MX2012015232A

MX2012015232A - Composiciones y metodos para el tratamiento de influenza.

Info

Publication number: MX2012015232A
Application number: MX2012015232A
Authority: MX
Inventors: David E Anderson; Andrei Ogrel; Ronald Erwin Boch; Jeff Baxter
Original assignee: Variation Biotechnologies Inc
Priority date: 2010-07-06
Filing date: 2011-07-06
Publication date: 2013-02-26
Also published as: AU2011276223B2; BR112013000394A2; MX342138B; WO2012006367A2; JP6119030B2; WO2012006367A3; CA2840079A1; CA2840079C; EP2590674A2; AU2011276223C1; EP2590674A4; IL224022B; JP2013533259A; CN103096922B; BR112013000394B8; AU2011276223A1; BR112013000394B1; EP2590674B1; CN103096922A; US9610248B2

Abstract

La presente divulgación proporciona composiciones y métodos útiles para tratar la influenza. Como se describe aquí, las composiciones y métodos proporcionados están basados en el desarrollo de ciertas composiciones que incluyen un antígeno de hemaglutinina del virus de la influenza en combinación con vesículas de lípidos que incluyen un surfactante no iónico (NISVs) y opcionalmente un adyuvante. En ciertas modalidades, las composiciones proporcionadas permanecen en potencia aún cuando no se almacenen en un sistema de cadena fría estándar (es decir, que son termoestables).

Description

COMPOSICIONES Y METODOS PARA EL TRATAMIENTO DE INFLUENZA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La influenza es una enfermedad infecciosa común del sistema respiratorio asociada con la familia de virus de Orthomyxoviridae. Debido al alto grado de variabilidad del virus, la vacunación es comúnmente requerida en una base anual con una vacuna reformulada que toma en cuenta variaciones de cepa. La composición de la vacuna desarrollada cada año en los Estados Unidos de América es determinada por el Departamento de Vacunas de la Administración de Alimentos y Medicinas y el Comité de Consejo de Biológicos Relacionados. La Organización Mundial de la Salud (OMS) maneja similarmente una red de vigilancia global de laboratorio para detección de nuevas variantes de influenza, por ejemplo véase Lavanchy, Vaccine 17:S24 (1999). La selección está basada en el análisis antigénico de virus de influenza aislados recientemente, los patrones de esparcimiento de variantes antigénicas y las respuestas de anticuerpo de sujetos recientemente vacunados.

La influenza A y B son los dos tipos de virus de influenza que provocan enfermedad humana epidérmica. Los virus de influenza A son clasificados adicionalmente en subtipos en base a dos antigenos de superficie: hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (N) . Por ejemplo, el subtipo H1N1 de virus de influenza A tiene un antigeno tipo 1 de hemaglutinina (Hl) y un antigeno tipo 1 de neuraminidasa (NI) mientras que el subtipo de H3N2 tiene un antigeno tipo 3 dé hemaglutinina (H3) y un antigeno tipo 3 de neuraminidasa (N2). Los virus de influenza B no son clasificados en subtipos. Desde 1977, los virus de influenza A (H1N1), virus de influenza A (H3N2) y virus de influenza B han estado en circulación global. La vacunación es reconocida como la única manera más efectiva para impedir o atenuar influenza para aquellos en alto riesgo de enfermedad seria de infección de influenza y complicaciones relacionadas. La inoculación de antigeno preparado a partir de virus de influenza desactivado estimula la producción de anticuerpos específicos. La protección es provista solamente contra aquellas cepas de virus de las cuales la vacuna es preparada o cepas estrechamente relacionadas.

La vacuna de cada año contiene antigenos de tres cepas diferentes (denominada como vacuna trivalente que contiene usualmente antígenos de dos cepas tipo A y una cepa tipo B) que representan los virus de influenza se creen probables que circulen en el invierno venidero. Las características antigénicas de las cepas de virus de influenza actuales y emergentes proveen la base para seleccionar cepas incluidas en la vacuna de cada año. La OMS revisa la situación epidemiológica mundial anualmente y si es necesario recomienda nuevas cepas en base a la evidencia epidemiológica actual .

En tanto que las vacunas de influenza han sido exitosas para reducir la incidencia de influenza mundialmente, todavía hay necesidad en el arte por vacunas de influenza mejoras que sean estables y retengan potencia.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente revelación provee composiciones y métodos útiles para el tratamiento de influenza. Como se describe en la presente, las composiciones y métodos provistos están basados en el desarrollo de ciertas composiciones que incluyen un antígeno de hemaglutinina de virus de influenza en combinación con vesículas de lípido que incluyen un surfactante no iónico (NISV) y opcionalmente un adyuvante. En ciertas modalidades, las composiciones provistas siguen siendo potentes aun cuando no son almacenadas en un sistema de cadena fría estándar (esto es, son termo estables) .

En un aspecto, la presente- revelación provee composiciones que comprenden un antígeno de hemaglutinina de virus de influenza y vesículas de lípido, en donde las vesículas de lípido consisten de lípidos que están presentes en la composición en una cantidad que obtiene una proporción en peso de lípido: antígeno dentro de un intervalo de alrededor de 50:1 a alrededor de 400:1 y los lípidos incluyen un surfactante no iónico. En ciertas modalidades, las composiciones provistas son inmunogenas.

En otro aspecto, la presente revelación provee composiciones inmunogenas que comprenden un antigeno de hemaglutinina de virus de influenza y vesículas de lípido, en donde las vesículas de lípido consisten de lipidos que están presentes en la composición en una cantidad que obtiene una proporción en peso de lipidos: antígeno de por lo menos alrededor de 50:1 y los lipidos incluyen un surfactante no iónico.

En ciertas modalidades, las composiciones mencionadas anteriormente son liquidas. En ciertas modalidades, las composiciones mencionadas anteriormente son secadas (por ejemplo, liofilizadas) .

En otro aspecto, la presente revelación provee composiciones secas (por ejemplo, liofilizadas ) que comprenden un antígeno de hemaglutinina de virus de influenza y vesículas de lípido, en donde las vesículas de lípido consisten de lipidos que están presentes en la composición en una cantidad que obtiene una proporción en peso de lípido: antígeno de por lo menos alrededor de 30:1, los lipidos incluyen un surfactante no iónico y el contenido de humedad de la composición es menor de alrededor de 2% en peso. En ciertas modalidades, la proporción en peso de lipidos: antígeno es de por lo menos de alrededor de 40:1 o 50:1. En ciertas modalidades, . el contenido de humedad de las composiciones provistas es menor de alrededor de 1.9%, 1.8%, 1.7%, 1.6%, 1.5%, 1.4%, 1.3%, 1.2%, 1.1%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5% o 0.4% en peso. En ciertas modalidades, el contenido de humedad de las composiciones provistas está en el intervalo de alrededor de 0.4% a alrededor de 2% en peso. En ciertas modalidades, el contenido de humedad de las composiciones provistas está en el intervalo de alrededor de 0.5% a alrededor de 1.9% en peso. En ciertas modalidades, el contenido de humedad de las composiciones provistas está en el intervalo de alrededor de 0.6% a alrededor de 1.8% en peso. En ciertas modalidades, el contenido de humedad de las. composiciones provistas está en el intervalo de alrededor de 0.7% a alrededor de 1.7% en peso. En ciertas modalidades, el contenido de humedad de las composiciones provistas está en el intervalo de alrededor de 0.8% a alrededor de 1.6% en peso. En ciertas modalidades, el contenido de humedad de las composiciones provistas está en el intervalo de alrededor de 0.9% a alrededor de 1.5% en peso. En ciertas modalidades, el contenido de humedad de las composiciones provistas está en el intervalo de alrededor de 0.1% a alrededor de 1.4% en peso. En ciertas modalidades, el contenido de humedad de las composiciones provistas está en el intervalo de alrededor de 0.5% a alrededor de 1% en peso. En ciertas modalidades, el contenido de humedad de las composiciones provistas está en el intervalo de alrededor de 0.5% a alrededor de 1.5% en peso. En ciertas modalidades, el contenido de humedad de las composiciones provistas está en el intervalo de alrededor de 0.5% a alrededor de 2% en peso. En ciertas modalidades, el contenido de humedad de las composiciones provistas está en el intervalo de alrededor de 1% a alrededor de 1.5% en peso. En ciertas modalidades, el contenido de humedad de las composiciones provistas está en el intervalo de alrededor de 1% a alrededor de 2% en peso. En ciertas modalidades, el contenido de humedad de las composiciones provistas está en el intervalo de alrededor de 1.5% a alrededor de 2% en peso.

En ciertas modalidades, la proporción del peso de lipidos: antigeno en una de las composiciones mencionadas anteriormente es de por lo menos alrededor de 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 110:1, 120:1, 130:1, 140:1, 150:1, 160:1, 170:1, 180:1, 190:1, 200:1, 210:1, 220:1, 230:1, 240:1, 250:1, 260:1, 270:1, 280:1, 290:1 o 300:1. En ciertas modalidades, la proporción en peso de lipidos: antigeno en una de las composiciones mencionadas anteriormente es menor de alrededor de 400:1, 390:1, 380:1, 370:1, 360:1, 350:1, 340:1, 330:1, 320:1, 310:1.

En ciertas modalidades, la proporción en peso de lipidos: antigeno en una de las composiciones mencionadas anteriormente está dentro de un intervalo de alrededor de 50:1 a alrededor de 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 110:1, 120:1, 130:1, 140:1, 150:1, 160:1, 170:1, 180:1, 190:1, c 200:1, 210:1, 220:1, 230:1, 240:1, 250:1, 260:1, 270:1, 280:1, 290:1, 300:1, 310:1, 320:1, 330:1, 340:1, 350:1, 360:1, 370:1, 380:1, 390:1, 400:1. En ciertas modalidades, la proporción en peso de lipido: antigeno en una de las composiciones mencionadas anteriormente está dentro de un intervalo de alrededor de 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 110:1, 120:1, 130:1, 140:1, 150:1, 160:1, 170:1, 180:1, 190:1, 200:1, 210:1, 220:1, 230:1, 240:1, 250:1, 260:1, 270:1, 280:1, 290:1, 300:1, 310:1, 320:1, 330:1, 340:1, 350:1, 360:1, 370:1, 380:1, 390:1, 400:1 En ciertas modalidades, la proporción en peso de lipidos: antigeno en una de las composiciones mencionadas anteriormente está dentro de un intervalo de alrededor de 50:1 a alrededor de 100:1, alrededor de 50:1 a alrededor de 150:1, alrededor de 50:1 a alrededor de 200:1, alrededor de 50:1 a alrededor de 250:1, alrededor de 50:1 a alrededor de 300:1, alrededor de 50:1 a alrededor de 350:1 o alrededor de 50:1 a alrededor de 400:1. En ciertas modalidades, la proporción en peso de lipido: antigeno en una de las composiciones mencionadas anteriormente está dentro de un intervalo de alrededor de 100:1 a alrededor de 150:1, alrededor de 100:1 a alrededor de 200:1, alrededor de 100:1 a alrededor de 250:1, alrededor de 100:1 a alrededor de 300:1, alrededor de 100:1 a alrededor de 350:1 o alrededor de 100:1 a alrededor de 400:1. En ciertas modalidades, la proporción en peso de lípido: antígeno en una de las composiciones mencionadas anteriormente está dentro de un intervalo de alrededor de 150:1 a alrededor de 200:1, alrededor de 150:1 a alrededor de 250:1, alrededor de 150:1 a alrededor de 300:1, alrededor de 150:1 a alrededor de 350:1 o alrededor de 150:1 a alrededor de 400:1. En ciertas modalidades, la proporción en peso de lipido: antigeno en una de las composiciones mencionadas anteriormente está dentro de un intervalo de alrededor de 200:1 a alrededor de 250:1, alrededor de 200:1 a alrededor de 300:1', alrededor de 200:1 a alrededor de 350:1 o alrededor de 200:1 a alrededor de 4000.: 1. En ciertas modalidades, la proporción en peso de lipido: antigeno en una de las composiciones mencionadas anteriormente está dentro de un intervalo de alrededor de 250:1 a alrededor de 300:1, alrededor de 250:1 a alrededor de 350:1 o alrededor de 250:1 a alrededor de 400:1. En ciertas modalidades, la proporción en peso de lipido: antigeno en una de las composiciones mencionadas anteriormente está dentro de un intervalo de alrededor de 300:1 a alrededor de 350:1 o alrededor de 300:1 a alrededor de 400:1. En ciertas modalidades, la proporción en peso de lipido: antigeno en una de las composiciones mencionadas anteriormente está dentro de un intervalo de alrededor de 350:1 a alrededor de 400:1. En ciertas modalidades, la proporción en peso de lipido: antigeno en una de las composiciones mencionadas anteriormente es alrededor de 200:1, 210:1, 220:1, 230:1, 240:1, 250:1, 260:1, 270:1, 280:1, 290:1, 300:1, 310:1, 320:1, 330:1, 340:1, 350:1, 360:1, 370:1, 380:1, 390:1 o 400:1.

En ciertas modalidades, las composiciones mencionadas anteriormente exhiben menos del 50% de cambio en inmunogenicidad tal como se determina mediante un análisis de Inhibición de Hemaglutinina (HAI) cuando es almacenada por 6 meses a 40°C. En ciertas modalidades, las composiciones provistas exhiben menos del 40%, menos del 30%, menos del 20%, menos del 10%, menos del 5% o menos del 2% de cambio en inmunogenicidad.

En ciertas modalidades, las composiciones mencionadas anteriormente exhiben menos del 50% de pérdida de contenido de antigeno, como se determina mediante un Análisis Inmunoabsorbente Enzima-Enlazado (ELISA) cuando son almacenadas por 6 meses a 40°C. En ciertas modalidades, las composiciones provistas exhiben menos del 40%, menos del 30%, menos del 20%, menos del 10%, menos del 5% o menos del 2% de pérdida de contenido de antigeno.

En ciertas modalidades, las composiciones mencionadas anteriormente son más estables cuando son almacenadas por 6 meses a 40°C que una composición de referencia que carece de las vesículas de lípido. En ciertas modalidades, la estabilidad está basada en la inmunogenicidad tal como se determina mediante un análisis de HAI. En ciertas modalidades, la estabilidad está basada en el contenido de antigeno tal como se determina mediante un ELISA.

En todavía otro aspecto, la presente revelación provee composiciones inmunogénicas que comprenden un antígeno de hemaglutinina de virus de inflúenza y vesículas de lipido, en donde las vesículas de lipido consisten de lípidos que incluyen un surfactante no iónico y la composición exhibe menos de 50% de cambio en inmunogenicidad, tal como se determina . por un análisis de HAI cuando es almacenada por 6 meses a 40°C. En ciertas modalidades, las composiciones provistas exhiben menos del 40%, menos del 30%, menos del 20%, menos del 10%, menos del 5% o menos del 2% de cambio en inmunogenicidad .

En todavía otro aspecto, la presente revelación provee composiciones inmunogénicas que comprenden un antígeno de hemaglutinina de virus de influenza y vesículas de lipido, en donde las vesículas de lipido consisten de lipido que incluyen un surfactante no iónico y la composición exhibe menos del 50% de pérdida de contenido de antígeno tal como se determina por un análisis de ELISA cuando son almacenada por 6 meses a 40°C. En ciertas modalidades, las composiciones provistas exhiben menos del 40%, menos del 30%, menos del 20%, menos del 10%, menos del 5% o menos del 2% de cambio en inmunogenicidad.

En todavía otro aspecto, la presente revelación provee composiciones inmunogénicas que comprende un antigeno de hemaglutinina de virus de influenza y vesículas de lipido, en donde las vesículas de lipido consisten de lípidos que incluyen un surfactante no iónico y la composición es más estable cuando es almacenada por 6 meses a 40°C que una composición de referencia que carece de las vesículas de lipido. En ciertas modalidades, la estabilidad está basada en la inmunogenicidad tal como se determina por un análisis de HAI . En ciertas modalidades, la estabilidad está basada en el contenido de antígeno tal como se determina mediante un análisis de ELISA.

En ciertas modalidades, las composiciones mencionadas anteriormente son preparadas mediante un método que incluye: fundir los lípidos para producir lípidos fundidos; combinar los lípidos fundidos con una solución acuosa que incluye el antígeno de hemaglutinina de virus de influenza y homogeneizar el producto resultante.

En ciertas modalidades, los lípidos (por ejemplo, lípidos fundidos) y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas que obtienen la proporción en peso de lipido: antígeno deseada en el producto resultante (por ejemplo, por lo menos alrededor de 50:1 o cualquiera de los intervalos mencionados anteriormente) . En ciertas modalidades, los lípidos fundidos son agregados a la solución acuosa que incluye el antígeno de hemaglutinina de virus de influenza. En ciertas modalidades, la solución acuosa que incluye el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza es agregada a los lipidos fundidos.

En ciertas modalidades, los lipidos (por ejemplo, lipidos fundidos) y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas y volúmenes que obtienen una concentración de lipidos de por lo menos alrededor de 10 mg/ml en el producto resultante. En ciertas modalidades, se obtiene una concentración de lipido de por lo menos alrededor de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o 95 mg/ml. En ciertas modalidades, la concentración de lipido está en un intervalo de alrededor de 10 mg/ml a alrededor 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 mg/ml. En ciertas modalidades, la concentración de lipido está en un intervalo de alrededor de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o 95 mg/ml a alrededor de 100 mg/ml. En ciertas modalidades, la concentración de lipido está en un intervalo de alrededor de 25 mg/ml a alrededor de 100 mg/ml, alrededor de 25 mg/ml a alrededor de 75 mg/ml, alrededor de 25 mg/ml a alrededor de 50 mg/ml, alrededor de 50 mg/ml a alrededor de 75 mg/ml o alrededor de 50 mg/ml a alrededor de 100 mg/ml.

En ciertas modalidades, los lipidos (por ejemplo, lipidos fundidos) y solución acuosa son combinados en cantidades relativas y volúmenes que obtienen tanto la proporción en peso de lipido: antigeno deseada (por ejemplo, por lo menos alrededor de 50:1 o cualquiera de los intervalos mencionados anteriormente) tanto como una concentración de lipido de por lo menos alrededor de 10 mg/ml (o cualquiera de los otros intervalos de concentración de lipido) en el producto resultante.

En ciertas modalidades, los lipidos (por ejemplo, lipidos fundidos) y antigenos son combinados en cantidades relativas que obtienen un contenido de lipido de por lo menos alrededor de 5 mg por dosis unitaria de composición (por ejemplo, una dosis unitaria seca de composición en un recipiente sellado que es almacenado antes de la rehidratación) . En ciertas modalidades, se obtiene un contenido de lipidos de por lo menos alrededor de 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 mg por dosis unitaria de composición. En ciertas modalidades, el contenido de lipido está en un intervalo de alrededor de 5 mg a alrededor de 50 mg, 5 mg a alrededor de 40 mg, 5 mg a alrededor de 30 mg, 10 mg a alrededor de 50 mg, 10 mg a alrededor de 40 mg, 10 mg a alrededor de 30 mg, 20 mg a alrededor de 50 mg,. 20 mg a alrededor de 40 mg o 20 mg a alrededor de 30 mg.

En ciertas modalidades, los lipidos (por ejemplo, lipidos fundidos) y antigenos son combinados en cantidades relativas que obtienen tanto la proporción en peso de lipido: antigeno deseada (por ejemplo, por lo menos alrededor de 50:1 o cualquiera de los intervalos mencionados anteriormente) como un contenido de lipido de por lo menos alrededor de 5 mg por dosis unitaria (o cualquiera de los otros intervalos de contenido de lipidos) .

En ciertas modalidades, los lipidos (por ejemplo, lipidos fundidos) y antigenos son combinados en cantidades relativas y volúmenes que obtienen tanto la proporción en peso de lipido: antigeno deseada (por ejemplo, por lo menos alrededor de 50:1 o cualquiera de los intervalos mencionados anteriormente) , un contenido de lipido de por lo menos 5 mg por dosis unitaria (o cualquiera de los otros intervalos de contenido del lipido) y una concentración de lipido de por lo menos alrededor de 10 mg/ml (o cualquiera de los otros intervalos de concentración de lipidos) en el producto resultante.

En todavía otro aspecto, la presente revelación provee composiciones que comprenden un antígeno de hemaglutinina de virus de influenza y vesículas de lipido, en donde las vesículas de lipido consisten de lipidos que incluyen un surfactante no iónico y las composiciones son preparadas mediante un método que incluye: fundir los lipidos para producir lipidos fundidos; combinar los lipidos fundidos con una solución acuosa que incluye el antígeno de hemaglutinina de virus de influenza y homogeneizar el producto resultante, en donde los lipidos fundidos ' y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas que obtienen la proporción en peso de lipido: antigeno deseada (por ejemplo, por. lo menos alrededor de 50:1 o cualquiera de los intervalos mencionados anteriormente) en el producto resultante. En ciertas modalidades, los lipidos fundidos son agregados a la solución acuosa que incluye el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza. En . ciertas modalidades, la solución acuosa que incluye el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza es agregada a los lipidos fundidos.

En todavía otro aspecto, la presente revelación provee composiciones que comprenden un antígeno de hemaglutinina de virus de influenza y vesículas de lipido, en donde las vesículas de lipido consisten de lipidos que incluyen un surfactante no iónico y las composiciones son preparadas mediante un método que incluye: fundir los lipidos para producir lipidos fundidos; combinar los lipidos fundidos con una solución acuosa que incluye el antígeno de hemaglutinina de virus de influenza- y homogeneizar el producto resultante, en donde los lipidos fundidos y solución acuosa son combinados en cantidades relativas y volúmenes que obtienen una concentración de lipido de por lo menos alrededor de 10 mg/ml (o cualquiera de los otros intervalos de concentración del lipido) en el producto resultante. En ciertas modalidades, los lipidos fundidos y solución acuosa son combinados en cantidades relativas y volúmenes que obtienen tanto la proporción en peso del lipido: antigeno deseada (por ejemplo, por lo menos alrededor de 50:1 o cualquiera de los intervalos mencionados anteriormente) como una concentración de lipido de por lo menos alrededor de 10 mg/ml (o cualquiera de los otros intervalos de concentración de lipido) en el producto resultante. En ciertas modalidades, el contenido de lipido es también por lo menos alrededor de 5 mg por dosis unitaria (o cualquiera de los otros intervalos de contenido de lipido) . En ciertas modalidades, los lipidos fundidos son agregados a la solución acuosa que incluye el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza. En ciertas modalidades, la solución acuosa que incluye el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza es agregada a los lipidos fundidos.

