DE60037514T2 - Wässrige immunologische adjuvantzusammensetzungen aus monophosphoryllipid a - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Die Verbindungen Monophosphoryl Lipid A (MLA) und 3-O-deacyliertes Monophosphoryl Lipid A (3D-MLA) sind attenuierte Derivate des Lipid A-Bestandteils von bakteriellem Lipopolysaccharid (LPS). LPS und Lipid A sind wirkungsvolle Immunstimulanzien, die in Patienten, denen diese Verbindungen verabreicht werden, sowohl eine humorale Antikörperantwort als auch eine zellvermittelte Immunantwort induzieren. Lipid A und LPS können jedoch auch toxische Nebeneffekte wie Pyrogenizität und lokale Shwarzman-Reaktionen zeigen. MLA und 3D-MLA sind Lipid A-ähnliche Moleküle, die modifiziert worden sind, um die Toxizität von LPS abzuschwächen.
  • Wie Lipid A haben die MLA- und 3D-MLA-Moleküle ein Zuckergrundgerüst, an welches langkettige Fettsäuren angebracht sind. Das Grundgerüst besteht aus zwei glycosidisch verbundenen Zuckerringen mit sechs Kohlenstoffen. MLA und 3D-MLA sind an der Position 4 phosphoryliert. Fünf bis acht langkettige Fettsäuren (12-14 Kohlenstoffe) sind am Zuckergrundgerüst angebracht, was MLA und 3D-MLA zu sehr hydrophoben Molekülen macht, die nicht ohne Weiteres wasserlöslich sind.
  • Die attenuierten Lipid A-Derivate (ALDs) MLA und 3D-MLA werden als immunologische Adjuvanzien in prophylaktischen Vakzinen für infektiöse Erkrankungen und therapeutischen Vakzinen für die Behandlung von kanzerösen Tumoren und chronischen Infektionen verwendet.
  • WO 98/43670 offenbart eine wässrige Adjuvanszusammensetzung, die ein attenuiertes Lipid A-Derivat und ein Tensid umfasst. Das Derivat kann Monophosphoryl Lipid A oder 3'-O-deacyliertes Monophosphoryl Lipid A sein. Zu einem solchen Derivat wird gelöstes Tensid hinzugefügt, worauf das Lösungsmittel verdampft und Wasser zu dem resultierenden Film hinzugegeben wird. Eine Beschallung stellt eine klare Flüssigkeit bereit, die als Adjuvans verwendet wird.
  • S. Sasaki et al., Infect. Immun., 1997, 65(9): 3520–8 beschreiben die Auswertung der Wirksamkeit von Monophosphoryl Lipid A bei der Verstärkung der durch DNA-Impfung induzierten Immunität gegen HIV-1. Mäusen wurde eine immunogene DNA injiziert, die mit Monophosphoryl Lipid A, das in verschiedenen Trägerstoffen (in einer stabilen Emulsion oder einer wässrigen Formulierung) gelöst war, formuliert war.
  • WO 94/21292 offenbart Vakzinzusammensetzungen, die kleine Partikel von 3-O-deacyliertem Monophosphoryl Lipid A umfassen. Insbesondere liegt die Partikelgröße unter 120 nm.
  • GB-A-2220211 offenbart, dass modifizierte Lipopolysaccharide, insbesondere 3-O-deacyliertes Monophosphoryl Lipid A und 3-O-deacyliertes Diphosphoryl Lipid A, mittels alkalischer Hydrolyse unter kontrollierten Bedingungen bereitgestellt werden, die lediglich den β-Hydroxymyristinacylrest entfernen, der über eine Esterbindung an das Glucosamin an Position 3 des reduzierenden Endes gebunden ist.
  • EP-A-0 407 804 offenbart einen wasserlöslichen Metallocenkomplex, welcher als Zytostatikum eingesetzt werden kann und der durch Vermischen eines Metallocenkomplexes eines Polyols, Wasser und optional Additiven und anschließender Entfernung des Wassers erhalten werden kann, wobei die Polyole vorzugsweise Glykole, Zuckeralkohole oder Kohlenhydrate sind. Glycerin wird als Polyol erwähnt.
  • US-A-4 448 683 offenbart, dass eine hitzesensible terminale Desoxynukleotidyltransferase mittels Lyophilisierung einer Lösung des Enzyms stabilisiert werden kann. Die Lösung hat vor der Lyophilisierung einen sorgfältig kontrollierten pH, eine Ionenkonzentration von wenigstens 0,05 M und eine Proteinkonzentration von mehr als 0,3 g/l. Dieses US-Patent offenbart ebenfalls, dass die Lösung Glycerin enthalten kann, obwohl es nicht nötig ist, dass das Glycerin anwesend ist.
  • Die in den meisten Vakzinen enthaltenen Antigenpräparationen sind häufig komplizierte Mischungen wasserlöslicher Proteine, was es schwierig macht, das wasserunlösliche Adjuvans in einem auf Wasser basierenden Vakzin zu formulieren. Daher müssen MLA und 3D-MLA zunächst mit Lösungsmitteln vermischt werden, bevor sie zu der Antigenpräparation hinzugegeben werden. Die Gegenwart von Lösungsmitteln kann jedoch die Formulierung des Vakzins weiter verkomplizieren, und in einigen Fällen die Wirksamkeit seiner Bestandteile erniedrigen. Zudem können Lösungsmittel die Schleimhautoberflächen reizen, oder eine Entzündung an den Injektionsstellen verursachen. Eine einfache Formulierung von MLA oder 3D-MLA, die keine störenden Co-Lösungsmittel enthält, würde es erlauben, den maximalen Nutzen aus sowohl dem Adjuvans als auch dem Antigen in einer Vakzinzusammensetzung zu erzielen. Die vorliegende Erfindung befriedigt diesen Bedarf.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Bei der vorliegenden Erfindung handelt es sich um eine wässrige Formulierung eines attenuierten Lipid A-Derivats (ALD) und eines Tensids und Verfahren zu dessen Herstellung und Lagerung. Attenuierte Lipid A-Derivate, die gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sind, sind Monophosphoryl Lipid A (MLA) und 3-O-deacyliertes Monophosphoryl Lipid A (3D-MLA). Wässrige Formulierungen von MLA (MLA/AF) oder 3D-MLA (3D-MLA/AF) beseitigen den Bedarf an unerwünschten Lösungsmitteln oder an einem Co-Lösungsmittelsystem für die Vakzinherstellung. Die Erfindung stellt eine stabile wässrige Zusammensetzung von ALD, Glycerin und einem Tensid bereit, die, wenn sie mit einem Antigen an Mäuse verabreicht wird, die zelluläre und humorale Immunantwort des Tieres auf dieses Antigen verstärkt. Überraschenderweise induziert die wässrige Formulierung der vorliegenden Erfindung, wenn sie intranasal verabreicht wird, in immunisierten Tieren hohe Levels an Serum und von der Mucosa sezerniertem IgA. Eine Ausführungsform der beanspruchten wässrigen Zusammensetzung umfasst ein molares Verhältnis von MLA oder 3D-MLA zu Tensid von ungefähr 4:1 und hat eine Partikelgröße von ungefähr 50–70 nm. 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DPPC) ist ein bevorzugtes Tensid. Unerwarteterweise wird, wenn Glycerin vor der Lyophilisierung zu der vorliegenden wässrigen Formulierung hinzugegeben wird, die Zusammensetzung ohne zusätzliche Beschallung bei der Rekonstitution wiederhergestellt. Die erfolgreiche Lagerung der vorliegenden Zusammensetzung in einem lyophilisierten Zustand erlaubt die bequeme Lagerung und den bequemen Transport der wässrigen Formulierung oder Vakzinzusammensetzungen, die die Formulierung umfassen.
