ES2296629T3 - Composiciones adyuvantes inmunologicas acuosas de monofosforil-lipido a. - Google Patents
Composiciones adyuvantes inmunologicas acuosas de monofosforil-lipido a. Download PDFInfo
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Abstract
Una composición adyuvante inmunoestimulante acuosa que comprende un derivado atenuado del lípido A, que es monofosforil-lípido A o monofosforil-lípido A 3-O-desacilado, uno o varios tensioactivos no inmunoestimulantes y glicerina.
Description
Composiciones adyuvantes inmunológicas acuosas
de monofosforil-lípido A.
Los compuestos
monofosforil-lípido A (MLA) y
monofosforil-lípido A
3-O-desacilado
(3D-MLA) son derivados atenuados del componente
lípido A del lipopolisacárido bacteriano (LPS). El LPS y el lípido A
son potentes inmunoestimulantes que inducen tanto una respuesta de
anticuerpos humoral como una respuesta inmunitaria celular en
pacientes a los que se administran estos compuestos. Sin embargo,
el lípido A y el LPS pueden producir también efectos secundarios
tóxicos como pirogenicidad y reacciones de Shwarzman locales. MLA y
3D-MLA son moléculas similares al lípido A que se
han modificado para atenuar la toxicidad del LPS.
Al igual que el lípido A, las moléculas de MLA y
3D-MLA tienen un esqueleto de azúcar al que se
encuentran unidos ácidos grasos de cadena larga. El esqueleto se
compone de dos anillos de azúcar de seis carbonos unidos por enlace
glicosídico. MLA y 3D-MLA están fosforilados en la
posición 4. De cinco a ocho ácidos grasos de cadena larga
(12-14 carbonos) se encuentran unidos al esqueleto
de azúcar, haciendo que MLA y 3D-MLA sean moléculas
muy hidrófobas que no se disuelven fácilmente en agua.
Los derivados atenuados del lípido A (ALD), MLA
y 3D-MLA, se usan como adyuvantes inmunológicos en
vacunas profilácticas para enfermedades infecciosas y en vacunas
terapéuticas para el tratamiento de tumores cancerosos e
infecciones crónicas.
El documento WO 98/43670 describe una
composición adyuvante acuosa que comprende un derivado atenuado del
lípido A y un tensioactivo. El derivado puede ser
monofosforil-lípido A o
monofosforil-lípido A
3-O-desacilado. Un tensioactivo
disuelto se añade a tal derivado, después de lo cual el disolvente
se evapora y se añade agua a la película resultante. Por sonicación
se produce un líquido transparente que se usa como adyuvante.
S. Sasaki y col., Infect. Immun., 1997,
65(9): 3520-8 describen la evaluación de la
eficacia del monofosforil-lípido A en el aumento de
la inmunidad inducida por la vacunación de ADN contra
VIH-1. Se inyectaron ratones con ADN inmunogénico
formulado con monofosforil-lípido A disuelto en
diferentes vehículos (en emulsión estable o en formulación
acuosa).
El documento WO 94/21292 describe composiciones
de vacunas que comprenden pequeñas partículas de
monofosforil-lípido A
3-O-desacilado. En particular, el
tamaño de partícula es inferior a 120 nm.
El documento
GB-A-2220211 describe que
lipopolisacáridos modificados, en particular
monofosforil-lípido A
3-O-desacilado y lípido A
difosforilado 3-O-desacetilado, se
producen por una hidrólisis alcalina en condiciones controladas que
elimina sólo el resto acilo \beta-hidroximirístico
que está unido por enlace éster a la glucosamina del extremo
reductor en la posición 3.
El documento
EP-A-407804 describe un complejo
metaloceno soluble en agua que puede emplearse como citostático y
que puede obtenerse mezclando un complejo metaloceno, un poliol,
agua y, opcionalmente, aditivos y eliminando posteriormente el
agua, siendo los polioles preferentemente glicoles, alcoholes de
azúcar o carbohidratos. La glicerina se menciona como un
poliol.
El documento
US-A-4448683 describe que una
desoxinucleotidiltransferasa terminal sensible al calor se
estabiliza por liofilización de una disolución de la enzima. La
disolución antes de la liofilización tiene un pH cuidadosamente
controlado, una concentración iónica de al menos 0,05 M y una
concentración de proteína superior a 0,3 gramos/litro. Esta patente
de los EEUU también describe que la disolución puede contener
también glicerina, aunque no es necesario que la glicerina esté
presente.
Las preparaciones antigénicas incluidas en la
mayor parte de las vacunas son frecuentemente mezclas complicadas
de proteínas solubles en agua, haciendo difícil la formulación del
adyuvante insoluble en agua en una vacuna de base acuosa. Por lo
tanto, MLA y 3D-MLA deben mezclarse primeramente con
disolventes antes de añadirse a la preparación de antígenos. Sin
embargo, la presencia de disolventes puede complicar aún más la
formulación de la vacuna y en algunos casos puede reducir la
eficiencia de sus componentes. Además, los disolventes pueden
irritar las superficies de las mucosas o causar inflamación en el
punto de inyección. Una formulación sencilla de MLA o
3D-MLA sin codisolventes que interfieran permitiría
obtener los máximos beneficios tanto del adyuvante como del
antígeno en una composición de vacuna. La presente invención
satisface esta necesidad.
