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Diese Anmeldung ist eine Continuation-in-Part-Anmeldung
mit der Serien-Nr. 08/476,656, eingereicht am 7. Juni 1995.
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Insbesondere hinsichtlich rekombinanter
Borrelia-Proteine wird auf jede der Anmeldungen mit den Serien-Nummern
07/973,338, eingereicht am 29. Oktober 1992, 08/373,455 (Richtlinie
62 FWC der USSN 07/973,338), eingereicht am 17. Januar 1995, 07/888,765,
eingereicht am 27. Mai 1992, 08/211,891, eingereicht am 16. Oktober
1992 (nationale Phase von PCT/US92/08697) und 07/779,048, eingereicht
am 18. Oktober 1991, hingewiesen. Insbesondere hinsichtlich der
Strukturgene von Pneumokokken-Proteinen, epitopen Bereichen davon
und Verabreichung von Pneumokokken-Proteinen wird auf jede der Anmeldungen
mit den Serien-Nummern 656,773, eingereicht am 15. Februar 1991,
835,698, eingereicht am 12. Februar 1992, 072,065, eingereicht am
3. Juni 1993, 072,164, eingereicht am 3. Juni 1993, 214,222, eingereicht
am 17. März 1994,
214, 164, eingereicht am 17. März
1994, 247,491, eingereicht am 23. Mai 1994, 048,896, eingereicht am
20. April 1993, 246,636, eingereicht am 20. Mai 1994, 08/458,399
(Continuation-in-Part-Anmeldung mit der Serien-Nr. 246,636, eingereicht am 7. Oktober
1994), eingereicht am 2. Juni 1995, 08/446,201, eingereicht am 19.
Mai 1995, 08/312,949, eingereicht am 30. September 1994, hingewiesen.
Hinsichtlich der Expression der Lipoproteine wird auf die Anmeldung
mit der Serien-Nr. 08/475,781, eingereicht am 7. Juni 1995, hingewiesen. Und
hinsichtlich der Zusammensetzungen und der Verfahren für das mucosale,
z. B. orale, Verabreichen von Borrelia-Burgdorferi-Antigenen zum
Anregen einer immunologischen Antwort, wird auf Barbour et al.,
Anmeldungsnr., die gleichzeitig hiermit eingereicht wurde (Anwaltsaktenzeichen
454312-2420) hingewiesen.
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Im folgenden Text werden mehrere
Schriftstücke
zitiert und jedes wird hiermit ebenso hierin durch Hinweis aufgenommen.
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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft
Zusammensetzungen, die in einem Wirt, einem Tier oder einem Menschen,
eine immunologische Antwort hervorrufen, und Verfahren für die Herstellung
und die Verwendung derselben. Die Erfindung betrifft des weiteren
solche Zusammensetzungen und Verfahren, bei denen die Zusammensetzung
ein Antigen und ein Lipoprotein an einen Hilfsstoff angelagert umfaßt. Besonders
bevorzugt ist das Lipoprotein ebenfalls antigen oder immunogen,
und die Zusammensetzung kann daher eine Kombinationszusammensetzung,
eine multivalente Zusammensetzung oder eine "Cocktail-Zusammensetzung"
sein. Dementsprechend betrifft die Erfindung ebenfalls die gleichzeitige
Verabreichung von wenigstens einem Antigen und wenigstens einem
Lipoprotein in einer Zusammensetzung, die zusätzliche Inhaltsstoffe, wie
z. B. einen Hilfsstoff, einschließen kann.
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Das Lipoprotein kann ein natürlich vorkommendes
Lipoprotein oder ein rekombinantes Lipoprotein sein. Das rekombinante
Lipoprotein kann aus der Expression von homologen Sequenzen der
mit Lipid versehenen und der Protein-Anteile des Lipoproteins durch
einen Vektor stammen, d. h. die Sequenzen für das Versehen mit Lipid und
das Protein können
auf natürliche
Weise zusammen vorliegen. Bei solch einem rekombinanten Lipoprotein
kann das Versehen davon mit einem Lipid aus der Expression einer
ersten Nukleinsäuresequenz
und das Protein davon aus der Expression einer zweiten Nukleinsäuresequenz
stammen, wobei die ersten und die zweiten Nukleinsäuresequenzen,
welche nicht natürlich
zusammen vorliegen, und solche Sequenzen als ein zusammenhängendes
Lipoprotein exprimiert werden können.
Daher betrifft die Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren, die
die Verabreichung von Lipoproteinen, einschließlich rekombinanter Lipoproteine,
einschließen,
und die rekombinanten Lipoproteine können ähnlich zu nativen Proteinen
oder neuartige Hybrid-Proteine sein.
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Die Erfindung betrifft des weiteren
die zuvor genannten Zusammensetzungen zum Hervorrufen einer immunologischen
Antwort und Verfahren zur Herstellung und Verwendung derselben,
wobei das Lipoprotein rekombinant exprimiertes Lipoprotein der Expression
der zuvor genannten ersten und zweiten Nukleinsäuresequenzen ist, wobei die
erste Nukleinsäuresequenz
eine Borrelia-Lipoprotein-Leitsequenz
codiert, bevorzugt solch ein rekombinantes, mit Lipid versehenes
Protein, das unter Verwendung der Nukleinsäuresequenz, die die OspA-Leitsequenz
codiert, exprimiert wird. Bei einer bevorzugten Ausführungsform
kann das Lipoprotein OspA sein, und daher betrifft die Erfindung
ebenso rekombinantes OspA und verwendet davon die Zusammensetzungen
und Verfahren.
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Auf mehrere Veröffentlichungen wird in dieser
Anmeldung hingewiesen. Die vollständige Zitierung dieser Hinweise
ist am Ende der Beschreibung, den Ansprüchen unmittelbar vorangehend
zu finden , oder dort, wo die Veröffentlichung erwähnt wird.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die immunogene Aktivität kann signifikant
verbessert werden, wenn ein Antigen gemeinsam mit einem Hilfsstoff
verabreicht wird, üblicherweise
verwendet als 0,001%-ige bis 50%-ige Lösung in einer phosphatgepufferten
Salzlösung
(PBS). Hilfsstoffe verstärken
die immunogene Aktivität
eines Antigens, sind aber nicht unbedingt selbst immunogen. Hilfsstoffe
können
sich so verhalten, daß sie
das Antigen örtlich
in der Nähe
der Stelle der Verabreichung zurückbehalten,
um so eine Speicherwirkung hervorzurufen und so eine langsame, anhaltende
Freisetzung des Antigens an die Zellen des Immunsystems zu erleichtern.
Hilfsstoffe können
auch die Zellen des Immunsystems zu einem Antigen-Speicher anziehen
und solche Zellen stimulieren, Immunantworten hervorzurufen.
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Immunstimulierende Mittel oder Hilfsstoffe
werden seit vielen Jahren verwendet, um die Wirts-Immunantwort auf
z. B. Impfstoffe zu verbessern. Intrinsische Hilfsstoffe, wie z.
B. Lipopolysaccharide, sind normalerweise die Bestandteile der abgetöteten oder
abgeschwächten
Bakterien, die als Impfstoffe verwendet werden. Extrinsische Hilfsstoffe
sind Immunmodulatoren, welche typischerweise nicht-kovalent mit
Antigenen verknüpft
sind und die formuliert werden, um die Wirts- Immunantwort zu verstärken. Aluminiumhydroxid
und Aluminiumphosphat (gewöhnlich
gemeinsam als Alaun bezeichnet) werden routinemäßig als Hilfsstoffe in human- und
veterinärmedizinischen
Impfstoffen verwendet. Die Wirksamkeit von Alaun beim Erhöhen der
Antikörperantworten
auf Diphtherie- und Tetanus-Toxoide ist gut etabliert und erst kürzlich wurde
ein HBsAg-Impfstoff mit Alaun als einem Hilfsstoff versehen.
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Ein weiter Bereich von extrinsischen
Hilfsstoffen kann starke Immunantworten auf Antigene auslösen. Diese
umfassen mit Membranproteinantigenen komplexierte Saponine (immunstimulierende
Komplexe), Pluronic-Polymere mit Mineralöl, abgetötete Mycobakterien in Mineralöl, Freunds
Adjuvans, bakterielle Produkte, wie z. B. Muramyldipeptid (MDP)
und Lipopolysaccharide (LPS), sowie Lipid A und Liposome. Um die
humorale Immunantwort (HIR) und die zellvermittelte Immunität (CMI)
wirksam zu induzieren, werden die Immunogene vorzugsweise in Hilfsstoffen
emulgiert.
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Die wünschenswerten Merkmale von
idealen Hilfsstoffen schließen
einige oder alle der folgenden ein:
- (1) keine
Giftigkeit,
- (2) Fähigkeit,
eine langandauernde Immunantwort zu stimulieren,
- (3) Einfachheit der Herstellung und Stabilität bei Langzeitlagerung,
- (4) Fähigkeit,
sowohl CMI als auch HIR auf über
verschiedene Wege verabreichte Antigene hervorzurufen,
- (5) Synergie mit anderen Hilfsstoffen,
- (6) Fähigkeit,
selektiv mit Populationen von antigen-präsentierenden Zelten (APC) Wechselwirkung
einzugehen,
- (7) Fähigkeit,
spezifisch angemessene TH1- oder TH2-zellspezifische Immunantworten hervorzurufen
und
- (8) Fähigkeit,
die angemessenen Antikörper-Isotyp-Niveaus
(z. B. IgA) gegen Antigene selektiv zu erhöhen.
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Das US-Patent Nr. 4,855,283, erteilt
für Lockhoff
et al. am 8. August 1989, welches hierin durch Bezugnahme darauf
eingeschlossen ist, lehrt dazu Glycolipidanaloga, die N-Glycosylamide,
N-Glycosylharnstoffe und N-Glycosylcarbamate einschließen, von
denen jedes am Zuckerrest durch eine Aminosäure substituiert ist, als Immunmodulatoren
oder Hilfsstoffe. Demnach berichteten Lockhoff et al. (US-Patent
Nr. 4,855,283), daß N-Glycolipidanaloga,
die strukturelle Ähnlichkeiten
zu den natürlich
vorkommenden Glycolipiden, wie z. B. Glycosphingolipiden und Glycoglycerollipiden,
aufweisen, dazu fähig
sind, starke Immunantworten bei sowohl Herpes-simplex-Virusimpstoft
und Pseudorabies-Virusimpfstoff hervorzurufen. Einige Glycolipide
wurden aus langkettigen Alkylaminen und Fettsäuren synthetisiert, die über ein
anomeres Kohlenstoffatom direkt mit dem Zucker verknüpft sind,
um die Funktionen der natürlich
vorkommenden Lipidreste nachzuahmen.
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Das US-Patent Nr. 4,258,029, erteilt
für Moloney,
das auf Connaught Laboratories Limited übertragen wurde und hierin
durch Bezugnahme mit eingeschlossen ist, lehrt dazu, daß Octadecyltyrosinhydrochlorid (OTH)
als ein Hilfsstoff wirkt, wenn es mit Tetanus-Toxoid und formalininaktiviertem
Poliomyelitis-Virusimpfstoff vom Typ I, II und III komplexiert ist.
Octadecylester von aromatischen Aminosäuren, die mit rekombinantem Hepatitis-B-Oberflächenantigen
komplexiert sind, verstärkten
die Wirts-Immunantworten gegen das Hepatitis-B-Virus.
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Bessler et al., "Synthetic lipopeptides
as novel adjuvants" im 44. Forum In Immunology (1992) auf S. 548
ff., insbesondere auf S. 548–550,
welches hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist, ist auf das
Anwenden von Lipopeptiden als Hilfsstoffe gerichtet, wenn sie in
Verbindung mit einem Antigen gegeben werden. Die Lipopeptide wiesen
typischerweise als die mit Lipid versehene Untereinheit P3C und
nur bis zu 5 Aminosäuren
auf, z. B. P3C-SG, P3C-SK4, P3C-SS, P3C-SSNA, P3C-SSNA. Das Lipopeptid
wurde nur mit bestimmten Antigenen oder nicht-immunogenen Proteinen
gekoppelt oder zu diesen hinzugegeben, wie z. B. P3C-SSNA, das den
S.-Typhimurium-Impfstoff
ergänzt,
mit VP1 (135–154)
der Maul- und Klauenseuche gekoppeltes PC3-SS, mit dem nicht-immunogenen
Protein Hirudin gekoppeltes PC3-SG-OSu, mit FITC oder DNP gekoppeltes
P3C-SK oder mit einem Stoffwechselprodukt von Sfreptomyces venezuelae
gekoppeltes P3C-SG. Obwohl die Verfahren des Mischens und Konjugierens
von Hilfsstoff nach Bessler beim Gebrauch der vorliegenden Erfindung
angewendet werden können,
versäumt
es Bessler, das Anwenden eines Lipoproteins mit zumindest einem
Antigen in einer Zusammensetzung, insbesondere solche Zusammensetzungen, bei
denen das Lipoprotein ebenso antigen ist, oder die immunologischen
Kombinationszusammensetzungen und die Verfahren dieser Erfindung
zu lehren oder anzudeuten.
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In dieser Hinsicht wird ein Unterschied
zwischen einem Peptid, insbesondere einem Peptid, das nur bis zu
etwa 5 Aminosäuren
hat, und einem Protein gemacht, wie unter anderem ein Unterschied
zwischen einem antigenen Lipoprotein und einem nicht-antigenen Lipopeptid
besteht. Peptide unterscheiden sich immunologisch von Proteinen
dadurch, daß kurze
Peptide die Möglichkeit
der direkten Präsentation
durch den Haupthistokompatibilitätskomplex
(MHC) aufweisen, während
Proteine vor der Präsentation
zu den T-Zellen aufbereitet werden müssen. Ein Peptid unterscheidet
sich des weiteren von einem Protein dadurch, daß ein Protein groß genug
ist, um funktionelle Bereiche (z. B. Aufweisen einer Tertiärstruktur)
auszubilden, was ein Peptid nicht kann.
