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Die
Erfindung betrifft einen kombinierten Impfstoff zur Behandlung bakterieller
Meningitis. Insbesondere schützt
der kombinierte Impfstoff effektiv gegen Infektionen durch Haemophilus
influenzae Typ B (Hib) und Neisseria meningitis (Meningokokke) Serogruppen
B und C (MenB, MenC).
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Die
durch Infektionen mit Hib, MenB und/oder MenC verursachte, bakterielle
Meningitis stellt ein weltweites Problem dar. Die Infektion durch
diese Organismen kann zur dauerhaften Invalidität und Tod bei jungen Kindern
führen.
Kürzlich
wurde jedoch ein konjugierter Hib-Impfstoff allgemein erhältlich (siehe
Force et al., Annals of Pharmacology 26 (1992), 1429-1440; Vella
et al., Pediatrics 85 (1990), 668-675) und führte zur effektiven Kontrolle
der Hib-Infektionen. Ähnliche
Impfstoffe werden bald für
MenC-Infektionen und auch für MenB-Infektionen
erhältlich
sein (siehe Costantino et al., Vaccine 10 (1992), 691-698). Nicht
konjugierte Impfstoffe gegen Hib und gegen MenC sind ebenfalls bekannt
(siehe Parke et al., J Infekt Dis 136 (1977), Suppl S51-S56).
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Die
Hib- und Meningokokkenimpfstoffe basieren auf Konjugate zwischen
Oligosaccharide, die von der bakteriellen Oberfläche abgeleitet sind und die
spezifische Epitope für
das in Frage kommende Bakterium definieren, die mit Trägerproteinen,
wie z. B. nicht toxische Mutanten des Diphtherietoxins, zum Beispiel CRM197,
konjugiert sind.
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Kombinationsimpfstoffe
gewinnen nun eine weitverbreitete Akzeptanz in Entwicklungsländern. Die
Begründung
hinter der Verwendung von Kombinationsimpfstoffen, die mehr als
ein Antigen umfassen und die effektiv sind, den Empfänger gegen
eine Anzahl von Krankheiten zu immunisieren, ist, dass die Verabreichungskosten
des Impfstoffes drastisch reduziert sein können, wenn sie mit einer größeren Anzahl
einzelner Impfstoffe verglichen werden. Weil die Verabreichungskosten
die Kosten des Impfstoffes um das Zigfache übersteigen können, sind
die Vorteile von Kombinationsimpfstoffen klar deutlich, wo Programme zur
Massenimpfung berücksichtigt
werden. Kombinationsimpfstoffe werden aktiv von der Weltgesundheitsbehörde (World
Health Organisation, WHO) gefördert
(siehe, zum Beispiiel CVI Forum, Nr. 5, November 1993, S. 212; „CVI Report
of the First Meeting of the Consultative Group", CVI-Bericht des ersten Treffens der
Beratergruppe, Genf, 16.-17. Dezember 1991, S. 29-32).
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Diese
Vorteile wurden vor einiger Zeit erkannt, aber nur drei dieser Kombinationsimpfstoffe
sind zur Zeit weitläufig
erhältlich.
Der erste, der in den 50er Jahren eingeführt wurde, war DTP, ein abgetöteter Impfstoff gegen
Diphtherie, Tetanus und Keuchhusten. Die Neubildung dieses Dreifachimpfstoff
zeigte keine größeren Probleme,
weil die Komponenten der Kombination gegenseitig kompatibel sind
und das Konservierungsmittel (Merthiolat) und das Adjuvans (Alum),
die in jedem getrennten Impfstoff verwendet werden, identisch waren. Des
weiteren fand man heraus, dass die vollständige Zelle der Keuchhusten-Komponente
die Immunantwort auf die Diphtherie- und Tetanustoxoide verstärkt.
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In
den 60er Jahren wurde ein oraler Polio-Lebendimpfstoff (oral polio
vaccine, OPV) entwickelt, der Polioviren von Typ 1, 2 und 3 enthielt.
Ein Problem, das bei der Neubildung von OPV auftrat, war das Vorhandensein
von Störungen
zwischen den Impfstoffkomponenten, ein Problem, das bei DTP nicht
aufgetreten war. Das Problem wurde durch die Optimierung der Konzentration
der einzelnen Komponenten minimiert.
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Vor
kurzem wurde in den meisten Entwicklungsländern ein dritter Kombinationsimpfstoff,
ein Masern-, Mumps- und Röteln-Lebendimpfstoff,
eingeführt.
Wieder musste die Konzentration jeder einzelnen Komponente eingestellt
werden, um das Phänomen
der Störung
zwischen den im Impfstoff eingeschlossenen Komponenten zu minimieren.
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Zur
Zeit gibt es einen Trend zur Entwicklung eines auf DTP-Impfstoff
basierenden Superimpfstoffes, der eine größere Anzahl von Antigenen umfasst.
