ES2639035T3

ES2639035T3 - Formulaciones estables de antígenos rLP2086 de Neisseria meningitidis

Info

Publication number: ES2639035T3
Application number: ES11757949.0T
Authority: ES
Inventors: Lakshmi Khandke; Rasappa Arumugham; Bounthon Loun
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 2010-08-23
Filing date: 2011-08-22
Publication date: 2017-10-25
Anticipated expiration: 2031-08-22
Also published as: SI2608805T1; AU2016201346A1; EP2608805A2; CN103189071A; CN107913396A; CN107961367A; JP5945538B2; AU2016201346B2; KR20160017129A; MX2013002175A; EP3246044B2; KR101594228B1; IL224626A; PT3246044T; HRP20210242T1; AU2011294776A1; EP3246044A1; PL3246044T3; HUS1700043I1; KR101817450B1

Abstract

Una composición inmunogénica que comprende un detergente, un polipéptido LP2086 (fHBP) de la subfamilia B, un polipéptido LP2086 (fHBP) de la subfamilia A y aluminio, en la que la proporción molar entre el detergente y la proteína está entre 0,5:1 y 10:1 y en la que la concentración de aluminio está entre 0,1 mg/ml y 1 mg/ml.

Description

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potencia, en comparación con un patrón de referencia, durante al menos 1 año, 2 años, 3 años, 4 años o 5 años. Los términos “estable” y “estabilidad” también se refieren a la capacidad de un antígeno para mantener epítopos o inmunorreactividad durante un periodo de tiempo. Por ejemplo, un antígeno en una formulación estable de la invención puede mantener al menos un 50 %, 0,60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 5 % o 100 % de sus epítopos o inmunorreactividad, en comparación con un patrón de referencia, durante al menos 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 9 meses, 12 meses, 18 meses, 24 meses, 30 meses, 36 meses, 42 meses, 48 meses, 54 meses o 60 meses. En algunas realizaciones, la estabilidad se mide con respecto a una condición ambiental. Ejemplos no limitantes de condiciones ambientales incluyen la luz, la temperatura, los ciclos de congelación/descongelación, la agitación y el pH. Un experto en la técnica podría determinar la presencia de epítopos antigénicos o inmunorreactividad usando los procedimientos divulgados en el presente documento u otros procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, McNeil y col. Vaccine, 27: 3417-3421 (2009). En algunas realizaciones, la estabilidad de un antígeno se mide desde la fecha de su formulación. En algunas realizaciones, la estabilidad de un antígeno se mide desde la fecha de un cambio en sus condiciones de almacenamiento. Ejemplos no limitantes de cambios en las condiciones de almacenamiento incluyen cambios de

15 congelado a refrigerado, cambios de congelado a temperatura ambiente, cambios de refrigerado a temperatura ambiente, cambios de refrigerado a congelado, cambios de temperatura ambiente a congelado, cambios de temperatura ambiente a refrigerado, cambios de luz a oscuridad o introducción de agitación.

El término “estabilizante” se refiere a un compuesto que se une a un antígeno y mantiene los epítopos o inmunorreactividad del antígeno durante un periodo de tiempo. Los estabilizantes se conocen en la técnica. Ejemplos de estabilizantes incluyen cationes multivalentes, por ejemplo de calcio o aluminio.

El término "sujeto" se refiere a un mamífero, ave, pez, reptil o cualquier otro animal. El término “sujeto” también incluye seres humanos. El término “sujeto” también incluye mascotas domésticas. Ejemplos no limitantes de mascotas domésticas incluyen: Perros, gatos, cerdos, conejos, ratas, ratones, jerbos, hámster, cobayas, hurones, aves, serpientes, lagartijas, peces, tortugas y ranas. El término “sujeto” también incluye animales de ganado.

25 Ejemplos no limitantes de animales de ganado incluyen: alpacas, bisontes, camellos, ganado vacuno, ciervos, cerdos, caballos, llamas, mulas, burros, ovejas, cabras, conejos, renos, yak, pollos, gansos y pavos.

Los términos "vacuna" o "composición de vacuna", que se usan de forma intercambiable, se refieren a composiciones farmacéuticas que comprenden al menos una composición inmunogénica que induce una respuesta inmunitaria en un sujeto.

Descripción general

La presente invención surge del nuevo descubrimiento de que los antígenos rLP2086 de la subfamilia B, pero no los antígenos rLP2086 de la subfamilia A, pierden potencia en el tiempo en una formulación de vacuna bivalente y, por tanto, son inestables. Variando los componentes de la formulación bivalente se determinó que proporciones molares altas entre detergente y proteína en la formulación de vacuna bivalente tenía como resultado inestabilidad específica

35 del antígeno rLP2086 de la subfamilia B. Reduciendo la proporción molar entre detergente y proteína en las formulaciones bivalentes y monovalentes se tuvo como resultado un incremento de la estabilidad, determinado por el mantenimiento de la potencia en el tiempo, del antígeno rLP2086 de la subfamilia B sin afectar a la estabilidad del antígeno rLP2086 de la subfamilia A. Este resultado es sorprendente porque las lipoproteínas normalmente se purifican y almacenan usando concentraciones de detergente altas para prevenir la agregación de sus restos lipídicos hidrófobos. En consecuencia, en algunas realizaciones, la invención proporciona una composición inmunogénica que comprende un antígeno rLP2086 de la subfamilia B y una proporción molar detergente-proteína baja. En algunas realizaciones, la invención proporciona un procedimiento de mantener la estabilidad de un antígeno rLP2086 de la subfamilia B en una composición inmunogénica que comprende la etapa de almacenar el antígeno rLP2086 de la subfamilia B en un tampón que comprende una proporción molar detergente-proteína baja.

45 En estudios adicionales se reveló que las formulaciones de proporción molar baja tenían como resultado la agregación de los antígenos rLP2086 de las subfamilias A y B tras agitación de las composiciones inmunogénicas de proporción molar baja. No obstante, el incremento de la concentración de aluminio en las composiciones de proporción molar baja previno la agregación de los antígenos rLP2086 de las subfamilias A y B, incluso con agitación. Además, los antígenos rLP2086 de la subfamilias A son más sensibles a los efectos de las proporciones molares del detergente bajas en ausencia de aluminio. En consecuencia, en algunas realizaciones, la invención proporciona una composición inmunogénica que comprende un antígeno rLP2086 de la subfamilia A, un antígeno rLP2086 de la subfamilia B, una concentración alta de aluminio y una proporción molar detergente-proteína baja. En algunas realizaciones, la invención proporciona un procedimiento de mantener la estabilidad de un antígeno rLP2086 de la subfamilia A y de de un antígeno rLP2086 de la subfamilia B en una composición inmunogénica que

55 comprende la etapa de almacenar el antígeno rLP2086 de la subfamilia A y el antígeno rLP2086 de la subfamilia B en un tampón que comprende una concentración alta de aluminio y una proporción molar detergente-proteína baja.

