BR112013000394B1

BR112013000394B1 - Composição imunogênica, uso da mesma e método para preparar a referida composição

Info

Publication number: BR112013000394B1
Application number: BR112013000394-4A
Authority: BR
Inventors: David E. Anderson; Andrei Ogrel; Ronald Erwin Boch; Jeff Baxter
Original assignee: Variation Biotechnologies, Inc.
Priority date: 2010-07-06
Filing date: 2011-07-06
Publication date: 2021-12-14
Also published as: AU2011276223B2; BR112013000394A2; MX342138B; WO2012006367A2; JP6119030B2; WO2012006367A3; CA2840079A1; CA2840079C; EP2590674A2; AU2011276223C1; EP2590674A4; IL224022B; JP2013533259A; CN103096922B; MX2012015232A; BR112013000394B8; AU2011276223A1; EP2590674B1; CN103096922A; US9610248B2

Abstract

COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, USO DA MESMA E MÉTODO PARA PREPARAR A REFERIDA COMPOSIÇÃO A presente revelação fornece composições e métodos úteis para o tratamento de influenza. Como aqui descrito, as composições e os métodos fornecidos se baseiam no desenvolvimento de certas composições que incluem um antígeno de hemaglutinina do vírus influenza em com binação com vesículas lipídicas que incluem um tensoativo não iônico (NISVs) e, opcionalmente, um adjuvante. Em certas modalidades, as composições fornecidas permanecem potentes até mesmo quando não são armazenadas em um sistema de cadeia do frio padronizado (ou seja, são termoestáveis).

Description

REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Esse pedido reivindica prioridade para o Pedido Provisório de Patente U.S. N° de Série 61/361.898, depositado em 6 de julho de 2010 e Pedido Provisório de Patente U.S. N° de Série 61/431.218, depositado em 10 de janeiro de 2011; cujo conteúdo total de cada um deles é aqui incorporado por referência.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

[002] A Influenza é uma common doença infecciosa do sistema respiratório associada à família de vírus Orthomyxoviridae. Por causa do grau elevado de variabilidade do vírus, a vacinação é tipicamente necessária anualmente com uma vacina reformulada que leva em conta variações de cepa. A composição da vacina desenvolvida a cada ano nos Estados Unidos é determinada pelo “Department of Food and Drug Administration Vaccines” e pelo “Related Biologicals Advisory Committee”. A Organização Mundial de Saúde (OMS) similarmente opera uma rede de laboratórios de vigilância global, para detecção de novas variantes de influenza, por exemplo, veja Lavanchy, Vaccine 17: S24 (1999). A seleção se baseia na análise antigênica de vírus influenza recentemente isolados, nos padrões de disseminação de variantes antigênicas e nas respostas de anticorpo de recentemente indivíduos vacinados.

[003] Influenza A e B são os dois tipos de vírus influenza que causam doença humana epidêmica. Vírus influenza A são ainda categorizados em subtipos com base em dois antígenos de superfície: hemaglutinina (HA) e neuraminidase (N). Por exemplo, o subtipo H1N1 de vírus influenza A possuem um antígeno de hemaglutinina tipo 1 (H1) e um antígeno de neuraminidase tipo 1 (N1), enquanto o subtipo H3N2 possui um antígeno de hemaglutinina tipo 3 (H3) e um antígeno de neuraminidase tipo 2 (N2). Vírus influenza B não são categorizados em subtipos. Desde 1977, vírus influenza A (H1N1), vírus influenza A (H3N2) e vírus influenza B estão em circulação global. A vacinação é reconhecida como a forma única mais eficaz de prevenir ou atenuar influenza para aqueles em risco elevado de enfermidade séria de infecção por influenza e complicações relacionadas. A inoculação de antígeno preparado a partir de vírus influenza inativado estimula a produção de anticorpos específicos. A proteção é gerada somente contra aquelas cepas de vírus das quais a vacina é preparada ou contra cepas intimamente relacionadas.

[004] A vacina de cada ano contém antígenos de três cepas do vírus (denominada vacina trivalente, normalmente contendo antígenos de duas cepas do tipo A e uma cepa do tipo B) que representam os vírus influenza que supostamente provavelmente circularão no inverno seguinte. As características antigênicas de cepas atuais e emergentes do vírus influenza fornecem a base para a seleção de cepas incluídas na vacina de cada ano. A OMS revisa a situação epidemiológica do mundo anualmente e, se necessário, recomenda novas cepas com base nas evidências epidemiológicas atuais.

[005] Embora as vacinas contra influenza tenham tido sucesso na redução da incidência de influenza em todo o mundo, permanece uma necessidade na técnica por vacinas aprimoradas contra influenza que sejam estáveis e retenham a potência.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[001] A presente revelação fornece composições e métodos úteis para o tratamento de influenza. Como aqui descrito, as composições e os métodos fornecidos se baseiam no desenvolvimento de certas composições que incluem um antígeno de hemaglutinina do vírus influenza em combinação com vesículas lipídicas que incluem um tensoativo não iônico (NISVs) e, opcionalmente, um adjuvante. Em certas modalidades, as composições fornecidas permanecem potentes até mesmo quando não são armazenadas em um sistema de cadeia do frio padronizado (ou seja, são termoestáveis).

[002] Em um aspecto, a presente revelação fornece composições que compreendem um antígeno de hemaglutinina do vírus influenza e vesículas lipídicas, em que as vesículas lipídicas são compostas por lipídeos que estão presentes na composição em uma quantidade que obtém uma proporção de peso de lipídeo:antígeno dentro de uma faixa de cerca de 50:1 até cerca de 400:1 e os lipídeos incluem um tensoativo não iônico. Em certas modalidades, as composições fornecidas são imunogênicas.

[003] Em outro aspecto, a presente revelação fornece composições imunogênicas que compreendem um antígeno de hemaglutinina do vírus influenza e vesículas lipídicas, em que as vesículas lipídicas são compostas por lipídeos que estão presentes na composição em uma quantidade que obtém uma proporção de peso de lipídeo:antígeno de pelo menos cerca de 50:1 e os lipídeos incluem um tensoativo não iônico.

[004] Em certas modalidades, as composições mencionadas anteriormente são líquidas. Em certas modalidades, as composições mencionadas anteriormente são secas (por exemplo, liofilizadas).

[005] Em outro aspecto, a presente revelação fornece composições secas (por exemplo, liofilizadas) que compreendem um antígeno de hemaglutinina do vírus influenza e vesículas lipídicas, em que as vesículas lipídicas são compostas por lipídeos que estão presentes na composição em uma quantidade que obtém uma proporção de peso de lipídeo:antígeno de pelo menos cerca de 30:1, os lipídeos incluem um tensoativo não iônico e o teor de umidade da composição é de menos do que cerca de 2% por peso. Em certas modalidades, a proporção de peso de lipídeo:antígeno é pelo menos cerca de 40:1 ou 50:1. Em certas modalidades, o teor de umidade das composições fornecidas é de menos do que cerca de 1,9%, 1,8%, 1,7%, 1,6%, 1,5%, 1,4%, 1,3%, 1,2%, 1,1%, 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5% ou 0,4% por peso. Em certas modalidades, o teor de umidade das composições fornecidas está na faixa de cerca de 0,4% até cerca de 2% por peso. Em certas modalidades, o teor de umidade das composições fornecidas está na faixa de cerca de 0,5% até cerca de 1,9% por peso. Em certas modalidades, o teor de umidade das composições fornecidas está na faixa de cerca de 0,6% até cerca de 1,8% por peso. Em certas modalidades, o teor de umidade das composições fornecidas está na faixa de cerca de 0,7% até cerca de 1,7% por peso. Em certas modalidades, o teor de umidade das composições fornecidas está na faixa de cerca de 0,8% até cerca de 1,6% por peso. Em certas modalidades, o teor de umidade das composições fornecidas está na faixa de cerca de 0,9% até cerca de 1,5% por peso. Em certas modalidades, o teor de umidade das composições fornecidas está na faixa de cerca de 1% até cerca de 1,4% por peso. Em certas modalidades, o teor de umidade das composições fornecidas está na faixa de cerca de 0,5% até cerca de 1% por peso. Em certas modalidades, o teor de umidade das composições fornecidas está na faixa de cerca de 0,5% até cerca de 1,5% por peso. Em certas modalidades, o teor de umidade das composições fornecidas está na faixa de cerca de 0,5% até cerca de 2% por peso. Em certas modalidades, o teor de umidade das composições fornecidas está na faixa de cerca de 1% até cerca de 1,5% por peso. Em certas modalidades, o teor de umidade das composições fornecidas está na faixa de cerca de 1% até cerca de 2% por peso. Em certas modalidades, o teor de umidade das composições fornecidas está na faixa de cerca de 1,5% até cerca de 2% por peso.

[006] Em certas modalidades, a proporção de peso de lipídeo:antígeno em uma das composições mencionadas anteriormente é pelo menos cerca de 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 110:1, 120:1, 130:1, 140:1, 150:1, 160:1, 170:1, 180:1, 190:1, 200:1, 210:1, 220:1, 230:1, 240:1, 250:1, 260:1, 270:1, 280:1, 290:1 ou 300:1. Em certas modalidades, a proporção de peso de lipídeo:antígeno em uma das composições mencionadas anteriormente é de menos do que cerca de 400:1, 390:1, 380:1, 370:1, 360:1, 350:1, 340:1, 330:1, 320:1 ou 310:1.

[007] Em certas modalidades, a proporção de peso de lipídeo:antígeno em uma das composições mencionadas anteriormente está dentro de uma faixa de cerca de 50:1 até cerca de 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 110:1, 120:1, 130:1, 140:1, 150:1, 160:1, 170:1, 180:1, 190:1, 200:1, 210:1, 220:1, 230:1, 240:1, 250:1, 260:1, 270:1, 280:1, 290:1, 300:1, 310:1, 320:1, 330:1, 340:1, 350:1, 360:1, 370:1, 380:1, 390:1 ou 400:1. Em certas modalidades, a proporção de peso de lipídeo:antígeno em uma das composições mencionadas anteriormente está dentro de uma faixa de cerca de 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 110:1, 120:1, 130:1, 140:1, 150:1, 160:1, 170:1, 180:1, 190:1, 200:1, 210:1, 220:1, 230:1, 240:1, 250:1, 260:1, 270:1, 280:1, 290:1, 300:1, 310:1, 320:1, 330:1, 340:1, 350:1, 360:1, 370:1, 380:1 ou 390:1 até cerca de 400:1.

[008] Em certas modalidades, a proporção de peso de lipídeo:antígeno em uma das composições mencionadas anteriormente está dentro de uma faixa de cerca de 50:1 até cerca de 100:1, cerca de 50:1 até cerca de 150:1, cerca de 50:1 até cerca de 200:1, cerca de 50:1 até cerca de 250:1, cerca de 50:1 até cerca de 300:1, cerca de 50:1 até cerca de 350:1 ou cerca de 50:1 até cerca de 400:1. Em certas modalidades, a proporção de peso de lipídeo:antígeno em uma das composições mencionadas anteriormente está dentro de uma faixa de cerca de 100:1 até cerca de 150:1, cerca de 100:1 até cerca de 200:1, cerca de 100:1 até cerca de 250:1, cerca de 100:1 até cerca de 300:1, cerca de 100:1 até cerca de 350:1 ou cerca de 100:1 até cerca de 400:1. Em certas modalidades, a proporção de peso de lipídeo:antígeno em uma das composições mencionadas anteriormente está dentro de uma faixa de cerca de 150:1 até cerca de 200:1, cerca de 150:1 até cerca de 250:1, cerca de 150:1 até cerca de 300:1, cerca de 150:1 até cerca de 350:1 ou cerca de 150:1 até cerca de 400:1. Em certas modalidades, a proporção de peso de lipídeo:antígeno em uma das composições mencionadas anteriormente está dentro de uma faixa de cerca de 200:1 até cerca de 250:1, cerca de 200:1 até cerca de 300:1, cerca de 200:1 até cerca de 350:1 ou cerca de 200:1 até cerca de 400:1. Em certas modalidades, a proporção de peso de lipídeo:antígeno em uma das composições mencionadas anteriormente está dentro de uma faixa de cerca de 250:1 até cerca de 300:1, cerca de 250:1 até cerca de 350:1 ou cerca de 250:1 até cerca de 400:1. Em certas modalidades, a proporção de peso de lipídeo:antígeno em uma das composições mencionadas anteriormente está dentro de uma faixa de cerca de 300:1 até cerca de 350:1 ou cerca de 300:1 até cerca de 400:1. Em certas modalidades, a proporção de peso de lipídeo:antígeno em uma das composições mencionadas anteriormente está dentro de uma faixa de cerca de 350:1 até cerca de 400:1. Em certas modalidades, a proporção de peso de lipídeo:antígeno em uma das composições mencionadas anteriormente é de cerca de 200:1, 210:1, 220:1, 230:1, 240:1, 250:1, 260:1, 270:1, 280:1, 290:1, 300:1, 310:1, 320:1, 330:1, 340:1, 350:1, 360:1, 370:1, 380:1, 390:1 ou 400:1.

[009] Em certas modalidades, as composições mencionadas anteriormente exibem menos de 50% de alteração na imunogenicidade, como determinada por um ensaio de inibição da hemaglutinação (HAI) quando armazenadas por 6 meses a 40°C. Em certas modalidades, as composições fornecidas exibem menos de 40%, menos de 30%, menos de 20%, menos de 10%, menos de 5% ou menos de 2% de alteração na imunogenicidade.

[0010] Em certas modalidades, as composições mencionadas anteriormente exibem menos de 50% de perda do teor de antígeno, como determinado por um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) quando armazenadas por 6 meses a 40°C. Em certas modalidades, as composições fornecidas exibem menos de 40%, menos de 30%, menos de 20%, menos de 10%, menos de 5% ou menos de 2% de perda do teor de antígeno.

[0011] Em certas modalidades, as composições mencionadas anteriormente são mais estáveis quando armazenadas por 6 meses a 40°C do que uma composição de referência que não contém as vesículas lipídicas. Em certas modalidades, a estabilidade se baseia na imunogenicidade, como determinada por um ensaio de HAI. Em certas modalidades, a estabilidade se baseia no teor de antígeno, como determinado por um ELISA.

[0012] Ainda em outro aspecto, a presente revelação fornece composições imunogênicas que compreendem um antígeno de hemaglutinina do vírus influenza e vesículas lipídicas, em que as vesículas lipídicas são compostas por lipídeos que incluem um tensoativo não iônico e a composição exibe menos de 50% de alteração na imunogenicidade, como determinada por um ensaio de HAI quando armazenada por 6 meses a 40°C. Em certas modalidades, as composições fornecidas exibem menos de 40%, menos de 30%, menos de 20%, menos de 10%, menos de 5% ou menos de 2% de alteração na imunogenicidade.

[0013] Ainda em outro aspecto, a presente revelação fornece composições imunogênicas que compreendem um antígeno de hemaglutinina do vírus influenza e vesículas lipídicas, em que as vesículas lipídicas são compostas por lipídeos que incluem um tensoativo não iônico e a composição exibe menos de 50% de perda do teor de antígeno, como determinado por um ELISA, quando armazenada por 6 meses a 40°C. Em certas modalidades, as composições fornecidas exibem menos de 40%, menos de 30%, menos de 20%, menos de 10%, menos de 5% ou menos de 2% de perda do teor de antígeno.

[0014] Ainda em outro aspecto, a presente revelação fornece composições imunogênicas que compreendem um antígeno de hemaglutinina do vírus influenza e vesículas lipídicas, em que as vesículas lipídicas são compostas por lipídeos que incluem um tensoativo não iônico e a composição é mais estável quando armazenada por 6 meses a 40°C do que uma composição de referência que não contém as vesículas lipídicas. Em certas modalidades, a estabilidade se baseia na imunogenicidade, como determinada por um ensaio de HAI. Em certas modalidades, a estabilidade se baseia no teor de antígeno, como determinado por um ELISA.

[0015] Em certas modalidades, as composições mencionadas anteriormente são preparadas por um método que inclui: derretimento dos lipídeos para produzir lipídeos derretidos; combinação dos lipídeos derretidos com uma solução aquosa que inclui o antígeno de hemaglutinina do vírus influenza; e homogeneização do produto resultante.

[0016] Em certas modalidades, lipídeos (por exemplo, lipídeos derretidos) e solução aquosa são combinados em quantidades relativas que obtêm a proporção de peso de lipídeo:antígeno desejada no produto resultante (por exemplo, pelo menos cerca de 50:1 ou qualquer uma das faixas mencionadas anteriormente). Em certas modalidades, os lipídeos derretidos são adicionados à solução aquosa que inclui o antígeno de hemaglutinina do vírus influenza. Em certas modalidades, a solução aquosa que inclui o antígeno de hemaglutinina do vírus influenza é adicionada aos lipídeos derretidos.

[0017] Em certas modalidades, lipídeos (por exemplo, lipídeos derretidos) e solução aquosa são combinados em quantidades e volumes relativos que obtêm uma concentração de lipídeo de pelo menos cerca de 10 mg/ml no produto resultante. Em certas modalidades, uma concentração de lipídeo de pelo menos cerca de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ou 95 mg/ml é obtida. Em certas modalidades, a concentração de lipídeo está em uma faixa de cerca de 10 mg/ml até cerca de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 mg/ml. Em certas modalidades, a concentração de lipídeo está em uma faixa de cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ou 95 mg/ml até cerca de 100 mg/ml. Em certas modalidades, a concentração de lipídeo está em uma faixa de cerca de 25 mg/ml até cerca de 100 mg/ml, cerca de 25 mg/ml até cerca de 75 mg/ml, cerca de 25 mg/ml até cerca de 50 mg/ml, cerca de 50 mg/ml até cerca de 75 mg/ml ou cerca de 50 mg/ml até cerca de 100 mg/ml.

[0018] Em certas modalidades, lipídeos (por exemplo, lipídeos derretidos) e solução aquosa são combinados em quantidades e volumes relativos que obtêm tanto a proporção de peso de lipídeo:antígeno desejada (por exemplo, pelo menos cerca de 50:1 ou qualquer uma das faixas mencionadas anteriormente) quanto uma concentração de lipídeo de pelo menos cerca de 10 mg/ml (ou qualquer uma das outras faixas de concentração de lipídeo) no produto resultante.

[0019] Em certas modalidades, lipídeos (por exemplo, lipídeos derretidos) e antígeno são combinados em quantidades relativas que obtêm um teor de lipídeo de pelo menos cerca de 5 mg por dose unitária de composição (por exemplo, uma dose unitária de composição seca em um recipiente lacrado que está sendo armazenada antes da reidratação). Em certas modalidades, um teor de lipídeo de pelo menos cerca de 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 mg por dose unitária de composição é obtido. Em certas modalidades, o teor de lipídeo está em uma faixa de cerca de 5 mg até cerca de 50 mg, cerca de 5 mg até cerca de 40 mg, cerca de 5 mg até cerca de 30 mg, cerca de 10 mg até cerca de 50 mg, cerca de 10 mg até cerca de 40 mg, cerca de 10 mg até cerca de 30 mg, cerca de 20 mg até cerca de 50 mg, cerca de 20 mg até cerca de 40 mg ou cerca de 20 mg até cerca de 30 mg.

[0020] Em certas modalidades, lipídeos (por exemplo, lipídeos derretidos) e antígeno são combinados em quantidades relativas que obtêm tanto a proporção de peso de lipídeo:antígeno desejada (por exemplo, pelo menos cerca de 50:1 ou qualquer uma das faixas mencionadas anteriormente) quanto um teor de lipídeo de pelo menos cerca de 5 mg por dose unitária (ou qualquer uma das outras faixas de teores de lipídeo).

