KR20120128162A - 인플루엔자 백신 조성물의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
인플루엔자 백신으로서 적합한, 란 및 숙주 세포 내의 인플루엔자 바이러스, 예를 들어, ca 인플루엔자 B 균주를 최적화하고 생산하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다.
Description
매년 많은 사람이 다른 균주 및 종류의 인플루엔자 바이러스에 감염되기 때문에, 인플루엔자의 다양하고 진화된 균주에 대한 백신은 공중 보건의 관점에서뿐만 아니라, 상업적으로도 중요하다. 유아, 노인, 적절한 건강 관리를 받지 못하는 사람 및 면역력이 약화된 사람은 특히 이러한 감염에 의하여 죽음에 이를 수도 있는 위험이 있다. 인플루엔자 감염의 문제를 복잡하게 하는 것은 신종 인플루엔자 균주가 빨리 진화되어, 새로운 백신의 계속적인 생산을 불가피하게 한다는 것이다.
이러한 다양한 인플루엔자 바이러스에 특수한 보호 면역 반응을 일으킬 수 있는 다양한 백신이 50년 이상 제조되어 왔고, 예를 들어, 전(whole) 바이러스 백신, 분할(split) 바이러스 백신, 표면 항원 백신 및 약독화 바이러스 생백신을 포함한다. 그러나, 이러한 백신 종류 중의 적절한 제제가 전신 면역 반응을 일으킬 수 있는데 반해, 약독화 바이러스 생백신은 기도 국소 점막 면역도 자극할 수 있다는 이점이 있다. 따라서 빠르고 경제적으로 제조가능하고 쉽게 보관/수송이 가능한, 약독화 생바이러스를 포함하는 백신이 매우 바람직하다. 또한 바람직한 것은, 이러한 바이러스의 제조를 증가시켜, 이에 따라 이러한 바이러스용 백신, 특히 전통적 방법을 사용하여 제조 및/또는 상업적으로 생산을 위한 스케일업이 어렵다고 알려진 바이러스 균주용 백신의 제조를 증가시키는 방법일 것이다.
현재까지, 미국 내의 모든 상업적으로 이용가능한 인플루엔자 백신은 닭의 유정란(embroynated hen egg)에서 증식시켜왔다. 많은 인플루엔자 바이러스 균주가 닭의 란(egg)에서 잘 자라지만, 백신의 생성은 이러한 란의 유효성에 의존한다. 란의 공급이 유기적이어야 하고, 백신 제조용 균주가 다음 독감 시즌에 몇 달 앞서 선택되어야 하기 때문에, 이러한 접근의 유연성이 제한될 수 있고, 종종 제조 및 공급이 늦어지고, 부족해질 수 있다. 또한, 다양한 인플루엔자 바이러스 균주는 다른 인플루엔자 균주처럼 란에서 잘 자라지 못한다(예를 들어, 높은 역가(titer)로 제조되지 않음). 따라서, 예를 들어, 이러한 바이러스, 및 이에 따른 백신의 바람직한 균주의 제조를 증가시키는 방법이 매우 바람직하다.
세포 배양에서 인플루엔자 바이러스를 제조하기 위한 시스템이 최근 개발되었다(예를 들어, Furminger. Vaccine Production, in Nicholson et al.(eds.) Textbook of Influenza pp. 324-332; Merten et al.(1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation, in Cohen & Shafferman(eds.) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines pp. 141-151 참조). 그러나, 이러한 시스템 역시 란 내에서의 제조 또는 스케일업을 필요로 하여, 마찬가지로 생산성 문제(특히 특정 균주에 대한)에 접하게 된다. 따라서, 이러한 시스템 내에서 바이러스/백신 제조를 증가시키는 방법이 역시 매우 바람직하다.