Composiciones inmunogénicas

En la técnica se conocen composiciones inmunogénicas que incluyen una proteína codificada por una secuencia de nucleótidos del ORF2086 de Neisseria meningitidis.

Ejemplos de composiciones inmunogénicas incluyen las descritas en las publicaciones de solicitud de patente de EE.UU. nº US 20060257413 y US 20090202593, que se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad. Dichas composiciones inmunogénicas descritas en ellas incluyen una proteína que exhibe actividad bactericida identificada como proteína ORF2086, porciones inmunogénicas de la misma y/o equivalentes biológicos

5 de la misma. La proteína ORF2086 se refiere a una proteína codificada por el marco de lectura abierto 2086 de especies de Neisseria.

La proteína puede ser una proteína recombinante o una proteína aislada de especies de Neisseria nativas. Por ejemplo, las proteínas ORF2086 de Neisseria se pueden aislar de cepas bacterianas, tales como de las especies de Neisseria, incluidas las cepas de Neisseria meningitidis (serogrupos A, B, C, D, W-135, X, Y, Z y 29E), Neisseria

10 gonorrhoeae y Neisseria lactamica, así como porciones inmunogénicas y/o equivalentes biológicos de dichas proteínas.

Las proteínas ORF2086 incluyen las proteínas 2086 de la subfamilia A y las proteínas de la subfamilia B, porciones inmunogénicas de las mismas y/o equivalentes biológicos de las mismas. Las proteínas ORF2086 o equivalentes de las mismas pueden estar lipidadas o no lipidadas. Preferentemente, la proteína ORF2086 de Neisseria está lipidada.

15 En una realización, la composición inmunogénica incluye una proteína aislada que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos un 95 % con una proteína codificada por una secuencia de nucleótidos de ORF2086 de Neisseria.

En una realización, la composición inmunogénica incluye una proteína aislada que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos un 95 % con una proteína de la subfamilia A codificada por una secuencia de

20 nucleótidos de ORF2086 de Neisseria. Preferentemente, la composición inmunogénica incluye una proteína aislada de la subfamilia A codificada por una secuencia de nucleótidos de ORF2086 de Neisseria.

En otra realización, la composición inmunogénica incluye una proteína aislada que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos un 95 % con una proteína de la subfamilia B codificada por una secuencia de nucleótidos de ORF2086 de Neisseria. Preferentemente, la composición inmunogénica incluye una proteína aislada

25 de la subfamilia B codificada por una secuencia de nucleótidos de ORF2086 de Neisseria. En algunas realizaciones, la proteína ORF2086 de la subfamilia B es una variante B01.

En otra realización más, la composición inmunogénica incluye una proteína aislada que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos un 95 % con una proteína de la subfamilia A codificada por una secuencia de nucleótidos de ORF2086 de Neisseria y una proteína aislada que tiene una identidad de secuencia de

30 aminoácidos de al menos un 95 % con una proteína de la subfamilia B codificada por una secuencia de nucleótidos de ORF2086 de Neisseria. Preferentemente, la composición inmunogénica incluye una proteína aislada de la subfamilia A codificada por una secuencia de nucleótidos de ORF2086 de Neisseria y una proteína aislada de la subfamilia B codificada por una secuencia de nucleótidos de ORF2086 de Neisseria.

En una realización, la composición inmunogénica incluye una proporción 1:1 entre una proteína de la subfamilia A y 35 una proteína de la subfamilia B.

La composición inmunogénica puede incluir una proteína codificada por una secuencia de nucleótidos de ORF2086 de Neisseria, polinucleótidos o equivalentes de la misma, como único inmunógeno activo en la composición inmunogénica. Como alternativa, la composición inmunogénica puede incluir además inmunógenos activos, incluidos polipéptidos inmunogénicos de Neisseria sp., o proteínas inmunológicamente activas de uno o más patógenos

40 microbianos distintos (p. ej., virus, prión, bacteria u hongo, sin limitaciones) o polisacárido capsular. Las composiciones pueden comprender una o más proteínas, fragmentos o compuestos farmacéuticos deseados, según se desee para una indicación escogida.

En la presente invención se contempla cualquier composición inmunogénica multiantígeno o multivalente. Por ejemplo, la composición inmunogénica puede incluir combinaciones de dos o más proteínas ORF2086, una

45 combinación de una proteína ORF2086 con una o más proteínas Por A, una combinación de una proteína ORF2086 con polisacáridos y/o conjugados polisacáridos del serogrupo A, C, Y y W135 de meningococcus, una combinación de una proteína ORF2086 con combinaciones de meningococcus y pneumococcus o una combinación de cualquiera de los anteriores en una forma adecuada para una administración deseada, por ejemplo para liberación en la mucosa. Los expertos en la técnica podrán formular fácilmente dichas composiciones multiantígeno o multivalentes.

50 La presente invención también contempla regímenes multi-inmunización en los que cualquier composición útil contra un patógeno se puede combinar en o con las composiciones de la presente invención. Por ejemplo, sin limitaciones, se puede administrar a un paciente la composición inmunogénica de la presente invención y otra composición inmunológica para inmunizar contra el papilomavirus humano (PVH), tal como la vacuna contra el PVH GARDASIL®, como parte de una régimen de multi-inmunización. Los expertos en la técnica podrán seleccionar fácilmente

55 composiciones inmunogénicas para usar junto con las composiciones inmunogénicas de la presente invención para los fines de desarrollar e implementar régimenes de multi-inmunización.

Los polipéptidos ORF2086, fragmentos y equivalentes se pueden usar como parte de una composición

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aproximadamente 1,4, aproximadamente 1,5, aproximadamente 1,6, aproximadamente 1,7, aproximadamente 1,8, aproximadamente 1,9, aproximadamente 2,0, aproximadamente 2,1, aproximadamente 2,2, aproximadamente 2,3, aproximadamente 2,4, aproximadamente 2,5, aproximadamente 2,6, aproximadamente 2,7, aproximadamente 2,8, aproximadamente 2,9, aproximadamente 3,0, aproximadamente 3,1, aproximadamente 3,2, aproximadamente 3,3,

5 aproximadamente 3,4, aproximadamente 3,5, aproximadamente 3,6, aproximadamente 3,7, aproximadamente 3,8, aproximadamente 3,9, aproximadamente 4,0, aproximadamente 4,1, aproximadamente 4,2, aproximadamente 4,3, aproximadamente 4,4, aproximadamente 4,5, aproximadamente 4,6, aproximadamente 4,7, aproximadamente 4,8, aproximadamente 4,9, aproximadamente 5,0, aproximadamente 5,5, aproximadamente 6,0, aproximadamente 6,5, aproximadamente 7,0, aproximadamente 7,5, aproximadamente 8,0, aproximadamente 8,5, aproximadamente 9,0, aproximadamente 9,5, o aproximadamente 10. En algunas realizaciones, el detergente es un detergente no iónico. En algunas realizaciones, el detergente es un detergente de polisorbato. En algunas realizaciones, el detergente es polisorbato 80.

