DE2528411C2

DE2528411C2 -

Info

Publication number: DE2528411C2
Application number: DE2528411A
Authority: DE
Inventors: Anthony Clifford London Gb Allison; Gregory Kenton Middlesex Gb Gregoriadis
Original assignee: National Research Development Corp UK
Current assignee: BTG International Ltd
Priority date: 1974-06-25
Filing date: 1975-06-25
Publication date: 1987-08-20
Also published as: JPS5126218A; AU8243875A; US4053585A; DE2528411A1; JPS6238330B2; AU507372B2; FR2276062A1; FR2276062B1; GB1502774A; ZA754051B; CA1047921A; BE830629A

Description

Die Erfindung betrifft immunologische Zubereitungen, welche antigene Mittel, z. B. Viren- und Bakterienvaccine und Antikörperzubereitungen, einschließen. Die Erfindung betrifft insbesondere immunologische Zubereitungen, welche Adjuvantia enthalten.

Adjuvantia sind Substanzen, die die Immunreaktion eines spezifischen Antigens verstärken. Beispiele für Adjuvantia sind das unvollständige Freundsche Adjuvans und das vollständige Freundsche Adjuvans. Der erstgenannte Adjuvans ist eine Wasser-in-Öl-Emulsion, die das Antigen enthält, und das letztgenannte Adjuvans ist das gleiche mit abgetöteten Tuberkelbazillen. Nachteiligerweise werden die derzeit zur Verwendung für Adjuvantia verfügbaren Mineralöle im Menschen nicht ohne weiteres abgebaut, und sie bleiben an der Stelle der Injektion zurück, wodurch nicht annehmbare Granulome oder andere unerwünschte Effekte bewirkt werden. Es besteht daher ein Bedürfnis nach einem sicheren und wirksamen Adjuvans zur Verwendung bei Immunisierungsprogrammen des Menschen. Ein solches Adjuvans könnte die Menge der Antigene, z. B. Diphtherie- und Tetanus-Toxoide, vermindern, welche für eine Schutzimmunisierung erforderlich sind. Dies würde insbesondere für die Entwicklungsländer entsprechende wirtschaftliche Vorteile mit sich bringen. Auch besteht ein Bedürfnis für verbesserte Adjuvantia für Veterinärvaccine.

Es ist weiterhin zweckmäßig, zur gleichen Zeit so viele Vaccine wie möglich zu verabreichen, so daß eine oder wenige Injektionen Menschen oder Tiere gegen einen weiten Bereich von Organismen oder ihre toxischen Produkte immunisieren können. Dies ist insbesondere für tropische Länder von Bedeutung, wo zusätzlich zu den Infektionen der gemäßigten Klimagegenden noch der Befall durch viele Parasiteninfektionen kommt. Wenn zwei oder mehrere Antigene gleichzeitig verabreicht werden, dann kann jedes die Bildung von Antikörpern gegen das andere durch eine Erscheinung vermindern, die als Antigen-Konkurrenz bekannt ist. Weiterhin wird die Auswahl von geeigneten Adjuvantia-Materialien auch durch die Notwendigkeit kontrolliert, allergische Reaktionen zu vermeiden.

Es wurde nun gefunden, daß auf Lipiden aufgebaute Zubereitungen, wenn sie in der Form von "Liposomen" (die nachstehend definiert werden) vorliegen, sich in vielfacher Hinsicht als ausgezeichnete Adjuvantien erweisen, vorausgesetzt, daß die Oberfläche des Liposoms eine negative Ladung trägt. Adjuvanszubereitungen auf der Grundlage von negativ geladenen Liposomen bewirken die Bildung von erheblich höheren Konzentrationen von Antikörpern, als es bei der Verwendung von freien Antigenen der Fall ist. Andererseits bringen Antigene, die (ganz oder teilweise) in positiv geladene anstelle von negativ geladenen Liposomen eingehüllt sind, oftmals weniger Antikörper hervor, als die gleichen Dosis des freien Antigens.