[0021] Em certas modalidades, lipídeos (por exemplo, lipídeos derretidos) e solução aquosa são combinados em quantidades e volumes relativos que obtêm a proporção de peso de lipídeo:antígeno desejada (por exemplo, pelo menos cerca de 50:1 ou qualquer uma das faixas mencionadas anteriormente), um teor de lipídeo de pelo menos cerca de 5 mg por dose unitária (ou qualquer uma das outras faixas de teores de lipídeo) e uma concentração de lipídeo de pelo menos cerca de 10 mg/ml (ou qualquer uma das outras faixas de concentração de lipídeo) no produto resultante.

[0022] Ainda em outro aspecto, a presente revelação fornece composições que compreendem um antígeno de hemaglutinina do vírus influenza e vesículas lipídicas, em que as vesículas lipídicas são compostas por lipídeos que incluem um tensoativo não iônico e as composições são preparadas por um método que inclui: derretimento dos lipídeos para produzir lipídeos derretidos; combinação dos lipídeos derretidos com uma solução aquosa que inclui o antígeno de hemaglutinina do vírus influenza; e homogeneização do produto resultante, em que os lipídeos derretidos e a solução aquosa são combinados em quantidades relativas que obtêm a proporção de peso de lipídeo:antígeno desejada (por exemplo, pelo menos cerca de 50:1 ou qualquer uma das faixas mencionadas anteriormente) no produto resultante. Em certas modalidades, os lipídeos derretidos são adicionados à solução aquosa que inclui o antígeno de hemaglutinina do vírus influenza. Em certas modalidades, solução aquosa que inclui o antígeno de hemaglutinina do vírus influenza é adicionada aos lipídeos derretidos.

[0023] Ainda em outro aspecto, a presente revelação fornece composições que compreendem um antígeno de hemaglutinina do vírus influenza e vesículas lipídicas, em que as vesículas lipídicas são compostas por lipídeos que incluem um tensoativo não iônico e as composições são preparadas por um método que inclui: derretimento dos lipídeos para produzir lipídeos derretidos; combinação dos lipídeos derretidos com uma solução aquosa que inclui o antígeno de hemaglutinina do vírus influenza; e homogeneização do produto resultante, em que os lipídeos derretidos e a solução aquosa são combinados em quantidades e volumes relativos que obtêm uma concentração de lipídeo de pelo menos cerca de 10 mg/ml (ou qualquer uma das outras faixas de concentração de lipídeo) no produto resultante. Em certas modalidades, os lipídeos derretidos e a solução aquosa são combinados em quantidades e volumes relativos que obtêm tanto a proporção de peso de lipídeo:antígeno desejada (por exemplo, pelo menos cerca de 50:1 ou qualquer uma das faixas mencionadas anteriormente) quanto uma concentração de lipídeo de pelo menos cerca de 10 mg/ml (ou qualquer uma das outras faixas de concentração de lipídeo) no produto resultante. Em certas modalidades, o teor de lipídeo também é pelo menos cerca de 5 mg por dose unitária (ou qualquer uma das outras faixas de teores de lipídeo). Em certas modalidades, os lipídeos derretidos são adicionados à solução aquosa que inclui o antígeno de hemaglutinina do vírus influenza. Em certas modalidades, solução aquosa que inclui o antígeno de hemaglutinina do vírus influenza é adicionada aos lipídeos derretidos.

[0024] Em certas modalidades, o antígeno de hemaglutinina do vírus influenza é de uma cepa de influenza A H1N1. Em certas modalidades, o antígeno de hemaglutinina do vírus influenza é de uma cepa de influenza A H3N2. Em certas modalidades, o antígeno de hemaglutinina do vírus influenza é de uma cepa de influenza B. Em certas modalidades, o antígeno de hemaglutinina do vírus influenza é de duas ou mais de uma cepa de influenza A H1N1, uma cepa de influenza A H3N2 e uma cepa de influenza B. Em certas modalidades, o antígeno de hemaglutinina do vírus influenza é de uma cepa de influenza A H1N1, uma cepa de influenza A H3N2 e uma cepa de influenza B. Em certas modalidades, as composições fornecidas compreendem quantidades aproximadamente iguais de antígeno de hemaglutinina do vírus influenza de cada cepa.

[0025] Em certas modalidades, as composições fornecidas compreendem um ou mais vírus influenza inativados que incluem antígeno de hemaglutinina do vírus influenza. Em certas modalidades, as composições fornecidas compreendem um ou mais vírus influenza atenuados que incluem antígeno de hemaglutinina do vírus influenza. Em certas modalidades, antígeno de hemaglutinina do vírus influenza está presente como um antígeno de vírus fracionado. Em certas modalidades, antígeno de hemaglutinina do vírus influenza está presente como um antígeno de subunidade. Em certas modalidades, pelo menos uma porção do antígeno de hemaglutinina do vírus influenza está associada a vesículas lipídicas. Em certas modalidades, pelo menos uma porção do antígeno de hemaglutinina do vírus influenza está contida dentro de vesículas lipídicas.

[0026] Em certas modalidades, as composições fornecidas ainda compreendem um adjuvante. Em certas modalidades, as composições fornecidas compreendem um adjuvante de agonista de TLR-4. Em certas modalidades, as composições fornecidas compreendem um derivado atenuado de lipídeo A. Em certas modalidades, as composições fornecidas compreendem um derivado monofosforil de lipídeo A. Em certas modalidades, as composições fornecidas compreendem um derivado 3-deacil monofosforil de lipídeo A. Em certas modalidades, pelo menos uma porção do adjuvante de agonista de TLR-4 está associada a vesículas lipídicas. Em certas modalidades, o adjuvante de agonista de TLR-4 é derretido em conjunto com lipídeos durante a preparação das composições fornecidas. Em certas modalidades, o adjuvante de agonista de TLR-4 é combinado com lipídeos derretidos e solução aquosa que inclui antígeno de hemaglutinina do vírus influenza durante a preparação das composições fornecidas (por exemplo, por misturação com a solução aquosa que inclui antígeno de hemaglutinina do vírus influenza antes de ser combinada com lipídeos derretidos). Em certas modalidades, o adjuvante de agonista de TLR-4 é adicionado antes da secagem (por exemplo, liofilização) das composições fornecidas.

[0027] Em certas modalidades, as composições fornecidas são preparadas por um método que não envolve seu armazenamento sob condições de temperatura controlada. Em certas modalidades, as composições fornecidas são preparadas por um método que envolve seu armazenamento em uma temperatura que pelo menos temporariamente excede 8°C, 15°C, 20°C, 25°C, 30°C ou 35°C.

[0028] Em certas modalidades, as composições fornecidas são preparadas por um método que envolve seu armazenamento em forma seca (por exemplo, liofilizada).

[0029] Em outro aspecto, a presente revelação fornece métodos de tratamento de um indivíduo que sofre de, ou em risco para, uma infecção por influenza por fornecimento de uma das composições mencionadas anteriormente em forma seca (por exemplo, liofilizada); a reidratação da composição; e a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição reidratada. Em certas modalidades, composições reidratadas são administradas por injeção intramuscular.

[0030] Ainda em outro aspecto, a presente revelação fornece métodos de preparação de composições que compreendem um antígeno de hemaglutinina do vírus influenza e vesículas lipídicas, em que as vesículas lipídicas são compostas por lipídeos que incluem um tensoativo não iônico, o método compreendendo: derretimento dos lipídeos para produzir lipídeos derretidos; combinação dos lipídeos derretidos com uma solução aquosa que inclui o antígeno de hemaglutinina do vírus influenza; e homogeneização do produto resultante, em que os lipídeos derretidos e a solução aquosa são combinados em quantidades relativas que obtêm a proporção de peso de lipídeo:antígeno desejada (por exemplo, pelo menos cerca de 50:1 ou qualquer uma das faixas mencionadas anteriormente) no produto resultante. Em certas modalidades, os lipídeos derretidos são adicionados à solução aquosa que inclui o antígeno de hemaglutinina do vírus influenza. Em certas modalidades, solução aquosa que inclui o antígeno de hemaglutinina do vírus influenza é adicionada aos lipídeos derretidos.

[0031] Ainda em outro aspecto, a presente revelação fornece métodos de preparação de composições que compreendem um antígeno de hemaglutinina do vírus influenza e vesículas lipídicas, em que as vesículas lipídicas são compostas por lipídeos que incluem um tensoativo não iônico, o método compreendendo: derretimento dos lipídeos para produzir lipídeos derretidos; combinação dos lipídeos derretidos com uma solução aquosa que inclui o antígeno de hemaglutinina do vírus influenza; e homogeneização do produto resultante, em que os lipídeos derretidos e a solução aquosa são combinados em quantidades e volumes relativos que obtêm uma concentração de lipídeo de pelo menos cerca de 10 mg/ml (ou qualquer uma das outras faixas de concentração de lipídeo) no produto resultante. Em certas modalidades, os lipídeos derretidos e a solução aquosa são combinados em quantidades e volumes relativos que obtêm tanto a proporção de peso de lipídeo:antígeno desejada (por exemplo, pelo menos cerca de 50:1 ou qualquer uma das faixas mencionadas anteriormente) quanto uma concentração de lipídeo de pelo menos cerca de 10 mg/ml (ou qualquer uma das outras faixas de concentração de lipídeo) no produto resultante. Em certas modalidades, os lipídeos derretidos são adicionados à solução aquosa que inclui o antígeno de hemaglutinina do vírus influenza. Em certas modalidades, solução aquosa que inclui o antígeno de hemaglutinina do vírus influenza é adicionada aos lipídeos derretidos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0032] A Figura 1 mostra a estrutura química do adjuvante de agonista de TLR-4 exemplar hexaacil dissacarídeo fosforilado (sal de amônio) ou PHAD (de Avanti Polar Lipids, Inc. de Alabaster, AL).

[0033] A Figura 2 mostra a estrutura química de outro adjuvante de agonista de TLR-4 exemplar di[3-desóxi- D-mano-octulosonil]-lipídeo A (sal de amônio) (de Avanti Polar Lipids, Inc. de Alabaster, AL).

[0034] A Figura 3 mostra a potência contra vírus H1N1 de uma vacina licenciada contra influenza exemplar em camundongos (dose-excedente a 1/30X dose unitária humana- padrão, em que uma “dose unitária de camundongo-padrão” é 0,1X da dose unitária humana-padrão, ou seja, após as diferenças de tamanho entre humanos e camundongos serem levadas em conta) formulada com NISV (Grupo 2) ou não formulada com NISV (Grupo 3) com o adjuvante de agonista de TLR-4 exemplar PHAD, comparada com a vacina licenciada contra influenza (dose-equivalente a 0,1X dose unitária humana-padrão, em que uma “dose unitária de camundongo- padrão” é 0,1X da dose unitária humana-padrão, ou seja, após as diferenças de tamanho entre humanos e camundongos serem levadas em conta) sem formulação em NISV ou adjuvante (Grupo 1), como descrito no Exemplo 2, Tabela 4.

[0035] A Figura 4 mostra a potência contra vírus H3N2 de uma vacina licenciada contra influenza exemplar em camundongos (dose-excedente a 1/30X dose unitária humana- padrão) formulada com NISV (Grupo 2) ou não formulada com NISV (Grupo 3) com o adjuvante de agonista de TLR-4 exemplar PHAD, comparada com a vacina licenciada contra influenza (dose-equivalente a 0,1X dose unitária humana- padrão) sem formulação em NISV ou adjuvante (Grupo 1), como descrito no Exemplo 2, Tabela 4.

[0036] A Figura 5 mostra a potência de resposta à dose contra vírus H1N1 (A) e vírus H3N2 (B) de uma vacina não formulada (ou seja, usada “como está”) contra influenza licenciada em camundongos (dose-equivalente a 0,1X dose unitária humana-padrão) versus a vacina licenciada contra influenza formulada com NISV (dose-excedente a 1/30X dose unitária humana-padrão) e sem adjuvante ou formulada com NISV com quantidades crescentes (1-50 μg) do adjuvante de agonista de TLR-4 exemplar PHAD. Todas as composições foram injetadas em camundongos IM e os soros foram testados 15 dias após a segunda imunização. Os resultados são apresentados como titulações de HAI contra H1N1 e H3N2 e a média geométrica (ou médias geométricas) para o mesmo conjunto de dados (ou conjuntos).

[0037] A Figura 6 mostra a potência contra vírus H1N1 e vírus H3N2 de uma vacina licenciada contra influenza exemplar em camundongos (dose-excedente a 1/30X dose unitária humana-padrão) formulada com NISV ou não formulada com NISV com o adjuvante de agonista de TLR-4 exemplar PHAD, comparada com a vacina licenciada contra influenza (dose-equivalente a 0,1X dose unitária humana-padrão) sem formulação em NISV ou adjuvante, como descrito no Exemplo 4, Tabela 6. Todas as composições foram armazenadas a 4°C e 40°C por 6 meses e depois injetadas em camundongos IM e os soros foram testados 15 dias após a segunda imunização. Os resultados são apresentados como titulações de HAI contra H1N1 ou H3N2.

[0038] A Figura 7 mostra a potência contra vírus H1N1 e vírus H3N2 de uma vacina contra influenza sem adjuvante licenciada exemplar em camundongos (dose- equivalente a 0,1X dose unitária humana-padrão) formulada com NISV, comparada com a vacina licenciada contra influenza (dose-equivalente a 0,1X dose unitária humana- padrão), como descrito no Exemplo 4, Tabela 6. Todas as composições foram armazenadas a 4°C e 40°C por 6 meses e depois injetadas em camundongos IM e os soros foram testados 15 dias após a segunda imunização. Os resultados são apresentados como titulações de HAI contra H1N1 ou H3N2.

[0039] A Figura 8 mostra dados in vitro do teor de antígeno de HA para Fluzone® comercial que foi: (A) formulada com NISVs ou (B) sem NISVs como determinado por sELISA; T = 0, 1, 3 e 6 meses armazenada a 4°C, 25°C e 40°C. Ambas as composições eram dose-excedentes e receberam o adjuvante de agonista de TLR-4 exemplar PHAD.

[0040] A Figura 9 mostra dados in vitro do teor de antígeno de HA for vacinas comerciais não formuladas contra influenza Fluzone®, Fluvirin® e FluLaval® versus as mesmas vacinas comerciais contra influenza formuladas com NISVs. Alíquotas de amostras reconstituídas foram analisadas por sELISA para determinar o teor de antígeno (ou “potência in vitro”) para as composições em T = 3 meses a 4°C e 40°C.

[0041] A Figura 10 mostra a potência contra vírus H3N2 de uma vacina licenciada contra influenza exemplar (dose-excedente a 1/3X dose unitária humana-padrão, em que uma “dose unitária de macaco-padrão” é 1X da dose unitária humana-padrão) em macacos Rhesus formulada com NISV e com o adjuvante de agonista de TLR-4 exemplar PHAD ou formulada com NISV e sem adjuvante, comparada com a vacina licenciada contra influenza (dose-equivalente a 1X dose unitária humana-padrão, em que uma “dose unitária de macaco-padrão” é 1X da dose unitária humana-padrão) sem formulação em NISV ou adjuvante.

[0042] A Figura 11 mostra o teor de antígeno de HA in vitro para Fluzone® comercial não formulada (Artigo de teste 8) versus uma composição de NISV-Fluzone® com proporção de lipídeo:antígeno de 300:1 (Artigo de teste 3), uma composição de NISV-Fluzone® com proporção de lipídeo:antígeno de 100:1 (Artigo de teste 2) e uma composição de NISV-Fluzone® com proporção de lipídeo:antígeno de 30:1 (Artigo de teste 1). Alíquotas de amostras reconstituídas foram analisadas por sELISA para determinar o teor de antígeno (ou “potência in vitro”) para as quatro composições a (A) T = 0 e (B) T = 3 meses a 40°C.

[0043] A Figura 12 mostra a potência contra (A) vírus H1N1 e (B) vírus H3N2 de várias composições de NISV- Fluzone® em diferentes proporções de lipídeo:antígeno, concentrações de lipídeo e teores de lipídeo, como descrito no Exemplo 7. As composições em T = 0 foram injetadas em camundongos IM e os soros foram testados 15 dias após a segunda imunização. Os resultados são apresentados como titulações de HAI individuais contra H1N1 e H3N2 e a média geométrica (ou médias geométricas) para o mesmo conjunto de dados (ou conjuntos).

[0044] A Figura 13 mostra a potência contra (A) vírus H1N1 e (B) vírus H3N2 de várias composições de NISV- Fluzone® em diferentes proporções de lipídeo:antígeno e diferentes concentrações de lipídeo (durante homogeneização e/ou reconstituição), como descrito no Exemplo 7. Todas as composições foram armazenadas a 4°C e 40°C por 3 meses e depois injetadas em camundongos IM e os soros foram testados 15 dias após a segunda imunização. Os resultados são apresentados como a média geométrica de titulações de HAI contra H1N1 e H3N2.

Definições

[0045] Ao longo da presente revelação, são empregados vários termos que são definidos nos parágrafos seguintes.

[0046] Como aqui usado, o termo “antígeno” se refere a uma substância que contém um ou mais epitopos (lineares, conformacionais ou ambos) que são reconhecidos por um anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humano, em algumas modalidades, despertado em um organismo humano exposto ao antígeno, em algumas modalidades, quando essa exposição ocorre por ou inclui exposição na corrente sangüínea. Em certas modalidades, um antígeno pode ser um “imunógeno”.

[0047] Como aqui usado, o termo “resposta imune” se refere a uma resposta despertada em um animal hospedeiro. Uma resposta imune pode se referir a imunidade celular, imunidade humoral ou pode envolver ambas. Uma resposta imune pode ser limitada a uma parte do sistema imune. Por exemplo, em certas modalidades, uma resposta de IFNy aumentada é considerada como sendo uma resposta imune. Em certas modalidades, uma resposta de IgA mucosa (por exemplo, como medida em lavagens nasais e/ou retais) é considerada como sendo uma resposta imune. Em certas modalidades, uma resposta de IgG sistêmica (por exemplo, como medida no soro) é considerada como sendo uma resposta imune. Em certas modalidades, a produção, pelo animal hospedeiro, de anticorpos que inibem hemaglutinação, por exemplo, como medida em um ensaio de inibição da hemaglutinação (HAI) é considerada como sendo uma resposta imune.

[0048] Como aqui usado, o termo “imunogênica” é usado para se referir a uma substância que produz uma resposta imune em um animal hospedeiro contra uma entidade que não é do hospedeiro (por exemplo, um vírus influenza). Em certas modalidades, essa resposta imune forma a base da imunidade protetora despertada por uma vacina contra um organismo infeccioso específico (por exemplo, um vírus influenza). Em certas modalidades, uma substância imunogênica produz uma resposta imune em humanos. Em certas modalidades, uma substância imunogênica produz uma resposta imune quando colocada em contato com a corrente sangüínea de um corpo, por exemplo, de um corpo humano.

[0049] Como aqui usado, o termo “quantidade terapeuticamente eficaz” se refere a uma quantidade suficiente para exibir um benefício significativo em um indivíduo que está sendo tratado, quando administrada como parte de um regime de dosagem terapêutica. Aqueles habilitados na técnica irão observar que, em algumas modalidades, uma composição particular pode ser considerada como contendo uma quantidade terapeuticamente eficaz caso contenha uma quantidade apropriada para uma forma de dosagem unitária administrada em um regime de dosagem terapêutica, embora essa quantidade possa ser insuficiente para obter o benefício significativo se administrada como uma dose unitária única. Aqueles habilitados observarão ainda que uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição imunogênica pode diferir para indivíduos diferentes que recebem a composição, por exemplo, dependendo de fatores como, por exemplo, o resultado biológico final desejado, a natureza da composição, a via de administração, a saúde, o tamanho e/ou idade do indivíduo que está sendo tratado etc. Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz é aquela que foi correlacionada com o efeito benéfico quando administrada como parte de um regime de dosagem terapêutica particular (por exemplo, uma administração única ou uma série de administrações como, por exemplo, em um regime de “reforço” tradicional). Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz é aquela que foi aprovada por uma agência de licenciamento de substâncias terapêuticas (por exemplo, o “Food and Drug Administration” ou a “European Medicines Agency”) como parte de um regime de dosagem terapêutica particular (por exemplo, veja as bulas para várias vacinas licenciadas contra influenza, como apresentado pelo “Food and Drug Administration” em: www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/Vaccines/ApprovedProduct /ucm181950.htm para vacinas monovalentes licenciadas e www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/Vaccines/ApprovedProduct s/ucm094045.htm para vacinas trivalentes licenciadas).