En algunas realizaciones, la composición inmunogénica comprende además un catión multivalente. En algunas realizaciones, el catión multivalente es calcio o aluminio. En algunas realizaciones, el aluminio está presente como 15 uno o más de AlPO4, Al(OH)3, Al2(SO4)3 y alumbre. En algunas realizaciones, la composición inmunogénica comprende entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 1 mg/ml, entre aproximadamente 0,25 mg/ml y aproximadamente 0,75 mg/ml o entre aproximadamente 0,4 mg/ml y aproximadamente 0,6 mg/ml de aluminio. En algunas realizaciones, la composición inmunogénica comprende aproximadamente 0,1 mg/ml, aproximadamente 0,15 mg/ml; aproximadamente 0,2 mg/ml, aproximadamente 0,25 mg/ml, aproximadamente 0,3 mg/ml, aproximadamente 0,35 mg/ml, aproximadamente 0,4 mg/ml, aproximadamente 0,45 mg/ml, aproximadamente 0,5 mg/ml, aproximadamente 0,55 mg/ml, aproximadamente 0,6 mg/ml, aproximadamente 0,65 mg/ml, aproximadamente 0,7 mg/ml, aproximadamente 0,75 mg/ml, aproximadamente 0,8 mg/ml, aproximadamente 0,85 mg/ml, 0,9 mg/ml, aproximadamente 0,95 mg/ml, o aproximadamente 1 mg/ml de aluminio. En algunas realizaciones, hay al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o

25 100 % de unión de aluminio a la proteína.

En algunas realizaciones, la composición inmunogénica comprende además tampón que comprende histidina. En algunas realizaciones, la concentración de histidina está entre aproximadamente 2mM y aproximadamente 20 mM, entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 15 mM o entre aproximadamente 8 mM y 12 mM. En algunas realizaciones, la concentración de histidina es aproximadamente 2 mM, aproximadamente 3 mM, aproximadamente 4 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 6 mM, aproximadamente 7 mM, aproximadamente 8 mM, aproximadamente 9 mM, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 11 mM, aproximadamente 12 mM, aproximadamente 13 mM, aproximadamente 14 mM, aproximadamente 15 mM, aproximadamente 16 mM, aproximadamente 17 mM, aproximadamente 18 mM, aproximadamente 19 mM o aproximadamente 20 mM.

En algunas realizaciones, la composición inmunogénica comprende además tampón que comprende succinato. En

35 algunas realizaciones, la concentración de succinato está entre aproximadamente 2mM y aproximadamente 20 mM, entre aproximadamente 2 mM y aproximadamente 10 mM o entre aproximadamente 3 mM y 7 mM. En algunas realizaciones, la concentración de succinato es aproximadamente 2 mM, aproximadamente 3 mM, aproximadamente 4 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 6 mM, aproximadamente 7 mM, aproximadamente 8 mM, aproximadamente 9 mM, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 11 mM, aproximadamente 12 mM, aproximadamente 13 mM, aproximadamente 14 mM, aproximadamente 15 mM, aproximadamente 16 mM, aproximadamente 17 mM, aproximadamente 18 mM, aproximadamente 19 mM o aproximadamente 20 mM.

En algunas realizaciones, el pH de la composición inmunogénica tiene un pH de entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 8,0 o entre aproximadamente 5,5 y aproximadamente 7,0; o entre aproximadamente 5,8 y aproximadamente 6,0. En algunas realizaciones, el pH de la composición inmunogénica tiene un pH de

45 aproximadamente 5,0, aproximadamente 5,1, aproximadamente 5,2, aproximadamente 5,3, aproximadamente 5,4, aproximadamente 5,5, aproximadamente 5,6, aproximadamente 5,7, aproximadamente 5,8, aproximadamente 5,9, aproximadamente 6,0, aproximadamente 6,1, aproximadamente 6,2, aproximadamente 6,3, aproximadamente 6,4 o aproximadamente 6,5.

En algunas realizaciones, la formulación de la composición inmunogénica del antígeno proteico MnB rLP2086 de la subfamilia B es solución salina tamponada con histidina 10 mM, a pH 6,0, que contiene 0,5 mg/ml de aluminio como fosfato se aluminio y una proporción polisorbato 80-proteína de 2,8.

En algunas realizaciones, la formulación de la composición inmunogénica del antígeno proteico MnB rLP2086 de la subfamilia B es solución salina tamponada con succinato 5 mM, a pH 6,0, que contiene 0,5 mg/ml de aluminio como fosfato se aluminio y una proporción polisorbato 80-proteína de 2,8.

55 En algunas realizaciones, la invención proporciona un procedimiento de estabilizar antígenos rLP2086 de la subfamilia B en el tiempo, que comprende almacenar los antígenos en un tampón con una proporción molar detergente-proteína baja.

En algunas realizaciones, la proporción molar detergente-proteína en el tampón está entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 10. En algunas realizaciones, la proporción molar detergente-proteína en el tampón está entre

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subfamilia B es solución salina tamponada con succinato 5 mM, a pH 6,0, que contiene 0,5 mg/ml de aluminio como fosfato se aluminio y una proporción polisorbato 80-proteína de 2,8.

En algunas realizaciones, la invención proporciona un procedimiento de estabilizar los antígenos rLP2086 de la subfamilia A y/o los antígenos rLP2086 de la subfamilia B en el tiempo, que comprende almacenar los antígenos en 5 un tampón con una concentración de estabilizante alta y una proporción molar detergente-proteína baja.

En algunas realizaciones, la proporción molar detergente-proteína es inferior a 10:1. En el tampón algunas realizaciones, la proporción molar detergente-proteína en el tampón está entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 10. En algunas realizaciones, la proporción molar detergente-proteína en el tampón está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 5. En algunas realizaciones, la proporción molar detergente-proteína en el

10 tampón está entre aproximadamente 1,4 y aproximadamente 4,2. En algunas realizaciones, la proporción molar detergente-proteína en el tampón es de aproximadamente 0,5,aproximadamente 0,6,aproximadamente 0,7, aproximadamente 0,8, aproximadamente 0,9, aproximadamente 1,0, aproximadamente 1,1, aproximadamente 1,2, aproximadamente 1,3, aproximadamente 1,4, aproximadamente 1,5, aproximadamente 1,6, aproximadamente 1,7, aproximadamente 1,8, aproximadamente 1,9, aproximadamente 2,0, aproximadamente 2,1, aproximadamente 2,2,

15 aproximadamente 2,3, aproximadamente 2,4, aproximadamente 2,5, aproximadamente 2,6, aproximadamente 2,7, aproximadamente 2,8, aproximadamente 2,9, aproximadamente 3,0, aproximadamente 3,1, aproximadamente 3,2, aproximadamente 3,3, aproximadamente 3,4, aproximadamente 3,5, aproximadamente 3,6, aproximadamente 3,7, aproximadamente 3,8, aproximadamente 3,9, aproximadamente 4,0, aproximadamente 4,1, aproximadamente 4,2, aproximadamente 4,3, aproximadamente 4,4, aproximadamente 4,5, aproximadamente 4,6, aproximadamente 4,7,

20 aproximadamente 4,8, aproximadamente 4,9, aproximadamente 5,0, aproximadamente 5,5, aproximadamente 6,0, aproximadamente 6,5, aproximadamente 7,0, aproximadamente 7,5, aproximadamente 8,0, aproximadamente 8,5, aproximadamente 9,0, aproximadamente 9,5, o aproximadamente 10. En algunas realizaciones, el detergente es un detergente no iónico. En algunas realizaciones, el detergente es un detergente de polisorbato. En algunas realizaciones, el detergente es polisorbato80.

