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Kombinierte
Meningitis-Vakzine
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Die Erfindung betrifft einen kombinierten
Impfstoff zur Behandlung bakterieller Meningitis. Insbesondere schützt der
kombinierte Impfstoff effektiv gegen Infektionen durch Haemophilus
influenzae Typ B (Hib) und Neisseria meningitis (Meningokokke) Serogruppen
B und C (MenB, MenC).
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Die durch Infektionen mit Hib, MenB
und/oder MenC verursachte, bakterielle Meningitis stellt ein weltweites
Problem dar. Die Infektion durch diese Organismen kann zur dauerhaften
Invalidität
und Tod bei jungen Kindern führen.
Kürzlich
wurde jedoch ein konjugierter Hib-Impfstoff allgemein erhältlich (siehe
Force et al., Annals of Pharmacology 26 (1992), 1429– 1440;
Vella et al., Pediatrics 85 (1990), 668–675) und führte zur effektiven Kontrolle
der Hib-Infektionen. Ähnliche
Impfstoffe werden bald f- MenC-Infektionen und auch für MenB-Infektionen erhältlich sein
(siehe Costantino et al., Vaccine 10 (1992), 691–698). Nicht konjugierte Impfstoffe
gegen Hib und gegen MenC sind ebenfalls bekannt (siehe Parke et
al., J Infekt Dis 136 (1977), Suppl S51–S56).
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Die Hib- und Meningokokkenimpfstoffe
basieren auf Konjugate zwischen Oligosaccharide, die von der bakteriellen
Oberfläche
abgeleitet sind und die spezifische Epitope für das in Frage kommende Bakterium
definieren, die mit. Trägerproteinen,
wie z. B. nicht toxische Mutanten des Diphtherietoxins, zum Beispiel CRM197,
konjugiert sind.
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Kombinationsimpfstoffe gewinnen nun
eine weitverbreitete Akzeptanz in Entwicklungsländern. Die Begründung hinter
der Verwendung von Kombinationsimpfstoffen, die mehr als ein Antigen
umfassen und die effektiv sind, den Empfänger gegen eine Anzahl von
Krankheiten zu immunisieren, ist, dass die Verabreichungskosten
des Impfstoffes drastisch reduziert sein können, wenn sie mit einer größeren Anzahl
einzelner Impfstoffe verglichen werden. Weil die Verabreichungskosten
die Kosten des Impfstoffes um das Zigfache übersteigen können, sind
die Vorteile von Kombinationsimpfstoffen klar deutlich, wo Programme
zur Massenimpfung berücksichtigt
werden. Kombinationsimpfstoffe werden aktiv von der Weltgesundheitsbehörde (World
Health Organisation, WHO) gefördert
(siehe, zum Beispiil CVI Forum, Nr. 5, November 1993, S. 212; „CVI Report
of the First Meeting of the Consultative Group", CVI-Bericht des ersten Treffens der
Beratergruppe, Genf, 16.–17.
Dezember 1991, S. 29–32).
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Diese Vorteile wurden vor einiger
Zeit erkannt, aber nur drei dieser Kombinationsimpfstoffe sind zur Zeit
weitläufig
erhältlich.
Der erste, der in den 50er Jahren eingeführt wurde, war DTP, ein abgetöteter Impfstoff gegen
Diphtherie, Tetanus und Keuchhusten. Die Neubildung dieses Dreifachimpfstoff
zeigte keine größeren Probleme,
weil die Komponenten der Kombination gegenseitig kompatibel sind
und das Konservierungsmittel (Merthiolat) und das Adjuvans (Alum),
die in jedem getrennten Impfstoffverwendet werden, identisch waren. Des
weiteren fand man heraus, dass die vollständige Zelle der Keuchhusten-Komponente
die Immunantwon auf die Diphtherie- und Tetanustoxoide verstärkt.
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In den 60er Jahren wurde ein oraler
Polio-Lebendimpfstoff oral polio vaccine, OPV entwickelt, der Polioviren
von Typ 1, 2 und 3 enthielt. Ein Problem, das bei der Neubildung
von OPV auftrat, war das Vorhandensein von Störungen zwischen den Impfstoffkomponenten,
ein Problem, das bei DTP nicht aufgetreten war. Das Problem wurde
durch die Optimierung der Konzentration der einzelnen Komponenten
minimiert.
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Vor kurzem wurde in den meisten Entwicklungsländern ein
dritter Kombinationsimpfstoff, ein Masern-, Mumps- und Röteln-Lebendimpfstoff,
eingeführt.
Wieder musste die Konzentration jeder einzelnen Komponente eingestellt
werden, um das Phänomen
der Störung
zwischen den im Impfstoff eingeschlossenen Komponenten zu minimieren.
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Zur Zeit gibt es einen Trend zur
Entwicklung eines auf DTP-Impfstoff basierenden Superimpfstoffes, der
eine größere Anzahl
von Antigenen umfasst.