La presente invención se refiere a una
formulación acuosa de un derivado atenuado del lípido A (ALD) y un
tensioactivo y a procedimientos para su preparación y
almacenamiento. Los derivados atenuados del lípido A útiles según
la presente invención son monofosforil-lípido A
(MLA) y monofosforil-lípido A
3-O-desacilado
(3D-MLA). Las formulaciones acuosas de MLA (MLA/AF)
o 3D-MLA (3D-MLA/AF) eliminan la
necesidad de disolventes indeseables o sistemas de codisolventes
para la preparación de vacunas. La invención proporciona una
composición acuosa estable del ALD, glicerina y un tensioactivo que
cuando se administra a ratones junto con un antígeno, aumenta las
respuestas inmunitarias celular y humoral del animal a dicho
antígeno. Sorprendentemente, la formulación acuosa de la presente
invención induce altos niveles de IgA secretados en suero y mucosas
en los animales inmunizados al administrarse por vía intranasal.
Una realización de la composición acuosa reivindicada comprende una
proporción molar de MLA o 3D-MLA al tensioactivo de
aproximadamente 4:1 y tiene un tamaño de partículas de
aproximadamente 50-70 nm. Un tensioactivo preferido
es
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina
(DPPC). Inesperadamente, cuando se añade glicerina a la presente
formulación acuosa antes de la liofilización, la composición se
restituye al reconstituirse sin sonicación adicional. El
almacenamiento satisfactorio de la presente composición en estado
liofilizado permite un almacenamiento y transporte prácticos de la
formulación acuosa o de las composiciones de vacunas que comprenden
la formulación.
Se describe un procedimiento para preparar la
composición acuosa. En una realización el ALD y el tensioactivo se
disuelven y se mezclan uniformemente en etanol. El etanol se evapora
después dejando una película. Se añade agua a la película. El ALD y
el tensioactivo se suspenden en el agua por sonicación. La
suspensión se sonica hasta quedar transparente. Se añade glicerina
en una cantidad del 2 por ciento al 40 por ciento v/v y la
composición se liofiliza. Los animales a los que se administra la
composición reivindicada junto con un antígeno presentan respuestas
inmunitarias humoral y celular aumentadas a dicho antígeno. También
se describen y reivindican procedimientos para usar la composición
a fin de aumentar estas respuestas.
La figura 1a-d muestra los
títulos de anticuerpos de ratones a los que se administró el
antígeno del toxoide tetánico (TT) en una fórmula acuosa de
monofosforil-lípido A
3-O-desacilado
(3D-MLA/AF) * o el antígeno del toxoide tetánico en
disolución salina \lozenge. La figura 1 a muestra los títulos de
anticuerpos IgG totales de ratones a los que se administró el
antígeno del toxoide tetánico. La figura 1 b muestra los títulos de
anticuerpos IgG2a de ratones a los que se administró el antígeno del
toxoide tetánico. La figura 1 c muestra los títulos de anticuerpos
IgG2b de ratones a los que se administró el antígeno del toxoide
tetánico y la figura 1 d muestra los títulos de anticuerpos IgG1
para dichos animales.
La figura 2 muestra la respuesta proliferativa
de células T en ratones inmunizados con un derivado proteico
purificado. Se muestra la respuesta proliferativa en ratones a los
que se administró el toxoide tetánico en 3D-MLA/AF
* y controles normales \lozenge a los 14 días después de la
vacunación primaria.
La presente invención se refiere a una
formulación adyuvante acuosa de un derivado atenuado del lípido A
(ALD). El ALD y un tensioactivo se suspenden en agua en una
proporción molar de aproximadamente 4:1 y se sonican para obtener
una suspensión con un tamaño de partículas de aproximadamente
50-70 nm.
Según la presente invención, un derivado
atenuado del lípido A puede formularse en una composición acuosa
que comprenda también uno o varios tensioactivos no
inmunoestimulantes y glicerina, para proporcionar un potente
adyuvante. Un derivado atenuado del lípido A es un compuesto
semejante al lípido A que presenta las ventajosas propiedades
inmunoestimulantes del lípido A, pero exhibe menos de los efectos
secundarios adversos de dicho compuesto. Los ALD son
monofosforil-lípido A (MLA) y
monofosforil-lípido A
3-O-desacilado
(3D-MLA), que son potentes inmunoestimulantes, pero
sorprendentemente menos tóxicos que el lípido A. En las
composiciones de la presente invención pueden usarse tanto MLA como
3D-MLA, que son conocidos y no necesitan describirse
en detalle en este documento. Véase por ejemplo la patente de los
EE.UU. nº 4.436.727, concedida el 13 de marzo de 1984, transferida
a Ribi ImmunoChem Research, Inc., que describe el
monofosforil-lípido A y su preparación. La patente
de los EE.UU. nº 4.912.094 y certificado de reexamen B1 4.912.094 de
Meyers y col., transferida también a Ribi ImmunoChem Research Inc.,
incorpora el monofosforil-lípido A
3-O-desacilado y un procedimiento
para su preparación.