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Es
gibt jedoch Nachteile in der Formulierung des auf DTP basierenden
Superimpfstoffes. Neuere Beweise zeigten, dass die Verabreichung
des Hib-Konjugatimpfstoffes
zusammen mit DTP die Effektivität
des Hib-Konjugates im Vergleich mit der getrennten Verabreichung
von DTP- und Hib-Impfstoff (siehe Abstrakt 300 von der 33. ICAAC)
reduziert. Gegensätzliche
Daten existieren über
die Rolle der Immunität
des Trägerproteins
bei der Einflussnahme auf die Antikörperantwort auf die Hapten-
oder die Oligosaccharid-Komponente eines konjugierten Impfstoffes.
Ein solcher Einfluss ist kritisch für die Formulierung von Hib-MenB/C-Impfstoffen, weil
die verwendeten Trägerproteine
unveränderlich ähnlich oder
identisch zu den Antigenen sind, die im DTP-Impfstoff eingeschlossen
sind, welcher Kleinkindern in einem frühen Alter verabreicht wird.
Nach einigen Studien ist die Antwort auf das Konjugat durch das
frühere
Aussetzen gegenüber
dem Träger
erhöht,
während sie
nach anderen Studien unterdrückt
ist. (Barington T et al., Infection and Immunity 62 (1994), 9-14;
Schneerson R et al., J Exp Med 152 (1980), 361-376; Barington T
et al., Infect Immun 61 (1993), 432-438; Peeters CCAM et al., Infect
Immun 59, 3504-3510).
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Es
wurde jetzt nachgewiesen, dass das frühere Aussetzen gegenüber dem
Trägerprotein
die Antwort auf den Hib-Konjugatimpfstoff deutlich erhöht.
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Dementsprechend
ist das Ziel der vorliegenden Erfindung, einen kombinierten Hib- und Meningokokken-Impfstoff
bereitzustellen, der bei der Prophylaxe von bakterieller Meningitis
verwendet werden kann und der eine wirtschaftliche, sichere und
ratsame Impfung gegen die vorherrschenden Ursachen der Meningitis
erlaubt.
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Die
Erfindung stellt daher einen Meningitis-Impfstoff bereit, der konjugierte
Hib- und MenC-Oligosaccharide umfasst.
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Es
wurde herausgefunden, dass der Kombinationsimpfstoff der Erfindung
effektiv bei der Verhütung einer
Infektion durch Haemophilus influenzae und Neisseria meningitidis
Serogruppe C ist, wobei Antikörper gegen
die verabreichten konjugierten Kapsel-Oligosaccharide nach der ersten
Dosis gebildet wurden. Des weiteren wurde gezeigt, dass der Kombinationsimpfstoff
frei von Störungen
zwischen den verwendeten Antigenen war.
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Vorteilhafterweise
kann eine Trägersensibilisierung
ausgenutzt werden, um die Antwort auf den Impfstoff zu maximieren.
Die Trägersensibilisierung
kann durch die Verabreichung eines DTP-Impfstoffes durchgeführt werden.
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Die
MenC-Komponente kann in drei verschieden bevorzugten Konfigurationen
formuliert werden: in einer gepufferten, flüssigen Form; lyophilisiert
mit einem geeigneten Excipienten; und als ein zum Gebrauch fertiges
Produkt mit einem passenden Adjuvans. Der Hib-Impfstoff ist nach
der Lyophilisierung mit einem geeigneten Excipienten und in einer
gepufferten, flüssigen
Form stabil. Zusätzlich
können
die beiden Impfstoffe, MenC und Hib, zusammen mit einem geeigneten
Excipienten lyophilisiert und anschließend vor der Verwendung mit
einem passenden Adjuvans resuspendiert werden. Alle Kombinationen
der stabilen Formulierungen können
vor der Verwendung gemischt werden.
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Der
Impfstoff der Erfindung kann weiterhin ein konjugiertes Kapsel-Oligosaccharid
umfassen, das von Neisseria meningitidis Serotyp B abgeleitet ist.
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Das
Trägerprotein,
mit dem die Oligosaccharid-Komponente des Impfstoffes der Erfindung
konjugiert ist, kann jedes Protein sein, dass auf dem Fachgebiet
für diesen
Zweck bekannt ist. Zum Beispiel kann es Tetanustoxoid, Diphtherietoxoid
oder ein Protein der äußeren Membran
von Neisseria meningitidis oder eine Mutante oder eine Variante
dergleichen sein.
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Die
Oligosaccharide sind vorzugsweise der Größe nach ausgewählt und
haben vorteilhafterweise einen Polymerisationsgrad von 4 oder mehr.
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Die
Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Prophylaxe oder Behandlung
von Meningitis bereit, welche die Verabreichung einer pharmazeutisch
effektiven Menge eines Kombinationsimpfstoffes gemäß der Erfindung
an eine Person umfasst. Das bevorzugte Verabreichungsschema ist
eine intramuskuläre
Verabreichung im Alter von 2, 4 und 6 Monaten.