25 En algunas realizaciones, el estabilizante en el tampón es un catión multivalente. En algunas realizaciones, el catión multivalente es calcio o aluminio. En algunas realizaciones, el aluminio está presente como uno o más de AlPO4, Al(OH)3, Al2(SO4)3 y alumbre. En algunas realizaciones, el estabilizante en el tampón está entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 1 mg/ml, entre aproximadamente 0,25 mg/ml y aproximadamente 0,75 mg/ml o entre aproximadamente 0,4 mg/ml y aproximadamente 0,6 mg/ml de aluminio. En algunas realizaciones, el estabilizante

30 en el tampón es aproximadamente 0,1 mg/ml, aproximadamente 0,15 mg/ml; aproximadamente 0,2 mg/ml, aproximadamente 0,25 mg/ml, aproximadamente 0,3 mg/ml, aproximadamente 0,35 mg/ml, aproximadamente 0,4 mg/ml, aproximadamente 0,45 mg/ml, aproximadamente 0,5 mg/ml, aproximadamente 0,55 mg/ml, aproximadamente 0,6 mg/ml, aproximadamente 0,65 mg/ml, aproximadamente 0,7 mg/ml, aproximadamente 0,75 mg/ml, aproximadamente 0,8 mg/ml, aproximadamente 0,85 mg/ml, 0,9 mg/ml, aproximadamente 0,95 mg/ml, o

35 aproximadamente 1 mg/ml de aluminio. En algunas realizaciones, hay al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % de unión de aluminio a la proteína.

En algunas realizaciones, el tampón comprende además histidina. En algunas realizaciones, la concentración de histidina está entre aproximadamente 2mM y aproximadamente 20 mM, entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 15 mM o entre aproximadamente 8 mM y 12 mM. En algunas realizaciones, la concentración de

40 histidina es aproximadamente 2 mM, aproximadamente 3 mM, aproximadamente 4 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 6 mM, aproximadamente 7 mM, aproximadamente 8 mM, aproximadamente 9 mM, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 11 mM, aproximadamente 12 mM, aproximadamente 13 mM, aproximadamente 14 mM, aproximadamente 15 mM, aproximadamente 16 mM, aproximadamente 17 mM, aproximadamente 18 mM, aproximadamente 19 mM o aproximadamente 20 mM.

45 En algunas realizaciones, el tampón comprende además succinato. En algunas realizaciones, la concentración de succinato está entre aproximadamente 2mM y aproximadamente 20 mM, entre aproximadamente 2 mM y aproximadamente 10 mM o entre aproximadamente 3 mM y 7 mM. En algunas realizaciones, la concentración de succinato es aproximadamente 2 mM, aproximadamente 3 mM, aproximadamente 4 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 6 mM, aproximadamente 7 mM, aproximadamente 8 mM, aproximadamente 9 mM,

50 aproximadamente 10 mM, aproximadamente 11 mM, aproximadamente 12 mM, aproximadamente 13 mM, aproximadamente 14 mM, aproximadamente 15 mM, aproximadamente 16 mM, aproximadamente 17 mM, aproximadamente 18 mM, aproximadamente 19 mM o aproximadamente 20 mM.

En algunas realizaciones, el tampón tiene un pH de entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 8,0 o entre aproximadamente 5,5 y aproximadamente 7,0; o entre aproximadamente 5,8 y aproximadamente 6,0. En algunas

55 realizaciones, el tampón tiene un pH de aproximadamente 5,0, aproximadamente 5,1, aproximadamente 5,2, aproximadamente 5,3, aproximadamente 5,4, aproximadamente 5,5, aproximadamente 5,6, aproximadamente 5,7, aproximadamente 5,8, aproximadamente 5,9, aproximadamente 6,0, aproximadamente 6,1, aproximadamente 6,2, aproximadamente 6,3, aproximadamente 6,4 o aproximadamente 6,5.

En algunas realizaciones, el tampón en el que se almacenan los antígenos proteicos MnB rLP2086 de las 60 subfamilias A y B es solución salina tamponada con histidina 10 mM, a pH 6,0, que contiene 0,5 mg/ml de aluminio

como fosfato se aluminio y una proporción polisorbato 80-proteína de 2,8.

En algunas realizaciones, el tampón en el que se almacenan los antígenos proteicos MnB rLP2086 de las subfamilias A y B es solución salina tamponada con succinato 5 mM, a pH 6,0, que contiene 0,5 mg/ml de aluminio como fosfato se aluminio y una proporción polisorbato 80-proteína de 2,8.

5 Con el fin de que esta invención se entienda mejor, se exponen los ejemplos siguientes. Los ejemplos son con fines ilustrativos únicamente y no deben interpretarse como limitantes del ámbito de la invención.

Todas las referencias citadas se incorporan en el presente documento por referencia.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Procedimientos experimentales

10 Determinación de la unión a aluminio

Una composición que comprende aluminio y al menos un antígeno proteico se centrifugó de modo que sedimentó el aluminio. La centrifugación de las proteínas adsorbidas en aluminio se conoce en la técnica. Véase, por ejemplo, Egan y col., Vaccine, Vol. 27(24):3175-3180 (2009). La proteína unida a aluminio también sedimentó, mientras que la proteína no unida a aluminio permaneció en el sobrenadante. La proteína total en el sobrenadante y en el

15 sedimento se determinó mediante el ensayo de Lowry. El porcentaje de proteína unida se calculó dividiendo la proteína total en el sobrenadante por la proteína total añadida a la composición, y multiplicando por 100 %. De forma similar, el porcentaje de proteína no unida se calculó dividiendo la proteína total en el sobrenadante por la proteína total añadida a la composición, y multiplicando por 100 %.