[0050] Como aqui usado, o termo “tratar” (ou “que trata”, “tratada”, “tratamento” etc.) se refere à administração das composições fornecidas a um indivíduo que sofre ou suscetível a uma doença, um sintoma de uma doença ou uma predisposição a uma doença, com a finalidade de aliviar, diminuir, alterar, melhorar ou afetas a doença, um sintoma ou sintomas da doença ou a predisposição à doença. Em certas modalidades, o termo “que trata” se refere à vacinação de um indivíduo. Em geral, o tratamento pode obter redução da gravidade e/ou freqüência de um ou mais sintomas ou características da doença, e/ou pode retardar o surgimento de um ou mais desses sintomas ou características.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE CERTAS MODALIDADES

[0051] Todas as vacinas perdem potência ao longo do tempo e a taxa de perda de potência depende da temperatura. Portanto, foram estabelecidos sistemas de cadeia do frio para assegurar que a potência de vacinas seja mantida por seu armazenamento sob condições refrigeradas (na maioria dos casos entre 2 e 8°C) até o ponto de uso. O estabelecimento de uma cadeia do frio para armazenamento e distribuição de vacinas é uma tarefa importante e a manutenção é difícil. Também é evidente que, apesar dos melhores esforços, cadeias do frio nem sempre funcionam como esperado por muitas razões, por exemplo, equipamento de refrigeração mantido inadequadamente ou obsoleto, interrupções de energia que levam à falha do equipamento, pouca aceitação dos procedimentos da cadeia do frio e monitoramento inadequado. O resultado é que vacinas na cadeia do frio são freqüentemente submetidas a variações de temperatura (ou seja, temperaturas foram da faixa-alvo).

[0052] Para as vacinas trivalentes contra influenza atuais no mercado que são predominantemente disponíveis em uma composição líquida, é importante compreender a importância dos requisitos da cadeia do frio e do gerenciamento adequado de vacinas a fim de assegurar que os indivíduos estejam recebendo uma vacina contra influenza estável e potente. Se as vacinas contra influenza não são mantidas adequadamente (por exemplo, não mantidas dentro da faixa de temperatura necessária de 2 a 8°C), a vacina pode se tornar instável e isso, por sua vez, possui um significante sobre a potência que pode resultar no fato de o indivíduo vacinado não converter sorologicamente pós- imunização. Os indivíduos vacinados acreditam que estão protegidos já que foram imunizados quando, na verdade, permanecem vulneráveis à infecção por influenza, porque a vacina não é potente em conseqüência da instabilidade resultante de variações de temperatura.

[0053] A presente revelação fornece composições e métodos para o tratamento de influenza que solucionam alguns desses desafios. Como aqui descrito, as composições e os métodos fornecidos se baseiam no desenvolvimento de certas composições que incluem um antígeno de hemaglutinina do vírus influenza em combinação com vesículas lipídicas que incluem um tensoativo não iônico (NISVs) e, opcionalmente, um adjuvante. Em certas modalidades, as composições fornecidas permanecem potentes até mesmo quando não são armazenadas em um sistema de cadeia do frio padronizado (ou seja, são termoestáveis).

I. Antígeno de hemaglutinina do vírus Influenza

[0054] Em geral, as composições da presente revelação incluem um antígeno de hemaglutinina do vírus influenza. O antígeno de hemaglutinina utilizado de acordo com a presente invenção não está limitado aos antígenos de hemaglutinina do tipo selvagem de comprimento total e, como aqui usado, o termo “antígeno de hemaglutinina”, portanto, também engloba fragmentos imunogênicos e variantes de antígenos de hemaglutinina do tipo selvagem de comprimento total. O termo “antígeno de hemaglutinina” também engloba proteínas de fusão e conjugados que incluem qualquer um dos citados anteriormente. A quantidade de antígeno de hemaglutinina nas composições fornecidas pode ser determinada por qualquer método conhecido na técnica. Em algumas modalidades, a quantidade de antígeno de hemaglutinina pode ser determinada por um ELISA (por exemplo, um ou mais sELISAs de subtipo específico). Essa abordagem é comumente usada para padronizar a quantidade de antígeno em vacinas de vírus fracionado.

[0055] Não há restrições em relação ao tipo de antígeno de hemaglutinina usado. Em particular, o antígeno de hemaglutinina pode ser retirado de uma única cepa de vírus influenza ou uma combinação de cepas de vírus influenza. Como descrito acima, as vacinas contra influenza atuais são normalmente vacinas “trivalentes” que contêm antígenos derivados de duas cepas do vírus influenza A (por exemplo, H1N1 e H3N2) e uma cepa de influenza B. Dessa forma, em certas modalidades, uma composição trivalente da presente revelação pode incluir antígeno de hemaglutinina de uma cepa de influenza A H1N1, uma cepa de influenza A H3N2 e uma cepa de influenza B. Certas composições trivalentes podem compreender quantidades aproximadamente iguais de antígeno de hemaglutinina de cada uma dessas cepas.

[0056] Vacinas monovalentes também são conhecidas na técnica e são englobadas pela presente invenção. Em algumas modalidades, as composições fornecidas são monovalentes. Vacinas monovalentes são freqüentemente consideradas como sendo particularmente úteis, por exemplo, em uma situação pandêmica. Uma vacina contra influenza monovalente, pandêmica, conterá provavelmente antígeno de hemaglutinina de uma única cepa A. Em algumas modalidades, o antígeno de hemaglutinina para uso em uma composição monovalente será derivada de uma cepa de influenza pandêmica. Por exemplo, em algumas modalidades, o antígeno de hemaglutinina para uso em uma composição monovalente é de uma cepa de influenza A (H1N1 de origem suína). Como demonstrado nos Exemplos, composições que incluem antígeno de hemaglutinina de uma cepa de influenza A H3N2 (isoladamente ou em combinação com outros antígenos) são de interesse particular, pois antígenos dessa cepa parecem ser particularmente sensíveis a temperaturas elevadas.

[0057] Também não há restrições sobre a fonte do antígeno de hemaglutinina usado (ou seja, nativo, recombinante, sintético etc.). Predominantemente, três tipos de vacinas são usados em todo o mundo para proteger contra influenza: vacinas de vírus inteiro, vacinas de vírus fracionado contendo componentes externos e internos do vírus, e vacinas de subunidade compostas apenas por componentes externos do vírus (hemaglutinina e neuraminidase).

[0058] Em certas modalidades, as composições da presente invenção compreendem um ou mais vírus inteiros que incluem antígeno de hemaglutinina. Em certas modalidades, os vírus influenza são inativados. Será observado que pode ser usado qualquer método para preparar um vírus influenza inativado. WO 09/029695 descreve métodos exemplares para produção de uma vacina de vírus inteiro inativado. Em geral, esses métodos envolverão a propagação de um vírus influenza em uma célula hospedeira, opcionalmente lise da célula hospedeira para liberar o vírus, isolamento e depois inativação do vírus. O tratamento químico (por exemplo, formalina, formaldeído, entre outros) é comumente usado para inativar vírus para preparação de vacinas. No entanto, subentende-se que outras técnicas poderiam ser usadas, por exemplo, tratamento com cloro, exposição a temperaturas elevadas etc. Nesses tratamentos, o revestimento externo do vírion é tipicamente deixado intacto, enquanto a função de replicação é danificada. Em certas modalidades, os vírus influenza são atenuados. Como é bem conhecido na técnica, uma vantagem de uma vacina preparada com um vírus atenuado se baseia no potencial para uma imunogenicidade maior que resulta de sua habilidade para replicar in vivo, sem causar uma infecção plena. Vacinas de vírus vivo que são preparadas a partir de cepas atenuadas preferivelmente não possuem patogenicidade, mas ainda são capazes de replicar no hospedeiro. Um método que tem sido usado na técnica para a preparação de vírus influenza atenuados é a adaptação viral, que envolve a passagem serial de uma cepa viral através de múltiplas culturas de células. Ao longo do tempo a cepa sofre mutação e cepas atenuadas podem então ser identificadas. Em certas modalidades o vírus pode ser passado através de diferentes culturas de células. Em certas modalidades, pode se mostrar vantajoso realizar uma ou mais das etapas da cultura de células em uma temperatura reduzida.

[0059] Em certas modalidades, antígenos de hemaglutinina do vírus influenza utilizados de acordo com a presente invenção se baseiam na tecnologia de vacina de vírus fracionado. Vacinas de vírus fracionado tipicamente contêm uma concentração maior das porções mais imunogênicas do vírus (por exemplo, hemaglutinina e neuraminidase) reduzindo, ao mesmo tempo, a concentração de proteínas virais menos imunogênicas, bem como de proteínas não virais presentes de ovos (usados para produzir o vírus) ou agentes extrínsecos (por exemplo, vírus da leucose aviária, outros microorganismos e restos celulares). Geralmente, vacinas de vírus fracionado são preparadas por um processo físico que envolve a ruptura da partícula viral, tipicamente com um solvente orgânico ou um detergente (por exemplo, Triton X 100), e separação ou purificação das proteínas virais em graus variáveis, por exemplo, por centrifugação por um gradiente de sacarose ou passagem de fluido alantóico em uma coluna cromatográfica. Em algumas modalidades, a ruptura e separação de partículas virais são seguidas por diálise ou ultrafiltração. Métodos de fracionamento viral, bem como de fracionamento adequados, são conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Publicação de Patente U.S. N° 20090155309).

[0060] Em certas modalidades, os antígenos de hemaglutinina do vírus influenza utilizados de acordo com a presente invenção se baseiam na tecnologia de vacina de subunidade. Geralmente, vacinas de subunidade contêm somente aquelas partes do vírus influenza que são necessárias para vacinação eficaz (por exemplo, despertar uma resposta imune protetora). Em algumas modalidades, os antígenos de subunidade de influenza são preparados a partir de partículas virais (por exemplo, purificação de componentes particulares do vírus). Em algumas modalidades, os antígenos de subunidade de influenza são preparados por métodos recombinantes (por exemplo, expressão em cultura de células). Por exemplo, a Patente U.S. N° 5.858.368 descreve métodos de preparação de uma vacina recombinante contra influenza usando tecnologia de DNA. A vacina contra influenza trivalente resultante se baseia em uma mistura de antígenos de hemaglutinina recombinantes clonados de cepas de vírus influenza que possuem potencial epidêmico. Os antígenos de hemaglutinina recombinantes são glicoproteínas de comprimento total, não clivadas, produzidas a partir de vetores de expressão de baculovírus em células de inseto cultivadas e purificadas sob condições não desnaturantes. Em algumas modalidades, os antígenos de subunidade são gerados por métodos sintéticos (por exemplo, síntese peptídica). As vacinas de subunidade também podem conter antígenos de hemaglutinina purificados preparados por cepas selecionadas determinadas pela OMS.

[0061] Em certas modalidades, os antígenos de hemaglutinina podem ser originados de uma ou mais vacinas licenciadas contra influenza. Em certas modalidades, antígeno de hemaglutinina (opcionalmente com outros antígenos, por exemplo, antígeno de neuraminidase) pode ser purificado da vacina licenciada contra influenza e depois utilizado nas composições fornecidas. Em certas modalidades, uma vacina licenciada contra influenza pode ser usada “como está” sem nenhuma purificação. A Tabela 1 é uma lista não limitante de vacinas licenciadas contra influenza. Informações completas de prescrição e detalhes em relação a essas vacinas licenciadas podem ser obtidas nas bulas que são fornecidas com as próprias vacinas, pelos fabricantes ou fornecedores, e/ou pelo “Food and Drug Administration” (por exemplo, veja www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/Vaccines/ApprovedProduct s/ucm181950.htm para vacinas monovalentes licenciadas e www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/Vaccines/ApprovedProduct s/ucm094045.htm para vacinas trivalentes licenciadas). O conteúdo dessas bulas é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Tabela 1

[0062] Nas seções seguintes discutiremos esses e outros antígenos de influenza exemplares que poderiam ser usados nas composições e métodos da presente revelação.

[0063] Fluzone®, uma vacina inativada fracionada trivalente contra influenza, é desenvolvida e fabricada por Sanofi Pasteur, Inc. e pode ser usada de acordo com a presente revelação. Fluzone® contém uma suspensão estéril preparada a partir de vírus influenza propagados em ovos embrionados de galinha. Os fluidos contendo vírus são coletados e inativados com formaldeído. O vírus influenza é concentrado e purificado em uma solução de gradiente de densidade linear de sacarose usando uma centrífuga de fluxo contínuo. O vírus é então quimicamente rompido usando um tensoativo não iônico, octoxinol-9 (Triton® X-100), produzindo um antígeno viral fracionado. O vírus fracionado é então ainda purificado por meios químicos e suspendo em solução isotônica de cloreto de sódio tamponada com fosfato de sódio. A vacina Fluzone® é então padronizada de acordo com as necessidades da temporada de influenza e é formulada para conter 45 μg de antígeno de hemaglutinina (HA) por dose unitária de 0,5 ml, na proporção recomendada de 15 μg de HA cada, representativa das três cepas-protótipo (por exemplo, a vacina de 2007-2008 foi preparada com HA das cepas A/Ilhas Salomão/3/2006 (H1N1), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) e B/Malásia/2506/2004). Fluzone® é formulada para injeção intramuscular (IM).

[0064] Outro exemplo de uma vacina licenciada contra influenza que pode ser usada de acordo com a presente revelação é Vaxigrip®, que é uma vacina inativada fracionada trivalente contra influenza também desenvolvida e fabricada por Sanofi Pasteur, Inc. Vaxigrip® é preparada de forma similar ao processo descrito acima para Fluzone® e é formulada similarmente para injeção intramuscular.

[0065] Ainda outro exemplo de uma vacina licenciada contra influenza que pode ser usada de acordo com a presente revelação é Flumist®. Flumist® é uma vacina trivalente viva atenuada para administração por spray intranasal. As cepas de vírus influenza em Flumist® possuem três mutações genéticas que levam crescimento restringido por temperatura e um fenótipo atenuado. O efeito cumulativo das propriedades antigênicas e dos vírus influenza geneticamente modificados é que são capazes de replicar no nasofaringe para induzir imunidade protetora. A fim de produzir Flumist®, ovos livres de patógenos específicos (SPF) são inoculados com cada uma das cepas virais apropriadas e incubados para permitir a replicação do vírus da vacina. O fluido alantóico desses ovos é coletado, reunido em pool e depois clarificado por filtração. O vírus é concentrado por ultracentrifugação e diluído com tampão de estabilização para obter as concentrações finais de sacarose e fosfato de potássio. O material viral coletado é então filtrado de forma estéril para produzir as bateladas monovalentes. As bateladas monovalentes das três cepas são subseqüentemente misturadas e diluídas da forma necessária para adquirir a potência desejada com tampões de estabilização para produzir a vacina em batelada trivalente. A vacina em batelada é então preenchida diretamente em pulverizadores individuais para administração nasal. Cada pulverizador pré-preenchido refrigerado de Flumist® contém uma única dose unitária de 0,2 ml. Cada dose unitária de 0,2 ml contém 106,5-7,5 FFU de reordenados de vírus influenza vivo atenuado de cada uma das três cepas virais apropriadas.

[0066] Como descrito acima, diversas vacinas contra influenza estão licenciadas atualmente. Deve ser subentendido que qualquer uma ou uma combinação dessas vacinas licenciadas contra influenza pode ser combinada com vesículas lipídicas, como aqui descrito. Por exemplo, Fluzone® comercial pode ser combinada dessa forma para produzir uma composição. Em algumas modalidades, vacinas licenciadas contra influenza inicialmente são purificadas (por exemplo, para remover adjuvante ou outros reagentes na vacina). Em algumas modalidades, as vacinas licenciadas contra influenza não são purificadas (ou seja, elas são usadas “como estão”) antes da formulação com vesículas lipídicas, como aqui descrito.

II. Adjuvantes

[0067] As composições da presente revelação podem incluir um adjuvante. Como é bem conhecido na técnica, adjuvantes são agentes que intensificam as respostas imunes (por exemplo, veja “Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach”, Pharmaceutical Biotechnology, Volume 6, Eds. Powell e Newman, Plenum Press, New York e Londres, 1995).

[0068] Receptores Toll-like (TLRs) são uma família de proteínas homólogas ao receptor Toll de Drosophila, que reconhecem padrões moleculares associados a patógenos e, dessa forma, ajudam o corpo na distinção entre moléculas self e non-self. Substâncias comuns em patógenos virais são reconhecidas por TLRs como padrões moleculares associados a patógenos. Por exemplo, sem limitação, acredita-se que TLR- 4 reconheça padrões em lipopolissacarídeos (TLR-4 também foi designado CD284 ou agrupamento de diferenciação 284); enquanto se acredita que TLR-7/8 reconheça RNAs de fita simples e pequenas moléculas sintéticas; e que TLR-9 reconheça DNA bacteriano não metilado ou oligonucleotídeos sintéticos. Quando um TLR é disparado por um reconhecimento de padrão desse tipo, ocorre uma série de eventos de sinalização que leva à inflamação e ativação de respostas imunes inatas e adaptivas.

[0069] Em algumas modalidades, as composições fornecidas incluem um adjuvante de agonista de TLR-4. Diversos ligantes sintéticos que contêm os padrões moleculares reconhecidos por TLR-4 (agonistas de TLR-4) foram desenvolvidos como adjuvantes e podem ser incluídos nas composições fornecidas. Derivados atenuados de lipídeo A (ALD), por exemplo, monofosforil lipídeo A (MPL) e 3- deacil monofosforil lipídeo A (3D-MPL), são adjuvantes exemplares que são agonistas para TLR-4. ALDs são moléculas lipídeo A-like que foram alteradas ou construídas para reduzir ou modificar os efeitos adversos do lipídeo A. Esses efeitos adversos incluem pirogenicidade, reatividade de Shwarzman local e toxicidade, como avaliadas no ensaio de dose letal para 50% (CELD50) em embrião de pinto. MPL e 3D-MPL são descritos nas Patentes U.S. Nos 4.436.727 e 4.912.094, respectivamente. MPL foi originalmente derivado de lipídeo A, um componente de lipopolissacarídeos enterobacterianos (LPS), um modulador do sistema imune potente, mas altamente tóxico. Derivados sintéticos exemplares de MPL são descritos na Publicação PCT N° WO 95/14026 e também nas Publicações de Patente U.S. Nos 20080131466 e 20090181078. 3D-MPL difere de MPL pelo fato de que o resíduo acil que está ligado por éster à glicosamina da extremidade redutora na posição 3 foi seletivamente removido (por exemplo, veja as Patentes U.S. Nos 4.877.611, 4.866.034 e 4.912.094). Será observado que MPL, 3D-MPL e seus derivados podem incluir uma mistura de diversos padrões de substituição de ácido graxo, ou seja, heptaacil, hexaacil, pentaacil etc., com comprimentos variáveis da cadeia de ácido graxo. Dessa forma, várias formas de MPL e 3D-MPL, incluindo misturas destes, estão englobadas pela presente revelação.