백신 제조용 인플루엔자 바이러스의 제조에 있어서 괄목할 만한 업적은 본 발명자 및 공동 연구자에 의해 이루어졌다; 예를 들어, PCT 공개 WO 03/091401, WO 05/014862, 및 2005년 5월 20일에 출원된 PCT 특허출원 PCT/US05/017734, 및 2005년 10월 4일에 출원된 PCT/US05/035614 참조. 본 발명은 백신 조성물 제조용 인플루엔자 바이러스 및 바이러스 조성물의 제조를 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 양상은 닭의 란 내에서의 바이러스 증식 단계를 포함하고, 또한 하기내용을 참조하여 명백해질 많은 다른 이점을 포함하는, 일반적인 닭의 란 및 새로운 세포 배양 백신 제조 방식(또한 혼합된 시스템)에 적용할 수 있다.
본 발명은 인플루엔자 바이러스 게놈 또는 부분적 게놈을 포함하거나 인코딩하는 다수의 벡터(예를 들어, 플라스미드, 바이러스 등, 하기 참조)를 하나 이상의 숙주 란 또는 다른 숙주 세포(예를 들어, MDCK 및 Vero)에 도입하고, 숙주 란 또는 다른 숙주 세포(예를 들어, MDCK 및 Vero)를 33℃ 미만의 온도에서 배양하고; 그리고 숙주 란 또는 다른 숙주 세포(예를 들어, MDCK 및 Vero)로부터 인플루엔자 바이러스 입자를 회수함으로써 인플루엔자 바이러스 입자를 제조하는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 숙주 세포(예를 들어, MDCK 또는 Vero 세포의 연속적 세포 배양) 또는 유정란 내에서 상기 바이러스 입자를 33℃ 미만(예를 들어, 31℃)의 온도에서 배양하는 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스 입자의 수율 증 방법을 포함한다. 어떤 구체예에서는, 33℃ 미만의 온도에서 제조된 바이러스 입자의 log10 TCID50/mL 역가는 33℃에서 제조된 같은 바이러스 입자의 것보다 더 크다. 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 인플루엔자 바이러스(예를 들어, 유전자 재배열(reassortant) 바이러스)를 인플루엔자 바이러스의 복제를 보조할 수 있는 하나 이상의 유정란에 도입하여, 상기 유정란을 감염시키는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 인플루엔자 바이러스(예를 들어, 유전자 재배열 바이러스)를 인플루엔자 바이러스의 복제를 보조할 수 있는 하나 이상의 숙주 세포(예를 들어, MDCK 및 Vero)에 도입하여, 상기 숙주 세포를 감염시키는 단계를 포함한다. 제조된 바이러스는 인플루엔자 B 균주 바이러스, 약독화 인플루엔자 바이러스, 추위적응 인플루엔자 바이러스, 온도민감성 인플루엔자 바이러스, 약독화 추위적응 온도민감성 인플루엔자 바이러스, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 일부 구체예에서, 바이러스는 PR8 백본(backbone)을 포함하는 반면, 다른 구체예에서는, 바이러스는 Ann Arbor B 균주 인플루엔자 백본, B/Leningrad/14/17/55 백본, B/14/5/1, B/USSR/60/69 백본, B/Leningrad/179/86 백본, B/Leningrad/14/55 백본, 또는 B/England/2608/76 백본을 포함한다. 다른 구체예에서는, 바이러스는 ca B/Jilin/20/03이다. 어떤 구체예에서는, 상기 란은 닭의 SPF 란이다. 어떤 구체예에서는, 숙주 세포는 MDCK 세포이다. 또한, 어떤 구체예에서는, 33℃ 미만의 배양은 29℃ 내지 33℃, 또는 31℃ 내지 33℃, 또는 31℃ 내지 32℃, 또는 31℃에서의 란 또는 다른 숙주 세포(예를 들어, MDCK 및 Vero)의 배양을 포함한다.