Para las composiciones que comprenden antígenos de las dos subfamilias, A y B, las concentraciones individuales

20 de proteína de las subfamilias A y B en el sobrenadante se determinaron mediante cromatografía de intercambio iónico. La separación y la elución de las proteínas de las subfamilias A y B se llevaron a cabo usando una columna de aniones fuertes y un eluyente de concentración alta de sales. Las proteínas de las dos subfamilias A y B se detectaron y cuantificaron usando un equipo detector de fluorescencia a Excitación= 280 por ciclo y Emisión = 310 por ciclo. Las proteínas de la subfamilia A y de la subfamilia B eluyen a distintos tiempos de retención y se

25 cuantificaron usando una curva estándar generada contra un material de referencia proteico B rLP2086. El porcentaje de proteína no unida se calculó dividiendo la proteína total en el sobrenadante por la proteína total añadida a la composición, y multiplicando por 100 %. El porcentaje de proteína unida se calculó restando el porcentaje de proteína no unida del 100 %.

Ensayo de potencia in vitro

30 El ensayo de potencia de rLP2086 es un ensayo de captura homogénea o ensayo de tipo sándwich que depende de dos anticuerpos monoclonales funcionales que reconocen epítopos conformacionales y no solapantes sobre una molécula proteica sencilla de la sustancia farmacológica rLP2086. Un anticuerpo monoclonal purificado sirve como anticuerpo de captura (AcMo) y está químicamente conjugado a perlas de poliestireno carboxiladas que tienen un identificador único codificado por colores. El segundo anticuerpo está biotinilado y sirve como anticuerpo de

35 detección que se une posteriormente a estreptavidina conjugada con el fluróforo R-ficoeritrina (SA-PE). Las características de fluido de un instrumento de detección Bio-Plex cuantifican microesferas individuales y su señal SA-PE asociada. Una señal de fluorescencia de R-ficoeritrina asociada con la microesfera solo se detectará mediante la formación de un complejo ternario entre el anticuerpo conjugado con las perla, el antígeno y el anticuerpo de detección, y será proporcional al número funcional de epítopos en las muestras rLP2086. Un cambio

40 en uno o ambos epítopos que tiene como resultado una pérdida de fluorescencia con respecto al patrón de referencia indicará una pérdida de potencia.

Reactivos

 Microesferas conjugadas con anticuerpo monoclonal (conjugado a la región 12 de la esfera o a la región 66 de la espera de Luminex MicroPlex Microsphere)

45  Anticuerpo monoclonal biotinilado.  Materiales de referencia rLP2086, subfamilias a y B, 2 mg/ml. Almacenar a 70 ºC  rLP2086 Subfamilia A y B, catión bivalente  Estreptavidina, conjugado con R-ficoeritrina, liofilizado

Tampones

50  Histidina 10 mM, NaCl 150 mM, pH 6,0  Polisorbato 80 al 5 % p/v (PS-80) en solución salina al 0,85 % p/v.  Tampón de la matriz (Histidina 10 mM, polisorbato 80 al 0,02 %, NaCl 150 mM, pH 6,0).  Tampón de ensayo (PBS, pH 7,4 con BSA al 0,1 %, polisorbato 80 al 0,02 %, azida al 0,1 %).  100x Estreptavidina, conjugado con R-ficoeritrina(SA-PE) – Vial abierto de estreptavidina, R-ficoeritrina liofilizada,

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Las proteínas tanto de la subfamilia A como de la subfamilia B se unían al polisorbato 80. La unión de la subfamilia A fue la misma para las muestras almacenadas a 2-8°C y a 25°C, pero la unión de la subfamilia B fue casi el doble para las muestras almacenadas a 25°C. Además, el estudio de la proporción molar crítica indicó que las muestras de formulación a 200 μg/ml eran estables cuando contenían 0,008 % de polisorbato o menos, lo que es equivalente a

5 una proporción molar total de 4,2 o menor.

Ejemplo 5: Concentración del detergente y potencia del antígeno rLP2086 de la subfamilia B

Estudios de estabilidad adicionales con concentraciones variables de polisorbato 80 corroboraron la calidad de crítica de la proporción molar entre el polisorbato 80 y la proteína para mantener la potencia. En un experimento, la composición inmunogénica se formuló a la dosis de 200 μg (concentración de proteína total 400 μg/ ml)a pH 6,3 en 10 solución salina tamponada con histidina 10 mM (HBS) con 0,5 mg/ml de aluminio (como fosfato de aluminio) y con picos de 0,01 %, 0,02 %, 0,05 % o 0,1 % de polisorbato 80 (proporción molar correspondiente entre polisorbato 80 y la proteína rLP2086 a 5,3, 10,7, 26,7 y 53,4). Las muestras formuladas se incubaron a 25 ºC y las muestras control se almacenaron a 2-8ºC. No se observó ningún cambio significativo de la potencia a tiempo “0” a concentraciones de polisorbato de hasta 0,1 %. No obstante, para periodos más prolongados de 2-8 ºC, se observó una reducción de la

15 potencia como una función de la temperatura y la concentración de polisorbato 80. A medida que la concentración de polisorbato 80 aumentaba de 0,01 % a 0,1 % en la composición inmunogénica, el punto de estabilidad a 3 meses demostró una reducción de la potencia de la proteína de la subfamilia B a menos del 10 % y del 25 % a 25 ºC y a 2-8 ºC, respectivamente (Figura 1).

Se realizó un estudio de estabilidad adicional (Figura 2) en el que se evaluó la proteína de la subfamilia B a una

20 concentración de 4 mg/ml en HBS y con picos de polisorbato 80 hasta una concentración final de 0,06, 0,5 y 1 % (proporciones molares correspondientes de 3,3, 26,7 y 53,4). El control contenía 0,09 % de polisorbato 80. La proteína de la subfamilia B en 0,06 % de polisorbato 80 (proporción molar de 3,3) era estable. Las mismas muestras que contenían una concentración mayor de polisorbato 80 a 0,5 % y 1 % (proporciones molares de 26,7 y 53.4, respectivamente) eran inestables. Para las formulaciones de las composiciones inmunogénicas a 400 μg/ml, se

25 observó inestabilidad de la proteína de la subfamilia B en todas las formulaciones que contenían una concentración de polisorbato 80 de 0,01 % (proporción molar 5,3) o mayor. No obstante, a concentraciones de 4 mg/ml de proteína y de 0,06 % de polisorbato 80 no se observó reducción de la potencia porque la proporción entre el polisorbato 80 y la proteína (3,3) es mejor que a concentraciones de 400 μg/ml de proteína más 0,01 % de polisorbato 80 (proporción molar 5,3). Por tanto, la reducción de la potencia de la proteína de la subfamilia B por el polisorbato 80 se

30 correlaciona con la proporción molar entre el detergente polisorbato 80 y la proteína y no con la concentración absoluta del polisorbato 80 en la matriz.