[0070] MPL está disponível por Avanti Polar Lipids, Inc. de Alabaster, AL, como PHAD ou hexaacil dissacarídeo fosforilado (sal de amônio). A Figura 1 mostra uma estrutura química de PHAD. A estrutura de di[3-desóxi-D- mano-octulosonil]-lipídeo A (sal de amônio), outro adjuvante de agonista de TLR-4 exemplar, é mostrada na Figura 2 (também de Avanti Polar Lipids, Inc. de Alabaster, AL). Em algumas modalidades, esses ou outros ALDs podem ser combinados com trehalose-dimicolato (TDM) e esqueleto da parede celular (CWS), por exemplo, em uma emulsão de esqualeno 2%/TweenTM 80 (por exemplo, veja a Patente GB N° 2122204).

[0071] Aqueles habilitados na técnica são capazes de identificar outros adjuvantes de agonista de TLR-4 adequados. Por exemplo, alquil glicosaminida fosfatos (AGPs), tais como aqueles revelados na Publicação PCT N° WO 98/50399 ou nas Patentes U.S. Nos 6.303.347 e 6.764.840, podem ser usados. Outros agonistas de TLR-4 adequados são descritos nas Publicações PCT N° WO 03/011223 e WO 03/099195 (por exemplo, compostos I-III revelados nas páginas 4-5 de WO 03/011223 ou nas páginas 3-4 de WO 03/099195 e, em particular, aqueles compostos revelados em WO 03/011223 as ER803022, ER803058, ER803732, ER804053, ER804057, ER804058, ER804059, ER804442, ER804680 e ER804764).

[0072] Em algumas modalidades, as composições fornecidas incluem entre cerca de 1 e 50 μg de um adjuvante de agonista de TLR-4. Em certas modalidades, as composições fornecidas incluem entre cerca de 1-40, 1-30, 1-20, 1-10 ou 1-5 μg de um adjuvante de agonista de TLR-4. Em certas modalidades, as composições fornecidas incluem entre cerca de 10-40, 10-30 ou 10-20 μg de um adjuvante de agonista de TLR-4. Em certas modalidades, as composições fornecidas incluem entre cerca de 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9 ou 1-10 μg de um adjuvante de agonista de TLR-4. Em certas modalidades, as composições fornecidas incluem entre cerca de 5-20, 5-18, 5-16, 5-14, 5-12, 5-10, 5-9, 5-8 ou 5 7 μg de um adjuvante de agonista de TLR-4.

[0073] Em algumas modalidades, as composições fornecidas incluem um adjuvante de agonista de TLR-7/8. Diversos ligantes sintéticos que contêm os padrões moleculares reconhecidos por TLR-7/8 (agonistas de TLR-7/8) foram desenvolvidos como adjuvantes e podem ser incluídos nas composições fornecidas. Ligantes de TLR-7/8 exemplares incluem, sem limitação, CL075 (um derivado de tiazoloquinolona), CL097 (um composto de imidazoquinolina altamente hidrossolúvel), e R848 (um composto sintético de imidazoquinolina de peso molecular baixo), cada um dos quais sendo disponível por InvivoGen de San Diego, CA. Em alguns casos, poli(dT), um fosforotioato oligodesoxinucleotídeo de homopolímero de timidina, pode ser usado em combinação com uma imidazoquinolina para aumentar a sinalização mediada por TLR-8 e/ou para diminuir a sinalização mediada por TLR-7 (por exemplo, veja Jurk e cols., Eur. J. Immunol. 36(7): 1.815-26, 2006). Aqueles habilitados na técnica são capazes de identificar quantidades e/ou derivados de adjuvantes de agonista de TLR-7/8 adequados para uso de acordo com a presente invenção.

[0074] Em algumas modalidades, as composições fornecidas incluem um adjuvante de agonista de TLR-9. Em geral, DNA bacteriano é rico em dinucleotídeos de 2’- desoxirribo-(citidina-fosfatoguanosina) (CpG) não metilados, em contraste com DNA mamífero, que tipicamente contém uma freqüência baixa de dinucleotídeos CpG que são em grande parte metilados. Foi demonstrado que CpGs não metilados, em contextos de base particulares, denominados motivos CpG, ativam o sistema imune por meio de TLR-9. Em alguns casos, o reconhecimento por TLR-9 de DNA de CpG leva à produção de citocinas pró-inflamatórias (por exemplo, IL- 6, IL-12). Motivos CpG podem conter uma seqüência conservada central que leva a níveis elevados de estimulação de um TLR-9 em uma espécie particular. Por exemplo, foi demonstrado que GACGTT estimulam altamente TLR-9 de camundongo, enquanto foi demonstrado que motivos CpG que contêm mais de um CpG e a seqüência central GTCGTT estimulam TLR-9 humano. Diversos ligantes sintéticos que contêm os padrões moleculares reconhecidos por TLR-9 (agonistas de TLR-9) foram desenvolvidos como adjuvantes e podem ser incluídos nas composições fornecidas. Aqueles habilitados na técnica são capazes de identificar quantidades e/ou derivados de adjuvantes de agonista de TLR-9 adequados para uso de acordo com a presente invenção.

[0075] Em certas modalidades, pelo menos uma porção de adjuvante está associada a vesículas lipídicas. Em certas modalidades, pelo menos uma porção de adjuvante não está associada a vesículas lipídicas. Em certas modalidades, o adjuvante é derretido em conjunto com lipídeos durante a preparação das composições fornecidas. Em certas modalidades, o adjuvante é combinado com lipídeos derretidos e solução aquosa que inclui antígeno de hemaglutinina do vírus influenza durante a preparação das composições fornecidas (por exemplo, por misturação com a solução aquosa que inclui antígeno de hemaglutinina do vírus influenza antes de ser combinada com lipídeos derretidos). Em certas modalidades, o adjuvante é adicionado antes da secagem (por exemplo, liofilização) das composições fornecidas.

III. Vesículas lipídicas

[0076] Em geral, as composições da presente revelação incluem vesículas lipídicas que são compostas por lipídeos que incluem um tensoativo não iônico. Essas vesículas lipídicas também são aqui denominadas “vesículas tensoativas não iônicas” ou “NISVs”. Como é bem conhecido na técnica, vesículas geralmente possuem um compartimento aquoso circundado por uma ou mais bicamadas lipídicas.

Tensoativo não iônico

[0077] Qualquer tensoativo não iônico com propriedades anfipáticas apropriadas pode ser usado para formar vesículas para uso de acordo com a presente invenção. Sem limitação, exemplos de tensoativos adequados incluem tensoativos com ligação éster à base de glicerol. Esses ésteres de glicerol podem compreender um dos dois grupos acil alifáticos superiores contendo, por exemplo, pelo menos dez átomos de carbono em cada porção acil. Tensoativos à base desses ésteres de glicerol podem compreender mais de uma unidade de glicerol, por exemplo, até 5 unidades de glicerol. Podem ser usados monoésteres de glicerol, por exemplo, aqueles que contêm uma porção C12-C20 alcanoil ou alquenoil, por exemplo, caproil, lauroil, miristoil, palmitoil, oleil ou estearoil. Um tensoativo exemplar com ligação éster é 1-monopalmitoil glicerol.

[0078] Alternativamente ou adicionalmente, tensoativos com ligação éter podem ser usados ou incluídos como um tensoativo não iônico de acordo com a presente invenção. Por exemplo, tensoativos com ligação éter à base de glicerol ou um glicol que possui um glicol alifático inferior de até 4 átomos de carbono, por exemplo, etileno glicol, são adequados. Tensoativos à base de glicóis podem compreender mais de uma unidade de glicol, por exemplo, até 5 unidades de glicol (por exemplo, éter de diglicolcetil e/ou polioxietileno-3-lauril éter). Podem ser usados monoéteres de glicol ou glicerol, incluindo aqueles que contêm uma porção C12-C20 alcanil ou alquenil, por exemplo, capril, lauril, miristil, cetil, oleil ou estearil. Produtos da condensação de óxido etileno que podem ser usados incluem aqueles revelados na Publicação PCT N° WO 88/06882 (por exemplo, tensoativos de éter alifático superior e amina de polioxietileno). Tensoativos com ligação éter exemplares incluem éter de 1-monocetil glicerol e éter de diglicolcetil.

Anfifílico iônico

[0079] Deve ser subentendido que os lipídeos usados para produzir as vesículas lipídicas para uso de acordo com a presente invenção podem incorporar um anfifílico iônico, por exemplo, de modo tal que as vesículas adquiram uma carga negativa. Por exemplo, isso pode ajudar a estabilizar as vesículas e fornecer dispersão eficaz.

[0080] Sem limitação, materiais ácidos como, por exemplo, ácidos alcanóico e alquenóicos superiores (por exemplo, ácido palmítico, ácido oléico) ou outros compostos que contêm grupos ácidos que incluem fosfatos como, por exemplo, dialquil fosfatos (por exemplo, dicetilfosfato ou ácido fosfatídico ou fosfatidil serina) e monoésteres de sulfato, por exemplo, alquil sulfatos superiores (por exemplo, cetil-sulfato), podem ser usados para essa finalidade. O anfifílico iônico, se presente, tipicamente compreenderão, entre 1 e 50% por peso do tensoativo não iônico (por exemplo, 1-5%, 1-10%, 1-15%, 1-20, 1-25%, 1 30%, 1-35%, 1-40%, 1-45%, 5-10%, 5-15%, 5-20%, 5-25%, 5 30%, 5-35%, 5-40%, 5-45%, 5-50%, 10-15%, 10-20%, 10-25%, 10-30%, 10-35%, 10-40%, 10-45%, 10-50%, 15-20%, 15-25%, 15 30%, 15-35%, 15-40%, 15-45%, 15-50%, 20-25%, 20-30%, 20-35%, 20-40%, 20-45%, 20-50%, 25-30%, 25-35%, 25-40%, 25 45%, 25-50%, 30-35%, 30-40%, 30-45%, 30-50%, 35-40%, 35 45%, 35-50%, 40-45%, 40-50% ou 45-50%).

Material hidrofóbico

[0081] Para formar vesículas de acordo com a presente invenção, os lipídeos também podem incorporar um material hidrofóbico apropriado de massa molecular mais elevada capaz de formar uma bicamada (por exemplo, um esteróide, por exemplo, um esterol como, por exemplo, colesterol). A presença de um material hidrofóbico de massa molecular mais elevada desse tipo capaz de formar uma bicamada (por exemplo, um esteróide, por exemplo, um esterol como, por exemplo, colesterol) ajuda na formação da bicamada na qual as propriedades físicas da vesícula dependem. O material, se presente, tipicamente compreenderá entre 20 e 120% por peso do tensoativo não iônico (por exemplo, 20-30%, 20-40%, 20-50%, 20-60%, 20-70%, 20-80%, 20-90%, 20-100%, 20-110%, 30-40%, 30-50%, 30-60%, 30-70%, 30-80%, 30-90%, 30-100%, 30-110%, 30-120%, 40-50%, 40-60%, 40-70%, 40-80%, 40-90%, 40-100%, 40-110%, 40-120%, 50-60%, 50-70%, 50-80%, 50-90%, 50-100%, 50-110%, 50-120%, 60-70%, 60-80%, 60-90%, 60-100%, 60-110%, 60-120%, 70-80%, 70-90%, 70-100%, 70-110%, 70-120%, 80-90%, 80-100%, 80-110%, 80 120%, 90-100%, 90-110%, 90-120%, 100-110%, 100-120% ou 110 120%).

Vesículas lipídicas exemplares

[0082] Em certas modalidades, vesículas lipídicas para uso de acordo com a presente invenção compreendem um tensoativo não iônico, um anfifílico iônico e um esteróide. Em certas modalidades, as vesículas lipídicas compreendem 1-monopalmitoil glicerol, dicetilfosfato e colesterol.

[0083] Em certas modalidades, as vesículas lipídicas para uso de acordo com a presente invenção consistem basicamente em um tensoativo não iônico, um anfifílico iônico e um esteróide. Em certas modalidades, as vesículas lipídicas consistem basicamente em 1- monopalmitoil glicerol, dicetilfosfato e colesterol.

[0084] Em certas modalidades, as vesículas lipídicas para uso de acordo com a presente invenção não compreendem ou são substancialmente livres de uma molécula de aumento de transporte. Em algumas modalidades, as vesículas lipídicas para uso de acordo com a presente invenção não compreendem ou são substancialmente livres de “ácido biliar”, por exemplo, ácido cólico e ácido quenodesoxicólico, seus produtos de conjugação com glicina ou taurina como, por exemplo, ácido glicocólico e taurocólico, derivados que incluem ácido desoxicólico e ursodesoxicólico, e sais de cada um desses ácidos. Em algumas modalidades, as vesículas lipídicas para uso de acordo com a presente invenção não compreendem ou são substancialmente livres de aminoácidos aciloxilados, por exemplo, acilcarnitinas e sais destas, e palmitoilcarnitinas.

Proporção de peso de lipídeo:antígeno

[0085] A presente invenção fornece o achado surpreendente que tanto a imunogenicidade quanto a termoestabilidade das composições fornecidas são controladas, pelo menos em parte, por quantidades relativas de lipídeos e antígeno de hemaglutinina presentes nas composições.

[0086] Por exemplo, por meio de experimentação, constatamos que composições com teor de lipídeo elevado (por exemplo, uma proporção de peso de lipídeo:antígeno de cerca de 450:1) são bem menos imunogênicas do que composições com um teor de lipídeo ligeiramente menor (por exemplo, uma proporção de peso de lipídeo:antígeno de cerca de 300:1). Embora composições com teor de lipídeo menor sejam geralmente mais imunogênicas, verificamos que elas são menos termoestáveis (por exemplo, em uma proporção de peso de lipídeo:antígeno de cerca de 30:1 observamos muito pouca termoestabilidade). À luz desses achados experimentais (discutidos com mais detalhes nos Exemplos), somos agora capazes de definir e fornecer novos conjuntos de composições que são tanto imunogênicas quanto termoestáveis. Em certas modalidades, as composições fornecidas possuem uma proporção de peso de lipídeo:antígeno de pelo menos cerca de 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 110:1, 120:1, 130:1, 140:1, 150:1, 160:1, 170:1, 180:1, 190:1, 200:1, 210:1, 220:1, 230:1, 240:1, 250:1, 260:1, 270:1, 280:1, 290:1 ou 300:1. Em certas modalidades, a proporção de peso de lipídeo:antígeno é de menos do que cerca de 400:1, 390:1, 380:1, 370:1, 360:1, 350:1, 340:1, 330:1, 320:1 ou 310:1. Em certas modalidades, a proporção de peso de lipídeo:antígeno está dentro de uma faixa de cerca de 50:1 até cerca de 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 110:1, 120:1, 130:1, 140:1, 150:1, 160:1, 170:1, 180:1, 190:1, 200:1, 210:1, 220:1, 230:1, 240:1, 250:1, 260:1, 270:1, 280:1, 290:1, 300:1, 310:1, 320:1, 330:1, 340:1, 350:1, 360:1, 370:1, 380:1, 390:1 ou 400:1. Em certas modalidades, a proporção de peso de lipídeo:antígeno está dentro de uma faixa de cerca de 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 110:1, 120:1, 130:1, 140:1, 150:1, 160:1, 170:1, 180:1, 190:1, 200:1, 210:1, 220:1, 230:1, 240:1, 250:1, 260:1, 270:1, 280:1, 290:1, 300:1, 310:1, 320:1, 330:1, 340:1, 350:1, 360:1, 370:1, 380:1 ou 390:1 até cerca de 400:1. Em certas modalidades, a proporção de peso de lipídeo:antígeno está dentro de uma faixa de cerca de 50:1 até cerca de 100:1, cerca de 50:1 até cerca de 150:1, cerca de 50:1 até cerca de 200:1, cerca de 50:1 até cerca de 250:1, cerca de 50:1 até cerca de 300:1, cerca de 50:1 até cerca de 350:1 ou cerca de 50:1 até cerca de 400:1. Em certas modalidades, a proporção de peso de lipídeo:antígeno está dentro de uma faixa de cerca de 100:1 até cerca de 150:1, cerca de 100:1 até cerca de 200:1, cerca de 100:1 até cerca de 250:1, cerca de 100:1 até cerca de 300:1, cerca de 100:1 até cerca de 350:1 ou cerca de 100:1 até cerca de 400:1. Em certas modalidades, a proporção de peso de lipídeo:antígeno está dentro de uma faixa de cerca de 150:1 até cerca de 200:1, cerca de 150:1 até cerca de 250:1, cerca de 150:1 até cerca de 300:1, cerca de 150:1 até cerca de 350:1 ou cerca de 150:1 até cerca de 400:1. Em certas modalidades, a proporção de peso de lipídeo:antígeno está dentro de uma faixa de cerca de 200:1 até cerca de 250:1, cerca de 200:1 até cerca de 300:1, cerca de 200:1 até cerca de 350:1 ou cerca de 200:1 até cerca de 400:1. Em certas modalidades, a proporção de peso de lipídeo:antígeno está dentro de uma faixa de cerca de 250:1 até cerca de 300:1, cerca de 250:1 até cerca de 350:1 ou cerca de 250:1 até cerca de 400:1. Em certas modalidades, a proporção de peso de lipídeo:antígeno está dentro de uma faixa de cerca de 300:1 até cerca de 350:1 ou cerca de 300:1 até cerca de 400:1. Em certas modalidades, a proporção de peso de lipídeo:antígeno está dentro de uma faixa de cerca de 350:1 até cerca de 400:1. Em certas modalidades, a proporção de peso de lipídeo:antígeno é de cerca de 200:1, 210:1, 220:1, 230:1, 240:1, 250:1, 260:1, 270:1, 280:1, 290:1, 300:1, 310:1, 320:1, 330:1, 340:1, 350:1, 360:1, 370:1, 380:1, 390:1 ou 400:1.

Métodos para produção de vesículas lipídicas

[0087] São conhecidas várias técnicas para a preparação de vesículas lipídicas que compreendem tensoativos não iônicos, por exemplo, aqueles citados na Publicação PCT N° WO 93/19781. Uma técnica exemplar é o método de evaporação rotatória de película, no qual uma película do tensoativo não iônico (e quaisquer outros lipídeos componentes) é preparada por evaporação rotatória de um solvente orgânico, por exemplo, um solvente de hidrocarboneto ou de hidrocarboneto clorado como, por exemplo, clorofórmio; por exemplo, veja Russell e Alexander, J. Immunol. 140: 1.274, 1988. A película fina resultante é então reidratada em tampão aquoso.

[0088] Outro método para a produção de vesículas lipídicas é aquele revelado por Collins e cols., J. Pharm. Pharmacol. 42: 53, 1990. Esse método envolve o derretimento do tensoativo não iônico (e quaisquer outros lipídeos componentes) e hidratação com misturação vigorosa na presença de tampão aquoso.

[0089] Outro método envolve a hidratação de lipídeos na presença de forças de cisalhamento. Os aparelhos que podem ser usados para aplicar essas forças de cisalhamento são bem conhecidos (por exemplo, veja a Publicação PCT N° WO 88/06882). A sonificação e a ultra- sonificação também são meios eficazes para formar vesículas lipídicas ou para alterar seu tamanho.

[0090] Em certas modalidades, pelo menos uma porção de antígeno de hemaglutinina está associada a vesículas lipídicas (em que, como aqui usado, o termo “associação” engloba qualquer forma de interação física). Em certas modalidades, pelo menos uma porção de antígeno de hemaglutinina está capturada dentro de vesículas lipídicas. A associação e a captura podem ser obtidas por qualquer forma. Por exemplo, na técnica de evaporação de película rotatória, a película pode ser hidratada na presença de antígeno (opcionalmente junto com um adjuvante). Em outros métodos, um método de desidratação-reidratação pode ser usado no qual o antígeno em uma fase aquosa é combinado com vesículas lipídicas pré-formadas e submetido ao congelamento instantâneo, seguido por liofilização, por exemplo, veja Kirby e Gregoriadis, Biotechnology 2: 979, 1984. Alternativamente ou adicionalmente, pode ser usada uma técnica de congelamento-descongelamento na qual vesículas pré-formadas são misturadas com o antígeno e repetidamente congeladas instantaneamente em nitrogênio líquido, e aquecidas até uma temperatura acima da temperatura de transição dos lipídeos relevantes; por exemplo, veja Pick, Arch. Biochem. Biophys. 212: 195, 1981. Além da associação do antígeno, o método de desidratação- reidratação e a técnica de congelamento-descongelamento também são capazes de associar concomitantemente um adjuvante com vesículas lipídicas.