다른 양상에서 본 발명은 상기한 방법으로 제조된 인플루엔자 바이러스뿐만 아니라, 이러한 바이러스를 포함하는 조성물 및 이러한 바이러스를 포함하는 인플루엔자 백신(예를 들어, 액체 약독화 비강내 생백신)을 포함한다. 본 발명을 통해 배양가능한 이러한 바이러스는 예를 들어, CAIV(추위적응 인플루엔자 바이러스, 예를 들어, 3가 제제), PCT 공개 WO 05/014862의 것과 같은 바이러스, 예를 들어, PCT 공개 WO 01/183794, WO 00/60050, US특허 6,544,785 및 US특허 6,649,372에 개시된 것과 같은 바이러스, 뿐만 아니라 다른 유사한 또한 관련된 바이러스 및 바이러스 종류를 선택적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 이러한 목적 및 다른 목적 및 특징은 하기 상세한 설명을 첨부하는 도면 및 청구항과 함께 파악할 때 더욱 명확해질 것이다.
도 1: 2차 배양 온도의 함수로서 ca B 균주의 바이러스 수율(TCID50/mL)을 보여주는 표를 나타냄.
도 2: 2차 배양 온도의 함수로서 ca B 균주의 수율(TCID50/mL) 그래프를 보여줌.
도 3: 2차 배양 온도의 함수로서 ca B/Jilin/20/03의 바이러스 수율(TCID50/mL)을 보여주는 표를 나타냄.
도 4: 29℃ 내지 33℃의 온도에서 배양된 란에서 성장한 경우, ca 및 ts 표현형의 특징을 발현하는 다양한 ca 인플루엔자 B 균주의 표현형의 표를 나타냄.
도 5: 다양한 온도에서 배양되고 감염 후 72 시간에 회수된, 감염된 란으로부터의 요막강액(allantoic fluid)의 HA 역가를 보여주는 표를 나타냄.
도 6: 다양한 온도에서 배양된 감염된 란의 요막강액 내의 HA 바이러스 RNA의 양을 보여주는 표를 나타냄.
도 7: 복제수(copy number)에서 감염성 입자의 양(1og10 TCID50)을 빼서 계산된 감염성 바이러스에 대한 게놈 복제 비율을 보여주는 표를 나타냄.
도 8: 31℃ 및 33℃에서 성장한 경우, ca B/Jilin/20/03 및 ca B/Ann Arbor/1/94의 감염성 입자의 퍼센트를 보여주는 표를 나타냄.
도 9: 상응하는 MVS와 비교하여, 33℃(1 Lot) 및 31℃(2 Lots)에서 성장한 ca B/Jilin/20/03의 뉴클레오티드 서열을 보여주는 표를 나타냄.
도 10: wt B/Jilin/20/03에 대해 제조된 항혈청에 관하여, 2가지 온도에서 배양된 바이러스의 HAI 역가를 비교한 표를 나타냄.
도 11: 31℃ 또는 33℃에서 성장한 ca B/Jilin/20/03 바이러스로 비강내 접종 후, 페렛(ferret) 내의 바이러스 복제를 설명한 그래프를 나타냄.
도 12: 31℃ 또는 33℃에서 성장한 ca B/Jilin/20/03로 면역화한 페렛으로부터 14일째 혈청의 HAI 역가를 비교한 표를 나타냄.
도 13: 여러 제2차 배양 온도에서, SPF 란 내에서 31℃ 및 33℃에서 성장한 ca B/Jilin/20/03의 제2 계대를 설명한 그래프를 보여줌.
도 2: 2차 배양 온도의 함수로서 ca B 균주의 수율(TCID50/mL) 그래프를 보여줌.
도 3: 2차 배양 온도의 함수로서 ca B/Jilin/20/03의 바이러스 수율(TCID50/mL)을 보여주는 표를 나타냄.
도 4: 29℃ 내지 33℃의 온도에서 배양된 란에서 성장한 경우, ca 및 ts 표현형의 특징을 발현하는 다양한 ca 인플루엔자 B 균주의 표현형의 표를 나타냄.
