JP5114628B2 - リポソームワクチンの作製法 - Google Patents

Description

本発明は、リポソームワクチンの作製法に関する。

現在、哺乳類、及び魚類においては、様々なウイルスが感染することが知られている。特に、新興ウイルス感染症は、人類のみならず、生物界全体の脅威になっている。魚類の養殖現場においても、そのようなウイルスによる魚病の被害額は毎年甚大に上っている。そのようなウイルス感染症に対しては、研究開発が進められているものの、未だに充分に有効な手段が開発されているとは言い難い。このような現状に対して、ワクチンによる水棲動物病対策が求められてきた。
本発明者は、上記現状に鑑み、特開２００３−３０６４２７に開示されたリポソームワクチンを開発した。このリポソームワクチンは、死滅させた病原体とリン脂質とを混在させておき、超音波処理することにより製造されるものであり、脂質二重膜に病原体が含まれている。このリポソームワクチンを魚類に経口投与することにより、細菌とウイルスを含む病原体に対して、免疫活性を増強させるという画期的なものである。

特開２００３−３０６４２７号公報

抗原として細菌を用いた場合には、前述の方法によって調製されたリポソームワクチンは、十分な効果を示す。しかしながら、抗原としてウイルスを用いた場合には、後述のように、リポソームワクチンにおいて、経時的にウイルスとリポソームとが分離してしまうことが判明した。
本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、ウイルスに対して有効に作用するリポソームワクチンの作製法を提供することである。

本発明者らは、鋭意検討の結果、リポソームワクチンを調製するに際して、予めウイルスを超音波処理しておくことで、ウイルスとリポソームとの分離現象を回避できることを見出し、基本的には本発明を完成させるに至った。
すなわち、上記課題を解決するための第１の発明に係るリポソームワクチンの作製法は、超音波処理したウイルスとリン脂質とを溶液中に共存させた状態で超音波処理を行ってリポソームを調製することを特徴とする。
上記発明において、前記ウイルスは、最初の超音波処理を行う前に、ホルマリン固定されていることが好ましい。
また、前記ウイルスは、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、イリドウイルスから選択されるものであることが好ましい。この場合に、ヘルペスウイルスは、コイヘルペスウイルスであることが好ましい。

また、第２の発明に係るリポソームワクチンは、上記第１の発明によって作製されたものである。
「ウイルス」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡをゲノムとして有し、宿主細胞内のみで複製する病原体の一種である。本発明の方法は、エンベロープウイルスと非エンベロープウイルスとのいずれに対しても用いることができる。ここで、エンベロープウイルスとは、核酸とそれを囲むタンパク質（キャプシド）から構成されるヌクレオキャプシドを取り囲む脂質膜（エンベロープ）を備えたウイルスを意味する。また、非エンベロープウイルスとは、そのようなエンベロープを持たないウイルスを意味する。

ウイルスとしては、例えば、（１）魚類のビルナウイルス、出血性敗血症ウイルス、伝染性造血器壊死症ウイルス、ヒラメラブドウイルス、スプリングバイレミアウイルス、ノダウイルス、ヘルペスウイルス、イリドウイルス、リンホシスチスウイルス、口白症ウイルス、鰓鬱血ウイルスなど、（２）エビなどの甲殻類の中腸腺壊死症バキュロウイルス、イエローヘッド病ウイルス、タウラシンドロームウイルス、ＭＢＶ病ウイルス、ＩＨＨＮウイルス、ＢＰウイルスなど、（３）ヒトなどの哺乳類のインフルエンザウイルス、エイズウイルス、ＳＡＲＳウイルス、肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルスなどが含まれる。本発明においては、これらのウイルスのうち、インフルエンザウイルス（特に、ヒトインフルエンザウイルス）、ヘルペスウイルス（特に、コイヘルペスウイルス）、イリドウイルスであることが好ましい。

また、ウイルスが特定されていない症状に対しては、その病気に罹患した動物（ヒトを含むことができる）から抽出したホモジネートをリポソームワクチン調製用に使用することもできる。ウイルスは、全体として用いることが好ましいが、その一部を用いることもできる。特に、ウイルスを抗原として用いる場合には、表面に表れる免疫原物質のみを適当に精製して用いることができる。
また、本発明は、治療的または予防的のいずれにも用いることができる。更に、病原体は、一種類のみを用いる場合の他に、二種類以上のものを混合して用いることもできる。
また、リポソームと一体化したウイルスは、ＰＣＲ法、ＤＮＡチップ、ＥＬＩＳＡ法等の方法により検出することができる。

「リポソーム」とは、リン脂質（ＰＬ，phospholipid）を含有する脂質二重層を含み、内部に水相を備えた閉鎖小胞のことを意味する。リポソームの形態は、脂質二重層が二層以上の複数に渡ってタマネギ状に重なった多重層リポソーム（ＭＬＶ，multilamellar vesicle）と、脂質二重層が一層の一枚膜リポソームとに分けられる。更に、一枚膜リポソームは、粒子径に応じて、より小さな一枚膜リポソーム（ＳＵＶ，small unilamellar vesicle）と、より大きな一枚膜リポソーム（ＬＵＶ，large unilamellar vesicle）とに分類される。本発明の方法では、超音波処理によりリポソームを調製するので、主として、脂質二重層が一層の一枚膜リポソーム（ＵＶ）を含む。