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Nardelli et al. [Vaccine (1994),
12(14): 1335–1339]
haben ein vierwertiges multiples Antigenpeptid, das eine gp120-Sequenz
enthält,
mit einer Lipid-Untereinheit verbunden und das resultierende synthetische
Lipopeptid Mäusen
verabreicht. Es wurde beobachtet, daß sowohl die mucosale IgA-Antwort
als auch das systemische Plasma-IgG stimuliert wurden, und die zelluläre Immunität wurde
induziert, wie anhand der Lymphokin-Produktion und der Erzeugung
einer spezifischen zytotoxischen Antwort gezeigt wurde. Anstelle
eines ganzen Lipoproteins wurde nur ein kurzes Peptid verwendet
und es gibt keine Lehre oder Andeutung, daß das synthetische Lipopeptid
als ein Hilfsstoff für
andere Proteine verwendet werden könnte. Vielmehr führt diese Referenz
sogar von der Anwendung von Lipoproteinen, welche löslicher
als Lipopeptide sind, als Immunogene weg; siehe z. B. S. 1338, letzte
Zeile ("lösliche
Proteine sind keine Immunogene über
die oralen Verabreichungswege").
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Croft et al. [J. Immunol. (1991),
146(5): 793–796)
haben aus E. coli isolierte integrale Membranproteine (Imps) kovalent
mit verschiedenen Antigenen verknüpft und durch intramuskuläre Injektion
in Mäuse
und Kaninchen verstärkte
Immunantworten erhalten. Dennoch gibt es Nachteile beim kovalenten
Verknüpfen
des Lipoproteins und des Antigens. Wichtige Epitope können beschädigt werden
und das Verknüpfungsverfahren
ist schwer zu kontrollieren und erfordert häufig die Verwendung von toxischen
Vernetzungsmitteln. Daher wäre es
vorteilhaft, ein Verfahren für
das Induzieren einer verstärkten
immunologischen Antwort bereitzustellen, bei dem es nicht erforderlich
ist, daß das
Antigen mit einem Protein vernetzt wird. Darüber hinaus wurde nur eine geringe
Erhöhung
der Antikörperantwort
erhalten, wenn das Antigen CSP-OVA mit dem Lipoprotein TraT lediglich
gemischt anstelle von kovalent verknüpft wurde. Croft et al. schlossen
daher, daß das
Lipid für
die Hilfsstoffwirkung nicht notwendig ist im Gegensatz zu den überraschenden
Ergebnissen der Erfinder der vorliegenden Erfindung.
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Das US-Patent Nr. 4,439,425 betrifft
Lipopeptide, die 2 bis 10 Aminosäuren
aufweisen und deren prophylaktische Verabreichung über den
oralen oder rektalen Verabreichungsweg.
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Bessler et al. ["Synthetic Lipopeptide
Conjugates Constitute Efficient Novel Immunogens and Adjuvants in
Parenteral and Oral Immunization" (Abstract), Meeting on Molecular
Approaches to the Control of Infectious Diseases, (13.–17. September
1995) Cold Spring Harbor Laboratory (kein Stand der Technik im Hinblick
auf den 7. Juni 1995, dem Einreichungsdatum von USSN 08/476,656)]
betrifft die orale Verabreichung von Lipopeptiden, die 6 Aminosäuren aufweisen,
welche kovalent mit Antigenen verknüpft wurden. Für die Lipopeptid-Antigen-Konjugate
wurde gezeigt, daß sie
eine haptenspezifische Immunantwort induzieren.
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Schlecht of al. Zbl. Bakt. (1989)
271: 493–500]
betrifft Salmonella-typhimurium-Impfstoffe, die mit synthetisch
zubereiteten Derivaten eines bakteriellen Lipoproteins, das 5 Aminosäuren aufweist,
ergänzt.
Die Impfstoffe wurden durch zwei intraperitoneale Injektionen verabreicht
und intraperitoneal mit abgestuften Dosen von S. typhimurium herausgefordert.
Wenn man die protektive Leistungsfähigkeit der ergänzten Impfstoffe mit
der des nicht ergänzten
Impfstoffs verglich, wurde beobachtet, daß 90% des S.-typhimurium-Impfstoffs durch
das Lipopeptid ersetzt werden konnten, ohne eine bemerkbare Abnahme
der protektiven Leistungsfähigkeit.
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Eine wesentliche Anstrengung wurde
auf die Entwicklung eines Impfstoffs für die Lyme-Borreliose gerichtet. Zwei verschiedene
Ansätze
wurden für
die Impfstoffentwicklung verwendet. Ein Ansatz ist es, einen aus ganzen
inaktivierten Spirochaeten gebildeten Impfstoff zu verwenden, wie
von Johnson im US-Patent Nr. 4,721,617 beschrieben wurde. Für einen
ganzen inaktivierten Impfstoff wurde gezeigt, daß er Hamster vor der Herausforderung
schützt,
und er wurde für
die Verwendung bei Hunden zugelassen.
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Aufgrund der Bedenken bezüglich kreuzreaktiver
Antigene bei Zubereitungen mit ganzen Zellen hat sich die Humanimpfstoff-Forschung
auf die Identifizierung und die Entwicklung von nichtkreuzreaktiven
protektiven Antigenen, die von B. burgdorferi exprimiert werden,
konzentriert. Mehrere Antigenkandidaten sind bis heute identifiziert
worden. Ein großer
Teil dieser Bemühungen
wurde auf das am reichlichsten vorhandene äußere Oberflächenprotein von B. burgdorferi
konzentriert, nämlich
das äußere Oberflächenprotein
A (OspA), wie beschrieben in der veröffentlichten PCT-Patentanmeldung WO
92/14488, die dem Inhaber hiervon zugeordnet ist. In Maus-, Hamster-
und Hund-Herausforderungsstudien wurde für mehrere Versionen dieses
Proteins gezeigt, daß sie
pro tektive Immunität
induzieren. Klinische Prüfungen
am Menschen haben gezeigt, daß die
Formulierungen von OspA beim Menschen sicher und immunogen sind
[Keller et al., JAMA (1994) 271: 1764-1768]. In der Tat durchläuft eine
Formulierung, die rekombinantes, mit Lipid versehenes OspA enthält, wie
in der zuvor genannten WO 92/14488 beschrieben, derzeit die Sicherheits-/Wirksamkeitsuntersuchungen beim
Menschen der Phase III.
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Obwohl OspA bei der überwiegenden
Mehrheit der klinischen Isolate von B. burgdorferi aus Nordamerika
exprimiert wird, stellte sich bei der Untersuchung der klinischen
Borrelia-Isolate in Europa ein unterschiedliches Bild dar. In Europa
wird die Lyme-Borreliose durch drei genetische Arten von Borrelia,
nämlich
B. burgdorferi, B. garinii und B. afzelli, verursacht. Bei ungefähr der Hälfte der
europäischen
Isolate ist OspA nicht das am reichlichsten vorhandene äußere Oberflächenprotein.
Ein zweites äußeres Oberflächenprotein
C (OspC) ist das Hauptoberflächenantigen,
das auf diesen Spirochaeten gefunden wird. Tatsächlich wurde eine Reihe von
europäischen
klinischen Isolaten identifiziert, die OspA nicht exprimieren. Die
Immunisierung von Wüstenrennmäusen und
Mäusen
mit aufgereinigtem, rekombinantem OspC liefert protektive Immunität gegenüber B.-burgdorferi-Stämmen, die
das homologe OspC-Protein exprimieren [V. Preac-Mursic et al., INFECTION (1992)
20: 342–349;
W. S. Probert et al., INFECTION AND IMMUNITY (1994) 62: 1920–1926].
Das OspC-Protein
wird derzeit als ein möglicher
Bestandteil einer zweiten Generation von Lyme-Borreliose-Impfstoff-Formulierungen
in Betracht gezogen.
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Rekombinante Proteine sind vielversprechende
Kandidaten für
Impfstoffe oder immunogene Zusammensetzungen, weil sie mit hoher
Ausbeute und hoher Reinheit produziert und zum Maximieren der gewünschten
Aktivitäten
und zum Minimieren der ungewünschten
manipuliert werden können.
Weil sie schwach immunogen sein können, sind bei der Entwicklung
von Impfstoffen oder immunogenen Zusammensetzungen trotzdem Verfahren
wichtig, um die Immunantwort auf rekombinante Proteine zu verstärken. Darüber hinaus
ist es sehr wünschenswert,
in der Lage zu sein, solche Proteine in Verbindung mit anderen Antigenen
verabreichen zu können.
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Ein sehr vielversprechender Immunstimulator
ist die Lipiduntereinheit N-Palmitoyl-S-(2RS)-2,3-bis-(palmitoyloxy)-propylcystein,
abgekürzt
Pam3Cys. Diese Untereinheit ist am Aminoende der
bakteriellen Lipoproteine zu finden, welche mit einer Signalsequenz
synthetisiert werden, die den Lipidanhang und die Spaltung durch
die Signalpeptidase II spezifiziert. Synthetische Peptide, die selbst
nicht immunogen sind, induzieren eine starke Antikörperantwort,
wenn sie kovalent mit Pam3Cys verknüpft werden
[Bessler et al. (1992)].
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Zusätzlich zu einer Antikörperantwort
braucht man häufig
die Induzierung einer zellulären
Immunantwort, insbesondere von cytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs).
Pam3Cys-verknüpfte synthetische Peptide sind äußerst leistungsfähige Induziermittel
für CTLs,
aber niemand hat bisher von CTL-Induzierung durch große rekombinante
Lipoproteine berichtet.
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Die Nukleinsäuresequenz und die codierte
Aminosäuresequenz
von OspA sind für
mehrere klinische Isolate von B. burgdorferi bekannt und sind z.
B. in der veröffentlichten
PCT-Anmeldung WO 90/04411 (Symbicom AB) für den Stamm B31 von B. burgdorferi
und in Johnson et al., Infect. Immun. 60: 1845–1853 für einen Vergleich der ospA-Operons
von drei B. burgdorferi-Isolaten verschiedenen geographischen Ursprungs,
nämlich
B31, ACA1 und Ip90, beschrieben.
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Wie in der WO 90/04411 beschrieben,
zeigt eine Analyse der DNA-Sequenz für den B31-Stamm, daß das OspA durch ein offenes
Leseraster aus 819 Nukleotiden, beginnend an Position 151 der DNA-Sequenz und
an Position 970 der DNA-Sequenz aufhörend, codiert wird (siehe 1 darin). Die ersten sechzehn
Aminosäurereste
von OspA stellen eine hydrophobe Signalsequenz von OspA dar. Das
primäre
Translationsprodukt des B.-burgdorferi-Gens über die gesamte Länge beinhaltet
eine hydrophobe N-terminale Signalsequenz, welche ein Substrat für die Anlagerung
eines Diazylglycerols an die Sulfhydryl-Seitenkette des benachbarten Cysteinrests
ist. Im Anschluß an
diese Anlagerung tritt die Spaltung durch die Signalpeptidase II
und die Anlagerung einer dritten Fettsäure an den N-Terminus auf.
Die vollständige
Lipiduntereinheit wird als Pam3Cys bezeichnet.
Es wurde gezeigt, daß das
Versehen von OspA mit einem Lipid für die Immunogenität notwendig ist,
da das OspA-Lipoprotein mit einem N-terminalen Pam3Cys-Rest
eine starke Antikörperantwort
stimuliert, während
OspA ohne das angelagerte Lipid keine nachweisbaren Antikörper induzierte
[Erdile et al., Infect. Immun., (1993), 61: 81–90].
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Die veröffentlichte internationale
Patentanmeldung WO 91/09870 (Mikrogen Molekularbiologische Entwicklungs-GmbH)
beschreibt die DNA-Sequenz des ospC-Gens des B.-burgdorferi-Stamms Pko und das dadurch
codierte OspC-Protein (in dieser Referenz als pC bezeichnet) mit
einem Molekulargewicht von 22 kDa. Diese Sequenz läßt erkennen,
daß OspC
ein Lipoprotein ist, das eine Signalsequenz verwendet, die ähnlich zu
der ist, die für
OspA verwendet wird. Auf der Grundlage der Ergebnisse hinsichtlich
OspA könnte
man erwarten, daß das
Versehen von rekombinantem OspC mit Lipid nützlich wäre, um seine Immunogenität zu verstärken. Wie
in USSN 08/475,781, auf die oben Bezug genommen wurde, diskutiert,
machten deren Anmelder aber die Erfahrung mit Schwierigkeiten, nachweisbare
Expression von rekombinantem OspC zu erhalten. Es wäre nützlich,
die Immunogenität
von rekombinantem OspC zu verstärken.
Darüber
hinaus wäre
es nützlich,
eine mehrwertige immunologische Zusammensetzung für die Lyme-Borreliose
zu haben, welche sowohl gegen nordamerikanische als auch europäische Borrelia-Isolate
Antigene enthält.
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Strepfococcus pneumoniae verursacht
weltweit mehr tödliche
Infektionen als fast jedes andere Pathogen. In den USA kommen die
durch S. pneumoniae verursachten Todesfälle denen, die durch AIDS verursacht wurden,
in der Anzahl gleich. Die meisten tödlichen Pneumokokken-Infektionen in den
USA treten bei Individuen auf, die über 65 Jahre alt sind, bei
denen S. pneumoniae die häufigste
Ursache für
ambulant erworbene Lungenentzündung
ist. In der entwickelten Welt treten die meisten Pneumokokken-Todesfälle bei älteren oder bei
immungeschwächten
Patienten, einschließlich
denjenigen mit Sichelzellanämie,
auf. In den weniger entwickelten Bereichen der Erde ist die Pneumokokken-Infektion
eine der größten Todesursachen
unter Kindern, die jünger
als 5 Jahre alt sind. Die Zunahme der Häufigkeit von multiplen Antibiotika-Resistenzen
unter Pneumokokken und die unerschwinglich hohen Kosten der Arzneimittelbehandlung
in armen Ländern
bestimmen den derzeitigen Ausblick für die Kontrolle der Pneumokokken-Erkrankungsproblematik.
