunisierende Komponente ein immunogenes
Produkt, das aus antigen wirksamen Kohlenhydrat-Struktureinheiten
(ACM) besteht, die von Mycobacterium tuberculosis abgeleitet sind
und jeweils kovalent, möglicherweise über identische
zweiwertige Brückengruppen,
an immunologisch aktive Träger
(IAC) gekoppelt sind.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung enthalten die immunologisch aktiven Träger (IAC)
Aminogruppen, und die zweiwertige Brückengruppe hat die folgende
Strukturformel:
wobei LAM Lipoarabinomannan
ist.
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Das
Adjuvans der Impfstoffzubereitung der Erfindung hat vorzugsweise
einen Gehalt an Monoglyceridpräparat
von wenigstens 90%, vorzugsweise wenigstens 95%, und die Acylketten
des Monoglyceridpräparats
enthalten 8 bis 20 Kohlenstoffatome, vorzugsweise 14 bis 20 Kohlenstoffatome,
und die Acylketten enthalten gegebenenfalls eine oder mehrere ungesättigte Bindungen,
und die immunologisch aktiven Träger
(IAC) sind von Polypeptiden abgeleitet und aus Tetanus-Toxoid, Diphtherie-Toxoid,
Cholera-Untereinheit B oder Protein D von H. influenzae ausgewählt.
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Die
Impfstoffzubereitung gemäß der Erfindung
kann weiterhin pharmazeutische Trägerstoffe umfassen, die aus
der Gruppe ausgewählt
sind, die aus bioverträglichen Ölen, wie
Rapsöl,
Sonnenblumenöl,
Erdnussöl,
Baumwollsaatöl,
Jojobaöl,
Squalan oder Squalen, physiologischer Kochsalzlösung, Konservierungsstoffen
und Osmoseregulatoren, Trägergasen,
pH-Regulatoren, organischen Lösungsmitteln,
Hydrophobiermitteln, Enzyminhibitoren, wasserabsorbierenden Polymeren,
Tensiden, Absorptionspromotoren und Antioxidantien besteht.
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Eine
am meisten bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung ist eine Impfstoffzubereitung, die als Adjuvans ein
Gemisch von Monoolein und Ölsäure sowie
möglicherweise
Sojaöl
und als immunisierende Komponente Lipoarabinomannan-Tetanus-Toxoid (LAM-TT)
umfasst.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Impfstoffzubereitung gemäß der Erfindung
wird die Zubereitung zu einem Präparat
für die
mucosale Verabreichung, wie nasale, pulmonale, orale, rektale oder vaginale
Verabreichung, formuliert.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Aerosol oder eine Spraypackung,
das bzw. die eine TB-Impfstoffzubereitung gemäß der Erfindung umfasst.
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Noch
ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine Nasentropfenpackung,
die eine TB-Impfstoffzubereitung gemäß der Erfindung umfasst.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung einer Impfstoffzubereitung
gemäß der Erfindung
zur Herstellung eines Medikaments zur Impfung eines Säugers gegen
ein Mycobakterium, das antigen wirksame Kohlenhydrat-Struktureinheiten
(ACM) aufweist, die von Mycobacterium tuberculosis abgeleitet sind.
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Wie
oben beschrieben, umfasst der vorliegend beschriebene kommerziell
erhältliche
Impfstoff gegen TB einen abgeschwächten Bakterienstamm. Solche
Systeme können
unter bestimmten Umständen,
wenn sie als Impfstoff verabreicht werden, zu einer Infektion durch
die abgeschwächten
Bakterien führen.
Weiterhin sind Antigensysteme auf der Basis von ganzen Bakterien
schwierig gemäß pharmazeutischen
Vorschriften zu standardisieren. Das bevorzugte System, wie es in
der vorliegenden Erfindung beschrieben ist, ist also ein aus dem Pathogen
gereinigtes Antigen, das in Kombination mit passenden Adjuvantien
zu einer schützenden
Immunität führt. Bestimmte
Antigene, wie Kohlenhydrate, erzeugen jedoch möglicherweise keine schützende Immunität, wenn
sie nicht mit einem Träger
in Form eines Konjugats assoziiert sind. Weiterhin sind konjugierte
Impfstoffe als Antigene/Impfstoffe stabiler und folglich attraktiver,
insbesondere in den Entwicklungsländern.
