WO2006090816A1

WO2006090816A1 - リポソームワクチンの作製法

Info

Publication number: WO2006090816A1
Application number: PCT/JP2006/303371
Authority: WO
Inventors: Tetsuro Yoshimura; Teruo Miyazaki; Yasuhiro Yasutomi
Original assignee: Mie University; Medical & Biological Laboratories Co., Ltd.
Priority date: 2005-02-25
Filing date: 2006-02-24
Publication date: 2006-08-31
Also published as: JPWO2006090816A1; JP5114628B2

Abstract

　長期間に渡って安定的に維持できると共に、有効な免疫活性能を有するリポソームワクチンの製造法を提供することを課題とする。この課題は、リン脂質と、超音波処理したウイルスとを共存させた状態で超音波処理することにより、リポソームワクチンを作製する。このリポソームワクチンでは、ウイルスはリポソームを構成するリン脂質二重膜と共存した状態で長期間に渡って安定に維持されると共に、魚類及び哺乳類に対して有効な免疫能を有している。

Description

明細書

リボソームワクチンの作製法

技術分野

[0001] 本発明は、リボソームワクチンの作製法に関する。

背景技術

[0002] 現在、哺乳類、及び魚類にお!ヽては、様々なウィルスが感染することが知られて!/ヽる。特に、新興ウィルス感染症は、人類のみならず、生物界全体の脅威になっている。魚類の養殖現場においても、そのようなウィルスによる魚病の被害額は毎年甚大に上っている。そのようなウィルス感染症に対しては、研究開発が進められているものの、未だに充分に有効な手段が開発されているとは言い難い。このような現状に対して、ワクチンによる水棲動物病対策が求められてきた。

本発明者は、上記現状に鑑み、特開 2003— 306427に開示されたリボソームワクチンを開発した。このリボソームワクチンは、死滅させた病原体とリン脂質とを混在させておき、超音波処理することにより製造されるものであり、脂質二重膜に病原体が含まれている。このリボソームワクチンを魚類に経口投与することにより、細菌とウィルスを含む病原体に対して、免疫活性を増強させるという画期的なものである。

[0003] 特許文献 1：特開 2003— 306427号公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0004] 抗原として細菌を用いた場合には、前述の方法によって調製されたリボソームワクチンは、十分な効果を示す。しかしながら、抗原としてウィルスを用いた場合には、後述のように、リボソームワクチンにおいて、経時的にウィルスとリボソームとが分離してしまうことが判明した。

本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、ウィルスに対して有効に作用するリボソームワクチンの作製法を提供することである。

課題を解決するための手段

[0005] 本発明者らは、鋭意検討の結果、リボソームワクチンを調製するに際して、予めウイルスを超音波処理しておくことで、ウィルスとリボソームとの分離現象を回避できることを見出し、基本的には本発明を完成させるに至った。

すなわち、上記課題を解決するための第 1の発明に係るリボソームワクチンの作製法は、超音波処理したウィルスとリン脂質とを溶液中に共存させた状態で超音波処理を行ってリボソームを調製することを特徴とする。

上記発明において、前記ウィルスは、最初の超音波処理を行う前に、ホルマリン固定されて!/、ることが好まし!/、。

また、前記ウィルスは、インフルエンザウイルス、ヘルぺスウィルス、イリドウィルスから選択されるものであることが好ましい。この場合に、ヘルぺスウィルスは、コィヘルべスウィルスであることが好まし!/、。

[0006] また、第 2の発明に係るリボソームワクチンは、上記第 1の発明によって作製されたものである。

「ウィルス」とは、 DNAまたは RNAをゲノムとして有し、宿主細胞内のみで複製する病原体の一種である。本発明の方法は、エンベロープウィルスと非エンベロープウイルスとのいずれに対しても用いることができる。ここで、エンベロープウィルスとは、核酸とそれを囲むタンパク質 (キヤプシド)力も構成されるヌクレオキヤプシドを取り囲む脂質膜 (エンベロープ)を備えたウィルスを意味する。また、非エンベロープウィルスとは、そのようなエンベロープを持たな、ウィルスを意味する。

[0007] ウィルスとしては、例えば、（1)魚類のビルナウィルス、出血性敗血症ウィルス、伝染性造血器壊死症ウィルス、ヒラメラブドウィルス、スプリングノィレミアウィルス、ノダウイノレス、へノレぺスゥイノレス、イリドウイノレス、リンホシスチスウイノレス、口白症ゥイノレス、鰓鬱血ウィルスなど、（2)ェビなどの甲殻類の中腸腺壊死症バキュロウィルス、イエロ一ヘッド病ウィルス、タウラシンドロームウィルス、 MBV病ウィルス、 IHHNウィルス、 BPウィルスなど、（3)ヒトなどの哺乳類のインフルエンザウイルス、エイズウイルス、 S ARSウィルス、肝炎ウィルス、日本脳炎ウィルスなどが含まれる。本発明においては、これらのウィルスのうち、インフルエンザウイルス（特に、ヒトインフルエンザウイルス）、ヘルぺスウィルス（特に、コィヘルぺスウィルス）、イリドウィルスであることが好ましい [0008] また、ウィルスが特定されて、な、症状に対しては、その病気に罹患した動物（ヒトを含むことができる）力も抽出したホモジネートをリボソームワクチン調製用に使用することもできる。ウィルスは、全体として用いることが好ましいが、その一部を用いることもできる。特に、ウィルスを抗原として用いる場合には、表面に表れる免疫原物質のみを適当に精製して用いることができる。