도 5: 다양한 온도에서 배양되고 감염 후 72 시간에 회수된, 감염된 란으로부터의 요막강액(allantoic fluid)의 HA 역가를 보여주는 표를 나타냄.
도 6: 다양한 온도에서 배양된 감염된 란의 요막강액 내의 HA 바이러스 RNA의 양을 보여주는 표를 나타냄.
도 7: 복제수(copy number)에서 감염성 입자의 양(1og10 TCID50)을 빼서 계산된 감염성 바이러스에 대한 게놈 복제 비율을 보여주는 표를 나타냄.
도 8: 31℃ 및 33℃에서 성장한 경우, ca B/Jilin/20/03 및 ca B/Ann Arbor/1/94의 감염성 입자의 퍼센트를 보여주는 표를 나타냄.
도 9: 상응하는 MVS와 비교하여, 33℃(1 Lot) 및 31℃(2 Lots)에서 성장한 ca B/Jilin/20/03의 뉴클레오티드 서열을 보여주는 표를 나타냄.
도 10: wt B/Jilin/20/03에 대해 제조된 항혈청에 관하여, 2가지 온도에서 배양된 바이러스의 HAI 역가를 비교한 표를 나타냄.
도 11: 31℃ 또는 33℃에서 성장한 ca B/Jilin/20/03 바이러스로 비강내 접종 후, 페렛(ferret) 내의 바이러스 복제를 설명한 그래프를 나타냄.
도 12: 31℃ 또는 33℃에서 성장한 ca B/Jilin/20/03로 면역화한 페렛으로부터 14일째 혈청의 HAI 역가를 비교한 표를 나타냄.
도 13: 여러 제2차 배양 온도에서, SPF 란 내에서 31℃ 및 33℃에서 성장한 ca B/Jilin/20/03의 제2 계대를 설명한 그래프를 보여줌.
본 발명은 FluMist?를 포함하나, 이에 한정되지는 않는 백신 제조에 적절한 바이러스, 더욱 특히 추위적응 인플루엔자 B 바이러스 균주의 제조를 증가시키는 방법을 포함한다. 포함되는 것은 예를 들어, 접종 후에, 란 내에서 배양(예를 들어, 란 내에서 2차 배양) 또는 다른 숙주 세포(예를 들어, MDCK 및 Vero) 내에서 배양하는 동안 낮은 온도에서 바이러스 균주를 성장시키는 방법이다. 추가적인 특징은 본 명세서에서 더욱 자세히 기술한다.
본 명세서의 일반적인 구체예가 당업계에서 공지된 단계/방법/조성물, 예를 들어, 란의 캔들링(candling), 바이러스로 란을 접종하는 것 등을 또한 포함한다는 것은 당업자에 의해 인식 가능할 것이다. 따라서, 당업자는 이러한 공지된 단계에 적절한 조건, 하위 단계, 단계의 세부사항 등을 결정하여, 적절한 바이러스, 바이러스 용액, 조성물을 제조할 수 있다. 각각의 단계는 이하에서 더 자세히 기재한다.
바이러스/바이러스 제조를 위한 본 명세서의 다양한 단계가 모두 수행되거나 동일한 제조 순서로 이루어질 필요가 없다는 것은 당업자에 의해 인식 가능할 것이다. 따라서, 몇몇 구체예에서는, 본 명세서에서 언급된 모든 단계 및/또는 조성물이 수행되거나 존재하지만, 다른 구체예에서는, 하나 이상의 단계가 선택적으로, 예를 들어, 생략되거나, (영역, 순서, 위치 등이) 변화된다.