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Das Sammelbecken von Pneumokokken,
die den Menschen infizieren, wird primär über den nasopharyngealen Transport
durch den Menschen unterhalten. Die Menschen erwerben die Pneumokokken
zuerst über
Aerosole oder durch direkten Kontakt. Die Pneumokokken besiedeln
zunächst
die oberen Atemwege und können
in der Nasenschleimhaut über
Wochen oder Monate verbleiben. Nicht weniger als 50% oder mehr der jungen
Kinder und der älteren
Menschen sind besiedelt. In den meisten Fällen resultiert diese Besiedelung
in nicht offensichtlichen Infektionen. Dennoch kann der im Nasopharynx
getragene Organismus bei einigen Individuen symptomatische Nebenhöhlenentzündung oder
Mittelohrinfektion verursachen. Wenn Pneumokokken in die Lunge eingeatmet
werden, insbesondere mit Essenspartikeln oder Schleim, können sie
eine Lungenentzündung
verursachen. Infektionen an diesen Stellen können allgemein einige Pneumokokken
in das Blut abgeben, wo sie zu Sepsis führen können, insbesondere wenn sie
kontinuierlich in großer
Zahl vom ursprünglichen
Infektionsherd abgegeben werden. Pneumokokken im Blut können das
Gehirn erreichen, wo sie Meningitis auslösen können. Obwohl Pneumokokken-Meningitis
weniger üblich
als andere durch diese Bakterien verursachte Infektionen ist, ist
sie ausgesprochen vernichtend. Etwa 10% der Patienten sterben, und über 50% der Überlebenden
weisen lebenslange neurologische Folgekrankheiten auf.
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Bei älteren Patienten ist der derzeitige
23-wertige, kapselförmige
Polysaccharid-Impfstoff zu etwa 60% wirksam gegen invasive Pneumokokken-Erkrankungen
mit in den Impfstoff eingeschlossenen Stämmen des kapselförmigen Typs.
Der 23-wertige Impfstoff ist aufgrund ihrer Unfähigkeit, angemessene Antworten
auf die meisten Polysaccharide auszubilden, nicht wirksam bei Kindern,
die weniger als 2 Jahre alt sind. Verbesserte Impfstoffe, die Kinder
und Erwachsene gegen invasive Infektionen mit Pneumokokken schützen können, würden einige
der schädlichsten
Aspekte dieser Krankheit verringern helfen.
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Es wurde nachgewiesen, daß das Oberflächenprotein
PspA der S.-pneumoniae-Zelle ein Virulenzfaktor und ein protektives
Antigen ist. In der veröffentlichten
internationalen Patentanmeldung WO 92/14488 werden die DNA-Sequenzen
des pspA-Gens von S. pneumoniae Rx1, die gentechnische Herstellung
einer verkürzten
Form von PspA und der Beweis, daß diese verkürzte Form
von PspA Mäusen
Schutz von der Herausforderung mit lebenden Pneumokokken verleiht,
beschrieben.
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Bei der Bemühung, einen Impfstoff oder
eine immunogene Zusammensetzung auf der Basis von PspA zu entwickeln,
wurde PspA rekombinant in E. coli exprimiert. Es wurde beobachtet,
daß es
für wirksames
Exprimieren von PspA nützlich
ist, das reife PspA-Molekül
des Rx1-Stamms von seiner normalen Länge von 589 Aminosäuren auf
314 Aminosäuren
zu verkürzen,
wobei die Aminosäuren
1 bis 314 umfaßt
sind. Dieser Bereich des PspA-Moleküls beinhaltet die meisten,
wenn nicht alle der protektiven Epitope von PspA. Dennoch haben
Immunogenitäts-
und Schutz-Untersuchungen
bei Mäusen
ergeben, daß die
verkürzte,
rekombinante Form von PspA in natürlichen Mäusen nicht immunogen ist. Daher
wäre es
nützlich,
die Immunogenität
von rekombinantem PspA und Fragmenten davon zu verbessern. Darüber hinaus
wäre es
sehr wünschenswert, ein
Pneumokokken-Antigen in einer Kombination oder mehrwertigen Zusammensetzung
anzuwenden. Zum Beispiel ist die Influenza (Grippe) ebenso wie die
Lungenentzündung,
insbesondere bei den Älteren
und den Jungen, eine problematische Infektion, und jährliche
Grippeimpfungen sind insbesondere in Nordamerika üblich. Daher
ist es wünschenswert,
in der Lage zu sein, Grippe- und Pneumokokken-Antigene in einer
Zubereitung zu verabreichen.
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Helicobacter pylori ist das spiralförmige Bakterium,
welches speziell schleimabsondernde Zellen im menschlichen Magen
besiedelt und ist der ursächliche
Grund bei den meisten Fällen
von nicht-erosiver Gastritis bei Menschen. Neueste Forschungsaktivitäten weisen
darauf hin, daß H.
pylori, welches eine hohe Urease-Aktivität aufweist, für die meisten
peptischen Ulcera sowie häufig
für Magenkrebs
verantwortlich ist. Viele Studien haben angedeutet, daß die Urease,
ein Komplex aus den Produkten der ureA- und ureB-Gene, ein protektives
Antigen sein kann. Dennoch war es bis jetzt nicht bekannt, wie eine
hinreichende mucosale Immunantwort auf Urease ohne Choleratoxin
oder verwandte Hilfsstoffe zu bewirken ist.
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Antigene oder immunogene Fragmente
davon stimulieren eine Immunantwort, wenn sie einem Wirt verabreicht
werden. Solche Antigene, insbesondere wenn sie rekombinant hergestellt
sind, können
eine stärkere
Immunantwort hervorrufen, wenn sie in Verbindung mit einem Hilfsstoff
verabreicht werden. Gegenwärtig ist
Alaun der einzige zugelassene Hilfsstoff für die Verwendung beim Menschen,
obwohl Hunderte von experimentellen Hilfsstoffen, wie z. B. Choleratoxin
B, getestet werden. Dennoch weisen diese Hilfsstoffe Unzulänglichkeiten
auf. Zum Beispiel ist das Choleratoxin, obwohl es ein guter Hilfsstoff
ist, sehr toxisch. Auf der anderen Seite hat das Choleratoxin B,
obwohl es nicht toxisch ist, keine Hilfsstoffaktivität. Es ist
daher wünschenswert,
eine immunologische Zusammensetzung bereitzustellen, die in der
Lage ist, eine starke Antwort ohne die Notwendigkeit eines Hilfsstoffs
hervorzurufen.
-
In manchen Fällen tritt ein Wirksamkeitsstörung genanntes
Phänomen
auf, wenn mehrere Antigene (zwei oder mehr) in derselben Zubereitung
oder aufeinanderfolgend verabreicht werden. Einfach aufgrund der Wechselwirkung
eines oder mehrerer Antigene in der Zubereitung mit dem Wirts-Immunsystem
ruft das zweite oder andere Antigene in der Zubereitung keine hinreichende
Antwort hervor, z. B. wird die Wirksamkeit des letzteren Antigens
oder der letzteren Antigene durch das vorige Antigen oder die vorigen
Antigene beeinträchtigt.
Es ist daher wünschenswert,
mehrwertige immunologische Zusammensetzungen bereitzustellen, welche dieses
Phänomen
der Wirksamkeitsstörung
nicht verursachen, z. B. weil das zweite Antigen ein Lipoprotein
ist und als solches eine Hilfsstoffwirkung auf das erste Antigen
aufweist, und eine synergistische potenzierende Wirkung erhalten
wird, wenn es in einer Kombinationszusammensetzung mit einem Hilfsstoff
ist (wobei das erste Antigen nicht das zweite Antigen beeinträchtigt und
umgekehrt), wobei es nicht gewünscht
wird, notwendigerweise auf eine einzelne besondere Theorie beschränkt zu werden.
-
Noch allgemeiner ist es wünschenswert,
die Immunogenität
von Antigenen durch andere Verfahren als die Verwendung eines Hilfsstoffs
zu verstärken
und die Möglichkeit
zu haben, solche Mittel für
verstärkte
Immunogenität
mit einem Hilfsstoff anzuwenden, um so eine noch größere immunologische
Antwort zu erhalten.
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Die USSN 081446,201, auf die oben
verwiesen wurde, offenbart, daß die
mucosale Verabreichung von abgetöteten
ganzen Pneumokokken, Pneumokokkenlysat oder isoliertem und aufgereinigtem
PspA sowie immunogenen Fragmenten davon, insbesondere bei Verabreichung
mit einem Hilfsstoff, Schutz gegen Pneumokokkenbesiedelung und systemische
Infektion bei Tieren liefert. Es wurde jetzt überraschenderweise beobachtet,
daß die
mucosale Verabreichung von anderen Antigenen, wie z. B. Urease,
gemeinsam mit einem Lipoprotein bei Tieren systemische und lokale
Antworten ohne die Verwendung eines Hilfsstoffs hervorruft.
-
Es wird angenommen, daß der Stand
der Technik vordem folgendes nicht gelehrt oder nahegelegt hat: Immunologische
Zusammensetzungen, die wenigstens ein Antigen und ein Lipoprotein
und wahlweise einen Hilfsstoff umfassen, vorzugsweise ein Antigen,
ein antigenes Lipoprotein und wahlweise einen Hilfsstoff, sowie Verfahren
für die
Verabreichung derselben als eine mehrwertige Zusammensetzung oder
für die
gleichzeitige oder aufeinanderfolgende Verabreichung dieser Bestandteile,
insbesondere solche Zusammensetzungen und Verfahren, die eine verstärkte Immunogenität aufweisen.
-
AUFGABEN UND ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Es ist eine Aufgabe der Erfindung,
immunologische Zusammensetzungen und Verfahren für die Herstellung und Verwendung
derselben bereitzustellen.
-
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung,
immunologische Zusammensetzungen bereitzustellen, die verstärkte Immunogenität aufweisen
oder Zusammensetzungen, deren Verabreichung die immunologische Antwort
potenziert.
-
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung,
Verfahren für
das Induzieren einer immunologischen Antwort, vorzugsweise einer
potenzierten Antwort bereitzustellen, die die Verabreichung solcher
immunologischer Zusammensetzungen an einen geeigneten Wirt einschließen.
-
Es ist noch eine zusätzliche
Aufgabe der Erfindung, eine immunologische Zusammensetzung bereitzustellen
mit einer ersten Zusammensetzung, die wenigstens ein Antigen umfaßt, und
einer zweiten Zusammensetzung, die wenigstens ein Lipoprotein umfaßt, und
wahlweise einem Hilfsstoff, vorzugsweise solche Zusammensetzungen,
bei denen das Lipoprotein antigen wirkt.
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Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung
ist es, ein Verfahren für
das Induzieren oder Potenzieren einer immunologischen Antwort bereitzustellen,
das die Verabreichung einer ersten Zusammensetzung, die wenigstens
ein Antigen umfaßt,
und einer zweiten Zusammensetzung, die wenigstens ein Lipoprotein
umfaßt, und
wahlweise eines Hilfsstoffs an einen Wirt, Tier oder Mensch, umfaßt, und
besonders bevorzugt solche Verfahren, bei denen das Lipoprotein
antigen wirkt.
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Es wurde überraschenderweise beobachtet,
daß die
Verabreichung einer Zusammensetzung, die wenigstens ein Lipoprotein
umfaßt,
mit einer Zusammensetzung, die wenigstens ein Antigen umfaßt, an einen Wirt
eine immunologische Antwort durch den Wirt liefert. Die immunologische
Antwort ist im allgemeinen besser als die, die durch die alleinige
Verabreichung des Antigens erhalten wird.
-
Darüber hinaus wurde auch überraschenderweise
beobachtet, daß die
Verabreichung einer ersten Zusammensetzung, die wenigstens ein Antigen
umfaßt,
einer zweiten Zusammensetzung, die wenigstens ein Lipoprotein umfaßt, und
wahlweise eines Hilfsstoffs entweder durch gemeinsame Verabreichung
oder durch aufeinanderfolgende Verabreichung (über einen geeigneten Zeitraum,
so daß sowohl
das Antigen, der Hilfsstoff als auch das Lipoprotein zur gleichen
Zeit im Wirt vorliegen) an einen Wirt eine immunologische Antwort
auf das Antigen durch den Wirt liefert. Diese immunologische Antwort
ist im allgemeinen besser als die, die durch die alleinige Verabreichung
des Antigens oder durch die Verabreichung des Antigens und des Hilfsstoffs
erhalten wird. Mit Lipid versehene Proteine scheinen die Immunantwort
auf die Weise wie der Hilfsstoff Choleratoxin B zu stimulieren.
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Darüber hinaus wurde zusätzlich überraschenderweise
beobachtet, daß bei
diesen Verabreichungen das Lipoprotein selbst immunogen oder antigen
sein kann, z. B. daß es
ein Antigen sein kann, und daß nicht nur
die immunologische Antwort durch den Wirt auf das Antigen erhalten
wird, sondern ebenso die immunologische Antwort auf das antigene
Lipoprotein erhalten wird. Die immunologische Antwort auf das antigene
Lipoprotein kann ebensogut oder besser sein als die, die durch die
Verabreichung des Lipoproteins alleine oder mit einem Hilfsstoff
erhalten wird, und die immunologische Antwort auf das Antigen kann
besser sein als die, die durch die Verabreichung des Antigens alleine
oder des Antigens und des Hilfsstoffs erhalten wird.
