DE4136553A1

DE4136553A1 - Impfstoff gegen schleimhauterreger und herstellungsverfahren

Info

Publication number: DE4136553A1
Application number: DE4136553A
Authority: DE
Inventors: Himanshu N Brahmbhatt; Juergen Wehland; Robert M Brownlie; Kenneth Timmis; David C White
Original assignee: GESELLSCHAFT fur BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) 3300 BRAUNSCHWEIG DE
Current assignee: GESELLSCHAFT fur BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) 3300 BRAUNSCHWEIG DE
Priority date: 1991-11-06
Filing date: 1991-11-06
Publication date: 1993-05-13
Also published as: EP0565708A4; EP0565708A1; WO1993008834A1; JPH06507420A

Description

Keuchhusten ist eine schwere Erkrankung der Atemwege, die im allgemeinen kleine Kinder trifft und vor den 30er Jahren einen erheblichen Anteil an der Mordbiditäts- und Sterblichkeitsrate von Kindern hatte. Seitdem haben parenterale Impfungen mit in der Hitze abgetöteten Ganzzell-Präparationen von Bordetella per tussis (dem verursachenden Bakterium) im großen Maßstab sowie verbesserte sozio-ökonomische Bedingungen das Auftreten von Keuchhusten in den entwickelten Ländern weitgehend zurückge drängt. In den vergangenen zwei Jahrzehnten ist diese Krankheit als Folge einer verminderten Akzeptanz der Vakzine durch die El tern allerdings wieder häufiger geworden, was hauptsächlich daran liegt, daß mit der Keuchhusten-Impfung Nebenwirkungen auf treten können. Deren Schweregrad reicht von schwach-lokalen Re aktionen über persistierendes Schreien bis zu bleibenden Hirn schäden. In manchen Ländern weigern sich die Ärzte aus Haftungs gründen, zur Impfung zu raten. Darüber hinaus können die Vakzinen verschiedener Hersteller höchst unterschiedlich sein, und nicht alle Impfpräparate bieten Schutz.

In den vergangenen Jahren lag die hauptsächliche Stoßrichtung der Keuchhusten-Forschung in der Entwicklung definierter zell freier Vakzinen mit reduzierter Reaktogenität und größerer Immunogenität. Sie wird jedoch durch einen Mangel an Wissen über die Pathogenese des Keuchhustens, die außerordentlich komplex ist, und über die immunologischen Schutzmechanismen, die auf die Infektion folgen, behindert. Bordetella pertussis besitzt meh rere Faktoren, die an der Pathogene beteiligt sind, jedoch wird weiterhin kontrovers diskutiert, welche von diesen die Schutz hervorrufenden Antigene beim Menschen sind und welche Faktoren an die Reaktogenität der Vakzine geknüpft sind. In schwedischen Feldversuchen wurde ermittelt, daß solche Impf stoffe einen gewissen Schutz boten, die auf gereinigten An tigenen, nämlich entgiftetem Keuchhusten-Toxin und filamentösem Haemagglutinin basierten; es ist jedoch klar, daß diese Vakzinen mit anderen Antigenen verunreinigt waren, die ebenfalls am Schutz beteiligt sein könnten. Das bedeutet, daß nach wie vor ein nicht reaktogener, hochwirksamer Impfstoff nicht zur Verfü gung steht. Demzufolge besteht der Bedarf an der Erarbeitung al ternativer Strategien. Wir haben die Möglichkeit einer Ver wendung von Liposomen untersucht, die Bordetella pertussis-Anti gene enthalten, um auf orale oder nasale Verabreichung hin die Immunantwort der Luftwege zu stimulieren.

Lipopolysaccharide (LPS) und Präparationen des äußeren Membran proteins, sog. "outer membrane protein" (OMP), von Bordetella pertussis wurden in multilamellare Liposomen eingebracht, z. B. in aus Phospholipiden auf der Basis von Sojabohnen bestehende oder diese enthaltende Liposomen wie Lyphasome^TM (Fountain Phar maceuticals, USA). Nach oraler oder intranasaler Impfung von Mäusen mit den Liposomenhüllen wurden antigenspezifische Antikörper-Reaktionen in Lungenspülflüssigkeit gefunden. Die Li posomen mit OMP-Hülle waren bei der Induzierung einer Immunant wort deutlich wirksamer als die OMP-Präparationen allein. Die Reaktionen waren am stärksten, wenn Mäusen 30 Tage nach der Primärimmunisierung eine Auffrischung verabreicht wurde. Das Ma ximum der Reaktionen trat 20 Tage nach der Auffrischungsimpfung auf, es konnten jedoch noch 75 Tage nach der Sekundärimmunisie rung Antikörper festgestellt werden.

Diese Ergebnisse zeigen, daß dieses Liposomen-Freigabesystem für Antigene die Wirkung hat, sekretorische Antikörper-Reaktionen zu stimulieren, die notwendig sein könnten, um wirksam gegen eine Infektion durch Bordetella pertussis zu schützen, und daß dieses System auch auf die Freigabe einer Anzahl geeigneter Protein- und/oder LPS-Antigene anwendbar sein sollte.