De acuerdo con esto, la concentración de polisorbato 80 debe reducirse en la composición inmunogénica con el fin de mantener la estabilidad de la proteína de la subfamilia B en la vacuna y durante el posterior almacenamiento a 2--8°C. Se diseñó un estudio de estabilidad acelerada a 28 días para la composición inmunogénica con varias 35 proporciones molares de polisorbato 80 (0,1, 0,1, 0,2 y 5,3) a dosis de 20 y 200 μg (Figura 3 y Figura 4). Se preparó una formulación bivalente (subfamilia A y subfamilia B) en solución salina tamponada con histidina 10 mM a pH 6,0, 0,05 mg/ml de aluminio en forma de fosfato de aluminio con varias concentraciones de polisorbato 80. Las muestras se incubaron a 25 ºC junto con un grupo control a 2-8 ºC. En las muestras se analizó la potencia a 0, 7, 14, 28 y 8 días. Las proteínas tanto de la subfamilia A (datos no mostrados) como de la subfamilia B eran estables para todos

40 los grupos que contenían una proporción molar inferior a 5,3 entre el polisorbato 80 y la proteína. Un valor de potencia superior al 80 % se considera dentro de la variabilidad del ensayo. A la proporción molar de 5,3 se observó una tendencia descendente para la potencia de la proteína de la subfamilia B para las muestras a 25 ºC.

En un estudio exhaustivo se evaluó todas las posibles dosificaciones clínicas (20, 60, 120 y 200 μg) formuladas con varias proporciones molares entre el polisorbato 80 y la proteína en condiciones de estabilidad de almacenamiento 45 acelerado para investigar los efectos de las proporciones molares entre el polisorbato 80 y la proteína sobre la estabilidad de las proteínas MnB rLP2086. Se usaron composiciones inmunogénicas bivalentes de MnB rLP2086 formuladas a proporciones molares entre el polisorbato 80 y la proteína que varían de aproximadamente 1,4 a 10,7. Para generar composiciones inmunogénicas formuladas a proporciones molares entre el polisorbato 80 y la proteína crecientes (1,4, 2,4, 3,4, 3,9, 4,3, 4,7 y 10,7), los antígenos se ajustaron a proporciones molares variables añadiendo 50 polisorbato 80 de modo que, durante la formulación de la composición inmunogénica, no fuera necesario polisorbato 80 adicional. En este estudio se usaron dos grupos de lotes de antígenos. Un grupo de lotes de la subfamilia A y la subfamilia B se generó con una proporción molar entre el polisorbato 80 y la proteína de 1,4 y el otro grupo de 2,4. El grupo de proteínas con una proporción molar de 2,4 se usó para ajustar las proporciones molares de 3,4, 3,9, 4,3 y 10,7 con adiciones de polisorbato adicional. La matriz final de la composición inmunogénica fue histidina 10 mM,

55 NaCl 150 mM, a pH 6,0, 0,5 mg/ml de fosfato de aluminio con las proporciones molares entre el polisorbato 80 y la proteína mencionadas anteriormente. Tras almacenamiento a 2-8 ºC o a 25 ºC durante intervalos específicos se aplicó mezclado suave con un agitador 24 horas antes del ensayo. Se analizaron la proteína total mediante IEX-HPLC, la potencia, el aspecto, la densidad óptica a 320 nm de la fracción sobrenadante y el pH.

Los resultados de potencia de las dosis de 200 y 20 µg se muestran en la Figura 5 y la Figura 6, respectivamente. El

60 ensayo de potencia fue más sensible que otras pruebas usadas en el estudio. En general, no se observó una reducción significativa de la potencia para los antígenos ni de la subfamilia A ni de la subfamilia B, en comparación

con el punto de tiempo inicial para todas las dosificaciones con proporciones molares de 4,3 y menores. Las formulaciones con una proporción molar de 4,7 se consideraron en el mínimo debido a una ligera reducción de la potencia para las proteínas de la subfamilia B almacenadas a 25 ºC. Los resultados de potencia para el antígeno de la subfamilia B para formulaciones con una proporción molar de 10,7 fueron significativamente menores para las

5 muestra almacenadas a 25 ºC respecto a las almacenadas a 2-8 ºC.

Ejemplo 6: Concentración de aluminio y potencia del antígeno rLP2086 de la subfamilia A y B

Se realizó una serie de experimentos para determinar el nivel óptimo de fosfato de aluminio para asegurar más de un 95 % de unión de las proteínas de la subfamilia A y B. Los estudios iniciales se centraron en la optimización de la formulación a pH 6,5. Las formulaciones se prepararon con una dosificación diana de 200 μg/ml de cada proteína de 10 las proteínas de las subfamilias A y B en tampón de histidina 10 mM a pH 6,5 con 0,02 % de polisorbato 80 y 0,25 o 0,5 mg/ml de aluminio (como fosfato de aluminio). La proteína de la subfamilia B se unió al fosfato de aluminio en menor medida que la proteína de la subfamilia A (Figura 7). Aumentar el contenido de aluminio de 0,25 mg/ml a 0,5 mg/ml aumentó la unión de la proteína de la subfamilia B a > 80 %. Dado que el mecanismo de unión entre la proteína y la suspensión de aluminio es, principalmente, una interacción iónica, el pH de la suspensión es un factor

15 que influye sobre la unión.

El pH de la formulación se optimizó para asegurar una unión superior al 90-95 % de la proteína de la subfamilia B. Se analizaron múltiples formulaciones a 200 μg/ml de cada una de las proteínas a y B con un pH variable de 5,6 a 6,5 con lotes diferentes de composiciones inmunogénicas (Figura 8). En las formulaciones con un pH que varía de 5,6 a 6,4 se produjeron uniones de más del 90-95 % de ambas proteínas. A medida que el pH de las formulaciones 20 aumentaba a valores de 6,5 y mayores, la unión de la proteína de la subfamilia B se reducía significativamente. El pH diana recomendado es de 6,0 para asegurar una unión superior al 90 % de las proteínas de las subfamilias A y

B.

También se evaluó la solidez de la formulación bajo variables y/o límites de formulación variando el pH, el tampón, la proteína y las concentraciones de polisorbato 80 (Figura 9). Aunque la unión de la proteína de la subfamilia A fue

25 alta de un modo consistente (≥95 %) con la concentración de proteína hasta 500 µg/ml (250 µg/ml cada proteína), la unión de la proteína de la subfamilia B era más sensible a la concentración proteica y al pH. Dado que se usan formulaciones comerciales a una dosis de 200 μg, los resultados de este experimento avalaron también la formulación recomendada a un pH de 6,0 con 0,5 mg/ml de fosfato de aluminio.