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In
einem weiteren Aspekt der Erfindung ist ein Kombinationsimpfstoff
gemäß der Erfindung
zur Verwendung in der Medizin bereit gestellt.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
die jeweiligen durchschnittlichen, geometrischen Mittel der Antikörperkonzentrationen ± 2 SE
(95% Konfidenzinterval) in Seren, die unmittelbar vor und 1 Monat
nach der Auffrischungsinjektionen von sensibilisierten und nicht
sensibilisierten Patienten erhalten wurden; Antikörperantwort
auf PRP-Impfung im Alter von 12 Monaten im Verhältnis zu früheren Konjugatimpfungen und
DT-Sensibilisierung;
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2 zeigt
das analytische Profil von H. influenzae Typ B-Oligosaccharide nach
Säurehydrolyse;
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3 zeigt
das Rohbild eines FACE-Oligosaccharid-Glyko-Scans von Oligosaccharid-Herstellungen vor
und nach der Größenauftrennung;
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4 zeigt
ein analytisches chromatographisches Profil von Oligomeren mit niedrigem
Molekulargewicht nach der Größentrennung,
die von den Polysacchariden von H. influenzae Typ B abgeleitet wurden;
die drei Hauptarten sind in der in Tabelle 4 gezeigten massenspektrographischen
Analyse gekennzeichnet.
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5 zeigt
das analytische chromatographische Profil von Oligomeren mit höherem Molekulargewicht nach
der Größentrennung,
die von den Polysacchariden von H. influenzae Typ B abgeleitet wurden;
und
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6 zeigt
die Reaktivität
von MenC-Oligosacchariden mit verschiedener Längen im Serum; kompetitiver
ELISA, Pool menschlicher Seren von Erwachsenen, die mit einem Men
A + C-Polysaccharid-Impfstoff geimpft wurden, wobei eine Hemmung
mit Men C-Oligosacchariden mit verschiedener Kettenlänge erfolgte.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Hib-
und MenC-Konjugate können
gemäß der etablierten
Konjugationstechnologie unter Verwendung von Oligosacchariden und
Trägerproteinen,
die auf dem Fachgebiet bekannt sind, hergestellt werden. Vorzugsweise
werden die Konjugate jedoch entsprechend einem Verfahren hergestellt,
welches das Aufteilen der Oligosaccharide nach Größe einschließt, um kurzkettige
Oligomere auszuschließen.
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Im
Fall des Hib-Impfstoffes wurde gezeigt, dass kurzkettige Oilgomere
nur wenig immunogen sind (Peeters et al., J Infect Immun 60, 1826-1833).
Des weiteren haben wir jetzt gezeigt, dass gleichermaßen MenC-Oligomere
mit einem niedrigen Molekulargewicht nur wenig immunogen sind. Oligosaccharide,
die einen Polymerisationsgrad von weniger als 4 haben, sind ineffektiv
bei der Hemmung der Reaktion zwischen menschlichen Antikörpern und
natürlichen
Polysacchariden in einem ELISA-Test.
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Die
Impfstoffe gemäß der Erfindung
können
entweder prophylaktisch (zur Verhinderung einer Infektion) oder
therapeutisch (zur Behandlung der Erkrankung nach Infektion) sein.
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Diese
Impfstoffe umfassen ein Antigen oder Antigene, üblicherweise in Kombination
mit „pharmazeutisch
verträglichen
Trägern", die jeden Träger einschließen, der
nicht selber die Herstellung von Antikörpern induziert, die schädlich für das Individuum
ist, welches die Zusammensetzung erhält. Geeignete Träger sind typischerweise
große, langsam
metabolisierende Makromoleküle,
wie z. B. Proteine, Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglykolsäure, polymere
Aminosäuren,
Aminosäurekopolymere,
Lipidaggregate (wie z. B. Öltröpfchen oder
Liposome) und inaktive Viruspartikel. Solche Träger sind dem Fachmann gut bekannt.
Zusätzlich
können
diese Träger
als weitere immunstimulierende Wirkstoffe („Adjuvans") funktionieren. Des weiteren können die
Antigene mit dem bakteriellen Toxoid von Diphtherie-, Tetanus-,
Cholera-, H. pylori-, etc. Pathogenen konjugiert sein.
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Die
immunogenen Zusammensetzungen (z. B. das Antigen, der pharmazeutisch
verträgliche
Träger und
das Adjuvans) werden typischerweise Verdünnungsmittel, wie z. B. Wasser,
Kochsalzlösung,
Glycerin, Ethanol, etc., enthalten. Zusätzlich können Hilfsstoffe, wie z. B.
Benetzungs- oder Emulgierungsmittel, pH-Wert puffernde Stoffe und
dergleichen, in diesen Vehikeln vorhanden sein.
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Immunogene
Zusammensetzungen, die als Impfstoff verwendet werden, umfassen
eine immunologisch effektive Menge des Adjuvans und eines Antigens
sowie jede andere der vorstehend erwähnten Komponenten, so wie es
benötigt
wird. Mit „immunologisch
effektiver Menge" ist
gemeint, dass die Verabreichung dieser Menge an ein Individuum,
entweder als eine Einzeldosis oder als Teil einer Serie, effektiv
zur Therapie oder Vorbeugung ist. Diese Menge variiert in Abhängigkeit
von der Gesundheit und der physischen Kondition des Individuums,
das behandelt werden soll, der taxonomischen Gruppe des Individuums
(z. B. nichtmenschliche Primaten, Primaten, etc.), das behandelt
werden soll, die Kapazität
des Immunsystems des Individuums zur Antikörpersynthese, der Grad des
gewünschten
Schutzes, die Neubildung des Impfstoffes, die Beurteilung der medizinischen
Situation des behandelnden Arztes und anderer relevanter Faktoren.