Obwohl Liposomen bereits in der Vergangenheit verwendet wurden, um in vivo Antikörper-Reaktionen hervorzurufen, gibt es keine Berichte über eine intranasale Immunisierung oder über Antikör per-Reaktionen in der Lunge nach oraler Verabreichung. Dies ist deshalb von Bedeutung, da bis heute Keuchhusten-Vakzinen paren teral verabreicht werden, und es ist möglich, daß dies nicht ausreicht, um das Immunsystem der Schleimhaut zu stimulieren. Als Verteidigung an vorderster Front gegen die Kolonialisierung und anschließende Infektion mit dem Erreger ist dies jedoch notwendig. In der Tat läßt sich aus epidemiologischen Studien mit einiger Sicherheit sagen, daß die derzeitigen Impfstoffe mehr von der Krankheit schützen als vor der Infektion. Die orale oder intranasale Verabreichung von Antigenen kann nicht nur zu einem besseren Schutz führen; durch sie können auch mit der parenteralen Impfung verbundene Nebenreaktionen wie der Endoto xin-Schock umgangen werden, der durch geringe Mengen von freiem LPS verursacht wird, mit dem die Präparationen der Protein-Anti gene verunreinigt sind. Unsere Ergebnisse zeigen, daß in Liposo men eingearbeitetes LPS keinen Endotoxin-Schock verursacht, wahrscheinlich deshalb, weil verhindert wird, daß der LipidA- Teil von LPS in die Wirtzell-Membranen eingeschleust wird.

Ein solches Freigabesystem kann auch für die Impfung gegen an dere bakterielle Pathogene verwendbar sein, die sich auf dem Weg Über die Schleimhaut, das heißt primär über die Lungen oder den Intestinaltrakt, Zutritt in den tierischen oder menschlichen Wirt verschaffen.

Das Auftreten von Keuchhusten in den entwickelten Ländern ist infolge einer Durchimpfung mit parenteral verabreichten, in der Hitze abgetöteten Ganzzell-Präparationen von Bordetella pertus sis stark zurückgedrängt worden. Keuchhusten ist aber immer noch ein weltweites Problem, was auf eine verminderte Akzeptanz des derzeitigen Impfstoffs als Folge einer starken Publizität der möglichen mit der Impfung verbundenen Nebenwirkungen (1), eine mit der Herstellung der Impfstoffe verbundene Schwankungsbreite der Wirksamkeit (2) sowie das Fehlen von Impfprogrammen in den unterentwickelten Ländern zurückzuführen ist, wo 95% der Fälle von Keuchhusten auftreten (3).

Ein möglicher Grund für das Fehlen einer reproduzierbaren Wirk samkeit der Impfstoffe liegt darin, daß die parenterale Verab reichung von Bordetella pertussis-Antigenen nicht ausreichend sein könnte, um das notwendige Immunsystem der Schleimhaut zu stimulieren, das als Verteidigung gegen die Infektion an vorder ster Front benötigt wird. Tatsächlich lassen epidemiologische Studien den Schluß zu, daß die derzeitigen Impfstoffe mehr gegen die Krankheit als gegen die Infektion schützen (4). Eine orale oder intranasale Verabreichung von Antigenen könnte nicht nur zu einem besseren Schutz führen; hierdurch könnten auch viele der Nebenreaktionen umgangen werden, die mit der parenteralen Imp fung verbunden sind. Oral verabreichte Antigene induzieren je doch häufig eine schwache Immun-Antwort von nur kurzer Dauer und benötigen Adjuvantien zur Verstärkung.

Doppelschichtige Phospholipid-Vesikeln (Liposomen) sind als Sy steme für die Freigabe einer Vielzahl von biologisch aktiven Substanzen an spezifische Gewebe eingesetzt worden und in jünge rer Zeit als immunologische Adjuvantien zur Beschleunigung der Immunantwort gegenüber verschiedenen Bakterien und viralen An tigenen (5) eingesetzt worden. Im folgenden wird die Wirkung von Liposomen als Freigabesystem zur Beschleunigung der immunologi schen Antwort auf Bordetella pertussis-Oberflächenantigene in der Lunge beschrieben.

Materialien und Methoden Stämme und Kultivierung

Bordetella pertussis D300421 (Serotyp 1.2.3) (6) wurde auf Bor det Gengou-Base (Difco) mit 1% (vol./vol.) 15% (vol./vol.) defibriniertem Pferdeblut gezüchtet. Für die Produktion in großem Maßstab wurde Bordetella pertussis auf modifiziertem Hor nibrook-Medium (7) vermehrt.

Herstellung von Lipopolysaccharid (LPS)

Zwei Liter einer 48 Stunden alten Bordetella pertussis-Kultur wurden durch Zentrifugation geerntet und einmal mit phosphatgge pufferter Salzlösung gewaschen (PBS; NaCl 8 g/l, KCl 0,2 g/l, KH₂PO₄ 0,2 g/l, Na₂HPO₄×2H₂O 2,9 g/l, pH 7,4). Die Zellen wur den mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 75 ml resuspendiert und 30 Minuten lang bei 65°C inkubiert. Diese Suspension wurde dann mit dem gleichen Volumen an 90%igem (Gew./vol.) Phenol vermischt und 45 Minuten lang unter konstan tem Mischen bei 65°C inkubiert. Man ließ die Suspension auf Eis abkühlen und zentrifugierte 10 Minuten lang bei 10 000×g. Die wässerige Oberschicht wurde entfernt und 10 Minuten lang bei 10 000×g zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Das Lipopolysaccharid (LPS) wurde durch die Zugabe des doppelten Vo lumens von eiskaltem Aceton und Inkubation über die Nacht hinweg ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch 10-minütiges Zentrifu gieren bei 10 000×g und 4°C gesammelt und mit 70%igem Aceton gewaschen. Das getrocknete Pellet wurde in 20 ml destilliertem Wasser resuspendiert und zwei Stunden lang bei 100 000×g ultrazentrifugiert. Die Pellets wurden weitere zwei Male mit de stilliertem Wasser gewaschen und dann lyophilisiert.