また、本発明は、治療的または予防的のいずれにも用いることができる。更に、病原体は、一種類のみを用いる場合の他に、二種類以上のものを混合して用いることもできる。

また、リボソームと一体化したウィルスは、 PCR法、 DNAチップ、 ELISA法等の方法により検出することができる。

[0009] 「リボソーム」とは、リン脂質 (PL, phospholipid)を含有する脂質二重層を含み、内部に水相を備えた閉鎖小胞のことを意味する。リボソームの形態は、脂質二重層が二層以上の複数に渡ってタマネギ状に重なった多重層リボソーム（MLV, multilamellar vesicle)と、脂質二重層が一層の一枚膜リボソームとに分けられる。更に、一枚膜リポソームは、粒子径に応じて、より小さな一枚膜リボソーム（SUV, small unilamellar vesi cle)と、より大きな一枚膜リボソーム（LUV, large unilamellar vesicle)とに分類される。本発明の方法では、超音波処理によりリボソームを調製するので、主として、脂質二重層が一層の一枚膜リボソーム (UV)を含む。

[0010] リン脂質とは、リン酸と脂質とを含む物質を意味し、その構成成分により、グリセロール骨格を有するグリセ口リン脂質と、スフインゴシン骨格を有するスフインゴリン脂質とに分類される。グリセ口リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン (レシチンともいう。本明細書中において、「PC」と略記することがある。）、ホスファチジルエタノールァミン (本明細書中において、「PE」と略記することがある。）、ホスファチジルセリン (本明細書中において、「PS」と略記することがある。）、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール（カルジォリピン）、ホスファチジン酸 (本明細書中において、「PA」と略記することがある。）等を例示できる。

[0011] また、スフインゴリン脂質としては、例えばスフインゴミエリンを例示できる。本発明のリボソームを製造するには、上記各種のリン脂質成分を任意の比で混合したものを用いることができるが、 PCを主たる成分 (例えば、リン脂質全体の約 40%〜約 100%の割合）とすることができる。また、 PCにカ卩えて、 PSを添加することが好ましい。詳細な理由は不明であるが、 PSを添加することにより、二回目の超音波処理を行った後に、リン脂質二重膜とウィルスとが共存する状態が安定的に維持されること、及び細胞の貪食能が高まり消化管力のリボソームの吸収率が向上する等の利点が認められる力もである。この場合に、 PSの混合割合としては、 PCの 1質量部に対して、約 0.1質量部〜約 1質量部、好ましくは約 0.2質量部〜約 0.8質量部、更に好ましくは約 0.3 質量部〜約 0.6質量部とする。なお、本発明のリボソームを調製するに当たっては、リン脂質に加えて、他の成分、例えばタンパク質'核酸'ィ匕合物等を予め混合しておくことちでさる。

[0012] 「超音波処理したウィルス」とは、リボソームを調製するに際して、リン脂質と共存させる前に、予めウィルスのみを超音波処理することを意味している。詳細は不明である力ウィルスのみを超音波処理することにより、ウィルスを物理的に変性させ、リン脂質と共存させた後、その状態を長期間に渡って安定的に保持できることが判った。発明の効果

[0013] 本発明によれば、ウィルスとリン脂質二重膜との分離現象を長期間に渡って阻止し、特定のウィルスに対して免疫作用を起こさせる安定なリボソームワクチンを提供することができる。また、このリボソームワクチンは、経口投与によっても、免疫作用を惹起できるので、特に魚類に対しては有効なものとなる。

発明を実施するための最良の形態

[0014] 次に、本発明の実施形態について、詳細に説明する。本発明の技術的範囲は、下記の実施形態によって限定されるものではなぐその要旨を変更することなぐ様々に改変して実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。

[0015] <比較例 1 > 従来法により調製したリボソームワクチンの安定性評価試験

1.インフルエンザウイルス含有リボソームワクチン（（F— IFV/Rh— PL)—V)の調製

ローダミンで蛍光標識したリン脂質及びコレステロール（PS： PC： CHOL： N- (ローダミン Bスルホ -ル) -ホスファチジルエタノールァミン（N- (rhodamine- B- sulfonyl)- phos phatidyl ethanolamine(Rh- PE))をスクリューキャップ式試験管に入れ、ロータリーエバポレータでクロ口ホルムを除去した。このとき、リン脂質、ローダミンで蛍光標識したリン脂質及びコレステロールのモル比は、 1 : 10 : 5 : 0.004とした。試験管の壁面に薄膜状となったリン脂質及びコレステロールに対して、フルォレセイン (fluorescein)で蛍光標識したヒトインフルエンザウイルス（F— IFV)と 10mM HEPES/lOOmM NaCl(pH7. 5) (以下、「緩衝液 A」という）とを加え、アルゴンガスで試験管内を充填し、共栓をした

[0016] この試験管をボルテックスミキサーで 30秒間処理することにより MLVを調製した。

この MLVをプローブ型ソ-ケータを用いて、溶液が透明になるまで 1分間の超音波処理と 1分間の氷冷処理とを繰り返すことにより、ウィルス含有 UV (以下、単に「V」（べシクル）と省略することがある。）を調製した。得られた UVを 4°Cにて 750xgで 5分間遠心分離して上清を採取した。こうして、リボソームワクチン（(F— IFVZRh— PL) V)を調製した。