Sin entrar en los detalles de las patentes
anteriores, el monofosforil-lípido A (MLA) como se
usa en este documento se deriva del lípido A, un componente de los
lipopolisacáridos (LPS) de las enterobacterias, un modulador
potente pero altamente tóxico del sistema inmunitario. Edgar Ribi y
sus colaboradores consiguieron la producción del
monofosforil-lípido A (MLA), originalmente
denominado endotoxina detoxificada refinada. El MLA se produce
calentando a reflujo un extracto de endotoxina (LPS o lípido A)
obtenido a partir de mutantes carentes de heptosas de bacterias
gram-negativas en disoluciones de ácidos minerales
de fuerza moderada (por ejemplo, HCl 0,1 N) durante un período de
aproximadamente 30 minutos. Este tratamiento resulta en la pérdida
de la fracción fosfato en la posición 1 de la glucosamina del
extremo reductor.
De forma coincidente, durante este tratamiento
se elimina el carbohidrato central de la posición 6 de la
glucosamina no reductora. El producto resultante (MLA) muestra
niveles considerablemente atenuados de las actividades endotóxicas
asociadas normalmente con la endotoxina de partida, tales como
pirogenicidad, reactividad Shwarzman local y toxicidad, tal como se
evalúa en el ensayo de dosis letal al 50% en embriones de pollo
(CEDL_{50}). Sin embargo, retiene inesperadamente la
funcionalidad del lípido A y el LPS como inmunomodulador.
Otro derivado atenuado del lípido A que puede
utilizarse en la práctica de la presente invención se denomina
monofosforil-lípido A
3-O-desacilado
(3D-MLA). El 3D-MLA se conoce tal
como se publica en la patente de los EE.UU. nº 4.912.094,
certificado de reexamen B1 4.912.094 (la patente '094), y se
diferencia del MLA en que de la molécula de MLA el resto acilo
\beta-hidroximirístico que está unido por enlace
éster a la glucosamina del extremo reductor en la posición 3 se
elimina selectivamente en condiciones que no afectan adversamente a
los otros grupos. El monofosforil-lípido A
3-O-desacilado puede obtenerse de
Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Montana 59840, EE.UU.
Las moléculas de MLA y 3D-MLA
son una composición o una mezcla de varios patrones de sustitución
de ácidos grasos, es decir, heptaacilo, hexaacilo, pentaacilo,
etc., con longitudes de cadena de ácido graso variables. Por tanto,
la invención abarca estas formas diversas de MLA y
3D-MLA. Además, esta invención abarca las mezclas
de las formas de un compuesto al igual que los compuestos
individuales producidos mediante procedimientos sintéticos o
semisintéticos. El esqueleto del lípido A que se ilustra en la
patente -094 corresponde al producto que se obtiene por
3-desacilación del heptaacil-lípido
A de S. minnesota R595. Este documento abarca otros patrones
de sustitución de ácidos grasos; la característica esencial es que
el material esté 3-O-desacilado.
El 3D-MLA modificado utilizado
en la presente invención se prepara sometiendo el MLA a hidrólisis
alcalina en condiciones que resultan en la pérdida de un único
ácido graso de la posición 3 del esqueleto del lípido A. El ácido
graso \beta-hidroximirístico en la posición 3 es
inusualmente inestable en medio alcalino. Sólo se requiere un
tratamiento alcalino muy suave para 3-desacilar
completamente el lípido A. Los demás enlaces éster en el lípido A
requieren condiciones más algo más fuertes para que se produzca la
hidrólisis, de modo que es posible desacilar selectivamente estos
materiales en la posición 3 sin afectar significativamente al resto
de la molécula. Por el momento se desconoce la razón de esta
sensibilidad inusual a medios alcalinos del ácido graso
\beta-hidroximirístico unido por enlace éster en
la posición 3.
Aunque los procedimientos de hidrólisis alcalina
son conocidos, es importante elegir condiciones que no produzcan
más hidrólisis que la del enlace éster del grupo
\beta-hidroximirístico en la posición 3. En
general, la hidrólisis puede llevarse a cabo en medio acuoso u
orgánico. En el último caso, los disolventes incluyen metanol
(alcoholes), dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF),
cloroformo, diclorometano y similares, al igual que mezclas de los
mismos. También pueden emplearse combinaciones de agua y uno o
varios de los disolventes orgánicos mencionados.
La base alcalina puede elegirse entre diversos
hidróxidos, carbonatos, fosfatos y aminas. Las bases ilustrativas
incluyen las bases inorgánicas tales como hidróxido de sodio,
hidróxido de potasio, carbonato de sodio, carbonato de potasio,
bicarbonato de sodio, bicarbonato de potasio y similares y bases
orgánicas tales como alquilaminas que incluyen, pero no se limitan
a, dietilamina, trietilamina y similares.
Típicamente, el pH en medio acuoso se encuentra
entre aproximadamente 10 y 14, siendo el intervalo de pH preferido
de aproximadamente 12 a aproximadamente 13,5. Típicamente, la
reacción de hidrólisis se lleva a cabo a una temperatura de
aproximadamente 20ºC a aproximadamente 80ºC, preferentemente de
aproximadamente 50ºC a 60ºC durante un período de aproximadamente
10 a aproximadamente 30 minutos. Por ejemplo, la hidrólisis puede
realizarse en trietilamina al 3% en agua a temperatura ambiente
(22º-25ºC) durante un período de 48 horas. El único requerimiento
en la elección de la temperatura y el tiempo de la hidrólisis es que
la desacilación se produzca para eliminar solamente el grupo
\beta-hidroximirístico en la posición 3.