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Der Begriff Lipoprotein, wie er hier
verwendet wird, soll die Lipopeptide aus dem Stand der Technik ausschließen, also
ein Lipoprotein kann mehr als 2 bis 10 Aminosäuren oder mehr als 18 bis 20
Aminosäuren oder
mehr als 24 Aminosäuren
oder 30 oder mehr Aminosäuren
aufweisen. Lipoproteine sind größere Moleküle, die,
trotz eines Vorurteils im Stand der Technik gegen Lipoproteine,
die Menge an Antigen und/oder Verabreichungen des Antigens reduzieren,
z. B. Vaccine (1994) 12 (14): 1335, 1338 letzte Zeile, Spalte 1
bis 1. Zeile, Spalte 2 ("Lösliche
Proteine ... nicht immunogen [über
den oralen Verabreichungsweg]"). Herkömmliche Lipopeptide können infolge
ihrer geringen Größe höchstens
ein Epitop haben, wohingegen Lipoproteine, die bei der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können,
mehr als ein Epitop aufweisen können,
z. B. ein B und ein T, oder sie können sogar an sich antigen
sein. Zusätzlich
dazu, daß sie
kürzer
sind und ein geringeres Molekulargewicht aufweisen als Lipoproteine
und daß sie
schwierig zu synthetisieren sind, weil sie normalerweise durch Merrifield-
oder andere Syntheseverfahren hergestellt werden, unterscheiden
sich Lipopeptide von Lipoproteinen darin, daß Lipoproteine größer sind,
im allgemeinen nicht durch das Merrifield-Syntheseverfahren hergestellt
sind und daß sie
aus Isolierungen aus natürlichen
Quellen oder aus Rekombinationsverfahren stammen können. Das
heißt,
Lipopeptide aus dem Stand der Technik wurden synthetisch hergestellt,
was ihre Größe auf nicht
mehr als etwa 30 Aminosäuren
begrenzt. Lipoproteine sind größer und
von höherem
Molekulargewicht als Lipopeptide und werden im Gegensatz zu Lipopeptiden
im allgemeinen nicht durch Merrifield-Syntheseverfahren hergestellt.
Lipoproteine können
aus natürlichen
Quellen isoliert oder durch Rekombinationsverfahren hergestellt
werden. Außerdem
sind Lipoproteine besser löslich
als Lipopeptide. Zudem weisen Peptide keine Quartär- oder
Tertiärstruktur
auf, wohingegen Proteine eine Quartär- und/oder Tertiärstruktur aufweisen
können.
Aufgrund ihrer Fähigkeit,
eine Tertiärstruktur
auszubilden, haben Protei ne die Fähigkeit, funktionelle Bereiche
auszubilden, was Peptide nicht können.
Folglich gibt es eine Reihe von Unterschieden zwischen herkömmlichen
"Lipopeptiden" und "Lipoproteinen", wie sie bei dieser Erfindung
verwendet werden.
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Die Lipoprotein-Formulierungen dieser
Erfindung können
nasal verabreicht werden und dies ist vorteilhaft.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung
wurde auch beobachtet, daß ein
gemäß der vorliegenden
Erfindung mit einem Antigen verabreichtes Lipoprotein 500-mal wirksamer
ist als die Verabreichung eines Lipopeptids und eines Antigens.
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Dementsprechend stellt die vorliegende
Erfindung eine immunologische Zusammensetzung bereit mit einer ersten
Zusammensetzung, die wenigstens ein Antigen umfaßt, und einer zweiten Zusammensetzung,
die wenigstens ein Lipoprotein umfaßt. Die Zusammensetzung kann
zudem wahlweise, aber nicht notwendigerweise, einen Hilfsstoff umfassen.
Vorzugsweise ist das Lipoprotein ein Antigen. Die immunologische
Zusammensetzung kann ein Impfstoff sein.
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Die vorliegende Erfindung umfaßt weiterhin
ein Verfahren für
das Induzieren einer immunologischen Antwort in einem Wirt, das
das Verabreichen der zuvor genannten immunologischen Zusammensetzung
umfaßt.
Das Verfahren kann zum Induzieren einer Schutzantwort sein, z. B.
wenn die immunologische Zusammensetzung ein Impfstoff ist.
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Die vorliegende Erfindung umfaßt zudem
ein Verfahren zum Induzieren einer immunologischen Antwort mit aufeinanderfolgender
Verabreichung einer ersten Zusammensetzung, die ein Antigen umfaßt, und
einer zweiten Zusammensetzung, die ein Lipoprotein umfaßt. Wahlweise
können
entweder die erste oder die zweite Zusammensetzung oder sowohl die
erste als auch die zweite Zusammensetzung zusätzlich einen Hilfsstoff umfassen.
Vorzugsweise ist das Lipoprotein ein Antigen. Die aufeinanderfolgende
Verabreichung sollte in einem geeigneten Zeitraum vorgenommen werden,
wobei sowohl das Antigen, das Lipoprotein und der wahlweise Hilfsstoff
zu derselben Zeit im Wirt vorliegen, und ein solcher Zeitraum kann
durch einen Fachmann anhand dieser Offenbarung ohne übermäßiges Experimentieren
und durch Verfahren im Bereich des Fachmanns bestimmt werden, wie
z. B. Wirtsseren-Titrationen, einschließlich der Analyse davon hinsichtlich
des Vorhandenseins von Antigen oder Antikörper durch z. B. die ELISA-Analyse.
Die Verabreichung kann mucosal, z. B. intragastrisch oder intranasal,
erfolgen.
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Die vorliegende Erfindung umfaßt insbesondere
Verfahren zum Induzieren einer immunologischen Antwort in einem
Wirt, die die Stufen der mucosalen Verabreichung wenigstens eines
Antigens an den Wirt und die mucosale Verabreichung wenigstens eines
Lipoproteins an den Wirt umfassen. Die Verabreichung kann gleichzeitig
oder nacheinander erfolgen. Das Antigen kann ein bakterielles Protein
oder ein Fragment davon sein, z. B. Urease.
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Das "Antigen" bei den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
und Verfahren kann jedes Antigen sein, gegen welches eine immunologische
Antwort in einem Wirt, Tier oder Mensch, hervorzurufen gewünscht wird.
Ohne die Erfindung notwendigerweise zu beschränken, kann das Antigen z. B.
folgendes sein: ein Borrelia-Antigen, z. B. OspA, OspC, OspB, OspD,
ein Pneumokokken-Antigen,
z. B. PspA, ein Influenza- (Grippe-) Antigen, wie z. B. HA, ein
Pertussis- oder Keuchhusten- Antigen,
wie z. B. das Pertussis-69kD-Polypeptid, z. B. ein Hepatitis-Antigen,
ein Hepatitis-B-Antigen, wie ein Hepatitis-B-Oberflächenantigen,
ein Helicobacter-pylori-Antigen, wie Urease, ein Tollwutvirus-Antigen,
z. B. Tollwut-G-Antigen, ein Flavivirus-Antigen, z. B. ein Japanische-Enzephalitis-Virus-,
ein Denguevirus- oder Gelbfiebervirus-Antigen, ein Windpockenvirus-Antigen, ein
Diphtherie-Antigen,
ein C.-tetani-Antigen, z. B. ein Tetanustoxoid, ein Mumpsvirus-Antigen,
ein Masernvirus-Antigen,
ein Malaria-Antigen, ein Herpesvirus-Antigen, wie ein Alphaherpesvirus-,
Betaherpesvirus- oder Gammaherpesvirus-Antigen,
z. B. ein Herpesvirus-Glycoprotein, z. B. ein Pferde-Herpesvirus-Antigen, z. B. gp13,
gp14, gD, gp63 oder gE, ein Pseudorabiesvirus-Antigen, z. B. gp50,
gpll, gplll, gpl, ein Herpes-Simplex-Virus-Antigen, z. B. gC, gD,
ein Rinder-Herpesvirus-Antigen, z. B. gl, ein Katzen-Herpesvirus-Antigen,
z. B. gB, ein Epstein-Barr-Virus-Antigen, z. B. gp220, gp340 oder
gH oder ein Mensch-Cytomegalovirus-Antigen, z. B. gB, ein Menschen-Immunschwächevirus-Antigen,
z. B. gp160 oder gp120, ein Affen-Immunschwächevirus-Antigen, ein Rinder-Virale-Diarrhö-Virus-Antigen, ein Pferde-Influenzavirus-Antigen,
ein Katzen-Leukämievirus-Antigen,
ein Hundestaupevirus-Antigen, z. B. HA- oder F-Glycoproteine, ein
Hunde-Adenovirus-Antigen, z. B. Hunde-Adenovirus-Typ-2-Antigen, ein Hunde-Koronavirus-Antigen,
ein Hunde-Parainfluenza-Antigen, ein Hunde-Parvovirus-Antigen, ein Hantaanvirus-Antigen,
ein Geflügelgrippevirus-Antigen,
z. B. ein Nukleoprotein-Antigen, ein Newcastle-Krankheit-Virus-Antigen,
z. B. F, HN, ein Antigen des mit Rous assoziierten Virus, z. B.
ein RAV-1-Hüll-Antigen,
ein Infektiöse-Bronchitis-Virus-Antigen,
z. B. ein Matrix-Antigen
oder ein Preplomer-Antigen, ein Infektiöse-Bursitis-Virus-Antigen,
ein Cholera-Antigen, ein Tumor-assoziiertes Antigen, ein Katzen-Immunschwächevinas-Antigen,
ein Maul-und-Klauenseuche-Virus-Antigen,
ein Mareks-Krankheit-Virus-Antigen, ein Staphylococci-Antigen, ein
Sfreptococci-Antigen,
ein Haemophilus-influenza-Antigen, z. B. Polysaccharid-Protein-Konjugate
der Gruppe B, ein Papillomavirus, ein Poliovirus-Antigen, ein Rubellavirus-Antigen,
ein Pockenvirus, wie ein Pokken-Antigen, z. B. Vaccinia, ein Typhusvirus-Antigen,
ein Typhoid-Virus-Antigen, ein Tuberkulosevirus-Antigen, ein HTLV-Antigen
oder ein anderes Bakterien-, Virus- oder Pathogen-Antigen, wie z.
B. ein bakterielles oder virales Oberflächenantigen oder Hüllprotein.
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Das Antigen kann ein bekanntes Antigen
sein, es kann aus Bakterien, Virus oder einem Pathogen isoliert
sein oder kann ein rekombinantes Antigen aus der Expression einer
dafür codierenden,
geeigneten Nukleinsäure
durch einen geeigneten Vektor und der Isolierung und/oder Aufreinigung
des rekombinanten Antigens sein. Die Auswahl des Antigens ist natürlich abhängig von
der gewünschten
immunologischen Antwort und dem Wirt.
-
Das Lipoprotein kann jedes Lipoprotein
sein, welches physiologisch mit dem Wirt verträglich ist. Besonders bevorzugt
ist es ein bakterielles Lipoprotein oder ein Lipoprotein, das eine
bakterielle Lipiduntereinheit aufweist.
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Das Lipoprotein ist vorzugsweise
auch selbst ein Antigen. Daher ist das Lipoprotein vorzugsweise
ein Bestandteil der äußeren Membran
eines Pathogens, z. B. eines Virus oder von Bakterien, besonders
bevorzugt ein Lipoprotein, das ein extrinsisches oder peripheres
Protein aufweist, so daß das
Lipoprotein unter milden Bedingungen oder mit mildem Detergens extrahiert
wird ohne wesentliche Denaturierung oder wesentlichen Verlust der
Lipiduntereinheit (um so die Epitope zu be wahren). Jedoch kann jedes
antigene Lipoprotein bei der Anwendung der Erfindung eingesetzt
werden. Und das Lipoprotein kann aus einer geeigneten physiologischen
Quelle isoliert werden oder aus einem Organismus, z. B. Bakterien,
oder kann rekombinant hergestellt werden. Daher können die
mit Lipid versehenen Borrelia-Antigene, z. B. rekombinantes OspA,
und mit Lipid versehenes OspA und Borrelia-Fraktionen, die (unter
milden Bedingungen isolierte) mit Lipid versehene Proteine enthalten,
offenbart in den Anmeldungen, auf die in dem Verweis auf die verwandten
Anmeldungen hingewiesen wird, und in WO 90/04411, als das Lipoprotein
bei der Anwendung der Erfindung verwendet werden. Selbstverständlich sind
das "Antigen" und das "Lipoprotein" bei der Erfindung getrennte,
verschiedene Inhaltsstoffe (so daß z. B., wenn das "Lipoprotein"
OspA ist, es nicht auch das "Antigen" ist).
-
In der Anmeldung mit der Serien-Nummer
08/475,781, eingereicht am 7. Juni 1995 und hierin durch Bezugnahme
eingeschlossen, sind rekombinante Lipoproteine offenbart, insbesondere
antigene rekombinante Lipoproteine, z. B. solche aus der Expression
der Leitsequenz von OspA für
das Versehen mit Lipid davon, und diese rekombinanten Lipoproteine
können
bei der Anwendung der Erfindung eingesetzt werden. Für die Expression
der rekombinanten Proteine wird erwartet, daß der Fachmann mit den verschiedenen
für eine
solche Expression erhältlichen
Vektorsystemen vertraut ist, z. B. Bakterien, wie z. B. E. coli
und Bakterienviren und dergleichen.
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Der Hilfsstoff kann jedes Transportmittel
sein, welches typischerweise die Antigenität des Antigens verstärkt, z.
B. eine Suspension oder ein Gel von Mineralien (z. B. Alaun, Aluminiumhydroxid
oder -phosphat), auf welches das Antigen adsorbiert wird, oder eine
Wasser-in-Öl-Emulsion,
in welche Antigenlösung
in Mineralöl
emulgiert wird (z. B. Freunds unvollständiges Adjuvans), manchmal
mit dem Einschluß von
abgetöteten Mycobakterien
(z. B. Freunds vollständiges
Adjuvans), oder Choleratoxin (manchmal mit Choleratoxin B, welches
die Wirkung verstärken
kann) oder jeder der anderen aus dem Stand der Technik bekannten
oder in dem Hintergrund der Erfindung diskutierten Hilfsstoffe.
Das Antigen und/oder das Lipoprotein kann an den Hilfsstoff adsorbiert
oder mit dem Hilfsstoff verknüpft
werden.