In einer Anzahl von Publikationen ist es bereits vorgeschlagen worden, Liposome zur Einhüllung von Arzneimitteln und anderen Substanzen zu verwenden. So wird z. B. in Chemical Abstracts 1973, Band 79 45830t (DE-OS 22 49 552), Chemical Abstracts 1974, Band 81 82398v (S Africa 73 01 850), Chemical Abstracts 1975, Band 83 33033e (DE-OS 22 21 122), Chemical Abstracts 1975, Band 83 33053m (Neth. Appl. 74 04 133) die Herstellung von Liposomen unter Verwendung von Lecithin oder Phosphatidylinosit beschrieben, wobei in den Liposomen Arzneimittel wie Insulin und Theophyllin enthalten sind. Die Verwendung von Liposomen zur Bildung von immunologisch aktiven Zubereitungen wird jedoch in diesen Druckschriften nicht vorgeschrieben und auch nicht nahegelegt. Tatsächlich würde der Wirkungsmechanismus von Liposomen, die andere Wirkstoffe enthalten, in vivo als eine Gegenindikation für ihre Verwendung im Zusammenhang mit Antigenmaterialien und dergleichen angesehen werden.

In der DE-OS 20 09 343 wird die Verwendung von Lysolecithinen als Adjuvantien beschrieben. In dieser Druckschrift finden sich aber keine Hinweise auf Liposome.

Durch die Erfindung wird nun eine immunologisch aktive Zubereitung zur Verabreichung in vivo, enthaltend Viren- und Bakterienantigene, zur Verfügung gestellt, die dadurch gekennzeichnet ist, daß der immunologische Wirkstoff mit einem Liposom mit einer negativen Ladung eingearbeitet ist.

Liposome sind aus der Literatur bekannt. Ihre allgemeine Struktur ist Biochemikern bekannt. Liposome haben zwiebelartige Strukturen, welche eine Reihe von Lipidschichten enthalten, die voneinander durch ein wäßriges Material getrennt sind, wobei die äußerste Schicht aus einem Lipid besteht.

Eine breite Vielzahl von Lipidmaterialien kann zur Bildung der Liposome verwendet werden. Bevorzugte Lipide sind solche, die nicht-immunogen und biologisch abbaubar sind, insbesondere die Phospholipide, wie natürliche Lecithine, z. B. Eilecithin, und synthetische Lecithine, z. B. Dipalmitoyllecithin. Solche Materialien genügen den oben angegebenen Erfordernissen und sie besitzen bestimmte zusätzliche Vorteile. Da der Wirkstoff von der Liposomstruktur eingefangen ist, können höhere Dosen als bei Verwendung des freien Antigens verabreicht werden. Dazu kommt noch, daß das immunologische Mittel durch die Liposomstruktur zurückgehalten wird, bis es den Wirkungsort erreicht, und daß auf diese Weise allergische Reaktionen erheblich vermindert werden.

Obgleich die vorliegende Erfindung auf eine Vielzahl von Antigenmaterialien anwendbar ist, ist sie besonders gut auf bakterielle und virale Antigene anwendbar.

Liposome erleichtern auch die Anwendung von Vielfach-Antigenen mit Einschluß von solchen, die über mindestens einen gewissen Zeitraum voneinander außer Kontakt gehalten werden sollten. Somit können Konkurrenz-Antigene in verschiedene Populationen von Liposomen eingearbeitet werden, welche unterschiedliche Komponenten enthalten, und es können Gemische davon miteinander verabreicht werden. Der Adjuvans-Effekt von erfindungsgemäßen Mitteln kann weiterhin dadurch gesteigert werden, daß man andere Materialien, die eine Adjuvans-Aktivität besitzen, mit dem Liposom einarbeitet, z. B. Saponine.

Liposome sind vielseitige Träger für Antigene, Adjuvantien und andere biologisch aktive Verbindungen. Sie haben sowohl wäßrige als auch lipidartige Abteile, und Substanzen mit sehr hohem Molekulargewicht können mit ihnen eingearbeitet werden. In kleineren Liposomen können Verbindungen mit einem Molekulargewicht von bis zu etwa 300 000 Dalton eingefangen werden, während die größeren, multilamellaren Liposome für Molekulargewichte von 500 000 und mehr verwendet werden können. Die chemische Zusammensetzung der Liposome und ihre Eigenschaften, z. B. die Ladung, können über einen weiten Bereich variiert werden, und die Materialien können sowohl an die Oberfläche der Liposome angefügt als auch in diese durch teilweise oder vollständiges Einfangen des Materials in den Liposomen eingearbeitet werden. Wie oben bereits zum Ausdruck gebracht, wird der Adjuvans-Effekt nur mit Liposomen erhalten, die negativ geladen sind. Eine geeignete geladene Liposomoberfläche kann im Verlauf der Herstellung des Liposoms z. B. unter Verwendung von zugegebenen sauren Substanzen erhalten werden.