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Es gibt jedoch Nachteile in der Neubildung
des auf DTP basierenden Superimpfstoffes. Neuere Beweise zeigten,
dass die Verabreichung des Hib-Konjugatimpfstoffes zusammen mit
DTP die Effektivität
des Hib-Konjugates im Vergleich mit der getrennten Verabreichung
von DTP- und Hib-Impfstoff (siehe Abstrakt 300 von der 33. ICAAC)
reduziert.
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Gegensätzliche Daten existieren über die
Rolle der Immunität
des Trägerproteins
bei der Einflussnahme der Antikörperantwort
auf die Hapten- oder die Oligosaccharid-Komponente eines konjugierten
Impfstoffes. Ein solcher Einfluss ist kritisch für die Neubildung von Hib-MenB/C-Impfstoffen,
weil die verwendeten Trägerproteine
unveränderlich ähnlich oder
identisch zu den Antigenen sind, die im DTP-Impfstoff eingeschlossen sind,
welche Kleinkindern in einem frühen
Alter verabreicht werden. Nach einigen Studien ist die Antwort auf das
Konjugat durch das frühere
Aussetzen mit dem Träger
erhöht,
während
sie nach anderen Studien unterdrückt
ist. (Barington T et al., Infection and Immuntt 62 (1994), 9–14 ; Schneerson
R et al., J Exp Med 152 (1980), 361–376; Barington T et al., Infect
Immun 61 (1993), 432–438
; Peeters CCAM et al., Infect Immun 59, 3504–3510).
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Es wurde jetzt nachgewiesen, dass
das frühere
Aussetzen mit dem Trägerprotein
die Antwort auf den Hib-Konjugatimpfstoff deutlich erhöht.
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Dementsprechend ist das Ziel der
vorliegenden Erfindung, einen kombinierten Hib- und Meningokokken-Impfstoff
bereitzustellen, der bei der Prophylaxe von bakterieller Meningitis
verwendet werden könnte
und der eine wirtschaftliche, sichere und vorteilhafte Impfung gegen
die vorherrschenden Ursachen der Meningitis erlaubt.
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Die Erfindung stellt daher einen
Meningitis-Impfstoff bereit, der konjugierte Hib- und MenC-Oligosaccharide umfasst.
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Es wurde herausgefunden, dass der
Kombinationsimpfstoff der Erfindung effektiv bei der Verhütung einer
Infektion durch Haemophilus influenzae und Neisseria meninitigidis
Serogruppe C ist, wobei Antikörper gegen
die verabreichten konjugierten Kapsel-Oligosaccharide nach der ersten Dosis
verstärkt
gebildet wurden. Des weiteren wurde gezeigt, dass der Kombinationsimpfstoff
frei von Störungen
zwischen den verwendeten Antigenen war.
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Vorteilhafterweise kann eine Trägersensibilisierung
ausgenutzt werden, um die Antwort auf den Impfstoff zu maximieren.
Die Trägersensibilisierung
kann durch die Verabreichung eines DTP-Impfstoffes durchgeführt werden.
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Die MenC-Komponente kann in drei
verschieden bevorzugten Konfigurationen neugebildet werden: in einer
gepufferten, flüssigen
Form; lyophilisiert mit einem geeigneten Excipienten; und als ein
zum Gebrauch fertigen Produkt mit einem passenden Adjuvans. Der
Hib-Impfstoff ist nach der Lyophilisierung mit einem geeigneten
Excipienten und in einer gepufferten, flüssigen Form stabil. Zusätzlich können die
beiden Impfstoffe, MenC und Hib, zusammen mit einem geeigneten Excipienten
lyophilisiert und anschließend
vor der Verwendung mit einem passenden Adjuvans resuspendiert werden.
Alle Kombinationen der stabilen Neubildungen können vor der Verwendung gemischt
werden.
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Der Impfstoff der Erfindung kann
weiterhin ein konjugiertes Kapsel-Oligosaccharid umfassen, das von Neisseria
meningitidis Serogruppe B abgeleitet ist.
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Das Trägerprotein, mit dem die Oligosaccharid-Komponente
des Impfstoffes der Erfindung konjugiert ist, kann jedes Protein
sein, dass auf dem Fachgebiet für
diesen Zweck bekannt ist. Zum Beispiel kann es Tetanustoxoid, Diphtherietoxoid
oder ein Protein der äußeren Membran
von Neisseria menintigitidis oder eine Mutante oder eine Variante
dergleichen sein.
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Die Oligosaccharide sind vorzugsweise
der Größe nach
ausgewählt
und haben vorteilhafterweise einen Polymerisationsgrad von 4 oder
mehr.
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Die Erfindung stellt weiterhin ein
Verfahren zur Prophylaxe oder Behandlung von Meningitis bereit, welche
die Verabreichung einer pharmazeutisch effektiven Menge eines Kombinationsimpfstoffes
gemäß der Erfindung
an eine Person umfasst. Die bevorzugte Verabreichungstherapie ist
eine intramuskuläre
Verabreichung im Alter von 2, 4 und 6 Monaten.
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In einem weiteren Aspekt der Erfindung
ist ein Kombinationsimpfstoff gemäß der Erfindung zur Verwendung
in der Medizin bereit gestellt.