-
Die derzeit bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung umfassen: Alaun als der Hilfsstoff, wenn ein Hilfsstoff
vorliegt, OspA oder ein rekombinantes OspA-Leitsequenz/PspA, ein
rekombinantes OspA-Leitsequenz/OspC, ein rekombinantes OspA-Leitsequenz/UreA
von H. pylori oder ein rekombinantes OspA-Leitsequenz/UreB von H.
pylori als das Lipoprotein (OspA-Leitsequenz/PspA
ist ein rekombinantes Lipoprotein, das eine mit Lipid versehene
Untereinheit aus der Expression der OspA-Leitnukleinsäuresequenz
und eine Proteinuntereinheit aus der Expression einer pspA-Nukleinsäuresequenz
aufweist, OspA-Leitsequenz/OspC ist analog zu OspA-Leitsequenz/PspA
außer,
daß die
Proteinuntereinheit aus der Expression einer ospC-Nukleinsäuresequenz
stammt, und OspA-Leitsequenz/ureA und OspA-Leitsequenz/ureB sind
ebenfalls analog zu OspA-Leitsequenz/PspA außer, daß die Proteinuntereinheit aus
der Expression einer ureA- oder ureB-Nukleinsäuresequenz stammt), und OspC
oder ein anderes Borrelia-Antigen oder ein Influenza-Antigen, z.
B. HA (wie z. B. aus Influenza A, z. B. Texas-Stamm) oder Urease
als das Antigen. Besondere Ausführungsformen können die
folgenden Zusammensetzungen einschließen: (i) Alaun [Hilfsstoff],
OspA [Lipoprotein] und ein anderes Borrelia-Antigen, wie z. B. OspC
[Antigen] umfassend, (ii) Alaun [Hilfsstoff], OspA [Antigen] und OspA-Leitsequenz/OspC
[Lipoprotein] umfassend, (iii) Alaun [Hilfsstoff], OspA-Leitsequenz/PspA
[Lipoprotein] und Influenza-Antigen, z. B. Influenza-A-HA [Antigen]
umfassend, (iv) OspA [Lipoprotein] und ein H.-pylori-Antigen, z.
B. Urease [Antigen] umfassend.
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Andere Aufgaben und Ausführungsformen
der Erfindung sind in der folgenden Beschreibung offenbart oder
sind daraus offensichtliche Varianten.
-
KURZE BESCHREIBUNG DER
FIGUREN
-
In der folgenden ausführlichen
Beschreibung wird auf die begleitenden Figuren hingewiesen, wobei:
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1 eine
graphische Darstellung der Immunantwort von Mäusen ist, die mit OspC-Formulierungen mit
oder ohne aufgereinigtem, mit Lipid versehenem OspA und mit oder
ohne Alaun als einem Hilfsstoff immunisiert wurden, gemessen in
einem Anti-OspC-ELISA am Tag 63 nach der Immunisierung, und
-
2 eine
graphische Darstellung der Immunantwort von Mäusen ist, die mit OspC-Formulierungen mit
oder ohne aufgereinigtem, mit Lipid versehenem OspA und mit oder
ohne Alaun als einem Hilfsstoff immunisiert wurden, gemessen in
einem Anti-OspC-ELISA am Tag 91 nach der Immunisierung.
-
3 ist
eine graphische Darstellung der Immunantwort von Mäusen, die
zweifach intranasal mit entweder mit Lipid versehenem oder nicht
mit Lipid versehenem OspA immunisiert wurden, gemessen in einem Anti-OspA-ELISA
am Tag 9 nach der zweiten Immunisierung.
-
4 ist
eine graphische Darstellung der Immunantwort von Mäusen, die
zweimal sowohl intranasal als auch intragastrisch entweder mit Jackbohnen-Urease
allein oder sowohl mit Urease als auch mit OspA immunisiert wurden,
gemessen in einem Anti-Urease-ELISA am Tag 9 nach der zweiten Immunisierung.
-
5 ist
eine graphische Darstellung der Immunantwort von Mäusen, die
zweimal intranasal mit Jackbohnen-Urease entweder wie oben oder
mit OspA oder Choleratoxin immunisiert wurden, gemessen in einem Anti-Urease-ELISA
am Tag 9 nach der zweiten Immunisierung.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Wie oben erörtert, umfaßt die Erfindung immunologische
Zusammensetzungen und Verfahren für deren Herstellung und Verwendung
(z. B. Verabreichung), welche in einem breiten Sinne immunologische
Zusammensetzungen einschließen,
die ein Antigen und ein Lipoprotein umfassen und wahlweise einen
Hilfsstoff enthalten, und die Verfahren umfassen breit die Verabreichung
solcher Zusammensetzungen an einen geeigneten Wirt, so daß die gemeinsame
Verabreichung des Antigens und des Lipoproteins und wahlweise des Hilfsstoffs
vorliegt oder die aufeinanderfolgende Verabreichung der Bestandteile
davon.
-
Es wurde jetzt überraschenderweise beobachtet,
daß die
mucosale Verabreichung eines Antigens, z. B. eines bakteriellen
Proteins oder eines Fragments davon, und eines Lipoproteins sowohl
zu lokalen als auch zu Serum-Immunantworten führt. Der prinzipiell bestimmende
Faktor der spezifischen Immunität
auf mucosalen Oberflächen
ist sekretorisches IgA (S-IgA), welches physiologisch und funktionell
von den Bestandteilen des zirkulatorischen Immunsystems getrennt
ist. S-IgA-Antikörperantworten
können
durch die Anwendung geeigneter Immunogene auf eine besondere mucosale
Stelle induziert werden. Dennoch sind die mucosalen S-IgA-Antworten
großteils
die Ergebnisse der Immunität,
die über
das herkömmliche
mucosale Immunsystem (CMIS) erzeugt wurde [Mestecky, J. J. Clin.
Immunol. (1987) 7: 265–276],
in welchem Immunogene durch spezialisierte lymphoepitheliale Strukturen
aufgenommen werden, die gemeinsam als Mucosa-assoziiertes Lymphgewebe
(MALT) bezeichnet werden. Die am besten untersuchten immunologischen
lymphoepithelialen Strukturen sind die Darm-assoziierten Lymphgewebe
(GALT), wie z. B. die Peyer'schen Plaques des Darms. Dennoch ist
jetzt eindeutig, daß andere
strukturell und funktionell ähnliche
Lymphfollikel auf anderen mucosalen Oberflächen auftreten, einschließlich derer
des Atmungstrakts [Croituru, K. et al., in "Handbook of Mucosal Immunology"
(Bienenstock, J., Hrsg.) San Diego, CA: Academic Press, Inc. (1994),
141–149].
-
In den experimentellen Ergebnissen,
die in den untenstehenden Beispielen angegeben werden, wird gezeigt,
daß Mäuse durch
intranasales (i. n.) oder intragastrisches (i. g.) Einbringen von
bakteriellen Protein-Immunogenen in Verbindung mit einem Lipoprotein,
wie z. B. OspA, wirksam immunisiert werden können. Spezifische IgA- und
IgG-absondernde Zellen werden in den Speicheldrüsen und Mägen (die Mägen sind nicht dargestellt)
induziert, und spezifische IgA-Antikörper werden im Speichel induziert
(nicht dargestellt). Starke zirkulatorische Immunantworten werden
ebenso mit IgG- und IgA-Antikörpern
im Serum induziert. Dementsprechend scheint es, daß die mucosale
Immunisierung mit Antigenen gemeinsam mit Lipoproteinen ein wirksamer
Weg für
die Stimulierung der üblichen
mucosalen Antworten sowie der zirkulatorischen Antikörperantworten
ist. Solche Immunisierung kann sowohl therapeutisch als auch prophylaktisch
sein.
-
Die Bestimmung der Menge an Antigen,
Lipoprotein und wahlweise Hilfsstoff bei den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
und der Herstellung dieser Zusammensetzungen kann den Standardverfahren
entsprechen, die dem Pharmazie- oder Veterinärfachmann gut bekannt sind.
Insbesondere werden die Menge an Antigen, Lipoprotein und Hilfsstoff
bei den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
und den verabreichten Dosierungen durch Verfahren bestimmt, die
den Fachleuten aus den medizinischen oder veterinärmedizinischen
Fachbereichen wohlbekannt sind, wobei solche Faktoren, wie das spezielle
Antigen, das Lipoprotein, der Hilfsstoff, das Alter, das Geschlecht,
das Gewicht, die Gattung und der Zustand des speziellen Patienten und
der Verabreichungsweg, berücksichtigt
werden. Zum Beispiel sind die Dosierungen der jeweiligen oben aufgelisteten
Antigene für
geeignete Wirte, in denen eine immunologische Antwort gewünscht ist,
ebenso wie die Menge an Hilfsstoff, die typischerweise damit verabreicht
wird, den Fachleuten bekannt. Daher kann der Fachmann die Menge
an Antigen und wahlweise an Hilfsstoff für die Zusammensetzungen und
welche bei den Verfahren der Erfindung verabreicht werden soll,
leicht bestimmen. Ty pischerweise wird ein Hilfsstoff gewöhnlich als
eine 0,001–50
Gew.-%-ige Lösung
in phosphatgepufferter Salzlösung
verwendet, und das Antigen liegt in der Größenordnung von Mikrogramm bis
Milligramm vor, wie z. B. etwa 0,0001 bis etwa 5 Gew.-%, bevorzugt
etwa 0,0001 bis etwa 1 Gew.-%, besonders bevorzugt etwa 0,0001 bis
etwa 0,05 Gew.-% (siehe z. B. die untenstehenden Beispiele).
-
Der Fachmann kann sich auf eine bekannte
Dosierung für
das bestimmte Antigen für
einen bestimmten Wirt beziehen, um die Menge an Lipoprotein für die Zusammensetzungen
und welche bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung verabreicht
wird, zu bestimmen (wenn das Lipoprotein antigen wirkt), wie z.
B. aus den hierin zitierten Schriften bekannte Dosierungen für OspA,
oder er kann die Dosierung für
einen bestimmten Wirt anhand der hierin zitierten Schriften und
der untenstehenden Beispiele bemessen (z. B. hinsichtlich OspA-Leitsequenz/PspA,
OspA-Leitsequenz/OspC, OspA-Leitsequenz/ureA und OspA-Leitsequenz/ureB). Typischerweise
liegt das antigene und/oder rekombinante Lipoprotein aber in einer
Menge in der Größenordnung
von Mikrogramm bis Milligramm vor oder von etwa 0,001 bis etwa 20
Gew.-%, bevorzugt von etwa 0,01 bis etwa 10 Gew.-% und besonders
bevorzugt von etwa 0,05 bis etwa 5 Gew.-% (siehe z. B. die untenstehenden
Beispiele).
-
Selbstverständlich ist es bevorzugt, für jede Zusammensetzung,
die an ein Tier oder an einen Menschen verabreicht werden soll,
einschließlich
der Bestandteile davon, und für
jedes spezielle Verfahren der Verabreichung, folgendes zu bestimmen:
die Toxizität,
wie z. B. über
die Bestimmung der letalen Dosis (LD) und der LD50 in
einem geeigneten Tiermodell, z. B. mit einem Nager wie der Maus,
und die Dosierung der Zusammensetzung(en), die Konzentration der
Bestandteile darin und die zeitliche Planung der Verabreichung der Zusammensetzung(en),
welche eine angemessene immunologische Antwort hervorrufen, z. B.
durch Titrationen der Seren und deren Analyse auf Antikörper oder
Antigene, z. B. durch ELISA. Solche Bestimmungen erfordern mit dem
Wissen des Fachmanns, dieser Offenbarung und der hierin zitierten
Schriften kein übermäßiges Experimentieren.
Und die Zeit der aufeinandertolgenden Verabreichungen kann, wie
oben diskutiert, ohne übermäßiges Experimentieren
ermittelt werden.
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Beispiele für Zusammensetzungen der Erfindung
umfassen flüssige
Zubereitungen wie z. B. Suspensionen, Sirupe oder Elixiere für die Verabreichung über die
Körperöffnungen,
z. B. oral, nasal, anal, vaginal, peroral, intragastrisch, mucosal
(z. B. perlingual, alveolar, über
das Zahnfleisch, über
die olfaktorische oder respiratorische Schleimhaut) etc. und Zubereitungen
für die
parenterale, subkutane, intradermale, intramuskuläre oder
intravenöse
Verabreichung (z. B. injizierbare Verabreichung), wie z. B. sterile
Suspensionen oder Emulsionen. Solche Zusammensetzungen können in
einem Gemisch mit einem geeigneten Träger, Verdünnungsmittel oder Arzneistoftträger, wie
z. B. sterilem Wasser, physiologischer Salzlösung, Glucose oder dergleichen sein.
Die Zusammensetzungen können
ebenso gefriergetrocknet sein. Die Zusammensetzungen können Hilfsstoffe,
wie z. B. Benetzungs- oder Emulgiermittel, pH-Puffer-Mittel, gelierende
oder die Viskosität
verstärkende Zusatzstoffe,
Konservierungsstoffe, Geschmacksmittel, Farben und dergleichen in
Abhängigkeit
von dem gewünschten
Verabreichungsweg und der gewünschten
Zubereitung enthalten. Standardschrif ten, wie z. B. "REMINGTON'S
PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17. Ausgabe, 1985, können herangezogen werden, um
geeignete Zubereitungen ohne übermäßiges Experimentieren
herzustellen.
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Die Zusammensetzungen der Erfindung
können
zweckmäßigerweise
als flüssige
Zubereitungen bereitgestellt werden, z. B. als isotonische wäßrige Lösungen,
Suspensionen, Emulsionen oder viskose Zusammensetzungen, welche
mit einem Puffer auf einen ausgewählten pH-Wert eingestellt sein
können.
Falls die Absorption über
den Verdauungstrakt bevorzugt ist, können erfindungsgemäße Zusammensetzungen
in der "festen" Form von Pillen, Tabletten, Kapseln, Caplets und
dergleichen, einschließlich
"fester" Zubereitungen, welche über
die Zeit freigesetzt werden oder welche eine flüssige Füllung aufweisen, z. B. eine
mit Gelatine umhüllte
Flüssigkeit,
bei der die Gelatine für
die Beförderung
in den Darm im Magen aufgelöst
wird.
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Falls die nasale oder respiratorische
(mucosale) Verabreichung gewünscht
ist, können
Zusammensetzungen als Inhaliermittel, Sprays und dergleichen zubereitet
und mit einem Druck-Sprüh-Spender, Pump-Spender
oder Aerosol-Spender verabreicht werden. Aerosole sind gewöhnlich mit
Hilfe eines Kohlenwasserstoffs unter Druck gesetzt. Pump-Spender
können
vorzugsweise eine abgemessenen Dosis oder eine Dosis, die eine bestimmte
Partikelgröße aufweist,
verabreichen.