  • Ein Verfahren zur Herstellung der wässrigen Zusammensetzung wird offenbart. In einer Ausführungsform werden das ALD und das Tensid gelöst und gleichmäßig Ethanol beigemengt. Das Ethanol wird dann unter Zurücklassen eines Films evaporiert. Wasser wird zu dem Film hinzugegeben. Das ALD und das Tensid werden mittels Beschallung im Wasser suspendiert. Die Suspension wird beschallt, bis sie klar ist. Glycerin wird in einer Menge von 2% bis 40% (V/V) hinzugegeben und die Zusammensetzung wird lyophilisiert. Tiere, denen die beanspruchte Zusammensetzung mit einem Antigen verabreicht wird, zeigen verstärkte humorale und zelluläre Immunantworten auf das Antigen. Verfahren zur Verwendung der Zusammensetzung, um diese Antworten zu verstärken, werden ebenfalls offenbart und beansprucht.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1a–d zeigt die Antikörpertiter von Mäusen, denen Tetanustoxoid-(TT)-Antigen in einer 3-O-deacylierten Monophosphoryl Lipid A-wässrigen Formulierung(3D-MLA/AF) ★ oder Tetanustoxoid-Antigen in Kochsalzlösung ⟡ verabreicht wurde. 1a zeigt die Gesamt-IgG-Antikörpertiter von Mäusen, denen das Tetanustoxoidantigen verabreicht wurde. 1b zeigt die IgG2a-Antikörpertiter von Mäusen, denen das Tetanustoxoidantigen verabreicht wurde. 1c zeigt die IgG2b-Antikörpertiter von Mäusen, denen das Tetanustoxoidantigen verabreicht wurde und 1d zeigt die IgG1-Antikörpertiter für die Tiere.
  • 2 zeigt die proliferative T-Zellantwort in Mäusen, die mit einem aufgereinigten Proteinderivat immunisiert wurden. Die proliferativen Antworten in Mäusen, denen Tetanustoxoid in 3D-MLA/AF ★ verabreicht wurde und Normalkontrollen ⟡ werden 14 Tage nach der ersten Vakzinierung gezeigt.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine wässrige Adjuvansformulierung eines attenuierten Lipid A-Derivats (ALD). Das ALD und ein Tensid werden mit einem molaren Verhältnis von ungefähr 4:1 in Wasser suspendiert und beschallt, um eine Suspension zu erhalten, die eine Partikelgröße von ungefähr 50 bis 70 nm aufweist.
  • In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung kann ein attenuiertes Lipid A-Derivat in eine wässrige Zusammensetzung formuliert werden, die ebenfalls ein oder mehrere nicht-immunostimulatorische Tenside und Glycerin umfasst, um ein wirkungsvolles Adjuvans bereitzustellen. Ein attenuiertes Lipid A-Derivat ist eine Lipid A-ähnliche Verbindung, die die vorteilhaften immunstimulatorischen Eigenschaften von Lipid A zeigt, jedoch weniger der nachteiligen Nebeneffekte dieser Verbindung aufweist. Monophosphoryl Lipid A (MLA) und 3-O-deacyliertes Monophosphoryl Lipid A (3D-MLA) sind die ALDs und sind wirkungsvolle Immunstimulanzien, doch sind sie überraschenderweise weniger toxisch als Lipid A. Sowohl MLA als auch 3D-MLA können in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden und sind bekannt und müssen hier nicht im Detail beschrieben werden. Siehe z. B. US-Patent Nr. 4,436,727 , erteilt am 13. März 1984, im Namen von Ribi ImmunoChem Research Inc., welches Monophosphoryl Lipid A und dessen Herstellung offenbart. US-Patent Nr. 4,912,094 und Re-Examinierungs-Zertifikat B1 4,912,094 an Myers et al., ebenfalls im Namen von Ribi Immuno Chem Research, Inc. offenbaren 3-O-deacyliertes Monophosphoryl Lipid A und Verfahren zu dessen Herstellung.
  • Ohne auf die Einzelheiten der früheren Patente einzugehen, wird Monophosphoryl Lipid A (MLA), wie hier verwendet, von Lipid A abgeleitet, einem Bestandteil von enterobakteriellen Lipopolysacchariden (LPS), einem wirkungsvollen, jedoch hoch toxischen Immunsystemmodulator. Edgar Ribi und seine Mitarbeiter bewerkstelligten die Herstellung von Monophosphoryl Lipid A (MLA), das anfänglich als aufgereinigtes entgiftetes Endotoxin bezeichnet wurde. MLA wird durch Erwärmen im Rückfluss eines Endotoxinextrakts (LPS oder Lipid A), das aus Heptose-losen Mutanten Gram-negativer Bakterien erhalten worden ist, in Mineralsäurelösungen moderater Stärke (z. B. 0,1 N HCl) für eine Zeitdauer von ungefähr 30 Minuten produziert. Diese Behandlung führt zum Verlust der Phosphateinheit an Position 1 des Glucosamins am reduzierenden Ende.
  • Gleichzeitig wird während dieser Behandlung das zentrale Kohlenhydrat an Position 6 des nicht-reduzierenden Glucosamins entfernt. Das resultierende Produkt (MLA) weist einen erheblich attenuierten Grad der endotoxischen Aktivitäten, wie Pyrogenizität, lokale Shwarzman-Reaktivität und wie im Hühner-Embryo 50%-Lethaldosisassay (CELD50) ausgewerteter Toxizität auf, als normalerweise mit dem Endotoxin-Ausgangsmaterial in Verbindung gebracht wird. Jedoch behält es unerwarteterweise die Funktionalität von Lipid A und LPS als Immunmodulator bei.