En ciertas modalidades, el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza es de una cepa H1N1 de influenza A. en ciertas modalidades, el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza es de una cepa H3N2 de influenza A. En ciertas modalidades, el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza es de una cepa de influenza B. En ciertas modalidades, el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza es de dos o más de una cepa H1N1 de influenza A, una cepa H3N2 de influenza A y una cepa de influenza B. En ciertas modalidades, el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza es de una cepa H1N1 de influenza A, una cepa H3N2 de influenza A y una cepa de influenza B. en ciertas modalidades, las composiciones provistas comprenden cantidades aproximadamente iguales de antigeno de hemaglutinina de virus de influenza de cada cepa.

En ciertas modalidades, las composiciones provistas comprenden uno o más virus de influenza desactivados que incluyen antigeno de hemaglutinina de virus de influenza. En ciertas modalidades, las composiciones provistas comprenden uno o más virus de influenza mutados que incluyen el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza. En ciertas modalidades, el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza está presente como un antigeno de virus dividido. En ciertas modalidades, el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza está presente como un antigeno de subunidad. En ciertas modalidades, por lo menos una porción del antigeno de hemaglutinina de virus de influenza está asociada con vesículas de lípido. En ciertas modalidades, por lo menos una porción del antígeno de hemaglutinina de virus de influenza está atrapada dentro de vesículas de lípido.

En ciertas modalidades, las composiciones provistas comprenden además un adyuvante. En ciertas modalidades, las composiciones provistas comprenden un adyuvante de agonista de TLR-4. En ciertas modalidades, las composiciones provistas comprenden un derivado de lípido A atenuado. En ciertas modalidades, las composiciones provistas comprenden un derivado de monofosforilo de lípido A. en ciertas modalidades, las composiciones provistas comprenden un derivado de 3-deacil monofosforilo de lipido A. en ciertas modalidades, por lo menos una porción del adyuvante de agonista de TLR-4 está asociada con vesículas de lipido. En ciertas modalidades, el adyuvante agonista de TLR-4 es co-fundido con lípidos durante la preparación de las composiciones provistas. En ciertas modalidades, el adyuvante de agonista de TLR-4 es combinado con lípidos fundidos y la solución acuosa que incluye el antígeno de hemaglutinina de virus de influenza durante la preparación de las composiciones provistas (por ejemplo, al mezclar la solución acuosa que incluye el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza de virus de influenza antes de que sea combinado con los lípidos fundidos) . En ciertas modalidades, el adyuvante de agonista de TLR-4 es agregado antes del secado (por ejemplo, liofilización de las composiciones provistas) .

En ciertas modalidades, las composiciones provistas son preparadas mediante un método que no involucra almacenarlas bajo condiciones de temperatura controlada. En ciertas modalidades, las composiciones provistas son preparadas mediante un método que involucra almacenarlas a una temperatura que excede por lo menos temporalmente de 8°C, 15°C, 20°C, 25°C, 30°C o 35°C.

En ciertas modalidades, las composiciones provistas son preparadas mediante un método que involucra almacenarlas en forma seca (por ejemplo, liofilizadas ) .

En otro aspecto, la presente revelación provee métodos de tratamiento de un sujeto que sufre de o está en riesgo de una infección de influenza al proveer una de las composiciones mencionadas anteriormente en forma seca (por ejemplo, liofilizadas) ; rehidratar la composición y administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición rehidratada. En ciertas modalidades, las composiciones rehidratadas son administradas mediante inyección intramuscular.

En todavía otro aspecto, la presente revelación provee métodos para preparar composiciones que comprenden un antigeno de hemaglutinina de virus de influenza y vesículas dé lípido, en donde las vesículas de lípido consisten de lípidos que incluyen un surfactante no iónico, el método comprende: fundir los lípidos para producir lípidos fundidos; combinar los lípidos fundidos con una solución acuosa que incluye el antígeno de hemaglutinina de virus de influenza y homogeneizar el producto resultante, en donde los lípidos fundidos y solución acuosa son combinados en cantidades relativas que obtienen la proporción en peso de lípido: antígeno deseada (por ejemplo, por lo menos alrededor de 50:1 o cualquiera de los intervalos mencionados anteriormente) en el producto resultante. En ciertas modalidades, los lípidos fundidos son agregados a la solución acuosa que incluye el antígeno de hemaglutinina de virus de influenza. En ciertas modalidades, la solución acuosa que incluye el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza es agregada a los lipidos fundidos.

En todavía otro aspecto, la presente revelación provee métodos para la preparación de composiciones que comprenden un antígeno de hemaglutinina de virus de influenza y vesículas de lípido, en donde las vesículas de lípido consisten de lipidos que incluyen un surfactante no iónico, el método comprende: fundir los lipidos para producir lipidos fundidos; combinar los lipidos fundidos con una solución acuosa que incluye el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza y homogeneizar el producto resultante, en donde los lipidos fundidos y solución acuosa son combinados en cantidades relativas y volúmenes que obtienen una concentración de lípido de por lo menos 10 mg/ml (o cualquiera de los otros intervalos de concentración de lipidos) en el producto resultante. En ciertas modalidades, los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas y volúmenes que obtienen tanto la proporción en peso de lipidos: antígeno deseada (por ejemplo, por lo menos alrededor de 50:1 o cualquiera de los intervalos mencionados anteriormente) como una concentración de lípido de por lo menos alrededor de 10 mg/ml (o cualquiera de los otros intervalos de concentración de lípido) en el producto-resultante. En ciertas modalidades, los lipidos fundidos son agregados a la solución acuosa que incluye el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza. En ciertas modalidades, la solución acuosa que incluye el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza es agregada a los lipidos fundidos.

BREVE DESCRICPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra la estructura química del adyuvante de agonista TLR-4 ejemplar disacárido de hexaacilo fosforilado (sal de amonio) o PHAD (de Avanti Polar Lipids, Inc. de Alabaster, AL) .

La Figura 2 muestra la estructura química de otro adyuvante de agonista de TLR-4 ejemplar di [ 3-desoxi-D-mano-octulosonil] -lípido A (sal de amonio) (de Avanti Polar Lipids, Inc. de Alabaster, AL) .

La Figura 3 muestra la potencia contra el virus H1N1 de una vacuna de influenza con licencia ejemplar en ratones (la dosis abarca una dosis unitaria humana 1/30X estándar, en donde una "dosis unitaria de ratón estándar" de 0. IX de la dosis unitaria humana estándar, esto es una vez que se toman en cuenta las diferencias de tamaño entre humanos y ratones) ya sea formuladas con NISV (Grupo 2) o formulada con NISV (Grupo 3) con el adyuvante de agonista de TLR-4 ejemplar PHAD en comparación con la vacuna de influenza con licencia (dosis equivalente a 0. IX de la dosis unitaria humana estándar en donde una "dosis unitaria de ratón estándar" es 0. IX de la dosis unitaria humana estándar, esto es, una vez que se toman en cuenta las diferencias de tamaño entre humano y ratones) sin formulación a NISV o adyuvante (Grupo 1) como se describe en el Ejemplo 2, Tabla 4.

La Figura 4 muestra la potencia contra el virus H3N2 de una vacuna de influenza con licencia ejemplar en ratones (la dosis abarca una dosis unitaria humana estándar 1/30X) ya sea formulada con NISV (Grupo 2) o no formulada con NISV (Grupo 3) con el adyuvante de agonista de TLR-4 ejemplar PHAD en comparación con la vacuna de influenza con licencia (dosis equivalente a 0. IX de la dosis unitaria humana estándar) sin formulación a NISV o adyuvante (Grupo 1) como se describe en el Ejemplo 2, Tabal 4.

La Figura 5A-5B muestra la respuesta de dosis de potencia contra el virus H1N1 (A) y virus H3N2 (B) de una vacuna de influenza con licencia sin formular (esto es, usada "tal cual") en ratones (dosis equivalente a 0. IX de dosis unitaria humana estándar) versus la vacuna de influenza con licencia formulada con NISV (la dosis abarca una dosis unitaria humana estándar 1/30X) y sin adyuvante o formulada con NISV con cantidades incrementadas (l-50 g) del adyuvante de agonista de TLR- ejemplar PHAD. Todas las composiciones fueron inyectadas a ratones IM y los sueros fueron probados 15 días después de la segunda inmunización. Los resultados son presentados como títulos de HAI contra H1N1 y H3N2 y la (s) media (s) geométrica (s) para el (los) mismo (s) conjunto (s) de datos.

La Figura 6 muestra la potencia contra virus H1N1 y virus H3N2 de una vacuna de influenza con licencia ejemplar en ratones (la dosis abarca una dosis unitaria humana estándar 1/30X) ya sea formulada con NISV o no formulada con NISV con el adyuvante de agonista de TLR-4 ejemplar PHAD en comparación' con la vacuna de influenza con licencia (dosis equivalente a 0. IX de la dosis unitaria humana estándar) sin formulación a NISV o adyuvante como se describe en el Ejemplo 4, Tabla 6. Todas las composiciones fueron almacenadas a 4°C y 40°C por 6 meses y luego inyectadas a ratones IM y los fueron probados 15 días después de la segunda inmunización. Los resultados son presentados como títulos de HAI contra H1N1 o H3N2.

La Figura 7 muestra la potencia contra virus HlNl y virus H3N2 de una vacuna de influenza con licencia ejemplar sin adyuvante en ratones (dosis equivalente a 0.1X de dosis unitaria, humana estándar) formulada con NISV en comparación la vacuna de influencia con licencia (dosis equivalente a 0.1 X de la dosis unitaria humana estándar) como se describe en el Ejemplo 4, Tabla 6. Todas las composiciones fueron almacenadas a 4°C y 40°C por 6 meses y luego inyectadas a ratones IM y los fueron probados 15 días después de la segunda inmunización. Los resultados son presentados como títulos de HAI contra H1N1 o H3N2.

LA Figura 8A-8B muestra datos in vitro del contenido de antígeno de HA para Fluzone® comercial que fue: (A) formulada con NISV o (B) sin NISV como se determina mediante ELISA; T=0, 1 3 y 6 meses almacenada a 4°C, 25°C y 40°C. Ambas composiciones fueron de ahorro de dosis y complementadas con adyuvante con el adyuvante de agonista de TLR-4 PHAD.

La Figura 9 muestra datos in vitro del contenido de antígeno de HA para vacunas de influenza comerciales sin formular Fluzone®, Fluvirin® y FluLaval® versus las mismas vacunas de influenza comerciales formuladas con NISV. Alícuotas de muestras reconstituidas fueron almacenadas mediante ELISA para determinar el contenido de antígeno (o "potencia in vitro") para las composiciones para T=3 meses a 4°C y 40°C.

La Figura 10 muestra la potencia contra el virus H3N2 de una vacuna de influenza con licencia ejemplar (ahorro de dosis a 1/3X de dosis unitaria humana estándar, en donde una "dosis unitaria de mono estándar" es IX de la dosis unitaria humana estándar) en macacos reshus formulada con NISV y con adyuvante con el adyuvante agonista de TLR-4 ejemplar PHAD o formulada con NISV y sin adyuvante en comparación con la vacuna de influenza con licencia (dosis equivalente a IX de la dosis unitaria humana estándar, en donde una "dosis unitaria de mono estándar" es IX de la dosis unitaria humana estándar) sin formulación a NISV o adyuvante.

La Figura 11A-11B muestra el contenido de antigeno de HA in vitro para Fluzone® comercial sin formular (articulo de prueba 8) versus una composición de Fluzone® de NISV de proporción de lipido: antigeno de 300:1 (articulo de prueba 3) , una composición de Fluzone® de NISV de proporción de lipidos: antigeno 100:1 (articulo de prueba 2) y una composición de Fluzone® de NISV de proporción de lipido: antigeno de 30:1 (articulo de prueba 1). Las alícuotas de muestras reconstituidas fueron analizadas mediante ELISA para determinar el contenido de antígeno (o "potencia in vitro") para las cuatro composiciones a (A) T=0 y (B) T=3 meses a 40°C.

La Figura 12A-12B muestra la potencia contra (A) virus H1N1 y (B) H3N2 de varias composiciones de Fluzone® de NISV a varias proporciones de lipido: antígeno, concentraciones de lipido y contenido de lipido como se describe en el Ejemplo 7. Las composiciones a T=0 fueron inyectadas a ratones IM y los sueros fueron probados 15 días después de la segunda inmunización. Los resultados son presentados como títulos de HAI individuales contra H1N1 y H3N2 y la (s) media (s) geométrica (s) para el (los) mismo (s) conjunto (s) de datos.

La Figura 13A-13B muestra la potencia contra (A) virus H1N1 y (B) H3N2 de varias composiciones de Fluzone® de NISV a diferentes proporciones de lipido: antigeno y diferentes concentraciones de lipido (durante la homogeneización y/o reconstitución) Ejemplo 7. Todas las formulaciones fueron almacenadas a 4°C y 40°C por 3 meses y luego inyectada a ratones I y los sueros fueron probados a 15 días después de la segunda inmunización. Los resultados son presentados como la media geométrica de los títulos de HAI contra HlNl y H3N2.

Definiciones En toda la presente revelación, varios términos empleados que son definidos en los siguientes párrafos.

Como se usa en la presente, el término "antigeno" se refiere a una sustancia que contiene uno o más epítopes (ya sea lineales, conformacionales o ambos) que es/son reconocidos por un anticuerpo. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo humano, en algunas modalidades, criado en un organismo humano expuesto al antígeno, en algunas modalidades, en donde tal exposición ocurre por o incluye exposición en la corriente sanguínea. En ciertas modalidades, un antigeno puede ser un "inmunogéno" .

Como se usa en la presente, el término "respuesta inmune" se refiere a una respuesta producida en un animal huésped. Una respuesta inmune se puede referir a inmunidad celular, inmunidad humoral o puede involucrar ambas. Una respuesta inmune puede estar limitada a una parte del sistema inmune. Por ejemplo, en ciertas modalidades, una respuesta de IFNY incrementada es considerada una respuesta inmune. En ciertas modalidades, una respuesta de IgA mucosal (por ejemplo, como es medida en lavados nasales Y/o rectales) es considerada ser una respuesta inmune. En ciertas modalidades, una respuesta de IgG sistémica (por ejemplo, como es medida en suero) es considerada ser una respuesta inmune. En ciertas modalidades, la producción por el animal huésped de anticuerpo que inhiben la hemaglutinacion, por ejemplo, como es medida en un Análisis de Inhibición de Hemaglutinacion (HAI) es considerada ser una respuesta inmune.

Como se usa en la presente, el término "inraunogénico" es usado para referirse a una sustancia que produce una respuesta inmune en un animal huésped contra una entidad no huésped (por ejemplo, un virus de influenza) . En ciertas modalidades, esta respuesta inmune forma la base de la inmunidad protectora producida por una vacuna contra un organismo infeccioso especifico (por ejemplo, un virus de influenza) . En ciertas modalidades, una sustancia inmunogénica producida una respuesta inmune en humanos. En ciertas modalidades, una sustancia inmunogénica produce una respuesta inmune cuando es puesta en contacto con la corriente sanguínea de un cuerpo, por ejemplo de un cuerpo humano .

Como se usa en la presente, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad suficiente para mostrar un beneficio significativo en un sujeto que es tratado, cuando es administrada como parte de un régimen de dosificación terapéutico. Aquellos de habilidad ordinaria en el arte apreciaran que en algunas modalidades se pueden considerar que una composición particular contiene una cantidad terapéuticamente efectiva que contiene una cantidad apropiada para una forma de dosificación unitaria administrada en un régimen de dosificación terapéutico, aunque tal cantidad puede ser insuficiente para obtener el beneficio significativo si es administrada como una sola dosis unitaria. Aquellos de habilidad ordinaria apreciaran además que una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición inmunogénica puede diferir para diferentes sujetos que reciben la composición, por ejemplo dependiendo de factores tales como el punto final biológico deseado, la naturaleza de la composición, la ruta de administración, la salud, tamaño y/o edad del sujeto que es tratado, etc. En algunas modalidades, una cantidad terapéuticamente efectiva es una que ha sido correlacionada con efecto benéfico cuando es administrada como parte de un régimen de dosificación particular (por ejemplo, una sola administración o una serie de administraciones tal como en un régimen de "refuerzo" tradicional) . En algunas modalidades, una cantidad terapéuticamente efectiva es una que ha sido aprobada por un cuerpo de licenciación terapéutico (por ejemplo, la Administración de Alimentos y Medicinas o la Agencia de Medicinas Europea) como parte de un régimen de dosificación terapéutico particular (por ejemplo, véase, los insertos de empaque para varias vacunas de influenza con licencia como se resume por la Administración de Alimentos y Medicinas en www. fd . gov/BiologicsBloodVaccines/Vaccines/ApprovedProducts/ ucml81950. htm para vacunas monovalentes con licencia y www . fda . gov/BiologicsBloodVaccines/Vaccines/ApprovedProducts/ ucm094045. htm para vacunas trivalentes con licencia) .

Como se usa en la presente, el término "tratar" (o "que trata", "tratado", "tratamiento", etc.) se refiere a la administración de las composiciones provistas a un sujeto que está sufriendo de o es susceptible a una enfermedad, un síntoma de una enfermedad o una predisposición hacia una enfermedad, con el propósito de aliviar, reducir, alterar, mejorar, realzar o afectar la enfermedad, un síntoma o síntomas de enfermedad o la predisposición hacia la enfermedad. En ciertas modalidades, el término "que trata" se refiere a la vacunación de un sujeto. En general, el tratamiento puede obtener la reducción de severidad y/o frecuencia de uno o más síntomas o características de la enfermedad y/o puede retardar el inicio de uno o más de tales síntomas o características.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE CIERTAS MODALIDADES Todas las vacunas pierden potencia con el paso del tiempo y la velocidad de pérdida de potencia es dependiente de' la temperatura. Por consiguiente, sistemas de cadena de frió han sido establecidos para asegurar que la potencia de las vacunas sea mantenida al almacenarlas bajo condiciones refrigeradas (en la mayoría de los casos entre 2 y 8°C) hasta el punto de uso. El establecimiento de una cadena de frió para el almacenamiento y distribución de vacunas es una empresa mayor y el mantenimiento es difícil. También es evidente que, a pesar de los mejores esfuerzos, las cadenas de frió no siempre funcionan como se pretende por muchas razones, tales como equipos de refrigeración mantenido inapropiadamente o caduco, escaseces de energía que dan como resultado falla del equipo, cumplimiento deficiente con los procedimientos de cadena de frió y monitoreo inapropiado. El resultado es que las vacunas en la cadena de frió son frecuentemente sometidas a exclusiones de temperatura (esto es, temperaturas fuera del intervalo objetivo) .

Para las vacunas trivalentes de influenza actuales en el mercado que están predominantemente disponibles en una composición liquida, es importante entender la importancia de los requerimientos de cadena de frió y el manejo de vacuna apropiado con el fin de asegurar que los sujetos están recibiendo una vacuna de influenza estable y potente. Si las vacunas de influenza no son mantenidas apropiadamente (por ejemplo, no mantenidas dentro del intervalo de temperatura requerido de 2 a 8°C) , la vacuna se puede volver inestable y esto a su vez tiene un impacto significativo sobre la potencia que puede dar como resultado que el sujeto vacunado no se convierta serológicamente post-inmunización . Se cree que los sujetos vacunados que están protegidos debido a que han sido inmunizados cuando en efecto siguen siendo vulnerables a la infección de influenza debido a que la vacuna no es potente debido a inestabilidad resultante de las exclusiones de temperatura.

La presente revelación provee composiciones y métodos para el tratamiento de influenza que resuelven algunos de estos desafios. Como se describe en la presente, las composiciones y métodos provistos están basados en el desarrollo de ciertas composiciones que incluyen un antigeno de hemaglutinina de virus de influenza en combinación con vesículas de lípido que incluyen un surfactante no iónico (NISV) y opcionalmente un adyuvante. En ciertas modalidades, las composiciones provistas siguen siendo potentes aun cuando no son almacenadas en un sistema de cadena de frió estándar (esto es, son termo estables) .

I . Antigeno de hemaglutinina de virus de influenza En general, las composiciones de la presente revelación incluyen un antigeno de hemaglutinina del virus de influenza. El antigeno de hemaglutinina utilizado de acuerdo con la presente invención no está limitado a antigenos de hemaglutinina tipo silvestre de plena longitud y como se usa en la presente, el término "antigeno de hemaglutinina" también abarca fragmentos inmunogenicos y variantes de antigeno de hemaglutinina tipo silvestre de plena longitud. El término "antigeno de hemaglutinina" también abarca proteínas de fusión y conjugados que incluyen cualquiera de los anteriores. La cantidad de antígeno de hemaglutinina en las composiciones provistas pueden ser determinadas mediante cualquier método conocido en el arte. En algunas modalidades, la cantidad de antígeno de hemaglutinina puede ser determinada mediante un ELISA (por ejemplo, una o más ELISAs especificas del subtipo) . Este procedimiento es usado comúnmente para estandarizar la cantidad de antígeno en vacunas de virus divididas.

No hay restricciones en cuanto al tipo de antígeno de hemaglutinina usado. En particular, el antígeno de hemaglutinina puede ser tomado de una cepa de virus de influenza individual o una combinación de cepas de virus de influenza. Como se describe anteriormente, las vacunas de influenza actuales son usualmente vacunas "trivalentes" que contienen antígenos derivados de dos cepas de virus de influenza A (por ejemplo, H1N1 y H3N2) y una cepa de influenza B. asi, en ciertas modalidades, una composición trivalente de la presente revelación puede incluir antigeno de hemaglutinina de una cepa H1N1 de influenza A, una cepa H3N2 de influenza A y una cepa de influenza B. ciertas composiciones trivalentes pueden comprender cantidades aproximadamente iguales de antigeno de hemaglutinina de cada una de estas cepas.