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Zusammensetzungen innerhalb des Umfangs
dieser Erfindung können
ein Befeuchtungsmittel enthalten, um das Austrocknen der Schleimhautmembran
zu verhindern und um einer Reizung vorzubeugen. Jedes aus einer
Vielzahl von pharmazeutisch verträglichen Befeuchtungsmitteln
kann eingesetzt werden, einschließlich z. B. Sorbit, Propylenglycol
oder Glycerol. Wie bei den Verdickern wird die Konzentration mit
dem ausgewählten
Mittel variieren, obwohl die Anwesenheit oder die Abwesenheit dieser
Mittel oder ihre Konzentration kein wesentliches Merkmal dieser
Erfindung ist.
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Eine verstärkte Absorption über die
mucosale und insbesondere über
die nasale Membran kann durch das Einsetzen eines pharmazeutisch
verträglichen
oberflächenaktiven
Stoffs erreicht werden. Typischerweise schließen die für die Zusammensetzungen nützlichen
obertlächenaktiven
Stoffe Polyoxyethylenderivate von teilweise fettsäureveresterten
Sorbitolanhydriden ein, wie z. B. Tween 80, Polyoxynol-40-stearat,
Polyoxyethylen-50-stearat und Octoxynol. Die gewöhnliche Konzentration beträgt von 1%
bis 10%, bezogen auf das Gesamtgewicht.
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Ein pharmazeutisch verträgliches
Konservierungsmittel kann verwendet werden, um die Haltbarkeit der
Zusammensetzungen zu erhöhen.
Benzylalkohol kann geeignet sein, wenngleich eine Vielzahl von Konservierungsmitteln
ebenso verwendet werden kann, einschließlich Parabenen, Thimerosal,
Chlorbutanol oder Benzalkoniumchlorid. Eine geeignete Konzentration
des Konservierungsstoffs in Bezug auf das Gesamtgewicht wird von
0,02% bis 2% betragen, wenngleich es abhängig von dem ausgewählten Mittel
eine merkliche Variation geben kann.
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Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können pharmazeutisch
verträgliche
Geschmacksstoffe und/oder Farben beinhalten, um sie ansprechender
zu machen, insbesondere wenn sie oral verabreicht werden. Die viskosen
Zusammensetzungen können
in der Form von Gelen, Lotionen, Salben, Cremes und dergleichen
vorliegen und werden typischerweise eine hinreichende Menge eines
Verdickungsmittels enthalten, so daß die Viskosität von etwa
2.500 bis 6.500 cps beträgt,
wenngleich viskosere Zusammensetzungen von sogar bis zu 10.000 cps
verwendet werden können.
Die viskosen Zusammensetzungen haben vorzugsweise eine Viskosität von 2.500
bis 5.000 cps, da sie oberhalb dieses Bereichs schwieriger zu verabreichen sind.
Trotz allem können
die Zusammensetzungen oberhalb dieses Bereichs feste oder gelatinöse Formen
erreichen, welche dann als eine geschluckte Pille leicht für die orale
Einnahme verabreicht werden können.
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Flüssige Zubereitungen sind normalerweise
leichter herzustellen als Gele, andere viskose Zusammensetzungen
und feste Zusammensetzungen. Außerdem
sind flüssige
Zusammensetzungen etwas angenehmer zu verabreichen, insbesondere
durch Injektion oder orale Verabreichung an Tiere, Kinder, insbesondere
kleine Kinder, und andere, die Schwierigkeiten beim Schlucken einer
Pille, Tablette, Kapsel oder dergleichen haben, oder unter Umständen in
vielen Dosen. Viskose Zusammensetzungen können auf der anderen Seite
innerhalb des angemessenen Viskositätsbereichs formuliert werden,
um längere
Kontaktzeiten mit der Schleimhaut, wie z. B. der inneren Oberfläche der
Magen- oder Nasenschleimhaut, zu erreichen.
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Offensichtlich wird die Wahl des
geeigneten Trägers
und anderer Zusatzstoffe von dem genauen Weg der Verabreichung und
der Natur der speziellen Dosierungsform abhängen, z. B. flüssige Dosierungsform
[z. B. ob die Zusammensetzung in einer Lösung, einer Suspension, einem
Gel oder einer anderen flüssigen
Form formuliert werden soll) oder feste Dosierungsform [z. B. ob
die Zusammensetzung in einer Pille, Tablette, Kapsel, Caplet, in
einer über
die Zeit freisetzenden Form oder flüssigkeitsgefüllten Form
formuliert werden soll].
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Lösungen,
Suspensionen und Gele enthalten normalerweise einen größeren Anteil
an Wasser (vorzugsweise aufgereinigtes Wasser) zusätzlich zu
dem Antigen, dem Lipoprotein und dem wahlweisen Hilfsstoff. Kleinere
Mengen von anderen Inhaltsstoffen, wie z. B. pH-einstellenden Stoffen
(z. B. eine Base wie NaOH), Emulgier- oder Dispergiermittel, Puffermittel,
Konservierungsmittel, Benetzungsmittel, gelierende Mittel (z. B. Methylzellulose),
Farben und/oder Geschmacksstoffe können ebenso vorliegen. Die
Zusammensetzungen können
isotonisch sein, d. h. sie können
den gleichen osmotischen Druck wie das Blut und die Tränenflüssigkeit
aufweisen.
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Die gewünschte Isotonizität der Zusammensetzungen
dieser Erfindung können
unter Verwendung von Natriumchlorid oder anderen pharmazeutisch
verträglichen
Mitteln, wie z. B. Dextrose, Borsäure, Natriumtartrat, Propylenglycol
oder andere anorganischen oder organischen gelösten Substanzen, erreicht werden.
Natriumchlorid wird insbesondere für Puffer, die Natriumionen
enthalten, bevorzugt.
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Die Viskosität der Zusammensetzungen kann
auf dem ausgewählten
Niveau unter Verwendung eines pharmazeutisch verträglichen
Verdickungsmittels aufrechterhalten werden. Methylzellulose ist
bevorzugt, weil sie einfach und wirtschaftlich erhältlich und
leicht zu verarbeiten ist. Andere geeignete Verdickungsmittel umfassen
z. B. Xanthangummi, Carboxymethylzellulose, Hydroxypropylzellulose,
Carbomer und dergleichen. Die bevorzugte Konzentration des Verdickungsmittels
wird von dem ausgewählten
Mittel abhängen.
Der wichtige Punkt ist, eine Menge zu verwenden, die die ausgewählte Viskosität erzielt.
Viskose Zusammensetzungen werden normalerweise aus Lösungen durch
den Zusatz solcher Verdickungsmittel zubereitet.
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Ein pharmazeutisch verträgliches
Konservierungsmittel kann verwendet werden, um die Haltbarkeit der
Zusammensetzungen zu erhöhen.
Benzylalkohol kann geeignet sein, wenngleich eine Vielzahl von Konservierungsmitteln
ebenso verwendet werden kann, einschließlich z. B. Parabenen, Thimerosal,
Chlorbutanol oder Benzalkoniumchlorid. Eine geeignete Konzentration
des Konservierungsmittels wird von 0,02% bis 2%, bezogen auf das
Gesamtgewicht, betragen, wenngleich es abhängend von dem ausgewählten Mittel
eine merkliche Variation geben kann.
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Fachleute werden bemerken, daß die Bestandteile
der Zusammensetzungen so gewählt
sein müssen, daß sie in
Bezug auf das Antigen, das Lipoprotein und den wahlweisen Hilfsstoff
chemisch inert sind. Dies wird für
diejenigen, die mit chemischen und pharmazeutischen Prinzipien vertraut
sind, keine Schwierigkeit darstellen oder Schwierigkeiten können unter
Hinweis auf Standardschriften oder durch einfache Versuche (übermäßiges Experimentieren
nicht einschließend)
anhand dieser Offenbarung und der hierin zitierten Schriften einfach
vermieden werden.
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Die immunologisch wirksamen Zusammensetzungen
dieser Erfindung werden durch Mischen der Gradienten zubereitet,
wobei allgemein anerkannte Verfahren befolgt werden. Zum Beispiel
können
die ausgewählten
Bestandteile einfach in einem Mixer oder einer anderen Standardeinrichtung
gemischt werden, um ein konzentriertes Gemisch herzustellen, welches
dann auf die Endkonzentration und Viskosität durch den Zusatz von Wasser
oder Verdickungsmittel und möglicherweise
eines Puffers, um den pH-Wert zu kontrollieren, oder eines zusätzlichen
gelösten
Stoffs, um die Tonizität
zu kontrollieren, eingestellt werden kann. Im allgemeinen kann der
pH-Wert von etwa 3 bis 7,5 betragen. Die Zusammensetzungen können in
den Fachleuten aus den medizinischen und veterinärmedizinischen Gebieten bekannten
Dosierungen und Verfahren verabreicht werden, wobei solche Faktoren,
wie das Alter, das Geschlecht, das Gewicht und der Zustand des speziellen
Patienten oder Tiers, und die für
die Verabreichung verwendete Form der Zusammensetzung (z. B. fest
gegenüber
flüssig)
berücksichtig
werden. Die Dosierungen für
Menschen oder andere Säugetiere
können
durch den Fachmann aus dieser Offenbarung, den hierin zitierten
Schriften, den untenstehenden Beispielen (z. B. aus den Beispielen,
die Mäuse
einschließen)
und den hierin erwähnten
Kenntnissen von Antigenen und Lipoproteinen und Hilfsstoffen ohne übermäßiges Experimentieren
bestimmt werden.
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Die vorliegende Erfindung umfaßt auch
ein Verfahren für
das Induzieren einer immunologischen Antwort in einem Wirt, wobei
das Antigen und das Lipoprotein an eine Schleimhaut verabreicht
werden und eine Antwort bei einer anderen Schleimhaut nachweisbar
ist, z. B. nasale Verabreichung und vaginale Antwort. Dieser Aspekt
der Erfindung ist insbesondere für
die Behandlung oder die Vorbeugung von sexuell übertragenen Erkrankungen nützlich.
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Die geeigneten Therapiepläne für die initiale
Verabreichung und zusätzliche
Verabreichungen oder für aufeinanderfolgende
Verabreichungen sind auch variabel, können eine initiale Verabreichung
gefolgt von anschließenden
Verabreichungen einschließen,
aber sie können
nichtsdestotrotz vom Fachmann aus dieser Offenbarung, den hierin
zitierten Schriften, den untenstehenden Beispielen und aus der Kenntnis
von Antigenen, Lipoproteinen und Hilfsstoffen, die hierin erwähnt wurden,
ohne übermäßiges Experimentieren
bestimmt werden.
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Die folgenden Beispiele werden zu
Erläuterungszwecken
angegeben und sind nicht als eine Beschränkung der Erfindung gedacht.
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BEISPIELE
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BEISPIEL 1
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Konstruktion eines pET9a-Expressionsvektors,
der ein hybrides ospA/pspA-Gen enthält
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Speziell entworfene Oligonukleotid-Primer
wurden in einer PCR-Reaktion verwendet, um den Anteil des interessierenden
pspA-Gens (in diesem Fall von Aminosäure 1 bis 314) aus dem S.pneumoniae-Stamm RX1
zu amplifizieren.
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Der Primer für das 5'-Ende hatte die Nukleotidsequenz:
5'-GGG ACA GCA TGC GAA GAA TCT CCC GTA GCC AGT-3' (PspN1) (SEQ ID
NO: 1).
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Der Primer für das 3'-Ende hatte die Nukleotidsequenz:
5'-GAT GGA TCC TTT TGG TGC AGG AGC TGG TTT-3' (PspC370) (SEQ ID
NO: 2).
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Die PCR-Reaktion lief wie folgt ab:
94°C für 30 Sekunden,
um die DNA zu denaturieren, 42°C
für eine Minute
für das
Annealing der DNA und 72°C
für eine
Minute für
die Verlängerung
der DNA. Dies wurde in 25 Zyklen durchgeführt, gefolgt von einer 5-minütigen Verlängerung
bei 72°C.
Dieses Verfahren führte
bei Aminosäure
315 ein Stop-Codon ein. Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung des
Verfahrens Gene Clean II (Bio101) aufgereinigt und mit Sphl und
BamHI verdaut.
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Das Plasmid pLF100 wurde wie folgt
hergestellt.
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Das Plasmid pBluescript KS+ (Stratagene)
wurde mit Xbal und BamHI verdaut und mit einem Xbal-BamHI-DNA-Fragment
mit 900 bp, das den vollständigen
codierenden Bereich des ospA-Gens
des B.-burgdorferi-Stamms ACA1 enthielt, ligiert, um einen Lipoprotein-Fusionsvektor
pLF100 auszubilden. Dieses Verfahren ist in 1 der Anmeldung mit der Serien-Nr. 08/475,781,
eingereicht am 7. Juni 1995, schematisch dargestellt.
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Der Vektor pLF100 ist in der American
Type Culture Collection in Rockville, Maryland am 2. Februar 1995
unter der Zugangsnr. 69750 hinterlegt worden. Diese Hinterlegung
wurde gemäß der Bestimmungen
des Budapester Vertrags vorgenommen.
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pLF100 wurde mit Sphl und BamHI verdaut,
und das amplifizierte pspA-Gen wurde mit diesem Plasmid ligiert,
um das Plasmid pLF321 auszubilden, welches das hybride ospA pspA-Gen
enthielt. Das Hybrid-Gen wurde aus pLF321 durch Verdau mit Ndel
und BamHI ausgeschnitten und in die Ndel- und BamHI-Stellen des
Plasmidvektors pET9a kloniert, um das Hybrid-Gen ospA-pspA unter
die Kontrolle eines T7-Promotors zu bringen. Das resultierende Plasmid
wird als pPA321-L bezeichnet. Dieses Verfahren ist in 9 der Anmeldung mit der Serien-Nr. 08/475,781,
eingereicht am 7. Juni 1995, schematisch dargestellt.