Herstellung der Proteine der äußeren Membran (OMP)

Zwei Liter einer 48 Stunden alten Bordetella pertussis-Kultur wurden durch Zentrifugation geerntet, und die Zellen wurden ein mal in PBS resuspen diert und durch Hitze abgetötet (56°C, 30 min). Phenylmethan sulfonylfluorid (PMFS) wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,1 mM zugegeben, und die Zellen wurden durch Ultraschallbehand lung zerstört (zehn einminütige Pulse auf Eis unter einminütiger Abkühlung zwischen den Pulsen). Unzerstörte Zellen wurden durch zehnminütige Zentrifugation bei 5000×g entfernt, und die Zellhüllen wurden durch einstündige Zentrifugation bei 100 000×g gesammelt. Die Hüllen wurden dann in 20 ml 2%igem Triton X- 100, 7,5 mM MgCl₂, 50 mM HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N′-2- ethansulfonsäure) pH 7,4 resuspendiert, eine Stunde lang auf Eis stehengelassen, eine Stunde lang bei 100 000×g zentrifugiert und im selben Puffer einmal gewaschen. Die OMP-Präparation wurde dann zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Protein- Konzentrationen wurden mit Hilfe einer Abwandlung des Lowry-Ver fahrens (8) bestimmt.

Herstellung der Vesikeln

Lyphazome^TM, eine käufliche Form kleiner multilamellarer Phospholipid-Vesikeln, wurden unter Verwendung der "Solvent Di lution Microcarrier technique", die von Fountain Pharmaceuticals Inc. entwickelt wurde (9), unter Einsatz von gereinigten Soja bohnen-Phosphatiden, bezogen von American Lecithin Company, New York, so präpariert, daß sie Bordetella pertussis-LPS- und -OMP- Präparationen enthielten. Die gereinigte Lipidmischung bestand aus Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidsäure und neutralen Lipiden in einem ungefähren Verhältnis von 8 : 1 : 0,7 : 0,3.

Immunisierung von Mäusen

Vier bis fünf Wochen alte weibliche Balb/c-Mäuse wurden in Fün fergruppen immunisiert. Intranasal immunisierte Mäuse wurden mit Ether anästhesiert, und 50 µl Vakzin-Lösung in PBS wurde auf den äußeren Nasenlöchern aufgebracht, wodurch sie inhaliert werden konnte. Für oral immunisierte Mäuse wurde die Vakzine in PBS passend verdünnt, und direkt vor der Immunisierung wurde 3%iges Natriumhydrogencarbonat in PBS (pH 8,0) in gleichem Volumen zugesetzt, um die Magenacidität zu neutralisieren. Mäusen, denen man sechs bis acht Stunden lang kein Wasser zu trinken gegeben hatte, wurden vorsichtig 50 µl verarbreicht. Wenn nichts anderes angegeben ist, wurden die Mäuse an den Tagen 1 und 4 immunisiert und am Tag 30 mit einer Auffrischung versehen. Eine Dosis be stand aus 4 µg Protein, wenn es sich um Vesikel mit OMP-Hülle handelte, und aus 15 µg Trockengewicht im Falle von Vesikeln mit LPS-Hülle und Vesikeln ohne LPS oder OMP. 10 Tage nach der Auf frischung wurden die Mäuse getötet, und zwar sofern nicht anders angegeben durch Ausrenkung des Nackens, und aus der Vorderbein arterie ausgeblutet. Lungenspülungen erhielt man, indem man mit einer Spritze eine Kanüle in die Luftröhre einführte und die Lungen viermal mit 0,7 ml eiskaltem PBS mit 0,1 mM PMFS füllte und leerte. Aus jeder Maus wurden ungefähr 0,5 ml gewonnen, bei 4°C und 10 000×g 10 Minuten lang zentrifugiert, um Zelltrüm mer zu entfernen, und bei -20°C gelagert.

Antiserum gegen OMP

Eine OMP-Präparation wurde im Verhältnis 1 : 1 mit Freunds unvoll ständigem Adjuvans in einem Endvolumen von 1 ml emulgiert und einem 3 Monate alten Chinchilla-Kaninchen subkutan und intramus kulär am Tag 1 (200 µg), am Tag 30 (100 µg) und am Tag 40 (100 µg) injiziert. Das Kaninchen wurde am Tag 50 getötet, und aus dem erhaltenen Serum wurde mit Hilfe von Protein A-Sepharose CL4B-Chromatographie das Immunglobulin gereinigt.

SDS-PAGE- und Western-Blot-Analyse

Die Proteine und das LPS wurden mit Hilfe von Natriumdodecylsul fat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) wie in der Lite ratur beschrieben (10) elektrophoretisch getrennt. Die Proteine wurden mit Commassie Blau und das LPS mit Silber angefärbt (11). Die Western-Blots wurden wie in der Literatur beschrieben durchgeführt (12). Dabei wurden Proteine unter Verwendung einer Semi-Dry-Transferzelle mit 25 mM Tris, 192 mM Glycin, 20% Me thanol pH 8,3 als Übertragungspuffer und 5% Rinderserumalbumin in PBS als Blockierungsagens auf Nitrocellulose übertragen. Die blockierten Membranen wurden eine Stunde lang bei 37°C entweder mit den Lungenspülungen, 1 in 4 in PBS verdünnt, oder mit einer Serumprobe, 1 in 10 in PBS verdünnt, inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Membranen mit an Ziegen-Anti-Maus IgA (Southern Biotechnology Associates Inc.) oder Anti-Maus IgG (Jackson Immunoresearch Laboratories) konjugierter Peroxidase eine Stunde lang bei 37% °C inkubiert. Die Membranen wurden dreimal in PBS gewaschen und unter Verwendung von 4-Chlor-1- naphtol als Substrat entwickelt.