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Des weiteren stellt die Erfindung
ein Hib-Oligosaccharid-Konjugat und ein Neisseria meninitidis Serogruppe
C-Konjugat zur gleichzeitigen, getrennten oder sequenziellen Verabreichung
bereit.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
die jeweiligen durchschnittlichen, geometrischen Mittel der Antikörperkonzentrationen ± 2 SE
(95% Konfidenzinterval) in Seren, die unmittelbar vor und 1 Monat
nach der Auffrischungsinjektionen von sensibilisierten und nicht
sensibilisierten Patienten erhalten wurden; Antikörperantwort
auf PRP-Impfung im Alter von 12 Monaten im Verhältnis zu früheren Konjugatimpfimgen und
DT-Sensibilisierung;
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2 zeigt
das analytische Profil von H. influenzae Typ B Oligosaccharide nach
Säurehydrolyse;
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3 zeigt
das Rohbild eines FACE-Oligosaccharid-Glyko-Scanning von Oligosaccharid-Herstellungen vor
und nach der Größenauftrennung;
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4 zeigt
ein analytisches, chromatographisches Profil von Oligomeren mit
niedrigem Molekulargewicht nach der Größentrennung, die von den Polysacchariden
von H. influenzae Typ B abgeleitet wurden; die drei Hauptarten sind
in der in Tabelle 4 gezeigten, massenspektrographischen Analyse
gekennzeichnet.
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5 zeigt
das analytische, chromatographische Profil von Oligomeren mit höherem Molekulargewicht
nach der Größentrennung,
die von den Polysacchariden von H. influenzae Typ B abgeleitet wurden;
und
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6 zeigt
die Reaktivität
von MenC-Oligosacchariden mit verschiedener Längen im Serum; kompetitiver
ELISA, Pool menschlicher Seren von Erwachsenen, die mit einem Men
A + C-Polysaccharid-Impfstoff geimpft wurden, wobei eine Hemmung
mit Men C-Oligosacchariden
mit verschiedener Kettenlänge
erfolgte.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Hib- und MenC-Konjugate können gemäß der etablierten
Konjugationstechnologie unter Verwendung von Oligosacchariden und
Trägerproteinen,
die auf dem Fachgebiet bekannt sind, hergestellt werden. Vorzugsweise
werden die Konjugate jedoch entsprechend eines Verfahrens hergestellt,
welches das Aufteilen der Oligosaccharide nach Größe einschließt, um kurzkettige
Oligomere auszuschließen.
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Im Fall des Hib-Impfstoffes wurde
gezeigt, dass kurzkettige Oilgomere nur wenig immunogen sind (Peeters
et al., J Infect Immun 60, 1826–1833).
Des weiteren haben wir jetzt gezeigt, dass gleichermaßen MenC-Oligomere
mit einem niedrigen Molekulargewicht nur wenig immunogen sind. Oligosaccharide,
die einen Polymerisationsgrad von weniger als 4 haben, sind ineffektiv
bei der Hemmung der Reaktion zwischen menschlichen Antikörpern und
natürlichen
Polysacchariden in einem ELISA-Test.
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Die Impfstoffe gemäß der Erfindung
können
entweder prophylaktisch (zur Verhinderung einer Infektion) oder
therapeutisch (zur Behandlung der Erkrankung nach Infektion) sein.
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Diese Impfstoffe umfassen ein Antigen
oder Antigene, üblicherweise
in Kombination mit „pharmazeutisch
verträglichen
Trägern", die jeden Träger einschließen, der
nicht selber die Herstellung von Antikörpern induziert, die schädlich für das Individuum
ist, welches die Zusammensetzung erhält. Geeignete Träger sind typischerweise
große,
langsam metabolisierende Makromoleküle, wie z. B. Proteine, Polysaccharide,
Polymilchsäuren,
Polyglykolsäure,
polymere Aminosäuren,
Aminosäurekopolymere,
Lipidaggregate (wie z. B. Öltröpfchen oder
Liposome) und inaktive Viruspartikel. Solche Träger sind dem Fachmann gut bekannt.
Zusätzlich
können
diese Träger
als weitere immunstimulierende Wirkstoffe („Adjuvans") funktionieren. Des weiteren können die
Antigene mit dem bakteriellen Toxoid von Diphtherie, Tetanus, Cholera,
H. pylori, etc., Pathogenen konjugiert sein.
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Die immunogenen Zusammensetzungen
(z. B. das Antigen, der pharmazeutisch verträgliche Träger und das Adjuvans) werden
typischerweise Verdünnungsmittel,
wie z. B. Wasser, Kochsalzlösung,
Glycerin, Ethanol, etc., enthalten. Zusätzlich können Hilfsstoffe, wie z. B.
Benetzungs- oder Emulgierungsmittel, pH-Wert puffernde Stoffe und
dergleichen, in diesen Vehikeln vorhanden sein.