リン脂質とは、リン酸と脂質とを含む物質を意味し、その構成成分により、グリセロール骨格を有するグリセロリン脂質と、スフィンゴシン骨格を有するスフィンゴリン脂質とに分類される。グリセロリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン（レシチンともいう。本明細書中において、「ＰＣ」と略記することがある。）、ホスファチジルエタノールアミン（本明細書中において、「ＰＥ」と略記することがある。）、ホスファチジルセリン（本明細書中において、「ＰＳ」と略記することがある。）、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール（カルジオリピン）、ホスファチジン酸（本明細書中において、「ＰＡ」と略記することがある。）等を例示できる。

また、スフィンゴリン脂質としては、例えばスフィンゴミエリンを例示できる。本発明のリポソームを製造するには、上記各種のリン脂質成分を任意の比で混合したものを用いることができるが、ＰＣを主たる成分（例えば、リン脂質全体の約４０％〜約１００％の割合）とすることができる。また、ＰＣに加えて、ＰＳを添加することが好ましい。詳細な理由は不明であるが、ＰＳを添加することにより、二回目の超音波処理を行った後に、リン脂質二重膜とウイルスとが共存する状態が安定的に維持されること、及び細胞の貪食能が高まり消化管からのリポソームの吸収率が向上する等の利点が認められるからである。この場合に、ＰＳの混合割合としては、ＰＣの１質量部に対して、約０.１質量部〜約１質量部、好ましくは約０.２質量部〜約０.８質量部、更に好ましくは約０.３質量部〜約０.６質量部とする。なお、本発明のリポソームを調製するに当たっては、リン脂質に加えて、他の成分、例えばタンパク質・核酸・化合物等を予め混合しておくこともできる。

「超音波処理したウイルス」とは、リポソームを調製するに際して、リン脂質と共存させる前に、予めウイルスのみを超音波処理することを意味している。詳細は不明であるが、ウイルスのみを超音波処理することにより、ウイルスを物理的に変性させ、リン脂質と共存させた後、その状態を長期間に渡って安定的に保持できることが判った。

本発明によれば、ウイルスとリン脂質二重膜との分離現象を長期間に渡って阻止し、特定のウイルスに対して免疫作用を起こさせる安定なリポソームワクチンを提供することができる。また、このリポソームワクチンは、経口投与によっても、免疫作用を惹起できるので、特に魚類に対しては有効なものとなる。

次に、本発明の実施形態について、詳細に説明する。本発明の技術的範囲は、下記の実施形態によって限定されるものではなく、その要旨を変更することなく、様々に改変して実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。

＜比較例１＞ 従来法により調製したリポソームワクチンの安定性評価試験
１．インフルエンザウイルス含有リポソームワクチン（（Ｆ−ＩＦＶ／Ｒｈ−ＰＬ）−Ｖ）の調製
ローダミンで蛍光標識したリン脂質及びコレステロール（ＰＳ：ＰＣ：ＣＨＯＬ：N-(ローダミンBスルホニル)-ホスファチジルエタノールアミン（N-(rhodamine-B-sulfonyl)-phosphatidyl ethanolamine(Rh-PE)）をスクリューキャップ式試験管に入れ、ロータリーエバポレータでクロロホルムを除去した。このとき、リン脂質、ローダミンで蛍光標識したリン脂質及びコレステロールのモル比は、１：１０：５：０.００４とした。試験管の壁面に薄膜状となったリン脂質及びコレステロールに対して、フルオレセイン（fluorescein）で蛍光標識したヒトインフルエンザウイルス（Ｆ−ＩＦＶ）と10mM HEPES/100mM NaCl(pH7.5)（以下、「緩衝液Ａ」という）とを加え、アルゴンガスで試験管内を充填し、共栓をした。

この試験管をボルテックスミキサーで３０秒間処理することによりＭＬＶを調製した。このＭＬＶをプローブ型ソニケータを用いて、溶液が透明になるまで１分間の超音波処理と１分間の氷冷処理とを繰り返すことにより、ウイルス含有ＵＶ（以下、単に「Ｖ」（ベシクル）と省略することがある。）を調製した。得られたＵＶを４℃にて７５０ｘｇで５分間遠心分離して上清を採取した。こうして、リポソームワクチン（（Ｆ−ＩＦＶ／Ｒｈ−ＰＬ）−Ｖ）を調製した。

２．超音波処理インフルエンザウイルス（Ｆ−ＩＦＶ−Ｖ）の調製
５μｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬに調製したＦ−ＩＦＶに対し、緩衝液Ａを加えて全量を１ｍＬとし、ボルテックスミキサーで３０秒間処理した。このＦ−ＩＦＶをプローブ型ソニケータを用いて、溶液が透明になるまで１分間の超音波処理と１分間の氷冷処理とを繰り返すことにより、Ｆ−ＩＦＶ−Ｖを調製した。得られたＵＶを４℃にて７５０ｘｇで５分間遠心分離して上清を採取した。

３．ローダミン導入ＵＶ（Ｒｈ−ＰＬ−Ｖ）の調製
クロロホルムに溶かしたリン脂質、ローダミンで蛍光標識したリン脂質及びコレステロール（ＰＳ：ＰＣ：ＣＨＯＬ：Ｒｈ−ＰＥ）をスクリュ−キャップ式試験管に入れ、ロータリーエバポレータでクロロホルムを除去した。リン脂質及びコレステロールの質量比は、ＰＳ：ＰＣ：ＣＨＯＬ：Ｒｈ−ＰＥ＝１：１０：５：０.００４とした。