ELISA

Mikrotiterplatten (Nunc Maxisorp) wurden über Nacht bei 4°C entweder mit OMP in 0,1 M NaHCO₃ pH 9,6 (5 µg in 50 µl pro Ver tiefung) oder mit LPS in 50 mM Tris HCl pH 9,6, 20 mM MgCl₂ (1 µg in 50 µl pro Vertiefung) beschichtet. Die Platten wurden gewaschen und mit 10%igem fötalem Kälberserum (FCS) in PBS (100 µl pro Vertiefung) eine Stunde lang bei 37°C blockiert. Nach dem Waschen wurden die Platten mit verschiedenen Verdünnun gen von Serum oder den Lungenspülungen in 10%igem FCS in PBS (50 µl pro Vertiefung) eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die Plat ten wurden gewaschen, und es wurden 50 µl (pro Vertiefung) von an Ziegen-Anti-Maus IgA oder Anti IgG konjugierter Peroxidase, 1 in 1000 in 10%igem FCS in PBS verdünnt, zugegeben. Die Platten wurden wie vorher inkubiert, und nach dem Waschen wurden die Platten durch den Zusatz von 50 µl (pro Vertiefung) Substrat (0,25 M Zitronensäure, 0,25 M Na₂HPO₄, 0,0015= H₂O₂, 0,3 mg ml^-1 O-Phenyl-diamin-Dihydrochlorid) entwickelt. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 µl 0,25 M H₂SO₄ beendet, und mit einem Biorad Mikroplattenablesege rät Modell 3550 wurde die A₄₉₀ bestimmt. Die Ergebnisse sind als die Mittelwerte angegeben, die man aus den Proben von fünf Mäu sen erhielt, und eine ELISA-Einheit ist die A₄₉₀, multipliziert mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor nach der Subtraktion der von den Proben nicht immunisierter Mäuse erhaltenen Rausch- oder Hintergrundwerte. Unverdünnte Lungenspülflüssigkeit und Serumproben (1 in 50 verdünnt) aus den Kontrollmäusen lieferten im wesentlichen Werte von 0.

Elektronenmikroskopie

Vesikeln mit und ohne OMP-Hülle wurden mit 4%igem wässerigem Uranylacetat, pH 4,5, gemäß dem Verfahren von Valentine et al. (13) negativ angefärbt. Für das Metal-Shadowing wurden die bei den Vesikelproben auf frisch hergestellte, Formvar-beschichtete Nickelnetze adsorbiert, mit destilliertem Wasser an der Luft ge trocknet, und das Metal-Shadowing wurde mit Platin unidirektio nal ausgeführt (20°-Winkel).

Immunelektronen-Mikroskopie

Vesikeln mit und ohne OMP-Hülle wurden auf frisch hergestellte, mit Collodium beschichtete Nickelnetze adsorbiert und vorsichtig mit destilliertem Wasser gewaschen. Nachdem sie bei Raumtempera tur an der Luft getrocknet worden waren, wurden die Netze 30 Mi nuten lang bei Raumtemperatur mit gereinigten Antikörpern (100 µg IgG Protein ml^-1) behandelt. Nichtgebundene Antikörper wurden durch vorsichtiges Aufsprühen von PBS (0,1 M Kaliumphosphat, 0,15 M NaCl, pH 6,9) aus einer Plastikflasche entfernt. Die ge bundenen Antikörper wurden durch 10minütiges Inkubieren der Netze auf Tropfen von Protein A-Goldkomplexen (10 nm Goldteil chengröße und A₅₂₀ von 0,03) bei Raumtemperatur für die Elektro nenmikroskopie sichtbar gemacht. Daraufhin wurden die Netze mit PBS, das 0,01% Tween 20 enthielt, und dann mit destilliertem Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen an der Luft wurden die Netze unidirektional mit Platin (20°-Winkel) dem Metal-Shadowing un terworfen. In Kontrollexperimenten wurden die Proben mit gerei nigtem Präimmun-Immunoglobin oder mit dem Protein A-Goldkomplex alleine behandelt. Die Proben wurden mit einem Elektronenmikros kop CEM 902 oder 10B von Zeiss untersucht, und zwar bei einer Beschleunigungsspannung von 80 kV und bei calibrierten Vergröß erungen.

Analyse von Vesikeln mit einer OMP-Hülle

Die Vesikeln mit einer OMP-Hülle und die OMP-Präparation wurden mit Hilfe von SDS-PAGE (Fig. 1) analysiert, und es wurde gefun den, daß sie im wesentlichen dieselben Proteine enthalten, was zeigt, daß durch die Inkorporierungstechnik keine spezifischen Proteine als bevorzugt selektioniert wurden. In der Vesikel-Prä paration ohne Hüllmodifizierung wurden keine Proteine gefunden (Ergebnisse nicht gezeigt). Die Elektronenmikroskopie der Vesi keln mit und ohne OMP-Hülle ergab, daß beide Vesikeln multila mellar waren und in ihrer Größe von 0,2 bis 2 µm variierten (Fig. 2A-D). Die mit der OMP-Hülle versehenen Vesikeln zeigten jedoch im Vergleich zu den Vesikeln ohne diese Hülle Unter schiede im morphologischen Erscheinungsbild; infolge der Inkor porierung von OMP zeigten die OMP-Vesikeln Bläschen oder Quad deln (Fig. 2D). Die Inkubation solcher Vesikeln mit Anti-OMP-An tikörpern führte zu einer intensiven Markierung der Vesikeln (Fig. 2E und F), welche die Anordnung des OMP-Materials auf der äußeren Oberfläche der Vesikeln zeigt. In Kontrollexperimenten konnte keine Markierung beobachtet werden (Fig. 2G und H).