[0091] Em certas modalidades, as vesículas lipídicas para uso de acordo com a presente invenção são preparadas por um método que inclui: derretimento dos lipídeos componentes para produzir lipídeos derretidos; combinação dos lipídeos derretidos com uma solução aquosa que inclui antígeno de hemaglutinina; e homogeneização do produto resultante. Em certas modalidades, os lipídeos derretidos são adicionados à solução aquosa que inclui antígeno de hemaglutinina. Em certas modalidades, a solução aquosa que inclui antígeno de hemaglutinina é adicionada aos lipídeos derretidos.

[0092] Em certas modalidades, os lipídeos derretidos e a solução aquosa são combinados em quantidades e volumes relativos que obtêm uma concentração de lipídeo de pelo menos cerca de 10 mg/ml no produto resultante. Na verdade, por meio de experimentação e como descrito nos Exemplos, constatamos que quando os lipídeos e antígeno são homogeneizados com uma concentração de lipídeo em excesso de 10 mg/ml, as composições resultantes tendem a ser mais termoestáveis do que quando uma concentração menor de lipídeo é usada (veja os Exemplos). Em algumas modalidades, portanto, a presente invenção fornece composições desejáveis (incluindo especificamente composições termoestáveis) que compreendem antígeno e vesículas lipídicas, cujas composições contêm uma concentração especificada de lipídeo aqui estabelecida para transmitir características particulares (por exemplo, termoestabilidade aumentada) às composições.

[0093] Em certas modalidades, uma concentração de lipídeo de pelo menos cerca de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ou 95 mg/ml é obtida. Em certas modalidades, a concentração de lipídeo está em uma faixa de cerca de 10 mg/ml até cerca de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 mg/ml. Em certas modalidades, a concentração de lipídeo está em uma faixa de cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ou 95 mg/ml até cerca de 100 mg/ml. Em certas modalidades, a concentração de lipídeo está em uma faixa de cerca de 25 mg/ml até cerca de 100 mg/ml, cerca de 25 mg/ml até cerca de 75 mg/ml, cerca de 25 mg/ml até cerca de 50 mg/ml, cerca de 50 mg/ml até cerca de 75 mg/ml ou cerca de 50 mg/ml até cerca de 100 mg/ml.

[0094] Em certas modalidades, os lipídeos derretidos e a solução aquosa são combinados em quantidades e volumes relativos que obtêm tanto a proporção de peso de lipídeo:antígeno desejada (por exemplo, pelo menos cerca de 50:1 ou qualquer uma das faixas de proporção de peso de lipídeo:antígeno mencionadas anteriormente que foram citadas acima) quanto uma concentração de lipídeo de pelo menos cerca de 10 mg/ml (ou qualquer uma das outras faixas de concentração de lipídeo citadas acima) no produto resultante.

[0095] Em certas modalidades, um adjuvante é derretido em conjunto com lipídeos durante a preparação das composições fornecidas. Em certas modalidades, um adjuvante é combinado com lipídeos derretidos e solução aquosa que inclui antígeno de hemaglutinina do vírus influenza durante a preparação das composições fornecidas (por exemplo, por misturação com a solução aquosa que inclui antígeno de hemaglutinina do vírus influenza antes de ser combinada com lipídeos derretidos). Em certas modalidades, um adjuvante é adicionado antes da secagem (por exemplo, liofilização) das composições fornecidas.

[0096] Em algumas modalidades, o tensoativo não iônico (opcionalmente com outros componentes lipídicos) é derretido em uma faixa de temperatura entre 120°C e 150°C (por exemplo, entre 120°C e 125°C, entre 120°C e 130°C, entre 120°C e 140°C, entre 130°C e 140°C, entre 135°C e 145°C, ou entre 140°C e 145°C). Em algumas modalidades, o tensoativo não iônico (opcionalmente com outros componentes lipídicos) é derretido em torno de 120°C, em torno de 125°C, em torno de 130°C, em torno de 135°C, em torno de 140°C, em torno de 145°C ou em torno de 150°C. Em algumas modalidades, a solução aquosa que compreende o antígeno de hemaglutinina é controlada por temperatura. Em algumas modalidades, a solução aquosa que compreende o antígeno de hemaglutinina é mantida em uma temperatura de menos do que cerca de 50°C durante a etapa de adição (por exemplo, menos do que cerca de 45°C, menos do que cerca de 40°C, menos do que cerca de 35°C, menos do que cerca de 30°C, menos do que cerca de 25°C etc.). Em algumas modalidades, a solução aquosa que compreende o antígeno de hemaglutinina é mantida em uma faixa de temperatura entre cerca de 25°C e cerca de 50°C. Em algumas modalidades, a solução aquosa que compreende o antígeno de hemaglutinina é mantida em temperatura ambiente.

[0097] Em certas modalidades, as vesículas são feitas por um processo que inclui etapas de fornecimento dos componentes lipídicos em forma seca (por exemplo, liofilizada) e reidratação do material seco com uma solução aquosa que compreende o antígeno de hemaglutinina. O material seco pode ser preparado, por exemplo, por derretimento de componentes lipídicos e depois liofilização do produto derretido.

[0098] Como descrito com mais detalhes abaixo, em algumas modalidades, as composições fornecidas podem ser secas (por exemplo, liofilizadas) antes do armazenamento e subseqüentemente hidratadas antes do uso.

Tamanho e processamento de vesículas

[0099] As composições fornecidas tipicamente incluirão uma mistura de vesículas lipídicas com uma faixa de tamanhos. Em algumas modalidades, > 90% de vesículas terão um diâmetro que se situa dentro de 50% do valor mais freqüente (por exemplo, 1.000 ± 500 nm). Em algumas modalidades, a distribuição pode ser mais estreita, por exemplo, > 90% de vesículas podem ter um diâmetro que se situa dentro de 40, 30, 20, 10 ou 5% do valor mais freqüente. Em algumas modalidades, sonificação ou ultra- sonificação podem ser usadas para facilitar a formação de vesícula e/ou para alterar o tamanho da vesícula. Em algumas modalidades, filtração, diálise e/ou centrifugação podem ser usadas para ajustar a distribuição do tamanho da vesícula.

[00100] Em geral, vesículas lipídicas produzidas de acordo com a presente revelação podem ser de qualquer tamanho. Em certas modalidades, as composições fornecidas podem incluir vesículas nas quais o diâmetro mais freqüente está na faixa de cerca de 0,1 μm até cerca de 10 μm, por exemplo, cerca de 0,1 μm até cerca de 5 μm, cerca de 0,5 μm até cerca de 2 μm ou cerca de 0,8 μm até cerca de 1,5 μm. Em certas modalidades, o diâmetro mais freqüente pode ser maior do que 10 μm, por exemplo, na faixa de cerca de 10 μm até cerca de 20 μm ou cerca de 15 μm até cerca de 25 pm. Em certas modalidades, o diâmetro mais freqüente pode estar na faixa de cerca de 0,1 μm até cerca de 20 μm, cerca de 0,1 μm até cerca de 15 μm, cerca de 0,1 μm até cerca de 10 μm, cerca de 0,5 μm até cerca de 20 μm, cerca de 0,5 μm até cerca de 15 μm, cerca de 0,5 μm até cerca de 10 μm, cerca de 1 μm até cerca de 20 μm, cerca de 1 μm até cerca de 15 μm ou cerca de 1 μm até cerca de 10 pm.

Liofilização

[00101] A composição líquida de vacinas era a apresentação-padrão desde a introdução de vacinas. A maioria das vacinas líquidas existentes foi desenvolvida para armazenamento sob refrigeração, mas não em temperaturas mais elevadas, com o resultado de que sua estabilidade pode não ser ótima. Todas as vacinas licenciadas contra influenza são formuladas e armazenadas atualmente como líquidos. No ambiente aquoso, os antígenos de influenza são submetidos à degradação física e química que pode levar à inativação e perda de potência.

[00102] Como discutido acima, em certas modalidades, são fornecidas composições secas (por exemplo, liofilizadas). Em algumas modalidades, os métodos da presente revelação incluem uma etapa de secagem (por exemplo, liofilização).

[00103] Em geral, a liofilização envolve o congelamento da preparação em questão e depois redução da pressão circundante (e, opcionalmente, aquecimento da preparação) para permitir que o(s) solvente(s) congelado(s) sublime diretamente da fase sólida em gás (ou seja, fase de secagem). A fase de secagem pode ser dividida em fases de secagem primária e secundária.

[00104] A fase de congelamento pode ser feita por colocação da preparação em um recipiente (por exemplo, um frasco, tubo de Eppendorf etc.) e, opcionalmente, rotação do recipiente em um banho que é resfriado por refrigeração mecânica (por exemplo, usando gelo seco e metanol, nitrogênio líquido etc.). Em algumas modalidades, a etapa de congelamento envolve o resfriamento da preparação até uma temperatura que está abaixo do ponto eutéctico da preparação. Como o ponto eutéctico ocorre na menor temperatura na qual as fases sólida e líquida da preparação podem coexistir, a permanência do material em uma temperatura abaixo desse ponto assegura que ocorrerá sublimação, e não evaporação, em etapas subseqüentes.

[00105] A fase de secagem (ou a fase de secagem primária, quando são usadas duas fases de secagem) envolve a redução da pressão e, opcionalmente, o aquecimento da preparação até um ponto em que o(s) solvente(s) pode sublimar. Essa fase de secagem tipicamente remove a maioria do(s) solvente(s) da preparação. As fases de congelamento e de secagem não são fases necessariamente distintas, mas podem ser combinadas por qualquer forma. Por exemplo, em certas modalidades, as fases de congelamento e de secagem podem ser superpostas.

[00106] Uma fase de secagem secundária pode opcionalmente ser usada para remover solvente(s) residual que foi adsorvido durante a fase de congelamento. Após o término da fase de secagem, o vácuo pode ser quebrado com um gás inerte (por exemplo, nitrogênio ou hélio), antes do produto lipídico liofilizado ser opcionalmente lacrado.

[00107] Excipientes como, por exemplo, sacarose, aminoácidos ou proteínas, por exemplo, gelatina ou albumina sérica, podem ser usados para proteger o antígeno durante o processo de secagem e armazenamento. Em algumas modalidades, um lioprotetor pode ser usado. Em algumas modalidades, um adjuvante pode ser adicionado com o lioprotetor. Lioprotetores exemplares incluem sacarose, trehalose, polietileno glicol (PEG), tampão de dimetil- succinato (DMS), albumina sérica bovina (BSA), manitol e dextrana.

[00108] A presente revelação estabelece que certas modalidades preferidas das composições fornecidas são aquelas com um teor de umidade particularmente baixo (por exemplo, menos do que cerca de 2% por peso). Por meio de experimentação (como descrito com mais detalhes nos Exemplos), determinamos que composições secas (por exemplo, liofilizadas) com um teor de lipídeo maior tendem a ter um teor de umidade residual menor (por exemplo, menos do que cerca de 2% por peso). Como observado acima, composições com um teor de lipídeo maior tendem a ser mais termoestáveis. Sem se limitar a qualquer teoria, formulamos a hipótese de que algumas ou todas as propriedades termoestáveis das composições com teor de lipídeo maior podem decorrer, em parte, do seu teor de umidade residual menor. Portanto, em certas modalidades, as composições da presente revelação são definidas e fornecidas com teor de umidade baixo (por exemplo, menos do que cerca de 2% por peso). Em certas modalidades, as composições fornecidas possuem uma proporção de peso de lipídeo:antígeno de pelo menos cerca de 50:1 (ou qualquer uma das faixas de proporção de peso de lipídeo:antígeno mencionadas anteriormente que foram citadas acima). Em certas modalidades, essas composições podem uma proporção de peso de lipídeo:antígeno menor (por exemplo, pelo menos cerca de 40:1 ou 30:1). Com base em nossos resultados do teor de umidade, essas composições com teor de lipídeo menor podem necessitar de etapas de secagem mais extensas durante o processo de liofilização.

[00109] Em certas modalidades, o teor de umidade das composições fornecidas é de menos do que cerca de 1,9%, 1,8%, 1,7%, 1,6%, 1,5%, 1,4%, 1,3%, 1,2%, 1,1%, 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5% ou 0,4% por peso. Em certas modalidades, o teor de umidade das composições fornecidas está na faixa de cerca de 0,4% até cerca de 2% por peso. Em certas modalidades, o teor de umidade das composições fornecidas está na faixa de cerca de 0,5% até cerca de 1,9% por peso. Em certas modalidades, o teor de umidade das composições fornecidas está na faixa de cerca de 0,6% até cerca de 1,8% por peso. Em certas modalidades, o teor de umidade das composições fornecidas está na faixa de cerca de 0,7% até cerca de 1,7% por peso. Em certas modalidades, o teor de umidade das composições fornecidas está na faixa de cerca de 0,8% até cerca de 1,6% por peso. Em certas modalidades, o teor de umidade das composições fornecidas está na faixa de cerca de 0,9% até cerca de 1,5% por peso. Em certas modalidades, o teor de umidade das composições fornecidas está na faixa de cerca de 1% até cerca de 1,4% por peso. Em certas modalidades, o teor de umidade das composições fornecidas está na faixa de cerca de 0,5% até cerca de 1% por peso. Em certas modalidades, o teor de umidade das composições fornecidas está na faixa de cerca de 0,5% até cerca de 1,5% por peso. Em certas modalidades, o teor de umidade das composições fornecidas está na faixa de cerca de 0,5% até cerca de 2% por peso. Em certas modalidades, o teor de umidade das composições fornecidas está na faixa de cerca de 1% até cerca de 1,5% por peso. Em certas modalidades, o teor de umidade das composições fornecidas está na faixa de cerca de 1% até cerca de 2% por peso. Em certas modalidades, o teor de umidade das composições fornecidas está na faixa de cerca de 1,5% até cerca de 2% por peso.

Reidratação de composições secas

[00110] Composições secas (por exemplo, liofilizadas) são reidratadas antes da administração a um indivíduo que delas necessita. Em algumas modalidades, essa reidratação é obtida por misturação da composição seca (por exemplo, liofilizada) com uma solução aquosa. Em algumas modalidades, a solução aquosa inclui um tampão. Por exemplo, sem limitação, um tampão de PCB, um tampão de Na2HPO4/NaH2PO4, um tampão de PBS, um tampão de bicina, um tampão Tris, um tampão HEPES, um tampão MOPS etc. pode ser usado. O tampão PCB é produzido por misturação de propionato de sódio, cacodilato de sódio e bis-Tris propano nas proporções molares de 2:1:2. A variação da quantidade de HCl adicionada permite o tamponamento ao longo de uma faixa de pH de 4-9. Em algumas modalidades, um tampão de carbonato pode ser usado.

Armazenamento de composições secas

[00111] Em certas modalidades, as composições secas (por exemplo, liofilizadas) podem ser armazenadas por um período de tempo (por exemplo, dias, semanas ou meses) antes da reidratação e administração a um indivíduo que dela necessita. Em certas modalidades, as composições secas (por exemplo, liofilizadas) são armazenadas sob condições que não são controladas pela temperatura. Em certas modalidades, as composições secas (por exemplo, liofilizadas) são pelo menos temporariamente expostas às temperaturas em excesso de 8°C durante o armazenamento (por exemplo, temperaturas que excedem 15°C, 20°C ou 25°C). Em certas modalidades, as composições secas (por exemplo, liofilizadas) são pelo menos temporariamente expostas às temperaturas na faixa de 10°C a 40°C, temperaturas na faixa de 20°C a 30°C, temperatura ambiente etc.).

[00112] Em certas modalidades, as composições secas (por exemplo, liofilizadas) são termoestáveis. Em certas modalidades, as composições secas (por exemplo, liofilizadas) são mais estáveis quando armazenadas por 6 meses a 40°C do que uma composição de referência seca que não possui vesículas lipídicas. Em certas modalidades, a estabilidade se baseia na imunogenicidade, como determinada por um ensaio de HAI. Em certas modalidades, a estabilidade se baseia no teor de antígeno, como determinado por um ELISA.

[00113] Em certas modalidades, as composições secas (por exemplo, liofilizadas) exibem menos de 50% de alteração na imunogenicidade, como determinada por um ensaio de HAI quando armazenadas por 6 meses a 40°C. Em certas modalidades, composições secas (por exemplo, liofilizadas) exibem menos de 40%, menos de 30%, menos de 20%, menos de 10%, menos de 5% ou menos de 2% de alteração na imunogenicidade.

[00114] Em certas modalidades, composições secas (por exemplo, liofilizadas) exibem menos de 50% de perda do teor de antígeno, como determinado por um ELISA, quando armazenadas por 6 meses a 40°C. Em certas modalidades, as composições secas (por exemplo, liofilizadas) exibem menos de 40%, menos de 30%, menos de 20%, menos de 10%, menos de 5% ou menos de 2% de perda do teor de antígeno.

[00115] Em certas modalidades, esses efeitos são observados após as composições secas terem sido armazenadas por apenas 1, 2 ou 3 meses, ao invés de 6 meses. Em certas modalidades, esses efeitos são observados após as composições secas terem sido armazenadas a 15°C, 20°C, 25°C, 30°C, ou 35°C, ao invés de 40°C.

[00116] Em certas modalidades, a antigenicidade e/ou imunogenicidade de composições secas permanece substancialmente inalterada durante armazenamento, apesar de ser exposta a temperaturas em excesso de 8°C (por exemplo, temperaturas na faixa de 10°C a 40°C, temperaturas na faixa de 20°C a 30°C, temperatura ambiente etc.) por um período de 1 a 6 meses.

[00117] Em certas modalidades, o armazenamento de composições secas nessas temperaturas elevadas destrói menos de 20% da antigenicidade do antígeno (por exemplo, menos de 15%, menos de 10%, menos de 5%, menos de 1%), como medida em um ELISA e quando comparadas com composições secas equivalentes que foram armazenadas entre 2 e 8°C pelo mesmo período de tempo.

[00118] Em certas modalidades, o armazenamento de composições secas nessas temperaturas elevadas destrói menos de 20% da imunogenicidade do antígeno (por exemplo, menos de 15%, menos de 10%, menos de 5%, menos de 1%) com base em medições da titulação por HAI e quando comparadas com composições secas equivalentes que foram armazenadas entre 2 e 8°C pelo mesmo período de tempo.

[00119] Em certas modalidades, a antigenicidade e/ou imunogenicidade de uma composição seca pós-armazenamento é pelo menos 1,5 vez maior do que em uma composição seca de outro modo equivalente que foi armazenada sob as mesmas temperaturas elevadas, mas que foi formulada sem vesículas lipídicas (por exemplo, pelo menos cerca de 2 vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 3,5 vezes, 4 vezes ou 5 vezes). Em algumas modalidades, o nível de antigenicidade se baseia em medições obtidas usando um ELISA. Em algumas modalidades, o nível de imunogenicidade é baseado em medições da titulação por HAI.