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BEISPIEL 2
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Konstruktion eines pET9a-Expressionsvektors,
der das pspA-Gen enthält
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Speziell entworfene Oligonukleotid-Primer
wurden bei einer PCR-Reaktion verwendet, um den Anteil des interessierenden
pspA-Gens (in diesem Fall von Aminosäure 1 bis 314) aus dem S.pneumoniae-Stamm RX1
zu amplifizieren.
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Der Primer für das 5'-Ende hatte die Nukleotidsequenz:
5'-GCT CCT GCA TAT GGA AGA ATC TCC CGT AGC C-3' (PspNL-2) (SEQ ID
NO: 3).
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Der Primer für das 3'-Ende hatte die Nukleotidsequenz
5'-GAT GGA TCC TTT TGG TGC AGG AGC TGG TTT-3' (PspC370) (SEQ ID
NO: 4).
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Die PCR-Reaktion lief wie folgt ab:
94°C für 30 Sekunden,
um die DNA zu denaturieren, und 72°C für eine Minute für das Annealing
und die Verlängerung
der DNA. Dies wurde in 25 Zyklen ausgeführt, gefolgt von einer 5-minütigen Verlängerung
bei 72°C.
Dieses Verfahren führte
bei Aminosäure
315 ein Stop-Codon ein. Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung des
Verfahrens Gene Clean II (Bio101) aufgereinigt und mit Ndel und
BamHI verdaut. Das verdaute PCR-Produkt wurde in die Ndel- und BamHI-Stellen
des Plasmidvektors pET9a kloniert, um das pspA-Gen unter die Kontrolle
des T7-Promotors zu bringen. Das resultierende Plasmid wird als
pPA321-NL bezeichnet. Dieses Verfahren ist in 10 der
Anmeldung mit der Serien-Nr. 08/475,781, eingereicht am 7. Juni
1995, schematisch dargestellt.
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BEISPIEL 3
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Expression und Aufreinigung
von mit Lipid versehenem PspA
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Das Plasmid pPA321-L wurde verwendet,
um den E.-coli-Stamm BL21(DE3)pLyS zu transformieren. Die transformierten
E. coli wurden in LB-Medium, das 30 μg/ml Kanamycinsulfat und 25 μg/ml Chloramphenicol
enthielt, inokuliert. Die Kultur wurde über Nacht in einem Flaschenschüttler bei
37°C angezogen.
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Am darauffolgenden Morgen wurden
50 ml der Über-Nacht-Kultur
in 1 L LB-Medium, das 30 μg/ml
Kanamycinsulfat enthielt, überführt, und
die Kultur wurde in einem Flaschenschüttler bei 37°C in ungefähr 3–5 Stunden
angezogen bis zu einem Niveau der OD 600 nm von 0,6 bis 1,0. Zu
dem Kulturmedium wurde zu einer Endkonzentration von 0,5 mM IPTG
zugegeben, und die Kultur wurde für weitere 2 Stunden bei 30°C angezogen.
Die Kulturen wurden durch Zentrifugation bei 4°C, bei 10.000x g geerntet und
das Zellpellet wurde gesammelt. Mit Lipid versehenes PspA wurde
aus dem Zellpellet zurückgewonnen.
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Das Zellpellet wurde mit 30 g feuchter
Zellmasse pro Liter PBS in PBS resuspendiert. Die Zellsuspension
wurde eingefroren und bei –20°C gelagert.
Die Zellen wurden bei Raumtemperatur aufgetaut, um die Lyse zu bewirken.
DNase I wurde zu dem aufgetauten Material mit einer Endkonzentration
von 1 μg/ml
zugegeben, und das Gemisch wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur
inkubiert, was eine Abnahme der Viskosität des Materials zur Folge hatte.
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Das Material wurde dann in einem
Eisbad auf unter 10°C
abgekühlt,
und TritonTM X-114 wurde als eine 10%-ige
Stammlösung
bis zu einer Endkonzentration von 0,3 bis 1% zugegeben. Das Gemisch
wurde für
20 Minuten auf Eis gehalten. Das gekühlte Gemisch wurde dann auf
37°C erwärmt und
bei dieser Temperatur für 10
Minuten gehalten. Dies bewirkte, daß die Lösung sehr trüb wurde,
während
die Phasentrennung auftrat. Das Gemisch wurde dann bei etwa 20°C für 10 Minuten
bei 12.000x g zentrifugiert, was zu einer Trennung des Gemischs
in eine untere Detergensphase, eine obere klare, wäßrige Phase
und ein Pellet führte.
Das mit Lipid versehene PspA verteilte sich in der Detergensphase.
Die Detergensphase wurde von den anderen zwei Phasen abgetrennt,
1 : 10 mit einem Puffer verdünnt,
der 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 10 mM NaCl enthielt und einen pH-Wert
von 7,5 hatte, und bei –20°C gelagert.
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Eine Q-Sepharose-Säule wurde
mit einem Volumen von 1 ml pro 5 ml verdünnter Detergensphase zubereitet.
Die Säule
wurde mit dem zweifachen Säulenvolumen
an Puffer gewaschen, der 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 0,3% TritonTM X-100, 1 M NaCl enthielt und einen pH-Wert
von 4,0 hatte, und dann mit dem 5- bis 10-fachen Säulenvolumen
an 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 0,3% TritonTM X-100,
10 mM NaCl mit einem pH-Wert von 4,0 äquilibriert. Der pH-Wert des
Materials der verdünnten
Detergensphase wurde auf 4,0 eingestellt, zu welchem Zeitpunkt eine
Ausfällung
eintrat. Dieses Material wurde durch eine 0,2 μM Zelluloseacetat-Filtereinheit laufen
gelassen, um das ausgefällte
Material zu entfernen. Die filtrierte verdünnte Detergensphase wurde auf die
Q-Sepharose-Säule aufgetragen,
und der Durchfluß (der
PA321-L enthielt) wurde gesammelt. Die Säule wurde mit dem 1- bis 2-fachen
Säulenvolumen
an 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 0,3% TritonTM X-100,
10 mM NaCl mit einem pH-Wert von 4,0 gewaschen, und der Durchfluß wurde
mit der vorherigen Durchflußfraktion
vereinigt. Der pH-Wert des vereinigten Durchflusses wurde auf 7,5
eingestellt. Das gebundene Material, kontaminierende E.-coli-Proteine,
wurde von der Q-Sepharose mit dem 2-fachen Säulenvolumen an 50 mM Tris,
2 mM EDTA, 0,3% TritonTM X-100, 1 M NaCl mit einem pH-Wert von 4,0
eluiert. Ein Schema des in diesem Beispiel beschriebenen Aufreinigungsvorgangs
ist in 11 der Anmeldung mit der Serien-Nr.
08/475,781, eingereicht am 7. Juni 1995, dargestellt.
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BEISPIEL 4
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Expression und Aufreinigung
von nicht mit Lipid versehenem PspA
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Das Plasmid pPA321-NL wurde verwendet,
um den E.-coli-Stamm BL21(DE3)pLyS zu transformieren. Die transformierten
E. coli wurde in LB-Medium, das 30 μg/ml Kanamycinsulfat und 25 μg/ml Chloramphenicol enthielt,
inokuliert. Die Kultur wurde über
Nacht in einem Flaschenschüttler
bei 37°C
angezogen.
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Am nächsten Morgen wurden 50 ml
der Über-Nacht-Kultur
in 1 L LB-Medium, das 30 μg/ml
Kanamycinsulfat enthielt, überführt, und
die Kultur wurde in einem Flaschenschüttler bei 37°C in ungefähr 3–5 Stunden angezogen
bis zu einem Niveau der OD 600 nm von 0,6 bis 1,0. Zu dem Kulturmedium
wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mM IPTG zugegeben, und
die Kultur wurde für
weitere 2 Stunden bei 30°C
angezogen. Die Kulturen wurden durch Zentrifugation bei 4°C bei 10.000x
g geerntet und das Zellpellet gesammelt. Nicht mit Lipid versehenes
PspA wurde aus dem Zellpellet zurückgewonnen.
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Das Zellpellet wurde mit 30 g feuchter
Zellmasse pro Liter PBS in PBS resuspendiert. Die Zellsuspension
wurde eingefroren und bei –20°C gelagert.
Die Zellen wurden bei Raumtemperatur aufgetaut, um die Lyse zu bewirken.
DNase I wurde zu dem aufgetauten Material in einer Endkon zentration
von 1 μg/ml
zugegeben, und das Gemisch wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur
inkubiert, was zu einer Abnahme der Viskosität des Materials führte. Das
Gemisch wurde bei 4°C
bei 10.000x g zentrifugiert, und der Zellüberstand, welcher nicht mit
Lipid versehenes PspA enthielt, wurde aufbewahrt. Das Pellet wurde
mit PBS gewaschen, bei 4°C bei
10.000x g zentrifugiert und der Zellüberstand mit dem vorherigen
Zellüberstand
vereinigt.
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Eine MonoQ-Säule (Pharmacia) wurde in einem
Volumen von 1 ml pro 2 ml Zellüberstand
erstellt. Die Säule
wurde mit dem 2-fachen Säulenvolumen
eines Puffers gewaschen, der 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 1 M NaCl enthielt
und einen pH-Wert von 7,5 hatte, und dann mit dem 5- bis 10-fachen Säulenvolumen
eines Puffers, der 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 10 mM NaCl enthielt und
einen pH-Wert von 7,5 hatte, äquilibriert.
Die vereinigten Zellüberstände wurden
auf die Q-Sepharose-Säule aufgetragen,
und der Durchfluß wurde
gesammelt. Die Säule
wurde mit dem 2- bis 5-fachen Säulenvolumen
an 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 10 mM NaCl mit einem pH-Wert von 7,5 gewaschen,
und der Durchfluß wurde
mit dem vorherigen Durchfluß vereinigt.
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Die Eluierung von gebundenen Proteinen
begann mit dem ersten Schritt des Waschens mit dem 5- bis 10-fachen
Säulenvolumen
an 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 100 mM NaCl mit einem pH-Wert von 7,5.
Der zweite Eluierungsschritt war ein Waschen mit dem 5- bis 10-fachen
Säulenvolumen
mit 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 200 mM NaCl, mit einem pH-Wert von 7,5.
Das nicht mit Lipid versehene PspA war in dieser Fraktion enthalten. Die
verbleibenden, gebundenen, kontaminierenden Proteine wurden mit
50 mM Tris und 2 mM EDTA mit einem pH-Wert von 7,5, mit 300 mM-1
M NaCl entfernt.
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Ein Schema des in diesem Beispiel
beschriebenen Aufreinigungsprozesses ist in 12 der
Anmeldung mit der Serien-Nr. 08/475,781, eingereicht am 7. Juni
1995, dargestellt.
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BEISPIEL 5
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Immunogenität von rekombinantem,
mit Lipid versehenem PspA
-
Aufgereinigtes, rekombinantes, wie
in Beispiel 3 beschrieben zubereitetes, mit Lipid versehenes PspA wurde
auf Immunogenität
in Mäusen
getestet und mit der von wie in Beispiel 4 beschrieben zubereitetem,
nicht mit Lipid versehenem PspA verglichen. Für diese Untersuchung wurden
CBA/N-Mäuse
auf der Hinterseite des Halses mit 0,5 ml der folgenden Formulierungen
mit den angegebenen PspA-Antigen-Konzentrationen subkutan immunisiert.
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Für
jede Dosierung der Formulierungen wurden vier Mäuse an den Tagen 0 und 21 immunisiert.
Den Mäusen
wurde dann an Tag 35 Blut abgenommen, und sie wurden anschließend mit
S. pneumoniae eines A66-Stamms herausgefordert. Die Tage des Überlebens
nach der Herausforderung wurden für die Mäuse aufgezeichnet, und den überlebenden
Mäusen
wurde an den Tagen 36, 37, 42 und 46 Blut abgenommen. Von diesen
folgenden Blutproben wurde das Blut auf die Anzahl von koloniebildenden
Einheiten (CFU) von S. pneumoniae/ml untersucht. Die am Tag 35 genommenen
Seren wurden unter Verwendung von ELISA mit ELISA auf Antikörper gegen
PspA untersucht. In der folgenden Tabelle sind die Tage bis zum
Tod der herausgeforderten Mäuse
dargestellt.
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Die Anzahl an CFU im Blut der Mäuse ist
in der untenstehenden Tabelle dargestellt.
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Diese Ergebnisse zeigen an, daß das rekombinante
Protein nicht protektiv war, wenn es alleine injiziert wurde. Das
rekombinante Antigen war, unterstützt mit Alaun und/oder durch
das Versehen mit dem Lipid PAM3cys, immunogen
und protektiv. Das native PspA-Antigen der vollen Länge brauchte
keinen Hilfsstoff, um protektiv zu sein. Die CFU-Ergebnisse zeigen
an, daß durch
die Immunisierung geschützte
Mäuse die
herausfordernden S. pneumoniae in zwei Tagen aus dem Blut entfernten.
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Die ELISA-Untersuchung der Seren,
die am Tag 35 entnommen wurden, zeigte an, daß es eine gute Korrelation
zwischen dem Schutz der Mäuse
vor der S.-pneumoniae-Herausforderung und der Induzierung von meßbaren Antikörperantworten
gab. In den Seren der Mäuse,
die mit nicht mit Lipid versehenem Antigen immunisiert wurden (pPA-321-NL),
bei Salzlösung
oder auf die Negativkontrollen, die kein PspA-Antigen enthielten,
wurden keine nachweisbaren Antikörperantworten
beobachtet (wie in der untenstehenden Tabelle dargestellt). Gute
Antikörperantworten
wurden auf das native RX1-PspA-Antigen nachgewiesen und auf das
rekombinante PspA, wenn es mit dem Lipid PAM3cys
versehen und/oder an Alaun adsorbiert war.