Bei der Herstellung von bevorzugten Liposomstrukturen gemäß der Erfindung ist es üblich, ein Phospholipid, wie Eilecithin, als Hauptliposombildner zu verwenden. Zusätzlich können andere Lipide, z. B. Cholesterin, in etwas geringeren Verhältnismengen als Membranverstärker bzw. Membranverfestiger verwendet werden. Eine weitere Komponente kann eine Substanz sein, die für die negativ geladene Liposomoberfläche verantwortlich ist, z. B. Phosphatidsäure, Dicetylphosphat oder Rinderhirngangliosid. Diese Komponenten können z. B. in einem Verhältnis: Lecithin (7 mol), Cholesterin (2 mol) und Phosphatidsäure oder ihr Äquivalent (1 mol) vorliegen. Schließlich können weitere Substanzen in die Struktur für verschiedene Zwecke eingearbeitet werden.

Die vorliegende Erfindung kann auf pharmazeutische Zubereitungen sowohl für die Verwendung beim Menschen als auch beim Tier angewendet werden, wobei sie besonders für den erstgenannten Fall geeignet ist.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.

Beispiel 1

Eilecithin (30 mg), Cholesterin (4,4 mg) und Phosphatidsäure (4,24 mg) werden in Chloroform (3 bis 4 ml) in einem 50-ml-Kugelkolben aufgelöst und im Vakuum bei 37°C eingedampft. Die dünne Lipidschicht auf den Kolbenwänden wird sodann mit 2 ml Diphtherie-Toxoid (12 mg/ml) von Wellcome Laboratories und nach Jodierung nach der Jodmonochlorid-Methode dispergiert. Die Suspension wird etwa 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Während dieser Zeit bilden sich die Liposome und sie reifen. Die Suspension wird sodann 10 Sekunden beschallt. Mehrere Stunden später wird die Suspension durch eine Sepharose-6B-Säule geleitet, um das liposomumhüllte Diphtherie-Toxoid abzutrennen. Die liposome Zubereitung enthält in einem Volumen von etwa 4 ml 50% des Ausgangsproteins. In den Tabellen I, II und III werden die Ergebnisse von biologischen Tests mit den auf diese Weise erhaltenen Antigenzubereitungen zusammengestellt.

Tabelle I

Serum-Antikörperreaktionen von Mäusen gegenüber intravenös als freies Protein oder in negativ geladene Liposome eingearbeitetes, verabreichtes Diphtherie-Toxoid (DT)

240 µg DT wurden Gruppen von 15 TO-Mäusen verabreicht, die 14 Tage später zur Ader gelassen wurden.

Tabelle II

Serum-Antikörperreaktionen von Mäusen gegenüber Diphterie-Toxoid (DT), das subkutan als freies Protein oder in Liposome mit positiven oder negativen Ladungen eingearbeitet, verabreicht wurde

60 µg freies oder in Liposome eingearbeitetes DT wurden in die Fußkissen von CBA-Mäusen, jeweils 6 pro Gruppe, injiziert. Die Primärreaktionen wurden nach 14 Tagen gemessen. Es wurden Zusatzinjektionen von 20 µg DT verabreicht und die Tiere wurden 10 Tage später zur Messung der Sekundärreaktionen ausbluten gelassen.

Tabelle III

Arthus-Reaktionen bei Immunmäusen, die durch Injektion von 10 µg freies oder in negativ geladene Liposome eingearbeitetes Diphtherie-Toxoid (DT) in das Fußkissen stimuliert worden waren