  • Ein anderes attenuiertes Lipid A-Derivat, das bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, wird als 3-O-deacyliertes Monophosporyl Lipid A (3D-MLA) bezeichnet. 3D-MLA ist bekannt, wie in US-Patent Nr. 4,912,094 , Re-Examinierungs-Zertifikat B1 4,912,094 (das '094-Patent) dargelegt, und unterscheidet sich von MLA darin, dass vom MLA-Molekül der β-Hydroxymyristinacylrest, der über eine Esterbindung mit dem Glucosamin am reduzierenden Ende an Position 3 verbunden ist, unter Bedingungen, die die anderen Gruppen nicht benachteiligen, selektiv entfernt worden ist. 3-O-deacyliertes Monophosphoryl Lipid A ist von Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Montana 59840 erhältlich.
  • Die MLA- und 3D-MLA-Moleküle sind eine Zusammensetzung oder Mischung einer Anzahl von Fettsäure-Substitutionsmustern, d. h. Heptaacyl, Hexaacyl, Pentaacyl etc., mit variierender Länge der Fettsäurekette. Daher sind diese verschiedenen Formen von MLA und 3D-MLA von dieser Erfindung eingeschlossen. Weiterhin sind Mischungen von Formen einer Verbindung sowie von individuellen Verbindungen, die mittels synthetischer oder halb synthetischer Mittel erzeugt wurden, von dieser Erfindung umfasst. Das Lipid A-Grundgerüst, das im -094-Patent illustriert ist, korrespondiert zu dem Produkt, das durch 3-Deacylierung des Heptaacyl Lipid A aus S. minnesota R 595 erhalten wird. Andere Fettsäure-Substitutionsmuster werden von dieser Offenbarung umfasst; das essentielle Merkmal ist, dass das Material 3-O-deacyliert ist.
  • Das in der vorliegenden Erfindung verwendete modifizierte 3D-MLA wird durch Aussetzen von MLA an alkalische Hydrolyse unter Bedingungen hergestellt, die im Verlust aller bis auf einer einzelnen Fettsäure an Position 3 des Lipid A-Grundgerüsts resultieren. Die β-Hydroxymyristinfettsäure an Position 3 ist in alkalischem Medium ungewöhnlich labil. Für eine komplette 3-Deacylierung von Lipid A bedarf es lediglich einer sehr milden alkalischen Behandlung. Die anderen Esterbindungen im Lipid A benötigen etwas stärkere Bindungen bevor die Hydrolyse stattfindet, so dass es möglich ist, diese Materialien selektiv an Position 3 zu deacylieren, ohne den Rest des Moleküls signifikant zu beeinflussen. Der Grund für diese ungewöhnliche Sensitivität der Esterverbundenen β-Hydroxymyristinfettsäure an Position 3 gegenüber alkalischem Medium ist zu dieser Zeit noch nicht bekannt.
  • Obwohl alkalische Hydrolyseprozeduren bekannt sind, ist es wichtig, Bedingungen auszuwählen, die keine weitergehende Hydrolyse über die Esterbindung zu der β-Hydroxymyristinfettsäure an Position 3 hinaus verursachen. Im Allgemeinen kann die Hydrolyse in wässrigem oder organischem Medium durchgeführt werden. Im letzteren Fall schließen die Lösungsmittel Methanol (Alkohole), Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylformamid (DMF), Chloroform, Dichlormethan und ähnliche, sowie Mischungen davon ein. Kombinationen von Wasser und einem oder mehreren der genannten organischen Lösungsmittel können ebenfalls eingesetzt werden.
  • Die alkalische Base kann aus verschiedenen Hydroxiden, Carbonaten, Phosphaten und Aminen ausgewählt werden. Beispielhafte Basen schließen die anorganischen Basen, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat, Natriumbicarbonat, Kaliumbicarbonat und ähnliche, und organische Basen wie Alkylamine ein, und schließen Diethylamin, Triethylamin und ähnliche ein, ohne darauf beschränkt zu sein.
  • In wässrigem Medium liegt der pH typischerweise zwischen ungefähr 10 und 14, wobei ein pH von ungefähr 12 bis ungefähr 13,5 der bevorzugte Bereich ist. Die Hydrolysierungsreaktion wird typischerweise bei einer Temperatur von ungefähr 20°C bis ungefähr 80°C, vorzugsweise ungefähr 50°C bis 60°C für eine Zeitdauer von ungefähr 10 bis ungefähr 30 Minuten ausgeführt. Die Hydrolyse kann z. B. in 3% Triethylamin in Wasser bei Raumtemperatur (22° bis 25°C) für eine Zeitdauer von 48 Stunden durchgeführt werden. Die einzige Voraussetzung bei der Auswahl der Temperatur und der Zeit der Hydrolyse ist, dass Deacylierung auftritt, um lediglich die β-Hydroxymyristinfettsäure an Position 3 zu entfernen.
  • In der Praxis hat sich gezeigt, dass ein besonders wünschenswertes Hydrolyseverfahren das Lösen von Lipid A oder Monophosphoryl Lipid A in Chloroform:Methanol 2:1 (V/V), das Sättigen dieser Lösung mit einem wässrigen Puffer, bestehend aus 0,5 M Na2CO3 bei pH 10,5 und darauf folgender Blitzevaporierung des Lösungsmittels bei 45° bis 50°C unter Vakuum oder mittels eines Aspirators (ungefähr 100 mm Hg) involviert. Das resultierende Material ist selektiv an Position 3 deacyliert. Dieser Prozess kann ebenfalls mit jeder der oben aufgelisteten anorganischen Basen durchgeführt werden. Die Zugabe eines Phasentransferkatalysators, wie Tetrabutylammoniumbromid, zu der organischen Lösung vor der Sättigung mit dem wässrigen Puffer, kann in einigen Fällen wünschenswert sein.
  • Bei der Herstellung der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird das attenuierte Lipid A-Derivat (ALD) im Allgemeinen mit dem Tensid kombiniert, wobei jedes in einem Lösungsmittel gelöst ist. Das Lösungsmittel wird unter Zurücklassen eines Films evaporiert. Zu dem Film wird Wasser hinzugegeben und die resultierende Suspension wird unter Erhitzung beschallt, bis sie klar ist. Die endgültige Suspension hat eine Partikelgröße von ungefähr 40 bis 150 nm und vorzugsweise von ungefähr 50 bis ungefähr 70 nm.