Es wird erwartet, dass die Menge in einen relativ großen Bereich
fallen wird, der durch Routinestudien bestimmt werden kann. Der bevorzugte
Bereich liegt zwischen 2 und 10 μg
pro Dosis.
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Die
Dosisbehandlung kann ein Einzeldosisprotokoll sein, obwohl ein Protokoll
mit multiplen Dosen bevorzugt wird.
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BEISPIELE
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BEISPIEL 1
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BESTIMMUNG DES EFFEKTS DER
TRÄGERSENSIBILISIERUNG
MIT Hib-KONJUGAT-IMPFSTOFF
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Impfstoffe und Personen
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Die
klinische Studie wurde an Studienorten in St. Louis (N = 83) und
Minneapolis (N = 20) durchgeführt.
103 gesunde Kleinkinder wurden in einem Alter von etwa einen Monat
nach dem Zufallsprinzip aufgeteilt, um entweder eine einzelne Injektion
des Diphtherie- und Tetanustoxoid-Impfstoffes zu erhalten (DT-sensibilisierte
Gruppe), oder sie wurden nicht geimpft. Der DT-Impfstoff (Lot 1L21121,
Connaught Laboratories, Inc, Swiftwater, PA) wurde intramuskulär gegeben,
wobei eine Dosis von 0,5 ml verwendet wurde. Der Mittelwert ± SA des
Alters der 52 Kinder, denen DT gegeben wurde, betrug 1,1 ± 0,1 Monate
(Bereich: 0,8 bis 1,3 Monate). Im Alter von zwei Monaten wurden
die Kleinkinder in jeder Gruppe erneut nach dem Zufallsprinzip aufgeteilt, um
entweder drei Dosen von HbOC (Lot M695HK) oder drei Dosen PRP-T
(Lot S2440) zu erhalten, die intramuskulär im Alter von 2, 4 und 6 Monaten
verabreicht wurden. Die Dosis von HbOC betrug 10 μg des Saccharids
und 25 μg
des CRM-Proteins in 0,5 ml und die Dosis von PRP-T betrug 10 μg des Saccharids
und 20 μg des
Proteins, ebenfalls in 0,5 ml verabreicht. Getrennte Injektionen
des DTP-Impfstoffes (0,5 ml, intramuskulär, von Lot 2G31010, Connaught
Laboratories) wurden im anderen Bein zur gleichen Zeit wie jede
der Hib-Konjugat-Impfungen gegeben. Im Alter von 12 Monaten wurden
5 μg unkonjugierter
PRP-Impfstoff in 0,1 ml subkutan gegeben. Der PRP-Impfstoff wurde
von NIAID, NIH bereitgestellt und wurde zuvor beschrieben (Granoff et
al., J Inf Dis 168 (1993), 663-671). Serumproben wurden direkt vor
jeder Hib-Konjugat/DTP-Dosis erhalten, etwa 4 Wochen nach der dritten
Konjugat-Dosis, und direkt vor und 1 Monat nach der PRP-Impfung. 94 der 103
Kinder (91%) vollendeten das Konjugat-Impfprotokoll und sind die
Personen, die in der hier berichteten Analyse eingeschlossen sind.
Die neun übrigen
Kinder wurden aus folgenden Gründen
ausgeschlossen: Schwierigkeiten bei dem Erhalt der Blutproben (1);
das Wegziehen der Eltern aus der Stadt (1); die fehlende Bereitschaft
weiterhin teilzunehmen (2); nicht verfügbar für die Nachfolgeuntersuchung
(1); versehentliche Gabe des falschen Impfstoffes außerhalb
der Studie (2); Diagnose einer zugrunde liegenden Immunschwäche (1)
und ein fieberhafter Anfall nicht in Beziehung stehend mit der Impfung
(1). Die demographischen Kennzeichen der vier Behandlungsgruppen,
die in den Analysen verwendet wurden, sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
Die Gruppen waren ähnlich in
Bezug auf Geschlecht, Rasse und Alter bei der ersten Dosis der Konjugat-Impfung. Tabelle 1. Demographische Kennzeichen
der Personengruppen
Impfstoff+/DT-Sensibilisierung
mit 1 Monat | Anzahl
der Patienten* | %
männlich | %
weiß | Alter
(Monate) Mittelwert ± SD** |
HbOC |
sensibilisiert | 21 | 52 | 90 | 2,0 ± 0,20 |
nicht
sensibilisiert | 24 | 33 | 92 | 2,0 ± 0,16 |
PRP-T |
sensibilisiert | 25 | 64 | 96 | 2,1 ± 0,23 |
nicht
sensibilisiert | 24 | 63 | 92 | 2,1 ± 0,22 |
- + HbOC (Haemophilus influenzae b Oligosaccharid-CRM-Konjugat-Impfstoff);
PRP-T
(Haemophilus influenzae B Polysaccharid-Tetanustoxoid-Konjugat);
DT
(Diphtherie- und Tetanustoxoide)
- * Die gezeigten Daten sind von den 94 Kleinkindern, welche die
Konjugat-Impfung vollendet haben und zur Auswertung in Frage kamen
(siehe Methoden).