Immunisierung mit Vesikeln mit OMP-Hülle

Um die Fähigkeit der präparierten Vesikeln zu untersuchen, als Adjuvantien zu wirken, wurden verschiedene Gruppen von Mäusen intranasal bei gleicher Proteinkonzentration mit Vesikeln mit der OMP-Hülle und der OMP-Präparation geimpft, die zur Umhüllung der Vesikeln benutzt worden waren. Bei mit Vesikeln mit der OMP- Hülle immunisierten Mäusen waren die IgA- und IgG-Titer in den Lungenspülflüssigkeiten etwa viermal höher als bei den mit der OMP-Präparation immunisierten Mäusen (Fig. 3). Der IgG-Serumti ter von Vesikeln mit OMP-Hülle immunisierten Mäusen war etwa doppelt so groß wie der von mit der OMP-Präparation immunisier ten Mäusen. Mäuse, die mit unpräparierten Vesikeln immunisiert worden waren, entwickelten keine Immunantwort auf OMPs (Ergeb nisse nicht gezeigt). Obwohl das Bestehen eines allgemeinen Mu cosa-Immunsystems längst gesichert ist, war es von Interesse, die Wirksamkeit der Immunisierung auf intranasalem und oralem Weg zu vergleichen. Die Titer in der Lungenspülflüssigkeit waren ähnlich, unabhängig davon, ob die Mäuse intranasaal oder oral im munisiert worden waren (Tabelle 1). eine Primärreaktion wurde 10 Tage nach der zweiten, am Tag 4 erfolgten Immunisation gefunden, jedoch erhöhten sich die Titer wesentlich, wenn am Tag 30 eine Auffrischung gegeben wurde. Es ist unbekannt, wann der Spitzen wert der Primärrekation auftrat, jedoch trat er sicherlich nach dem Tag 10 auf, da die Titer von Mäusen, die am Tag 40 ohne Auf frischungsimpfung getötet worden waren, höher waren. Der IgG-Ti ter im Serum verlief mit dem der Lungenreaktion parallel (Ergeb nisse nicht gezeigt).

Die für die maximale Reaktion in den Lungen benötigte Dosis be trug 6 bis 12 µg Protein (Gesamtdosis von zwei Erstimmunisatio nen und einer Auffrischung) (Fig. 4). Mit 120 µg Protein immuni sierte Mäuse zeigten eine schwächere Reaktion, was auf eine Inhi bitorwirkung bei höheren Konzentrationen hinweist. Es konnten jedoch auch mit Dosen, die nur 1,25 µg betrugen, in den Lungen spülflüssigkeiten noch spezifische Antikörper gefunden werden. Um die Dauer der Immunantwort zu bestimmen, wurden die Mäuse in bestimmten Zeitabschnitten nach der Auffrischungsimpfung des Ta ges 30 getötet (Fig. 5). Die maximale Reaktion von sowohl IgA als auch IgG trat 20 Tage nach der Auffrischungsimpfung auf, es konnte jedoch spezifisches Immunoglobulin in den Lungen auch noch nach 75 Tagen gefunden werden.

Westernblot-Analyse der Immunreaktion

Die Lungenspülflüssigkeiten und Serenproben aus Mäusen, die oral und intranasal analysiert worden waren, wurden zusammengegeben und durch Westernblotting (Fig. 6) analysiert. Die Lungenwasch flüssigkeiten aus mit Vesikeln mit OMP-Hülle immunisierten Mäu sen reagierten gleichermaßen mit verschiedenen OMP-Banden, ob wohl die Signale für Anti-Maus-IgG deutlich stärker als für Anti-IgA waren. Dies könnte an Unterschieden in der Bindungs stärke (Avidität) oder Sensivität zwischen den beiden Detektionssystemen oder aber daran liegen, daß die IgG-Antwort im Vergleich zur IgA-Antwort im unteren Respirationstrakt domi nant war. Interessanterweise berichteten Nedrud et al. (14), daß nach oraler und intranasaler Immunisation mit inaktiviertem Sen daivirus IgG die dominante Immunantwort im unteren Respirations trakt war, während IgA die dominante Antwort im oberen Respira tionstrakt war. In Kontrollexperimenten haben wir vorliegend keine Signale gegen OMP-Banden aus Lungenspülflüssigkeiten ge funden, die aus mit unpräparierten Vesikeln immunisierten Mäusen gewonnen worden waren (Fig. 6, Spuren 3 und 4). Gepooltes Serum von Mäusen, die mit Vesikeln mit OMP-Hülle immunisiert waren, reagierte ebenfalls mit mehreren OMP-Banden (Fig. 6, Spur 5). Sowohl Serum als auch Lungenspülflüssigkeit reagierten mit dem dominierenden 32 kD OMP, das Serum reagierte jedoch vorzugsweise mit Banden niederen Molekulargewichts, während das sekretorische Produkt vorzugsweise mit Banden höheren Molekulargewichts rea gierte. Serum aus mit unpräparierten Vesikeln immunisierten Mäu sen zeigte eine sehr schwache Reaktion mit dem dominierenden 32 kD OMP, obwohl dies in der Abbildung nicht sichtbar ist (Fig. 6, Spur 6).