Beispiel 2

Zur Herstellung von liposom-eingearbeitetem Diphterie-Toxoid (DT) wurde wie in Beispiel 1 verfahren, mit der Ausnahme, daß anstelle der Phosphatidsäure die äquivalente Menge von Dicetylphosphat (DP) (Molekulargewicht 546, 3,1 mg) verwendet wird. Gruppen von fünf BSVS/NIMR-Mäusen werden intramuskulär verschiedene Mengen von Diphtherie-Toxoid injiziert, das sowohl liposom-eingearbeitetes als auch freies Protein ist. Nach 14 Tagen werden die Mäuse ausbluten gelassen, und die primären Antikörperreaktionen werden durch die indirekte Hämagglutinierungsmethode (IHA) von Faulk und Houba [Journal of Immunological Methods, Band 3 (1973), Seiten 87 bis 98] bestimmt. Nach der Blutabnahme werden die Gruppen der Mäuse mit den gleichen Antigenmengen wie anfangs wieder beimpft und sie werden nach weiteren 13 Tagen erneut zur Ader gelassen. Die sekundären Antikörperreaktionen werden durch die obengenannte indirekte Hämagglutinationsmethode bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt, wobei die Antikörperreaktionen als log₂IHA-Titer ausgedrückt sind.

Tabelle IV

Effekt der Liposom(DP)-Einarbeitung auf die Immunreaktionen bei variierenden Dosen von Diphtherie-Toxoid (DT)

Beispiel 3

Wie in Beispiel 2 wird liposom-eingearbeitetes Diphtherie-Toxoid hergestellt. Es wird der Effekt der Zumischung von abgetöteten Mycobacterium tuberculosis(BCG)-Organismen zu dem Diphtherie-Toxoid aus die Antikörperreaktion untersucht. Getrennten Gruppen von fünf BSVS/NIMR-Mäusen werden 20 µg aliquote Teile von freiem oder liposom-eingearbeitetem Diphtherie-Toxoid injiziert, und zwar entweder für sich oder im Gemisch mit hitzeabgetöteten Mycobacterium tuberculosis(BCG)-Organismen. Die Mäuse werden nach 14 Tagen zur Ader gelassen und die primäre Antikörperreaktion (IHA) wird wie in Beispiel 2 ermittelt. Jede Gruppe von Mäusen wird sodann mit weiteren 20 µg Diphtherie-Toxoid wiederbeimpft, was auf die gleiche Weise wie bei der Anfangsimpfung, jedoch ohne BCG geschieht. Nach weiteren 10 Tagen wird den Mäusen erneut Blut abgenommen und die sekundäre Antikörperreaktion (IHA) wird wie oben bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengestellt. Die Antikörperreaktionen sind wie in Beispiel 2 ausgedrückt.

Tabelle V

Effekt der Liposom(DP)-Einarbeitung von Diphtherie-Toxoid mit und ohne BCG auf die primäre und sekundäre Reaktion

Beispiel 4

Wie in Beispiel 3 wird der Effekt der Zumischung von Bordetella pertussis(BP)-Organismen zu dem Diphtherie-Toxoid (DT) auf die Antikörperreaktionen untersucht. Getrennten Gruppen von fünf VSBS/NIMR-Mäusen werden intramuskulär 30 µg Diphtherie-Toxoid (DT) als freies Protein und auch in liposom-eingearbeiteter Form injiziert, was in jedem Fall für sich oder im Gemisch mit Bordetella pertussis(BP)-Organismen geschieht. Wie in Beispiel 2 werden die primären und sekundären Antikörperreaktionen bestimmt. Den Mäusen wird nach 14 Tagen Blut abgenommen und sie werden mit 20 µg Diphtherie-Toxoid wiederbeimpft und nach weiteren 13 Tagen wieder zur Ader gelassen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt.

Tabelle VI

Effekt der Liposom-Einarbeitung von Diphtherie-Toxoid mit oder ohne Bordetella pertussis(BP)-Organismen auf die primären und sekundären Antikörperreaktionen

Beispiel 5

Wie in den Beispielen 3 und 4 wird der Effekt von Saponin auf die Immunreaktion gegenüber liposom-eingearbeitetem Diphtherie-Toxoid (DT) untersucht. Gruppen von fünf ausgewachsenen VSVS/NIMR-Mäusen werden intramuskulär 20 µg freies oder liposom-eingearbeitetes Diphtherie-Toxoid entweder für sich oder zusammen mit Saponin injiziert. Es werden zwei verschiedene Gehalte des Saponingemisches untersucht (3 µg und 50 µg). Die primären und sekundären Antikörperreaktionen (IHA) werden wie in Beispiel 3 bestimmt. Die Gruppen der Mäuse werden nach 14 Tagen zur Ader gelassen, mit den gleichen Antigenen wiederbeimpft und erneut nach 14 Tagen zur Ader gelassen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle VII zusammengestellt. Die sekundäre Stimulierung erfolgt ohne Saponin.