En la práctica se ha encontrado que un
procedimiento particularmente deseable de hidrólisis implica la
disolución del lípido A o monofosforil-lípido A en
cloroformo:metanol 2:1 (v/v), la saturación de esta disolución con
un tampón acuoso compuesto de Na_{2}CO_{3} 0,5 M a pH 10,5 y
después, la evaporación instantánea del disolvente a 45º-50ºC en
vacío o en un aspirador (aproximadamente 100 mm de Hg / 133,32 hPa).
El material resultante se desacila selectivamente en la posición 3.
El proceso puede llevarse a cabo también con cualquiera de las
bases inorgánicas citadas anteriormente. En algunos casos puede ser
deseable la adición de un catalizador de transferencia de fase, tal
como bromuro de tetrabutilamonio, a la disolución orgánica antes de
la saturación con el tampón acuoso.
Por lo general, al preparar la composición de la
presente invención, el derivado atenuado del lípido A (ALD) se
combina con el tensioactivo, estando cada uno de éstos disuelto en
un disolvente. El disolvente se evapora dejando una película. Se
añade agua a la película y la suspensión resultante se sonica
mientras se calienta hasta quedar transparente. La suspensión final
tiene un tamaño de partículas de aproximadamente
40-150 nm y, preferentemente, de aproximadamente 50
a aproximadamente 70 nm.
El ALD y el tensioactivo se combinan en una
proporción molar de aproximadamente 10 partes de ALD a
aproximadamente 1 parte hasta aproximadamente 5 partes de
tensioactivo. Preferentemente, los componentes se combinan en una
proporción molar de aproximadamente 4 partes de ALD a 1 parte de
tensioactivo. Los tensioactivos considerados para su uso en las
composiciones de la presente invención no son inmunoestimulantes o
reactivos, y presentan poca o ninguna actividad biológica
independiente. Como se usa en este documento, los términos "no
inmunoestimulantes" y "no reactivos" indican que los
tensioactivos muestran poca o ninguna actividad biológica apreciable
por encima de los controles sin efecto inmunitario. Los
tensioactivos no inmunoestimulantes útiles según la presente
invención incluyen, pero no se limitan a, sales biliares,
fosfolípidos y esfingolípidos naturales. Las sales biliares tales
como glicodesoxicolato y desoxicolato son útiles como tensioactivos
en las composiciones reivindicadas. Otros tensioactivos adecuados
incluyen esfingolípidos tales como esfingomielina y esfingosina y
fosfolípidos tales como fosfatidilcolina de huevo,
1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina,
L-\alpha-fosfatidiletanolamina y
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina
o mezclas de los mismos. En una realización preferida, el
tensioactivo es el fosfolípido
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina
(DPPC). El DPPC está aceptado para su uso en humanos y es
especialmente efectivo cuando la formulación se administra por vía
intranasal.
El ALD y el tensioactivo se disuelven y se
mezclan completamente en un disolvente. Los disolventes acuosos u
orgánicos útiles según la presente invención incluyen cloroformo
alcoholes (por ejemplo, etanol), dimetilsulfóxido (DMSO),
dimetilformamida (DMF) y similares, al igual que mezclas de los
mismos.
El disolvente se evapora de la mezcla de ALD y
tensioactivo dejando una película. Se añade agua a la película y la
suspensión resultante se sonica mientras se calienta hasta quedar
transparente. Se prefiere sonicar la suspensión en un baño
sonicador de agua. La temperatura del baño de agua puede ser de 40ºC
a 80ºC y preferentemente de aproximadamente 60ºC. La suspensión
puede sonicarse durante períodos de 5 minutos hasta aproximadamente
una hora hasta quedar transparente. Los períodos de sonicación
variarán dependiendo del volumen y la concentración de la
suspensión, pero pueden ser determinados fácilmente por un experto
en la materia. La suspensión final tiene un tamaño de partículas de
aproximadamente 40-150 nm y preferentemente de
aproximadamente 50 a aproximadamente 70 nm.
La formulación acuosa de la presente invención
puede liofilizarse para el transporte y el almacenamiento.
Inesperadamente, cuando la composición se liofiliza en presencia de
glicerina puede reconstituirse sin sonicación adicional. La
glicerina, presente en la composición a aproximadamente el 2 por
ciento hasta aproximadamente el 40 por ciento y, preferentemente a
aproximadamente el 2 hasta el aproximadamente 10 por ciento, en
relación de volumen, permite la restituir la composición
liofilizada al añadir agua. La capacidad de reconstituir la
formulación acuosa a su tamaño de partículas original mediante la
simple adición de agua es una clara ventaja para la vacunación en
el campo, lejos del equipo de laboratorio. Otras ventajas de poder
transportar la presente composición en forma liofilizada incluyen
pesos de carga reducidos, que no se requiera refrigeración y el
aumento de la estabilidad. Se piensa que, en este estado
liofilizado, los ALD presentes en la composición de la presente
invención se encuentran protegidos contra la hidrólisis.