[0017] 2.超音波処理インフルエンザウイルス（F— IFV—V)の調製

5 μ gZmL〜50 μ g/mLに調製した F—IFVに対し、緩衝液 Aを加えて全量を 1 mLとし、ボルテックスミキサーで 30秒間処理した。この F— IFVをプローブ型ソ-ケータを用いて、溶液が透明になるまで 1分間の超音波処理と 1分間の氷冷処理とを繰り返すことにより、 F— IFV— Vを調製した。得られた UVを 4°Cにて 750xgで 5分間遠心分離して上清を採取した。

[0018] 3.ローダミン導入 UV (Rh— PL— V)の調製

クロ口ホルムに溶かしたリン脂質、ローダミンで蛍光標識したリン脂質及びコレステロール（PS： PC： CHOL： Rh-PE)をスクリユーキャップ式試験管に入れ、ロータリーエバポレータでクロ口ホルムを除去した。リン脂質及びコレステロールの質量比は、 P S : PC : CHOL:Rh—PE= 1 : 10 : 5 : 0.004とした。

[0019] 試験管の壁面に薄膜状となったリン脂質及びコレステロールに l.OmLの緩衝液 A を加え、アルゴンガスで試験管内を充填した後、共栓をした。この試験管をボルテックスミキサーで 30秒間処理して、 MLVを調製した。この ML Vをプローブ型ソ-ケータを用いて、溶液が透明になるまで 1分間の超音波処理と 1分間の氷冷処理とを繰り返すことにより、 UVの調製を行った。得られた UVを 4°Cにて 750xgで 5分間遠心分離して上清を採取し、 UVを形成しな力たリン脂質を除去した。

[0020] 4.リン脂質の濃度測定

上記各サンプルについて、適宜リン脂質の濃度を測定した。測定手順は、次の通りとした。すなわち、サンプルとコントロール (KH PO溶液）のそれぞれについて、 0.4

2 4

mLの ION硫酸を添カ卩した後、ブロックヒータを用いて 170°Cで 30分間以上加熱した。これを室温に放冷した後、 100 Lの 30%過酸ィ匕水素水を添カ卩し、再び 170°Cで 30分間以上加熱した。

[0021] 次に、これを室温に放冷した後、サンプルとコントロールのそれぞれの溶液に対して、 0.25N硫酸に溶解したモリブデン酸アンモ-ゥム（0.22% (NH ) Mo O ·4Η

4 6 7 24 2

Ο)をモリブデン酸アンモ-ゥムの最終濃度が 0.044%になるように添カ卩してボルテツタスした後、発色試薬（フィスケ'サバロー試薬： 30mg ANSA、 lmg Na SO )を

2 4 カロえて、沸騰水中で 10分間加熱した。空冷後、サンプル及びコントロールとして使用した KH POの吸光度を 830nmで測定することにより、サンプル中のリン含有量を

2 4

決定した。

[0022] 5.タンパク質の濃度測定

上記各サンプルについて、適宜タンパク質の濃度を測定した。測定手順は、次の通りとした。すなわち、濃度既知の BSA標準品とサンプルのそれぞれ 1300 Lに 20 のブラッドフォード試薬をカ卩えて、ボノレテックスした後、吸光度を 595nmで測定することにより、サンプル中のタンパク質含有量を決定した。

[0023] 6.作製されたリボソームのキャラクタリゼーシヨン

上記各サンプルをセフアクリル S— 1000カラムにアプライし分取した後、各フラクシヨンにっ、て、フルォレセインとローダミンの蛍光強度をそれぞれ励起波長 495nm、蛍光波長 520nm、及び励起波長 570nm、蛍光波長 590nmで測定した。

[0024] 図 1には、ー1?¥—¥と!¾1ー？1^ー¥とを別々にカラムにアプライし分取した後、前者のフラクションにつ!/ヽてはフルォレセインの蛍光強度を、後者のフラクションにつ!/ヽてはローダミンの蛍光強度を、それぞれ測定した結果を示した。この結果より、両者を別々に調製し、混合しただけでは、インフルエンザウイルスとリン脂質とは、ほとんど一体ィ匕しないことが判った。

[0025] 図 2には、（F—IFVZRh—PL)—Vを調製した後にカラムにアプライし分取した後、各フラクションについて、フルォレセインとローダミンの蛍光強度を測定した結果を示した。フラクション番号が 20番〜 35番の間では、フルォレセインとローダミンの蛍光強度が一致して増減して、ることから、インフルエンザがリン脂質二重膜と共存していることが示された。

[0026] 図 3には、図 2のフラクション番号が 20番〜 35番の分取サンプルを 48時間経過した後に、再度セフアクリル S— 1000カラムにアプライし分取した後、各フラクションについて、フルォレセインとローダミンの蛍光強度を測定した結果を示した。図 2では、フルォレセインとローダミンの蛍光強度パターンは一致していたものの、図 3では、明らかに両者のパターンは位置ずれしていた。このことより、インフルエンザウイルスは、一旦はリン脂質二重膜と共存したものの、時間の経過により、両者は分離してしまつたことが判った。

[0027] <実施例 1 > リボソームワクチンの安定性評価試験 1

1.ウィルスワクチン（（F—IFV—VZRh— PL)— V)の調製

5 μ gZmL〜50 μ g/mLに調整した F— IFVに対し、緩衝液 Aを加えて全量を 1 mLとし、ボルテックスミキサーで 30秒間処理した。この F— IFVをプローブ型ソ-ケータを用いて、上記溶液が透明になるまで 1分間の超音波処理と 1分間の氷冷処理とを繰り返すことにより、インフルエンザウイルスを超音波処理した。