試験管の壁面に薄膜状となったリン脂質及びコレステロールに１.０ｍＬの緩衝液Ａを加え、アルゴンガスで試験管内を充填した後、共栓をした。この試験管をボルテックスミキサーで３０秒間処理して、ＭＬＶを調製した。このＭＬＶをプローブ型ソニケータを用いて、溶液が透明になるまで１分間の超音波処理と１分間の氷冷処理とを繰り返すことにより、ＵＶの調製を行った。得られたＵＶを４℃にて７５０ｘｇで５分間遠心分離して上清を採取し、ＵＶを形成しなかったリン脂質を除去した。

４．リン脂質の濃度測定
上記各サンプルについて、適宜リン脂質の濃度を測定した。測定手順は、次の通りとした。すなわち、サンプルとコントロール（ＫＨ_２ＰＯ_４溶液）のそれぞれについて、０.４ｍＬの１０Ｎ硫酸を添加した後、ブロックヒータを用いて１７０℃で３０分間以上加熱した。これを室温に放冷した後、１００μＬの３０％過酸化水素水を添加し、再び１７０℃で３０分間以上加熱した。

次に、これを室温に放冷した後、サンプルとコントロールのそれぞれの溶液に対して、０.２５Ｎ硫酸に溶解したモリブデン酸アンモニウム（０.２２％（ＮＨ_４）_６Ｍｏ_７Ｏ_２４・４Ｈ_２Ｏ）をモリブデン酸アンモニウムの最終濃度が０.０４４％になるように添加してボルテックスした後、発色試薬（フィスケ・サバロー試薬：３０ｍｇ ＡＮＳＡ、１ｍｇ Ｎａ_２ＳＯ_４）を加えて、沸騰水中で１０分間加熱した。空冷後、サンプル及びコントロールとして使用したＫＨ_２ＰＯ_４の吸光度を８３０ｎｍで測定することにより、サンプル中のリン含有量を決定した。

５．タンパク質の濃度測定
上記各サンプルについて、適宜タンパク質の濃度を測定した。測定手順は、次の通りとした。すなわち、濃度既知のＢＳＡ標準品とサンプルのそれぞれ１３００μＬに２００μＬのブラッドフォード試薬を加えて、ボルテックスした後、吸光度を５９５ｎｍで測定することにより、サンプル中のタンパク質含有量を決定した。

６．作製されたリポソームのキャラクタリゼーション
上記各サンプルをセファクリルＳ−１０００カラムにアプライし分取した後、各フラクションについて、フルオレセインとローダミンの蛍光強度をそれぞれ励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ、及び励起波長５７０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍで測定した。

図１には、Ｆ−ＩＦＶ−ＶとＲｈ−ＰＬ−Ｖとを別々にカラムにアプライし分取した後、前者のフラクションについてはフルオレセインの蛍光強度を、後者のフラクションについてはローダミンの蛍光強度を、それぞれ測定した結果を示した。この結果より、両者を別々に調製し、混合しただけでは、インフルエンザウイルスとリン脂質とは、ほとんど一体化しないことが判った。

図２には、（Ｆ−ＩＦＶ／Ｒｈ−ＰＬ）−Ｖを調製した後にカラムにアプライし分取した後、各フラクションについて、フルオレセインとローダミンの蛍光強度を測定した結果を示した。フラクション番号が２０番〜３５番の間では、フルオレセインとローダミンの蛍光強度が一致して増減していることから、インフルエンザがリン脂質二重膜と共存していることが示された。

図３には、図２のフラクション番号が２０番〜３５番の分取サンプルを４８時間経過した後に、再度セファクリルＳ−１０００カラムにアプライし分取した後、各フラクションについて、フルオレセインとローダミンの蛍光強度を測定した結果を示した。図２では、フルオレセインとローダミンの蛍光強度パターンは一致していたものの、図３では、明らかに両者のパターンは位置ずれしていた。このことより、インフルエンザウイルスは、一旦はリン脂質二重膜と共存したものの、時間の経過により、両者は分離してしまったことが判った。

＜実施例１＞ リポソームワクチンの安定性評価試験１
１．ウイルスワクチン（（Ｆ−ＩＦＶ−Ｖ／Ｒｈ−ＰＬ）−Ｖ）の調製
５μｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬに調整したＦ−ＩＦＶに対し、緩衝液Ａを加えて全量を１ｍＬとし、ボルテックスミキサーで３０秒間処理した。このＦ−ＩＦＶをプローブ型ソニケータを用いて、上記溶液が透明になるまで１分間の超音波処理と１分間の氷冷処理とを繰り返すことにより、インフルエンザウイルスを超音波処理した。

ローダミンで蛍光標識したリン脂質及びコレステロール（ＰＳ：ＰＣ：ＣＨＯＬ：Ｒｈ−ＰＥ）をスクリューキャップ式試験管に入れ、ロータリーエバポレータでクロロホルムを除去した。このとき、リン脂質、ローダミンで蛍光標識したリン脂質及びコレステロールのモル比は、１：１０：５：０.００４とした。試験管の壁面に薄膜状となったリン脂質及びコレステロールに対して、超音波処理したインフルエンザウイルスと緩衝液Ａとを加え、アルゴンガスで試験管内を充填し、共栓をした。

この試験管をボルテックスミキサーで３０秒間処理することによりＭＬＶを調製した。このＭＬＶをプローブ型ソニケータを用いて、溶液が透明になるまで１分間の超音波処理と１分間の氷冷処理とを繰り返すことにより、ウイルス含有ＵＶを調製した。得られたＵＶを４℃にて７５０ｘｇで５分間遠心分離して上清を採取し、リポソームワクチン（（Ｆ−ＩＦＶ−Ｖ／Ｒｈ−ＰＬ）−Ｖ）を調製した。
（Ｆ−ＩＦＶ−Ｖ）の調製、（Ｒｈ−ＰＬ−Ｖ）の調製、リン脂質の濃度測定、タンパク質の濃度測定は、前述の＜比較例１＞の２〜５に従って行った。