[00120] Em algumas modalidades, um ou mais desses resultados de antigenicidade e/ou imunogenicidade são obtidos quando a composição seca é armazenada a 25°C por 1, 2, 3 ou 4 meses. Em algumas modalidades, esses resultados são obtidos quando a composição seca é armazenada a 15°C, 20°C, 30°C, 35°C ou 40°C por 1 mês. Em algumas modalidades, esses resultados são obtidos quando a composição seca é armazenada a 15°C, 20°C, 30°C, 35°C ou 40°C por 2 meses. Em algumas modalidades, esses resultados são obtidos quando a composição seca é armazenada a 15°C, 20°C, 30°C, 35°C ou 40°C por 3 meses. Em algumas modalidades, esses resultados são obtidos quando a composição seca é armazenada a 15°C, 20°C, 30°C, 35°C ou 40°C por 4 meses. Em algumas modalidades, esses resultados são obtidos quando a composição seca é armazenada a 15°C, 20°C, 30°C, 35°C ou 40°C por 6 meses.

Composições exemplares

[00121] Em certas modalidades, as composições fornecidas não compreendem ou são substancialmente livres de agentes adicionais com propriedades adjuvantes (ou seja, composições fornecidas não possuem adjuvante). Em certas modalidades, as composições fornecidas não compreendem ou são substancialmente livres de adjuvantes de agonista de TLR (ou seja, adjuvantes de agonista de TLR-3, TLR-4, TLR- 5, TLR-7/8, TLR-9 etc.). Em certas modalidades, as composições fornecidas não compreendem ou são substancialmente livres de adjuvantes de agonista de TLR-3, por exemplo, Poli(I:C) ou Poli(IC:LC). Em certas modalidades, as composições fornecidas não compreendem ou são substancialmente livres de adjuvantes de agonista de TLR-4, por exemplo, MPL ou 3D-MPL. Em certas modalidades, as composições fornecidas não compreendem ou são substancialmente livres de adjuvantes de agonista de TLR-5. Em certas modalidades, as composições fornecidas não compreendem ou são substancialmente livres de adjuvantes de agonista de TLR-7/8. Em certas modalidades, as composições fornecidas não compreendem ou são substancialmente livres de adjuvantes de agonista de TLR-9.

IV. Dosagem e administração

[00122] Métodos dessa revelação são úteis para o tratamento de infecções por influenza em humanos, incluindo adultos e crianças. Em geral, no entanto, eles podem ser usados com qualquer animal. Em certas modalidades, os métodos aqui apresentados são usados para aplicações veterinárias, por exemplo, aplicações caninas e felinas. Se desejado, os métodos aqui apresentados também podem ser usados com animais de criação, por exemplo, criações ovinas, aviárias, bovinas, suínas e eqüinas.

[00123] As composições aqui descritas geralmente serão administradas em quantidades e por tempos necessários ou suficientes para induzir uma resposta imune. Os regimes de dosagem podem consistir em uma dose unitária única ou em diversas doses unitárias ao longo de um período de tempo. A quantidade exata de uma composição fornecida a ser administrada pode variar de indivíduo para indivíduo e pode depender de vários fatores. Dessa forma, será observado que, em geral, a dose precisa usada será como determinada pelo médico responsável pela prescrição e dependerá não apenas do peso do indivíduo e da via de administração, mas também da idade do indivíduo e da gravidade dos sintomas e/ou do risco de infecção. Em certas modalidades, as composições fornecidas incluem uma dose de antígeno de hemaglutinina em uma faixa de cerca de 1 a 100 μg. Por exemplo, em certas modalidades, a faixa pode estar entre cerca de 2 e 50 μg, 5 e 50 μg, 2 e 20 μg, 5 e 20 μg etc. Em certas modalidades, as doses de antígeno de hemaglutinina pode ser de cerca de 5 μg, 10 μg, 15 μg, 20 μg, 25 μg, 30 μg, 35 μg, 40 μg, 45 μg etc. Em certas modalidades, essas doses são administradas como uma dose unitária única. Em certas modalidades, uma dose unitária é administrada em várias ocasiões (por exemplo, 1-3 doses unitárias que são separadas por 1-12 meses). Em certas modalidades, o antígeno de hemaglutinina é retirado de uma vacina contra influenza humana licenciada e a composição é administrada a um humano de tal forma que a dose unitária de antígeno de hemaglutinina seja menor do que a dose unitária humana- padrão (por exemplo, na faixa de 10-90%, 10-80%, 10-70%, 10-60%, 10-50%, 10-40%, 10-30%, 10-20%, 20-90%, 20-80%, 20 70%, 20-60%, 20-50%, 20-40%, 20-30%, 30-90%, 30-80%, 30 70%, 30-60%, 30-50%, 30-40%, 40-90%, 40-80%, 40-70%, 40 60%, 40-50%, 50-90%, 50-80%, 50-70%, 50-60%, 60-90%, 60 80%, 60-70%, 70-90%, 70-80% ou 80-90% da dose unitária humana-padrão). Por exemplo, se a dose unitária humana- padrão demanda uma administração única de uma composição que inclui 45 μg de antígeno de hemaglutinina (por exemplo, veja Fluzone®, Fluvirin R ou FluLaval®) então, em certas modalidades, os métodos da presente revelação podem envolver o fornecimento ao indivíduo de uma administração única de uma composição fornecida que inclui menos do que 45 μg de antígeno de hemaglutinina, por exemplo, 40 μg, 35 μg, 30 μg, 25 μg, 20 μg ou 15 μg de antígeno de hemaglutinina.

[00124] Em algumas modalidades, as quantidades de antígeno de hemaglutinina e adjuvante de agonista de TLR-4 (por exemplo, MPL ou 3D-MPL) nas composições fornecidas são de tal forma que cada dose unitária inclui cerca de 1-100 μg (por exemplo, cerca de 2-80 μg, 5-70 μg ou cerca de 10-50μg) de antígeno de hemaglutinina e cerca de 1-100 μg (por exemplo, cerca de 1-50 μg, cerca de 1,5-50 μg, cerca de 2,5-50 μg, cerca de 2,5-50 μg, cerca de 2,5-40 μg, cerca de 2,5-30 μg, cerca de 2,5-20 μg ou cerca de 2,5-10 μg) de adjuvante de agonista de TLR-4 (por exemplo, MPL ou 3D- MPL).

[00125] Em certas modalidades, as composições fornecidas são formuladas para liberação parenteralmente, por exemplo, por injeção. Nessas modalidades, a administração pode ser, por exemplo, injeção intravenosa, intramuscular, intradérmica ou subcutânea, ou por meio de infusão ou técnicas de injeção sem agulha. Em certas modalidades, as composições podem ser formuladas para liberação intramuscular. Para essa administração parenteral, as composições podem ser preparadas e mantidas em forma seca e reidratadas antes da administração, como discutido acima. O pH de composições injetáveis pode ser ajustado, como conhecido na técnica, com um ácido farmaceuticamente aceitável, por exemplo, ácido metanossulfônico. Outros veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados incluem solução de Ringer e U.S.P. Além disso, óleos fixos estéreis são convencionalmente empregados como um solvente ou meio de suspensão. Para essa finalidade, qualquer mistura de óleos fixos pode ser empregada, incluindo mono- ou diglicerídeos sintéticos. Além disso, ácidos graxos como, por exemplo, ácido oléico, são usados na preparação de injetáveis. Composições injetáveis podem ser esterilizadas, por exemplo, por filtração através de um filtro de retenção bacteriana, ou por incorporação de agentes de esterilização na forma de composições sólidas estéreis que podem ser dissolvidas ou dispersas em água estéril ou em outro meio injetável estéril antes do uso.

EXEMPLOS

[00126] Os exemplos seguintes descrevem alguns modos exemplares de produção e prática de certas composições que são aqui descritas. Deve ser subentendido que esses exemplos têm finalidade apenas ilustrativa, e não visam limitar o escopo das composições e métodos aqui descritos.

EXEMPLO 1 Composições imunogênicas termoestáveis liofilizadas

[00127] Esse Exemplo descreve métodos para a preparação de uma composição imunogênica termoestável liofilizada para injeção intramuscular (IM). Todas as composições de vesícula tensoativa não iônica (NISV) foram preparadas pelo método de derretimento invertido. Foram usados os seguintes lipídeos: 1-monopalmitoil glicerol (um tensoativo não iônico), colesterol (um esteróide) e fosfato de dicetila (um anfifílico iônico). Especificamente, uma proporção molar de 5:4:1 de lipídeos (496 mg de 1- monopalmitoil glicerol (MPG), 464 mg de colesterol (CHO) e 164 mg de fosfato de dicetila (DCP)) foi colocada em um béquer de fundo plano, assegurando que nenhum pó aderisse à lateral do béquer. Nessa composição exemplar, hexaacil dissacarídeo fosforilado (sal de amônio) (PHAD, um adjuvante de agonista de TLR-4 exemplar mostrado na Figura 1, disponível por Avanti Polar Lipids, Inc. de Alabaster, AL) foi opcionalmente adicionado a 12 mg (para as composições dose-excedentes) ou 4 mg (para as composições dose-equivalentes), e dissolvido em conjunto com os outros lipídeos. O béquer foi fixado e coberto com folha de alumínio e os lipídeos foram derretidos em um banho de óleo aquecido a 120-125°C com turbilhonamento ocasional usando um bastão de vidro. Enquanto os lipídeos eram derretidos, um tampão de fosfato concentrado foi preparado da seguinte forma: 5,980 g de Na2HPO4 e 1,363 g de NaH2PO4 foram dissolvidos em 20 ml de água estéril, o pH foi medido, a solução foi filtrada através de um filtro estéril de 0,45 μm e 0,796 ml desse tampão foi adicionado a 40 ml de vacina contra influenza Fluzone® (temporada 2009-2010; Sanofi Pasteur) em uma coifa de fluxo laminar. A vacina contra influenza Fluzone® (temporada 2009-2010; Sanofi Pasteur) é uma vacina inativada fracionada trivalente contra influenza que contém antígeno de HA de influenza em uma concentração de 45 μg/0,5 ml (cada 0,5 ml contém 15 μg de antígeno de HA de cada uma das seguintes cepas de vírus influenza: H1N1, A/Brisbane/59/2007; H3N2, A/Brisbane/10/2007 e B/Brisbane/60/2008). A solução tamponada de estoque de antígeno foi homogeneizada a 8.000 rpm a 30-35°C, e rapidamente (para evitar cristalização) os lipídeos derretidos foram transferidos para dentro do béquer durante homogeneização da solução, quando então a homogeneização a 8.000 rpm continuou por 10 minutos a 30-35°C. A suspensão lipídeo-antígeno resultante foi agitada por 1-2 horas a 220 ± 10 rpm a 30-35°C. Uma amostra em processo foi recolhida após essa etapa para determinar o pH e a distribuição de tamanho de partícula (PSD). Finalmente, 40 ml de 400 mM de solução de sacarose em água foram adicionados aos 40 ml de solução de NISV-antígeno e agitados por 5 minutos a 220 ± 10 rpm a 30-35°C. Foram coletadas amostras (0,5 ml/frasco para as composições dose-excedentes e 1,5 ml/frasco para as composições dose-equivalentes), congelados a -80°C de um dia para o outro, ou mais tempo, e subseqüentemente liofilizados de acordo com os parâmetros de liofilização- alvo no ciclo de liofilização descrito na Tabela 2 abaixo e nos pontos de ajuste do tempo de secagem primária mostrados na Tabela 3 abaixo para diferentes volumes de preenchimento. Tabela 2

* Etapa de carregamento da amostra, se a amostra não é pré- congelada. 2 * Etapa de carregamento da amostra, se a amostra é pré- congelada. 3 ** Se a amostra é pré-congelada, o tempo mínimo é de 1 hora. Tabela 3

[00128] Amostras de controle não formuladas com NISVs, mas que contêm antígeno e adjuvante, foram preparadas de acordo com o seguinte procedimento: 12 mg (composições dose-excedentes) ou 4 mg (composições dose- equivalentes) de PHAD foram ressuspensos em 40 ml de 400 mM de solução de sacarose e essa suspensão foi subseqüentemente misturada com 40 ml de vacina contra influenza Fluzone® (temporada 2009-2010; Sanofi Pasteur) e agitada por 5 minutos a 220 ± 10 rpm a 30-35°C. Essa solução não formulada de antígeno-adjuvante foi dividida em alíquotas em frascos (0,5 ml/frasco para as composições dose-excedentes e 1,5 ml/frasco para as composições dose- equivalentes), congelada a -80°C de um dia para o outro, ou mais tempo, e subseqüentemente liofilizada de acordo com os parâmetros de liofilização-alvo no ciclo de liofilização descrito acima na Tabela 2 e nos pontos de ajuste do tempo de secagem primária mostrados acima na Tabela 3 para diferentes volumes de preenchimento.

[00129] All composições liofilizadas foram reidratadas antes da administração em 0,75 ml de WFI. Como discutido com mais detalhes abaixo, alguns dos estudos usaram vacina contra influenza Fluzone® como fornecida em forma líquida como um controle (ou seja, sem nenhuma etapa de formulação, incluindo sem liofilização).

EXEMPLO 2 Imunização contra influenza de camundongos com composições imunogênicas

[00130] As composições preparadas como descrito no Exemplo 1 foram testadas em fêmeas de camundongos BALB/C com 6-8 semanas de idade (mínimo de 8 animais por grupo de teste). Os camundongos foram imunizados por via intramuscular com 50 μl do controle ou de composições reidratadas duas vezes, uma vez no dia 0 e uma vez no 14° dia. Foi coletado sangue de todos os camundongos nos grupos de estudo pré-imunização e depois pós-1a e 2a imunizações para avaliar respostas imunes humorais. Como resumido na Tabela 4 abaixo, os animais receberam (1) dose-equivalente de Fluzone® (controle positivo; não formulada e sem adjuvante) no equivalente de 0,1X uma dose unitária humana- padrão (uma “dose unitária de camundongo-padrão” é 0,1X da dose unitária humana-padrão, ou seja, após as diferenças de tamanho entre humanos e camundongos serem levadas em conta) (Grupo/artigo de teste 1); (2) Fluzone® dose-excedente no equivalente de 1/30X uma dose unitária humana-padrão formulada com NISV e com o adjuvante PHAD (0,005 mg) (Grupo/artigo de teste 2); ou (3) Fluzone® dose-excedente no equivalente de 1/30X uma dose unitária humana-padrão formulada com o adjuvante PHAD (0,005 mg), mas sem NISVs (Grupo/artigo de teste 3). Tabela 4

de formulação. 4 *** Teor por dose unitária de camundongo de 0,05 ml.

EXEMPLO 3 Ensaio de inibição da hemaglutinação da potência de composições imunogênicas

[00131] Para testes de potência, o ensaio de HAI foi usado para medir as respostas imunológicas nos animais. O ensaio de HAI é uma técnica sorológica usada para detectar anticorpo para HA no soro resultante de infecção ou vacinação com vírus influenza. As titulações de HAI estão correlacionadas com a proteção contra influenza em humanos. A titulação de anticorpo HAI é expressa como o reciproco da maior diluição de soro que mostra hemaglutinação completa usando quatro unidades de hemaglutinação. Uma titulação de HAI de 1:40 ou maior é considerada como soroprotetora, e um aumento de quatro vezes nas titulações de HAI em amostras coletadas antes e depois da vacinação é o aumento mínimo considerado necessário para classificação de soroconversão. Os resultados são apresentados como o inverso de titulações de HAI e média geométrica das titulações de HAI. O ensaio de HAI foi realizado da seguinte forma. Resumidamente, uma série de diluições de 2 vezes em PBS de soros de camundongos imunizados foi preparada em placas de 96 poços com fundo em “V” e incubada em temperatura ambiente por 30 minutos com 50 μl de quatro unidades de hemaglutinação (HAU) de A/Brisbane/59/07 (H1N1) ou A/Brisbane/10/2007 (H3N2). A seguir, 50 μl de eritrócitos de galinha (diluídos 0,5% v/v) (“Canadian Food Inspection Agency”, Ottawa, Canadá) foram adicionados a todos os poços na placa e incubados por 1,5 hora em temperatura ambiente. A maior diluição capaz de aglutinar eritrócitos de galinha foi então determinada.

[00132] A média geométrica, a mediana e o erro- padrão da média foram determinados. A análise estatística foi realizada usando o Software GraphPad Prism 5. Amostras pareadas foram avaliadas por teste t pareado e amostras não pareadas por teste t de Student. Os valores p < 0,05 foram considerados como sendo estatisticamente significantes. Uma resposta positiva era indicada por aumento > 2 vezes de respostas 14 dias pós-vacinação após a última imunização, quando comparados com os valores obtidos antes da imunização. Os resultados desses ensaios são descritos abaixo.

[00133] Nesse estudo em camundongos avaliamos a potência das três composições descritas no Exemplo 2, Tabela 4. Ensaios de HAI foram realizados em sangramentos obtidos de camundongos no 13° dia do estudo (P1Vd13) e 29° dia (P2Vd15).

[00134] A Figura 3 mostra a titulação média de HAI contra H1N1 A/Brisbane/59/07 treze dias após a primeira imunização (P1Vd13). Pode ser observado que a titulação média de HAI contra H1N1 para animais do Grupo 2 (Tabela 4; composição de dose-excedente de NISV-Fluzone® com adjuvante) foi significantemente maior do que animais do Grupo 3 (Tabela 4; composição de dose-excedente de Fluzone® com adjuvante sem NISVs) e também maior do que animais do Grupo 1 de controle (Tabela 4; dose-equivalente de Fluzone® sem adjuvante e não formulada. Também foi observado que a composição de dose-excedente de NISV-Fluzone® com adjuvante (Grupo 2) teve potência maior do que a dose-equivalente de Fluzone® sem adjuvante e não formulada de controle (Grupo 1) em um terço da dose unitária, enquanto a composição de dose-excedente de Fluzone® com adjuvante sem NISVs (Grupo 3) não teve.

[00135] A Figura 4 mostra a titulação média de HAI contra H3N2 A/Brisbane/10/07 treze dias após a primeira imunização (P1Vd13). Pode ser observado que a titulação média de HAI contra H3N2 para animais do Grupo 2 (Tabela 4; composição de dose-excedente de NISV-Fluzone® com adjuvante) foi significantemente maior do que animais do Grupo 3 (Tabela 4; composição de dose-excedente de Fluzone® com adjuvante sem NISVs) e também maior do que animais do Grupo 1 de controle (Tabela 4; dose-equivalente de Fluzone® sem adjuvante e não formulada). Novamente, também foi observado que a composição de dose-excedente de NISV- Fluzone® com adjuvante (Grupo 2) teve potência maior do que a dose-equivalente de Fluzone® sem adjuvante e não formulada de controle (Grupo 1) em um terço da dose unitária, enquanto a composição de dose-excedente de Fluzone® com adjuvante sem NISVs (Grupo 3) não teve. Tendências similares foram observadas nas respostas imunes de animais nos vários grupos após a segunda imunização (P2Vd15). Em geral, as titulações de HAI medidas quinze dias após a segunda imunização (P2Vd15) foram aproximadamente 4-5 vezes maiores do que as titulações de HAI observadas treze dias após a primeira imunização.

[00136] Para determinar a dose-dependência do adjuvante de agonista de TLR-4 exemplar PHAD sobre a resposta imune, um controle positivo e 5 composições de NISV diferentes preparadas pelo método descrito no Exemplo 1 (exceto com quantidades crescentes de PHAD derretidas em conjunto com os outros lipídeos) foram testadas em fêmeas de camundongos BALB/C com 6-8 semanas de idade (mínimo de 8 animais por grupo de teste). Os seis grupos de teste são resumidos abaixo na Tabela 5. Os camundongos foram imunizados por via intramuscular com 50 μl do controle ou de composições reidratadas duas vezes, uma vez no dia 0 e uma vez no 14° dia. Amostras de soro foram coletadas de todos os camundongos nos grupos de estudo pré-imunização e depois pós-1a e 2a imunizações e analisados usando um ensaio de HAI, como descrito no Exemplo 3. Tabela 5

* Fluzone® (temporada 2009-2010; Sanofi Pasteur) é uma vacina inativada fracionada trivalente contra influenza. Cada dose unitária de 0,5 ml de Fluzone® (temporada 2009- 2010; Sanofi Pasteur) contém 15 μg de antígeno de HA de cada uma das seguintes cepas de vírus influenza: H1N1, A/Brisbane/59/2007; H3N2, A/Brisbane/10/2007; e B/Brisbane/60/2008. 2 * Os camundongos recebem 0,1X da dose unitária humana- padrão de Fluzone® que está correlacionada aproximadamente a uma dose-equivalente de 1X ou “dose unitária humana- padrão” quando se converte de humanos para camundongos. 3 ** Controle de Fluzone® comercial usado sem nenhuma etapa de formulação. 4 *** Teor por dose unitária de camundongo de 0,05 ml.