[0028] ローダミンで蛍光標識したリン脂質及びコレステロール（PS： PC： CHOL:Rh-PE )をスクリューキャップ式試験管に入れ、ロータリーエバポレータでクロ口ホルムを除去した。このとき、リン脂質、ローダミンで蛍光標識したリン脂質及びコレステロールのモル比は、 1 : 10 : 5 : 0.004とした。試験管の壁面に薄膜状となったリン脂質及びコレステロールに対して、超音波処理したインフルエンザウイルスと緩衝液 Aとを加え、アルゴンガスで試験管内を充填し、共栓をした。

[0029] この試験管をボルテックスミキサーで 30秒間処理することにより MLVを調製した。

この MLVをプローブ型ソ-ケータを用いて、溶液が透明になるまで 1分間の超音波処理と 1分間の氷冷処理とを繰り返すことにより、ウィルス含有 UVを調製した。得られた UVを 4°Cにて 750xgで 5分間遠心分離して上清を採取し、リボソームワクチン（ (F -IFV-V/Rh-PL) -V)を調製した。

(F— IFV— V)の調製、（Rh— PL— V)の調製、リン脂質の濃度測定、タンパク質の濃度測定は、前述の <比較例 1 >の 2〜5に従って行った。

[0030] 2.リボソームのキャラクタリゼーシヨン

く比較例 1 >の 6に記載の方法に従って、リボソームのキャラクタリゼーシヨンを行つた。

図 1に示すように、インフルエンザウイルスとリン脂質とは、混合しただけでは、ほとんど一体ィ匕しな力た。

図 4には、（F— IFV— VZRh— PL)—Vを調製した後にカラムにアプライし分取した後、各フラクションについて、フノレォレセインとローダミンの蛍光強度を測定した結果を示した。フラクション番号が 18番〜 40番の間では、フルォレセインとローダミンの蛍光強度が一致して増減して、ることから、インフルエンザがリン脂質二重膜と共存していることが示された。

[0031] 図 5には、図 4のフラクション番号が 18番〜 40番の分取サンプルを 48時間経過した後に、再度セフアクリル S— 1000カラムにアプライし分取した後、各フラクションについて、フルォレセインとローダミンの蛍光強度を測定した結果を示した。図 5においても、図 4と同様に、フルォレセインとローダミンの蛍光強度パターンは一致していた。このことより、本実施例により調製されたリボソームワクチンでは、インフルエンザウイルスとリン脂質二重膜との共存状態は、長時間に渡って安定的に維持されることが判つた o

[0032] 3.蛍光顕微鏡による観察

図 6〜図 8には、（F—IFV—VZRh—PL)—Vを蛍光顕微鏡観察したときの結果を示した。これらの図より、ローダミンの蛍光像（図 7)と、フルォレセインの蛍光像（図 8)は、共に（F— IFV— VZRh— PL)—Vの位置（図 6)にあった。また、フルォレセィンの蛍光像は、リン脂質二重膜の内部水層ではなぐリン脂質二重膜の蛍光像に一致していることから、ウィルスは、リボソームを構成するリン脂質二重膜と安定的に共存していることが判った。

[0033] 4. SDS— PAGEによる解析

ワクチンを製造する前の IFV、 IFV— V、及び（IFV— VZPL)—Vを SDS— PAG Eによって解析した。 SDS— PAGEは、 Laemmliの方法に従った。まず、サンプルに等量のサンプル緩衝液（114mMトリス塩酸（pH6.8)、 3.64%SDS、 25.4%グルセロール、 9% βメルカプトエタノール、 0.02%ブロムフエノールブルー）を加え、 5分間沸騰して変性させた。次に、 12%分離用ゲル（12%アクリルアミド、 0.41%ビスァクリルアミド、 375mMトリス塩酸（pH8.8)、 0.01%APS、 0.001%TEMED)からなるスラブゲルとランニング緩衝液（0.1 %SDS、 25mMトリス、 52mMグリシン（pH8.3 ；) )を泳動槽にセットし、サンプルを濃縮ゲルの注入孔に注入後、ゲル 1枚について 3 OmAの定電流で約 90分間通電した。電気泳動が終了後、ゲルを染色液中に浸してゲル中のタンパク質を染色した後、脱色した。

図 9には、 SDS— PAGEを行った後に、ゲルを銀染色したときの写真を示した。 IF Vでは 50kD以下の低分子量側に 2本の大きなバンドが認められた。超音波処理した IFV—V及び（IFV—VZPL)—Vでは、そのようなバンドが認められなかった。（IFV -V/PL) Vの泳動パターンは、 IFV—Vの泳動パターンと一致することより、 IFV はリン脂質二重膜と共存して、ることが判った。

[0034] <実施例 2> リボソームワクチンの安定性評価試験 2

本実施例では、ウィルスとして、コィヘルぺスウィルス（KHV)を用いた。 KHVは、 KHVにより斃死したコィのホモジネートより調製した。 IFVに代えて、 KHVを用いた以外は、実施例 1に従って、 1.ウィルスワクチンの調製を行った。

[0035] 2.リボソームのキャラクタリゼーシヨン

図 10には、 F— KHV— Vと Rh— PL— Vとを別々にカラムにアプライし分取した後、前者のフラクションについてはフルォレセインの蛍光強度を、後者のフラクションについてはローダミンの蛍光強度を、それぞれ測定した結果を示した。この結果より、 K HVとリン脂質とは、ほとんど一体ィ匕しないことが判った。 [0036] 図 11には、（F—KHV—VZRh—PL)—Vを調製した後にカラムにアプライし分取した後、各フラクションについて、フノレォレセインとローダミンの蛍光強度を測定した結果を示した。フラクション番号が 20番〜 28番の間では、フルォレセインとローダミンの蛍光強度が一致して増減していることから、 KHV力 Sリン脂質二重膜と共存していることが示された。