- ** Zur Zeit der ersten Dosis des Konjugat-Impfstoffes.
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Gegenreaktionen
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Eltern
wurden gebeten, einen kurzen Fragebogen zu vervollständigen,
der örtlich
begrenzte Reaktionen an den Injektionsorten, tägliche Temperaturen und andere
mögliche
systemische Reaktionen vermerkt, die während der 72 Stunden nach jeder
Dosis der DTP/Konjugatimpfung auftraten. Diese Beobachtungen wurden durch
Telefonbefragungen, die von den Studienkrankenschwestern durchgeführt wurden,
und einer Übersicht der
möglichen
Gegenreaktionen zur Zeit jedes geplanten Bürobesuchs ergänzt. Eine
aktive Überwachung
von Gegenreaktionen wurde nach der DT-Impfung im Alter von 1 Monat
nicht durchgeführt;
Informationen über mögliche ernste
Reaktionen auf diese Impfung wurden jedoch bei dem Besuch nach 2
Monaten vor dem Anfang der Konjugat/DTP-Impfung erhalten.
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Labor
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Kodierte
Replika-Gefäße mit gefrorenen
Seren wurden zur Washington-Universität in St. Louis zur Bestimmung
der Gesamtkonzentrationen der Anti-PRP-Antikörper und zu Connaught Laboratories,
Inc., Swiftwater, PA, zur Bestimmung der Konzentrationen von Antikörpern gegen
Diphtherie- und Tetanustoxoide gesendet.
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Alle
Untersuchungen wurden ohne Kenntnis des DT-Sensibilisierungsstatus
oder der Zuweisung des Konjugatimpfstoffes durchgeführt.
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Gesamtkonzentrationen
der Anti-PRP-Antikörper
wurden mittels einer Radioantigen-Bindungsuntersuchung (radioantigen binding
assay, RABA) (Granoff et al., J Inf Dis 154 (1986), 257-264) bestimmt.
Die Standardkurve für
RABA bestand aus Verdünnungen
des Hib-Referenzserumpools, der vom Center for Biologic Evalualtion
and Research (CBER), U.S. Food and Drug Administration, Bethesda,
MD, erhalten wurde. Die Gesamtkonzentration der Anti-PRP-Antikörper dieses
Pools wurden auf 80 μg/ml
geschätzt.
Einzelne Untersuchungen schlossen Kontrollserumpools ein, die repräsentativ
für einen
großen
Bereich von Antikörperkonzentrationen
waren (Granoff et al., J Pediatr 121 (1992), 187-194; Holmes et
al. J Pediatr 118 (1991), 364-371).
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Konzentrationen
von Anti-Tetanustoxoid- und Anti-Diphtherietoxoid-Antikörper wurden
in Serumproben von etwa 90% der Proben der Personen bestimmt, die
basierend auf die Vollständigkeit
des PRP-Auffrischungsprotokoll vor April 1993 und dem Vorhandensein
ausreichender Mengen von Serum für
die Untersuchungen ausgewählt
wurden.
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Die
Antikörpertiter
gegen Anti-Tetanustoxoid wurden durch ELISA bestimmt. Kurz zusammengefasst, die
Mikrotiterplatten wurden über
Nacht bei Raumtemperatur mit gereinigtem Tetanustoxoid im Carbonatpuffer, pH-Wert
9,6, inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und 50 μl Proben
von seriellen zweifach Verdünnungen der
Testseren und der Kontrollseren wurden auf die beschichteten Platten
transferiert. Nach einer Inkubation von 3 Stunden bei Raumtemperatur
wurden die Platten gewaschen und gebundene Antikörper wurden unter Verwendung
von alkalischer Phosphatase konjugiertem Ziege-Anti-Mensch-IgG,
-IgA und -IgM (Kirkegaard und Perry Laboratory, Gaithersburg, MD)
detektiert. Die Konzentrationen der Anti-Tetanustoxoid-Antikörper wurden dem getesteten
Serum als Einheiten/ml durch Vergleich mit der Antigenbindungstitrationskurve
des Referenzserumpools zugewiesen, der bei Connaught Laboratory
aus Seren von erwachsenen Personen, die mit dem Tetanustoxoid geimpft
wurden, hergestellt wurde. Dieser Serumpool wurde willkürlich eine
Konzentration von 1 Einheit/ml des Antitoxins zugewiesen.