Vacunas monovalentes son también conocidas en el arte y abarcadas por la presente invención. En algunas modalidades, las composiciones provistas son monovalentes. Las vacunas monovalentes son frecuentemente consideradas particularmente útiles por ejemplo en una situación' pandémica. Una vacuna de influenza pandémica monovalente contendrá más probablemente antigeno de hemaglutinina de una sola cepa A. en algunas modalidades, el antigeno de hemaglutinina para uso en una composición monovalente será derivado de una cepa de influenza pandémica. Por ejemplo, en algunas modalidades, el antigeno de hemaglutinina para uso en una composición monovalente es de una cepa de influenza A (H1N1 de origen porcino) . Como se demuestra , en los ejemplos, las composiciones que incluyen antigeno de hemaglutinina de una cepa H3N2 de influenza A (solo o en combinación con otros antigenos) son de interés particular debido a que los antigenos de esta cepa parecen ser particularmente sensibles a altas temperaturas.

Tampoco hay restricciones en cuanto a la ' fuente de antigeno de hemaglutinina usada (esto es, natural, recombinante, sintética, etc.) - Predominantemente tres tipos de vacunas son usadas mundialmente para proteger contra influenza: vacunas de virus entero, vacunas de virus divido que contienen componentes externos e internos de virus y vacunas de subunidad compuestas solo por componentes externos del virus (hemaglutinina neuraminidasa) .

En ciertas modalidades, las composiciones de la presente invención comprenden uno o más virus enteros que incluyen antigeno de hemaglutinina. En ciertas modalidades, los virus de influenza están desactivados. Se apreciara que cualquier método puede ser usado para preparar un virus de influenza desactivado WO 09/029695 describe métodos ejemplares para producir una vacuna de virus desactivado entero. En general, estos métodos involucraran propagar un virus de influenza en una célula huésped, opcionalmente someter a lisis la 'célula huésped para liberar el virus, aislamiento y luego desactivación del virus. El tratamiento químico (por ejemplo, formalina, formaldehido, entre otros) es usado comúnmente para desactivar virus para preparación de vacuna. Sin embargo, se comprenderá que otras técnicas podrían ser usadas, por ejemplo tratamiento con cloro, exposición a altas temperaturas, etc. En estos tratamientos, el recubrimiento de virion externo es comúnmente dejado intacto mientras que la función replicativa es deteriorada. En ciertas modalidades, los virus de influenza son atenuados. Como es bien conocido en el arte, una ventaja de una vacuna preparada con un virus atenuado radica en el potencial de inmunogenicidad mas alta lo que da como resultado de su habilidad para replicarse in vivo sin provocar una infección plena. Las vacunas de virus vivo que son preparadas a partir de cepas atenuadas preferiblemente carecen de patogenicidad pero todavía son aptas de replicarse en el huésped. Un método que ha sido usado en el arte para preparar virus de influenza atenuados es adaptación viral que involucrar hacer pasar en serie una cepa viral a través de múltiples cultivos celulares. Con el paso del tiempo la cepa muta y cepas atenuadas pueden luego ser identificadas. En ciertas modalidades, el virus se puede hacer pasar a través de diferentes cultivos celulares. En ciertas modalidades, puede probar ser ventajoso efectuar una o más de las etapas de cultivo celular a una temperatura reducida .

En ciertas modalidades, los antígenos de hemaglutinina de virus de influenza utilizados de acuerdo con la presente invención son a base de tecnología de vacuna de virus divido. Las vacunas de virus divididos contienen comúnmente una concentración más alta de las porciones más inmunogénicas del virus (por ejemplo, hemaglutinina y neuraminidasa) , mientras que disminuyen la concentración de proteínas virales menos inmunogénicas también como proteínas no virales presentes de huevos (usados para producir virus) o agentes extraños (por ejemplo, virus de leucocis aviar, otros microorganismos y desechos celulares) . En general, las vacunas de virus divididos son preparadas mediante un proceso físico que involucra someter a disrupción la partícula de virus, comúnmente con un solvente orgánico o un detergente (por ejemplo, Tritón X-100) y separar o purificar las proteínas virales a extensiones variables, tal como mediante centrifugación sobre un gradiente de sacarosa o paso de fluido alantoico sobre una columna cromatográfica . En algunas modalidades, la disrupción y separación de partículas de virus es seguida por diálisis o ultrafiltración. Los métodos de dilución viral también como agentes de dilución apropiados son conocidos en el arte (véase, por ejemplo Publicación de Patente Estadounidense No. 20090155309).

En ciertas modalidades, los antígenos de hemaglutinina de virus de influenza utilizados de acuerdo con la presente invención son a base de tecnología de vacuna de subunidad. En general, las vacunas de subunidad contienen solamente aquellas partes del virus de influenza que son necesarias para la vacunación efectiva (por ejemplo, producir una respuesta inmune protectora) . En algunas modalidades, los antígenos de influenza de subunidad son preparados a partir de partículas de virus (por ejemplo, purificación de componentes particulares del virus) . En algunas modalidades, los _ antigenos de influenza de subunidad son preparados mediante métodos recombinantes (por ejemplo, expresión en cultivo celular) . Por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5,858,368 describe métodos para la preparación de una vacuna de influenza recombinante utilizando tecnología de ADN. La vacuna de influenza trivalente resultante está basada en una mezcla de antígenos de hemaglutinina recombinantes clonados de cepas de virus de influenza que tienen potencial epidémico. Los antígenos de hemaglutinina recombinantes son glicoproteínas sin escindir de plena longitud producidas a partir de vectores de expresión de baculovirus en células de insectos cultivadas y purificadas bajo condiciones no desnaturalizantes. En algunas modalidades, los antígenos de subunidad son generados mediante métodos sintéticos (por ejemplo, síntesis de péptido) . Las vacunas de subunidad pueden también contener antígenos de hemaglutinina purificados preparados de cepas seleccionadas determinadas por la OMS.

En ciertas modalidades, los antígenos de hemaglutinina pueden ser la fuente de una o más vacunas de influenza con licencia. En ciertas modalidades, los antígenos de hemaglutinina (opcionalmente con otros antígenos, por ejemplo antígeno de neuraminidasa) pueden ser purificado de la vacuna de influenza con licencia y luego utilizado en las composiciones provistas. En ciertas modalidades, una vacuna de influenza con licencia puede ser usada "tal cual" sin ninguna purificación. La Tabla 1 es una lista no limitante de vacunas de influenza con licencia. Una plena información de prescripción y detalles concernientes con estas vacunas con licencia se pueden obtener de los insertos de empaque que son provistos con las vacunas mismas de los fabricantes o proveedores y/o de la Administración de Alimentos y Medicinas (por ejemplo, véase www. fda . gov/BiologicsBloodVaccines/Vaccines/ApprovedProducts/ ucml81950. htm para vacunas monovalentes con licencias y www . fda . gov/BiologicsBloodVaccines/Vaccines/ApprovedProducts/ ucm094045. htm para vacunas trivalentes con licencia) . El contenido de estos insertos de empaque es incorporado en la presente por referencia en su totalidad.

Tabla 1 En las siguientes secciones se discuten estos y otros antígenos de influenza ejemplares que podrían ser usados en métodos y composiciones de la presente invención.

Fluzone®, una vacuna de influenza dividida trivalente desactivada, es desarrollada y manufacturada por Sanofi Pasteur Inc. y puede ser usada de acuerdo con la presente revelación. Fluzone®, contiene una suspensión estéril preparada a partir de virus de influenza propagados en huevos de pollo embrionados. Los fluidos que contienen virus son cosechados y descativados con formaldehido . El virus de influenza es concentrado y purificado en una solución de gradiente de densidad de sacarosa lineal utilizando una centrifuga de flujo continuo. Luego, el virus es sometido a disrupcion químicamente utilizando un surfactante no iónico, octoxino-9, (Tritón® X-100) produciendo un antígeno viral dividido. El virus dividido es luego purificado adicionalmente mediante medios químicos y suspendido en solución de cloruro de sodio isotónica de pH regulado con fosfato de sodio. Luego la vacuna Fluzone® es estandarizada de acuerdo con los requerimientos para la influenza estacional y es formulada para contener 45 µg de antígeno de hemaglutinina (HA) por 0.5 mi de dosis unitaria, en la proporción recomendada de 15 g de HA cada uno, representativos de las tres cepas de prototipo (la vacuna 2007-2008 fue preparada con HA de la cepas A/Solomon Islands/2006 (H1N1) , A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) y B/Malasia/2506/2004). Fluzone® es formulada para inyección intramuscular (IM) .

Otro ejemplo de una vacuna de influenza con licencia qué puede ser usada de acuerdo con la presente revelación es Vaxigrip®, que es una vacuna de influenza dividida trivalente desactivada también desarrollada y manufacturada por Sanofi Pasteur, Inc. Vaxigrip® es preparada de manera similar al proceso resumido anteriormente para Fluzone® y es formulada similarmente para inyección intramuscular.

Todavía otro ejemplo de una vacuna de influenza con licencia que puede ser usada de acuerdo con la presente revelación es Flumist®. Flumist® es una vacuna trivalente atenuada viva para administración mediante atomización intranasal. Las cepas . de virus de influenza en Flumist® tienen tres mutaciones genéticas que conducen a un fenotipo de crecimiento restringido por temperatura y atenuado. El efecto acumulativo de las propiedades antigénicas y los virus de influenza modificados genéticamente es que son aptos de replicarse en la nasofaringe para inducir inmunidad protectora. Con el fin de producir Flumist® huevos libres de patógeno específicos (SPF) son inoculados con cada de una de las cepas virales apropiadas e incubados para permitir la replicación de virus de vacuna. El fluido alantonico de estos huevos es cosechado, acumulado y luego clarificado mediante filtración. El virus es concentrado mediante centrifugación y diluido con solución reguladora del pH estabilizante para obtener las concentraciones finales de sacarosa y fosfato de potasio. Las cosechas virales pueden luego ser filtradas estériles para producir los monovalentes globales. Los monovalentes globales de las tres cepas son combinados subsecuentemente y diluidos como se requiera para obtener la potencia deseada con soluciones reguladoras del pH estabilizante para producir la vacuna global trivalente. La vacuna global es luego llevada directamente a atomizadores individuales para administración nasal. Cada atomizador de Flumist® refrigerado pre-lleno contienen una sola dosis unitaria de 0.2 mi. Cada dosis unitaria de 0.2 mi contiene 106"5"7'5 de FFU de surtidos de virus de influenza atenuada viva de cada una de las tres cepas virales apropiadas.

Como se describe anteriormente, varias vacunas de influenza tienen actualmente licencia. Se comprenderá que cualquiera o una combinación de estas vacunas de influenza con licencia pueden ser combinadas con vesículas de lipido como se describe en la presente. Por ejemplo, Fluzone® comercial puede ser combinado de esta manera para producir una composición. En algunas modalidades, las vacunas de influenza con licencia son primero purificadas (por ejemplo, para remover el adyuvante u otros reactivos en la vacuna) . En algunas modalidades, las vacunas de influenza con licencia no son purificadas (esto es, son usadas "tal cual") antes de la formulación con vesículas de lipido como se describe en la presente.

II. Adyuvantes Las composiciones de la presente revelación pueden incluir un adyuvante. Como es bien conocido en el arte, los adyuvantes son agentes que mejoran respuestas inmunes (por ejemplo, véase "Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach", Pharmaceutical Biotechnology, Volumen 6, Eds . Powell and Newman, Plenum Press, Nueva York y Londres, 1995) .

Los receptores semejantes a Toll (TLR) son una familia de homólogos de proteína al receptor Toll de Drosofila, que reconocen patrones moleculares asociados con patógenos y así ayudan al cuerpo a distinguir entre moléculas self y no self. Sustancias comunes en patógenos virales son reconocidas por TLR como patrones moleculares patógeno-asociados . Por ejemplo, sin limitación, se piensa que TLR-4 reconoce patrones en lipopolisacaridos (TLR-4 también ha sido designado como CD284 o grupo de diferenciación 284); mientras que se considera que TLR7/8 reconocen ARN de una sola hebra y moléculas sintéticas pequeñas y se piensa que TLR-9 reconoce ADN bacteriano sin metilar u oligonucleótidos sintéticos. Cuando un TLR es disparado o activado mediante tal reconocimiento de patrón, una serie de eventos de señalización ocurren que conducen a inflamación y activación sobre las respuestas inmunes innatas y adaptables.

En algunas modalidades, las composiciones provistas incluyen un adyuvante de agonista de TLR- . Un número de ligandos sintéticos que contienen los patrones moleculares reconocidos por TLR-4 (agonista de TLR-4) han sido desarrollados como adyuvantes y pueden ser incluidos en las composiciones provistas. Derivados de lipidos A atenuados (ALD) tal como lipido A de monofosforilo (MPL) y 3-deacil-monofosforil lipido A (3D-MPL) son adyuvantes ejemplares que son agonistas para TLR-4. Los ALD son moléculas semejantes a lipido A que han sido alteradas o construidas para reducir o modificar los efectos adversos del lipido A. estos efectos adversos incluyen pirogenicidad, reactividad de Shwarzman local y toxicidad tal como es evaluada en un análisis de dosis mortal al 50% de embrión de pollo (CELD50) . MPL y 3D-MPL son descritos en las Patentes Estadounidenses No. 4,436,727 y 4,912,094, respectivamente. MPL fue derivado originalmente del lipido A, un componente de lipopolisacaridos entero bacterianos (LPS) , un modular de sistema inmune potente pero altamente toxico. Derivados sintéticos ejemplares de MPL son descritos en la Publicación de PCT W095/14926 y también la Publicación de Patente Estadounidense No. 20080131466 y 20090181078. 3D-MPL difiere de MPL en que el residuo de acilo que éster-enlazado a la glucosamina de extremo reductor en posición 3 ha sido removido selectivamente (por ejemplo, véanse Patentes Estadounidenses No. 4,877,611; 4,866,034 y 4,912,094) . Se apreciara que MPL, 3D-MPL y sus derivados, pueden incluir una mezcla de un número de patrones de sustitución de ácido graso, esto es heptaacilo, hexaacilo, pentaacilo, etc., con longitudes de cadena de ácido graso variables. Asi, varias formas de MPL y 3D-MPL incluyendo mezclas de los mismos, son abarcadas por la presente revelación .

.. MPL está disponible de Avanti Polar, Lipids, Inc. de Alabaster, AL como PHAD o disacárido de hexaacilo fosforilado (sal de amonio) . La Figura 1 muestra la estructura química de PHAD. La estructura del di [3-desoxi-D-mano-octulosonil] -lipido A (sal de amonio) otro adyuvante de agonista de TLR4 es mostrado en la Figura 2 (también de Avanti Polar Lipids, Inc. de Alabaster, AL) . En algunas modalidades, estos u otros ALD pueden ser combinados con trehalosadimicolato (TDM) y el esqueleto de pared celular (CWS) , por ejemplo en una emulsión de escualeno/Tween™ 80 al 2% (por ejemplo, véase Patente GB No. 2122204) .

Aquellos experimentados en el arte son aptos de identificar otros adyuvantes de agonista de TLR-4 apropiados. Por ejemplo, los fosfatos de alquil glucosanimida (AGP) tales como aquellos revelados en la Publicación de PCT WO 98/50399 o Patente Estadounidense No, 6,303,347 y 6,764,840 pueden ser usados. Otros agonistas de TLR-4 apropiados son descritos en la Publicación de PCT WO o3/011223 y WO 03/099195 (por ejemplo, compuestos I-III revelados en las paginas 4-5 de WO 03/011223 o en las paginas 3-4 de WO 03/099195 y en particular aquellos compuestos revelados en WO 03/011223 como ER803022, ER803058, ER803732, ER804053, ER804057, ER804058, ER804059, ER804442, ER804680 y ER804764) .

En algunas modalidades, las composiciones provistas incluyen entre alrededor 1 y 50 µg de un adyuvante de agonista de TLR-4. En ciertas modalidades, las composiciones provistas incluyen entre alrededor de 1-40, 1-30, 1-20, 1-10 o 1-5 µ de un adyuvante de agonista de TLR-4. En ciertas modalidades, las composiciones provistas incluyen entre alrededor de 10-40, 10-30 o 10-20 µq de un adyuvante de agonista de TLR . En ciertas modalidades, las composiciones provistas incluyen entre alrededor de 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9 o 1-10 µg de un adyuvante de agonista de TLR-4.

En ciertas modalidades, las composiciones provistas incluyen entre alrededor de 5-20, 5-18, 5-16, 5-12, 5-10, 5-9, 5-8 o 5-7 \iq de un adyuvante de agonista de TLR-4.

En algunas modalidades, las composiciones provistas incluyen un a adyuvante de agonista de TLR-7/8. Un número de ligandos sintéticos que contienen los patrones moleculares reconocidos por TLR-7/8 (agonista de TLR-7/8) han sido desarrollados como adyuvantes y pueden ser incluidos en las composiciones provistas. Ligandos de TLR-7/8 ejemplares incluyen pero no están limitados a CL075 (un derivado de tiazoloquinilonoa) CL097 (un compuesto de imidazoquinolina altamente soluble en agua) y R848 (un compuesto de imidazoquinolina sintético de bajo peso molecular) , cada uno de los cuales está disponible de InvivoGen San Diego, CA. En algunos casos, poli (dT) , un homopolimero de timidina de olidodesoxinucleotido de fosforotioato puede ser usado en combinación con imidazoquinolina para incrementar la señalización moderada por TLR-8 y/o para disminuir la señalización moderada por TLR-7 (por ejemplo, véase Jurk et al., Eur J Immunol, 36 (7 ) : 1815-26, 2006) . Aquellos experimentados en el arte son aptos de identificar cantidades apropiadas y/o derivados de adyuvantes de TLR-7/8 para uso de acuerdo con la presente invención.

En algunas modalidades, las composiciones provistas incluyen un adyuvante de agonista de TLR-9. En general, el ADN bacteriano es rico en 2 ' -desoxirivo (citidina-fosfatoguanosina) (CpG) di nucleótidos. sin metilar, en contraste con el ADN mamífero, que contiene comúnmente una baja frecuencia de di nucleótidos de CpG que están en su mayoría metilados. Los CpG sin metilar en contexto de base particulares, llamados porciones de CpG han mostrado activar el sistema inmune vía TLR-9. En algunos casos, el reconocimiento de TLR-9 del ADN de CpG conduce a la producción de citoquinas pros inflamatorias (por ejemplo, IL-6, IL-12) . Las porciones de CpG pueden contener una secuencia de núcleo conservada que conduce a altos niveles de estimulación de un TLR-9 en una especie particular. Por ejemplo, GACGTT ha mostrado estimular, altamente TLR-9 de ratón, mientras que las porciones de CpG que contienen más de un CpG y la secuencia de núcleo GTCGTT han mostrado estimular TLR-9 humano. Un número de ligandos sintéticos que contienen los patrones moleculares reconocidos por TLR-9 (agonistas de TLR-9) han sido desarrollados como adyuvantes y pueden ser incluidos en las composiciones provistas. Aquellos experimentados en el arte son aptos de identificar cantidades apropiadas y/o derivados de adyuvantes del agonista de TLR-9 para uso de acuerdo con la presente invención.

En ciertas modalidades, por lo menos una . porción de adyuvante está asociada con vesículas de lípido. En ciertas modalidades, por lo menos una porción de adyuvante no está asociado con vesícula de lípidos. En ciertas modalidades, el adyuvante es co-fundido con lípidos durante la preparación de las composiciones provistas. En ciertas modalidades, el adyuvante es combinado con lípidos fundidos y la solución acuosa que incluye el antígeno de hemaglutinina del virus de influenza durante la preparación de las composiciones provistas (por ejemplo, al mezclar con la solución acuosa que incluye el antígeno de hemaglutinina de virus de influenza antes de que sea combinada con los lípidos fundidos) . En ciertas modalidades, el adyuvante es agregado antes del secado (por ejemplo, liofilización de las composiciones provistas) .

III . Vesículas de lipido En general, las composiciones de la presente revelación incluyen vesículas de lípido que consisten de lípido que incluyen un surfactante no iónico. Tales vesículas de lípido son también denominadas, como "vesículas de surfactante no iónico" o "NISV" en la presente. Como es bien conocido en el arte, las vesículas en general tienen un compartimiento acuoso encerrado por una o más bicapas de lípido.

Surfactante no iónico Cualquier surfactante no iónico con propiedades antipáticas apropiadas puede ser usado para formar vesículas de acuerdo con la presente invención. Sin limitación, ejemplos de surfactantes apropiados incluyen surfactantes éster-enlazados a base de glicerol. Tales esteres de glicerol pueden comprender uno de dos grupos acilo alifáticos superiores, por ejemplo que contienen por lo menos átomos de carbono en cada porción acilo. Los surfactantes a base de tales esteres de glicerol pueden comprender más de una unidad de glicerol, por ejemplo hasta 5 unidades de glicerol. Mono ésteres de glicerol pueden ser usados, por ejemplo aquellos que contienen una porción de C12-C20 alcanoil o alquenoil, por ejemplo caproil, lauroil, miristoil, palmitoil, oleil o estearoil. Un surfactante éster-enlazado ejemplar es 1-monopalmitoil glicerol.

Alternativa o adicionalmente, surfactantes éter-enlazados pueden ser usados como o incluidos como un surfactante no iónico de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, surfactantes éter-enlazados a base dé glicerol o un glicol que tienen glicol alifático inferior de hasta de 4 átomos de carbono, tal como etilenglicol son apropiados. Los surfactantes a base de tales glicoles pueden comprender más de una unidad de glicol, por ejemplo hasta 5 unidades de glicol (por ejemplo, diglicolcetil éter y/o polioxietilen-3-lauril ' éter) . Mono éter de glicol o glicerol pueden ser usados incluyendo aquellos que contienen una porción de Ci2-C20 alcanil o alquenil, por ejemplo capril, lauril, miristil, cetil, oleil o estearil. Productos de condensación de óxido de etileno que pueden ser usados incluyen aquellas revelaciones en la Publicación de PCT WO 88/06882 (por ejemplo, un éter alifático superior de polioxietileno y surfactantes de amina) . Surfactantes éter-enlazados ejemplares incluyen 1-monocetil glicerol éter y diglicolcetil éter .

Anfifílico iónico Se comprenderá que los lipidos usados para fabricar las vesículas de lípido para uso de acuerdo con la presente invención pueden incorporar un anfifílico iónico, por ejemplo de tal manera que las vesículas toman una carga negativa. Por ejemplo, esto puede ayudar a estabilizar vesículas y proveer dispersión efectiva.