２．リポソームのキャラクタリゼーション
＜比較例１＞の６に記載の方法に従って、リポソームのキャラクタリゼーションを行った。
図１に示すように、インフルエンザウイルスとリン脂質とは、混合しただけでは、ほとんど一体化しなかった。
図４には、（Ｆ−ＩＦＶ−Ｖ／Ｒｈ−ＰＬ）−Ｖを調製した後にカラムにアプライし分取した後、各フラクションについて、フルオレセインとローダミンの蛍光強度を測定した結果を示した。フラクション番号が１８番〜４０番の間では、フルオレセインとローダミンの蛍光強度が一致して増減していることから、インフルエンザがリン脂質二重膜と共存していることが示された。

図５には、図４のフラクション番号が１８番〜４０番の分取サンプルを４８時間経過した後に、再度セファクリルＳ−１０００カラムにアプライし分取した後、各フラクションについて、フルオレセインとローダミンの蛍光強度を測定した結果を示した。図５においても、図４と同様に、フルオレセインとローダミンの蛍光強度パターンは一致していた。このことより、本実施例により調製されたリポソームワクチンでは、インフルエンザウイルスとリン脂質二重膜との共存状態は、長時間に渡って安定的に維持されることが判った。

３．蛍光顕微鏡による観察
図６〜図８には、（Ｆ−ＩＦＶ−Ｖ／Ｒｈ−ＰＬ）−Ｖを蛍光顕微鏡観察したときの結果を示した。これらの図より、ローダミンの蛍光像（図７）と、フルオレセインの蛍光像（図８）は、共に（Ｆ−ＩＦＶ−Ｖ／Ｒｈ−ＰＬ）−Ｖの位置（図６）にあった。また、フルオレセインの蛍光像は、リン脂質二重膜の内部水層ではなく、リン脂質二重膜の蛍光像に一致していることから、ウイルスは、リポソームを構成するリン脂質二重膜と安定的に共存していることが判った。

４．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析
ワクチンを製造する前のＩＦＶ、ＩＦＶ−Ｖ、及び（ＩＦＶ−Ｖ／ＰＬ）−ＶをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｌａｅｍｍｌｉの方法に従った。まず、サンプルに等量のサンプル緩衝液（１１４ｍＭトリス塩酸（ｐＨ６.８）、３.６４％ＳＤＳ、２５.４％グルセロール、９％ βメルカプトエタノール、０.０２％ブロムフェノールブルー）を加え、５分間沸騰して変性させた。次に、１２％分離用ゲル（１２％アクリルアミド、０.４１％ビスアクリルアミド、３７５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８.８）、０.０１％ＡＰＳ、０.００１％ＴＥＭＥＤ）からなるスラブゲルとランニング緩衝液（０.１％ＳＤＳ、２５ｍＭトリス、５２ｍＭグリシン（ｐＨ８.３））を泳動槽にセットし、サンプルを濃縮ゲルの注入孔に注入後、ゲル１枚について３０ｍＡの定電流で約９０分間通電した。電気泳動が終了後、ゲルを染色液中に浸してゲル中のタンパク質を染色した後、脱色した。
図９には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後に、ゲルを銀染色したときの写真を示した。ＩＦＶでは５０ｋＤ以下の低分子量側に２本の大きなバンドが認められた。超音波処理したＩＦＶ−Ｖ及び（ＩＦＶ−Ｖ／ＰＬ）−Ｖでは、そのようなバンドが認められなかった。（ＩＦＶ−Ｖ／ＰＬ）−Ｖの泳動パターンは、ＩＦＶ−Ｖの泳動パターンと一致することより、ＩＦＶはリン脂質二重膜と共存していることが判った。

＜実施例２＞ リポソームワクチンの安定性評価試験２
本実施例では、ウイルスとして、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）を用いた。ＫＨＶは、ＫＨＶにより斃死したコイのホモジネートより調製した。ＩＦＶに代えて、ＫＨＶを用いた以外は、実施例１に従って、１．ウイルスワクチンの調製を行った。

２．リポソームのキャラクタリゼーション
＜比較例１＞の６に記載の方法に従って、リポソームのキャラクタリゼーションを行った。
図１０には、Ｆ−ＫＨＶ−ＶとＲｈ−ＰＬ−Ｖとを別々にカラムにアプライし分取した後、前者のフラクションについてはフルオレセインの蛍光強度を、後者のフラクションについてはローダミンの蛍光強度を、それぞれ測定した結果を示した。この結果より、ＫＨＶとリン脂質とは、ほとんど一体化しないことが判った。

図１１には、（Ｆ−ＫＨＶ−Ｖ／Ｒｈ−ＰＬ）−Ｖを調製した後にカラムにアプライし分取した後、各フラクションについて、フルオレセインとローダミンの蛍光強度を測定した結果を示した。フラクション番号が２０番〜２８番の間では、フルオレセインとローダミンの蛍光強度が一致して増減していることから、ＫＨＶがリン脂質二重膜と共存していることが示された。