Immunisierung mit Vesikeln mit einer LPS-Hülle

Aus B. pertussis isoliertes LPS und Vesikeln mit einer LPS-Hülle wurden mit Hilfe von LPS-PAGE und Silberanfärbung analysiert. Beide zeigten dasselbe Wanderungsmuster (Fig. 7) und waren vom ab-Phänotyp wie von Peppler beschrieben (15); der Wildtyp B. pertussis besitzt zwei unterschiedliche Roh-LPSe, und diese er scheinen nach SDS-PAGE als zwei Banden, die mit a und b bezeich net werden. Nach der oralen und intranasalen Immunisierung von Mäusen mit Vesikeln mit einer LPS-Hülle konnte kein spezifisches IgA in den Lungenspülflüssigkeiten gefunden werden (Tabelle 2), während eine spezifische IgG-Antwort gefunden wurde. Dagegen wurde eine spezifische IgA-Antwort auf LPS gefunden, wenn Mäuse mit den Vesikeln mit einer OMP-Hülle immunisiert waren. Die Sil beranfärbung der Vesikeln mit einer LPS-Hülle zeigte das Vorlie gen von LPS (Ergebnisse nicht gezeigt), obwohl diese etwa 10 mal weniger LPS enthielten als Vesikeln mit einer LPS-Hülle. Dies läßt vermuten, daß Proteine, die in den Vesikeln mit einer OMP- Hülle vorhanden sind, für die adäquate Präsentation des LPS-An tigens notwendig sind. Auch die IgG-Antwort war bei mit Vesikeln mit einer OMP-Hülle immunisierten Mäusen höher als bei mit den Vesikeln mit einer LPS-Hülle immunisierten Mäusen. Die Immuni sierung auf intranasalem Weg schien für die Induktion einer Im munantwort wirksamer als eine orale Immunisierung. Im Serum wurde gegen LPS spezifisches IgG gefunden, und der Titer war ähnlich, gleichgültig, ob OMP-Vesikeln oder LPS-Vesikeln für die Imunisierung der Mäuse verwendet worden war.

Ergebenisse

Präparationen von Lipopolysaccharid (LPS) und Protein der äuße ren Membran (OMP) von B. pertussis wurden in multilamellare Liposomen inkorporiert, die aus Phospholipiden auf Sojabohnen- Basis bestanden oder diese enthielten. Nach oraler oder intrana saler Impfung von Mäusen mit den präparierten Liposomen wurden in den Lungenspülflüssigkeiten spezifische Antikörperreaktionen gefunden. Eine spezifische IgA-Reaktion gegen LPS konnte jedoch nur nach Immunisierung mit Liposomen mit OMP-Hülle und nicht mit Liposomen mit LPS-Hülle gefunden werden, was nahelegt, daß den Proteinen eine Adjuvans-Aktivität zukommt. Die Liposomen mit OMP-Hülle waren bezüglich der Induzierung einer Immunantwort si gnifikant wirksamer als die OMP-Präparationen allein. Die Reak tionen waren am höchsten, wenn den Mäusen 30 Tage nach der Pri märimmunisierung eine Auffrischungsimpfung verabreicht worden war. Die maximale Reaktion trat am Tag 20 nach der Auffri schungsimpfung auf; spezifische Antikörper konnten jedoch noch 75 Tage nach der Auffrischungsimpfung festgestellt werden. Diese Ergebnisse zeigen, daß dieses Liposomen-Freigabesystem für Anti gene die Wirkung besitzt, sekretorische Antikörperreaktionen hervorzurufen, die für den wirksamen Schutz gegen eine Infektion mit B. pertussis notwendig sein könnte.

Es konnte gezeigt werden, daß Vesikeln mit einer OMP- oder einer LPS-Hülle effektiv die Induzierung einer sekretorischen und sy stemischen Immunantwort auf diese Antigene induzieren. Eine se kretorische IgA-Antwort gegen LPS konnte jedoch nur nach der Im munisierung mit den Vesikeln mit einer OMP-Hülle und nicht mit den Vesikeln mit einer LPS-Hülle beobachtet werden. Dies läßt vermuten, daß Protein-Antigene in der OMP-Präparation einen Ad juvans-Effekt bei der Stimulation der IgA-Antwort hatten. Mögli cherweise werden Protein-Antigene für die T-Helferzellen-Präsen tationen benötigt, die das Umschalten des B-Zell-Isotyps direkt von IgM nach IgA mediiert (16). Mit OMP-Vesikeln immunisierte Mäuse lieferten etwa vierfach höhere sekretorische Antikörper- Titer als mit der OMP-Präparation immunisierte Mäuse. Die Grund lage der Fähigkeit von Liposomen, als Adjuvantien zu wirken, ist im allgemeinen nicht bekannt, es ist jedoch möglich, daß die präparierten Vesikeln länger im lymphoiden Gewebe persistieren können als die OMP-Präparation. Die Existenz eines allgemeinen Immunsystems der Mucosa, worin eine Immunantwort in einem be stimmten Mucosagewebe zu einer sekretorischen Immunantwort an anderen Orten führt, ist nun allgemein anerkannt (17). Es gibt jedoch eine Reihe von Anzeichen dafür, daß zwischen den Systemen des darmassoziierten lymphoiden Gewebes (GALT) und des bronchi alassoziierten lymphoiden Gewebes (BALT) unterschiedliche regu latorische Mechanismen existieren (18). Vorliegend waren die Ti ter gegen OMP ähnlich hoch, gleichgültig ob die Mäuse oral oder intranasal geimpft worden waren, obwohl intranasal geimpfte Mäuse offensichtlich einen höheren Titer gegen LPS entwickelten.