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Neutralisierende
Anti-Diphtherie-Antikörper
wurden durch einen mikrometabolischen Inhibitionstest (Miyamura
et al., J Biol Stand 2 (1974), 203-209; Keeftenberg et al., J Biol
Stand 13 (1985), 229-234) bestimmt. Kurz zusammengefasst, 50 μl von seriellen
Zweifach-Verdünnungen
von Testseren wurden in Vertiefungen einer Gewebekulturplatte mit
flachem Boden und 96 Vertiefungen (Katalognummer: 25861, Corning
Laboratory Sciences, Corning, NY) zugegeben. Diphtherietoxin (25 μl einer 4fach Überschusskonzentration
der minimalen cytopatischen Dosis) wurde zu allen Probenvertiefungen
zugegeben. VERO-Zellen (Niere der afrikanischen grünen Meerkatze)
wurden zugegeben (25 μl
von 150.000 Zellen/ml) und ein pH-Wert-Indikator wurde in das Zellkulturmedium
eingeschlossen. Die Zellen wurden bei 37°C für 7 Tage inkubiert; in dieser
Zeit zeigten stoffwechselaktive Zellen eine Verminderung des pH-Wertes
auf < 7,20 zeigten,
während
die Stoffwechselaktivität der
Diphtherie vergifteten Zellen gehemmt ist und eine Senkung des pH-Wertes
nicht erfolgt. Antikörpertiter wurden
bestimmt durch die höchste
Serumverdünnung,
die einen pH-Wert von < 7,2
nach einer Inkubation von sieben Tagen ergab. Die Konzentrationen
der Anti-Diphtherie-Antikörper
der Testseren wurden in Einheiten/ml durch Vergleich mit der Antitoxin-Aktivität von Verdünnungen
eines bekannten US-Standardserums
(Charge A52, von CBER, U.S. Food and Drug Administration, Bethesda,
MD, bereitgestellt) zugewiesen, wobei diese zu den Testproben parallel
untersucht wurden. Es muss berücksichtigt
werden, dass eine Einheit von Anti-Diphtherietoxin-Antikörper und
eine Einheit von Anti-Tetanustoxoid-Antikörper auf der Basis von Gewicht oder
Aktivität
nicht äquivalent
sind. Darum kann die Größe der jeweiligen
Antikörperkonzentrationen
nicht direkt miteinander verglichen werden.
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Statistische Analyse
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Frequenzdaten
wurden unter Verwendung des Chi-Quadrat-Tests oder des Fisher-Exact-Tests verglichen,
wenn sie durch erwartete kleine Frequenzen notwendig waren. Antikörperkonzentrationen
wurden logarithmisch umgewandelt und die geometrischen Mittelwerte
der Antikörperkonzentrationen
wurden durch die Varianzanalyse verglichen. Für diese Berechnungen wurden
Antikörperkonzentrationen
mit weniger als das Minimum, das in der Untersuchung detektiert
wurde, Werte von 50% des Minimums zugewiesen (z. B. bei Anti-PRP-Antikörperkonzentrationen < 0,07 μg/ml, Anti-Tetanus-Antikörperkonzentrationen < 0,01 Einheiten/ml und
Anti-Diphtherie-Antikörperkonzentrationen < 0,01 Einheiten/ml
wurden Werte von 0,035 μg/ml.
0,005 Einheiten/ml bzw. 0,005 Einheiten/ml zugewiesen). Antikörperantworten
auf Konjugat- und DT/DTP-Impfungen von Kleinkindern in Minneapolis
und St. Louis wurden vereinigt, da es keine statistisch signifikanten
Unterschiede in den Ergebnissen zwischen den beiden Studienorten
gab.
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Ergebnisse
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Gegenreaktionen
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Die
Impfschemata wurden gut vertragen. Bei keinem der Kleinkinder gab
es ernste Reaktionen, eingeschlossen hypotensive/hyporesponsive
Reaktionen, epileptische Anfälle,
andauernde Schreizwischenfälle, Temperaturen
von > 39,9°C. In den
vier Gruppen gab es Temperaturen von > 37,8°C
in 20% bis 33% der Kleinkinder nach Dosis 1 des DTP/Konjugats, 23%
bis 29% nach Dosis 2 und 21% bis 35% nach Dosis 3. Keiner der jeweiligen
Unterschiede zwischen Impfgruppen war signifikant (p > 0,10).
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Immunogenität
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Anti-PRP-Antikörperantworten
auf Konjugat-Impfung
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Tabelle
2 fasst die Effekte der Sensibilisierung mit DT-Impfstoff im Alter
von 1 Monat auf die Anti-PRP-Antikörperantworten auf den Hib-Konjugat-Impfstoff,
der im Alter von 2, 4 und 6 Monaten gegeben wurde, zusammen. Vor
der ersten Dosis des Konjugat-Impfstoffes gab es keine signifikanten
Unterschiede in den geometrischen Mittelwerten der PRP-Antikörperkonzentrationen
der vier Gruppen. Bei Kleinkindern, denen die PRP-T, DT-Impfung
im Alter von 1 Monat gegeben wurde, stieg der geometrischen Mittelwert
der Anti-PRP-Antikörperantworten
auf das 2- bis 3fache nach jeder der drei Dosen des Konjugat-Impfstoffes
im Vergleich mit den jeweiligen geometrischen Mittelwerten der Antikörperantworten
der PRP-T geimpften Kleinkinder, die nicht mit DT sensibilisiert
wurden. Bei Kleinkindern, denen HbOC gegeben wurde, gab es ebenfalls
eine 2- bis 3fache Steigerung der Anti-PRP-Antikörperantwort in der DT-sensibilisierten
Gruppe im Vergleich zur nicht sensibilisierten Gruppe, allerdings
nur nach der Konjugat-Dosis 1 und 2 (Tabelle 2).