３．共焦点レーザー顕微鏡による観察
図１２〜図１４には、（Ｆ−ＫＨＶ−Ｖ／Ｒｈ−ＰＬ）−Ｖを共焦点レーザー顕微鏡観察したときの結果を示した。図１２には、フルオレセインの蛍光の様子を、図１３には、ローダミンの蛍光の様子を示した。また、図１４には、両写真を合成した様子を示した。フルオレセインの蛍光像とローダミンの蛍光像とは重なっていたことから、ＫＨＶはリポソームを構成するリン脂質二重膜と安定的に共存していることが判った。
４．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析
ワクチンを製造する前のＫＨＶ、ＫＨＶ−Ｖ、及び（ＫＨＶ−Ｖ／ＰＬ）−ＶをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、＜実施例１＞の４に記載の方法に従って行った。図１５には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後に、ゲルを銀染色したときの写真をそれぞれ示した。この結果からも、ＫＨＶがリン脂質二重膜と共存していることが認められた。

＜実施例３＞ リポソームワクチンの安定性評価試験３
イリドウイルスを用いた場合の結果
本実施例では、ウイルスとして、イリドウイルス（ＩＶ）を用いた。ＩＶは、イリド不活化ワクチン「ビケン」を用いた。ＩＦＶに代えて、ＩＶを用いた以外は、実施例１に従って、１．ウイルスワクチンの調製を行った。

２．リポソームのキャラクタリゼーション
＜比較例１＞の６に記載の方法に従って、リポソームのキャラクタリゼーションを行った。
図１６には、Ｆ−ＩＶ−ＶとＲｈ−ＰＬ−Ｖとを別々にカラムにアプライし分取した後、前者のフラクションについてはフルオレセインの蛍光強度を、後者のフラクションについてはローダミンの蛍光強度を、それぞれ測定した結果を示した。この結果より、ＩＶとリン脂質とは、ほとんど一体化しないことが判った。

図１７には、（Ｆ−ＩＶ−Ｖ／Ｒｈ−ＰＬ）−Ｖを調製した後にカラムにアプライし分取した後、各フラクションについて、フルオレセインとローダミンの蛍光強度を測定した結果を示した。フラクション番号が１８番〜３２番の間では、フルオレセインとローダミンの蛍光強度が一致して増減していることから、ＩＶがリン脂質二重膜と共存していることが示された。

図１８には、図１７のフラクション番号が１８番〜３２番の分取サンプルを４８時間経過した後に、再度セファクリルＳ−１０００カラムにアプライし分取した後、各フラクションについて、フルオレセインとローダミンの蛍光強度を測定した結果を示した。図１８においても、図１７と同様に、フルオレセインとローダミンの蛍光強度パターンは一致していた。このことより、本実施例により調製されたリポソームワクチンでは、イリドウイルスとリン脂質二重膜との共存状態は、長時間に渡って安定的に維持されることが判った。

３．共焦点レーザー顕微鏡による観察
図１９〜図２１には、（Ｆ−ＩＶ−Ｖ／Ｒｈ−ＰＬ）−Ｖを共焦点レーザー顕微鏡観察したときの結果を示した。図１９には、フルオレセインの蛍光の様子を、図２０には、ローダミンの蛍光の様子を示した。また、図２１には、両写真を合成した様子を示した。両蛍光像は重なっていたことから、ＩＶは、リポソームを構成するリン脂質二重膜と安定的に共存していることが判った。

４．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析
ワクチンを製造する前のＩＶ、ＩＶ−Ｖ、及びＩＶ／ＰＬ−ＶをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。
図２２には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後に、ゲルをクマシーブリリアントブルーで染色したときの写真を示した。図２３には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後に、ゲルを銀染色したときの写真を示した。この結果からも、ＩＶがリン脂質二重膜と共存していることが認められた。

＜実施例４＞ ＰＳの効果確認試験１
次に、ワクチンを作製する際のリン脂質の種類を評価するため、ホスファチジン酸（ＰＡ）とＰＳとの差違を確認する試験を行った。
１．ＰＡを用いたワクチン
ローダミンで蛍光標識したリン脂質及びコレステロール（ＰＡ：ＰＣ：ＣＨＯＬ：Ｒｈ−ＰＥ＝１：１０：５：０.００４）を用い、ＩＦＶと共にワクチンを調製した。調製方法は、＜実施例１＞の１に記載の方法に従った。

２．ＰＳを用いたワクチン
ローダミンで蛍光標識したリン脂質及びコレステロール（ＰＳ：ＰＣ：ＣＨＯＬ：Ｒｈ−ＰＥ＝１：１０：５：０.００４）を用い、ＩＦＶと共にワクチンを調製した。調製方法は、＜実施例１＞の１に記載の方法に従った。

３．リポソームのキャラクタリゼーション
上記１及び２のリポソームワクチンのそれぞれについて、＜比較例１＞の６に記載の方法に従って、キャラクタリゼーションを行った。
図２４には、ＰＡを用いて調製したワクチンについて、（Ｆ−ＩＦＶ−Ｖ／Ｒｈ−ＰＬ）−Ｖを調製した後にカラムにアプライし分取した後、各フラクションについて、フルオレセインとローダミンの蛍光強度を測定した結果を示した。フラクション番号が２５番〜３３番の間では、フルオレセインとローダミンの蛍光強度が一致して増減していることから、ＩＦＶがリン脂質二重膜と共存していることが示された。