Sin limitación, materiales ácidos tales como ácidos alcanoicos y alquenoicos superiores (por ejemplo, acido palmítico, ácido oleico) u otros compuestos que contienen grupos ácidos incluyendo fosfatos tales como fosfatos de dialquilo (por ejemplo, dicetilfosfato o ácido fosfatidico o fosfatidil serina) y mono ésteres de sulfato tales como alquil sulfato superiores (por ejemplo, cetilsulfato) , pueden todos ser usados para este propósito. El anfifílico, si este presente, comprenderá entre 1 y 50% del peso en surfactante no iónico (por ejemplo, 1-5%, 1-10%, 1-15%, 1-20%, 1-25%, 1- 30%, 1-35%, 1-40%, 1-45%, 5-5%, 5-10%, 5-15%, 5-20%, 5-25%, 5- 30%, 5-350%, 5-40%, 5-45%, 5-50%, 10-15%, 10-20%, 10-25%, 10- 30%, 10-350%, 10-40%, 10-45%, 10-50% 15-20%, 15-25%, 15-30%, 15-35%, 15-40%, 15-45%, 15-50%, 20-25%, 20-30%, 20-35%, 20- 40%, 20-45%, 20-50%, 25-30, 25-35%, 25-40%, 25-45%, 25-50%, 30-35%, 30-40%, 30-45%, 30-50%, 35-40%, 35-45%, 35-50%, 40- 45%, 40-50% o 45-50%) .

Material hidrofobico Para formar vesículas de acuerdo con la presente invención, los lipidos pueden también incorporar un material hidrofobico apropiado de masa molecular más alta apto de ¦ formar una bicapa (tal como un esteroide, por ejemplo un esterol tal como colesterol) . La presencia¦ de tal material hidrofobico de masa molecular más alta apto de formar una bicapa (tal como un esteroide, por ejemplo un esterol tal como colesterol) ayuda en la formación de la bicapa sobre la cual dependen las propiedades físicas de la vesícula. El material, si está presente, comprenderá comúnmente entre 20 y 120% en peso de surfactante no iónico (por ejemplo, 20-30%, 20-40%, 20-50%, 20-60%, 20-70%, 20-80%, 20-90%, 20-100%, 30- 40%, 30-50%, 30-60%, 30-70%, 30-80%, 30-90%, 30-100%, 30- 110%, 30-120%, 40-50%, 40-60%, 40-70%, 40-80%,. 40-90%, 40- 100%, 40-110%, 40-120%, 50-60%, 50-70%, 50-80%, 50-90%, 50-100%, 50-110%, 50-120%, 60-70%, 60-80%, 60-90%, 60-100%, 60-110%, 60-120%, 70-80%, 70-90%, 70-100%, 70-110%, 70-120%, .80-90%, 80-100%, 80-110%, 80-120%, 90-100%, 90-110%, 90-120%, 100-110%, 100-120% o 110-120%).

Vesículas de lipido ejemplares En ciertas modalidades, las vesículas de lipido para uso de acuerdo con la presente invención comprenden un surfactante no iónico, un anfifílico iónico y un esteroide. En ciertas modalidades, las vesículas de lipido comprenden 1-monopalmitoil glicerol, dicetilfosfato y colesterol.

En ciertas modalidades, las vesículas de lipido para uso de acuerdo con la presente invención consisten esencialmente de un surfactante no iónico, un anfifílico iónico y un esteroide. En ciertas modalidades, las vesículas de lipido consisten esencialmente de 1-monopalmitoil glicerol, dicetilfosfato y colesterol.

En ciertas modalidades, las vesículas de lipido para uso de acuerdo con la presente invención no comprenden o están sustancialmente libres de una molécula mejoradora del transporte. En algunas modalidades, las vesículas de lipido para uso de acuerdo con la presente invención no comprenden o están sustancialmente libres de "acido biliar" tal como ácido cólico y ácido quenodesoxicolico, sus productos de conjugación con glicina o taurina tal como ácido glicocolico y ácido tauro cólico, derivados incluyendo ácidos desoxicolico y ácido ursodesoxicolico y tales de cada uno de estos ácidos. En algunas modalidades, las vesículas de lipido para uso de acuerdo con la presente invención no comprenden o están sustancialmente libres de aminoácidos aciloxilados tales como acilcarnitinas y sales de las mismas y palmitoil carnitinas.

Proporción en peso de lipido: antígeno La presente invención provee el hallazgo sorprendente que tanto la inmunogenicidad como la termo estabilidad de las composiciones provistas son controladas por lo menos en parte por las cantidades relativas del lipido y antígeno de hemaglutinina presente en las composiciones.

Por ejemplo, por medio de experimentación, se encontró que las composiciones con alto contenido de lipido (por ejemplo, una proporción en peso de lipido: antígeno de alrededor de 450:1) son bastante menos inmunogénicas que las composiciones con un contenido de lipido ligeramente más bajo (por ejemplo, una proporción en peso de lipido: antígeno de alrededor de 300:1). Mientras que las composiciones con un contenido de lipido más bajo son en general más inmunogénicas, también se encontró que son menos termoestables (por ejemplo, a una proporción en peso de lipido: antígeno de alrededor de 30:1 se observó muy poca termo estabilidad) . A la luz de estos hallazgos experimentales (discutidos en más detalle en los ejemplos) todos ahora aptos de definir y proveer nuevos conjuntos de composiciones que son tanto inmunogénicas como termoestables . En ciertas modalidades, las composiciones provistas tienen una proporción en peso de lipido: antigeno de por lo menos alrededor de 50:1, 60:1, .70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 110:1, 120:1, 130:1, 140:1, 150:1, 160:1, 170:1, 180:1, 190:1, 200:1, 210:1, 220:1, 230:1, 240:1',· 250:1, 260:1, 270:1, 280:1, 290:1, 300:1. En ciertas modalidades, las composiciones provistas tienen una proporción en peso de lipido: antigeno de por lo menos alrededor de 400:1, 390:1, 380:1, 370:1, 360:1, 350:1, 340:1, 330:1, 320:1 o 310:1. En ciertas modalidades, la proporción en peso de lipido: antigeno está dentro de un intervalo de alrededor de 60:1 a alrededor de 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 110:1, 120:1, 130:1, 140:1, 150:1, 160:1, 170:1, 180:1, 190:1, 200:1, 210:1, 220:1, 230:1, 240:1, 250:1, 260:1, 270:1, 280:1, 290:1, 300:1, 310:1, 320:1, 330:1, 340:1, 350:1, 360:1, 370:1, 380:1, 390:1, 400:1. En ciertas modalidades, la proporción en peso de lipido: antigeno está dentro de un intervalo de alrededor de 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 110:1, 120:1, 130:1, 140:1, 150:1, 160:1, 170:1, 180:1, 190:1, 200:1, 210:1, 220:1, 230:1, 240:1, 250:1, 260:1, 270:1, 280:1, 290:1, 300:1, 310:1, 320:1, 330:1, 340:1, 350:1, 360:1, 370:1, 380:1 o 390:1 a alrededor de 400:1. En ciertas modalidades, la proporción en peso de lipido: antigeno está dentro de un intervalo de alrededor de 50:1 a alrededor de 100:1, alrededor de 50:1 a alrededor de 150:1, alrededor de 50:1 a alrededor de 200:1, alrededor de 50:1 a alrededor de 250:1, alrededor de 50:1 a alrededor de 300:1, alrededor de 50:1 a alrededor de 350:1 o alrededor de 50:1 a alrededor de 400:1. En ciertas modalidades, la proporción en peso de lipido: antigeno está dentro de un intervalo de alrededor de 100:1 a alrededor de 150:1, alrededor de 100:1 a alrededor de 200:1, alrededor de 100:1 a alrededor de 250:1, alrededor de 100:1 a alrededor de 300:1, alrededor de 100:1 a alrededor de 350:1 o alrededor de 100:1 a alrededor de 400:1. En ciertas modalidades, la proporción en peso de lipido: antigeno está dentro de un intervalo de alrededor de 150:1 a alrededor de 200:1, alrededor de 150:1 a alrededor de 250:1, alrededor de 150:1 a alrededor de 300:1, alrededor de 150:1 a alrededor de 350:1 o alrededor de 150:1 a alrededor de 400:1. En ciertas modalidades, la proporción en peso de lipido: antigeno está dentro de un intervalo de alrededor de. 200:1 a alrededor de 250:1, alrededor de 200:1 a alrededor de 300:1, alrededor de 200:1 a alrededor de 350:1 o alrededor de 200:1 a alrededor de 4000:1. En ciertas modalidades, la proporción en peso de lipido: antigeno está dentro de un intervalo de alrededor de 250:1 a alrededor de 300:1, alrededor de 250:1 a alrededor de 350:1 o alrededor de 250:1 a alrededor de 400:1. En ciertas modalidades, la proporción en peso de lipido: antigeno está dentro de un intervalo de alrededor de 300:1 a alrededor de 350:1 o alrededor de 300:1 a alrededor de 400:1. En ciertas modalidades, la proporción en peso de lipido: antigeno está dentro de un intervalo de alrededor de 350:1 a alrededor de 400:1. En ciertas modalidades, la proporción en peso de lipido: antigeno esta de alrededor de 200:1, 210:1, 220:1, 230:1, 240:1, 250:1, 260:1, 270:1, 280:1, 290:1, 300:1, 310:1, 320:1, 330:1, 340:1, 350:1, 360:1, 370:1, 380:1, 390:1 o 400:1.

Métodos de fabricación de vesículas de lípidos Varias técnicas son conocidas para preparar las vesículas de lipido que comprenden surfactantes no iónicos, tales como aquellas referidas en la Publicación de PCT WO 93/19781. Una técnica ejemplar es el método de evaporación de película giratoria, en el cual una película del surfactante no iónico (y cualesquier otros lípidos componentes) es preparadas mediante evaporación giratoria de un solvente orgánico, por ejemplo un hidrocarburo o solvente de hidrocarburo clorado tal como cloroformo, por ejemplo véase Russell y Alexander, J. Immunol, 140:1274, 1988. La película delgada resultante es luego rehidratada en solución reguladora del pH acuosa.

Otro método para la producción de vesículas de lipido es aquel revelado por Collins et al., J. Pharm, Pharmacol, 42:53, 1990. Este método involucra fundir el surfactante no iónico (y cualquier otros lípidos componentes) e hidratación con mezcla vigorosa en presencia de solución reguladora del pH acuosa.

Otro método involucra hidratación de lípidos en presencia de fuerzas cortantes. Aparatos que pueden ser usados para aplicar tales fuerzas cortantes son bien conocidos (por ejemplo, véase Publicación de PCT No. WO 88/06882) . La sonificación y ultra sonificación fue también medios efectivos para formar vesículas de lípidos para alterar su tamaño.

En ciertas modalidades, por lo menos una porción de antígeno de hemaglutinina está asociada con vesículas de lipido (en donde, como se usa en la presente, el término "asociación" abarca cualquier forma de interacción física) . En ciertas modalidades, por lo menos una porción del antígeno de hemaglutinina es atrapado dentro de las vesículas de lipido. La asociación y atrapamiento pueden ser obtenidas de cualquier manera. Por ejemplo, en la técnica de evaporación de película giratoria, la película puede ser hidratada en presencia de antígeno (opcionalmente junto con un adyuvante) . En otros métodos, se puede usar un método de deshidratación-rehidratación en el cual el antígeno en una fase acuosa es combinado con vesículas de lípido pre-formadas y sometido a congelación instantánea seguido por liofilización, por ejemplo véase, Kirby y Gregoriadis, Biotechnology 2:979, 1984. Alternativa o adicionalmente, se puede usar una técnica de congelación-de hielo en el cual las vesículas pre-formadas son mezcladas con el antígeno y repetidamente congeladas instantáneamente en nitrógeno líquido y calentadas a una temperatura por encima de la temperatura de transición de los lípidos relevantes, por ejemplo véase Pick, Arch. Biochem. Biophys. 212:195, 1981. Además del antígeno de asociación, e método de deshidratación-rehidratación y la técnica de congelación-de hielo son también aptas de asociar concomitantemente un adyuvante con vesículas de lípido.

En ciertas modalidades, las vesículas de lípido para uso de acuerdo con la presente invención son preparadas mediante un método que incluye: fundir los lípidos componentes para producir lípidos fundidos; combinar los lípidos fundidos con una solución acuosa que incluye antígeno de hemaglutinina 4y homogeneizar el producto resultante. En ciertas modalidades, los lípidos fundidos son agregados a la solución acuosa que incluye el antígeno de hemaglutinina. En ciertas modalidades, la solución acuosa que incluye el antígeno de hemaglutinina es agregada a los lípidos fundidos.

En ciertas modalidades, los lípidos fundidos y solución acuosa son combinados en cantidades relativas y volúmenes que obtienen una concentración de lípido de por lo menos alrededor de 10 mg/ml en el producto resultante. Por supuesto, por medio de experimentación y como se describe en los ejemplos, se ha encontrado que cuando los lípidos y antígeno son homogeneizados con una concentración de lípido en exceso de 10 mg/ml, las composiciones resultantes tienden a ser más termoestables que cuando se usa una concentración de lípido más baja (véanse Ejemplos) . En algunas modalidades, por consiguiente la presente invención provee composiciones deseables (que incluyen específicamente composiciones termoestables) que comprenden antígeno y vesículas de lípido, tales composiciones contienen una concentración de lipido especificada establecida en la presente para impartir características particulares (por ejemplo, termo estabilidad mejorada) a las composiciones.

En ciertas modalidades, se obtiene una concentración de lípido de por lo menos alrededor de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o 95 mg/ml. En ciertas modalidades, la concentración de lípido está en un intervalo de alrededor de 10 mg/ml a alrededor de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 mg/ml. En ciertas modalidades, la concentración de lípido está en un intervalo de alrededor de 10, 15, 20, 25, 30, 35, .40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o 95 mg/ml a alrededor de 100 mg/ml. En ciertas modalidades, la concentración de lípido está en un intervalo de alrededor de 25 mg/ml a alrededor de 100 mg/ml, alrededor de 25 mg/ml a alrededor de 75 mg/ml,, alrededor de 25 mg/ml a alrededor de 50 mg/ml, alrededor de 50 mg/ml a alrededor de 75 mg/ml o alrededor de 50 mg/ml a alrededor de 100 mg/ml.

En ciertas modalidades, los lipidos fundidos y solución acuosa son combinados en cantidades relativas y volúmenes que obtienen tanto la proporción en peso de lipido: antigeno deseada (por ejemplo, por lo menos alrededor de 50:1 o cualquiera de' los intervalos de proporción en peso de lipidos: antigeno mencionados anteriormente que fueron citados anteriormente) como una concentración de lipidos de por lo menos alrededor de 10 mg/ml (o cualquiera de los otros intervalos de concentración de lipidos citados anteriormente) en el producto resultante.

En ciertas modalidades, un adyuvante es co-fundido con lipidos durante la preparación de las composiciones provistas. En ciertas modalidades, un adyuvante es combinado con lipidos fundidos y la solución acuosa que incluye el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza durante la preparación de las composiciones provistas (por ejemplo, al mezclar con la solución acuosa que incluye el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza antes de que sea combinada con los lipidos fundidos) . En ciertas modalidades, un adyuvante es agregado antes del secado (por ejemplo, liofilización) de las composiciones provistas.

En algunas modalidades, el surfactante no iónico (opcionalmente con otros componentes de lipido) es fundido a un intervalo de temperatura de entre 120°C y 150°C (por ejemplo, entre 120°C Y 125°c, 120°C y 130°C, 120°C y 140°C, 130°C y 140°C, entre 135°C y 145°C o entre 140°C y 145°C) . En algunas modalidades, el surfactante no iónico (opcionalmente con otros componentes de lipido) es fundido a alrededor de 120°C, a alrededor de 125°C, a alrededor de 130°C, a alrededor de 135°C, a alrededor de 140°C, a alrededor de 145°C, a alrededor de 150°C. En algunas modalidades, la solución acuosa que comprende el antigeno de hemaglutinina es de temperatura controlada. En algunas modalidades, la solución acuosa que contiene el antigerio de hemaglutinina es mantenida a una temperatura de menos de alrededor de 50°C durante la etapa de adición (por ejemplo, menos de alrededor de 45°C, menos de alrededor de 40°C, menos de alrededor de 35°C, menos de alrededor de 30°C, menos de alrededor de 25°C, etc.) . En algunas modalidades, la solución acuosa que comprende antigeno de hemaglutinina es mantenida a un intervalo de alrededor de entre 25°C y alrededor de 50°C. En algunas ' modalidades, la solución acuosa que comprende antigeno de hemaglutinina es mantenida a temperatura ambiente .

En ciertas modalidades, las vesículas son fabricadas mediante un proceso que incluye las etapas de proveer los componentes de lípido en forma seca (por ejemplo, liofilizada) y rehidratar el material seco con una solución acuosa que comprende antígeno de hemaglutinina . El material seco puede ser preparado por ejemplo al fundir los componentes de lípido y luego liofilizar el producto fundido.

Como se describe en más detalle posteriormente en la presente, en algunas modalidades, las composiciones provistas pueden ser secadas (por ejemplo, liofilizadas) antes del almacenamiento y subsecuentemente hidratadas antes del uso.

Tamaño de vesícula y procesamiento Las composiciones provistas incluirán comúnmente una mezcla de vesículas de lípido con un intervalo de tamaños. En algunas modalidades, >90% de las vesículas tendrán un diámetro que cae entre 50% del valor más frecuente (por ejemplo, 1000 ± 500 nm) . En algunas modalidades, la distribución puede ser más estrecha, por ejemplo >90% de las vesículas pueden tener un diámetro que cae en 40, 30, 20, 10 o 5% del valor más frecuente. En algunas modalidades, se puede usar sonificación o ultra-sonificación para facilitar la formación de vesículas y/o alterar el tamaño de vesícula. En algunas modalidades, se pueden usar filtración, diálisis y/o centrifugación para ajustar la distribución del tamaño de vesícula.

En general, las vesículas de lípido producidas de acuerdo con la presente invención pueden ser de cualquier tamaño. En ciertas modalidades, las composiciones provistas pueden incluir vesículas en donde el diámetro más frecuente está en el intervalo de alrededor de 0. 1 µp? a alrededor de 10 µp?, por ejemplo, de alrededor de 0.1 µ?? a alrededor de 5 µ?t?, de alrededor de 0.5 µp\ a alrededor de 2 o alrededor de 0.8 µ? a alrededor de 1.5 µp?. en ciertas modalidades, el diámetro más frecuente puede ser mayor de 10 µ?t?, por ejemplo en el intervalo de alrededor de 10 µt a alrededor de 20 µp? a alrededor de 15 µp? a alrededor de 25 µp?. en ciertas modalidades, el diámetro más frecuente puede estar en el intervalo de alrededor de 0.1 µp\ a alrededor de 20 µp?, alrededor de 0.1 a alrededor de 15 µp?, alrededor de 0.1 µp? a alrededor de 10 µp\, alrededor de 0.5 µp? a alrededor de 20 µp?, alrededor de 0.5 µp\ a alrededor de 15 µp?, alrededor de 0.5 µp\ a alrededor de 10 µp?, alrededor de 1 µ? a alrededor de 20 µp\, alrededor de 1 µp? a alrededor de 15 µp? o alrededor de 1 µp? a alrededor de 10 pm.

Liofilización Las composiciones liquidas de vacunas que han tenido la presentación predeterminada desde la introducción de vacunas. La mayoría de las vacunas liquidas existentes han sido desarrolladas para almacenamiento bajo refrigeración, pero no a altas temperaturas, con el resultado de que su estabilidad no puede ser óptima. Todas las vacunas de influenza con licencia son formuladas actualmente y almacenadas como líquidos. En el medio ambiente acuoso, los antígenos de influenza son sometidos a degradación física y química que pueden conducir a desactivación y pérdida de potencia.

Como se discute anteriormente, en ciertas modalidades se proveen composiciones secas (por ejemplo, liofilizadas ) . En algunas modalidades, los métodos de la presente revelación incluyen una etapa de secado (por ejemplo, liofilización) .

En general, la liofilización involucra congelar la preparación en cuestión y luego reducir la presión de los alrededores (y opcionalmente calentar la preparación) para permitir que el (los) solvente (s) congelado (s) se sublime (n) directamente de fase solida a gas (esto es, fase de secado) . La fase de secado puede ser dividida en fases de secado primarias y secundarias.

La fase de congelación se puede hacer al colocar la preparación en un recipiente (por ejemplo, un matraz, tubo de Eppendorf, etc.) y opcionalmente hacer girar el recipiente en un baño que es enfriado mediante refrigeración mecánica (por ejemplo, utilizando hielo seco y metanol, nitrógeno líquido, etc.). En algunas modalidades, la etapa de congelación involucra enfriar la preparación a una temperatura que está debajo del punto . eutéctico de la preparación. Puesto que el punto eutéctico se presenta a la temperatura más baja en donde la fase sólida y fase liquida de la preparación pueden coexistir, el mantenimiento del material a una temperatura de bajo de este punto asegura que la sublimación en lugar de la evaporación se presentara en las etapas subsecuentes.

La fase de secado (o la fase de secado primaria cuando se usan dos fases de secado) involucrar reducir la temperatura y opcionalmente calentar la preparación en un punto donde el (los) solvente (s) puede (n) sublimar. Esta fase de secado remueve comúnmente la mayoría del (los) solvente (s) de la preparación. Las fases de congelación y secado no son necesariamente fases distintas sino que pueden ser combinadas de cualquier manera. Por ejemplo, en ciertas modalidades, las fases de congelación y secado se pueden traslapar.

Una fase de secado secundaria puede opcionalmente ser usada para remover el (los) solvente (s) residual (es) que fue (ron) absorbido (s) durante la fase de congelación. Una vez que la fase de secado está completa, se puede romper el vacío con un gas inerte (por ejemplo, nitrógeno o helio) antes de que el producto de líquido liofilizado sea opcionalmente sellado.

Excipientes tales como sacarosa, aminoácidos o proteínas tales como gelatina o albúmina de suero pueden ser usados para proteger el antígeno durante el proceso de secado ? y almacenamiento. En algunas modalidades, se puede usar un lio protector. En algunas modalidades, se puede agregar adyuvante con el lio protector. Lio protectores ejemplares incluyen sacarosa, trehalosa, polietilenglicol (PEG) , solución reguladora del pH de dimetil-succinato (DMS) , albúmina de suero bovino (BSA) , manitol y dextrana.