Adicionalmente, la concentración del ALD añadido a la vacuna puede
variarse mediante el ajuste del volumen de reconstitución. Por
ejemplo, 10 mililitros de una composición que contiene 1 mg/ml de
ALD pueden liofilizarse y reconstituirse con 1 ml de agua para
obtener composiciones acuosas de 10 mg/ml de ALD. La glicerina
estabiliza también los antígenos proteicos presentes en las
composiciones de vacunas de la presente invención durante la
liofilización. Otros componentes que podrían usarse para
estabilizar la presente composición para liofilización incluyen,
pero no se limitan a, polipropilenglicol, polietilenglicol u otros
polioles apropiados para el uso parenteral.
Una cantidad efectiva de la composición de la
presente invención se administra a un animal de sangre caliente
junto con un antígeno para aumentar la respuesta inmunitaria del
animal a dicho antígeno. La composición de la presente invención
aumenta tanto la respuesta inmunitaria humoral de un animal al
antígeno como la respuesta inmunitaria celular. La cantidad de
antígeno administrada para desencadenar la respuesta deseada puede
ser determinada fácilmente por un experto en la materia y variará
con el tipo de antígeno administrado, la vía de administración y
los calendarios de inmunización. Por ejemplo, 0,1 \mug del toxoide
tetánico administrado junto con la composición reivindicada a un
ratón por vía subcutánea en dos inmunizaciones separadas por 21
días desencadena una respuesta inmunitaria humoral a dicho antígeno.
Cunado se administran por vía intranasal, la composición de la
presente invención y un antígeno estimulan la producción de
linfocitos T citotóxicos. El antígeno superficial de la hepatitis B
(2,5 \mug), administrado por vía intranasal los días 0 y 21 en la
composición reivindicada, estimuló la producción de linfocitos T
citotóxicos en los animales inmunizados. Además, la composición de
la presente invención es particularmente efectiva en desencadenar
una respuesta de IgA en los animales inmunizados cuando se
administra por vía intranasal. Los ratones a los que se habían
administrado 0,5-12,5 \mug del toxoide tetánico en
una formulación acuosa de monofosforil-lípido A
3-O-desacilado
(3D-MLA/AF) presentaron títulos aumentados de IgA
contra dicho antígeno. Una cantidad efectiva de la composición de
la presente invención es aquella cantidad que estimula o aumenta la
respuesta inmunitaria. Por ejemplo, una cantidad efectiva de la
composición reivindicada puede contener de 1 a aproximadamente 250
microgramos del derivado atenuado del lípido A y preferentemente de
aproximadamente 25 a aproximadamente 50 microgramos, basado en la
administración a un paciente adulto típico de 70 kg.
Se ofrecen los ejemplos siguientes para ilustrar
adicionalmente, pero sin limitar, tanto las composiciones como el
procedimiento de la presente invención. Ha de entenderse que los
modelos de ratones presentados en este documento son
representativos de los animales de sangre caliente y se
correlacionan razonablemente con lo que sucede en otros animales de
sangre caliente, incluyendo humanos. Todos los porcentajes se dan en
peso y todas las proporciones de mezclas de disolventes se refieren
a volumen a menos que se indique de otra manera.
Una preparación acuosa de
monofosforil-lípido A
3-O-desacilado
(3D-MLA/AF) según la presente invención, que
comprendía 1.000 \mug/ml de 3D-MLA (Ribi
ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Montana 59840, EE.UU.), una
forma atenuada del lípido A de Salmonella minnesota R 595 y
118 \mug/ml de
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina
(DPPC) en agua para inyección se preparó de la manera
siguiente:
Se preparó una disolución de DPPC a una
concentración de 4 mg/ml en etanol y se agitó con un vórtex hasta
quedar transparente. Una alícuota de 2,7 ml de la disolución de DPPC
se añadió a un vial que contenía 100 mg de 3D-MLA
liofilizado y se agitó suavemente en rotación para humedecer el
3D-MLA. El etanol se eliminó haciendo pasar
suavemente una corriente de nitrógeno filtrado por el vial. Se
añadió agua para inyección (91,7 ml) al vial, que se taponó, se
selló y se suspendió en un baño sonicador de agua Labline 9303. La
suspensión se sonicó durante 10 minutos a 60ºC hasta quedar
transparente. La formulación acuosa resultante contenía partículas
de 70 nm, medidas mediante un espectrómetro PSC100 de Malvern
Instruments y se esterilizó por filtración a través de un filtro
de
0,2 \mum.
0,2 \mum.
A una formulación acuosa de MLA preparada como
en el ejemplo 1 se añadió el 2 por ciento de glicerina. La mezcla
se alicuotó en viales con volúmenes de uno a 10 ml. Los viales se
congelaron en un liofilizador a una temperatura de los estantes de
-45ºC. Después de 2 horas se conectaron el condensador y el vacío y
la temperatura de los estantes se ajustó a -10ºC. La temperatura de
los estantes se modificó a +10ºC después de 48 horas y la nueva
temperatura se mantuvo durante 24 horas. La temperatura de los
estantes se ajustó entonces a +25ºC durante un período final de 24
horas. Después de la liofilización, los viales se reconstituyeron
con 1 ml de agua para inyección (API). La reconstitución se realizó
por agitación rotatoria del agua en los viales. Todos los viales
fueron transparentes sin un precipitado visible. Antes de la
determinación del tamaño de las partículas se diluyeron en API
porciones de las formulaciones concentradas para obtener una
disolución final de 1 mg/ml.
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La tabla 1 muestra que la formulación acuosa de
la presente invención se restituye al tamaño de partículas original
después de la liofilización por la adición de agua.