  • Das ALD und das Tensid werden bei einem molaren Verhältnis von ungefähr 10 Teilen ALD zu von ungefähr 1 Teil bis ungefähr 5 Teilen Tensid kombiniert. Vorzugsweise werden die Bestandteile in einem molaren Verhältnis von ungefähr 4 Teilen ALD zu 1 Teil Tensid kombiniert. Tenside, die für die Verwendung in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen werden, sind nicht-immunstimmulatorisch oder nicht-reaktiv und zeigen eine geringe oder keine unabhängige biologische Aktivität. Wie hier verwendet, bedeuten die Begriffe nicht-immunstimulatorisch und nicht-reaktiv, dass die Tenside eine geringe oder keine nennenswerte biologische Aktivität oberhalb der von Nicht-Immun-Kontrollen zeigen. Nicht-immunstimulatorische Tenside, die gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schließen Gallensalze, natürliche Phospholipide und Sphingolipide ein, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Gallensalze wie Glycodeoxycholat und Deoxycholat sind in den beanspruchten Zusammensetzungen als Tenside nützlich. Andere geeignete Tenside schließen Sphingolipide, wie Sphingomyelin und Sphingosin, und Phospholipide, wie Ei-Phosphatidylcholin, 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin, L-α-Phosphatidylethanolamin und 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin oder Mischungen davon ein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Phospholipid 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DPPC) das Tensid. DPPC ist für die Verwendung beim Menschen anerkannt und ist besonders wirksam, wenn die Formulierung intranasal verabreicht wird.
  • Das ALD und das Tensid werden in einem Lösungsmittel gelöst und gründlich vermischt. Wässrige oder organische Lösungsmittel, die gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schließen Chloroform, Alkohole (z. B. Ethanol), Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylformamid (DMF) und ähnliche sowie Mischungen davon ein.
  • Das Lösungsmittel wird unter Zurücklassen eines Films aus der Mischung aus ALD und Tensid evaporiert. Wasser wird zu dem Film hinzugegeben, und die resultierende Suspension wird unter Erhitzung beschallt, bis sie klar ist. Es wird bevorzugt, dass die Suspension in einem Wasserbad-Beschaller beschallt wird. Die Wasserbadtemperatur kann von 40°C bis 80°C reichen und ist vorzugsweise ungefähr 60°C. Die Suspension kann für Zeiträume von 5 Minuten bis ungefähr 1 Stunde beschallt werden, bis sie klar ist. Die Zeiträume der Beschallung werden abhängig von dem Volumen und der Konzentration der Suspension variieren, sie können jedoch einfach vom Fachmann bestimmt werden. Die endgültige Suspension hat eine Partikelgröße von ungefähr 40 bis 150 nm und vorzugsweise von ungefähr 50 bis ungefähr 70 nm.
  • Die wässrige Formulierung der vorliegenden Erfindung kann für den Versand und die Lagerung lyophilisiert werden. Überraschenderweise kann die Zusammensetzung, wenn sie in der Gegenwart von Glycerin lyophilisiert wird, ohne zusätzliche Beschallung rekonstituiert werden. Das Vorhandensein von Glycerin in der Zusammensetzung bei ungefähr 2 Vol.-% bis ungefähr 40 Vol.-% und vorzugsweise von ungefähr 2 bis ungefähr 10 Vol.-% erlaubt es, dass die lyophilisierte Zusammensetzung auf die Zugabe von Wasser hin wiederhergestellt werden kann. Die Möglichkeit, die wässrige Formulierung durch simple Hinzugabe von Wasser auf ihre ursprüngliche Partikelgröße zu rekonstituieren, ist ein deutlicher Vorteil für die Vakzinierung im praktischen Einsatz ohne Laborausstattung. Weitere Vorteile neben der Möglichkeit, die vorliegende Zusammensetzung in lyophilisierter Form zu versenden, schließen erniedrigte Ladegewichte, kein Erfordernis für Kühlung und eine erhöhte Stabilität ein. Es wird angenommen, dass die in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung vorhandenen ALDs in diesem lyophilisierten Zustand vor Hydrolyse geschützt sind. Zusätzlich kann die Konzentration an ALD, das dem zu Impfenden verabreicht wird, mittels Einstellung des Volumens für die Rekonstitution verändert werden. Zum Beispiel können 10 ml einer Zusammensetzung, die 1 mg/ml an ALD enthalten, lyophilisiert und mit 1 ml an Wasser rekonstituiert werden, um wässrige Zusammensetzungen mit 10 mg/ml ALD zu ergeben. Während der Lyophilisierung stabilisiert Glycerin außerdem die Proteinantigene, die in den Vakzinzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung vorhanden sind. Andere Komponenten, die verwendet werden könnten, um die vorliegenden Zusammensetzungen für die Lyophilisierung zu stabilisieren, schließen Polypropylenglykol, Polyethylenglykol oder andere Polyalkohole ein, die für die parenterale Verwendung angemessen sind, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.
  • Eine wirkungsvolle Menge der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird an ein warmblütiges Tier zusammen mit einem Antigen verabreicht, um die Immunantwort des Tiers auf dieses Antigen zu verstärken. Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verstärkt sowohl die humorale Immunantwort als auch die zelluläre Immunantwort eines Tiers auf ein Antigen. Die Menge des zu verabreichenden Antigens, um die gewünschte Antwort hervorzurufen, kann einfach vom Fachmann bestimmt werden, und hängt vom Typ des verabreichten Antigens, von der Verabreichungsroute und dem Immunisierungsplan ab. Zum Beispiel rufen 0,1 μg an Tetanustoxoid, welches zusammen mit der beanspruchten Zusammensetzung in zwei Immunisierungen im Abstand von 21 Tagen subkutan an eine Maus verabreicht wurde, eine humorale Immunantwort auf dieses Antigen hervor. Bei intranasaler Verabreichung stimulieren die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung und das Antigen die Produktion von zytotoxischen T-Lymphozyten. Hepatitis B-Oberflächenantigen (2,5 μg), das intranasal an den Tagen 0 und 21 in der beanspruchten Zusammensetzung verabreicht wurde, stimulierte die Produktion von zytotoxischen T-Lymphozyten in immunisierten Tieren. Weiterhin ist die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung insbesondere wirksam für das Hervorrufen einer IgA-Antwort in immunisierten Tieren, wenn diese intranasal verabreicht wird. Mäusen, denen 0,5 bis 12,5 μg an Tetanustoxoid in einer wässrigen Formulierung von 3-O-deacyliertem Monophosphoryl Lipid A (3D-MLA/AF) verabreicht wurden, zeigten erhöhte IgA- Titer für dieses Antigen. Eine wirksame Menge der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist diejenige Menge, die eine Immunantwort stimuliert oder verstärkt. Zum Beispiel kann eine wirksame Menge der beanspruchten Zusammensetzung von 1 bis ungefähr 250 Mikrogramm und vorzugsweise von ungefähr 25 bis ungefähr 50 Mikrogramm an attenuiertem Lipid A-Derivat enthalten, was auf der Verabreichung an einen typischen 70 kg schweren erwachsenen Patienten beruht.
  • Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um sowohl die Zusammensetzung als auch die Verfahren der vorliegenden Erfindung weiterhin zu illustrieren, diese jedoch nicht einzuschränken. Die hier präsentierten Mausmodelle sollen als stellvertretend für warmblütige Tiere verstanden werden und sie korrelieren in vernünftiger Weise mit den Ereignissen für andere warmblütigen Tiere, einschließlich des Menschen. Alle Prozentangaben sind Gew.-% und alle Lösungsmittel-Mischungsverhältnisse sind auf das Volumen bezogen, wenn nicht anderweitig angegeben.
  • Beispiel 1 – Herstellung einer wässrigen Formulierung eines attenuierten Lipid A-Derivats
  • Eine wässrige Präparation von 3-O-deacyliertem Monophosphoryl Lipid A (3D-MLA/AF) gemäß der vorliegenden Erfindung, umfassend 1000 μg/ml 3D-MLA (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Montana 59840), eine attenuierte Form von Lipid A aus Salmonella minnesota R 595 und 118 μg/ml 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DPPC) wurde in Wasser für Injektionszwecke wie folgt hergestellt:
    Eine DPPC-Lösung wurde mit einer Konzentration von 4 mg/ml in Ethanol hergestellt und gevortext, bis diese klar war. Ein Aliquot von 2,7 ml der DPPC-Lösung wurde in ein Fläschchen gegeben, das 100 mg lyophilisiertes 3D-MLA enthielt, und vorsichtig geschwenkt, um das 3D-MLA zu befeuchten. Das Ethanol wurde mittels vorsichtigen Einblasens eines Stroms von gefiltertem Stickstoff in das Fläschchen entfernt. Wasser für Injektionszwecke (91,7 ml) wurde zu dem Fläschchen hinzugegeben, das dann verschlossen, versiegelt und in einem Labline 9303-Wasserbad-Beschaller aufgehängt wurde. Die Suspension wurde für 10 Minuten bei 60°C beschallt, bis sie klar war. Die resultierende wässrige Formulierung enthielt Partikel von 70 nm, wie mittels eines PSC100-Spektrometers von Malvern Instruments gemessen, und wurde durch einen 0,2 μm Filter sterilfiltriert.
  • Beispiel 2 – Lyophilisierung und Rekonstitution der wässrigen Formulierung
  • Zwei Prozent Glycerin wurden zu einer wie in Beispiel 1 hergestellten wässrigen Formulierung von MLA hinzugegeben. Die Mischung wurde in Fläschchen mit Volumina von 1 bis 10 ml aliquotiert. Die Fläschchen wurden in einem Lyophilisator mit einer Einlegbodentemperatur von –45°C eingefroren. Nach 2 Stunden wurden der Kondensator und das Vakuum eingeschaltet und die Einlegbodentemperatur wurde auf –10°C eingestellt. Die Einlegbodentemperatur wurde nach 48 Stunden auf +10°C geändert und bei dieser neuen Temperatur für 24 Stunden gehalten. Die Einlegbodentemperatur wurde dann für abschließende 24 Stunden auf +25°C eingestellt. Nach der Lyophilisierung wurden die Fläschchen mit 1 ml Wasser für Injektionszwecke (WFI) rekonstituiert. Die Rekonstitution wurde mittels Schwenkens des Wassers in den Fläschchen durchgeführt. Alle Fläschchen waren klar ohne sichtbares Präzipitat. Teile der konzentrierten Formulierungen wurden vor der Bestimmung der Partikelgröße in WFI verdünnt, um eine endgültige Lösung von 1 mg/ml zu erhalten. Tabelle 1 Konz. der Formulierung
    Menge im Fläschchen (ml) nach Rekonstituierung Partikelgröße (nm)
    vor Lyophilisierung 83,5
    1 ml 1 mg/ml MLA 71,9
    2 ml 2 mg/ml MLA 71,1
    3 ml 3 mg/ml MLA 71,0
    4 ml 4 mg/ml MLA 71,4
    5 ml 5 mg/ml MLA 75,9
    6 ml 6 mg/ml MLA 79,4
    7 ml 7 mg/ml MLA 70,4
    8 ml 8 mg/ml MLA 74,4
    9 ml 9 mg/ml MLA 74,6
    10 ml 10 mg/ml MLA 80,7
  • Tabelle 1 zeigt, dass die wässrige Formulierung der vorliegenden Erfindung nach Lyophilisierung durch die Zugabe von Wasser wieder auf ihre ursprüngliche Partikelgröße zurückgeführt wird.
  • Beispiel 3 – Stimulierung einer Antikörperantwort
  • Mäuse, die mit Tetanustoxoid (TT) in der wässrigen Formulierung der vorliegenden Erfindung immunisiert worden waren, erzeugten Tetanustoxoidspezifische Antikörper. Der TT-spezifische Gesamt-IgG-Titer und die IgG-Isotypen (2a, 2b, 1)-Titer wurden mittels Enzym-gekoppeltem Immunabsorptionstest (ELISA) in den Seren von Mäusen nach der Immunisierung gemessen.
  • Weibliche ICR-Mäuse wurden mit einer Dosis des Vakzins, enthaltend 0,1 μg an Tetanustoxoid (TT) + 50 μg 3D-MLA/AF oder 0,1 μg TT in Kochsalzlösung immunisiert. 3D-MLA/AF wurde wie in Beispiel 1 hergestellt. Die Vakzine wurden mittels subkutaner Injektion an den Tagen 0 und 21 verabreicht. Das Serum wurde 14 Tage nach der sekundären Immunisierung gesammelt und mittels Standard-ELISA-Techniken getestet, um die relativen Mengen an Tetanus-Toxoid-spezifischem Antikörper der IgG1-, IgG2a- und IgG2b-Isotpyen sowie das Gesamt IgG zu bestimmen.
  • 1 zeigt den Tetanustoxoid-spezifischen Antikörpertiter, der durch 3D-MLA/AF erzeugt wurde. 3D-MLA/AF stimuliert, wenn es mit dem Tetanustoxoidantigen verabreicht wird, in immunisierten Tieren die Produktion von IgG-Antikörper und stimuliert insbesondere aktiv die IgG2a-Produktion.