La presente revelación establece que ciertas modalidades preferidas de las composiciones provistas son aquellas con un contenido de humedad particularmente bajo (menos de alrededor de 2% en peso). Por medio de experimentación (como se describe en más detalle en los ejemplos), se ha determinado que las composiciones secas (por ejemplo, liofilizadas) con un contenido de lipido más alto tienden a tener un contenido de humedad residual más bajo (por ejemplo, menos de alrededor de 2% en peso) . Como se indica anteriormente, las composiciones con un contenido de lipido más alto tienden a ser más termos estables. Sin desear estar limitados a alguna teoría, se tiene la hipótesis de que algunas o todas las propiedades termoestables de las composiciones de contenido de lipido más alto podrían ser impulsadas en parte por su contenido de humedad residual más bajo. Por consiguiente, en ciertas modalidades, las composiciones de la presente revelación son definidas y provistas con un bajo contenido de humedad (por ejemplo, menos de alrededor.de 2% en peso). En ciertas modalidades, las composiciones provistas tienen una proporción en peso de lipido: antigeno de por lo menos alrededor de 50:1 (o cualquiera de los intervalos de proporción en peso de lipidos: antigeno mencionados anteriormente . que fueron citados anteriormente) . En ciertas modalidades, ciertas composiciones pueden tener una proporción en peso de lipido: antigeno más baja (por ejemplo, por lo menos alrededor de 40:1 o 30:1). En base a los resultados del contenido de humedad, estas composiciones de contenido de lipido más bajo pueden requerir etapas de secado más extensas durante el proceso de liofilización.

En ciertas modalidades, el contenido de humedad de las composiciones provistas es menor de alrededor de 1.9%, 1.8%, 1.7%, 1.6%, 1.5%, 1.4%, 1.3%, 1.2%, 1.1%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5% o 0.4% en peso. En ciertas modalidades, el contenido de humedad de las composiciones provistas está en el intervalo de alrededor de 0.4% a alrededor de -2% en peso. En ciertas modalidades, el contenido de humedad de las composiciones provistas está en el intervalo de alrededor de 0.5% a alrededor de 1.9% en peso. En ciertas modalidades, el contenido de humedad de las composiciones provistas está en el intervalo de alrededor de 0.6% a alrededor de 1.8% en peso. En ciertas modalidades, el contenido de humedad de las composiciones provistas está en el intervalo de alrededor de 0.7% a alrededor de 1.7% en peso. En ciertas modalidades, el contenido de humedad de las composiciones provistas está en el intervalo de alrededor de 0.8% a alrededor de 1.6% en peso. En ciertas modalidades, el contenido de humedad de las composiciones provistas está en el intervalo de alrededor de 0.9% a alrededor de 1.5% en peso. En ciertas modalidades, el contenido de humedad de las composiciones provistas está en el intervalo de alrededor de 1% a alrededor de 1.4% en peso. En ciertas modalidades, el contenido de humedad de las composiciones provistas está en el intervalo de alrededor de 0.5% a alrededor de 1% en peso. En ciertas modalidades, el contenido de humedad de las composiciones provistas está en el intervalo de alrededor de 0.5% a alrededor de 1.5% en peso. En ciertas modalidades, el contenido de humedad de las composiciones provistas está en el intervalo de alrededor de 0.5% a alrededor de 2% en peso. En ciertas modalidades, el contenido de humedad de las composiciones provistas está en el intervalo de alrededor de 1% a alrededor de 1.5% en peso. En ciertas modalidades, el contenido de humedad de las composiciones provistas está en el intervalo de alrededor de 1% a alrededor de 2% en peso. En ciertas modalidades, el contenido de humedad de las composiciones provistas está en el intervalo de alrededor de 1.5% a alrededor de 2% en peso.

Rehidratación de composiciones secas Las composiciones secas (por ejemplo, liofilizadas) son rehidratadas antes de la administración a un sujeto en necesidad de las mismas. En algunas modalidades, tal rehidratación es obtenida al mezclar la composición seca (por ejemplo, liofilizada) con una solución acuosa. En algunas modalidades, la solución acuosa incluye una solución reguladora del pH. Por ejemplo, sin limitación, una solución reguladora del pH de PCB, una solución reguladora del pH de a2HP04/ aH2P04, una solución reguladora del pH de PBS, una solución reguladora del pH de bicina, una solución reguladora del pH de Tris, una solución reguladora del pH de HEPES, una solución reguladora del pH MOPS, etc., puede ser usada. La una solución reguladora del pH de PCB es producida al mezclar propionato de sodio, cacodilato de sodio y bis-Tris propano en proporciones molares 2:1:2. Al hacer variar la cantidad de HC1 agregado permite regular el pH en un intervalo de pH de 49. En algunas modalidades, se puede usar una solución reguladora del pH de carbonato.

Almacenamiento de composiciones secas En ciertas modalidades, las composiciones secas (por ejemplo, liofilizadas) pueden ser almacenadas por un periodo de tiempo, días, meses o semanas) antes de la rehidratación y administración a un sujeto en necesidad de las mismas. En ciertas modalidades, las composiciones secas, (por ejemplo liofilizadas) son almacenadas bajo condiciones que no son temperatura-controladas. En ciertas modalidades, las composiciones secas (por ejemplo, liofilizadas) son expuestas por lo menos temporalmente a temperaturas en exceso de 8°C durante el almacenamiento (por ejemplo, temperaturas que exceden de 15°C, 20°C o 25°C) . En ciertas modalidades, las composiciones secas (por ejemplo, liofilizadas) son expuestas por lo menos temporalmente a temperaturas en el intervalo de 10°C. a 40°C, temperaturas en el intervalo de 20°C a 30°C, a temperatura ambiente, etc.) .

En ciertas modalidades, las composiciones secas (por ejemplo, liofilizadas ) son termo estables. En ciertas modalidades, las composiciones secas (por ejemplo, liofilizadas ) son más estables cuando son almacenadas por 6 meses a 40°C que una composición seca de referencia que carece de vesículas de lípido. En ciertas modalidades, la estabilidad está basada en la inmunogenicidad tal como se determina mediante un análisis de HAI . En ciertas modalidades, la estabilidad está basada en el contenido de antígeno tal como, se determina mediante un análisis de ELISA.

En ciertas modalidades, las composiciones secas (por ejemplo, liofilizadas ) exhiben menos del 50% de cambio en inmunogenicidad, tal como se determina mediante un análisis HAI cuando son almacenadas por 6 meses a 40°C. En ciertas modalidades, las composiciones secas (por ejemplo, liofilizadas) exhiben menos del 40%, menos del 20%, menos de 10% o menos de 2% de cambio en inmunogenicidad.

En ciertas modalidades, las composiciones secas (por ejemplo, liofilizadas ) exhiben menos del 50% de pérdida de contenido de antigeno, tal como se determina mediante un análisis de ELISA, cuando son almacenadas por 6 meses a 40°C. En ciertas modalidades, las composiciones secas (por ejemplo, liofilizadas ) exhiben menos del 40%, menos del 20%, menos de 10% o menos de 2% de pérdida de contenido de antigeno.

En ciertas modalidades, estos efectos son observados después que las composiciones secas han sido almacenadas por solo 1, 2 o 3 meses en lugar de 6 meses. En ciertas modalidades, estos efectos son observados después que las composiciones secas han sido almacenadas a 15°C, 20°C, 25°C, 30°C o 35°C, en lugar de 40°C.

En ciertas modalidades, la antigenicidad y/o inmunogenicidad de las composiciones secas permanecen sustancialmente sin cambios durante el almacenamiento a pesar de ser expuestas a temperaturas en exceso de 8°C (por ejemplo, temperaturas en el intervalo de 10°C a 40°C, temperaturas en el intervalo de 20°C o 30°C, temperatura ambiente, etc.) por un periodo de 1 a 6 meses.

En ciertas modalidades, el almacenamiento de las composiciones secas a estas temperaturas elevadas destruyen menos del 20% de la antigenicidad del antigeno (por ejemplo, menos del 15%, menos de 10%, menos del 5%, menos del 1%) tal como es medida en un análisis de ELISA y en comparación con composiciones secas equivalentes que fueron almacenadas entre 2 y 8°C por el mismo periodo de tiempo.

En ciertas modalidades, el almacenamiento de las composiciones secas a temperaturas elevadas destruye menos del 20% de la inmunogenicidad del antigeno (por ejemplo, menos del 15%, menos del 10%, menos del 5%, menos del 1%) en base a mediciones del titulo de HAI y en comparación con composiciones secas equivalentes que fueron almacenadas entre 2 y 8°C por el mismo periodo de tiempo.

En ciertas modalidades, la antigenicidad y/o inmunogenicidad de una composición seca post-almacenamiento es por lo menos 1.5 veces mayor que en una composición seca equivalentes de otra manera que fuer almacenada bajo las mismas temperaturas elevadas pero que fue formulada sin vesículas de lípido (por ejemplo, por lo menos alrededor de 2 veces, 2.5 veces, 3 veces, 3.5 veces, 4 veces o 5 veces) . En algunas modalidades, el nivel de antigenicidad está basado en mediciones obtenidas utilizando un ELISA. En algunas modalidades, el nivel de inmunogenicidad está basado en mediciones de título de HAI.

En algunas modalidades, uno o más de estos resultados de antigenicidad y/o inmunogenicidad son obtenidos cuando la composición seca es almacenada a 25°C, por 1, 2, 3 o meses. En alunas modalidades, estos resultados son obtenidos cuando la composición seca es almacenada a 15°C, 20°C, 30°C, 35°C o 40°C por un mes. En algunas modalidades, estos resultados son obtenidos cuando la composición seca es almacenada a 15°C, 20°C, 30°C, 35°C o 40°C por 2 meses. En algunas modalidades, estos resultados son obtenidos cuando la composición seca es almacenada 15°C, 20°C, 30°C, 35°C o 40°C por 3 meses. En algunas modalidades, estos resultados son obtenidos cuando la composición seca es almacenada a 15°C, 20°C, 30°C, 35°C o 40°C por 2 meses. En algunas modalidades, estos resultados son obtenidos cuando la composición seca es almacenada 15°C, 20°C, 30°C, 35°C o 40°C por 4 meses. En algunas modalidades, estos resultados son obtenidos cuando la composición seca es almacenada a 15°C, 20°C, 30°C, 35°C o 40°C por 2 meses. En algunas modalidades, estos resultados son obtenidos cuando la composición seca es almacenada 15°C, 20°C, 30°C, 35°C o 40°C por 6 meses.

Composiciones ejemplares En ciertas modalidades, las composiciones provistas no comprenden o están sustancialmente libres de agentes adicionales con propiedades adyuvantes (esto es, las composiciones provistas sin adyuvantes) . En ciertas modalidades, las composiciones provistas no comprenden o están sustancialmente libres de adyuvantes de agonista de TLR (esto es, adyuvantes de agonista de TLR-3, TLR-4, TRL-5 , TLR-7/8, TLR-9, etc.). En ciertas modalidades, las composiciones provistas no comprenden o están sustancialmente libres de adyuvantes de agonista de TLR-9, por ejemplo Poli (I:C) o Poli (IC:LC). En ciertas modalidades, las composiciones provistas no comprenden o están sustancialmente libres de adyuvantes de agonista de TLR-4, por ejemplo MPL o 3D-MPL. En ciertas modalidades, las composiciones provistas no comprenden o están sustancialmente libres de adyuvantes de agonista de TLR5. En ciertas modalidades, las composiciones provistas no -comprenden o están sustancialmente libres de adyuvantes de agonista de TLR-7/8. En ciertas modalidades, las composiciones provistas no comprenden o están sustancialmente libres de adyuvantes de agonista de TLR-9.

IV. Dosificación y administración Los métodos de esta revelación son útiles para el tratamiento de infecciones de influenza en humanos incluyendo en adultos y niños. En general, sin embargo pueden ser usados con cualquier animal. En ciertas modalidades, los métodos de la presente son usados para aplicaciones veterinarias, por ejemplo aplicaciones caninas y felinas. Si se desea, los métodos de la presente pueden también ser usados con animales de granja, tales como crias bovinas, aviares-, bovinas, porcinas y equinas.

Las composiciones descritas en la presente serán administradas en general en tales cantidades y por un tiempo como sea necesario o suficiente para inducir una respuesta inmune. Los regímenes de dosificación pueden consistir de una sola dosis unitaria o una pluralidad de dosis unitarias en un periodo de tiempo. La cantidad exacta de una composición provista a ser administrada puede variar de sujeto a sujeto y puede depender de varios factores. Así, se apreciara que en general, ' la dosis precisa usada será determinada por el médico que prescribe y dependerá no solamente del peso del sujeto y la ruta de administración, sino también de la edad del sujeto y la severidad de los síntomas y/o el riesgo de infección. En ciertas modalidades, las composiciones provistas incluye una dosis de antígeno de hemaglutinina en un intervalo de alrededor de 100 µg, por ejemplo, en ciertas modalidades, el intervalo puede ser de entre alrededor de 2 y 50 pg, 5 y 50 pg, 2 y 20 pg, 5 y 20 pg, etc. En ciertas modalidades, las dosis de antígeno de hemaglutinina pueden ser de alrededor de 5 pg, 10 pg, 15 pg, 20 pg, 25 pg, 30 pg, 35 pg, 40 pg, 45 pg, etc. En ciertas modalidades estas dosis son administradas en una sola dosis unitaria. En ciertas modalidades, una sola dosis unitaria es administrada en varias ocasiones (por ejemplo, 1-3 dosis unitaria que están separadas por 1-12 meses) . en ciertas modalidades, el antígeno de hemaglutinina es tomado de una vacuna de influenza humana con licencia y la composición son administradas a un humano de tal manera que la dosis unitaria de antígeno de hemaglutinina es menor de la dosis unitaria humana estándar (por ejemplo, en el intervalo de 10-90%, 10-80%, 10-70%, 10-60%, 10-50%, 10-40%, 10-30%, 10-20%, 20-90%, 20-80%, 20-70%, 20-60%, 20-50%, 20-40%, 20-30%, 30-90%, 3080%, 30-70%, 30-60%, 30-50%, 30-40%, 40-90%, 40-80%, 40-70%, 40-60%, 40-50%, 50-90%, 50-80%, 50-70%, 50-60%, 60-90%, 60-80%, 60-70%, 60-60%, 70-90%, 70-80% u 80-90% de la dosis unitaria humana estándar) . Por ejemplo, si la dosis unitaria humana estándar requiere una sola administración de una composición que incluye 45 pg de antigeno de hemaglutinina (por ejemplo, véase Fluzone®, Fluvirin® o FluLaval®) entonces, en ciertas modalidades, los métodos de la presente revelación pueden involucrar dar al sujeto una sola administración de una composición provista que incluye menos del 45 pg de antigeno de hemaglutinina, por ejemplo 40 pg, 35 pg, 30 pg, 25 pg, 20 pg o 15 pg de antigeno de hemaglutinina.

En algunas modalidades las cantidades de' antigeno de hemaglutinina y adyuvante de agonista de TLR-4 (por ejemplo, MPL o 3D- PL) en las composiciones provistas son de tal manera que cada dosis unitaria incluye alrededor de 1-100 pg (por ejemplo, alrededor de 2-80 pg, 5-70 pg o alrededor de 10-50 pg) de antigeno de hemaglutinina y alrededor de 1-100 pg (por ejemplo, alrededor de 1-50 pg, alrededor de 1.5-50 pg, alrededor de 2.5-50 pg, alrededor de 2.5-50 pg, alrededor de 2.5-40 pg, alrededor de 2.5-30 pg, alrededor de 2.5-20 pg o alrededor de 2.5-10 ig) de adyuvante de agonista de TLR-4 (por ejemplo, MPL o 3D-MPL) .

En ciertas modalidades, las composiciones provistas son formuladas para administración parenteralmente, por ejemplo mediante inyección. En tales modalidades, la administración puede ser por ejemplo mediante técnicas de inyección intravenosa, intramuscular, intradérmica o subcutánea o via por infusión o técnicas de inyección sin aguja. En ciertas modalidades, las composiciones pueden ser formuladas para administración intramuscular. Para tal administración parenteral, las composiciones pueden ser preparadas y mantenidas en forma seca y rehidratada's antes de la administración como se discute anteriormente. El pH de las composiciones inyectables pueden ser ajustado, como es conocido en el arte, con un ácido aceptable farmacéuticamente, tal como acido metano sulfonico. Oros vehículos y solventes aceptables que pueden ser empleados incluyen solución de Ringer y U.S.P. además, aceites fijos estériles son empleados convencionalmente como solvente o medio de suspensión. Para este propósito cualquier aceite fijo blando puede ser empleado incluyendo mono- o di-glicéridos sintéticos. Además, ácidos grasos tales como ácido oleico son usados en la preparación de inyectables. Las composiciones inyectables pueden ser esterilizadas, por ejemplo mediante, filtración a través de un filtro de retención bacteriano o al incorporar agentes esterilizantes en forma de composiciones solidas estériles que pueden ser disueltas o dispersadas en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes del uso.

Ejemplos Los siguientes ejemplos describen algunos modos ejemplares de fabricación y de llevar a la práctica ciertas composiciones que son descritas en la presente. Se debe entender que estos ejemplos son por propósitos ilustrativos solamente y no pretenden limitar el alcance de las composiciones y métodos descritos en la presente.

Ejemplo 1: Composiciones inmunogénicas liofilizadas termoestables Este ejemplo describe métodos para la preparación de una composición inmunogénica liofilizada termoestable para inyección intramuscular (IM). Todas las composiciones de vesículas de surfactante no iónico (NISV) fueron preparadas mediante el método de fusión invertido. Los siguientes lípidos fueron usados: 1-monopalmitoil glicerol (surfactante no iónico) , colesterol (esferoide) y fosfato de dicetilo (un anfifílico iónico) . Específicamente, una proporción molar de 5:4:1 de lípidos (496 mg de 1- monopalmitoil glicerol (MPG) , 464 mg de colesterol (CHO) y 164 mg de dicetilo fosfato (DCP) ) fue colocada en un vaso de precipitado de fondo plano, asegurando que nada del polvo se adherido al lado del vaso de precipitado de vidrio. En esta composición ejemplar, el disacárido de hexaacilo fosforilado (sal de amonio) (PHAD, un. adyuvante de agonista de TLR-4 ejemplar mostrado en la Figura 1, , disponible de Avanti Polar Lipids, Inc. de Alabaster, AL) fue agregado opcionalmente ya sea a 12 mg (para las composiciones de ahorro de dosis o 4 mg para las composiciones de dosis equivalentes) y co-fundidos junto con otros lipidos. El vaso de precipitado fue sujetado con hoja de aluminio y los lipidos fueron fundidos en un baño de aceite caliente a 120-125°C con agitación ocasional utilizando una varilla de vidrio. Mientras que los lipidos se están fundiendo, una solución reguladora del pH de fosfato concentrada fue preparada como sigue: 5.980 g de Na2HOP y 1.363 NaH2P04 fueron disueltos en 20 mi de agua estéril, el pH fue medida, la solución fue filtrada a través de un filtro estéril de 0.45 µq y 0.796 mi de esta solución reguladora del pH fueron agregados a 40 mi de vacuna de influenza Fluzone® (temporada 2009-2010; Sanofi Pasteur) en una campana de flujo laminar. La vacuna de influenza Fluzone® (temporada 2009-2010; Sanofi Pasteur) es una vacuna de influenza dividida trivalente desactivada que contiene antigeno HA de influenza a una concentración de 45 pg/0.5 mi (cada 0.5 mi contienen 15 g de antigeno de HA de cada una de las siguientes cepas de virus de influenza: H1N1, A/Brisbane/59/2007 ; H3N2, A/Brisbane/10/2007 y B/Brisbane/60/2008 ) . La solución reguladora del pH concentrada de antigeno de pH regulado fue homogeneizada a 8,000 rpm a 30-35°C y rápidamente (para impedir la cristalización) los lipidos fundidos fueron transferidos al vaso de precipitados mientras que se homogeneiza la solución, punto en el cual la homogeneización a 8,000 rpm continuo por 10 minutos 1 30-35°C. La suspensión de lipido-antigeno homogeneizante fue agitada por 1-2 horas a 220 ± 10 rpm a 30-35°C. Una muestra en proceso fue tomada de esta etapa para determinar el pH y distribución de tamaño de particular (PSD). Finalmente, 40 mi de solución de sacarosa 400 mM en agua fueron agregados a los 40 mi de solución de NISV-antigeno y agitadas por 5 minutos a 220 ± 10 rpm a 30-35°C. Se tomaron alícuotas (0.5 ml/frasco para las composiciones de ahorro de dosis y 1. 5 m/frasco para las composiciones de dosis equivalentes) , congeladas a -80°C de la noche a la mañana o más tiempo y subsecuentemente liofilizadas de acuerdo con los parámetros de liofilización objetivo en el ciclo de liofilización resumido en la Tabla 2 a continuación y los puntos establecidos en el tiempo de secado primario dados en la Tabla 3 a continuación para diferentes volúmenes de llenado..

Tabla 2 *Etapa de carga de muestra, si la muestra no está pre congelada **Etapa de carga de la muestra, si la muestra esta pre-congelada ***Si la muestra esta pre-congelada, el tiempo mínimo es de 1 hora.

Tabla 3 Las muestras testigo no formuladas con NISV pero que contienen antigeno y adyuvante fueron preparadas de acuerdo con el siguiente procedimiento: 12 mg (composiciones de ahorro de dosis) o 4 mg (composiciones de dosis equivalentes) de PHAD fueron re suspendidos en 40 mg de solución de sacarosas 400 mM y esta suspensión fue mezclada subsecuentemente con 40 mg de vacuna de influenza Fluzone® (temporada 2009-2010; Sanofi Pasteur) y agitada por 5 minutos a 220 ± 10 rpm a 30-35°C. esta solución de antigeno-adyuvante sin formular fue sometida en alícuotas en frascos (0.5 ml/frasco paras la composiciones de ahorro de dosis y 1.5 ml/frasco para las composiciones de dosis equivalentes), congelada a -80°C de la noche a la mañana y más tiempo y subsecuentemente liofilizadas de acuerdo con los. parámetros de liofilización objetivo en el ciclo de liofilización resumido anteriormente en la Tabla 2 y los puntos establecidos en el tiempo de secado primarios dados anteriormente en la Tabla 3 para diferentes volúmenes de llenado .