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Immunogene Zusammensetzungen, die
als Impfstoff verwendet werden, umfassen eine immunologisch effektive
Menge des Adjuvans und eines Antigens sowie jede andere der vorstehend
erwähnten
Komponenten, so wie es benötigt
wird. Mit „immunologisch
effektiver Menge" ist
gemeint, dass die Verabreichung dieser Menge an ein Individuum,
entweder als eine Einzeldosis oder als Teil einer Serie, effektiv
zur Therapie oder Vorbeugung ist. Diese Menge variiert in Abhängigkeit
von der Gesundheit und der physischen Kondition des Individuums,
das behandelt werden soll, der taxonomischen Gruppe des Individuums
(z. B. nichtmenschliche Primaten, Primaten, etc.), das behandelt
werden soll, die Kapazität
des Immunsystems des Individuums zur Antikörpersynthese, der Grad des
gewünschten
Schutzes, die Neubildung des Impfstoffes, die Beurteilung der medizinischen
Situation des behandelnden Arztes und anderer relevanter Faktoren.
Es wird erwartet, dass die Menge in einen relativ großen Bereich
fallen wird, der durch Routinestudien bestimmt werden kann. Der bevorzugte
Bereich liegt zwischen 2 und 10 μg
pro Dosis .
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Die Dosisbehandlung kann ein Einzeldosisprotokoll
sein, obwohl ein Protokoll mit multiplen Dosen bevorzugt wird.
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BEISPIELE
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BEISPIEL 1
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BESTIMMUNG
DES EFFEKTS DER TRÄGERSENSIBILISIERUNG
MIT Hib-KONJUGAT-IMPFSTOFF
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Impfstoffe und Personen
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Die klinische Studie wurde an Studienorten
in St. Louis (N = 83) und Minneapolis (N = 20) dwchgefiihrt. 103
gesunde Kleinkinder wurden in einem Alter von etwa einen Monat nach
dem Zufallsprinzip aufgeteilt, um entweder eine einzelne Injektion
des Diphtherie- und Tetanustoxoid-Impfstoffes zu erhalten (DT-sensibilisierte Gruppe)
oder sie wurden nicht geimpft. Der DT-Impfstoff (Lot 1L21121, Connaught
Laboratories, Inc, Swiftwater, PA) wurde intramuskulär gegeben,
wobei eine Dosis von 0,5 ml verwendet wurde. Der Mittelwert ± STABWN
des Alters der 52 Kinder, denen DT gegeben wurde, betrug 1,1 + 0,1
Monate (Bereich: 0,8 bis 1,3 Monate). Im Alter von zwei Monaten
wurden die Kleinkinder in jeder Gruppe erneut nach dem Zufallsprinzip
aufgeteilt, um entweder drei Dosen von HbOC (Lot M695HK) oder drei
Dosen PRP-T (Lot S2440) zu erhalten, die intramuskulär im Alter
von 2, 4 und 6 Monaten verabreicht wurden. Die Dosis von HbOC betrug
10 μg des
Saccharids und 25 μg
des CRM-Proteins in 0,5 ml und die Dosis von PRP-T betrug 10 μg des Saccharids
und 20 μg des
Proteins, ebenfalls in 0,5 ml verabreicht. Getrennte Injektionen
des DTF-Impfstoffes
(0,5 ml, intramuskulär, von
Lot 2G31010, Connaught Laboratories) wurden im anderen Bein zur
gleichen Zeit der jeweiligen Hib-Konjugat-Impfungen gegeben. Im
Alter von 12 Monaten wurde 5 μg
unkonjugierter PRP-Impfstoff in 0,1 ml subkutan gegeben. Der PRP-Impfstoff
wurde von MAID, NIH bereitgestellt und wurde zuvor beschrieben (Granoff
et al., J Inf Dis 168 (1993), 663–671). Serumproben wurden direkt
vor jeder Hib-Konjugat/DTP
Dosis erhalten, etwa 4 Wochen nach der dritten Konjugat-Dosis, und
direkt vor und 1 Monat nach der PRP-Impfung. Vierundneunzig der
103 Kinder (91%) vollendeten das Konjugat-Impfprotokoll und sind
die Personen, die in der hier berichteten Analyse eingeschlossen
sind. Die neun übrigen
Kinder wurden aus folgenden Gründen
ausgeschlossen: Schwierigkeiten bei dem Erhalt der Blutproben (1);
das Wegziehen der Eltern aus der Stadt (1); die fehlende Bereitschaft
weiterhin teilzunehmen (2); Verlust der Nachfolgeuntersuchung (1);
versehentliche Gabe des falschen Impfstoffes außerhalb der Studie (2); Diagnose
einer zugrunde liegenden Immununschwäche (1) und ein fieberhafter
Anfall nicht in Beziehung stehend mit der Impfung (1). Die demographischen
Kennzeichen der vier Behandlungsgruppen sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
Die Gruppen waren ähnlich
in Bezug auf Geschlecht, Rasse und Alter bei der ersten Dosis der
Konjugat-Impfung.