  • Beispiel 4 – Stimulierung der Zellproliferation
  • Mäuse, die mittels Immunisierung mit der Adjuvanszusammensetzung der vorliegenden Erfindung und aufgereinigtem Proteinderivat (PPD) (Tuberkulin) vorbereitet worden waren, zeigten in vitro eine proliferative Antwort, wenn Milzzellen mit diesem Antigen behandelt wurden.
  • Weibliche BALB/c-Mäuse wurden mittels subkutaner Injektion einer Dosis von Vakzinen immunisiert, die 50 μg PPD + 50 μg 3D-MLA/AF enthielten. 3D-MLA/AF wurde wie in Beispiel 1 hergestellt. Milzzellen wurden 14 Tage nach der Immunisierung geerntet und als eine Quelle für Lymphozyten in einem Proliferationsassay verwendet. Die Milzzellen wurden für 96 Stunden in Mikrotiter-Wells bei einer Konzentration von 106 Zellen/ml in Medium kultiviert, das 0,1, 1 oder 10 μg PPD/ml enthielt. Während der letzten 24 Stunden der Inkubation wurde Tritium-markiertes Thymidin zu den Kulturen hinzugefügt. Die Zellen wurden auf Glasfaserfiltern geerntet, und der Tritiumeinbau wurde bestimmt. Die Stimulierungsindizes wurden durch Teilen der Counts per Minutes (CPM) der PPD stimulierten Zellen durch den CPM der lediglich in Medium kultivierten Zellen bestimmt. Die resultierenden Daten werden in 2 gezeigt.
  • Beispiel 5 – Stimulierung einer zytotoxischen T-Lymphozytenantwort
  • Die Induktion einer zytotoxischen T-Lymphozytenantwort nach Verabreichung der wässrigen Adjuvanszusammensetzung der vorliegenden Erfindung und eines Proteinantigens wurde mittels eines Zytotoxizitätsassays bestimmt. Gruppen von C57/BL/6-Mäusen wurde eine primäre subkutane (Inguinalregion) Immunisierung mit 25 μg Ovalbumin (OVA), das in 3D-MLA/AF formuliert war, verabreicht. 3D-MLA/AF wurde wie in Beispiel 1 hergestellt. Das injizierte Volumen betrug 200 μl. Einundzwanzig Tage später wurden drei Mäuse pro experimenteller Gruppe getötet, die Milzen entfernt, als Einzelzellsuspensionen vereinigt und ausgezählt.
  • Die Milzzellen (75 × 106 Zellen in 3 bis 4 ml Medium) aus den experimentellen Gruppen wurden in einem 25 cm2 T-Kolben platziert. Als Nächstes wurden 1,0 ml bestrahlter (20.000 rads) E.G7 (OVA)-Zellen bei 5 × 106/ml zu dem Kolben hinzugegeben. Das Volumen wurde auf 10 ml eingestellt. Die Kulturen wurden durch aufrechte Platzierung der T-Kolben in einem 37°C, 5% CO2-Inkubator für 4 Tage gehalten. Am Tag 4 wurden die überlebenden Zellen aus dem Kolben geerntet, einmal gewaschen, in 5,0 ml resuspendiert und ausgezählt.
  • Die gewonnenen Effektorzellen wurden auf 5 × 106 lebensfähige Zellen/ml eingestellt und 100 μl Volumina wurden dreifach unter Verwendung von 100 μl/Well an Medium als Verdünnungsmittel in den Wells von 96-Well-Platten mit Rundboden (Corning 25850) seriell verdünnt. Als Nächstes wurden 100 μl Volumina an 51Cr-markierten (siehe unten) Zielen [E.G7 (OVA)-eine mit dem Ovalbumingen transfizierte EL-4-Zelllinie] bei 1 × 105 Zellen/ml zu den Wells hinzugegeben. Die spontanen-Freisetzungs (SR)-Wells enthielten 100 μl der Ziele und 100 μl an Medium. Die maximalen-Freisetzungs (MR)-Wells enthielten 100 μl der Ziele und 100 μl Detergens (2% Tween 20). Die Effektor/Ziel (E/T)-Verhältnisse lagen bei 50:1, 25:1, 12,5:1, 6,25:1. Die Platten wurden bei 400 × g zentrifugiert und bei 37°C, 5% CO2 für 4 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Überstände der Wells unter Verwendung eines Skatron-Überstands-Sammelsystems gesammelt.
  • Prozent der spezifischen Lyse =
    Figure 00130001
  • Die Zielzellen, E.G7 (OVA), wurden mit 51Cr (Natriumchromat) wie folgt markiert. In einem Gesamtvolumen von 1,0 ml wurden in einem 15 ml-konischen Reaktionsgefäß 5 × 106 Zielzellen und 250 μCi 51Cr vermischt. Die Zellsuspensionen wurden für 90 min in einem 37°C Wasserbad unter vorsichtigem Mischen nach je 15 min inkubiert. Nach der Inkubation wurden die markierten Zellen dreimal mittels Zentrifugation und Dekantieren mit 15 ml Volumina an Medium gewaschen. Nach der dritten Zentrifugation wurden die Zellen in 10 ml frischem Medium resuspendiert, es wurde ihnen erlaubt, für 30 min bei Raumtemperatur zu verbleiben und sie wurden zentrifugiert. Die Zellen wurden schließen in Medium bei 1 × 105 Zellen/ml resuspendiert. Die Resultate des Zytotoxizitätsassays werden in Tabelle 2 präsentiert. Tabelle 2
    % Zytotoxizität (51Cr-Freisetzung)
    Effektor:Ziel-Verhältnis
    Material 50:1 25:1 12,5:1 6,25:1
    PBS* 13 10 7 2
    3DS-MLA/AF 61 60 59 45
    Nicht-immune Milzzellen 8 4 2 2
    • * phosphatgepufferte Kochsalzlösung
  • Beispiel 6 – Stimulierung einer Antikörperantwort durch intranasale Verabreichung der wässrigen ALD-Formulierung
  • Mäusen, denen Tetanus-Toxoid (TT) in 3D-MLA/AF intranasal verabreicht worden war, produzierten IgA-Titer, die sowohl im Serum als auch den Fäkalextrakten detektierbar waren. Weiterhin produzierte die intranasale Verabreichung der wässrigen Formulierung der vorliegenden Erfindung und TT hohe Titer der IgG-Isotypen IgG2a und IgG2b.