図２５には、図２４のフラクション番号が２５番〜３３番の分取サンプルを４８時間経過した後に、再度セファクリルＳ−１０００カラムにアプライし分取した後、各フラクションについて、フルオレセインとローダミンの蛍光強度を測定した結果を示した。図より、一部のフルオレセインとローダミンの蛍光強度の変化は一致しているものの、ローダミンのピークの後ろに別のフルオレセインのピークが発生したことが分かった。このことより、一旦はリポソームと共存したＩＦＶが、時間の経過に連れて一部リポソームから分離したことが判った。

一方、ＰＳを用いて調製したワクチンについて、（Ｆ−ＩＦＶ−Ｖ／Ｒｈ−ＰＬ）−Ｖを調製した後にカラムにアプライし分取した後、各フラクションについて、フルオレセインとローダミンの蛍光強度を測定した結果は、既に図４及び図５に示した通りである。これらの図より、フルオレセインとローダミンの蛍光強度の変化は一致して増減しており、フルオレセインについて、別のピークは認められなかったことから、リポソームと共存したＩＦＶは、安定してリン脂質二重膜と共存していることが判った。
こうして、一定量のＰＳを用いることが、ウイルスとリン脂質二重膜との共存状態を安定して維持できることが判った。

＜実施例５＞ ＰＳの効果確認試験２
次に、ＰＳの有効性を確認するために、イリドウイルスを用い、＜実施例４＞と同様の試験を行った。
１．ＰＡを用いたワクチン
ローダミンで蛍光標識したリン脂質及びコレステロール（ＰＡ：ＰＣ：ＣＨＯＬ：Ｒｈ−ＰＥ＝１：１０：５：０.００４）を用い、ＩＶと共にワクチンを調製した。調製方法は、＜実施例１＞の１に記載の方法に従った。

２．ＰＳを用いたワクチン
ローダミンで蛍光標識したリン脂質及びコレステロール（ＰＳ：ＰＣ：ＣＨＯＬ：Ｒｈ−ＰＥ＝１：１０：５：０.００４）を用い、ＩＶと共にワクチンを調製した。調製方法は、＜実施例１＞の１に記載の方法に従った。
３．リポソームのキャラクタリゼーション
上記１及び２のリポソームワクチンのそれぞれについて、＜比較例１＞の６に記載の方法に従って、キャラクタリゼーションを行った。
図２６には、ＰＡを用いて調製したワクチンについて、（Ｆ−ＩＶ−Ｖ／Ｒｈ−ＰＬ）−Ｖを調製した後にカラムにアプライし分取した後、各フラクションについて、フルオレセインとローダミンの蛍光強度を測定した結果を示した。フラクション番号が２１番〜３５番の間では、フルオレセインとローダミンの蛍光強度が一致して増減していることから、ＩＶがリン脂質二重膜と共存していることが示された。

図２７には、図２６のフラクション番号が２１番〜３５番の分取サンプルを４８時間経過した後に、再度セファクリルＳ−１０００カラムにアプライし分取した後、各フラクションについて、フルオレセインとローダミンの蛍光強度を測定した結果を示した。図より、一部のフルオレセインとローダミンの蛍光強度の変化は一致しているものの、ローダミンのピークの後ろにフルオレセインのなだらかなピークが発生したことが分かった。このことより、一旦はリポソームと共存したＩＶが、時間の経過に連れて一部リポソームから分離したことが判った。

一方、ＰＳを用いて調製したワクチンについて、（Ｆ−ＩＶ−Ｖ／Ｒｈ−ＰＬ）−Ｖを調製した後にカラムにアプライし分取した後、各フラクションについて、フルオレセインとローダミンの蛍光強度を測定した結果は、既に図１７及び図１８に示した通りである。これらの図より、フルオレセインとローダミンの蛍光強度の変化は一致して増減しており、フルオレセインについて、別のピークは認められなかったことから、リポソームと共存したＩＶは、安定してリン脂質二重膜と共存していることが判った。
こうして、ＩＶを用いた場合にも、一定量のＰＳを用いることが、ウイルスとリン脂質二重膜との共存状態を安定して維持できることが示された。

＜実施例６＞ 免疫化による抗体産生能評価試験１
免疫化の評価には、ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いた。タンパク質濃度が、２μｇ／ｍＬ及び２０μｇ／ｍＬとなるように、２種類の（ＩＦＶ−Ｖ／ＰＬ）−Ｖを調製し、５００μＬ（ワクチン投与量として、１μｇ及び１０μｇ）を腹腔内に投与した。同時に、リポソーム、ＩＦＶ、ＩＦＶ−Ｖをそれぞれ腹腔内に投与したマウス、及び未処理のマウスをコントロールとした。１群当り２０匹のマウスを免疫化した。抗原投与から３週間後及び５週間後、マウスの眼窩静脈から採血し、得られた血清の抗体産生能をＥＬＩＳＡ法で評価した。結果を表１に示した。

表に示すとおり、リポソームワクチン（（ＩＦＶ−Ｖ／ＰＬ）−Ｖ）は、ＩｇＧの場合は、その他の抗原と同程度の抗体産生能を有していた。また、ＩｇＭの場合は、その他の抗原より高い抗体産生能を有することが判った。

＜実施例７＞ 免疫化による抗体産生能評価試験２
まず、コイをワクチン投与区（５尾）とワクチン非投与区（５尾）とに設定した。ワクチン非投与区には、通常のドライペレットのみを与えた。一方、ワクチン投与区には、ＰＳ／ＰＣ／ＣＨＯＬ（１：１０：５）の組成で調製した（ＫＨＶ−Ｖ／ＰＬ）−Ｖを吸収させたドライペレットを３日間に渡って連続的に経口投与した。３日間のワクチン摂取量は、１尾当り２０μＬであった。ワクチン投与終了から、２１日間は通常のペレットを投与した。
２２日目に、各区５尾から血液を採取し、ＫＦ−１細胞と培養したＫＨＶ懸濁液（１０^１.２５ＴＣＩＤ_５０／５０μＬ）を用い、血清の抗体価を二倍希釈法によって評価した。結果を表２に示した。