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Tabelle
1. Demographische Kennzeichen der Personengruppen
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Gegenreaktionen
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Eltern wurden gebeten, einen kurzen
Fragebogen zu vervollständigen,
der örtlich
begrenzte Reaktionen an den Injektionsorten, tägliche Temperaturen und andere
mögliche
systemische Reaktionen vermerkt, die während den 72 Stunden nach jeder
Dosis der DTP/Konjugatimpfung auftreten. Diese Beobachtungen wurden mittels
Telefonbefragungen, die von den Studienkrankenschwestern durchgeführt wurden,
und eine Übersicht der
möglichen
Gegenreaktionen zur Zeit jedes geplanten Bürobesuchs ergänzt. Eine
aktive Überwachung
von Gegenreaktionen wurde nach der DT-Impfung im Alter von 1 Monat
nicht dwchgefiihrt; Informationen über mögliche ernste Reaktionen auf
diese Impfung wurden jedoch bei dem Besuch nach 2 Monaten vor dem
Anfang der Konjugat/DTP-Impfung erhalten.
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Labor
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Kopie kodierte Gefäße mit gefrorenen
Seren wurden zur Washington Universität in St. Louis zur Bestimmung
der Gesamtkonzentrationen der Anti-PRP Antikörper und zu Connaught Laboratories,
Inc., Swiftwater, PA, zur Bestimmung der Konzentrationen von Antikörpern gegen
Diphtherie- und Tetanustoxoide gesendet. Alle Untersuchungen wurden
ohne Kenntnis des DT-Sensibilisierungsstatus oder der Zuweisung
des Konjugatimpfstoffes durchgeführt.
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Gesamtkonzentrationen der Anti-PRP
Antikörper
wurden mittels einer Radioantigen-Bindungsunter$uchung (radioantigen binding
assay, RABA) (Granoff et al., J Inf Dis 154 (1986), 257–264) bestimmt.
Die Standardkurve für
RABA bestand aus Verdünnungen
des Hib-Referenzserumpools, der vom Zentrum für biologische Evaluierung und
Forschung Center for Biologic Evalualtion and Researc CBER), U.S.
Nahrungsmittel- und Arzneimittelverwaltung (U.S. Food and Drin Administration),
Bethesda, MD, erhalten wurde. Die Gesamtkonzentration der Anti-PRP
Antikörper
dieses Pools wurden auf 80 μg/ml
geschätzt.
Einzelne Untersuchungen schlossen Kontrollserumpools ein, die repräsentativ
für einen
großen
Bereich von Antikörperkonzentrationen waren
(Granoff et al., J Pediatr 121 (1992), 187–194; Holmes et al J Pediatr
118 (1991), 364–371).
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Konzentrationen von Anti-Tetanustoxoid-
und Anti-Diphtherietoxoid-Antikörper
wurden in Serumproben von etwa 90% der Proben der Personen bestimmt,
die basierend auf die Vollständigkeit
des PRP-Auffrischungsprotokoll vor April 1993 und dem Vorhandensein
ausreichender Mengen von Serum für
die Untersuchungen ausgewählt
wurden.
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Die Antikörpertiter gegen Anti-Tetanustoxoid
wurden durch ELISA bestimmt. Kurz zusammengefasst, die Mikrotiterplatten
wurden über
Nacht bei Raumtemperatur mit gereinigtem Tetanustoxoid im Karbonatpuffer, pH-Wert
9,6, inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und 50 μl Proben
von seriellen zweifach Verdünnungen der
Testseren und der Kontrollseren wurden auf die beschichteten Platten
transferiert. Nach einer Inkubation von 3 Stunden bei Raumtemperatur
wurden die Platten gewaschen und gebundene Antikörper wurden unter Verwendung
von Alkalischer Phosphatase konjugierten Ziege-Anti-Mensch IgG,
IgA und IgM (Kirkegaard und Perry Laboratory, Gaithersburg, MD)
detektiert. Die Konzentrationen der Anti-Tetanustoxoid-Antikörper wurden dem
getesteten Serum zugewiesen als Einheiten/ml durch Vergleich mit
der Antigenbindungstitrationskurve des Referenzserumpools, der bei
Connaught Laboratory aus Seren von erwachsenen Personen, die mit
dem Tetanustoxoid geimpft wurden, hergestellt wurde. Dieser Serumpool
wurde willkürlich
eine Konzentration von 1 Einheit/ml des Antitoxins zugewiesen.