Tabelle VII

Effekt von Saponin auf die Immunreaktionen gegenüber liposom-eingearbeitetem Diphtherie-Toxoid

Beispiel 6

Liposom-eingearbeitetes Tetanus-Toxoid (TT) wird nach der Methode der Liposom-Einarbeitung von Diphtherie-Toxoid gemäß Beispiel 1 hergestellt, mit der Ausnahme, daß die äquivalente Menge (3,1 mg) von Dicetylphosphat (DP) anstelle von Phosphatidsäure (PA) verwendet wird und daß die Antigenkomponente Tetanus-Toxoid (TT) ist. Die Lipoidschicht wird mit 1,8 ml jodiertem Tetanus-Toxoid (40 Lf/ml Wellcome Laboratory) dispergiert. In sonstiger Hinsicht ist die Methode die gleiche wie in Beispiel 1, mit der Ausnahme, daß die Beschallung 1 Minute weitergeführt wird. Durch eine ähnliche Methode werden auch positiv geladene Liposome unter Verwendung einer äquivalenten Mengen von Stearylamin anstelle von Dicetylphosphat wie oben hergestellt, die Tetanus-Toxoid enthalten.

Gruppen von fünf ausgewachsenen VSBS/NIMR-Mäusen werden intramuskulär 1 Lf Tetanus-Toxoid, in freier Form oder in positiv oder negativ geladene Liposome eingearbeitet, injiziert. Durch die indirekte Hämagglutinations(IHA)-Methode werden wie in den vorstehenden Beispielen die primäre und die sekundäre Antikörperreaktion bestimmt. Dabei werden die Mäuse 17 Tage nach Impfung zur Ader gelassen, mit der gleichen Dosis des Antigens wiederbeimpft und 10 Tage später erneut zur Ader gelassen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle VIII zusammengestellt.

Tabelle VIII

Effekt der Liposom-Einarbeitung auf die Immunreaktion gegenüber Tetanus-Toxoid

Beispiel 7

In einem weiteren Beispiel wird der Effekt der Liposom-Einarbeitung auf die Immunreaktion von Meerschweinchen gegenüber detergens-extrahiertem Influenza-Virus-Hämagglutinin und -Neuraminidase untersucht. Liposom-eingearbeitetes Influenza-Virus-Hämagglutinin und -Neuraminidase wird im wesentlichen nach der Methode zur Herstellung von liposom-eingearbeitetem Diphtherie-Toxoid (DT) des Beispiels 1 hergestellt. Wie in Beispiel 2 wird die äquivalente Menge von Dicetylphosphat anstelle von Phosphatidsäure verwendet.

Zwei Gruppen von fünf Meerschweinchen werden intramuskulär A/Port Chalmers-Vaccine eingeimpft, wobei die eine Gruppe die Vaccine in freier Form und die andere die liposom-eingearbeitete Form erhält. Von den Meerschweinchen wird nach 20 Tagen Blut abgenommen und sie werden mit der gleichen Virusdosis erneut geimpft und nach weiteren 12 Tagen wiederum zur Ader gelassen. Die Sera werden durch Radialdiffusion untersucht und die primäre und sekundäre Antikörperreaktion werden bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle IX zusammengestellt.

Tabelle IX

Effekt der Liposom-Einarbeitung auf die Immunreaktion von Meerschweinchen gegenüber detergens-extrahiertem Influenza-Virus-Hämagglutinin und -Neuraminidase

Beispiel 8

Die Arbeitsweise des Beispiels 7 wird, jedoch unter Zugabe von Saponin (50 µg), wiederholt.

Claims

1. Immunologisch aktive Zubereitung zur Verabreichung in vivo, enthaltend Viren- und Bakterienantigene, dadurch gekennzeichnet, daß der immunologische Wirkstoff mit einem Liposom mit einer negativen Ladung eingearbeitet ist.

2. Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der immunologische Wirkstoff Diphtherie-Toxoid oder Tetanus-Toxoid ist.

3. Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der immunologische Wirkstoff ein Influenzavirus-Antigen ist

4. Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein zusätzliches Adjuvans vorhanden ist.

5. Zubereitung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Liposom mit Eilecithin gebildet ist.

6. Zubereitung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die negative Ladung auf das Vorhandensein von Phosphatidsäure oder Dicetylphosphat zurückzuführen ist.