Los ratones inmunizados con el toxoide tetánico
(TT) en la formulación acuosa de la presente invención generaron
anticuerpos específicos para el toxoide tetánico. El título de IgG
totales y los títulos de los isotipos de IgG (2a, 2b, 1)
específicos para TT se midieron en los sueros de los ratones después
de la inmunización mediante el ensayo inmunoabsorbente ligado a
enzimas (ELISA).
Se inmunizaron ratones ICR hembra con una dosis
de la vacuna que contenía 0,1 \mug de toxoide tetánico (TT) + 50
\mug de 3D-MLA/AF ó 0,1 \mug de TT en disolución
salina. El 3D-MLA/AF se preparó como en el ejemplo
1. Las vacunas se administraron por inyección subcutánea los días 0
y 21. El suero se recogió a los 14 días después de la inmunización
secundaria y se analizó mediante técnicas ELISA estándar, para
determinar las cantidades relativas de anticuerpos específicos para
el toxoide tetánico de los isotipos IgG_{1}, IgG_{2a} e
IgG_{2b}, al igual que los IgG totales.
La figura 1 muestra el título de anticuerpos
específicos para el toxoide tetánico generados por
3D-MLA/AF. Cuando se administra junto con el
antígeno del toxoide tetánico, el 3D-MLA/AF estimula
la producción de anticuerpos IgG en los animales inmunizados y, en
particular, estimula activamente la producción de IgG_{2a}.
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Los ratones primovacunados por inmunización con
la composición adyuvante de la presente invención y un derivado
proteico purificado (PPD) (tuberculina) mostraron una respuesta
proliferativa in vitro al tratar células de bazo con dicho
antígeno.
Se inmunizaron ratones BALB/c hembra por
inyección subcutánea con una dosis de vacuna que contenía 50 \mug
de PPD + 50 \mug de 3D-MLA/AF. El
3D-MLA/AF se preparó como en el ejemplo 1. Las
células de bazo se recogieron a los 14 días después de la
inmunización y se usaron como fuente de linfocitos en un ensayo de
proliferación. Las células de bazo se cultivaron durante 96 horas
en pocillos de placas de microtítulo a una concentración de
10^{6} células/ml en medios que contenían 0,1, 1 ó 10 \mug de
PPD/ml. Durante las 24 horas finales de la incubación se añadió
timidina tritiada a los cultivos. Las células se recogieron en
filtros de fibra de vidrio y se determinó la incorporación de
tritio. Los índices de estimulación se determinaron dividiendo las
cuentas por minuto (CPM) de las células estimuladas con PPD entre
las CPM de las células cultivadas en medio solamente. Los datos
resultantes se muestran en la figura 2.
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La inducción de una respuesta de linfocitos T
cititóxicos después de la administración de la composición adyuvante
acuosa de la presente invención junto con un antígeno proteico se
detectó mediante un ensayo de cititoxicidad. Una inmunización
primaria se administró a grupos de ratones C57/BL/6 por vía
subcutánea (región inguinal) con 25 \mug de ovoalbúmina (OVA)
formulada en 3D-MLA/AF. El 3D-MLA/AF
se preparó como en el ejemplo 1. El volumen inyectado fue de 200
\mul. Veintiún días después, se sacrificaron tres ratones por
grupo experimental, se extrajeron sus bazos y se reunieron como
suspensiones unicelulares y se contaron.
Las células de bazo (75 x 10^{6} células en
3-4 ml de medio) de los grupos experimentales se
colocaron en un frasco T de 25 cm^{2}. A continuación se
añadieron al frasco 1,0 ml de células E.G7 (OVA) irradiadas (20.000
rad) a 5 x 10^{6} células/ml. El volumen se llevó a 10 ml. Se
mantuvieron los cultivos colocando los frascos T en posición
vertical en un incubador a 37ºC con el 5% de CO_{2} durante cuatro
días. Al cuarto día se recuperaron las células supervivientes de
los frascos, se lavaron una vez, se resuspendieron en 5,0 ml y se
contaron.
Las células efectoras recuperadas se ajustaron a
5 x 10^{6} células viables/ml y se hicieron diluciones seriadas
por triplicado de volúmenes de 100 \mul en pocillos de placas de
96 pocillos de fondo redondeado (Corning 25850), usando 100
\mul/pocillo de medio como diluyente. A continuación, se añadieron
a los pocillos volúmenes de 100 \mul de dianas [E.G7 (OVA), una
línea celular EL-4 transfectada con el gen de la
ovoalbúmina] marcadas con ^{51}Cr (ver más adelante) a 1 x
10^{6} células/ml. Los pocillos de liberación espontánea (SR)
contenían 100 \mul de dianas y 100 \mul de medio. Los pocillos
de liberación máxima (MR) contenían 100 \mul de dianas y 100
\mul de detergente (Tween 20 al 2%). Las proporciones
efector/diana (E/T) fueron de 50:1, 25:1, 12,5:1, 6,25:1. Las
placas se centrifugaron a 400 x g y se incubaron a 37ºC con el 5% de
CO_{2} durante 4 horas. Después de la incubación se recogieron
los sobrenadantes de los pocillos usando un sistema de recogida de
sobrenadantes Skatron.