[0037] 3.共焦点レーザー顕微鏡による観察

図 12〜図 14には、（F— KHV— VZRh— PL)— Vを共焦点レーザー顕微鏡観察したときの結果を示した。図 12には、フルォレセインの蛍光の様子を、図 13には、口ーダミンの蛍光の様子を示した。また、図 14には、両写真を合成した様子を示した。フルォレセインの蛍光像とローダミンの蛍光像とは重なって、たことから、 KHVはリポソームを構成するリン脂質二重膜と安定的に共存していることが判った。

4. SDS— PAGEによる解析

ワクチンを製造する前の KHV、 KHV— V、及び（KHV— VZPL)— Vを SDS— P AGEによって解析した。 SDS— PAGEは、 <実施例 1 >の 4に記載の方法に従って行った。図 15には、 SDS— PAGEを行った後に、ゲルを銀染色したときの写真をそれぞれ示した。この結果からも、 KHV力 Sリン脂質二重膜と共存していることが認められた。

[0038] <実施例 3 > リボソームワクチンの安定性評価試験 3

イリドウィルスを用いた場合の結果

本実施例では、ウィルスとして、イリドウィルス (IV)を用いた。 IVは、イリド不活化ヮクチン「ピケン」を用いた。 IFVに代えて、 IVを用いた以外は、実施例 1に従って、 1. ウィルスワクチンの調製を行った。

[0039] 2.リボソームのキャラクタリゼーシヨン

図 16には、ー1^ー¥と1¾1ー？1^ー¥とを別々にカラムにアプライし分取した後、前者のフラクションにつ!/ヽてはフルォレセインの蛍光強度を、後者のフラクションにつ!/ヽてはローダミンの蛍光強度を、それぞれ測定した結果を示した。この結果より、 IVとリン脂質とは、ほとんど一体ィ匕しな、ことが判った。

[0040] 図 17には、（F— IV— VZRh— PL)— Vを調製した後にカラムにアプライし分取した後、各フラクションについて、フノレォレセインとローダミンの蛍光強度を測定した結果を示した。フラクション番号が 18番〜 32番の間では、フルォレセインとローダミンの蛍光強度が一致して増減して、ることから、 IVがリン脂質二重膜と共存して、ることが示された。

[0041] 図 18には、図 17のフラクション番号が 18番〜 32番の分取サンプルを 48時間経過した後に、再度セフアクリル S— 1000カラムにアプライし分取した後、各フラクションについて、フルォレセインとローダミンの蛍光強度を測定した結果を示した。図 18においても、図 17と同様に、フルォレセインとローダミンの蛍光強度パターンは一致していた。このことより、本実施例により調製されたリボソームワクチンでは、イリドウィルスとリン脂質二重膜との共存状態は、長時間に渡って安定的に維持されることが判った

[0042] 3.共焦点レーザー顕微鏡による観察

図 19〜図 21には、（F—IV—VZRh—PL)—Vを共焦点レーザー顕微鏡観察したときの結果を示した。図 19には、フルォレセインの蛍光の様子を、図 20には、ローダミンの蛍光の様子を示した。また、図 21には、両写真を合成した様子を示した。両蛍光像は重なっていたことから、 IVは、リボソームを構成するリン脂質二重膜と安定的に共存していることが判った。

[0043] 4. SDS— PAGEによる解析

ワクチンを製造する前の IV、 IV— V、及び IV/PL— Vを SDS— PAGEによって解祈した。

図 22には、 SDS— PAGEを行った後に、ゲルをクマシ一ブリリアントブルーで染色したときの写真を示した。図 23には、 SDS— PAGEを行った後に、ゲルを銀染色したときの写真を示した。この結果からも、 IVがリン脂質二重膜と共存していることが認められた。

[0044] <実施例 4> PSの効果確認試験 1

次に、ワクチンを作製する際のリン脂質の種類を評価するため、ホスファチジン酸（ PA)と PSとの差違を確認する試験を行った。

1. PAを用いたワクチン

ローダミンで蛍光標識したリン脂質及びコレステロール（PA: PC： CHOL:Rh-PE = 1 : 10 : 5 : 0.004)を用い、 IFVと共にワクチンを調製した。調製方法は、 <実施例 1 >の 1に記載の方法に従った。

[0045] 2. PSを用いたワクチン

ローダミンで蛍光標識したリン脂質及びコレステロール（PS： PC： CHOL:Rh-PE = 1 : 10 : 5 : 0.004)を用い、 IFVと共にワクチンを調製した。調製方法は、 <実施例 1 >の 1に記載の方法に従った。

[0046] 3.リボソームのキャラクタリゼーシヨン

上記 1及び 2のリボソームワクチンのそれぞれについて、 <比較例 1 >の 6に記載の方法に従って、キャラクタリゼーシヨンを行った。

図 24には、 PAを用いて調製したワクチンについて、（F— IFV— VZRh— PL)— V を調製した後にカラムにアプライし分取した後、各フラクションについて、フルォレセィンとローダミンの蛍光強度を測定した結果を示した。フラクション番号が 25番〜 33番の間では、フルォレセインとローダミンの蛍光強度が一致して増減していることから、 I FVがリン脂質二重膜と共存して、ることが示された。