Las formulaciones con y sin fosfato de aluminio se evaluaron para investigar la viabilidad de proporcionar una

30 formulación estable sin fosfato de aluminio a concentraciones de polisorbato 80 lo suficientemente bajas para la estabilidad de la proteína de la subfamilia B. Las composiciones inmunogénicas se formularon a dosis de 20 y 200 μg de tampón de solución salina tamponada con histidina con una concentración de polisorbato 80 que varía de 0 a 5,3 proporciones molares. La mitad de las muestras se sometieron a agitación con un agitador de tipo vórtex multitubos digital a 500 rpm en modo de pulsos (2 segundos con y 1 segundo sin) durante 24 horas antes del

35 análisis. Esta condición se adoptó para simular las pruebas ISTA (International Safe Transit Association) que normalmente se realizan en la última etapa de envío de la composición inmunogénica para imitar las vibraciones extremas durante las condiciones de envío.

Con agitación, las formulaciones sin fosfato de aluminio precipitaron, lo que, en última instancia, llevaron a la pérdida de potencia de los antígenos de la subfamilia A y la subfamilia B. Una prueba de aspecto (Figura 10) y las 40 mediciones de la absorbancia a λ = 320 nm (Figura 11) demostraron la formación de agregados y/o precipitados cuando se agitaron las formulaciones sin fosfato de aluminio. El análisis de la potencia de estas muestras (Figura 12 y Figura 13) demostró una pérdida significativa de potencia para ambas proteínas de la subfamilia A y la subfamilia B en todos los puntos de tiempo analizados. La pérdida de potencia fue más pronunciada en las formulaciones que contienen cantidades bajas de polisorbato 80. Dado que son necesarias cantidades bajas de polisorbato 80 para

45 mantener la estabilización de la proteína de la subfamilia B, la inclusión de fosfato de aluminio en la formulación es necesaria para conservar la estabilidad. Las composiciones inmunogénicas de rLP2086 se pueden formular con fosfato de aluminio, que funcionará reforzando la estabilidad de la potencia, medida mediante el ensayo de potencia in vitro.

Ejemplo 7: Succinato e histidina como tampones

50 Se preparó una serie de formulaciones para comparar la unión de las proteínas rLP2086 de las subfamilias A y B en succinato e histidina, así como los efectos del pH, el polisorbato 80 y el MgCl2 sobre la unión (Tabla 2). Se evaluó la solidez de la formulación bajo variables y/o límites de formulación variando el pH, el tampón, la proteína y las concentraciones de polisorbato 80 (Figuras 25 y 26). La unión de aluminio a la proteína de la subfamilia A y la subfamilia B fue similar, con independencia del tampón usado (histidina o succinato).

55

Tabla 2: Formulaciones para evaluar los tampones de histidina y succinato, MgCl2, Polisorbato y el pH 5,6 – 6,0 sobre la unión de rLP2086 con AlPO41

Solución

rLP2086 rLP2086 Histidina Succinato PS 80 MgCl2

salina pH diana

A (µg/ml) B (µg/ml) (mM) (mM) (%) (mM)

(%)

200
200: 0 5 0,020 0,9 0 6,0

200
200: 0 5 0,020 0,9 0 5,8

200
200: 0 5 0,020 0,9 0 5,6

200
200: 0 5 0,010 0,9 0 6,0

200
200: 0 5 0,005 0,9 0 6,0

250
250: 0 5 0,020 0,9 0 6,0

250
250: 0 5 0,020 0,9 0 5,8

250
250: 0 5 0,020 0,9 0 5,6

200
200: 0 10 0,020 0,9 0 6,0

200
200: 0 20 0,020 0,9 0 6,0

200
200: 0 5 0,020 0,9 10 6,0

200
200: 10 0 0,020 0,9 0 6,0

200
200: 10 0 0,020 0,9 0 5,8

200
200: 10 0 0,020 0,9 0 5,6

200
200: 10 0 0,010 0,9 0 6,0

200
200: 10 0 0,005 0,9 0 6,0

250
250: 10 0 0,020 0,9 0 6,0

250
250: 10 0 0,020 0,9 0 5,8

250
250: 10 0 0,020 0,9 0 5,6

200
200: 5 0 0,020 0,9 0 6,0

200
200: 20 0 0,020 0,9 0 6,0

200
200: 10 0 0,020 0,9 10 6,0

1Todas las formulaciones descritas en la Tabla 2 contienen 0,5 mg Al/ml.

El efecto de la sal tampón y el tiempo de mezclado sobre la unión a aluminio se evaluó con tres sales tampón de uso

5 habitual, escogidas porque sus pKa están dentro del intervalo fisiológico y porque estas sales se consideran, en general, seguras. Las proteínas rLP2086 de las subfamilias A y B se formularon con una de las tres sales tampón: succinato 5 mM, histidina 10 mM o fosfato 10 mM a un pH adecuado para la pKa de cada sal para determinar la unión en cada condición. El tiempo requerido para la finalización de la unión se evaluó dejando que las muestras se mezclaran durante 5 o 120 minutos antes de medir la cantidad de proteína unida.

10 Como se muestra en la Figura 27, la proteína de la subfamilia B exhibió una unión reducida a un pH 6,8 en tampón fosfato, mientras que la proteína de la subfamilia A no se vio significativamente afectada a las mismas condiciones. La cantidad de proteína unida a aluminio fue similar en las muestras formuladas con histidina o succinato. Por tanto, estas dos sales tampón se escogieron para su posterior evaluación. Aunque sin desear quedar ligado a teoría alguna, es posible que la menor unión en el tampón fosfato es el resultado de la competición por los sitios de unión

15 en AlPO4 con los iones fosfato añadidos.

En estas condiciones y concentraciones de proteína y AlPO4, la unión se completó tras 5 minutos de mezcla a temperatura ambiente, ya que se obtuvieron resultados similares tras mezclar durante 2 horas.

Para analizar después si la menor unión de la proteína de la subfamilia B en tampón fosfato a pH 6,8 se debía al pH

o a diferencias entre las sales tampón, se midió la unión en un intervalo de pH de 5,3 a 7,0 en formulaciones tamponados con histidina o con succinato. Se prepararon formulaciones bivalentes que contenían 0,2 mg/ml de las proteínas de cada subfamilia (0,4 mg/ml de proteína total), 0,02 % de PS80, 0,5 mg Al/ml y NaCl 150 mM. Las

5 muestras se formularon en histidina 10 mM o succinato 5 mM para comparar el efecto de la sal tampón. Tras la formulación, el pH de cada muestra se verificó de forma individual.

El perfil de la unión del pH 5,3 a 7,0 se muestra en la proteína de la subfamilia A en la Figura 28 y para la proteína de la subfamilia B en la Figura 28. La proteína de la subfamilia A exhibieron pocos cambios en la cantidad de la proteína unida, permaneciendo la unión por encima del 95 % en el intervalo de pH analizado. Una formulación que

10 contiene histidina con un pH 7,0 diana tuvo como resultado un pH de 6,8. El pH no se ajustó a 7,0 (p. ej., mediante la adición de base) para evitar los posibles efectos sobre la proteína o AlPO4 y, por tanto, los resultados para estos puntos de datos no están disponibles.