[00137] A Figura 5 mostra a potência de resposta à dose em camundongos como determinada pelo ensaio de titulação de HAI do Exemplo 3 usando amostras de soros coletadas 15 dias pós-2a vacinação. Como pode ser observado na Figura 5, 5 μg de PHAD (Grupo 5) aumentaram a potência da composição de dose-excedente de NISV-Fluzone® até aproximadamente se equiparar à potência do controle dose- equivalente de Fluzone® sem adjuvante e não formulada (Grupo 1), enquanto as maiores doses de PHAD (15 e 50 μg) (Grupos 4 e 3, respectivamente) aumentaram a potência até aproximadamente três vezes aquela do controle. As Figuras 5A e B mostram que o adjuvante de agonista de TLR-4 exemplar, adjuvante PHAD, aumentou a potência de forma dose-dependente tanto para H1N1 quanto para H3N2.

EXEMPLO 4 Testes de termoestabilidade de composições imunogênicas liofilizadas

[00138] A estabilidade de composições liofilizadas imunogênicas (NISVs) preparadas de acordo com Exemplo 1 foi avaliada em três condições de temperatura de armazenamento (5°C ± 3°C, 25°C ± 2°C e 40°C ± 2°C) por até 6 meses. Não há ensaio ou parâmetro único de indicação da estabilidade que defina o perfil das características de estabilidade de um produto biológico. Como definido pelo FDA (“FDA Guidance for Industry”. “Content and Format of Chemistry, Manufacturing and Controls Information and Establishment Description Information for a Vaccine or Related Product”), um estudo de estabilidade para um produto biológico deve geralmente testar: potência; medições físico-químicas que são indicativas da estabilidade; teor de umidade (se liofilizado); pH; esterilidade ou controle de biocarga; pirogenicidade e segurança geral. Conseqüentemente, um perfil indicativo da estabilidade com o uso de diversos ensaios fornece a garantia de que alterações na identidade, pureza e potência do produto biológico sejam tipicamente detectadas.

[00139] Como aqui usado, o termo “potência” se refere à habilidade ou capacidade específica de um produto para obter seu efeito desejado e é determinada por um método quantitativo adequado in vivo ou in vitro. Um ensaio de potência em camundongos in vivo foi usado para avaliar a potência das composições armazenadas ao longo do tempo e nas três temperaturas de armazenamento diferentes. Como mostrado na Tabela 6 abaixo, composições de controle e liofilizadas foram armazenadas em temperaturas diferentes por até 6 meses, e após esse tempo foram reidratadas (no caso de composições liofilizadas) e administradas IM aos camundongos (como descrito no Exemplo 2). As respostas imunes foram então determinadas usando o ensaio de HAI do Exemplo 3.

Petição 870210065309, de 19/07/2021, pág. 88/118 1 Fluzone® (temporada 2009-2010; Sanofi Pasteur) é uma vacina inativada fracionada trivalente contra influenza. Cada dose unitária de 0,5 ml de Fluzone® (temporada 2009 2010; Sanofi Pasteur) contém 15 μg de antígeno de HA de cada uma das seguintes cepas de vírus influenza: H1N1, A/Brisbane/59/2007; H3N2, A/Brisbane/10/2007; e B/Brisbane/60/2008. 2 * Os camundongos recebem 0,1X da dose unitária humana- padrão de Fluzone® que está correlacionada aproximadamente a uma dose-equivalente de 1X ou “dose unitária humana- padrão” quando se converte de humanos para camundongos. 3 ** Controle de Fluzone® comercial usado sem nenhuma etapa de formulação. 4 *** Teor por dose unitária de camundongo de 0,05 ml. 5 Proporção de peso de lipídeos formadores de vesículas:antígeno de HA.

[00140] As composições também foram analisadas quanto à aparência (cor e opacidade), e após reidratação foram analisadas quanto à distribuição de tamanho de partícula (PSD) e pH. Alíquotas de amostras reidratadas foram centrifugadas em uma ultracentrífuga a 24.000 rpm, por 20 minutos a 4°C e frações do sobrenadante e do pélete foram removidas, extraídas e analisadas por sELISA para determinar o teor de antígeno (também descrito como “potência in vitro”). A estabilidade de material reidratado foi testada ao longo de 4-6 horas após reidratação. Nos pontos do tempo especificados, os lipídeos nas composições liofilizadas foram analisados quanto à pureza e degradantes usando HPLC. O teor de umidade nas composições liofilizadas foi avaliado usando o ensaio de Karl Fischer. As composições usadas para o estudo de estabilidade não eram estéreis. No entanto, o método de formulação envolveu o aquecimento dos lipídeos até > 100°C e adição dos lipídeos derretidos a uma solução-tampão filtrada de forma estéril contendo Fluzone® estéril. Os métodos de formulação foram realizados sob condições de baixo teor microbiano (biocarga), por exemplo, em uma coifa de fluxo lamelar, e usando bolsas de Tyvek estéreis durante liofilização e preenchidas de forma retrograda usando nitrogênio estéril. A biocarga foi avaliada como contagem microbiana anaeróbica total (CFU por grama) por plaqueamento das amostras em ágar tríptico de soja (TSA) e incubação por 3-5 dias a 30-35°C e como contagem total combinada de leveduras e bolores (CFU por grama) por plaqueamento das amostras em ágar-Sabouraud (SDA) e incubação por 5-7 dias a 20-25°C.

[00141] As recomendações gerais, como definidas no “ICH Harmonized Tripartite Guideline: Stability Testing of New Drug Substances and Products”, Q1A(R2), foram seguidas durante a execução do estudo de estabilidade. Os testes indicativos de estabilidade propostos estão listados na Tabela 7 abaixo, na qual um “mês” era aproximadamente 4 semanas, e “X” indica um teste necessário, enquanto “O” indica um teste opcional. Tabela 7

[00142] A Figura 6 mostra a potência em camundongos in vivo(titulações de HAI testadas como descrito no Exemplo 3, usando amostras de soros coletadas 15 dias pós- 2a vacinação) de uma composição dose-excedente de NISV- Fluzone® com adjuvante (Grupo 2: NISV, adjuvante de agonista de TLR-4) versus uma composição dose-excedente de Fluzone® com adjuvante (Grupo 3: sem NISV, adjuvante de agonista de TLR-4) e um controle dose-equivalente de Fluzone® sem adjuvante e não formulada (Grupo 1: sem NISV, sem adjuvante de agonista de TLR-4). As composições de controle e liofilizadas foram armazenadas por 6 meses a 4°C ou 40°C antes da injeção IM em camundongos, como descrito no Exemplo 2. Como pode ser observado na Figura 6, as titulações de HAI para H1N1 e H3N2 demonstram que a composição dose-excedente de NISV-Fluzone® com adjuvante (Grupo 2) foi igualmente potente quando armazenada por até 6 meses a 4°C ou 40°C, enquanto o controle dose-equivalente de Fluzone® sem adjuvante e não formulada (Grupo 1) e composição dose-excedente de Fluzone® com adjuvante (Grupo 3) perderam potência quando armazenadas a 40°C versus 4°C ao longo do mesmo período de tempo de 6 meses.

[00143] A Figura 7 mostra a potência in vivo em camundongos (titulações de HAI testadas como descrito no Exemplo 3, usando amostras de soros coletadas 15 dias pós- 2a vacinação) para uma composição dose-equivalente de NISV- Fluzone® sem adjuvante (Grupo 7: NISV, sem adjuvante de agonista de TLR-4) versus a controle dose-equivalente de Fluzone® sem adjuvante e não formulada (Grupo 1: sem NISV, sem adjuvante de agonista de TLR-4). As composições de controle e liofilizadas foram armazenadas por 6 meses a 4°C ou 40°C antes da injeção IM em camundongos, como descrito no Exemplo 2. Como pode ser observado na Figura 7, as titulações de HAI for H1N1 e H3N2 demonstram que a composição dose-equivalente de NISV-Fluzone® sem adjuvante (Grupo 7) foi igualmente potente quando armazenada por até 6 meses a 4°C ou 40°C, enquanto o controle dose-equivalente de Fluzone® sem adjuvante e não formulada (Grupo 1) perdeu potência quando armazenada a 40°C versus 4°C ao longo do mesmo período de tempo de 6 meses.

[00144] A Figura 8 mostra o teor de antígeno de HA in vitro após diferentes períodos de armazenamento (pontos do tempo T = 0, 1, 3 e 6 meses) e temperaturas (4°C, 25°C e 40°C) para as seguintes composições: (A) composição dose- excedente de NISV-Fluzone® com adjuvante (Grupo 2) e (B) composição dose-excedente de Fluzone® com adjuvante (Grupo 3). Os valores do teor de antígeno de HA foram determinados por sELISA, como descrito acima. As composições foram centrifugadas e as quantidades de antígeno de HA no pélete e no sobrenadante foram medidas separadamente, como mostrado. Como pode ser observado na Figura 8, os resultados demonstram perda mínima de teor de antígeno de HA quando Fluzone® era formulada com NISVs e armazenada por até 6 meses a 40°C (Grupo 2, Figura 8A), enquanto o teor de HA declinava de forma constante quando Fluzone® não era formulada com NISVs e armazenada a 40°C (Grupo 3, Figura 8B).

[00145] Aparência: A alteração tempo- e temperatura- dependente mais perceptível na aparência foi o derretimento das tortas liofilizadas que foi observado em todas as composições de controle liofilizadas que não contêm NISVs após armazenamento a 40°C e, em menor grau, a 25°C. Sem se prender a uma teoria, o derretimento das tortas liofilizadas observado nessas composições liofilizadas que não contêm NISV não pareceu ser causado por secagem incompleta das tortas antes do início da secagem secundária. Todas as tortas liofilizadas eram satisfatórias após liofilização, mas encolheram e se liquefizeram em temperaturas crescentemente elevadas ao longo do tempo de armazenamento.

[00146] Umidade residual: A umidade residual em tortas liofilizadas foi determinada usando o ensaio de Karl Fischer e foi expressa como percentual de umidade por peso. Sem se prender a uma teoria, pareceu que o teor de umidade residual da torta liofilizada pode estar relacionado inversamente à estabilidade da composição. Foi observado que, no tempo zero (diretamente após liofilização), a umidade residual total nos grupos da composição liofilizada que não contém NISV foi maior do que a umidade residual nas composições liofilizadas que contêm NISV: cerca de 2-4% versus cerca de 1-2% de umidade residual, respectivamente. Em geral, a presença de NISVs durante a liofilização resultou em um teor de umidade residual menor. Houve alterações muito mínimas ou não observáveis na umidade residual das composições liofilizadas que contêm NISV quando armazenadas em temperaturas elevadas (por exemplo, 25°C, 40°C) por períodos de tempo prolongados (por exemplo, até 6 meses) (dados não mostrados).

[00147] Distribuição do tamanho de partícula: Houve alterações aparentes na distribuição de tamanho e no tamanho de partícula médio a 40°C (e, em um grau bem menor, a 25°C) em composições liofilizadas que contêm NISV e que não contêm NISV (dados não mostrados). Essas alterações na distribuição de tamanho de partícula e no tamanho de partícula médio não foram observadas a 4°C para nenhuma das composições que contêm NISV.

[00148] pH: O pH de todas as composições foi aproximadamente o mesmo quando armazenadas a 4°C, 25°C ou 40°C, e não mostrou tendência observável ao longo do intervalo de tempo do estudo de seis meses.

EXEMPLO 5 Termoestabilidade de composições imunogênicas liofilizadas com outros adjuvantes e antígenos

[00149] O objetivo desse estudo foi determinar se diferentes tipos de adjuvantes e antígenos seriam termoestáveis quando formulados com NISVs. Observe que nenhuma otimização das várias composições foi completada a fim de testar esses adjuvantes e antígenos alternativos (por exemplo, otimização da concentração de adjuvante etc.).

[00150] Adjuvantes diferentes: Todas as composições de vesícula tensoativa não iônica (NISV) com adjuvantes diferentes foram preparadas pelo método de derretimento invertido, como descrito no Exemplo 1. Especificamente, para cada composição, uma proporção molar de 5:4:1 de lipídeos (147,59 mg de MPG, 138,25 mg de CHO e 49,66 mg de DCP) foi colocada em um béquer de fundo plano. O béquer foi fixado e coberto e os lipídeos foram derretidos em um banho de óleo aquecido a 120°C-125°C com turbilhonamento ocasional usando um bastão de vidro. Tampão de fosfato concentrado, preparado como descrito no Exemplo 1 (0,224 ml) foi adicionado a 11,67 ml de vacina contra influenza Fluzone® (temporada 2010-2011; Sanofi Pasteur) em uma coifa de fluxo laminar. As soluções tamponadas de estoque de antígeno foram homogeneizadas a 8.000 rpm a 30-35°C, e rapidamente (para evitar cristalização) os lipídeos derretidos foram transferidos para dentro do béquer durante homogeneização da solução. A homogeneização a 8.000 rpm continuou por 10 minutos a 30-35°C. A suspensão lipídeo- antígeno resultante foi agitada por 1-2 horas a 220 ± 10 rpm a 30°C-35°C. Um volume equivalente de 400 mM de solução de sacarose em água foi adicionado com cada adjuvante (3,5 mg de adjuvante) a cada uma das soluções de NISV-antígeno e elas foram agitadas por 5 minutos a 220 ± 10 rpm a 30°C- 35°C. Foram coletadas amostras (0,5 ml/frasco), congeladas a -80°C de um dia para o outro, ou mais tempo, e subseqüentemente liofilizadas de acordo com os parâmetros de liofilização-alvo no ciclo de liofilização descrito na Tabela 2 e nos pontos de ajuste do tempo de secagem primária mostrados na Tabela 3 para diferentes volumes de preenchimento.

[00151] Composições liofilizadas com adjuvante foram armazenadas por 3 meses a 4°C ou 40°C e depois reidratadas em 0,75 ml de WFI antes da injeção IM em camundongos, como descrito no Exemplo 2. A potência in vivo das composições reidratadas foi testada (foram medidas titulações de HAI contra H1N1, como descrito no Exemplo 3) em amostras de soros coletadas de camundongos vacinados 15 dias pós-2a vacinação. Os resultados são mostrados abaixo na Tabela 8. Esses resultados demonstram que as composições dose- excedentes de Fluzone® com adjuvante (Grupos 1 e 2) são igualmente potentes quando armazenadas por até 3 meses a 4°C ou 40°C independentemente do tipo de adjuvante. A potência global dessas composições dose-excedentes de NISV- Fluzone® com adjuvante (Grupos 1 e 2) foi menor do que a potência global de uma composição dose-equivalente de NISV- Fluzone® (Grupo 3). Também foi realizado um estudo com flagelina (um adjuvante de agonista de TLR-5); no entanto, a dose testada era tóxica para os camundongos. Tabela 8

cada uma das seguintes cepas de vírus influenza: H1N1, A/Califórnia/07/2009 X-179A. H3N2, A/Victoria/210/2009 X 187; e B/Brisbane/60/2008. 2 * adjuvante de agonista de TLR 7/8. 3 ** adjuvante de agonista de TLR 9.

[00152] Antígenos diferentes: Composições de vesículas tensoativas não iônicas (NISV) de diferentes antígenos de influenza foram preparadas pelo método de derretimento invertido, como descrito no Exemplo 1. Especificamente, para cada composição, uma proporção molar de 5:4:1 de lipídeos (404 mg de MPG, 378 mg de CHO e 134 mg de DCP) foi colocada em um béquer de fundo plano. O béquer foi fixado e coberto e os lipídeos foram derretidos em um banho de óleo aquecido a 120°C-125°C com turbilhonamento ocasional usando um bastão de vidro. Tampão de fosfato concentrado, preparado como descrito no Exemplo 1 (0,615 ml) foi adicionado a 32 ml de vacina contra influenza Fluzone® (temporada 2010-2011; Sanofi Pasteur), vacina contra influenza Fluvirin® (temporada 2010-2011; Novartis), ou vacina contra influenza FluLaval® (temporada 2010-2011; GSK) em uma coifa de fluxo laminar. A vacina contra influenza Fluzone® (temporada 2010-2011; Sanofi Pasteur) é uma vacina inativada fracionada trivalente contra influenza que contém antígeno de HA de influenza em uma concentração de 45 μg/0,5 ml (cada 0,5 ml contém 15 μg de antígeno de HA de cada uma das seguintes cepas de vírus influenza: H1N1, A/Califórnia/07/2009 X-179A. H3N2, A/Victoria/210/2009 X 187; e B/Brisbane/60/2008). A vacina contra influenza Fluvirin® (temporada 2010-2011; Novartis) é uma vacina inativada fracionada trivalente contra influenza que contém antígeno de HA de influenza em uma concentração de 45 μg/0,5 ml (cada 0,5 ml contém 15 μg de antígeno de HA de cada uma das seguintes cepas de vírus influenza: H1N1, A/Califórnia/07/2009 X-181; H3N2, A/Victoria/210/2009 X 187; e B/Brisbane/60/2008). A vacina contra influenza FluLaval® (temporada 2010-2011; GSK) também é uma vacina inativada fracionada trivalente contra influenza que contém antígeno de HA de influenza em uma concentração de 45 μg/0,5 ml (cada 0,5 ml contém 15 μg de antígeno de HA de cada uma das seguintes cepas de vírus influenza: H1N1, A/Califórnia/07/2009 X-181; H3N2, A/Victoria/210/2009 X 187; e B/Brisbane/60/2008). As soluções tamponadas de estoque de antígeno foram homogeneizadas a 8.000 rpm a 30-35°C, e rapidamente (para evitar cristalização) os lipídeos derretidos foram transferidos para dentro do béquer durante homogeneização da solução, quando então a homogeneização a 8.000 rpm continuou por 10 minutos a 30-35°C. A suspensão lipídeo-antígeno resultante foi agitada por 1-2 horas a 220 ± 10 rpm a 30°C-35°C. Um volume equivalente de 400 mM de solução de sacarose em água foi adicionado a cada uma das soluções de NISV/antígeno e agitado por 5 minutos a 220 ± 10 rpm a 30°C-35°C. Foram coletadas amostras (1,5 ml/frasco), elas foram congeladas a -80°C de um dia para o outro, ou mais tempo, e subseqüentemente liofilizadas de acordo com os parâmetros de liofilização-alvo no ciclo de liofilização descrito na Tabela 2 e nos pontos de ajuste do tempo de secagem primária mostrados na Tabela 3 para diferentes volumes de preenchimento.

[00153] As composições foram armazenadas por 3 meses a 4°C e 40°C e depois reidratadas em 0,75 ml de WFI antes da injeção IM em camundongos, como descrito no Exemplo 2. A Figura 9 mostra a “potência in vitro” das composições após 3 meses a 4°C ou 40°C (teor de antígeno de HA determinado por sELISA, como descrito no Exemplo 4). Os resultados demonstram perda mínima do teor de antígeno de HA com armazenamento até 3 meses a 40°C quando os antígenos de influenza (Fluzone®, Fluvirin® ou FluLaval®) eram formulados com NISVs, enquanto o teor de antígeno de HA declinou de forma constante quando os antígenos de influenza (Fluzone®, Fluvirin® ou FluLaval®) não eram formulados com NISVs.