[0047] 図 25には、図 24のフラクション番号が 25番〜 33番の分取サンプルを 48時間経過した後に、再度セフアクリル S— 1000カラムにアプライし分取した後、各フラクションについて、フルォレセインとローダミンの蛍光強度を測定した結果を示した。図より、一部のフルォレセインとローダミンの蛍光強度の変化は一致して!/、るものの、ローダミンのピークの後ろに別のフルォレセインのピークが発生したことが分かった。このことより、ー且はリボソームと共存した IFV力時間の経過に連れて一部リボソーム力分離したことが判った。

[0048] 一方、 PSを用いて調製したワクチンについて、（F—IFV—VZRh—PL)—Vを調製した後にカラムにアプライし分取した後、各フラクションについて、フルォレセインとローダミンの蛍光強度を測定した結果は、既に図 4及び図 5に示した通りである。これらの図より、フルォレセインとローダミンの蛍光強度の変化は一致して増減しており、フルォレセインについて、別のピークは認められなかったことから、リボソームと共存した IFVは、安定してリン脂質二重膜と共存していることが判った。

こうして、一定量の PSを用いることが、ウィルスとリン脂質二重膜との共存状態を安定して維持できることが判った。

[0049] <実施例 5 > PSの効果確認試験 2

次に、 PSの有効性を確認するために、イリドウィルスを用い、く実施例 4>と同様の試験を行った。

1. PAを用いたワクチン

ローダミンで蛍光標識したリン脂質及びコレステロール（PA: PC： CHOL:Rh-PE = 1 : 10 : 5 : 0.004)を用い、 IVと共にワクチンを調製した。調製方法は、く実施例 1 >の 1に記載の方法に従った。

[0050] 2. PSを用いたワクチン

ローダミンで蛍光標識したリン脂質及びコレステロール（PS： PC： CHOL:Rh-PE = 1 : 10 : 5 : 0.004)を用い、 IVと共にワクチンを調製した。調製方法は、く実施例 1 >の 1に記載の方法に従った。

3.リボソームのキャラクタリゼーシヨン

図 26には、 PAを用いて調製したワクチンについて、（F—IV—VZRh—PL)—V を調製した後にカラムにアプライし分取した後、各フラクションについて、フルォレセィンとローダミンの蛍光強度を測定した結果を示した。フラクション番号が 21番〜 35番の間では、フルォレセインとローダミンの蛍光強度が一致して増減していることから、 I Vがリン脂質二重膜と共存していることが示された。

[0051] 図 27には、図 26のフラクション番号が 21番〜 35番の分取サンプルを 48時間経過した後に、再度セフアクリル S— 1000カラムにアプライし分取した後、各フラクションについて、フルォレセインとローダミンの蛍光強度を測定した結果を示した。図より、一部のフルォレセインとローダミンの蛍光強度の変化は一致して!/、るものの、ローダミンのピークの後ろにフルォレセインのなだらかなピークが発生したことが分力つた。このことより、ー且はリボソームと共存した IV力時間の経過に連れて一部リボソームから分離したことが判った。

[0052] 一方、 PSを用いて調製したワクチンについて、（F— IV— VZRh— PL)— Vを調製した後にカラムにアプライし分取した後、各フラクションについて、フルォレセインと口ーダミンの蛍光強度を測定した結果は、既に図 17及び図 18に示した通りである。これらの図より、フルォレセインとローダミンの蛍光強度の変化は一致して増減しており、フルォレセインについて、別のピークは認められなかったことから、リボソームと共存した IVは、安定してリン脂質二重膜と共存して、ることが判った。

こうして、 IVを用いた場合にも、一定量の PSを用いることが、ウィルスとリン脂質二重膜との共存状態を安定して維持できることが示された。

[0053] <実施例 6 > 免疫化による抗体産生能評価試験 1

免疫化の評価には、 BALBZcマウスを用いた。タンパク質濃度が、 2 /z gZmL及び 20 μ gZmLとなるように、 2種類の（IFV— VZPL)— Vを調製し、 500 μ L (ヮクチン投与量として、 1 μ g及び 10 g)を腹腔内に投与した。同時に、リボソーム、 IFV、 I FV—Vをそれぞれ腹腔内に投与したマウス、及び未処理のマウスをコントロールとした。 1群当り 20匹のマウスを免疫化した。抗原投与から 3週間後及び 5週間後、マウスの眼窩静脈から採血し、得られた血清の抗体産生能を ELISA法で評価した。結果を ¾klにした。

[0054] [表 1]

免疫化後抗体投与量生成物

週数タイプ ( u g ) IFV IFV - V (IFV-V/PL) -V

3 IgG 1 2.49 1.97 1.83

10 2.52 2.31 1.93

IgM 1 0.17 ― 0.50

10 0.74 ― 1.1 2

5 IgG 1 2.60 2.50 2.16

10 2.85 2.62 1.95

IgM 1 0.26 ― 0.52

10 0.57 ― 0.82 表に示すとおり、リボソームワクチン（（IFV—VZPL) -V)は、 IgGの場合は、その他の抗原と同程度の抗体産生能を有していた。また、 IgMの場合は、その他の抗原より高い抗体産生能を有することが判った。

[0055] <実施例 7 > 免疫化による抗体産生能評価試験 2

まず、コィをワクチン投与区 (5尾)とワクチン非投与区 (5尾)とに設定した。ワクチン非投与区には、通常のドライペレットのみを与えた。一方、ワクチン投与区には、 PS ZPCZCHOL (1 : 10 : 5)の組成で調製した (KHV— VZPL)— Vを吸収させたドラィペレットを 3日間に渡って連続的に経口投与した。 3日間のワクチン摂取量は、 1尾当り 20 であった。ワクチン投与終了から、 21日間は通常のペレットを投与した。