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Bei
beiden Konjugat-Impfgruppen war der Anteil der Kleinkinder, die
auf die zweite Dosis des Konjugat-Impfstoffes mit > 1 μg/ml eines Anti-PRP-Antikörpers reagierten,
höher bei
DT-sensibilisierten Kleinkindern (HbOC: 38% gegen 4%, p < 0,01; PRP-T: 88%
gegen 67%, p = 0,10). Die entsprechenden Unterschiede waren nicht
signifikant unterschiedlich nach einer Dosis des Konjugat-Impfstoffes
(HbOC: 0% gegen 0%; PRP-T: 20% gegen 4%, p > 0,10); oder nach drei Dosen (HbOC: 86%
gegen 88%; PRP-T: 96% gegen 96%, p > 0,90).
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Gedächtnisantikörper-Reaktionen auf die PRP-Auffrischungsimpfung
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Nicht
konjugiertes PRP wurde im Alter von 12 Monaten 74 der 94 Kleinkinder
(79%) gegeben, welche die Konjugat-Impfung vollständig beendet
hatten. 1 fasst die jeweiligen geometrischen
Mittelwerte der Antikörperkonzentrationen ±2 SE ("standard error", Standardfehler)
(95% Konfidenzinterval) in Seren zusammen, die unmittelbar vor und
1 Monat nach der Auffrischungsinjektion erhalten wurden. Unter den
Kleinkindern, die mit PRP-T geimpft wurden, betrug der geometrische
Mittelwert der Anti-PRP-Antikörperkonzentration
der DT sensibilisierten Gruppe 2,6 μg/ml unmittelbar vor der PRP-Auffrischung
gegen 1,6 μg/ml
bei den entsprechenden Kleinkindern, die kein DT erhalten hatten
(p = 0,11). Ein Monat nach der PRP-Auffrischung betrug der geometrische
Mittelwert der Antikörperkonzentration
26,4 μg/ml
in der DT sensibilisierten Gruppe gegen 8,6 μg/ml bei Kleinkindern, die kein
DT erhalten hatten (p = 0,01). Bei Kleinkindern, denen HbOC gegeben
wurde, gab es keine signifikanten Unterschiede in den jeweiligen
geometrischen Mittelwerten der Anti-PRP-Antikörperkonzentrationen zwischen
DT sensibilisierten und nicht sensibilisierten Kleinkindern vor
der PRP-Auffrischung (1,2 gegen 1,1 μg/ml) oder 1 Monat nach PRP
(6,0 gegen 8,8 μg/ml,
p = 0,34).
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Anti-Diphtherie- und Anti-Tetanus-Antikörperantworten
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Mit
einer Ausnahme gab es keine signifikanten Unterschiede im Alter
von 2 Monaten in den jeweiligen geometrischen Mittelwerten der Anti-D-
oder Anti-T-Antikörperkonzentrationen
der Kleinkinder, die mit DT im Alter von 1 Monat geimpft wurden,
und denen, die nicht mit DT geimpft wurden (Tabelle 3 und 4). Die
Ausnahme war, dass Kleinkinder, die nach dem Zufallsprinzip aus
der DT-sensibilisierten
Gruppe ausgewählt
wurden, um PRP-T zu erhalten, einen 2fach höheren geometrischen Mittelwert
der Anti-T-Antikörperkonzentration
hatten als die entsprechende, nicht sensibilisierte Gruppe (0,06
gegen 0,03 Einheiten/ml, p < 0,02).
Dieses Ergebnis könnte
zufällig
entstanden sein, da der entgegengesetzte Trend in den entsprechenden
Gruppen beobachtet wurden, die nach dem Zufallsprinzip ausgewählt wurden,
um HbOC zu erhalten (0,05 gegen 0,07 Einheiten/ml, p > 0,10, Tabelle 3).
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DT-Sensibilisierung
mit 1 Monat verstärkte
die Anti-D-Antikörperantworten
auf nachfolgende Injektionen von DTP und Konjugat, die mit 2, 4
und 6 Monaten gegeben wurden. Nach der ersten Impfung mit DTP/Konjugat
hatten die sensibilisierten Kleinkinder einen 1,5- bis 2fach höheren geometrischen
Mittelwert der Anti-D- und Anti-T-Antikörperkonzentrationen als der
jeweilige Mittelwert der nicht sensibilisierten Kleinkinder (p < 0,60); nach der
zweiten Impfung waren die jeweiligen geometrischen Mittelwerte der
sensibilisierten Kleinkinder 3- bis 5fach höher als die der nicht sensibilisierten
Kleinkinder (p < 0,001).
Nach der dritten DTP/Konjugat-Impfung trat eine Interaktion zwischen
dem verwendeten, spezifischen Konjugat-Impfstoff und der jeweiligen
Anti-D- oder Anti-T-Antikörperantwort
auf. Die DT-sensibilisierten Kleinkinder, die mit PRP-T/DTP geimpft wurden,
hatten 2fach höhere
Anti-T-Antikörperkonzentrationen
als die nicht sensibilisierten Kleinkinder (p < 0,001), aber die jeweiligen Anti-D-Antworten
waren nicht signifikant unterschiedlich (p > 0,20). Im Gegensatz dazu hatten die sensibilisierten
Kleinkinder, die mit HbOC/DTP geimpft wurden, 2fach höhere Anti-D-Antikörperkonzentrationen
als die nicht sensibilisierten Kleinkinder (P < 0,01), aber die jeweiligen Anti-T-Antworten waren
nicht signifikant unterschiedlich (p > 0,24).