El perfil de unión de la proteína de la subfamilia B (mostrado en la Figura 29) exhibió una tendencia dependiente del pH. No obstante se realizará la unión en formulaciones tamponadas con histidina o con succinato, la cantidad de

15 proteína unida al aluminio fue similar. La unión dependía del pH de la formulación en lugar de de la sal tampón. La unión permaneció en un 95 % hasta un pH de 6,5 (94 % en histidina, 95 % en succinato), pero disminuyó cuando el pH era superior a 6,5. A pH 7,0, la unión disminuyó a aproximadamente 82 %, con diferencias pequeñas entre las sales tampón.

Para obtener una unión sólida de la proteína de la subfamilia B con AlPO4 a estas concentraciones se prefiere un pH 20 de 6,5 o menor.

Ejemplo 8: Estudio de seguridad, tolerabilidad e inmunogenicidad

Se realiza un estuido para evaluar la seguridad, toerabilidad e inmunogenicidad de la vacuna de rLP2086 administrada en una población de adolescentes sanos conforme a reg´menes de 0 y 2 meses; 0, 2 y 6 meses; 0 y 2 meses, seguido de una dosis de refuerzo de 12 meses.

25 La composición inmuogénica es una vacuna contra rLP2086 (lipidada recombinante). La composición inmunogénica incluye una proteína ORF2086 recombinante del serogrupo B de N. meningitidis que se expresó en Escherichia coli y se formuló en una vacuna bivalente compuesta por una cepa de la subfamilia A y una cepa de la subfamilia B de rLP2086. En particular, la composición inmunogénica es una dosis de 0,5 ml formulada para contener 60 μg, 120 μg

o 200 μg cada uno de una subfamilia A purificada y una proteína rLP2086 de la subfamilia B purificada, una relación

30 molar de 2,8 del polisorbato 80 y 0,25 mg de Al3+ como AlPO4, solución salina tamponada con histidina 10 mM de a pH 6,0. Una composición de control incluye una solución salina normal (cloruro de sodio al 0,9 %) en una dosis de 0,5 ml.

Los sujetos son asignados aleatoriamente a 5 grupos. Véase la Tabla 3. Los sujetos se clasifican en dos grupos de edad, ≥11 a <14 y ≥14 a <19 años de edad.

Tabla 3: Diseño del estudio

Vacunación 1: Vacunación 2 Extracción de sangre posvacunación 2 Vacunación 3 Extracción de sangre posvacunación 3 Vacunación 4 Extracción de sangre posvacunación 4

Número de visita: 1 2 3 4 5 6 7

Mes aproximado: 0 2 3 6 7 12 13

Grupo 1: rLP2086 rLP2086 Solución salina Solución salina

Grupo 2: rLP2086 rLP2086 rLP2086 Solución salina

Grupo 3: rLP2086 rLP2086 Solución salina rLP2086

Grupo 4: rLP2086 Solución salina rLP2086 Solución salina

Grupo 5: Solución salina Solución salina rLP2086 rLP2086

(continuación)

Tabla 3: Diseño del estudio

Extracción de sangre: 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml

La solución salina se usa como placebo porque no existe una vacuna segura, inmunogénica y efectiva probada contra MnB que pueda servir como un control activo.

5 Los sujetos reciben una dosis de la vacunade rLP2086 o solución salina en cada una de las visitas de vacunación (por ejemplo, las visitas 1, 2, 4 y 6) de acuerdo con la Tabla 3. Se observan las prácticas estándar de vacunación y la vacuna no se inyecta en los vasos sanguíneos. La vacuna de rLP2086 se administra por vía intramuscular inyectando 0,5 ml en el músculo deltoides superior. La solución salina se administra por vía intramuscular en el músculo deltoides superior.

10 A. Visita 1

En la visita 1, día 1, vacunación 1, primero se extrae la sangre del sujeto y luego recibe una vacunación.. La extracción de sangre de la visita 1 y la vacunación 1 ocurren el mismo día. Antes de la vacunación, se recoge una muestra de sangre (aproximadamente 20 ml) del sujeto. Para los sujetos asignados al azar al grupo 1, 2, 3 y 4, se administra una sola inyección intramuscular de 0,5 ml de la vacuna de rLP2086 en el músculo deltoides superior.

15 Para los sujetos del grupo 5, se administra una sola inyección intramuscular de 0,5 ml de solución salina al músculo deltoides superior.

B. Visita 2 (de 42 a 70 días después de la Visita 1), vacunación 2

Para los grupos 1, 2 y 3, se administra una sola inyección intramuscular de 0,5 ml de la vacuna de rLP2086 en el músculo deltoides superior. Para los grupos 4 y 5, se administra una sola inyección intramuscular de 0,5 ml de

20 solución salina al músculo deltoides superior.

C. Visita 3 (de 28 a 42 días después de la visita 2), extracción de sangre posvacunación 2

Se recoge una muestra de sangre (aproximadamente 20 ml) del sujeto.

D. Visita 4 (de 105 a 126 días después de la Visita 2), vacunación 3

Para los grupos 2, 4 y 5, se administra una sola inyección intramuscular de 0,5 ml de la vacuna de rLP2086 en el

25 músculo deltoides superior. Para los grupos 1 y 3, se administra una sola inyección intramuscular de 0,5 ml de solución salina al músculo deltoides superior.

E. Visita 5 (de 28 a 42 días después de la visita 4), extracción de sangre posvacunación 3

Se recoge una muestra de sangre (aproximadamente 20 ml) del sujeto.

F. Visita 6 (de 161 a 175 días después de la Visita 4), vacunación 4

30 En la visita 6, primero se extrae sangre del sujeto y luego recibe una vacunación.. La extracción de sangre de la visita 6 y la vacunación 4 ocurren el mismo día. Antes de la vacunación, se recoge una muestra de sangre (aproximadamente 20 ml) del sujeto. Para los grupos 3 y 5, se administra una sola inyección intramuscular de 0,5 ml de la vacuna de rLP2086 en el músculo deltoides superior. Para los sujetos de los grupos 1, 2 y 4 se administra una sola inyección intramuscular de 0,5 ml de solución salina al músculo deltoides superior.

35 G. Visita 7 (de 28 a 42 días después de la visita 6), extracción de sangre posvacunación 4

Se recoge una muestra de sangre (aproximadamente 20 ml) del sujeto.

Resultados de inmunogenicidad

El objetivo principal de este estudio era evaluar la inmunogenicidad de 60 μg, 120 μg y 200 μg de la vacuna de rLP2086, medida mediante SBA realizada con cepas de MnB que expresan las proteínas LP2086 de la subfamilia A

40 y B.

El objetivo secundario de este estudio era evaluar la inmunogenicidad de 60 μg, 120 μg y 200 μg de la vacuna de rLP2086 determinada mediante cuantificación de la unión de Ig a las proteínas de la vacuna rLP2086 de la

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Claims

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