Todas las composiciones liofilizadas fueron rehidratadas ante de la administración en 0.35 mi de FI . Como se discute en más detalle posteriormente en la presente, algunos de los estudios utilizaron la vacuna de influenza Fluzone® tal como es administrada en forma liquida como testigo (esto es, sin ninguna etapa de formulación sin incluir liofilización) .

Ejemplo 2 : Inmunización de influenza de ratones con composiciones inmunogénieas Las composiciones preparadas como se describe en el ejemplo 1 fueron probadas en ratones BALBC hembras de 6-8 semanas de edad (mínimo 8 animales por grupo de prueba) . Los ratones fueron inmunizados intramuscularmente con 50 µ? del testigo o composiciones rehidratadas dos veces, una vez en el día 0 y una vez en el día 14. La sangre fue recolectada de todos los ratones en los grupos de estudio pre-inmunización y luego post primera y segunda inmunizaciones para determinar las respuestas inmunes humorales. Como se resume en la Tabla 4 a continuación, los animales recibieron ya sea (1) Fluzone® de dosis equivalente (testigo positivo; sin formular y sin adyuvantes) al equivalente de 0. IX de dosis unitaria humana estándar (una "dosis unitaria de ratón estándar" es 0.1X de la dosis unitaria humana estándar, esto es, una vez que se toman en cuenta las diferencias de tamaño entre humanos y ratones) (grupo/articulo de prueba 1) ; (2) Fluzone® de ahorro de dosis al equivalente de 1/30X de dosis unitaria humana estándar formulada con NISV y el adyuvante PHAD (0.005 mg) (Grupo/Articulo de prueba 2) o (3) Fluzone® de ahorro de dosis al equivalente de 1/30X de dosis unitaria humana estándar formulada con el adyuvante PHAD (0.005 mg) pero sin NISV (Grupo/Articulo de prueba 3) .

Tabla 4 *Fluzone® (temporada 2009-2010; Sanofi Pasteur) es una vacuna de influenza dividida trivalente desactivada. Cada dosis unitaria de 0.5 mi de Fluzone® (temporada 2009-2010; Sanofi Pasteur) contiene 15 g de antigeno de HA de cada una de las siguientes cepas de virus de influenza: H1N1, A/Brisbane/59/2007; H3N2, A/Brisbane/10/2007 y B/Brisbane/60/2008.

**Los ratones reciben 0.1X de la dosis unitaria humana estándar de Fluzone® que se correlaciona con aproximadamente una dosis equivalente IX o "dosis unitaria humana estándar" cuando se convierte de humanos a ratones.

***Testigo de Fluzone® comercial usado sin ninguna etapa de formulación.

****Contenido por 0.05 mi de dosis unitaria de ratón.

Ejemplo 3: Análisis de inhibición de hemaglutinación de potencia de composiciones inmunogénicas Para las pruebas de potencia, se usó el análisis de HAI para medir respuestas inmunológicas en animales. El análisis de HAI es una técnica serológica usada para detectar el anticuerpo HA en suero resultante de infección o vacunación con virus de influenza. Los títulos de HAI se correlación con la protección de influenza en humanos. El título de anticuerpo de HAI es expresado como el reciproco de la dilución en suero más alta que muestra hemaglutinación completa utilizando 4 unidades de hemaglutinación. Un título de HAI de 1:40 o más alto es considerado como seroprotector y un incremento de cuatro veces en títulos de HAI en las muestras tomadas después y antes de la vacunación es el incremento mínimo considerado necesario para clasificación de seroconversión . Los resultados son presentados como el inverso de titulo de HAI y titulo de HAI de media geométrica. El análisis de HAI fue efectuado como sigue. Brevemente, una serie de diluciones dos veces en PBS de sueros de ratones inmunizados fueron preparadas en placas de fondo en forma de V de 96 cavidades e incubadas a temperatura ambiente por 30 minutos con 50 µ? de 4 unidades de hemaglutinación (HAU) de A/Brisbane/59/07 (H1N1) o A/Brisbane/10/2007 (H3N2) . Enseguida, 50 µ? de glóbulos rojos sanguíneos de pollo (diluidos al 0.5% en v/v) (Canadian Food Inspection Agency, Ottawa, Canadá) fueron agregados a todas las células sobre las placas e incubadas por 1.5 horas a temperatura ambiente. Luego se determinó la dilución más alta apta de aglutinar glóbulos rojos sanguíneos de pollo.

La media geométrica y error estándar de la media fueron determinadas. El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando los elementos de programación GraphPad Prism 5. Las muestras apareadas fueron determinadas mediante la prueba de t apareada y muestras sin aparear por la prueba t de student . Los valores p = 0.05 fueron, considerados estadísticamente significativos. Una respuesta positiva fue indicada por un incremento = 2 veces de 14 días de respuesta post-vacunación después de la última inmunización en comparación con los valores obtenidos antes de la inmunización. Los resultados de estos análisis son descritos a continuación.

En este estudio de ratón se evaluó la potencia de las tres composiciones descritas en el ejemplo 2, Tabla 4. Los análisis de HAI fueron efectuados en sangrados obtenidos de ratones en el día de estudio 13 (PlVdl3) y día 29 (P2Vdl5) .

La Figura 3 muestra el titulo de HAI medio contra H1N1 A/Brisbane/59/07 trece días después de la primera inmunización (PlVdl3) . Se puede ver que el titulo de HAI medio contra H1N1 para el Grupo de animales 2 (Tabla 4; composición de Fluzone® NISV de ahorro de dosis con adyuvante) fue significativamente más alto que los animales- del Grupo 3 (Tabla 4; composición de Fluzone® de ahorro de dosis con adyuvante sin NISV) y también más alta que los animales del Grupo 1 testigos (Tabla 4; Fluzone® de dosis equivalente sin adyuvante y sin formular) . También se observó que la composición de Fluzone® de NISV de ahorro de dosis con adyuvante (Grupo 2) tuvo potencia más alta que la composición de Fluzone® de dos equivalente sin adyuvante y sin formular testigo (Grupo 1) a un tercio de la dosis unitaria mientras que la composición de Fluzone® con ahorro de dosis con adyuvante sin NISV (Grupo 3) no.

La Figura 4 muestra el titulo de HAI medio contra H3N2 A/Brisbane/10/07 trece días después de la primera inmunización (PlVdl3) . Se puede ver que el titulo de HAI medio contra H3N2 para los animales del Grupo 2 (Tabla 4 ; composición de Fluzone® de, NISV de ahorro de dosis con adyuvante) fue significativamente más alto que los animales del Grupo 3 (Tabla 4; composición de Fluzone® de ahorro de dosis con adyuvante sin NISV) y también más alta que los animales del Grupo 1 testigos (Tabla 4; Fluzone® de dosis equivalente sin adyuvante y sin formular) . Otra vez, también se observó que la composición de Fluzone® de NISV de ahorro de dosis con adyuvante (Grupo 2) tuvo potencia más alta que la composición de Fluzone® de dos equivalente sin adyuvante y sin formular testigo (Grupo 1) a un tercio de la dosis unitaria mientras que la composición de Fluzone® con ahorro de dosis con adyuvante sin NISV (Grupo 3) no. Tendencias similares se observaron en las respuestas inmunes de animales en los varios grupos después de la segunda inmunización (P2Vdl5) . En general, los títulos de HAI medidos 15 después de la segunda inmunización (P2Vdl5) fueron aproximadamente 4-5 veces más altos que los títulos de HAI observados 13 días después de la primera inmunización.

Para determinar la dosis de dependencia a la dosis del adyuvante de agonista de TLR-4 ejemplar PHAD sobre la respuesta inmune, un testigo positivo y 5 diferentes composiciones de NISV preparadas por el método descrito en el ejemplo 1 (excepto con cantidades incrementadas de PHAD co-fundido con los otros lípidos) fueron probadas en ratones BALB/C hembra de 6-8 semanas de edad (mínimo 8 animales por grupo de prueba) . Los seis grupos de prueba son resumidos a continuación en la Tabla 5. Los ratones fueron inmunizados intramuscularmente con 50 µ? del testigo o composiciones rehidratadas dos veces, una vez en el dia 0 y una vez en el día 14. Las muestras de suero fueron recolectadas de todos los ratones en el grupo de estudio pre-inmunización y luego post-primera y segunda inmunizaciones y analizadas utilizando un análisis de HAI como se describe en Ejemplo 3.

Tabla 5 *Fluzone® (temporada 2009-2010; Sanofi Pasteur) es una vacuna de influenza dividida trivalente desactivada. Cada dosis unitaria de 0.5 mi de Fluzone® (temporada 2009-2010; Sanofi Pasteur) contiene 15 pg de antigeno de HA de cada una de las siguientes cepas de virus de influenza: H1N1, A/Brisbane/59/2007; H3N2, A/Brisbane/10/2007 y B/Brisbane/60/2008.

*** Fluzone® comercial testigo usado sin ninguna etapa de formulación.

****Contenido por 0.05 mi de dosis unitaria de ratón. La Figura 5A-5B muestra la respuesta de dosis de potencia en ratones tal como se determina por el análisis del titulo de HAI del Ejemplo 3 utilizando muestras de sueros tomadas 15 días post-segunda vacunación. Como se puede ver en la Figura 5A-5B, 5 µg de PHAD ('Grupo 5) incrementaron la potencia de la composición de Fluzone® de NISV de ahorro de dosis para coincidir aproximadamente con la potencia del Fluzone® de dosis equivalente sin adyuvante y sin formular testigo (Grupo 1) mientras que las dosis más altas de PHAD (15 y 50 µ?) (Grupos 4 y 3, respectivamente) incrementaron la potencia aproximadamente tres veces aquella del testigo. Las Figuras 5A y 5B muestran que el adyuvante de agonista de TLR-4 ejemplar incremento la potencia de manera dependiente de la dosis tanto para H1N1 como H3N2: Ejemplo 4: Pruebas de termo estabilidad de composiciones inmunogénicas liofilizadas La estabilidad de las composiciones inmunogénicas liofilizadas (NISV) preparadas de acuerdo · con el ejemplo 1 fue evaluada a 3 condiciones de temperatura de almacenamiento (5°C ± 3°C, 25°C + 2°C y 40°C ± 2°C) por hasta 6 meses. No hay ningún análisis que indique estabilidad individual o parámetros que perfilen las características de estabilidad de un producto biológico. Como se define por la FDA (Guía de la FDA para la industria. Contenido y formato de química, Manufactura e información de controles y establecimiento de información de descripción para una vacuna o producto relacionado) , un estudio de estabilidad para un producto biológico debe probar en general por: potencia; mediciones fisicoquímicas que son indicadores de estabilidad; contenido de humedad (si esta liofilizado) ; pH; esterilidad o control de biocarga; pirogenicidad y seguridad general. Consecuentemente, un perfil indicador de estabilidad que usa un número de análisis provee aseguramiento de que cambios en la identidad, pureza y potencia del producto biológico es comúnmente detectado.

Como se usa en la presente, el término "potencia" se refiere a la habilidad o capacidad especifica de un producto para obtener su efecto propuesto y es determinada mediante un método cuantitativo in vivo o in vitro apropiado. Un análisis de potencia de ratón in vivo fue usado para evaluar la potencia de las composiciones almacenadas con el paso del tiempo y a las tres temperaturas de almacenamiento diferentes. Como se muestra en la Tabla 6 a continuación, las composiciones testigo y composiciones liofilizadas fueron almacenadas a diferentes temperaturas por hasta 6 meses, tiempo después del cual fueron rehidratadas (en el caso de composiciones liofilizadas) y administradas intramuscularmente a ratones (como se describe en el Ejemplo 2) . Luego las respuestas inmunes fueron determinadas utilizando el análisis de HAI del Ejemplo 3.

Tabla 6 *Fluzone® (temporada 2009-2010; Sanofi Pasteur) es una vacuna de influenza dividida trivalente desactivada. Cada 0.5 mi de dosis unitaria de Fluzone® (temporada 2009-2010; Sanofi Pasteur) contiene 15 pg de antigeno de HA de cada una de las siguientes cepas de virus de influenza: H1N1, A/Brisbane/59/2007; H3N2, A/Brisbane/10/2007 y B/Brisbane/60/2008.

**Los ratones reciben 0.1X de la dosis unitaria humana estándar de Fluzone® que se correlaciona con aproximadamente una dosis equivalente I o "dosis unitaria humana estándar" cuando se convierte de humanos a ratones.

*** Fluzone® comercial Testigo usado sin ninguna etapa de formulación.

***Contenido por 0.05 mi de dosis unitaria de ratón.

"Proporción en peso de lipidos formadores de vesículas: antigeno de HA.

Las composiciones fueron también analizadas en cuanto a apariencia (color y opacidad) y enseguida de la rehidratación fueron analizadas en cuanto a distribución de tamaño de partícula (PSD) y pH. Alícuotas de muestras rehidratadas fueron centrifugadas en una ultracentrífuga a 24,000 rpm por 20 minutos a 4°C y las fracciones de sobrenadante y pelotilla fueron removidas, extraídas y analizadas mediante ELISA para determinar el contenido de antígeno (también descrito como "potencia in vitro") . La estabilidad del material rehidratado fue probada durante 4-6 horas enseguida de la rehidratación. A los puntos en el tiempo especificados, los lipidos en las composiciones liofilizadas fueron analizados en cuanto pureza y agente degradantes utilizando HPLC.

El contenido de humedad en las composiciones liofilizadas fue evaluado utilizando el análisis de Karl Fischer. Las composiciones usadas para el estudio de estabilidad no fueron estériles. Sin embargo, el método de formulación involucra el calentamiento de los lipidos á > 100°C y agregar los lipidos fundidos a una solución reguladora del pH filtrada estéril que contiene Fluzone® estéril. Los métodos de formulación fueron efectuados bajo condiciones de bajo contenido microbiano (Biocarga) tal como en una campana de flujo laminar utilizando bolsas ' estériles Tyvek durante la liofilización y vueltas a rellenar utilizando nitrógeno estéril. La biocarga fue evaluada como conteo microbiano aeróbico total (CFU por gramo) mediante deposición de muestras sobre Agar de Soya Tríptico (TSA) e incubación por 3-5 días a 30-35°C y como Conteo de' Levaduras y Hongos Combinados Totales (CFU por gramo) al depositar muestras sobre Agar Sabouraud (SDA) e incubación por 5-7 días a 20-25°C.

Las recomendaciones generales, como se resume en las directrices de Tripartita Armonizadas de ICH: Pruebas de estabilidad de nuevas sustancias de medicinas y productos QIA (R2), fueron seguidas durante la ejecución del estudio de estabilidad. Las pruebas que indican la estabilidad propuesta son enlistadas en la Tabla 7, debajo en donde un "mes" fue de aproximadamente 4 semanas y X indica una prueba requerida mientras que 0 indica una prueba opcional.

Tabla 7 La Figura 6 muestra la potencia in vivo en ratones (títulos de HAI analizados como se describe en el Ejemplo 3 utilizando muestras de sueros tomados 15 días posta 2a vacunación) de una composición de Fluzone® de NISV con adyuvante de ahorro de dosis (Grupo 2: NISV, adyuvante de agonista de TLR-4) versus una composición de Fluzone® con adyuvante de ahorro de dosis (Grupo 3; sin NISV, adyuvante de agonista de TLR-4) y un grupo testigo de Fluzone® sin adyuvante y sin formular de dosis equivalentes (Grupo 1: sin NISV, sin adyuvante de agonista de TLR4 ) . Las composiciones testigo y liofilizadas fueron almacenadas por 6 meses a 4°C o 40°C antes de la inyección de IM a ratones como se describe en el Ejemplo 2. Como se puede ver en la Figura 6, los títulos de HAI para HlNl y H3N2 demuestran que la composición de Fluzone® de NISV con adyuvante de ahorro de dosis (Grupo 2) fue igualmente potente cuando es almacenada por hasta 6 meses a 4°C o 40°C, mientras que el grupo testigo de Fluzone® sin adyuvante y sin formular de dosis equivalente (Grupo 1) y la composición de Fluzone® con adyuvante con ahorro de dosis (Grupo 3) ambos pierden potencia con son almacenadas a 40°C versus 4°C en el mismo periodo de tiempo de 6 meses.

La Figura 7 muestra la potencia in vivo en ratones (títulos de HAI analizados como se describe en el Ejemplo 3 utilizando muestras de suero tomadas 15 días post 2a vacunación) para una composición de Fluzone® de NISV sin adyuvante de dosis equivalente (Grupo 7: NISV, sin adyuvante de agonista de TLR-4) versus el grupo testigo de Fluzone® sin adyuvante y sin formular de dosis equivalente (Grupo 1: sin NISV, sin adyuvante de agonista de TLR-4) . Las composiciones testigo y liofilizadas fueron almacenadas por 6 meses a 4°C o 40°C antes de la inyección intramuscular a ratones como se describe en el Ejemplo 2. Como se puede ver en la Figura 7, los títulos de HAI para HlNl y H3N2 demuestran que la composición de Fluzone® con NISV sin adyuvante de dosis equivalente (Grupo 7) fue igualmente potente cuando es almacenada por hasta 6 meses a 4°C o 40°C, mientras que el grupo testigo de Fluzone® sin adyuvante y sin formular de dosis equivalente (Grupo 1) pierde potencia cuando es almacenada a 40°C versus 4°C en el mismo periodo de tiempo de 6 meses.

La Figura 8A-8B muestra el contenido de antigeno de HA in vitro después de diferentes periodos de almacenamiento (puntos en el tiempo T=0, 1, 3, y 6 meses) y temperaturas (4°C, 25°C y 40°C) para la siguientes composiciones: (A) composición de Fluzone® de NISV con adyuvante de ahorro de dosis (Grupo 2) y (B) composición de Fluzone® con adyuvante de ahorro de dosis Fluzone® (Grupo 3) . Los valores del contenido de antigeno de HA fueron determinados mediante análisis de ELISA como se describe anteriormente. Las composiciones fueron centrifugadas y las cantidades de antígeno de HA en la pelotilla y sobrenadante fueron medidas separadamente como se muestra. Como se puede ver en la Figura 8A-8B los resultados demuestran pérdida mínima de contenido de antígeno de HA cuando Fluzone® fue formulada con NISV y almacenada hasta 6 meses a 40°C (Grupo 2, Figura 8A) , mientras que el contenido de HA declino establemente cuando Fluzone® no fue formulada con NISV y almacenada a 40°C (Grupo 3, Figura 8B) .

Apariencia: El cambio dependiente del tiempo y dependiente de la temperatura más notable en la apariencia con la función de las retortas liofilizadas que fue observado en todas las composiciones testigo que no contienen NISV liofilizadas después de almacenamiento a 40°C y a una extensión menor a 25°C. Sin desear estar limitados por alguna teoría, la fusión de las retortas liofilizadas observada en estas composiciones liofilizadas sin NISV no" pareció ser debido al secado incompleto de retortas antes del inicio del secado secundario. Las retortas liofilizadas fueron todas satisfactorias enseguida de la liofilización pero se encogieron y licuaron a temperaturas incrementadamente elevadas durante el tiempo de almacenamiento.

Humedad residual: La humedad residual en la retortas liofilizadas fue determinada utilizando el análisis de Karl Fischer y fue expresada como por ciento de humedad en peso. Sin desear estar limitados por alguna teoría, se aprecia que el contenido de humedad residual de la retorta liofilizada se puede correlacionar inversamente con la estabilidad de la composición. Se observó que, a tiempo cero (directamente después de la liofilización) la unidad residual total en los grupos de composición que no contienen NISV liofilizados fue más alta que la humedad residual en las composiciones que contienen NISV liofilizadas: alrededor de 2-4% versus alrededor de 1-2% de humedad residual, respectivamente. En general, la presencia de NISV durante la liofilización dio como resultado un contenido de humedad residual más bajo. Hubieron cambios muy mínimos a no observables en la humedad residual de las composiciones que contienen NISV liofilizadas cuando son almacenadas a temperaturas elevadas (por ejemplo, 25°C, 40°C) por periodos de tiempo extensos (por ejemplo, hasta 6 meses) (datos no mostrados) .

Distribución de tamaño de partículas: Hubieron cambios evidentes en la distribución de tamaño y el tamaño de partículas media a 40°C (y a una extensión mucho menor a 25°C) tanto en las composiciones que contienen NISV liofilizadas como en las composiciones que no contienen NISV (datos no mostrados) . Estos cambios en la distribución del tamaño de partícula y tamaño de partícula medio no fueron observados a 4°C para cualquier composición que contiene NISV. pH: el pH de todas las composiciones fue aproximadamente el mismo cuando son almacenados a 4°C, 25°C o 40°C y no mostraron ninguna tendencia observable en el curso del estudio de 6 meses.

Ejemplo 5: Termo estabilidad de composiciones inmunogénicas liofilizadas con otros adyuvantes y antigenos El objetivo de este estudio fue determinar si diferentes tipos de adyuvantes y antígenos serian termoestables cuando son ' formulados con NISV. Nótese que ninguna optimización de la varias composiciones fue consumada con el fin de probar estos adyuvantes y antigenos alternativos (por ejemplo, optimización de concentración de adyuvante, etc.) .

Diferentes adyuvantes: Todas las composiciones de vesículas de surfactante no iónicas (NISV) con diferentes adyuvantes fueron preparadas mediante el método de fusión 10 invertido como se describe en el Ejemplo 1. Específicamente, para cada composición una proporción molar de 5:4:1 de lípidos (147.59 mg de MPG, 138.25 mg de CHO y 19.66 mg de DCP) fue colocada en un vaso de precipitado de vidrio de fondo plano. El vaso de precipitado fue sujetado y cubierto y los lipidos fueron fundidos en un baño de aceite calentado a 120°C-125°C con agitación ocasional utilizando una varilla de vidrio. La solución reguladora del pH de fosfato concentrada, preparada como se describe en el Ejemplo 1 (0.224 mi) fue agregada a 11.67 mi de vacuna de influenza Fluzone® (temporada 2009-2011; Sanofi Pasteur) en una campana de flujo laminar. Las soluciones concentradas de antígeno de pH regulado fueron homogeneizadas a 8,000 rpm a 30-35°C y rápidamente (para impedir la cristalización) los lípidos fundidos fueron transferidos al vaso de precipitados mientras que se homogeniza la solución. La homogeneización a 8000 rpm prosiguió por 10 minutos a 30-35°C. La suspensión de lípido-antígeno resultante fue agitada por 1-2 horas a 220 + 10 rpm a 30°C-35°C. Un volumen equivalente de solución de sacarosa 400 mM en agua fue agregado con cada adyuvante (3.5 mg de adyuvante) a cada de unas de las soluciones de NISV-antígeno y agitada por 5 minutos a 220 ± 10 rpm a 30°C-35°C. se tomaron alícuotas (o.5 ml/frascos) , congeladas a -80°C de la noche a la mañana o más tiempo y subsecuentemente liofilizadas de acuerdo con los parámetros de liofilización objetivo en el ciclo de liofilización resumido en la Tabla 2 y los puntos establecidos de tiempo de secado primario dados en la Tabla 3 para diferentes volúmenes de llenado.