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BEISPIEL 2
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GRÖSSENAUSWAHL
DER IMMUNOGENEN OLIGOMERE
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Als
ein Beispiel wird die Auswahl der immunogenen Oligomere von Haemophilus
influenzae Typ B beschrieben. Nach der kontrollierten Säurehydrolyse
bei erhöhter
Temperatur umfassen die so erhaltenen Oligosaccharid-Herstellungen
Oligomere von unterschiedlicher Kettenlänge, von einzelnen bis relativ
langkettige Oligomere. 2 und 3 (Spur
B) stellen die Heterogenität
eines solchen Hydrolysats dar. In dem dargestellten Fall wurde berechnet,
dass etwa die Hälfte
der Oligomerarten, in einem molaren Verhältnis, eine Zuckerkette mit
weniger als 5 Zuckerresten hat. Wenn ein solches Hydrolysat mit
einem Trägerprotein
konjugiert wird, wie zum Beispiel CRM-197, dann würde es wahrscheinlich
ein Impfstoffprodukt herstellen, dass nur wenig immunogen ist.
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Um
die unerwünschten,
kurzkettigen Arten zu entfernen, haben wir ein chromatographisches
Verfahren entwickelt, dass ausgezeichnet die Trennung der langkettigen
Zucker-Oligomere von den kurzkettigen Arten erlaubt. Das entwickelte
Verfahren beruht auf die Verwendung einer spezifischen chromatographischen Matrix,
der Q-Sepharose-Fast-Flow, und definierten Konzentrationen von Salz-
und Wasserstoffionen. Die Konzentration der Ladesalzlösung zur
Entfernung der Arten mit einem niedrigen Molekulargewicht kann zwischen
0,05 M und 0,150 M betragen. Vorzugsweise wird Natriumchlorid verwendet.
Die Wasserstoffionenkonzentration sollte zwischen 10–5–10–8 M
betragen und Acetatsalze werden vorzugsweise verwendet. 4 und 3 (Spur
F) zeigen das Profil der Arten mit einem niedrigen Molekulargewicht,
die nur wenig immunogen sind.
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Die
Oligosaccharide, die zur Herstellung der Impfstoffherstellung verwendet
werden sollen, werden mit einer Salzkonzentration zwischen 0,25
M und 1,0 M eluiert, vorzugsweise mit Natriumchlorid. Das chromatographische
Profil dieser Arten mit einem höheren
Molekulargewicht, die zur Herstellung des Impfstoffes verwendet
werden, ist in 5 dargestellt. Um weiter zu
bestätigen,
dass unser chromatographisches Verfahren ein vollständig definiertes
Impfstoffprodukt bereitstellen kann, haben wir 3 verschiedene Herstellungen
analysiert und diese in 3, Spuren C, D und E, gezeigt.
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Unter
Verwendung einer massenspektroskopischen Analyse haben wir bewiesen,
dass unser Verfahren tatsächlich
die Arten mit einem geringeren Molekulargewicht entfernt und dass
diese die erwartete Kettenlänge
haben, wie in der massenspektrographische Analyse, die in Tabelle
5 beschrieben wird, gezeigt wird.
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Dieses
Fraktionierungsverfahren erlaubt die Fraktionierung und die spezifische
Auswahl von Oligosacchariden von 1 bis 60 mg/ml Matrixträger. Tabelle
5 Elektrospray-MS-Daten
Probe | ESI
MG | theoretisches
MG | Kennzeichen |
Peak
3 | 1122 | 1122
(Na eingeschlossen) | DP3 |
Peak
4 | 1490 | 1490
(Na eingeschlossen) | DP4 |
Peak
5 | 1858 | 1858
(Na eingeschlossen) | DP5 |
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Die
ausgewählten
Oligosaccharid-Arten können
mit dem Trägerprotein
CRM-197 unter Verwendung der nachstehend aufgelisteten Chemie konjugiert
werden (Costantino et al., Vaccine 10, 691-698).
- a)
Reduktive Animierung der ausgewählten
Oligosaccharide-Einbringen einer primären Aminogruppe an ihrem reduzierenden
Ende;
- b) Transformation der Amino-Oligosaccharide in einen aktiven
Ester durch die Reaktion mit N-Hydroxysuccinimid-Diester von Adipinsäure;
- c) Verknüpfung
der aktivierten Oligosaccharide mit CRM-197; und schließlich die
Reinigung des Konjugats zur Impfstoffherstellung
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Das
hier beschriebene Verfahren wurde erfolgreich bei Meningokokken
C-Oligosacchariden
eingesetzt und kann selbstverständlich
bei allen Zuckerpolymeren angewendet werden, die eine negativ geladene Einheit
enthalten, wie z. B. Meningokokken A und B und andere. 6 zeigt
die nur wenig immunogene Natur von Men C-Oligosacchariden, die einen
Polymerisationsgrad von weniger als 4 haben.