Die maximale Immunantwort trat 20 Tage nach einer Nachimpfung am 30. Tag auf, wenn Mäuse intranasal mit Vesikeln mit einer OMP- Hülle immunisiert waren. Sekretorische Antikörper konnten jedoch noch 75 Tage nach der Immunisierung aufgefunden werden. Dies ist im Hinblick auf die Beobachtung von Goodman et al. (19) von be sonderem Interesse, daß Anti-Pertussis-IgA drei Monate nach der natürlichen Infektion von Menschen in nasopharyngealen Sekretio nen gefunden werden konnte, nicht aber nach einer parenteralen Impfung. Darüberhinaus ist allgemein anerkannt, daß die natürli che Infektion mit Pertussis zu einer besseren und länger andau ernden Immunität führt als die parenterale Impfung.

Vorliegend wurde nur die humorale Antwort auf eine Impfung un tersucht. Andere Studien konnten jedoch zeigen, daß Liposomen, die Antiggene in ihrer Hülle tragen, zellmediierte Immunität (CMI) induzieren können (20). Obwohl die Rolle von CMI als Schutz gegen B. pertussis nicht bekannt ist, sind doch CMI-Reak tionen auf verschiedene Antigene nach menschlicher Infektion be richtet worden (21, 22).

Die Pathogenese von Pertussis ist komplex, und es ist immer noch nicht bekannt, welche Antigene eine zellfreie Vakzine enthalten sollte. Parenterale Vakzinen, die auf Pertussis-Toxin und fila mentösem Haemagglutinin basiren, gaben in schwedischen Feldstu dien (23) einen gewissen Schutz. Es ist jedoch klar, daß diese Vakzinen mit anderen Antigenen kontaminiert waren, die bei der Entwicklung des Schutzes ebenfalls eine Rolle spielen könnten (24). Die Rolle von Anti-LPS-Antikörpern bei der Ausbildung des Schutzes ist nicht klar. Kaninchen-Anti-LPS in Mischungen mit Bakterien, denen die Mäuse ausgesetzt werden sollten, schützte die Mäuse nicht vor der Infektion (25), obwohl vorgeschlagen worden ist, daß Anti-LPS-Antikörper in Menschen eine Rolle bei der Verhinderung der Kolonialisierung spielen könnten (26). Die Liposomen-Vakzine mit OMP-Hülle, die erfindungsgemäß verwendet wird, um eine sekretorische Antwort hervorzurufen, ist zweifel los eine Rohvakzine. Das Liposomen-Freigabesystem, das die Anti körper-Stimulation gegenüber diesen Antigenen beschleunigte, könnte verwendet werden, um gereinigte Oberflächenantigene wie zum Beispiel filamentöses Haemagglutinin, Pertussis-Toxin oder das 69 kD schwere, mit der Virulenz in Verbindung gebrachte OMP zu inkorporieren, Substanzen, deren Schutzwirkung in Modellen an der Maus gezeigt werden konnte (27). Die Sojabohnen-Lipide, die für die Herstellung dieser Liposomen verwendet werden, sind re lativ billig und deshalb für eine Vakzin-Produktion in großem Maßstab attraktiv. Auf der anderen Seite könnte ein vollständi ger Schutz gegen B. pertussis eine Immunantwort gegenüber ver schiedenen Antigenen erfordern, und es ist vielleicht ein falscher Ansatz, den Satz aufzustellen, daß zukünftige Vakzinen nur aus definierten gereinigten Komponenten bestehen sollten. Auf dem oralen Weg der Verabreichung könnten viele toxische Ne beneffekte umgangen werden, die mit der parenteralen Verabrei chung roher Vakzinen verbunden sind, insbesondere mit der von LPS. Mit Pertussis-Toxin verbundene Nebenwirkungen sollten si cherlich ebenfalls vermindert werden. Es könnte jedoch wün schenswert sein, entweder die Präparation vor der Inkorporation in die Liposomen zu detoxinieren oder die jüngst beschriebene Mutante von B. pertussis einzusetzen, die ein immunologisch ak tives, aber biologisch inaktives Pertussis-Toxin exprimiert (28). Es ist bemerkenswert, daß in einer Studie über 15 000 Kin der eine oral verabreichte Ganzzell-Vakzine genauso wirksam war wie eine parenteral verabreichte Vakzine, wobei jedoch bei der oralen Immunisierung Nebenreaktionen im wesentlichen eliminiert waren (29). Die Dauer der Immunizität, die durch die orale Immu nisierung erreicht worden war, wurde dort jedoch nicht weiter untersucht.

Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die vorliegende Arbeit die Verwendbarkeit des Liposomen-Freigabe-Systems zur Beschleunigung der Stimulation sekretorischer Antikörper gegen B. pertussis Oberflächen-Antigene gezeigt hat. Weitere Studien sind jedoch noch notwendig, um festzustellen, ob diese die Mäuse vor einer Kolonialisierung schützen und ob die Liposomen als Freigabesy stem für einzelne Oberflächen-Antigene von B. pertussis verwen det werden können.

Figurenbeschreibung Fig. 1

SDS-PAGE von Vesikeln. Die Proben wurden mit einem 11%igen Se parationsgel analysiert. 1: Vesikeln mit OMP-Hülle; 2: OMP-Prä paration von B. pertussis; 3: ganze Zellen von B. pertussis; 4: Molekulargewicht-Marker.