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Neutralisierende Anti-Diphtherie-Antikörper wurden
durch einen mikrometabolischen Inhibitionstest (Miyamura et al.,
J Biol Stand 2 (1974), 203–209;
Keeftenberg et al., J Biol Stand 13 (1985), 229–234) bestimmt. Kurz zusammengefasst,
50 μl von
seriellen zweifach Verdünnungen
von Testseren wurden in Vertiefungen einer „96-well" Gewebekulturplatte mit flachem Boden
(Katalognummer: 25861, Corning Laboratory Sciences, Corning, NY)
zugegeben. Diphtherietoxin (25 μl
einer 4fach Überschusskonzentration
der minimalen zytopatischen Dosis) wurde in allen Probenvertiefungen
zugegeben. VERO-Zellen (african green monkey kidney) wurden zugegeben
(25 μl von
150.000 Zellen/ml) und ein pH-Wert-Indikator wurde in das Zellkulturmedium
eingeschlossen. Die Zellen wurden bei 37°C für 7 Tage inkubiert, während der
Zeit, in der die Stoffwechsel tätigen
Zellen eine Verminderung des pH-Wertes auf < 7,20 zeigten, wobei die Stoffwechselaktivität der Diphtherie
vergifteten Zellen gehemmt ist und eine Senkung des pH-Wertes nicht
erfolgt. Antikörpertiter
wurden bestimmt durch die höchste
Serumverdünnung,
die einen pH-Wert von < 7,2
nach einer Inkubation von sieben Tagen ergab. Die Konzentrationen
der Anti-Diphtherie-Antikörper
der Testseren wurden in Einheiten/ml durch Vergleich mit der Antitoxin-Aktivität von Verdünnungen
eines bekannten U.S. Standardserums (Lot A52, von CBER, U.S. Nahrungsmittel-
und Arzneimittelverwaltung, U.S. Food and Drug Administration, Bethesda, MD, bereitgestellt)
zugewiesen, wobei diese zu den Testproben parallel untersucht wurden.
Es muss berücksichtigt werden,
dass eine Einheit von Anti-Diphtherietoxin-Antikörper und eine Einheit von Antit-Tetanustoxoid-Antikörper basierend
auf Gewicht oder Aktivität
nicht äquivalent
sind. Darum kann die Größe der jeweiligen
Antikörperkonzentrationen
nicht direkt miteinander verglichen werden.
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Statistische Analyse
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Frequenzdaten wurden unter Verwendung
des Chi-Quadrates oder des Fisher-Exact-Tests verglichen, wenn sie
durch erwartete kleine Frequenzen notwendig waren. Antikörperkonzentrationen
wurden logarithmisch umgewandelt und die geometrischen Mittelwerte
der Antikörperkonzentrationen
wurden durch die Untersuchung der Varianz verglichen. Für diese
Berechnungen wurden Antikörperkonzentrationen
mit weniger als das Minimum, das in der Untersuchung detektiert
wurde, Werte von 50% des Minimums zugewiesen (z. B. bei Anti-PRP-Antikörperkonzentrationen < 0,07 μg/ml, Anti-Tetanus-Antikörperkonzentrationen < 0,01 Einheiten/ml
und Anti-Diphtherie-Antikörperkonzentrtionen < 0,01 Einheiten/ml
wurden Werte von jeweils 0,035 μg/ml.
0,005 Einheiten/ml und 0,005 Einheiten/ml zugewiesen). Antikörperantworten
auf Konjugat- und DT/DTP-Impfungen von Kleinkindern in Minneapolis
und St. Louis wurden vereinigt, da es keine signifikanten statistischen
Unterschiede in den Ergebnissen zwischen den beiden Studienorten
gab.
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Ergebnisse
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Gegenreaktionen
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Die Impftherapien wurden gut vertragen.
Bei keinem der Kleinkinder gab es ernste Reaktionen, eingeschlossen
hypotensive/hyperresponsive Reaktionen, epileptische Anfälle, andauernde
Schreizwischenfälle, Temperaturen
von > 39,9°C. In den
vier Gruppen gab es Temperaturen von > 37,8°C
in 20% bis 33% der Kleinkinder nach Dosis 1 des DTP/Konjugats, 23%
bis 29% nach Dosis 2 und 21% bis 35% nach Dosis 3. Keine der jeweiligen
Unterscheide der Impfgruppen war signifikant (p > 0,10).
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Immunogenität
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Anti-PRP-Antikörperantworten
auf Konjugat-Impfung
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Tabelle 2 fasst die Effekte der Sensibilisierung
mit DT-Impfstoff im Alter von 1 Monat auf die Anti-PRP-Antikörperantworten
auf den Hib-Konjugat-Impfstoff, der im Alter von 2, 4 und 6 Monaten
gegeben wurde, zusammen. Vor der ersten Dosis des Konjugat-Impfstoffes
gab es keine signifikanten Unterschiede in den geometrischen Mittelwerten
der PRP-Antikörperkonzentrationen
der vier Gruppen. Bei Kleinkindern, denen die PRP-T, DT-Impfung im Alter
von 1 Monat gegeben wurde, stieg der geometrischen Mittelwert der
Anti-PRP-Antikörperantworten
auf das 2- bis 3fache nach jeder der drei Dosen des Konjugat-Impfstoffes im Vergleich
mit den jeweiligen geometrischen Mittelwerten der Antikörperantworten
der PRP-T geimpften Kleinkinder, die nicht mit DT sensibilisiert
wurden. Bei Kleinkindern, denen HbOC gegeben wurde, gab es ebenfalls
eine 2- bis 3fache Steigerung der Anti-PRP-Antikörperantwort in der DT-sensibilisierten
Gruppe im Vergleich zur nicht sensibilisierten Gruppe, allerdings
nur nach der Konjugat-Dosis 1 und 2 (Tabelle 2).