表に示すとおり、リポソームワクチン投与区では、抗体価が２３〜１２８と大きくなっており、抗体産生能を有することが判った。

＜実施例８＞ 生ウイルスによる攻撃試験１
１．ワクチンの投与
イリドウイルスに対して感受性がある体重８ｇのマダイ幼魚を用いた。１日に１尾のマダイ当り、ドライペレットに５０μＬのワクチンを浸潤させ、３日間に渡ってこのドライペレットを自由に摂取させることでワクチンを投与した。ワクチンとして、（Ｉ）ＰＳ／ＰＣ／ＣＨＯＬ（１：１０：５）の組成で調製した（ＩＶ−Ｖ／ＰＬ）−Ｖ及びＩＶ−Ｖ、並びに（ＩＩ）ＰＡ／ＰＣ／ＣＨＯＬ（１：１０：５）の組成で調製した（ＩＶ−Ｖ／ＰＬ）−Ｖ及びＩＶ−Ｖを用いた。（ＩＶ−Ｖ／ＰＬ）−Ｖ投与区、ＩＶ−Ｖ投与対照区ともに、２０尾のマダイを供試した。１回目のワクチンの投与の後、１０日間の間隔をあけて２回目のワクチンの投与（５０μＬ／尾／日、３日間）を行った。

２．ウイルス攻撃試験
体重１５ｇに成長したマダイ２０尾を、イリドウイルスを添加した海水に浸漬することにより、マダイにイリドウイルスを摂取させた。このマダイの生存率を２０日間に渡って評価した。
表３には、２０尾のマダイの生存率を示した。

ＰＡを用いたワクチンでは、コントロールと同等の生存率（８／２０）しか示さなかった。一方、ＰＳを用いたワクチンでは、有意に高い生存率（９／２０：１５／２０）を示したことから、本発明のワクチンの優位性が認められた。

＜実施例９＞ 生ウイルスによる攻撃試験２
コイをワクチン投与３区（各５尾）とワクチン非投与２区（各５尾）とに設定した。ワクチン非投与区には、通常のドライペレットのみを与えた。一方、ワクチン投与区には、ＰＳ／ＰＣ／ＣＨＯＬ（１：１０：５）の組成で調製した（ＫＨＶ−Ｖ／ＰＬ）−Ｖを吸収させたドライペレットを３日間に渡って連続的に経口投与した。３日間のワクチン摂取量は、１尾当り２０μＬであった。ワクチン投与終了から、２１日間は通常のペレットを投与した。
２２日目に、培養したＫＨＶ懸濁液（１０^１.３ＴＣＩＤ_５０／１００μＬ）を麻酔をかけたコイの鰓に滴下する方法で攻撃試験を行った。この攻撃試験は、ワクチン非投与区のコイに対しても、同日に行った。
結果を図２８及び表４に示した。

ワクチン非投与区（コントロール、または対照区）では、ＫＨＶによる攻撃後７日〜１６日で９０％の斃死（４／５、５／５）が起こった。これに対し、ワクチン投与区では、攻撃後７日〜９日でわずか２３％の斃死（０／５、１／４、２／４：第２区及び第３区では、飼育途中に水槽から各１尾が飛び出して死亡した）しか起こらず、２１日後の実験終了時に７７％のコイが生残した。

ＫＨＶの感染状況を確認する目的で、採取したコイの鰓と腎臓を用いて、ウイルスＤＮＡのＰＣＲ検査を行った。その結果、ワクチン非投与区の死亡魚９尾の鰓からＫＨＶのＤＮＡが検出され、一部のコイの腎臓からもＫＨＶのＤＮＡが検出された。また、ワクチン投与区の死亡魚３尾の鰓からもＫＨＶのＤＮＡが検出された。このことから、コイの斃死の原因は、ＫＨＶ感染であることが実証された。

これに対し、ワクチン投与区の生残魚１０尾の鰓からは、ＫＨＶのＤＮＡは検出されなかった（図２９及び図３０を参照）。この結果より、ワクチン投与区の生残魚は、ＫＨＶ感染を克服して生残したものと判断された。以上より、本実施形態の（ＫＨＶ−Ｖ／ＰＬ）−Ｖは、経口から投与された場合にも、ＫＨＶ抗原の腸管からの吸収と免疫系の刺激に対抗できることが示された。

このように本実施形態によれば、ウイルスとリン脂質二重膜との分離を長期間に渡って阻止し、安定な状況を維持することにより、特定のウイルスに対して免疫作用を起こさせるリポソームワクチンを提供することができた。このリポソームワクチンは、経口投与によっても有効であることから、特に魚類に対しては有効なものであった。

Ｆ−ＩＦＶ−ＶとＲｈ−ＰＬ−Ｖとを混合した後にゲルクロマトグラフィーにかけたときのフルオレセインとローダミンの溶出位置を示すグラフである。 （Ｆ−ＩＦＶ／Ｒｈ−ＰＬ）−Ｖをゲルクロマトグラフィーにかけたときのフルオレセインとローダミンの溶出位置を示すグラフである。 図２において、フルオレセインとローダミンとが一致したピークについて、所定時間の経過後にリクロマトしたときのフルオレセインとローダミンの溶出位置を示すグラフである。