22日目に、各区 5尾力血液を採取し、 KF—1細胞と培養した KHV懸濁液（10¹·² ⁵TCID /50 μ L)を用い、血清の抗体価を二倍希釈法によって評価した。結果を

50

^： ^した o

[0056] [表 2] 脂質組成サンプル抗体価

PS/PC/CH0L (1 :10:5) コントロール 5 - 8

ワクチン 23- 1 28 表に示すとおり、リボソームワクチン投与区では、抗体価が 23〜128と大きくなつており、抗体産生能を有することが判った。

[0057] <実施例 8> 生ウィルスによる攻撃試験 1

1.ワクチンの投与

イリドウィルスに対して感受性がある体重 8gのマダイ幼魚を用いた。 1日に 1尾のマダイ当り、ドライペレットに 50 Lのワクチンを浸潤させ、 3日間に渡ってこのドライべレットを自由に摂取させることでワクチンを投与した。ワクチンとして、 (D PS/PC/C HOL (1 : 10: 5)の組成で調製した (IV-V/PL) V及び IV— V、並びに（Π) PA ZPCZCHOL (1 : 10: 5)の組成で調製した（IV— VZPL)— V及び IV— Vを用いた。 (IV-V/PL)— V投与区、 IV— V投与対照区ともに、 20尾のマダイを供試した。 1回目のワクチンの投与の後、 10日間の間隔をあけて 2回目のワクチンの投与（50 μ L/ /日、 3日間）を行った。

[0058] 2.ウィルス攻撃試験

体重 15gに成長したマダイ 20尾を、イリドウィルスを添加した海水に浸漬することにより、マダイにイリドウィルスを摂取させた。このマダイの生存率を 20日間に渡って評価し 7こ。

表 3には、 20尾のマダイの生存率を示した。

[0059] [表 3] 脂霣組成サンプル生存率

PS/PC/CH0L ( 1 :10:5) コントロール 9/20 ワクチン 1 5/20

PA/PC/CH0L (1 :10:5) コントロール 8/20 ワクチン 8/20

PAを用いたワクチンでは、コントロールと同等の生存率（8Z20)しか示さなかった。一方、 PSを用いたワクチンでは、有意に高い生存率（9Z20 : 15Z20)を示したことから、本発明のワクチンの優位性が認められた。

[0060] <実施例 9 > 生ウィルスによる攻撃試験 2

コィをワクチン投与 3区 (各 5尾)とワクチン非投与 2区 (各 5尾)とに設定した。ヮクチン非投与区には、通常のドライペレットのみを与えた。一方、ワクチン投与区には、 P S/PC/CHOL (l : 10 : 5)の組成で調製した (KHV— VZPL)— Vを吸収させたドライペレットを 3日間に渡って連続的に経口投与した。 3日間のワクチン摂取量は、 1 尾当り 20 であった。ワクチン投与終了から、 21日間は通常のペレットを投与した

22日目に、培養した KHV懸濁液（10^{1 3}TCID /100 μ L)を麻酔をかけたコィの

50

鰓に滴下する方法で攻撃試験を行った。この攻撃試験は、ワクチン非投与区のコィに対しても、同日に行った。

結果を図 28及び表 4に示した。

[0061] [表 4] 脂霣組成サンプル生存率

PS/PC/CHOL (1 :10:5) コントロール 1 / 10

ワクチン 10/ 13

[0062] ワクチン非投与区 (コントロール、または対照区)では、 KHVによる攻撃後 7日〜 16 日で 90%の斃死 (4Z5、 5Z5)が起こった。これに対し、ワクチン投与区では、攻撃後 7日〜 9日でわずか 23%の斃死（0Z5、 1/4, 2Ζ4 :第 2区及び第 3区では、飼育途中に水槽から各 1尾が飛び出して死亡した)しか起こらず、 21日後の実験終了時に 77%のコィが生残した。

[0063] KHVの感染状況を確認する目的で、採取したコィの鰓と腎臓を用いて、ウィルス D ΝΑの PCR検査を行った。その結果、ワクチン非投与区の死亡魚 9尾の鰓力 KHV の DNAが検出され、一部のコィの腎臓からも KHVの DNAが検出された。また、ワクチン投与区の死亡魚 3尾の鰓からも KHVの DNAが検出された。このことから、コィの斃死の原因は、 KHV感染であることが実証された。

[0064] これに対し、ワクチン投与区の生残魚 10尾の鰓からは、 KHVの DNAは検出されな力つた（図 29及び図 30を参照）。この結果より、ワクチン投与区の生残魚は、 KHV 感染を克服して生残したものと判断された。以上より、本実施形態の (KHV— VZP D—Vは、経口力も投与された場合にも、 KHV抗原の腸管力もの吸収と免疫系の刺激に対抗できることが示された。

[0065] このように本実施形態によれば、ウィルスとリン脂質二重膜との分離を長期間に渡つて阻止し、安定な状況を維持することにより、特定のウィルスに対して免疫作用を起こさせるリボソームワクチンを提供することができた。このリボソームワクチンは、経口投与によっても有効であることから、特に魚類に対しては有効なものであった。図面の簡単な説明

[0066] [図 1]F— IFV— Vと Rh— PL— Vとを混合した後にゲルクロマトグラフィーにかけたときのフルォレセインとローダミンの溶出位置を示すグラフである。