Fig. 2

Elektronenmikroskopische Untersuchung von Vesikeln. Unpräpa rierte Vesikeln (A) und Vesikeln mit OMP-Hülle (C) wurden mit 4%igem Uranylacetat negativ angefärbt; die Pfeile deuten auf die multilamellaren Schichten. B (unpräparierte Vesikeln) und D (Ve sikeln mit OMP-Hülle) zeigen Vesikeln nach unidirektionalem Me tal-Shadowing. Vesikeln mit OMP-Hülle wurden mit Anti-OMP-Anti körpern und dann Protein A-Goldkomplexen inkubiert (E: nichtan gefärbte Vesikeln; F: nach Metal-Shadowing). Die Goldteilchen (die Pfeile weisen darauf hin) weisen auf das OMP-Material, das auf der äußeren Oberfläche der OMP-Vesikeln angeordnet ist. In Kontrollexperimenten wurden Vesikeln mit OMP-Hülle mit Präimmun- Immunglobulin und dann Protein A-Goldkomplexen (G) oder mit den Protein A-Goldkomplexen allein (H) angefärbt; eine Markierung der Vesikeln mit der OMP-Hülle war nicht feststellbar. Die unten eingezeichneten Stege stehen für eine Länge von 0,2 µm.

Fig. 3

Antikörpertiter (Anti-OMP) in Lungenspülflüssigkeiten von Mäusen nach intranasaler Impfung mit Vesikeln mit OMP-Hülle und nicht in Vesikeln eingearbeiteter OMP-Präparation. Die Stege geben die Standardabweichung an.

Fig. 4

Die Wirkung einer Impfdosis auf die Antikörpertiter (Anti-OMP) in Lungenspülflüssigkeiten von Mäusen nach intranasaler Impfung mit Vesikeln mit OMP-Hülle. Die Stege geben die Standardabwei chung an.

Fig. 5

Dauer der Antikörperreaktion nach intranasaler Immunisierung von Mäusen mit Vesikeln mit OMP-Hülle. Die Mäuse wurden geimpft und an den angegebenen Tagen getötet, und die Anti-OMP-Titer aus den Lungenspülflüssigkeiten wurden bestimmt. Die Stege geben die Standardabweichungen an.

Fig. 6

Westernblot-Analyse von Lungenspülflüssigkeit und Serum. OMP′s von B. pertussis wurden mit Hilfe von SDS-PAGE mit einem 11%igen Separationsgel getrennt und geblottet. Die Streifen 1 und 2 wurden mit gepoolter Lungenspülflüssigkeit aus Mäusen inku biert, die mit Vesikeln mit OMP-Hülle immunisiert waren, die Streifen 3 und 4 wurden mit gepoolter Lungenspülflüssigkeit von Mäusen inkubiert, die mit nichtpräparierten Vesikeln immunisiert waren, Streifen 5 wurde mit gepooltem Serum von Mäusen inku biert, die mit Vesikeln mit OMP-Hülle immunisiert waren, und Streifen 6 wurde mit gepooltem Serum von Mäusen inkubiert, die mit unpräparierten Vesikeln immunisiert worden waren. Die Strei fen 1 und 3 wurden mit an Peroxidase konjugiertem Anti-Maus-IgA als zweitem Antikörper inkubiert, und die Streifen 2, 4, 5 und 6 mit Anti-Maus-IgG. Die Pfeile weisen auf das dominante 32 kD- Protein.

Fig. 7

Silberanfärbung von Vesikeln mit LPS-Hüllen. 1: aus B. pertussis extrahiertes LPS; 2: unpräparierte Vesikeln; 3: Vesikeln mit LPS-Hülle.

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Tabelle 1

Antikörpertiter gegen OMP von B. pertussis in Mäuse-Lungenspülflüssigkeit nach oraler und intranasaler Verabreichung von Vesikeln mit OMP-Hülle

Tabelle 2

Antikörpertiter gegen LPS von B. pertussis in Lungenspülflüssig keit von Mäusen nach oraler und intranasaler Verabreichung von Vesikeln mit LPS und OMP-Hülle

Claims

1. Impfstoff gegen Schleimhauterreger, der aus einem Liposomen- Freigabesystem besteht oder dieses Freigabesystem als reaktive Komponente enthält, wobei das Freigabesystem aus Lipid-Vesi keln besteht oder diese enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipid-Vesikeln mindestens ein Antigen des Schleimhauter regers in ihre äußere Membran eingearbeitet enthalten.

2. Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Schleimhauterreger um Bordetella pertussis han delt.

3. Impfstoff nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen eine Präparation des äußeren Membranproteins (OMP) von Bordetella pertussis ist.

4. Impfstoff nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen ein Lipopolysaccharid (LPS) von Bordetella pertussis ist.

5. Impfstoff nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen filamentöses Hämagglutinin und/oder Pertussis-Toxin aus Bordetella pertussis ist.

6. Impfstoff nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Antigene sowohl eine Präparation des äußeren Membranproteins (OMP) als auch ein Lipopolysaccharid (LPS) von Bordetella pertussis enthalten sind.

7. Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipid-Vesikeln kleine multilamellare Phospholipid-Vesikeln auf Sojabohnenbasis sind.

8. Verfahren zum Herstellen eines Impfstoffs nach einem der vor anstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das oder die Antigene mit Hilfe der "solvent dilution microcarrier technique" in die Lipid-Vesikeln eingearbeitet werden.