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Um zu ermitteln, ob der Schutz zumindest
zum Teil durch die Anti-PspA-Antikörperantworten vermittelt wurde,
wurde ein passiver Versuch durchgeführt. BALB/c-Mäuse wurden
mit 0,5 μg
eines rekombinanten, mit Lipid versehenen PspA alleine oder adsorbiert
an Alaun, oder mit rekombinantem, nicht mit einem Lipid versehenem
PspA, das an Alaun adsorbiert war, an den Tagen 0 und 21 immunisiert,
und am Tag 35 wurde ihnen Blut abgenommen. Die Antiseren wurden
1 : 3 oder 1 : 15 in Salzlösung
verdünnt,
und 0,1 ml der Verdünnung wurden
je Verdünnung
in zwei Mäuse
i. p. injiziert. Eine 1/3-Verdünnung
von normalem BALB/c-Mausserum wurde als eine Negativkontrolle verwendet.
Anschließend
wurden die Tiere eine Stunde nach der passiven Immunisierung i.
v. mit dem WU2-Stamm von S. pneumoniae (15.000 CFU) herausgefordert.
Die passiv mit Anti-PspA-Seren immunisierten Mäuse wurden im Vergleich zu
den Mäusen,
die Verdünnungen
von normalen Mausseren erhielten, geschützt, wie in der folgenden Tabelle
dargestellt.
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Passiver
Schutz von BALBic auf WU2
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BEISPIEL 6
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PspA/Grippe-Kombinationsimpfstoff
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Wie in Beispiel 3 beschrieben hergestelltes,
aufgereinigtes, rekombinantes, mit Lipid versehenes PspA und wie
in Beispiel 4 beschrieben zubereitetes, nicht mit Lipid versehenes
PspA wurden mit gespaltenem Grippe-Antigen aus dem A/Texas-Stamm
kombiniert.
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Diese Kombinationen und das Grippe-Antigen
alleine wurden entweder in Salzlösung
formuliert oder an Alaun in Salzlösung adsorbiert. Der Alaun
wurde, wenn er zugegeben wurde, konstant bei 100 μg/Injektion gehalten,
und das PspA wurde konstant bei 0,5 μg/Injektion gehalten. Das Grippe-Antigen
wurde auf Konzentrationen von 0,5, 0,1, 0,02 und 0,004 μg/Injektion
verdünnt.
Für jede
der Formulierungen wurden vier BALB/c-Mäuse an den Tagen 0 und 21 immunisiert
und ihnen wurde dann am Tag 35 Blut abgenommen. Die Seren der immunisierten
Mäuse wurden
dann auf ihre Fähigkeit,
die Agglutination von roten Blutkörperchen von Hühnern durch
das A/Texas-HA-Antigen zu hemmen, untersucht. Die resultierenden
Titer der Hämagglutinationshemmung
(HAI) sind in der folgenden Tabelle dargestellt.
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HAI-Titer
von Kombinationen von rekombinantem PspA und Grippe
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BEISPIEL 7
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Expression und Aufreinigung
von nicht mit Lipid versehenem OspC
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E.-coli-JM-109-Transformanten, die
einen Plasmidvektor enthielten, der chromosomale Genfragmente enthielt,
die nicht mit Lipid versehenes OspC codierten, wurden wie in der
WO 91/09870 beschrieben zubereitet und angezogen. Die Kulturen wurden
geerntet, das Kulturmedium bei 10.000x g für 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert,
der Überstand
verworfen und das Pellet gesammelt.
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Das Zellpellet wurde zunächst in
dem Lyse-Puffer A, nämlich
50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM EDTA, 0,1 mM DTT, 5% Glycerol und 0,4
mg/ml Lysozym, resuspendiert, und die Suspension wurde für 20 Minuten bei
Raumtemperatur gerührt.
Dann wurde zu der Zellsuspension TRITONTM X-100
bis zu einer Konzentration von 1 Gew.-% zugegeben, DNase I wurde
bis zu einer Konzentration von 1 μg/ml
zugegeben und die Suspension bei Raumtemperatur für weitere
20 Minuten gerührt,
um die Zelllyse zu bewirken. Als nächstes wurde zu der Zellsuspension
Natriumchlorid in einer Konzentrati on von 1 M zugegeben und die
Suspension wieder für weitere
20 Minuten bei 4°C
gerührt.
Die Suspension wurde dann bei 20.000x g für 30 Minuten zentrifugiert,
der resultierende Überstand
vom Pellet abgetrennt, und das Pellet wurde verworfen.
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Der abgetrennte Überstand wurde gegen einen
Puffer, der 50 mM Tris, pH 8, 2 mM EDTA enthielt, dialysiert. Als
nächstes
wurde der Überstand
auf eine DEAE-Sepharose-CL-6B-Säule
aufgetragen, und das nicht mit Lipid versehene OspC wurde in dem
Säulendurchfluß gesammelt.
Der Durchfluß wurde
gegen einen 0,1 M Phosphatpuffer, pH 6,0, dialysiert.
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Der dialysierte Durchfluß wurde
als nächstes
an eine S-Sepharose-Schnellflußsäule, die
mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH 6,0, äquilibriert war, gebunden.
Das aufgereinigte, nicht mit Lipid versehene OspC wurde dann von
der S-Sepharose-Säule
unter Verwendung des Dialysepuffers mit zugesetztem 0,15 M NaCl
eluiert.
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Die wäßrige Lösung des hochgradig gereinigten,
nicht mit Lipid versehenen OspC wurde mit Coomassie-gefärbten Gelen
untersucht. Die Reinheit des Produkts wurde größer als 80% eingestuft.
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BEISPIEL 8
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Potenzierung der Antwort
auf nicht mit Lipid versehenes OspC mit mit Lipid versehenem OspA
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Aufgereinigtes, rekombinantes, nicht
mit Lipid versehenes OspC, zubereitet wie in Beispiel 7 beschrieben,
wurde in Kombination mit oder ohne aufgereinigtem, mit Lipid versehenem
OspA (zubereitet wie in der WO 92/14488 beschrieben) auf Immunogenität in Mäusen untersucht.
Die Formulierungen wurden mit oder ohne Alaun als einem Hilfsstoff
verabreicht. Die in diesem Versuch getestete Antigendosis betrug
1 μg/Dosis. Für diese
Studie wurden 4 bis 8 Wochen alte weibliche C3H/He-Mäuse am Tag
0 immunisiert und an den Tagen 21 und 42 zusätzlich behandelt.
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Drei repräsentativen Tieren wurde an
den Tagen 21, 42, 63 und 91 Blut abgenommen. Mit diesen Seren wurde
unter Verwendung von aufgereinigtem, mit Lipid versehenem OspC als
dem beschichtenden Antigen die ELISA-Untersuchung durchgeführt.
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Die einzigen nachweisbaren OspC-ELISA-Antworten,
die in dieser Studie ausgebildet wurden, gab es mit der Formulierung
von OspC auf Alaun. Trotz allem war die OspC-ELISA-Antwort, wenn
mit Lipid versehenes OspA auf Alaun enthalten war, 20-mal höher am Tag
63 (wie in 1 dargestellt)
und 5-mal höher
am Tag 91 (wie in 2 dargestellt).
Wenn mit Lipid versehenes OspA in der Formulierung ohne Alaun enthalten
war, gab es keine offensichtliche Wirkung auf die Immunantwort.
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BEISPIEL 9
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Speicheldrüsen-ELISPOT-Untersuchung
der Antworten auf Urease mit OspA
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Über
den mucosalen Weg wurden Mäuse
(CH3/HeN, 4-5/Gruppe) mit den in der untenstehenden Tabelle angegebenen
Antigenen an den Tagen 0 und 28 immunisiert. Die Proteine wurden
in einer Endkonzentration von 25 μl
für intranasal
und 0,5 ml für
intragastrisch in PBS verdünnt.
15-17 Tage nach
der zweiten Immunisierung wurden die Mäuse für ELISPOTs getötet.
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Das ELISPOT-Protokoll wurde von dem
von Mega et al., J. Immunol. (1992), 148: 2030–2039 beschriebenen Protokoll
abgeleitet. Die Speicheldrüsen
wurden direkt nach dem Töten
der Mäuse
entnommen und sofort in ein großes
Volumen an RPMI-1640-Medium (Gibco) gegeben. Die Organe wurden unter
Verwendung eines automatischen Gewebeschneiders (Mc Illwain Gewebeschneider,
The Mickle Laboratory Engineering, Gilford, UK) in kleine Stücke (1 × 1 mm)
geschnitten und dann in 2 ml RPMI-1640-Medium, das 5% FCS und 1
mg/ml an Kollagenase des Typs IV (Sigma) enthielt, für 30 Minuten
bei 37°C
unter leichtem Schütteln verdaut.
Die verdauten Zellen und Fragmente wurden durch einen 70 μm-Filter
(Falcon) gegeben und die Verdauung wurde drei weitere Male wiederholt.
Die verdauten Zellen wurden vereinigt und zweimal in einem großen Volumen
des Mediums gewaschen. Die vereinigten Zellen wurden dann unter
Verwendung von Geys Lösung
für 4 Minuten
auf Eis lysiert. Nach zwei weiteren Waschschritten wurden die Zellen
in 2 ml Medium (+5% FCS) resuspendiert, gezählt und zu aliquoten Anteilen
in 96-Well-Nitrozelluloseplatten (MILLIPORE) gegeben. Die Platten
waren über
Nacht mit 20 μg/ml
an Jackbohnen-Urease (Boehringer Mannheim) oder 10 μg/ml OspA
(Connaught) in PBS bei 4°C
beschichtet und dann mit vollständigem
Medium für
1 Stunde bei 37°C
abgesättigt
worden. Zwei fünffache
Verdünnungen
der Zellen wurden für
jede Verdünnung
und jeden Isotyp in vierfacher Ausführung in die Wells gegeben
(100 μl/Well).
Nach 4-16 Stunden
bei 37°C
unter 5% CO2 wurden die Zellen 2 × 5 Minuten
in PBS/Tween 20 (0,005%) lysiert, und biotinylierte Anti-Isotypen-Antikörper (Amersham)
wurden für
2 Stunden bei Raumtemperatur zugegeben (Verdünnung 1/1000). Nach drei Waschschritten
mit PBS-Tween wurde der biotinylierte Streptavidin-Peroxidase-Komplex
(Amersham) für
1 Stunde zugegeben (Verdünnung
1/500) und dann die Flecken mit 3,9-Aminoethylcarbazol (SIGMA) dargestellt.
Sobald die Platten getrocknet waren, wurden die Flecken unter einem
Präpariermikroskop
numeriert (Vergrößerung 16
oder 40X). Die Werte repräsentieren
das Mittel von 4 Wells, die für
jede Tiergruppe Bemittelt wurden.
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Wie in der untenstehenden Tabelle
dargestellt, wurde beobachtet, daß mit Lipid versehenes OspA-Lipoprotein
ohne jedweden Zusatz von Hilfsstoff über den mucosalen Weg verabreicht
sehr stark lokale IgG- und IgA-Antworten induzierte, während nicht
mit Lipid versehenes OspA überhaupt
keine nachweisbaren Antworten induzierte. Es wurde ebenso beobachtet,
daß OspA
eine starke Hilfsstoffwirkung auf die lokale Antwort auf Urease
hat.
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BEISPIEL 10
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ELISA-Assay
zur Messung der Serumantikörper
gegen OspA und Urease
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Mäuse
(CH3/HeN, 4-5/Gruppe) wurden über
den mucosalen Weg mit den in der Tabelle von Beispiel 9 angezeigten
Antigenen an den Tagen 0 und 28 immunisiert. Die Proteine wurden
in einem Endvolumen von 25 μl
für intranasal
und 0,5 ml für
intragastrisch in PBS verdünnt.
Neun Tage nach der zweiten Immunisierung wurde Blut entnommen.
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Für
den ELISA-Assay wurden 96-Well-Mikrotiterplatten mit flachem Boden
(Dynatech) mit 100 μl/Well an
1 μg/ml
OspA (Connaught) oder mit 2 μg/ml
Jackbohnen-Urease (Boehringer Mannheim), verdünnt in 0,1M Natriumcarbonatpuffer,
pH 9,6, beschichtet. Die Platten wurden über Nacht bei Raumtemperatur
beschichtet.
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Am nächsten Tag wurden die Platten
4x mit PBS/0,05% Tween 20 gewaschen und mit PBS mit 1% BSA für 30 Minuten
bei Raumtemperatur blockiert. Nach einem weiteren Waschgang erhielt
jedes Well 100 μl an
PBS mit 0,05% Tween 20 und 0,1% BSA (PBS/T/B). Die Seren wurden
innerhalb jeder Gruppe von Mäusen vereinigt
und serienmäßig verdünnt, und
die Platten wurden für
3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen wurde 1
: 5000 in PBS/T/B verdünntes
2°-antikörperbiotinyliertes
Ziege-Anti-Maus-IgG oder -IgA (Amersham) zugegeben, und die Platten
wurden für
2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden wieder
gewaschen und mit 1 : 2000 in PBS/T/B verdünnter Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase (Amersham)
für 1,5
Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einem abschließenden Waschgang
wurde das Substrat OPD (Sigma) zugegeben, und die Platten wurden
10–20
Minuten inkubiert. Schließlich
wurde die Reaktion mit 50 μl
2 N H2SO4 abgestoppt,
und die Platten wurden bei 490/650 nm mit einem Molecular-Devices-Plattenlesegerät eingelesen.
Die in den 3, 4 und 5 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß mucosal verabreichtes,
mit Lipid versehenes OspA, aber nicht das nicht mit Lipid versehene
OspA, eine sehr starke Serum-IgG-Antwort induziert. Außerdem wies
mit Lipid versehenes OspA eine starke Hilfsstoffwirkung auf die
Serum-IgG-Antwort auf Urease auf.
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Durch die ausführliche Beschreibung bestimmter
bevorzugter Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung soll verdeutlicht werden, daß die durch
die anhängenden
Ansprüche
definierte Erfindung nicht durch spezielle, in der obigen Beschreibung
dargestellte Details beschränkt
sein soll, da viele offensichtliche Variationen davon möglich sind,
ohne hiervon abzuweichen.