Las composiciones con adyuvante liofilizadas fueron almacenadas por 3 meses a 4°C o 40°C y luego rehidratadas en 0.75 mi de WFI antes de inyección intramuscular a ratones como se describe en el Ejemplo 2. La potencia in vivo de las composiciones rehidratadas fue analizada (los títulos de HAI contra H1N1 fueron medidos como se describe en el Ejemplo 3) en muestras de suero tomadas de ratones vacunados 15 días post-segunda vacunación. Los resultados son mostrados a continuación en la Tabla 8. Estos resultados demuestran que las composiciones de Fluzone® para adyuvante de ahorro de dosis (Grupos 1 y 2) son igualmente potentes cuando son almacenadas por hasta 3 meses a 4°C o 40°C sin consideración de tipo de adyuvante. La potencia global de estas composiciones de Fluzone® de NISV con adyuvante de ahorro de dosis (Grupos 1 y 2) fue menor que la potencia global de una composición de Fluzone® de NISV de dosis equivalente (Grupo 3) . Un estudio también efectuado con flagelina (un adyuvante de agonista de TLR-5) ; sin embargo, la dosis probada fue toxica a los ratones.

Tabla 8 *Fluzone® (temporada 2009-2011; Sanofi Pasteur) es una vacuna de influenza dividida trivalente desactivada. Cada 0.5 mi de dosis unitaria de Fluzone® (temporada 2010-2011; Sanofi Pasteur) contiene 15 µg de antigeno de HA de cada una de las siguientes cepas de virus de influenza: H1N1, A/Brisbane/59/2007; H3N2, A/Brisbane/10/2007 y B/Brisbane/60/2008.

**Adyuvante de agonista de TLR 7/8.

***Adyuvante de agonista de TLR 9.

Diferentes Antigenos: composiciones de vesículas de diferentes de surfactante no iónico (NISV) de antígeno de influenza diferente fueron preparadas mediante métodos de fusión invertido como se describe en el Ejemplo 1. Específicamente, para cada composición, una proporción molar de 5:4:1 de lípidos (404 mg MPG, 378 mg de CHO y 134 mg de DCP) fue colocada en un vaso de precipitados de fondo plano. El vaso de precipitado fue sujetado y cubierto y los lípidos fueron, fundidos en un baño de aceite calentado a 120°C-125°C con agitación ocasional utilizando una varilla de vidrio. La solución reguladora del pH de fosfato concentrada, preparada como se describe- en el Ejemplo 1, (0.615 mi) fue agregada a 32 mi de vacuna de influenza Fluzone® (temporada 2010-2011; Sanofi Pasteur) , vacuna de influenza Fluvirin® (temporada 2010-2011; Novartis) o vacuna de influenza Flulaval® (temporada 2010-2011; GSK) en una campana de flujo laminar. La vacuna de influenza Fluzone ® (temporada 2010-2011; Sanofi Pasteur) es una vacuna de, influenza dividida trivalente desactivada que contiene antígeno de HA de influenza a una concentración de 45 µg/0.5 mi (cada 0.5 mi contiene 15 pg de antígeno de HA de cada una de las siguientes cepas de virus de influenza: H1N1, A/California/07 /2009 X-181; H3N2, A/Victoria/210/2009 X-187 y B/Brisbane/60/2008) . La vacuna de influenza Fluvirin® (temporada 2010-2011; Novartis) es una vacuna de influenza dividida trivalente desactivada que contiene antígeno de HA de influenza a una concentración de 45 g/0.5 mi (cada 0.5 mi contiene 15 pg de antígeno HA de cada una de las siguientes cepas de virus de influenza: H1N1, A/California/07/2009 X-181; H3N2, A/Victoria/210/2009 X-187 y B/Brisbane/60/2008 ) . La vacuna de influenza FluLaval® (temporada 2010-2011, GSK) es también una vacuna de influenza dividida trivalente desactivada que contiene antigeno de HA de influenza a una concentración de 45 pg/0.5 mi (cada 0.5 mi contiene 15 µg de antigeno HA de cada una de las siguientes cepas de virus' de influenza: H1N1, A/California/07/2009 X-181; H3N2, A/Victoria/210/2009 X-187 y B/Brisbane/60/2008). La solución es concentrada de antigeno de pH regulado fueron homogeneizadas a 8000 rpm a 30-35°C y rápidamente (para impedir la cristalización) los lipidos fundidos fueron transferidos al vaso de precipitado mientras que se homogeneiza la solución, punto en el cual la homogeneización a 8000 rpm prosiguió por 10 minutos a 30-35°C. La suspensión de lipido-antigeno resultante fue agitada por 1-2 horas a 220 ± 10 rpm a 30°C a 35°C. Un volumen equivalente de solución de sacarosa de 400 mM en agua fue agregado a cada una de las soluciones de NISV/antigeno y agitada por 5 minutos a 220 ± 10 rpm a 30°C-35°C. Se tomaron alícuotas (1.5 ml/frasco) , fueron congeladas a -80°C de la noche a la mañana o más tiempo y subsecuentemente liofilizadas de acuerdo con los parámetros de liofilización objetivo en el ciclo de liofilización resumido en la Tabla 2 y los puntos establecidos en el tiempo de secado primarios dados en la Tabla 3 para diferentes volúmenes de llenado.

Las composiciones fueron almacenadas por 3 meses a 4°C y 40°C y fueron rehidratadas en 0.75 mi de WFI antes de la inyección intramuscular a ratones como se describe en el Ejemplo 2. La Figura 9 muestra la "potencia in vitro" de la composición después de 3 meses a 4°C o 40°C (contenido de antigeno HA determinado mediante ELISA como se describe en el Ejemplo 4). Los resultados demuestran pérdida mínima de contenido de antigeno de HA con almacenamiento de hasta 3 meses a 40°C cuando los antígenos de influenza (Fluzone®, Fluvirin® o Flulaval®) fueron formulados con NISV, mientras que el contenido de antígeno de HA declino establemente cuando los antígenos de influenza (Fluzone®, Fluvirin® o Flulaval®) no fueron formulados con NISV.

Ejemplo 6: Inmunización de influenza de monos con composiciones inmunogenicas Para examinar la inmunogenicidad en un modelo de primate no humano, las composiciones que habían demostrado termo estabilidad in vitro e in vivo en ratones a 4°C, 25°C y 40°C por hasta 6 meses fueron también probadas en macacos resus. Los monos recibieron dos inyecciones (0, 28 días) ya sea de (a) una cantidad de dosis equivalente (IX de dosis unitaria humana estándar o 45 g) de un testigo positivo de Fluzone® sin adyuvante y sin formular o (b) una cantidad de ahorro de dosis (1/3X de dosis unitaria humana estándar o 15 pg) de Fluzone® formulada con NISV con o sin él adyuvante agonista de TLR-4 ejemplar PHAD (50 µg) . Las muestras de suero fueron recolectadas pre- y post-inyección intramuscular (por hasta 10 semanas post-segunda inyección) y analizada mediante un análisis de HAI como se describe en el Ejemplo 3. Los análisis de HAI se llevaron a cabo para H1N1 y H3N2 y datos para H3N2 son presentados en la Figura 10 para los tres grupos de tratamiento. Como se muestra en la Figura 10, las composiciones de Fluzone® de NISV de ahorro de dosis, ya sea con adyuvante de PHAD o sin adyuvante, mostraron inmunogenicidad superior en comparación con el testigo positivo de Fluzone® sin adyuvante y sin formular en macacos resus hasta 10 semanas después de la segunda administración intramuscular.

Ejemplo 7: El papel de la proporción de lipido: Antigeno, concentración de lipido y contenido de lipido en la termo estabilidad Para examinar el papel que los lipidos juegan en la termo estabilidad, composiciones inmunogénicas fueron formulada utilizando los métodos de fusión invertidos (como se describe en el Ejemplo 1) con diferentes proporciones de lipido: antigeno, diferente contenido de lipidos por dosis unitaria y diferentes concentraciones de lipido durante la homogeneización y reconstitución. Las varias composiciones probadas son descritas en la Tabla 9 a continuación. El objetivo de este estudio fue determinar la termo estabilidad de la composiciones de NISV de Fiuzone® enseguida de 3 meses de almacenamiento a 4°C y 40°C.

Tabla 9 *Fluzone® (temporada 2009-2010; Sanofi Pasteur) es una vacuna de influenza dividida trivalente desactivada. Cada 0.5 mi dosis unitaria de Fiuzone® (temporada 2009-2010; Sanofi Pasteur) contiene 15 g de antigeno de HA de cada una -de las siguientes cepas de virus de influenza: H1N1, A/Brisbane/59/2007; H3N2, A/Brisbane/10/2007 y B/Brisbane/60/2008. (Esto es, 45 µ? de antigeno de HA total en 0.5 mi) .

**Solución concentrada de antigeno diluida dos veces con solución reguladora del pH de fosfato 10 mM, pH 7.2 (esto es, 22.5 yg de antigeno de HA total en 0.5 mi) .

***Solución concentrada de antigeno concentrada dos veces con tubos de ultrafiltración Amicon (esto es, 90 pg de antigeno de HA total en 0. 5ml) .

****Proporción en peso de lipidos formadores de vesículas: antígeno de HA.

Los NISV fueron compuestos de los siguientes lipidos: 1-monopalmitoil glicerol (MPG, un surfactante no iónico) , colesterol (CHO, un esteroide) y fosfato de dicetilo (DCP, un anfifílico iónico) . Para mantener una proporción molar de 5:4:1, las cantidades como se dan en la Tabla 9 fueron pesadas y colocadas en un vaso de precipitado de vidrio de fondo plano y fundidas en un baño de aceite calentado a 120°C-125°C con agitación ocasional utilizando una varilla de vidrio como se describe en el ejemplo 1. Mientras que los lipidos se fundían una la solución reguladora del pH de fosfato concentrada en volúmenes dados en la Tabla 9 fue agregada al volumen apropiado de Fluzone® como se da en la Tabla 9. La soluciones concentradas de antígeno de pH reguladora fueron luego homogeneizadas a 8,000 rpm a 30-35°C y rápidamente (para impedir la cristalización) los lipidos fundidos füeron transferidos al vaso de precipitados mientras que se homogeniza la solución punto en el cual la homogeneización a 8000 rpm prosiguió por 10 minutos a 30-35°C. La suspensión de NISV-antigeno resultante fueron agitadas por 1-2 horas a 220 ± 10 rpm a 30°C-35°C. Finalmente, un volumen igual de solución de sacarosa 400 mM en agua fue agregado a las soluciones de NISV-antigeno y agitadas por 5 minutos a 220 + 10 rpm a 30°C-35°C. se tomaron alícuotas (1 ml/frascos), fueron congeladas a -80°C de la noche a la mañana o más tiempo y subsecuentemente liofilizadas de acuerdo con los parámetros de liofilización objetivo en el ciclo de liofilización resumido en la Tabla 2 y los puntos establecidos de tiempo de secado primario dados en la Tabla 3 para diferentes volúmenes de llenado.

Las composiciones (descritas en la Tabla 10) fueron almacenadas a 4°C y 40°C por hasta 3 meses y fueron luego administradas intramuscularmente a ratones (como se describe en el Ejemplo 2) . La respuesta inmune en ratones vacunados fue determinada utilizando el análisis de HAI descrito en el Ejemplo 3. ademas de la potencia in vivo, algunas pruebas de estabilidad adicionales como se describen en el Ejemplo 4 se llevaron a cabo en las composiciones incluyendo inspección visual de la retorta liofilizada, medición de contenido de antígeno mediante ELIS y medición del contenido de humedad de la retorta liofilizada.

Tabla 10 *Fluzone® (temporada 2009-2010; Sanofi Pasteur) es una vacuna de influenza dividida trivalente desactivada. Cada dosis unitaria de 0.5 mi de Fluzone® (temporada 2009-2010; Sanofi Pasteur) contiene 15 µq de antigeno de HA de cada una de las siguientes cepas de virus de influenza: H1N1, A/Brisbane/59/2007; H3N2, A/Brisbane/10/2007 y B/Brisbane/60/2008. (esto es, 45 µg de antigeno de HA total en O .5 mi.) .

**Concentración del lípido aproximada enseguida de la homogeneización ***Concentración de lípido aproximada enseguida de la reconstitución.

****Proporción en peso de lípidos formadores de vesículas: antígeno de HA "Solución concentrada de antígeno diluida dos veces ##Solución concentrada de antígeno concentrada dos veces ##ffTestigo de Fluzone® comercial usado sin ninguna etapa de formulación.

La humedad residual en las composiciones fue determinada utilizando el análisis de Karl Fischer y fue expresada como por ciento de humedad en peso y es presentada en la Tabla 11. Hubieron diferentes diferencias distintas cuando se compara la humead residual de las composiciones de Fluzone® de NISV de proporción de lípido: antígeno más baja (30:1 y 100:1) versus las composiciones de Fluzone® de NISV de proporción de lípido: antígeno más altas (300:1) . En general, las composiciones de Fluzone® de NISV de baja proporción de lípido: -antígeno tuvieron un contenido de humedad más alto (30:1-2.87% y 100:1-1.181%) que la composición de NISV de proporción de lípido: antígeno más alta (300:1-1.53% o menos) . También ser observaron diferencias en la humedad residual en las composiciones de Fluzone® de NISV de proporción de lipido: antigeno 300:1 dependiendo de la concentración de lipido durante la homogeneización. Asi, las composiciones preparadas con concentraciones de lipido más bajas durante la homogeneización tuvieron un contenido de humedad residual en el intervalo de 1.21% a 1.53% (articulo de prueba 3, 4, 6) mientras que las composiciones preparadas con concentraciones de lipido más altas, durante la homogeneización tuvieron un contenido de humedad residual más bajo en el intervalo de 0.54 a 0.66% (artículos de prueba 5 y 7). Las varias proporciones de lipido: antígeno y concentraciones de lipido pueden también ser expresadas como contenido de lipido total en la retorta liofilizada. Utilizando esta medición para el contenido de lipido permite una correlación entre .el contenido de lipido y la humedad residual, en donde las retortas liofilizadas de bajo contenido de lipido tienen alto 'contenido de humedad residual y las retortas liofilizadas de alto contenido de lipido tienen bajo contenido de humedad residual. El contenido de lipido en la retortas liofilizadas fue también comparado con la apariencia de la retortas después de T=0, T=3 meses a 4°C y T=3 meses a 40°C. A T=0, todas las retortas liofilizadas de la composición de Fluzone® de NISV aparecen blancas, bien formadas y desprovistas de micro-aplastamiento, sin consideración del contenido de lipido. La misma observación también se hizo para todas las retortas liofilizadas de la composición de Fluzone® de NISV a T=3 meses a 4°C. sin embargo, a T=3 meses a 40°C, no todas las retortas liofilizadas de la composición de Fluzone® de NISV aparecieron intactas; las dos retortas liofilizadas de contenido de lipido más bajo, esto es, artículos de prueba 1 (1.35 mg) y articulo de prueba 2 (4.5 mg) , parecieron haberse aplastado y fundido otra vez mientras que todas las retortas liofilizadas de contenido de lipido más alto, esto es, artículos de prueba 3-7 (6.75 mg o más) todavía parecían intactas aun después de almacenamiento por tres meses a esta temperatura elevada. Las mismas correlaciones son observadas cuando se usa la concentración de lipidos durante la homogeneización en lugar del contenido de lipido, compárese: artículo de prueba 1 (2.7 mg/ml) y articulo de prueba 2 (9 mg/ml) con artículos de pruebas 3.7 (13.5 mg/ml o más).

Tabla 11 ^Calculada utilizando concentraciones de lipido durante volumen igual de sacarosa pre-liofilización . } **Concentración del lipido aproximada enseguida de la homogeneización .

***Proporción en peso de lipidos formadores de vesículas: antígeno de HA.

LA figura 11A-11B muestra el contenido de antígeno de HA in vitro para Fluzone® comercial sin formular (articulo de prueba 8) versus una composición de Fluzone® de NISV de proporción de lipido: antigeno 300:1 (articulo de prueba 3), una composición de Fluzone® de NISV de proporción de lipido: antigeno 100:1 (articulo de prueba 2) y una composición de Fluzone® de NISV de proporción de lipido: antigeno 30:1 (articulo de prueba 1) . Alícuotas de composiciones rehidratadas fueron centrifugadas en una ultracentrífuga a 24,000 rpm por 20 minutos a 4°C y las fracciones de sobrenadante y pelotilla fueron removidas, extraídas y analizadas mediante ELISA para determinar el contenido de antigeno (o "potencia in vitro") como se describe ¦ en el Ejemplo 4. El contenido de antígeno fue determinado para las cuatro composiciones T=0 y después de 3 meses de tratamiento a 40°C (T=3 meses a 40°C) . se detectó una pérdida significativa de contenido de antígeno de HA mediante ELISA después de tres meses de almacenamiento a 40°C tanto para el testigo de Fluzone® sin formular (artículo de prueba 8) y la composición de Fluzone® de NISV de proporción de lipido: antígeno más baja (30:1) (artículo de prueba 1). Después de tres meses e almacenamiento a 40°C, solamente el 70% del contenido de HA original permanecía para Fluzone® comercial mientras que solo el 40% del contenido de HA original permanecía para la composición de Fluzone® de NISV de proporción de lipido: antígeno más baja (30:1) (artículo de prueba 1) . En contraste-, las composiciones de Fluzone® de NISV de proporción de lipido: antigeno más alta (100:1 y 300:1) mostraron muy poca pérdida de contenido de antigeno de HA con respecto al tiempo a pesar de ser almacenadas a 40°C por 3 meses.

La Figura 12A-12B muestra la potencia in vivo en ratones (titulo de HAI analizados como se describe en el Ejemplo 3 utilizando muestras de suero tomadas 15 días post-segunda vacunación) para todas las composiciones de Fluzone® de NISV (grupos 1-7) descritas en la Tabla 10 versus un testigo de Fluzone® sin formular (grupo 8) . Los resultados mostrados son para (A) H1N1 y (B) H3N2 y demuestran que las composiciones de Fluzone® de NISV y el testigo de Fluzone® sin formular fueron todos en general de la misma potencia de T=0 (titulo de HAI promedio para H1N1-189.9; titulo de HAI promedio para H3N2-177.5) .

La Figura 13A-13B muestra la potencia in vivo en ratones (titulo de HAI analizados como se describe en el Ejemplo 3 utilizando muestras de suero tomadas 15 días post-vacunación) para el testigo de Fluzone® sin formular (Grupo 8) versus una composición de Fluzone® de NISV de proporción de lipidos: antigeno 300:1 (Grupo 3), una composición de Fluzone® de NISV de proporción de lipido: antigeno de 100:1 (Grupo 2) y una composición de Fluzone® de NISV de proporción de lipido: antigeno de 30:1 (Grupo 1) . Todas las composiciones fueron almacenadas por 3 meses a 4°C o 40°C antes de la inyección intramuscular a ratones. Los resultados mostrados son para (A) H1N1 y (B) H3N2 y demuestran que las composiciones de Fluzone® de NISV de proporción de lipidos: antigeno de 300:1 y 100:1 (Grupos 2 y 3) fueron igualmente potentes cuando son almacenadas por hasta 3 meses a 4°C o 40°C, mientras que el testigo de Fluzone® sin formular (Grupo 8) y la composición de Fluzone® de NISV de proporción de lipido: antigeno 30:1 (Grupo 1) perdió potencia cuando es almacenada a 40°C en el mismo periodo de tiempo de 3 meses.

La Figura 13A-13B también muestra la potencia in vivo en ratones (títulos de HAI analizados como se describe en el Ejemplo 3 utilizando muestras de suero tomadas 15 días post-. segunda vacunación) para composiciones de Fluzone® de NISV de proporción de lipidos: antigeno 300:1 a tres concentraciones de lipido diferentes durante la homogeneización y reconstitución: concentración de lipido de bajo rango (Grupo 4), concentración de lipido de rango medio (Grupo 3) y concentración de lipido de alto rango (Grupo 5) . Todas las composiciones fueron almacenadas por 3 meses a 4°C o 40°C antes de la inyección intramuscular a ratones. Los resultados mostrados son para (A) H1N1 y (B) H3N2 y demuestran que las composiciones de Fluzone® de NISV de rango medio y alto rango (Grupo 3 y 5) fueron igualmente potentes cuando son almacenadas por hasta 3 meses a 4°C o 40°C, mientras que la composición de Fluzone® de NISV de concentración de lipido de rango bajo (Grupo 4) mostró una pérdida mínima de potencia cuando es almacenada a 40°C en el mismo periodo de tiempo de 3 meses. La composición de Fluzone® de NISV de proporción de lipido: antígeno de 300:1 de concentración de lipido de bajo rango (13.5 mg/ml de concentración de lipido durante la homogeneización) no fue tan baja como una concentración de lipido como en la composición de Fluzone® de NISV de proporción de lipido: antígeno de 30:1 (concentración de lipido de 2.7 mg/ml durante la homogenización) .