（Ｆ−ＩＦＶ−Ｖ／Ｒｈ−ＰＬ）−Ｖをゲルクロマトグラフィーにかけたときのフルオレセインとローダミンの溶出位置を示すグラフである。 図４において、フルオレセインとローダミンとが一致したピークについて、所定時間の経過後にリクロマトしたときのフルオレセインとローダミンの溶出位置を示すグラフである。

（Ｆ−ＩＦＶ−Ｖ／Ｒｈ−ＰＬ）−Ｖの位相差顕微鏡写真図である。 図６と同じ位置において、ローダミンの蛍光を観察した蛍光顕微鏡写真図である。 図６と同じ位置において、フルオレセインの蛍光を観察した蛍光顕微鏡写真図である。 ＩＦＶ−Ｖ、（ＩＦＶ−Ｖ／ＰＬ）−Ｖ、及びＩＦＶをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後に銀染色したときのゲルの写真図である。

Ｆ−ＫＨＶ−ＶとＲｈ−ＰＬ−Ｖとを混合した後にゲルクロマトグラフィーにかけたときのフルオレセインとローダミンの溶出位置を示すグラフである。 （Ｆ−ＫＨＶ−Ｖ／Ｒｈ−ＰＬ）−Ｖをゲルクロマトグラフィーにかけたときのフルオレセインとローダミンの溶出位置を示すグラフである。 （Ｆ−ＫＨＶ−Ｖ／Ｒｈ−ＰＬ）−Ｖのフルオレセインの蛍光を観察した共焦点レーザ顕微鏡写真図である。 図１２と同じ位置において、ローダミンの蛍光を観察した共焦点レーザ顕微鏡写真図である。 図１２と図１３の蛍光を重ねたときの様子を示す図である。

ＫＨＶ、ＫＨＶ−Ｖ、及び（ＫＨＶ−Ｖ／ＰＬ）−ＶをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後に銀染色したときのゲルの写真図である。 Ｆ−ＩＶ−ＶとＲｈ−ＰＬ−Ｖとを混合した後にゲルクロマトグラフィーにかけたときのフルオレセインとローダミンの溶出位置を示すグラフである。 （Ｆ−ＩＶ−Ｖ／Ｒｈ−ＰＬ）−Ｖをゲルクロマトグラフィーにかけたときのフルオレセインとローダミンの溶出位置を示すグラフである。 図１７において、フルオレセインとローダミンとが一致したピークについて、所定時間の経過後にリクロマトしたときのフルオレセインとローダミンの溶出位置を示すグラフである。

（Ｆ−ＩＶ−Ｖ／Ｒｈ−ＰＬ）−Ｖのフルオレセインの蛍光を観察した共焦点レーザー顕微鏡写真図である。 図１９と同じ位置において、ローダミンの蛍光を観察した共焦点レーザ顕微鏡写真図である。 図１９と図２０の蛍光を重ねたときの様子を示す図である。 ＩＶ、ＩＶ−Ｖ、及びＩＶ／ＰＬ−ＶをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後にクマシーブリリアントブルー染色したときのゲルの写真図である。 ＩＶ、及びＩＶ／ＰＬ−ＶをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後に銀染色したときのゲルの写真図である。

ＰＡ／ＰＣ／ＣＨＯＬ（１：１０：５）の組成で調製した（Ｆ−ＩＦＶ−Ｖ／Ｒｈ−ＰＬ）−Ｖをゲルクロマトグラフィーにかけたときのフルオレセインとローダミンの溶出位置を示すグラフである。 図２４において、フルオレセインとローダミンとが一致したピークについて、所定時間の経過後にリクロマトしたときのフルオレセインとローダミンの溶出位置を示すグラフである。

ＰＡ／ＰＣ／ＣＨＯＬ（１：１０：５）の組成で調製した（Ｆ−ＩＶ−Ｖ／Ｒｈ−ＰＬ）−Ｖをゲルクロマトグラフィーにかけたときのフルオレセインとローダミンの溶出位置を示すグラフである。 図２６において、フルオレセインとローダミンとが一致したピークについて、所定時間の経過後にリクロマトしたときのフルオレセインとローダミンの溶出位置を示すグラフである。

コイをＫＨＶで攻撃したときの経過日数と生残数との関係を示すグラフである。上側の線はワクチン投与区を、下側の線はワクチン非投与区の様子を示している。 ワクチン投与区における生残魚の鰓（Ｇ）と腎臓（Ｋ）におけるＫＨＶ遺伝子の有無をＰＣＲ法で解析したときの様子を示すゲルの写真図である。Ｇ及びＫの後ろの数字は、生残したコイの番号（１〜４）を示している。 図２９と同様のゲルの写真図である。但し、生残したコイの番号は、５〜８である。

Claims (4)

1. 最初の超音波処理したウイルスと、リン脂質とを溶液中に共存させた後、第２回目の超音波処理を行うことにより、前記ウイルスとリン脂質との分離現象を阻止したリポソームを調製することを特徴とするリポソームワクチンの作製法。
2. 前記ウイルスは、最初の超音波処理を行う前に、ホルマリン処理により不活化されていることを特徴とする請求項１に記載のリポソームワクチンの作製法。
3. 前記ウイルスは、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、イリドウイルスから選択されるものであることを特徴とする請求項１または２に記載のリポソームワクチンの作製法。
4. 前記ヘルペスウイルスは、コイヘルペスウイルスであることを特徴とする請求項３に記載のリポソームワクチンの作製法。