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Bei beiden Konjugat-Impfgruppen war
der Anteil der Kleinkinder, die auf die zweite Dosis des Konjugat-Impfstoffes
mit > 1 μg/ml eines
Anti-PRP-Antikörpers
reagierten, höher
bei DT-sensibilisierten Kleinkindern (HbOC: 38% gegen 4%, p < 0,01; PRP-T: 88%
gegen 67%, p = 0,10). Die entsprechenden Unterschiede waren nicht
signifikant unterschiedlich nach einer Dosis des Konjugat-Impfstoffes
(HbOC: 0% gegen 0%; PRP-T: 20% gegen 4%, p > 0,10); oder nach drei Dosen (HbOC: 86%
gegen 88%; PRP-T: 96% gegen 96%, p > 0,90).
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Sekundäre Immunantworten („memorv
antibody responses")
auf die PRP-Auffrischungsimpfun.
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Nicht konjugiertes PRP wurde im Alter
von 12 Monaten 74 der 94 Kleinkinder (79%) gegeben, welche die Konjugat-Impfung
vollständig
beendet hatten. 1 fasst
die jeweiligen geometrischen Mittelwerte der Antikörperkonzentrationen ± 2 SE
(95% Konfidenzinterval) in Seren zusammen, die unmittelbar vor und
1 Monat nach der Auffrischungsinjektion erhalten wurden. Unter den
Kleinkindern, die mit PRP-T geimpft wurden, betrug der geometrische
Mittelwert der Anti-PRP-Antikörperkonzentration
der DT sensibilisierten Gruppe 2,6 μg/ml unmittelbar vor der PRP-Auffrischung
gegen 1,6 μg/ml
bei den entsprechenden Kleinkindern, die kein DT erhalten hatten
(p = 0,11). Ein Monat nach der PRP-Auffrischung betrug der geometrische
Mittelwert der Antikörperkonzentration
26,4 μg/ml
in der DT sensibilisierten Gruppe gegen 8,6 μg/ml bei Kleinkindern, die kein DT
erhalten hatten (p = 0,01). Bei Kleinkindern, denen HbOC gegeben
wurde, gab es keine signifikanten Unterschiede in den jeweiligen
geometrischen Mittelwerten der Anti-PRP-Antikörperkonzentrationen zwischen DT
sensibilisierten und nicht sensibilisierten Kleinkindern vor der
PRP-Auffrischung (1,2 gegen 1,1 μg/ml)
oder 1 Monat nach PRP (6,0 gegen 8,8 μg/ml, p = 0,34).
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Anti-Diphtherie- und Anti-Tetanus-Antikörperantworten.
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Mit einer Ausnahme gab es keine signifikanten
Unterschieden im Alter von 2 Monaten in den jeweiligen geometrischen
Mittelwerten der Anti-D- oder Anti-T-Antikörperkonzentrationen der Kleinkinder,
die mit DT im Alter von 1 Monat geimpft wurden, und denen, die nicht
mit DT geimpft wurden (Tabelle 3 und 4). Die Ausnahme war, dass
Kleinkinder, die nach dem Zufallsprinzip aus der DT-sensibilisierten
Gruppe ausgewählt
wurden, um PRP-T zu erhalten, einen 2fach höheren geometrischen Mittelwert
der Anti-T-Antikörperkonzentration
hatten als die entsprechende, nicht sensibilisierte Gruppe (0,06
gegen 0,03 Einheiten/ml, p < 0,02).
Dieses Ergebnis könnte
zufällig
entstanden sein, da der entgegengesetzte Trend in den entsprechenden
Gruppen beobachtet wurden, die nachdem Zufallsprinzip ausgewählt wurden,
um HbOC zu erhalten (0,05 gegen 0,07 Einheitenlml, p > 0,10, Tabelle 3).
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DT-Sensibilisierung mit 1 Monat verstärkte die
Anti-D-Antikörperantworten
auf nachfolgende Injektionen von DTP und Konjugat, die mit 2, 4
und 6 Monaten gegeben wurden. Nach der ersten Impfung mit DTP/Konjugat
hatten die sensibilisierten Kleinkinder einen 1,5 bis 2fach höheren geometrischen
Mittelwert der Anti-D- und Anti-T-Antikörperkonzentrationen als der
jeweilige Mittelwert der nicht sensibilsierten Kleinkinder (p < 0,60); nach der
zweiten Impfung waren die jeweiligen geometrischen Mittelwerte der
sensibilisierten Kleinkinder 3- bis 5fach höher als die der nicht sensibilisierten
Kleinkinder (p < 0,001).