  • Gruppen von ICR-Mäusen wurden intranasal 0,5, 2,5, 10 oder 12,5 μg Tetanustoxoid in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), oder zu 25 μg 3D-MLA/AF hinzugemischt, verabreicht. 3D-MLA/AF wurde wie in Beispiel 1 hergestellt. Die Mäuse wurden an Tag 0 vorbereitet, an Tag 10 (d10P1°) wurde Blut entnommen, an Tag 14 geboostet, an Tag 24 (d10P2°) wurde Blut entnommen, an Tag 28 geboostet, an Tag 38 (d10P3°) wurde Blut entnommen.
  • Ein ELISA für IgG- und IgA-spezifische Anti-Tetanustoxoid-Antikörper wurde mit den vereinigten Seren aus jeder Blutentnahme durchgeführt. Die Fäkalextrakte wurden an Tag 22 (d7P2°) untersucht. Die IgG- und IgA-Titer der Seren und Fäkalextrakte der immunisierten Mäuse werden in Tabellen 3 bis 6 gezeigt. Tabelle 3
    Serum Anti-Tetanustoxoid-Titer–1
    IgG-spezifisch IgA-spezifisch
    Vakzin* Route d10P1° d10P2° d10P3° d10P1° d10P2° d10P3°
    0,5 μg TT + PBS IN 200 400 25.600 < 200 < 200 < 200
    2,5 μg TT + PBS IN 400 51.200 25.600 < 200 < 200 < 200
    12,5 μg TT + PBS IN 3.200 51.200 102.400 < 200 200 400
    0,5 μg TT + 3D-MLA/AF IN 12.800 > 409.600 > 409.600 < 200 800 6.400
    2,5 μg TT + 3D-MLA/AF IN 51.200 > 409.600 > 409.600 < 200 12.800 25.600
    12,5 μg TT + 3D-MLA/AF IN 102.400 > 409.600 > 409.600 < 200 25.600 102.400
    0,5 μg TT + PBS SQ 800 204.800 409.600 < 200 < 200 < 200
    • *n = 4
    Tabelle 4 IgG-Isotypanalyse des Serums aus den d10P3°-Blutentnahmen der Tabelle 3
    Anti-Tetanustoxoid-Titer–1
    Vakzin Route IgG1 IgG2a IgG2b
    0,5 μg TT + PBS IN 25.600 6.400 25.600
    2,5 μg TT + PBS IN 51.200 3.200 25.600
    12,5 μg TT + PBS IN 204.800 12.800 51.200
    0,5 μg TT + 3D-MLA/AF IN 819.200 409.600 819.200
    2,5 μg TT + 3D-MLA/AF IN > 819.200 819.200 > 819.200
    12,5 μg TT + 3D-MLA/AF IN > 819.200 > 819.200 > 819.200
    0,5 μg TT + PBS SQ 819.200 6.400 25.600
    Normale Mausseren - < 400 < 400 < 400
    Tabelle 5
    Serum-Anti-Tetanustoxoid-Titer–1
    IqG-spezifisch IqA-spezifisch Fäkalextrakt
    d7P2°
    Vakzin Route d1022° d10P3° d10P2° d10P3° IgG IgA
    TT* + 3D-MLA/AF/PBS IN > 102.400 >> 102.400 6.400 25.600 < 50 1.600
    TT + DPPC/PBS IN 6.400 6.400 100 200 < 50 < 50
    TT + 3D-MLA/AF/PBS SQ > 102.400 > 102.400 100 100 < 50 < 50
    Normale Mausseren - 50 50 100 100 < 50 < 50
    • *10 μg an Tetanustoxoid wurden verabreicht
    Tabelle 6 IgG-Isotypanalyse des Serums aus den d10P3°-Blutentnahmen der Tabelle 5
    Anti-Tetanustoxoid-Titer–1
    Vakzin Route IgG1 IgG2a IgG2b
    TT + 3D-MLA/AF/PBS IN > 819.200 102.400 409.600
    TT + DPPC/PBS IN 25.600 1.600 3.200
    TT + 3D-MLA/AF/PBS IN > 819.200 51.200 102.400
    Normale Mausseren - < 400 < 400 < 400
  • Beispiel 7 – Stimulierung einer Immunantwort auf das Hepatitis B-Oberflächenantigen durch intranasale Verabreichung der wässrigen ALD-Formulierung
  • Mäusen, denen das Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBSAG) in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung intranasal verabreicht worden war, produzierten Serum-IgG und -IgA-Titer für dieses Antigen. Sekretorisches IgA wurde in Vaginalwaschungen detektiert, und die Induktion einer zytotoxischen T-Lymphozytenantwort wurde mittels eines Zytotoxizitätsassays detektiert.
  • Gruppen von BALB/c-Mäusen wurde eine intranasale primäre Immunisierung (1°) mit 2,5 μg HBsAg + 10 μg 3D-MLA/AF in einem Volumen von 20 μl verabreicht. 3D-MLA/AF wurde wie in Beispiel 1 hergestellt. 21 Tage später wurde den Mäusen eine sekundäre Immunisierung (2°) von 7,5 μg HBsAg + 10 μg 3D-MLA/AF intranasal in 20 μl verabreicht. Eine tertiäre Immunisierung (3°), die in ihrer Zusammensetzung identisch mit der sekundären Immunisierung war, wurde 28 Tage nach der sekundären Immunisierung verabreicht. Assays wurden durchgeführt, um die zytotoxische T-Lymphozytenaktivität 16 Tage nach der sekundären Immunisierung (d16, post 2°) und 8 Tage nach der tertiären Immunisierung (d8, post 3°) zu detektieren. Die Antikörpertiter von Serum und Schleimhäuten wurden 22 Tage nach der sekundären Immunisierung (d22, post 2°) und 21 Tage nach der tertiären Immunisierung (d21, post 3°) bestimmt. Alle Assays wurden mittels Verfahren durchgeführt, die auf dem Gebiet Standardverfahren sind und in den vorgehenden Beispielen 3 und 5 beschrieben werden. Die Resultate dieses Experiments werden in Tabellen 7 bis 9 gezeigt. Tabelle 7
    % Zytotoxizität (51Cr-Freisetzung)
    Effektor:Ziel-Verhältnis
    Material Tag 50:1 25:1 12,5:1 6,25:1
    3D-MLA/AF d16, post 2° 38 22 15 9
    Trägerstoff 3 2 0 0
    Nicht-immune 3 3 0 0
    Milzzellen
    3D-MLA/AF d8, post 3° 82 65 49 36
    Trägerstoff 5 2 1 1
    Nicht-immune 7 5 3 3
    Milzzellen
    Tabelle 8
    Anti-HBsAg-Titer–1
    Material Tag IgG1 IgG2a IqA
    3D-MLA/AF d22, post 2° 256.000 64.000 1.600
    Trägerstoff < 2.000 < 2.000 < 200
    3D-MLA/AF d21, post 3° 1.000.000 1.000.000 25.600
    Trägerstoff < 2.000 < 2.000 < 200
  • Gruppen von BALB/c-Mäusen wurden mit 2,5 μg HBsAg + 10 μg 3D-MLA/AF intranasal immunisiert und 21 Tage später intranasal mit 7,5 μg HBsAg + 10 μg 3D-MLA/AF geboostet. Vaginalproben wurden 10 Tage nach der Booster-Immunisierung gesammelt. Tabelle 9
    Vaginalwaschung
    Anti-HBsAg-Titer–1
    Material IgG IgA
    3D-MLA/AF 100 6400
    Trägerstoff < 50 < 50
  • Die intranasale Verabreichung von HBsAg in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung stimulierte sowohl eine humorale als auch eine zelluläre Immunantwort auf das Antigen. Die intranasale Immunisierung mit dem Antigen, das in 3D-MLA/AF formuliert war, induzierte eine zytotoxische T-Lymphozytenantwort und Antigen-spezifische humorale und mucosale Immunantworten.