La Figura 13A-13B también muestra la potencia in vivo en ratones (títulos de HAI analizados como se describe en el Ejemplo 3 utilizando muestras de suero tomadas 15 días postsegunda vacunación) para composiciones de Fluzone® de NISV de proporción de lipido: antígeno de 300:1 a 3 concentraciones de lipido diferentes durante la homogeneización y la misma concentración de lipido en la reconstitución: . concentración de lipido de bajo rango (Grupo 6) , concentración de lipido de rango medio (Grupo 3) y concentración de lipido de alto rango (Grupo 7) . Todas las composiciones fueron almacenadas por 3 meses a 4°C o 40°C antes de la inyección intramuscular a ratones. Los resultados mostrados son para (A) H1N1 y (B) H3N2 y demuestran que las composiciones de Fluzone® de NISV de rango medio y alto rango (Grupos 3 y 7) fueron igualmente potentes cuando son almacenadas por hasta 3 meses a 4°C o 40°C, mientras que la composición de Fluzone® de NISV de concentración de lipido de bajo rango (Grupo 6) mostró una pérdida de potencia mínima cuando es almacenada a 40°C en el mismo periodo de tiempo de 3 meses, la composición de Fluzone® de NISV de proporción de lípidos: antígeno 300:1 de concentración de lipido de bajo rango (concentración de lipido de 13.5 mg/ml durante la homogenización) no fue tan baja como una concentración de lipido cómo en la composición de Fluzone® de NISV de proporción de título: antígeno de 30:1 (concentración de lipido de 2.7 mg/ml durante la homogeneización) .

Otras modalidades Otras modalidades de la revelación se harán evidentes para aquellos experimentados en el arte después de una concentración de la especificación o práctica de la revelación de la presente. Se pretende que la especificación y ejemplos sean considerados ejemplares solamente, con el verdadero alcance de la revelación siendo indicado por las siguientes reivindicaciones. El contenido de cualquier referencia al que se hace referencia en la presente es incorporado por referencia en su totalidad.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición caracterizada porque comprende un antigeno de hemaglutinina de virus de influenza y vesículas de lípido, en donde las vesículas de lípido consisten de lípidos que están presentes en la composición en una cantidad que obtiene una proporción en peso de lípido: antígeno en un intervalo de alrededor de 50:1 a alrededor de 400:1 y los lípidos incluyen un surfactante no iónico.

2. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque la composición es inmunogénica .

3. Una composición caracterizada porque comprende un antígeno de hemaglutinina de virus de influenza y vesículas de lípido, en donde las vesículas de lípido consisten de lípidos que están presentes en la composición en una cantidad que obtiene una proporción en peso de lípido: antígeno de por lo menos de alrededor de 50:1 y los lípidos incluyen un surfactante no iónico.

4. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque la composición es líquida.

5. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque la composición es seca.

6. Una composición seca caracterizada porque comprende un antígeno de hemaglutinina de virus de influenza y vesículas de lípido, en donde las vesículas de lípido consisten de lípidos que están presentes en la composición en una cantidad que obtiene u a proporción en peso de lipidos: antigeno de por lo menos alrededor de 30:1, los lipidos incluyen un surfactante no ionio y el contenido de humedad de la composición es menor de alrededor del 2% en peso.

7. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque la proporción en peso de lipidos: antigeno es de por lo menos alrededor de 100:1.

8. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque la proporción en peso de lipidos: antigeno es de por lo menos alrededor de 200:1.

9. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque la proporción en peso de lipidos: antigeno es de por lo menos alrededor de 250:1.

10. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque la proporción en peso de lipidos: antigeno es de por lo menos alrededor de 350:1.

11. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque la proporción en peso de lipidos: antigeno está en un intervalo de alrededor de 250:1 a alrededor de 350:1.

12. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque la proporción en peso de lipidos: antigeno es de alrededor de 300:1.

13. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizada porque la composición exhibe menos del 50% de cambio en inmunogenicidad, tal como se determina mediante un análisis de HAI cuando es almacenada por 6 meses a 40°C.

14. La composición de la reivindicación 13, caracterizada porque la composición exhibe menos de 10% de carga en cambio en inmunogenicidad.

15. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizada porque la composición exhibe menos del 50% de pérdida de contenido de antigeno, tal como se determina mediante un ELISA cuando es almacenada por 6 meses a 40°C.

16. La composición de la reivindicación 15, caracterizada porque la composición exhibe menos del 10% de pérdida de contenido de antigeno.

1 . La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-16, caracterizada porque la composición es más estable cuando es almacenada por 6 meses a 40°C que una composición de referencia que carece de vesículas de lípido.

18. La composición de la reivindicación 17, caracterizada porque la estabilidad está basada en la inmunogenicidad tal como se determina mediante un análisis de HAI.

19. La composición de la reivindicación 17, caracterizada porque la estabilidad está basada en el contenido de antigeno tal como se determina mediante un análisis de ELISA.

20. Una composición inmunogénica que comprenden un antigeno de hemaglutinina de virus de influenza y vesículas de lípido, caracterizada porque las vesículas de lípido consisten de lípidos que incluyen un surfactante no iónico la composición exhibe menos del 50% de cambio en inmunogenicidad tal como se determina mediante un análisis de HAI cuando es almacenada por 6 meses a 40°C.

21. La composición de la reivindicación 20, caracterizada porque la composición exhibe menos del 10% de cambio en inmunogenicidad.

22. Una composición inmunogénica que comprenden un antígeno de hemaglutinina de virus de influenza y vesículas de lípido, caracterizada porque las vesículas de lípido consisten de lípidos que incluyen un surfactante no iónico y la composición exhibe menos del 50% de pérdida de contenido de antígeno tal como se determina mediante un análisis de ELISA cuando es almacenada por 6 meses a 40°C.

23. La composición de la reivindicación 22, caracterizada porque la composición exhibe menos del 10% de pérdida de contenido de antígeno.

24. Una composición inmunogénica que comprenden un antígeno de hemaglutinina de virus de influenza y vesículas de lípido, caracterizada porque las vesículas de lípido consisten de lípidos que incluyen un surfactante no iónico y la composición es más estable cuando es almacenada por 6 meses a 40°C que una composición de referencia que carece de las vesículas de lípido.

25. La composición de la reivindicación 24, caracterizada porque la estabilidad esta basada en la inmunogenicidad tal como se determina mediante un análisis de HAI .

26. La composición de la reivindicación 24, caracterizada porque la estabilidad está basada en el contenido de antígeno tal como se determina mediante un análisis de ELISA.

27. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizada porque la composición es preparada mediante un método que incluye: fundir los lípidos para producir los lípidos fundidos; combinar los lípidos fundidos con una solución acuosa que incluye el antígeno de hemaglutinina de virus de influenza y homogeneizar el producto resultante, en donde los lípidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas que obtienen una proporción en peso de lípido: antígeno de por lo menos alrededor de 50:1 en el producto resultante.

28. La composición de la reivindicación 27, caracterizada porque los lípidos son agregados a la solución acuosa que incluye e antigeno de hemaglutinina de virus de influenza .

29. La composición de la reivindicación 27, caracterizada porque la solución acuosa que incluye el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza es agregada a los lipidos fundidos.

30. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-29, caracterizada porque' la composición es preparada mediante un método que incluye: fundir los lipidos para producir lipidos fundidos; combinar los lipidos fundidos con una solución acuosa que incluye el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza y homogeneizar el producto resultante, en donde los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades y volúmenes relativos que obtienen una concentración de lipido de por lo menos alrededor de 10 mg/ml en el producto resultante.

31. La composición de la reivindicación 30, caracterizad porque los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades y volúmenes relativos que obtienen una concentración de lipidos en un intervalo de alrededor de 10 mg/ml alrededor de 100 mg/ml en el producto resultante.

32. Una composición que comprende un antigeno de hemaglutinina de virus de influenza y vesículas de lipido, caracterizada porque las vesículas de lípido consisten de lipidos que incluye un surfactante no iónico y la composición es preparada mediante un método que incluye: fundir los lipidos para producir lipidos fundidos; combinar los lipidos fundidos con una solución acuosa que incluye el antígeno de hemáglutinina de virus de influenza y homogeneizar el producto resultante, en donde los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas que obtienen una proporción en peso de lípido: antígeno de por lo menos alrededor de 50:1 en el producto resultante.

33. La composición de la reivindicación 32, caracterizada porque los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas que obtienen una proporción en peso de lípido: antígeno de por lo menos alrededor de 100:1 en el producto resultante.

34. La composición de la reivindicación 32, caracterizada porque los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas que obtienen una proporción en peso de lípido: antígeno de por lo menos alrededor de 200:1 en el producto resultante.

35. La composición de la reivindicación 32, caracterizada porque los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas que obtienen una proporción en peso de lipido: antigeno de por lo menos alrededor de 250:1 en el producto resultante.

36. La composición de la reivindicación 32, caracterizada porque los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas que obtienen una proporción en peso de lipido: antigeno de por lo menos alrededor de 300:1 en el producto resultante.

37. La composición de la reivindicación 32, caracterizada porque los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas que obtienen una proporción en peso de lipido: antigeno de por lo menos alrededor de 350:1 en el producto resultante.

38. La composición de la reivindicación 32, caracterizada porque los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas que obtienen una proporción en peso de lipido: antigeno en un intervalo de alrededor de 250:1 a alrededor de 350:1 en el producto resultante .

39. La composición de la reivindicación 32, caracterizada porque los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas que obtienen una proporción en peso de lipido: antigeno de alrededor de 300:1 en el producto resultante.

40. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 32-39, caracterizada porque los lipidos fundidos son agregados a la solución acuosa que incluye el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza. .

41. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 32-39, caracterizada porque la solución acuosa que incluye el antígeno de hemaglutinina de virus de influenza es agregada a los lipidos fundidos.

42. Una composición que comprende un antigeno de hemaglutinina de virus de influenza y vesículas de lípido, caracterizada por que las vesículas de lípido consisten de lipidos que incluyen un surfactante no iónico y la composición es preparada mediante un método que incluye: fundir los lipidos para producir lipidos fundidos; combinar los lipidos fundidos con una solución acuosa que incluye el antígeno de hemaglutinina de virus de influenza y homogeneizar el producto resultante, en donde los lipidos fundidos y la solución acuosa son agregados en cantidades y volúmenes relativos que obtienen una concentración de lípido de por lo menos alrededor de 10 mg/ml en el producto resultante.

43. La composición de la reivindicación 42, caracterizada porque los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades y volúmenes relativos que obtienen una concentración de lipidos en un intervalo de alrededor de 10 mg/ml alrededor de 100 mg/ml en el producto resultante .

44. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 42-43, caracterizada porque los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas que obtienen una proporción en peso de lipido: antigeno de por lo menos alrededor de 50:1 en el producto resultante.

45. La composición de la reivindicación 4, caracterizada porque los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas que obtienen una proporción en peso de lipido: antigeno de por lo menos alrededor de 100:1 en el producto resultante.

46. La composición de la reivindicación 44, caracterizada porque los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas que obtienen una proporción en peso de lipido: antigeno de por lo menos alrededor de 200:1 en el producto resultante.

47. La composición de la reivindicación 44, caracterizada porque los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas que obtienen una proporción en peso de lipido: antigeno de por lo menos alrededor de 250:1 en el producto resultante.

48. La composición de la reivindicación 44, caracterizada porque los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas que obtienen una proporción en peso de lipido: antigeno de por lo menos alrededor de 400:1 en el producto resultante.

49. La composición de la reivindicación 44, caracterizada porque los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas que obtienen una proporción en peso de lipido: antígeno de por lo menos alrededor de 350:1 en el producto resultante.

50. La composición de la reivindicación 44, caracterizada porque los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas que obtienen una proporción en peso de lipido: antigeno en un intervalo de alrededor de 250:1 a alrededor de 350:1 en el producto resultante .

51. La composición de la reivindicación 44, caracterizado porque los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas que obtienen una proporción en peso de lipido: antigeno de alrededor de 300:1 en el producto resultante.

52. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 42-51, caracterizada porque los lipidos fundidos son agregados a la solución acuosa que incluye el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza.

53. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 42-51, caracterizada porque la solución acuosa que incluye el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza es agregada a los lipidos fundidos.

5 . La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-53, caracterizada porque el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza es de una cepa H1N1 de influenza A.

55. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-53, caracterizada porque el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza es de una cepa H3NA de influenza A.

56. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-53, caracterizada porque el antigeno de hemaglutinina de virus de in-fluenza es de una cepa de influenza B.

57. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-53, caracterizada porque el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza es de dos o más de una cepa de H1N1 de influenza A, una cepa H3N2 de influenza A y una cepa de influenza B.

58. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-53, caracterizada porque el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza es de una cepa H1N1 de influenza A, una influenza H3N2 de influenza A y una cepa de influenza B.

59. La composición de la reivindicación 58, caracterizada porque la composición comprende cantidades aproximadamente iguales de antigeno de hemaglutinina de virus de influenza de cada cepa.

60. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-59, caracterizada porque la composición comprende uno o más virus de influenza desactivados que incluyen el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza.

61. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-59, caracterizada porque la composición comprende uno o más virus de influenza atenuados que incluyen el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza.

62. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-59, caracterizada porque el antigeno de hemaglutinina e virus de influenza está presente en la composición como un antigeno de virus dividido.

63. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-59, caracterizada porque el antigeno de hemaglutinina e virus de influenza está presente en la composición como un antigeno de subunidad.

64. La composición de cualquier de las reivindicaciones 1-63, caracterizada porque el surfactante no iónico es un surfactante éster-enlazado .

65. La composición de la reivindicación 64, caracterizada porque el surfactante no iónico es un éster de glicerol .

66. La composición de la reivindicación 64, caracterizada porque el surfactante no iónico es 1-monopalmitoil glicerol.

67. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-63, caracterizada porque el surfactante no iónico es un surfactante éter-enlazado.

68. La composición de la reivindicación 64, caracterizada porque el surfactante no iónico es mono éter de glicol o glicerol.

69. La composición de la reivindicación 67, caracterizada porque el surfactante no iónico es 1-monoceril glicerol éter o diglicolcetil éter.

70. La composición de. cualquiera de las reivindicaciones 1-69, caracterizada porque los lipidos comprenden además un anfifilico iónico.

71. La composición de la reivindicación 70, caracterizada porque el anfifilico iónico es dicetil fosfato.

72. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-71, caracterizada porque los lipidos comprenden además un esteroide .

73. La composición de la reivindicación 72, caracterizada porque el esteroide es colesterol.

74. la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-73, caracterizada porque los lipidos comprenden un surfactante no iónico, un anfifilico iónico y un esteroide.

75. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-73, caracterizada porque los lipidos comprenden 1-monopalmtoil glicerol, dicetilfosfato y colesterol.

76. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-75, caracterizada porque por lo menos una porción del antigeno de hemaglutinina de virus de influenza presente en la composición está asociada con las vesículas de lípido.

77. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-75, caracterizada porque por lo menos una porción del antigeno de hemaglutinina de virus de influenza presente en la composición está atrapada dentro de las vesículas de lípido .

78. La composición de 'cualquiera de las reivindicaciones 1-77, caracterizada porque la composición comprende además un adyuvante .

79. La composición de la reivindicación 78, caracterizada porque el adyuvante comprende un agonista de TLR- .

80. La composición de la reivindicación 79, caracterizada porque el adyuvante comprende un derivado de lípido A atenuado.

81. La composición de la reivindicación 79, caracterizada porque el adyuvante comprende un derivado de monofosforilo de lípido A.

82. La composición de la reivindicación 79, caracterizado porque el adyuvante comprende un derivado de 3-diacil monofosforilo de lípido A.

83. La composición de la reivindicación 78, caracterizada porque el adyuvante comprende un agonista de TLR-7/8.

84. La composición de la reivindicación 78, caracterizada porque el adyuvante comprende un agonista de TLR-9.

85. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 77-84, caracterizada porque por lo menos una porción del adyuvante presente en la composición está asociado con las vesículas de lípido.

86. La composición' de cualquiera de las reivindicaciones 78-84, caracterizada porque por lo menos una porción del adyuvante presente en la composición no está asociada con las vesículas de lípido.

87. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 78-84, caracterizada porque la composición es preparada mediante un método que comprende: fundir los lipidos para producir lipidos fundidos; combinar los lipidos fundidos con una solución acuosa que incluye el antígeno de hemaglutinina de virus de influenza y homogeneizar el producto resultante, . en donde el adyuvante es fundidos con los lipidos.

88. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 78-84, caracterizado porque la composición es preparada mediante un método que comprende: fundir los lipidos para producir lipidos fundidos; combinar los lipidos fundidos con una solución acuosa que incluye el antígeno de hemaglutinina de virus de influenza y homogeneizar el producto resultante, en donde el adyuvante es combinado con los lipidos fundidos y la solución acuosa que incluye el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza.

89. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 78-84, caracterizada porque la composición es preparada mediante un método que comprende: fundir los lipidos para producir lipidos fundidos; combinar los lipidos fundidos con una solución acuosa que incluye el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza y homogeneizar y luego secar el producto resultante, en donde el adyuvante es agregado al producto resultante antes del secado.

90. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-89, caracterizada porque la composición es preparada mediante un método que no involucra almacenar la composición bajo, condiciones de temperatura controladas.

91. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-89, caracterizada porque la composición es preparada mediante un método que involucro almacenar la composición a una temperatura que excede por lo menos temporalmente de 8°C.

92. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-89, caracterizada porque la composición fue preparada mediante un método que involucro almacenar la composición a una temperatura que excede por lo menos temporalmente de 15°C.

93. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-89, caracterizada porque la composición fue preparada mediante un método que involucro almacenar la composición a una temperatura que excede por lo menos temporalmente de 20°C.

94. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-89, caracterizada porque . la composición fue preparada mediante un método que involucro almacenar la composición a una temperatura que excede por lo menos temporalmente de 25°C.

95. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-94, caracterizada porque la composición fue preparada mediante un método que involucro almacenar la composición en forma seca.

96. Un método de tratamiento de un sujeto que sufre de o está en riesgo de una infección de influenza, el método está caracterizado porque comprende: proveer una composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-95 en forma seca; rehidratar la composición y administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición rehidratada.

97. El método de la reivindicación 96, caracterizada porque la composición rehidratada es administrada mediante inyección intramuscular.

98. Un método para la preparación de una composición que comprende un antigeno de hemaglutinina de virus de influenza y vesículas de lípido, en donde las vesículas de lípido consisten de lipidos que incluyen un surfactante no iónico, el método está caracterizado porque comprende: fundir los lipidos para producir lipidos fundidos; combinar los lipidos fundidos con una solución acuosa que incluye el antígeno de hemaglutinina de virus de influenza y homogeneizar el producto resultante, en donde los lipidos fundidos y la solución acuosa son - combinados en cantidades relativas que obtienen una proporción en peso de lípido: antígeno de por lo menos alrededor de 50:1 en el producto resultante.

99. El método de la reivindicación 98, caracterizado porque los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas que obtienen una proporción en peso de lípido: antígeno de por lo menos alrededor de 100:1 en el producto resultante.

100. El método de la reivindicación 98, caracterizado porque los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas que obtienen una proporción en peso de lípido: antigeno de por lo menos alrededor de 200:1 en el producto resultante.

101. El método de la reivindicación 98, caracterizado porque los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas que obtienen una proporción en peso de lipido: antigeno de por lo menos alrededor de 250:1 en el producto resultante.

102. El método de la reivindicación 98, caracterizado porque los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas que obtienen una proporción en peso de lípido: antígeno de por lo menos alrededor de 400:1 en el producto resultante.

103. El método de la reivindicación 98, caracterizado porque los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas que obtienen una proporción en peso de lípido: antígeno de por lo menos alrededor de 350:1 en el producto resultante.

104. El método de la reivindicación 98, caracterizado porque los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas que obtienen una proporción en peso de lípido: antígeno en un intervalo de alrededor de 250:1 a alrededor de 350:1 en el producto resultante .

105. El método de la reivindicación 98, caracterizado porque los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas que obtienen una proporción en peso de lipido: antiqeno de alrededor de 300:1 en el producto resultante.

106. El método de cualquiera de las reivindicaciones 98-105, caracterizado porque los lipidos fundidos son agregados a la solución acuosa que incluye el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza.

107. El método de cualquiera de las reivindicaciones 98-105, caracterizado porque la solución acuosa que incluye el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza es agregada a los lipidos fundidos.

108. Un método para la preparación de una composición que comprende un antigeno de hemaglutinina dé virus de influenza y vesículas de lipido, en donde las vesículas de lipido consisten de lípidos que incluyen un surfactante no iónico, el método está caracterizado porque comprende: fundir los lípidos para producir lípidos fundidos; combinar los lípidos , fundidos con una solución acuosa que incluye el antígeno de hemaglutinina de virus de influenza y homogeneizar el producto resultante, en donde los lípidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades y volúmenes relativos que obtienen una concentración en peso de lipido: antígeno de por lo menos alrededor de 10 mg/ml en el producto resultante.

109. El método de la reivindicación 108, caracterizado porque los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades y volúmenes relativos que obtienen una concentración de lipido en un intervalo de alrededor de 10 mg/ml a alrededor de 10 mg/ml en el producto resultante.

110. El método de cualquiera de las reivindicaciones 108-109, caracterizado porque los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas que obtienen una proporción en peso de lipido: antigeno de por lo menos alrededor de 50:1 en el producto resultante.

111. El método de la reivindicación 110, caracterizado porque los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas que obtienen una proporción en peso de lipido: antigeno de por lo menos alrededor de 100:1 en el producto resultante.

112. El método de la reivindicación 110, caracterizado porque los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas que obtienen una proporción en peso de lipido: antigeno de por lo menos alrededor de 200:1 en el producto resultante.

113. El método de la reivindicación 108, caracterizado porque los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas que obtienen una proporción en peso de lipido: antigeno de por lo menos alrededor de 250:1 en el producto resultante.

114. El método de la reivindicación 110, caracterizado porque los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas que obtienen una proporción en peso de lípido: antígeno de por lo menos alrededor de 400:1 en el producto resultante.

115. El método de la reivindicación 110, caracterizado porque los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas que obtienen una proporción en peso de lipido: antigeno de por lo menos alrededor de 350:1 en el producto resultante.

116. El método de la reivindicación 110, caracterizado porque los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas que obtienen una proporción en peso de lipido: antigeno en un intervalo de alrededor de 250:1 a alrededor de 350:1 en el producto , resultante .

117. El método de la reivindicación 110, caracterizado porque los lipidos fundidos y la solución acuosa son combinados en cantidades relativas que obtienen una proporción en peso de lipido: antigeno de alrededor de 300:1 en el producto resultante.

118. El método de cualquiera de las reivindicaciones 108-117, caracterizado porque los lipidos fundidos son agregados a la solución acuosa que incluye antigeno de hemaglutinina de virus de influenza.

119. El método de cualquiera de las reivindicaciones 108-117, caracterizado porque la solución acuosa que incluye el antigeno de hemaglutinina de virus de influenza es agregada a los lipidos fundidos.