Nach der dritten DTP/Konjugat-Impfung trat eine Interaktion zwischen
dem spezifischen Konjugat-Impfstoff und der jeweiligen Anti-D- oder Anti-T
Antikörperantwort
auf. Die DT-sensibilisierten Kleinkinder, die mit PRP-T/DTP geimpft
wurden, hatten 2fach höhere
Anti-T-Antikörperkonzentrationen
als die nicht sensibilisierten Kleinkinder (p < 0,001), aber die jeweiligen Anti-D-Antworten
waren nicht signifikant unterschiedlich (p > 0,20). Im Gegensatz dazu hatten die sensibilsierten
Kleinkinder, die mit HbOC/DTP geimpft wurden, 2fach höhere Anti-D-Antikörperkonzentrationen
als die nicht sensibilisierten Kleinkinder (P < 0,01), aber die jeweiligen Anti-T-Antworten
waren nicht signifikant unterschiedlich (p > 0,24).
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BEISPIEL 2
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GRÖSSENAUSWAHL
DER IMMUNOGENEN OLIGOMERE
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Als ein Beispiel wird die Auswahl
des immunogenen Oligomers von Haemophilus influenzae Typ B beschrieben.
Nach der kontrollierten Säurehydrolyse
bei erhöhter
Temperatur umfassen die so erhaltenen Oligosaccharid-Herstellungen
Oligomere von unterschiedlicher Kettenlänge, von einzelnen bis relativ
langkettigen Oligomeren. 2 und 3 (Spur B) stellt die Heterogenität eines
solchen Hydrolysats dar. In dem dargestellten Fall wurde berechnet,
dass etwa die Hälfte
der Oligomerarten, in einem molaren Verhältnis, eine Zuckerkette mit
weniger als 5 Zuckenesten haben. Wenn ein solches Hydrolysat mit
einem Trägerprotein
konjugiert wird, wie zum Beispiel CRM-197, dann würden sie
wahrscheinlich ein Impfstoffprodukt herstellen, dass nur wenig immunogen
ist.
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Um die unerwünschten, kurzkettigen Arten
zu entfernen, haben wir ein chromatographisches Verfahren entwickelt,
dass ausgezeichnet die Trennung der langkettigen Zucker-Oligomere
von den kurzkettigen Arten erlaubt. Das entwickelte Verfahren beruht
auf die Verwendung einer spezifischen chromatographischen Matrix,
der Q-Sepharose-Fast-Flow, und definierten Konzentrationen von Salz
und Wasserstoffionen. Die geladene Salzkonzentration zur Entfernung
der Arten mit einem niedrigen Molekulargewicht kann zwischen 0,05 M
und 0,150 M betragen. Vorzugsweise wird Natriumchlorid verwendet.
Die Wasserstoffionenkonzentration sollte zwischen 10–5 – 10–8 M
betragen und Acetatsalze werden vorzugsweise verwendet. 4 und 3 (Spur F) zeigen das Profil der Arten
mit einem niedrigen Molekulargewicht, die nur wenig immunogen sind.
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Die Oligosaccharide, die zur Herstellung
des Impfstoffes verwendet werden sollen, werden mit einer Salzkonzentration
zwischen 0,25 M und 1,0 M eluiert, vorzugsweise mit Natriumchlorid.
Das chromatographische Profil dieser Arten mit einem höheren Molekulargewicht,
die zur Herstellung des Impfstoffes verwendet werden, ist in 5 dargestellt. Um weiter
zu bestärken,
dass unser chromatographisches Verfahren ein vollständig definiertes
Impfstoffprodukt bereitstellen kann, haben wir 3 verschiedene Herstellungen
analysiert und diese in 3,
Spuren C, D und E, gezeigt.
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Unter Verwendung einer massenspektroskopischen
Analyse haben wir bewiesen, dass unser Verfahren tatsächlich die
Arten mit einem geringeren Molekulargewicht entfernt und dass diese
die erwartete Kettenlänge
haben, wie in der massenspektrographische Analyse, die in Tabelle
5 beschrieben wird, gezeigt wird. Dieses Fraktionierungsverfahren
erlaubt die Fraktionierung und die spezifische Auswahl von Oligosacchariden von
1 bis 60 mg/ml des Matrixträgers.
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Die ausgewählten Oligosaccharid-Arten
können
mit dem Trägerprotein
CRM-197 unter Verwendung der nachstehend aufgelisteten Chemie konjugiert
werden (Costantino et al., Vaccine 10, 691–698).
- a)
Reduktive Animierung der ausgewählten
Oligosaccharide – Einbringen
einer primären
Aminogruppe an ihrem reduzierenden Ende;
- b) Transformation der Amino-Oligosaccharide in einen aktiven
Ester durch die Reaktion mit N-Hydroxysuccinimid-Di-Ester von Adipinsäure;
- c) Verknüpfung
der aktivierten Oligosaccharide mit CRM-197; und schließlich die
Reinigung des Konjugats zur Impfstoffherstellung
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Das hier beschriebene Verfahren wurde
erfolgreich bei Meningokokken C-Oligosaccharide eingesetzt und kann
selbstverständlich
bei allen Zuckerpolymeren angewendet werden, die eine negativ geladene
Einheit enthalten, wie z. B. Meningokokken A und B und andere. 6 zeigt die nur wenig immunogene
Natur von Men C-Oligosacchariden, die einen Polymerisationsgrad
von weniger als 4 haben.