Porcentaje de
lisis específica = 100 x \left[\frac{(Liberación \ experimental -
SR)}{(MR -
SR}\right]
Las células diana, E.G7 (OVA), se marcaron con
^{51}Cr (cromato de sodio) como sigue. En un volumen total de 1,0
ml se mezclaron 5 x 10^{6} células diana y 250 \muCi de
^{51}Cr en un tubo cónico de 15 ml. La suspensión celular se
incubó a 37ºC en un baño de agua durante 90 minutos, agitando
suavemente cada 15 minutos. Después de la incubación, las células
marcadas se lavaron tres veces por centrifugación y decantación con
volúmenes de 15 ml de medio. Después de la tercera centrifugación,
las células se resuspendieron en 10 ml de medio fresco y se dejaron
reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos y entonces se
centrifugaron. Finalmente, las células se resuspendieron en medio a
1x 10^{5} células/ml. Los resultados del ensayo de citotoxicidad
se presentan en la tabla 2.
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Los ratones a los que se había administrado el
toxoide tetánico (TT) en 3D-MLA/AF por vía
intranasal produjeron títulos de IgA detectables tanto en suero
como en extractos fecales. Además, la administración por vía
intranasal de la formulación acuosa de la presente invención junto
con TT produjo títulos elevados de los isotipos de IgG, IgG_{2a}
e IgG_{2b}.
Se administraron por vía intranasal a grupos de
ratones ICR, 0,5, 2,5, 10 ó 12,5 \mug de toxoide tetánico en
disolución salina tamponada con fosfato (PBS) o mezclados con 25
\mug de 3D-MLA/AF. El 3D-MLA/AF se
preparó como en el ejemplo 1. Los ratones fueron primovacunados el
día 0, se sangraron el día 10 (d10P1º), se les administró un
refuerzo el día 14, se sangraron el día 24 (d10P2º), se les
administró un refuerzo el día 28, se sangraron el día 38 (d10P3º).
Con los sueros reunidos de cada sangrado se realizó un análisis
ELISA para determinar los anticuerpos IgG e IgA específicos contra
el toxoide tetánico. Los extractos fecales se examinaron el día 22
(d7P2º). Los títulos de IgG e IgA de los sueros y extractos fecales
de los ratones inmunizados se muestran en las tablas
3-6.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Los ratones a los que se había administrado por
vía intranasal el antígeno superficial de la hepatitis B (HBSAG) en
la composición de la presente invención produjeron títulos de IgG e
IgA en el suero contra dicho antígeno. Los IgA secretados se
detectaron en lavados vaginales y la inducción de una respuesta de
linfocitos T citotóxicos se detectó mediante un ensayo de
citotioxicidad.
Se administró una inmunización primaria (1º) a
grupos de ratones Balb/C por vía intranasal con 2,5 \mug de HBsAg
+
10 \mug de 3D-MLA/AF en un volumen de 20 \mul. El 3D-MLA/AF se preparó como en el ejemplo 1. Veintiún días después se administró a los ratones por vía intranasal una inmunización secundaria (2º) de 7,5 \mug de HBsAg + 10 \mug de 3D-MLA/AF en 20 \mul. Una inmunización terciaria (3º) idéntica en su composición a la inmunización secundaria se administró 28 días después de la inmunización secundaria. Se realizaron ensayos para detectar actividad de linfocitos T citotóxicos a los 16 días después de la inmunización secundaria (d16, post 2º) y a los 8 días después de la inmunización terciaria (d8, post 3º). Se analizaron los títulos de anticuerpos en el suero y en las mucosas a los 22 días después de la inmunización secundaria (d22, post 2º) y a los 21 días después de la inmunización terciaria (d21, post 3º). Todos los ensayos se realizaron por los procedimientos estándar en la técnica y descritos en los ejemplos anteriores 3 y 5. Los resultados de este experimento se muestran en las tablas 7-9.
10 \mug de 3D-MLA/AF en un volumen de 20 \mul. El 3D-MLA/AF se preparó como en el ejemplo 1. Veintiún días después se administró a los ratones por vía intranasal una inmunización secundaria (2º) de 7,5 \mug de HBsAg + 10 \mug de 3D-MLA/AF en 20 \mul. Una inmunización terciaria (3º) idéntica en su composición a la inmunización secundaria se administró 28 días después de la inmunización secundaria. Se realizaron ensayos para detectar actividad de linfocitos T citotóxicos a los 16 días después de la inmunización secundaria (d16, post 2º) y a los 8 días después de la inmunización terciaria (d8, post 3º). Se analizaron los títulos de anticuerpos en el suero y en las mucosas a los 22 días después de la inmunización secundaria (d22, post 2º) y a los 21 días después de la inmunización terciaria (d21, post 3º). Todos los ensayos se realizaron por los procedimientos estándar en la técnica y descritos en los ejemplos anteriores 3 y 5. Los resultados de este experimento se muestran en las tablas 7-9.
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Se inmunizaron grupos de ratones Balb/C con 2,5
\mug de HbsAg + 10 \mug de 3D-MLA/AF por vía
intranasal y 21 días después se les administró un refuerzo con 7,5
\mug de HbsAg + 10 \mug de 3D-MLA/AF por vía
intranasal. Se recogieron muestras vaginales 10 días después de la
inmunización de refuerzo.