[図 2] (F-IFV/Rh-PL) Vをゲルクロマトグラフィーにかけたときのフルォレセィンとローダミンの溶出位置を示すグラフである。

[図 3]図 2において、フルォレセインとローダミンとがー致したピークについて、所定時間の経過後にリク口マトしたときのフルォレセインとローダミンの溶出位置を示すダラフである。

[0067] [図 4] (F - IFV - V/Rh - PL) Vをゲルクロマトグラフィーにかけたときのフルォレセインとローダミンの溶出位置を示すグラフである。

[図 5]図 4において、フルォレセインとローダミンとがー致したピークについて、所定時間の経過後にリク口マトしたときのフルォレセインとローダミンの溶出位置を示すダラフである。

[0068] [図 6] (F-IFV-V/Rh-PL)—Vの位相差顕微鏡写真図である。

[図 7]図 6と同じ位置において、ローダミンの蛍光を観察した蛍光顕微鏡写真図である。 [図 8]図 6と同じ位置において、フルォレセインの蛍光を観察した蛍光顕微鏡写真図である。

[図 9]IFV— V、 (IFV-V/PL) V、及び IFVを SDS— PAGEにかけた後に銀染色したときのゲルの写真図である。

[0069] [図 10]F— KHV— Vと Rh— PL— Vとを混合した後にゲルクロマトグラフィーにかけたときのフルォレセインとローダミンの溶出位置を示すグラフである。

[図 11] (F - KH V - V/Rh - PL)—Vをゲルクロマトグラフィーにかけたときのフルォレセインとローダミンの溶出位置を示すグラフである。

[図 12] (F - KH V - V/Rh - PL) Vのフルォレセインの蛍光を観察した共焦点レ一ザ顕微鏡写真図である。

[図 13]図 12と同じ位置において、ローダミンの蛍光を観察した共焦点レーザ顕微鏡写真図である。

[図 14]図 12と図 13の蛍光を重ねたときの様子を示す図である。

[0070] [図 15]KHV、 KHV— V、及び (KHV— V/PL)—Vを SDS— PAGEにかけた後に銀染色したときのゲルの写真図である。

[図 16]F— IV— Vと Rh— PL— Vとを混合した後にゲルクロマトグラフィーにかけたときのフルォレセインとローダミンの溶出位置を示すグラフである。

[図 17] (F- IV -V/Rh -PL)—Vをゲルクロマトグラフィーにかけたときのフルォレセインとローダミンの溶出位置を示すグラフである。

[図 18]図 17において、フルォレセインとローダミンとがー致したピークについて、所定時間の経過後にリク口マトしたときのフルォレセインとローダミンの溶出位置を示すグラフである。

[0071] [図 19] (F- IV -V/Rh -PL)—Vのフルォレセインの蛍光を観察した共焦点レーザ一顕微鏡写真図である。

[図 20]図 19と同じ位置において、ローダミンの蛍光を観察した共焦点レーザ顕微鏡写真図である。

[図 21]図 19と図 20の蛍光を重ねたときの様子を示す図である。

[図 22]IV、 IV— V、及び IVZPL—Vを SDS— PAGEにかけた後にクマシーブリリアントブルー染色したときのゲルの写真図である。

[図 23]IV、及び IVZPL— Vを SDS— PAGEに力けた後に銀染色したときのゲルの写真図である。

[0072] [図 24]?八7?じ7じ1101^ (1 : 10 : 5)の組成で調製した^ー ¥—¥71¾1—？ Vをゲルクロマトグラフィーにかけたときのフルォレセインとローダミンの溶出位置を示すグラフである。

[図 25]図 24において、フルォレセインとローダミンとがー致したピークについて、所定時間の経過後にリク口マトしたときのフルォレセインとローダミンの溶出位置を示すグラフである。

[0073] [図 26]?八7?じ7じ1101^ (1 : 10 : 5)の組成で調製した^ー1¥—¥71¾1—？ V をゲルクロマトグラフィーにかけたときのフルォレセインとローダミンの溶出位置を示すグラフである。

[図 27]図 26において、フルォレセインとローダミンとがー致したピークについて、所定時間の経過後にリク口マトしたときのフルォレセインとローダミンの溶出位置を示すグラフである。

[0074] [図 28]コィを KHVで攻撃したときの経過日数と生残数との関係を示すグラフである。

上側の線はワクチン投与区を、下側の線はワクチン非投与区の様子を示している。

[図 29]ワクチン投与区における生残魚の鰓 (G)と腎臓 (K)における KHV遺伝子の有無を PCR法で解析したときの様子を示すゲルの写真図である。 G及び Kの後ろの数字は、生残したコィの番号（1〜4)を示している。

[図 30]図 29と同様のゲルの写真図である。但し、生残したコィの番号は、 5〜8である

Claims

請求の範囲

[1] 超音波処理したウィルスとリン脂質とを溶液中に共存させた状態で超音波処理を行つてリボソームを調製することを特徴とするリボソームワクチンの作製法。

[2] 前記ウィルスは、最初の超音波処理を行う前に、ホルマリン固定されていることを特徴とする請求項 1に記載のリボソームワクチンの作製法。

[3] 前記ウィルスは、インフルエンザウイルス、ヘルぺスウィルス、イリドウィルスから選択されるものであることを特徴とする請求項 1または 2に記載のリボソームワクチンの作製法。

[4] 前記へルぺスウィルスは、コィヘルぺスウィルスであることを特徴とする請求項 3に記載のリボソームワクチンの作製法。

[5] 請求項 1〜4のいずれかの方法によって作製されたリボソームワクチン。