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt eine Zubereitung, die vorgefertigt
werden kann, und daher wird bei nasaler Verabreichung kein ausgebildetes
Personal benötigt,
so dass auf Injektionssysteme wie Nadeln und Spritzen, die in Entwicklungsländern häufig kontaminiert
sind und daher Krankheiten zwischen den Patienten verbreiten, verzichtet
werden kann. Weiterhin kann eine Vorrichtung für die Multidosis-Aerosolabgabe eines
nasalen Impfstoffs leicht so gebaut werden, dass keine Infektion
von Person zu Person erfolgen kann.
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Die
Erfindung wird jetzt anhand eines Beispiels veranschaulicht, das
jedoch nicht als Beschränkung des
Schutzumfangs gemäß den beigefügten Ansprüchen anzusehen
ist.
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Kurzbeschreibung
der Zeichnung
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1 zeigt
die Ergebnisse der in Beispiel 1 offenbarten Tests.
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Beispiel 1
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Schutz
von C57BL-Mäusen
vor intranasaler subletaler Reizung mit M. tuberculosis (MT) durch
Immunisierung mit lebendem BCG und durch Hitze abgetötetem BCG
oder Lipoarabinomannan-Tetanus-Toxoid(LAM-TT)-Konjugat in zwei verschiedenen
L3-Lipid-Adjuvans-Zubereitungen.
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Die
Emulsion wurde durch Mischen des LAM-TT-Konjugats mit 100 μl Sojaöl und 100 μl eines Gemischs
von Monoolein und Ölsäure (1:1)
hergestellt. Die Menge des LAM-TT-Konjugats wurde so eingestellt, dass
den Mäusen
eine Dosis von 10 μg
in 100 μl
(parenteral) oder in 10 μl
(nasal) verabreicht wurde. Dieses Gemisch wurde kurz, für ein paar
Sekunden, mit Ultraschall behandelt, und dann wurden 1,0 ml 0,1
M TRIS-Puffer und 20 μl
4 M NaOH hinzugefügt.
Die Ultraschallbehandlung wurde 2 Minuten lang durchgeführt, woraufhin
die Emulsion zur Immunisierung verwendet wurde.
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Eine
L3-Suspension wurde aus einem 1:1-molarten Gemisch von Monoolein
und Ölsäure (1,43
g Monoolein und 1,12 g Ölsäure) hergestellt
und zu 40 ml 0,1 M TRIS-Puffer gegeben. Bevor 2 Minuten lang mit Ultraschall
behandelt wurde, wurden 640 μl
4 M NaOH hinzugefügt.
Vor der Immunisierung wurde das L3-Adjuvans mit dem LAM-TT-Konjugat gemischt,
um eine Dosis von 10 μg
in 100 μl
für die
parenterale Injektion oder 10 μl
für die
nasale Verabreichung zu erreichen.
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Immunisierung
1; 0 Wochen (parenteral für
alle Gruppen). Immunisierung 2; 3 Wochen (nasal für alle Gruppen
außer
für lebendes
BCG, das parenteral verabreicht wurde). Reizung; 4 Wochen.
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Veränderungen
des Körpergewichts
(%) in Bezug auf das Anfangsgewicht zum Zeitpunkt 0 Wochen. Mittlere
Körpergewichtsänderungen ± Standardabweichung
von 10 Mäusen/Gruppe
sind in 1 gezeigt.
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Wie
man anhand der Gewichtsänderungen
ersieht, führen
beide Adjuvanszubereitungen, die LAM-TT enthalten, zu einer positiven
Körpergewichtsentwicklung.