  • Beispiel 8 – Generierung einer protektiven Immunantwort auf Influenza durch intranasale Verabreichung der wässrigen ALD-Formulierung
  • Mäuse, die intranasal mit FLUSHIELD®-Influenzavakzin immunisiert worden waren, das das Hämagglutininantigen in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung formuliert enthält, produzierten sowohl IgG als auch IgA, die in Vaginalwaschungen nachgewiesen wurden. Die immunisierten Mäuse waren ebenfalls 100%ig vor einer nachfolgenden Influenza-Challenge geschützt.
  • ICR-Mäuse wurden dreimal im Intervall von 21 Tagen mit FLUSHIELD®-Influenzavakzin (Wyeth-Lederle) immunisiert, das 0,3 μg Hämagglutininantigen (HA) + 10 μg 3D-MLA/AF enthielt. 3D-MLA/AF wurde wie in Beispiel 1 hergestellt. Die Vaginalwaschungen wurden 14 Tage nach der abschließenden Immunisierung gesammelt. Die Mäuse wurden 35 Tage nach der abschließenden Immunisierung mit 10 LD50 (Lethaldosis 50) von infektiöser Influenza A/HK/68 herausgefordert und auf Mortalität hin überwacht. Tabelle 10
    IgA IgG
    Gruppe Vaginalwaschung Vaginalwaschung % Schutz
    nicht-immun < 20 < 20 0
    Trägerstoff 160 80 60
    3D-MLA/AF 2560 1280 100
  • Beispiel 9 – Zusammensetzungen von Monophosphoryl Lipid A
  • Monophosphoryl Lipid A (MLA) kann in wässrigen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung formuliert werden und in den gleichen Quantitäten und Mengen wie in Beispielen 1 bis 7 verabreicht werden, um ähnliche Resultate zu erzielen.

Claims (21)

  1. Wäßrige immunstimulierende Adjuvanszusammensetzung, umfassend ein attenuiertes Lipid A-Derivat, welches ein monophosphoryliertes Lipid A oder 3-O-deacyliertes Monophosphoryl Lipid A ist, ein oder mehrere nicht-immunstimulierende Tenside und Glycerol.
  2. Lyophilisierte Adjuvanszusammensetzung, umfassend ein attenuiertes Lipid A-Derivat, welches Monophosphoryl Lipid A oder 3-O-deacyliertes Monophosphoryl Lipid A ist, ein oder mehrere nicht-immunstimulierende Tenside und Glycerol.
  3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das attenuierte Lipid A-Derivat Monophosphoryl Lipid A ist.
  4. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das attenuierte Lipid A-Derivat 3-O-deacyliertes Monophosphoryl Lipid A ist.
  5. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das nicht-immunstimulierende Tensid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glycodeoxycholat, Deoxycholat, Sphingomyelin, Sphingosin, Phosphatodylcholin, 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin, L-α-Phosphatidylethanolamin und 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin oder einer Mischung daraus.
  6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, worin das nicht-immunstimulierende Tensid 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin ist.
  7. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das molare Verhältnis des attenuierten Lipid A-Derivats zum nicht-immunstimulierenden Tensid von 10:1 bis 10:5 reicht.
  8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei das molare Verhältnis des attenuierten Lipid A-Derivats zum nicht-immunstimulierenden Tensid 4:1 ist.
  9. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, wobei Glycerol von 2 Vol.% bis 40 Vol.% in dieser Zusammensetzung vorhanden ist.
  10. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, wobei Glycerol von 2 Vol.% bis 10 Vol.% in dieser Zusammensetzung vorhanden ist.
  11. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, welche ferner ein Antigen umfaßt.
  12. Verfahren zur Herstellung einer immunstimulierenden wäßrigen Adjuvanszusammensetzung, umfassend die Schritte: a) Lösen eines oder mehrerer nicht-immunstimulierenden/er Tensids/Tenside in einem Lösungsmittel; b) Mischen des/der gelösten Tensids/Tenside mit einem attenuierten Lipid A-Derivat, welches Monophosphoryl Lipid A oder 3-O-deacyliertes Monophosphoryl Lipid A ist, um eine Mischung des attenuierten Lipid A-Derivats und des Tensids/der Tenside zu erhalten; c) Verdampfen des Lösungsmittels aus der Mischung des/der Tensids/Tenside und des Lipid A-Derivats; d) Hinzufügen von Wasser zur verdampften Mischung, um eine Suspension zu gewinnen; e) Erwärmen und Schallbehandeln der Suspension des Schritts (d), bis sie klar wird; f) Zugeben von 2 bis 40 Vol.% Glycerol; und g) Lyophilisieren dieser Zusammensetzung.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei von 2 bis 20 Vol.% Glycerol in Schritt (f) zugegeben wird.
  14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei das Lösungsmittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Chloroform, Alkoholen, Dimethylsulfoxid und Dimethylformamid oder Gemischen daraus besteht.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Lösungsmittel Ethanol ist.
  16. Verfahre nach irgendeinem der Ansprüche 12 bis 15, wobei diese Suspension von 60°C bis 80°C erwärmt wird.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei diese Suspension auf 60°C erwärmt wird.
  18. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 12 bis 15, wobei diese Suspension für 5 bis 60 Minuten beschallt wird.
  19. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11 zur Verwendung als Pharmazeutikum.
  20. Verwendung der Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11 zur Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung einer Immunantwort.
  21. Zusammensetzung nach Anspruch 19 oder der Verwendung nach Anspruch 20, wobei die Zusammensetzung für die intranasale Verabreichung formuliert ist.
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