EXEMPLO 6 Imunização contra influenza de macacos com composições imunogênicas

[00154] Para examinar a imunogenicidade em um modelo em primata não humano, as composições que demonstraram termoestabilidade in vitro e in vivo em camundongos a 4°C, 25°C e 40°C por até 6 meses também foram testadas em macacos Rhesus. Os macacos receberam duas injeções (0,28 dias) de: (a) uma quantidade dose-equivalente (1X dose unitária humana-padrão ou 45 μg) de controle positivo de Fluzone® não formulada e sem adjuvante ou (b) uma quantidade dose-excedente (1/3X dose unitária humana-padrão ou 15 μg) de Fluzone® formulada com NISVs com ou sem o adjuvante de agonista de TLR-4 exemplar PHAD (50 μg). Amostras de soro foram coletadas pré- e pós-injeção IM (por até 10 semanas pós-2a injeção) e analisadas por um ensaio de HAI, como descrito no Exemplo 3. Os ensaios de HAI foram realizados para H1N1 e H3N2 e os dados para H3N2 são apresentados na Figura 10 para os três grupos de tratamento. Como mostrado na Figura 10, a composições dose- excedentes de NISV-Fluzone®, com adjuvante PHAD ou sem adjuvante, mostraram imunogenicidade superior, comparadas com o controle positivo de Fluzone® não formulada e sem adjuvante em macacos Rhesus até 10 semanas após a segunda administração IM.

Exemplo 7 O papel da proporção de lipídeo:antígeno, da concentração de lipídeo e do teor de lipídeo na termoestabilidade

[00155] Para examinar o role que os lipídeos desempenham na termoestabilidade, as composições imunogênicas foram formuladas usando o método de derretimento invertido (como descrito no Exemplo 1) com diferentes proporções de lipídeo:antígeno, diferentes teores de lipídeo por dose unitária e diferentes concentrações de lipídeo durante homogeneização e reconstituição. As várias composições testadas são descritas na Tabela 9 abaixo. O objetivo desse estudo foi determinar a termoestabilidade das composições de Fluzone® de NISV após armazenamento por 3 meses a 4°C e 40°C.

* Fluzone® (temporada 2009-2010; Sanofi Pasteur) é uma vacina inativada fracionada trivalente contra influenza. Cada dose unitária de 0,5 ml de Fluzone® (temporada 2009-2010; Sanofi Pasteur) contém 15 μg de antígeno de HA de cada uma das seguintes cepas de vírus influenza: H1N1, A/Brisbane/59/2007; H3N2, A/Brisbane/10/2007; e B/Brisbane/60/2008 (ou seja, 45 μg de antígeno de HA total em 0,5 ml). 2 * Estoque de antígeno diluído 2 vezes com 10 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 (ou seja, 22,5 μg de antígeno de HA total em 0,5 ml). 3 ** Estoque de antígeno concentrado 2 vezes com tubos de ultrafiltração Amicon (ou seja, 90 μg de antígeno de HA total em 0,5 ml). 4 *** Proporção de peso de lipídeos formadores de vesículas:antígeno de HA.

[00156] As NISVs eram compostas pelos seguintes lipídeos: 1-monopalmitoil glicerol (MPG, um tensoativo não iônico), colesterol (CHO, um esteróide) e fosfato de dicetila (DCP, um anfifílico iônico). Para manter uma proporção molar de lipídeo de 5:4:1, as quantidades apresentadas na Tabela 9 foram pesadas e colocadas em um béquer de fundo plano e derretidas em um banho de óleo aquecido a 120-125°C com turbilhonamento ocasional usando um bastão de vidro, como descrito no Exemplo 1. Enquanto os lipídeos eram derretidos, tampão de fosfato concentrado em volumes apresentados na Tabela 9 foi adicionado o volume apropriado de Fluzone®, como apresentado na Tabela 9. As soluções tamponadas de estoque de antígeno foram então homogeneizadas a 8.000 rpm a 30-35°C, e rapidamente (para evitar cristalização) os lipídeos derretidos foram transferidos para dentro do béquer durante homogeneização da solução, quando então a homogeneização a 8.000 rpm continuou por 10 minutos a 30-35°C. Ase suspensões de NISV- antígeno resultantes foram agitadas por 1-2 horas a 220 ± 10 rpm a 30-35°C. Finalmente, um volume igual de 400 mM de solução de sacarose em água foi adicionado às soluções de NISV-antígeno e agitado por 5 minutos a 220 ± 10 rpm a 30 35°C. Foram coletadas amostras (1 ml/frasco), elas foram congeladas a -80°C de um dia para o outro, ou mais tempo, e subseqüentemente liofilizadas de acordo com os parâmetros de liofilização-alvo no ciclo de liofilização descrito na Tabela 2 e nos pontos de ajuste do tempo de secagem primária mostrados na Tabela 3 para diferentes volumes de preenchimento.

[00157] As composições (descritas na Tabela 10) foram armazenadas a 4°C ou 40°C por até 3 meses, e foram então administradas IM aos camundongos (como descrito no Exemplo 2). A resposta imune em camundongos vacinados foi determinada usando o ensaio de HAI descrito no Exemplo 3. Além da potência in vivo, testes de estabilidade adicionais, como descritos no Exemplo 4, foram realizados nas composições, incluindo inspeção visual da torta liofilizada; medição do teor de antígeno por sELISA e medição do teor de umidade da torta liofilizada. Tabela 10

* Fluzone® (temporada 2009-2010; Sanofi Pasteur) é uma vacina inativada fracionada trivalente contra influenza. Cada dose unitária de 0,5 ml de Fluzone® (temporada 2009-2010; Sanofi Pasteur) contém 15 μg de antígeno de HA de cada uma das seguintes cepas de vírus influenza: H1N1, A/Brisbane/59/2007; H3N2, A/Brisbane/10/2007; e B/Brisbane/60/2008 (ou seja, 45 μg de antígeno de HA total em 0,5 ml). ** Concentração aproximada de lipídeos após homogeneização. reconstituição. peso de lipídeos formadores de vesículas:antígeno de HA. # Estoque de antígeno diluído duas vezes. # # Estoque de antígeno concentrado duas vezes. # ## controle de Fluzone® comercial usado sem nenhuma etapa de formulação.

[00158] A umidade residual em composições foi determinada usando o ensaio de Karl Fischer e foi expressa como percentual de umidade por peso e é apresentada na Tabela 11. Houve diferenças distintas quando se compara a umidade residual das composições de NISV-Fluzone® com proporção de lipídeo:antígeno menor (30:1 e 100:1) versus as composições de NISV-Fluzone® com proporção de lipídeo:antígeno maior (300:1). Em geral, as composições de NISV-Fluzone® com proporção de lipídeo:antígeno menor tiveram teor de umidade maior (30:1 - 2,87% e 100:1 - 1,81%) do que a composição com proporção de lipídeo:antígeno NISV maior (300:1 - 1,53% ou menos). Também observamos diferenças na umidade residual nas composições de NISV-Fluzone® com proporção de lipídeo:antígeno de 300:1, dependendo da concentração de lipídeo durante a homogeneização. Dessa forma, composições preparadas com concentrações menores de lipídeo durante a homogeneização tiveram um teor de umidade residual na faixa de 1,21 a 1,53% (Artigos de teste 3, 4, 6), enquanto composições preparadas com concentrações de lipídeo maiores durante a homogeneização tiveram um teor de umidade residual menor na faixa de 0,54 a 0,66% (Artigos de teste 5 e 7). As várias proporções de lipídeo:antígeno e concentrações de lipídeo também podem ser expressas como o teor de lipídeo total na torta liofilizada. A utilização dessa medição para o teor de lipídeo permite uma correlação entre o teor de lipídeo e a umidade residual, em que tortas liofilizadas com teor de lipídeo baixo possuem teor de umidade residual elevado, e tortas liofilizadas com teor de lipídeo elevado possuem teor de umidade residual baixo. O teor de lipídeo nas tortas liofilizadas também foi comparado com a aparência das tortas após T = 0, T = 3 meses a 4°C e T = 3 meses a 40°C. Em T = 0, todas as tortas da composição liofilizada de NISV-Fluzone® eram brancas, bem formadas e desprovidas de microcolapso, independentemente do teor de lipídeo. A mesma observação também foi feita para todas as tortas da composição liofilizada de NISV-Fluzone® em T = 3 meses a 4°C. No entanto, em T = 3 meses a 40°C, nem todas as tortas da composição liofilizada de NISV-Fluzone® pareciam intactas; as tortas liofilizadas com os dois menores teores de lipídeo, ou seja, Artigo de teste 1 (1,35 mg) e Artigo de teste 2 (4,5 mg), pareciam ter colapsado e derretido novamente, enquanto todas as tortas liofilizadas com teor de lipídeo maior, ou seja, Artigos de teste 3-7 (6,75 mg ou mais) ainda pareciam intactas, até mesmo após armazenamento por três meses nessa temperatura elevada. As mesmas correlações são observadas quando a concentração de lipídeo durante a homogeneização é usada ao invés do teor de lipídeo; compare: Artigo de teste 1 (2,7 mg/ml) e Artigo de teste 2 (9 mg/ml) com Artigos de teste 3-7 (13,5 mg/ml ou mais). Tabela 11

1 Calculado usando concentrações de lipídeo durante a homogeneização e dividido ao meio em função de adição de volume igual de sacarose pré-liofilização. 2 * Concentração aproximada de lipídeos após homogeneização. *** Proporção de peso de lipídeos formadores de vesículas:antígeno de HA.

[00159] Figura 11 mostra o teor de antígeno de HA in vitro para Fluzone® comercial não formulada (Artigo de teste 8) versus uma composição de NISV-Fluzone® com proporção de lipídeo:antígeno de 300:1 (Artigo de teste 3), uma composição de NISV-Fluzone® com proporção de lipídeo:antígeno de 100:1 (Artigo de teste 2) e uma composição de NISV-Fluzone® com proporção de lipídeo:antígeno de 30:1 (Artigo de teste 1). Alíquotas de composições reidratadas foram centrifugadas em uma ultracentrífuga a 24.000 rpm, por 20 minutos a 4°C, e frações do sobrenadante e do pélete foram removidas, extraídas e analisadas por sELISA para determinar o teor de antígeno (ou “potência in vitro”), como descrito no Exemplo 4. O teor de antígeno foi determinado para as quatro composições em T = 0 e após três meses armazenamento a 40°C (T = 3 meses a 40°C). Uma perda significante do teor de antígeno de HA foi detectada por sELISA após armazenamento por 3 meses a 40°C tanto para o controle de Fluzone® não formulada (Artigo de teste 8) quanto para a composição de NISV-Fluzone® com a menor proporção de lipídeo:antígeno (30:1) (Artigo de teste 1). Após armazenamento por 3 meses a 40°C, apenas 70% do teor de HA original permaneceram para Fluzone® comercial, enquanto apenas 40% do teor de HA original permaneceram para a composição de NISV-Fluzone® com a menor proporção de lipídeo:antígeno (30:1) (Artigo de teste 1). Em contraste, as composições de NISV-Fluzone® com proporção de lipídeo:antígeno maior (100:1 e 300:1) mostraram uma perda muito pequena do teor de antígeno de HA ao longo do tempo, apesar de serem armazenadas a 40°C por três meses.

[00160] A Figura 12 mostra a potência in vivo em camundongos (titulações de HAI testadas como descrito no Exemplo 3, usando amostras de soros coletadas 15 dias pós- 2a vacinação) para todas as composições de NISV-Fluzone® (Grupos 1-7) descritas na Tabela 10 versus um controle de Fluzone® não formulada (Grupo 8). Os resultados mostrados são para (A) H1N1 e (B) H3N2 e demonstram que as composições de NISV-Fluzone® e o controle de Fluzone® não formulada tiveram geralmente a mesma potência em T = 0 (titulação de HAI média para H1N1 - 189,9; titulação de HAI média para H3N2 - 177,5).

[00161] A Figura 13 mostra a potência in vivo em camundongos (titulações de HAI testadas como descrito no Exemplo 3, usando amostras de soros coletadas 15 dias pós- 2a vacinação) para o controle de Fluzone® não formulada (Grupo 8) versus uma composição de NISV-Fluzone® com proporção de lipídeo:antígeno de 300:1 (Grupo 3), uma composição de NISV-Fluzone® com proporção de lipídeo:antígeno de 100:1 (Grupo 2) e uma composição de NISV-Fluzone® com proporção de lipídeo:antígeno de 30:1 (Grupo 1). Todas as composições foram armazenadas por 3 meses a 4°C ou 40°C antes da injeção IM em camundongos. Os resultados mostrados são para (A) H1N1 e (B) H3N2 e demonstram que as composições de NISV-Fluzone® com proporção de lipídeo:antígeno de 300:1 e 100:1 (Grupos 2 e 3) eram igualmente potentes quando armazenadas por até 3 meses a 4°C ou 40°C, enquanto o controle de Fluzone® não formulada (Grupo 8) e a composição de NISV-Fluzone® com proporção de lipídeo:antígeno de 30:1 (Grupo 1) perderam potência quando armazenadas a 40°C ao longo do mesmo período de tempo de 3 meses.

[00162] A Figura 13 também mostra a potência in vivo em camundongos (titulações de HAI testadas como descrito no Exemplo 3, usando amostras de soros coletadas 15 dias pós- 2a vacinação) para composições de NISV-Fluzone® com proporção de lipídeo:antígeno de 300:1 em três concentrações de lipídeo diferentes durante homogeneização e reconstituição: concentração de lipídeo na faixa baixa (Grupo 4), concentração de lipídeo na faixa média (Grupo 3) e concentração de lipídeo na faixa alta (Grupo 5). Todas as composições foram armazenadas por 3 meses a 4°C ou 40°C antes da injeção IM em camundongos. Os resultados mostrados são para (A) H1N1 e (B) H3N2 e demonstram que as composições de NISV-Fluzone® na faixa média e na faixa alta (Grupos 3 e 5) foram igualmente potentes quando armazenadas por até 3 meses a 4°C ou 40°C, enquanto a composição de NISV-Fluzone® com concentração de lipídeo na faixa baixa (Grupo 4) mostrou uma perda de potência mínima quando armazenada a 40°C ao longo do mesmo período de tempo de 3 meses. A composição de NISV-Fluzone® com concentração de lipídeo na faixa baixa com proporção de lipídeo:antígeno de 300:1 (concentração de lipídeo de 13,5 mg/ml durante homogeneização) não tinham uma concentração de lipídeo tão baixa quanto na composição de NISV-Fluzone® com proporção de lipídeo:antígeno de 30:1 (concentração de lipídeo de 2,7 mg/ml durante homogeneização).

[00163] A Figura 13 também mostra a potência in vivo em camundongos (titulações de HAI testadas como descrito no Exemplo 3, usando amostras de soros coletadas 15 dias pós- 2a vacinação) para composições de NISV-Fluzone® com proporção de lipídeo:antígeno de 300:1 em três concentrações de lipídeo diferentes durante homogeneização e na mesma concentração de lipídeo na reconstituição: concentração de lipídeo na faixa baixa (Grupo 6), concentração de lipídeo na faixa média (Grupo 3) e concentração de lipídeo na faixa alta (Grupo 7). Todas as composições foram armazenadas por 3 meses a 4°C ou 40°C antes da injeção IM em camundongos. Os resultados mostrados são para (A) H1N1 e (B) H3N2 e demonstram que as composições de NISV-Fluzone® na faixa média e na faixa alta (Grupos 3 e 7) foram igualmente potentes quando armazenadas por até 3 meses a 4°C ou 40°C, enquanto a composição de NISV-Fluzone® com concentração de lipídeo na faixa baixa (Grupo 6) mostrou uma perda de potência mínima quando armazenada a 40°C ao longo do mesmo período de tempo de 3 meses. A composição de NISV-Fluzone® com concentração de lipídeo na faixa baixa com proporção de lipídeo:antígeno de 300:1 (concentração de lipídeo de 13,5 mg/ml durante homogeneização) não tinha uma concentração de lipídeo tão baixa quanto na composição de NISV-Fluzone® com proporção de lipídeo:antígeno de 30:1 (concentração de lipídeo de 2,7 mg/ml durante homogeneização).

Outras modalidades

[00164] Outras modalidades da revelação ficarão evidentes àqueles habilitados na técnica a partir de consideração do relatório descritivo ou da prática da revelação aqui apresentada. Deseja-se que o relatório descritivo e os exemplos sejam considerados apenas exemplares, com o verdadeiro escopo da revelação sendo indicado pelas reivindicações seguintes. O conteúdo de qualquer referência aqui citada é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

Claims

1. Composição imunogênica, tal como uma composição líquida ou seca, caracterizadapor compreender um antígeno de hemaglutinina do vírus influenza, o referido antígeno selecionado a partir de uma cepa de influenza A H1N1, uma cepa de influenza A H3N2 e uma cepa de influenza B, e vesículas lipídicas, em que as vesículas lipídicas compreendem lipídeos que estão presentes na composição em uma quantidade que alcança uma proporção em peso de lipídeo:antígeno dentro de uma faixa de 50:1 a 400:1, tal como dentro de 250:1 a 350:1, e mais preferencialmente a uma proporção em peso de 300:1, e os lipídeos incluem um tensoativo não iônico.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapor ser seca e o teor de umidade da composição ser menor do que 2% em peso.

3. Composição, de acordo a reivindicação 1 ou 2, caracterizadapor compreender quantidades iguais de antígeno de hemaglutinina do vírus influenza de cada cepa.

4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadapela composição compreender um vírus influenza inativado ou atenuado que inclui o antígeno de hemaglutinina do vírus influenza.

5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadapelo antígeno de hemaglutinina do vírus influenza estar presente na composição como um antígeno de vírus fracionado ou um antígeno de subunidade.

6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizadapelo fato de que o tensoativo não iônico é um tensoativo com ligação éster, tal como um éster de glicerol ou 1-monopalmitoil glicerol; ou é um tensoativo com ligação éter, tal como um monoéter de glicol ou glicerol, éter de 1-monocetil glicerol ou éter de diglicolcetil.

7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que os lipídeos ainda compreendem: um anfifílico iônico, tal como dicetilfosfato, um esteróide, tal como colesterol, ou qualquer combinação dos mesmos, tal como uma combinação de 1-monopalmitoil glicerol, dicetilfosfato e colesterol.

8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a composição ainda compreende um adjuvante, tal como um agonista de TLR-4, um derivado atenuado de lipídeo A, um derivado monofosforil de lipídeo A, um derivado 3-deacil monofosforil de lipídeo A, um agonista de TLR-7/8 ou um agonista de TLR-9.

9. Uso de uma composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por ser na preparação de uma composição imunogênica reidratada para tratamento de um indivíduo que sofre ou em risco de infecção por influenza, em que: a composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 está em uma forma seca; e a composição seca é reidratada para fornecer a composição imunogênica.

10. Método de preparação de uma composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por compreender: o derretimento dos lipídeos para produzir lipídeos derretidos; a combinação dos lipídeos derretidos com uma solução aquosa que inclui o antígeno de hemaglutinina do vírus influenza, o referido antígeno selecionado a partir de uma cepa de influenza A H1N1, uma cepa de influenza A H3N2 e uma cepa de influenza B; e a homogeneização do produto resultante, em que os lipídeos derretidos e a solução aquosa são combinados em quantidades relativas que alcançam uma proporção em peso de lipídeo:antígeno dentro de uma faixa de 50:1 a 400:1, tal como dentro de 250:1 a 350:1, e mais preferencialmente a uma proporção em peso de 300:1.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que os lipídeos derretidos são adicionados à solução aquosa que inclui o antígeno de hemaglutinina do vírus influenza.

12. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a solução aquosa que inclui o antígeno de hemaglutinina do vírus influenza é adicionada aos lipídeos derretidos.