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\newpage
La administración por vía intranasal de HbsAg en
la composición de la presente invención estimuló tanto una
respuesta inmunitaria humoral como celular a dicho antígeno. La
inmunización por vía intranasal con el antígeno formulado en
3D-MLA/AF indujo una respuesta de linfocitos T
citotóxicos y respuestas inmunitarias humorales y de mucosas
específicas para el antígeno.
Los ratones inmunizados por vía intranasal con
la vacuna contra la influenza FLUSHIELD® que contenía el antígeno
hemaglutinina formulado en la composición de la presente invención
produjeron tanto IgG como IgA, que se recuperaron en lavados
vaginales. Los ratones inmunizados también quedaron protegidos al
100% frente a una posterior exposición a la influenza.
Los ratones ICR se inmunizaron tres veces con
intervalos de 21 días por vía intranasal con la vacuna contra la
influenza FLUSHIELD® (Wyeth-Lederle) que contenía
0,3 \mug del antígeno hemaglutinina (HA) + 10 \mug de
3D-MLA/AF. El 3D-MLA/AF se preparó
como en el ejemplo 1. Los lavados vaginales se recogieron a los 14
días después de la inmunización final. Los ratones se expusieron a
10 DL_{50} (dosis letal 50) de la cepa infecciosa de influenza
A/HK/68 treinta y cinco días después de la inmunización final y se
evaluó su mortalidad.
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El monofosforil-lípido A (MLA)
puede formularse en las composiciones acuosas de la presente
invención y administrarse en las mismas cantidades que en los
ejemplos 1-7 para producir resultados similares.
Claims (21)
1. Una composición adyuvante inmunoestimulante
acuosa que comprende un derivado atenuado del lípido A, que es
monofosforil-lípido A o
monofosforil-lípido A
3-O-desacilado, uno o varios
tensioactivos no inmunoestimulantes y glicerina.
2. Una composición adyuvante liofilizada que
comprende un derivado atenuado del lípido A, que es
monofosforil-lípido A o
monofosforil-lípido A
3-O-desacilado, uno o varios
tensioactivos no inmunoestimulantes y glicerina.
3. La composición de las reivindicaciones 1 ó 2,
en la que dicho derivado atenuado del lípido A es
monofosforil-lípido A.
4. La composición de las reivindicaciones 1 ó 2,
en la que dicho derivado atenuado del lípido A es
monofosforil-lípido A
3-O-desacilado.
5. La composición de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 en la que dicho tensioactivo no estimulante
se selecciona del grupo compuesto por glicodesoxicolato,
desoxicolato, esfingomielina, esfingosina, fosfatidilcolina,
1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina,
L-\alpha-fosfatidiletanolamina y
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina,
o una mezcla de los mismos.
6. La composición de la reivindicación 5, en la
que el tensioactivo no inmunoestimulante es
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina.
7. La composición de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en la que la proporción molar del derivado
atenuado del lípido A al tensioactivo no inmunoestimulante es de
10:1 a 10:5.
8. La composición de la reivindicación 7, en la
que la proporción molar del derivado atenuado del lípido A al
tensioactivo no inmunoestimulante es de 4:1.
9. La composición de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en la que la proporción de glicerina es del
2 por ciento en relación de volumen al 40 por ciento en relación de
volumen de dicha composición.
10. La composición de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en la que la proporción de glicerina es del
2 por ciento en relación de volumen al 10 por ciento en relación de
volumen de dicha composición.
11. La composición de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10 que comprende además un antígeno.
12. Un procedimiento para fabricar una
composición adyuvante acuosa inmunoestimulante que comprende las
etapas de:
- a)
- disolución de uno o varios tensioactivos no inmunoestimulantes en un disolvente;
- b)
- mezclado del(los) tensioactivo(s) disuelto(s) con un derivado atenuado del lípido A, que es monofosforil-lípido A o monofosforil-lípido A 3-O-desacilado, para obtener una mezcla del derivado atenuado del lípido A y los tensioactivos;
- c)
- evaporación del disolvente de la mezcla de tensiactivo(s) y derivado del lípido A;
- d)
- adición de agua a la mezcla evaporada para obtener una suspensión;
- e)
- calentamiento y sonicación de la suspensión de la etapa d hasta que quede transparente;
- f)
- adición del 2 por ciento al 40 por ciento en relación de volumen de glicerina; y
- g)
- liofilización de dicha composición.
13. El procedimiento de la reivindicación 12, en
el que en la etapa (f) se añade del 2 al 10 por ciento en relación
de volumen de glicerina.
14. El procedimiento de la reivindicación 12 o
la reivindicación 13, en el que dicho disolvente se selecciona del
grupo compuesto por cloroformo, alcoholes, dimetilsulfóxido y
dimetilformamida o mezclas de los mismos.
15. El procedimiento de la reivindicación 14, en
el que dicho disolvente es etanol.
16. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 15, en el que dicha suspensión se calienta a
una temperatura de 60ºC a 80ºC.
17. El procedimiento de la reivindicación 16, en
el que dicha suspensión se calienta a 60ºC.
18. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 15, en el que dicha suspensión se sonica
durante 5 a 60 minutos.
19. La composición de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 para su uso como producto farmacéutico.
20. El uso de la composición de cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 11 para la preparación de un medicamento
para estimular una respuesta inmunitaria.
21. La composición de la reivindicación 19 o el
uso en la reivindicación 20, en que la composición se formula para
su administración por vía intranasal.
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