추위적응 인플루엔자 B 균주의 제조
백신 제제로 사용하고자하는, B/Jilin/20/03 균주와 같은 임의의 추위적응(ca) 인플루엔자 B 균주의 총 수율은 33℃에서 현재까지 승인된 2차 배양의 제조 조건에 따라 배양되는 경우, 때때로 원하는 수의 인플루엔자 백신 용량을 적절히 제조하기에 불충분하다. 본 발명은 이러한 균주의 수율을 증가시켜, 백신용 바이러스 제조의 증가를 가져오는, 33℃ 보다는 33℃ 미만의 온도, 예를 들어, 31℃(또는 선택적으로 약 29℃ 내지 약 32℃)에서의 란 또는 다른 숙주 세포(예를 들어, MDCK 및 Vero)의 배양 방법을 포함한다. 이러한 란 또는 다른 숙주 세포(예를 들어, MDCK 및 Vero) 배양은 감염 전에 세포를 증식하기 위해 사용되는, 더 높은 온도에서 란 또는 숙주 세포의 배를 발생시키는데 사용되는 37℃에서의 란의 1차 배양과 구별하기 위해서, 본 명세서에서 "2차" 배양으로 선택적으로 기술된다. 본 명세서의 실시예는 31℃ 및 33℃에서 성장한 B/Jilin/20/03 균주, 및 다른 ca 인플루엔자 B 균주의 특징과 비교하고, 31℃에서 성장한 바이러스가 33℃에서 성장한 바이러스와 생물학적으로 구별되는 특징이 없음을 나타낸다.
본 명세서의 실시예에서 포함하고 있는 데이터는 33℃ 미만의 온도(예를 들어, 31℃)에서 ca B/Jilin/20/03의 더 높은 수율이 B/Jilin/20/03 균주에만 독특한 것이 아님을 나타낸다. 백신의 중요한 시도에서 명백한 효과를 보인 ca B/Ann Arbor/1/94를 포함하여, 시험된 모든 다른 ca 인플루엔자 B 균주 역시 33℃ 미만의 온도에서 더 효율적으로 복제되었다. 또한, 본 명세서의 실시예는 33℃ 및 31℃에서 성장한 바이러스로부터의 ca B/Jilin/20/03 백신의 자세한 특성을 보여주고, 2가지 백신이 검토된 특성에 있어서 서로 동등함을 강조한다. 실제로, 33℃ 미만의 온도, 예를 들어, 31℃에서 성장한 ca B 바이러스 백신 균주의 물리학적 및 생물학적 특성은 인간에게 사용되거나 시험되는 33℃에서 성장한 다른 ca 인플루엔자 B 균주의 것과 동등하다. 이하를 참조한다.
본 명세서의 실시예에 개시된 공통점 및 특성 결과는 33℃ 미만의 온도(일반적으로 29℃ 내지 32℃의 최적 온도로)에서 성장한 경우, 란 내에서의 ca B/Jilin/20/03 및 다른 7가지 ca 인플루엔자 B 균주의 성장 곡선이 모두 높은 역가의 바이러스를 생성함을 나타낸다. 또한, 낮은 온도에서의 성장은 백신의 생물학적 특징을 부정적으로 변화시키지 않았다. 따라서, 원래 29℃, 31℃, 또는 33℃의 어느 온도에서 성장하든지 간에, ca B/Jilin/20/03를 포함하는 다른 ca 인플루엔자 B 백신 균주는 ca 및 온도민감성(ts) 표현형의 특징을 나타냈다. 또한, 감염성 입자에 대한 총 입자의 총 비율은 ca B/Jilin/20/03를 포함하는 다른 균주 간에 유사하였고, 31℃ 및 33℃간에 동등하였다. 총 입자의 양은 정량적 RT-PCR로 게놈 복제수를 측정함으로써 결정하였다. 또한, ca B/Jilin/20/03 총 입자는 투과 전자 현미경으로 측정되었다. 또한, 본 명세서의 실시예는 시퀀싱한 경우, 31℃ 또는 33℃에서 성장한 ca B/Jilin/20/03의 게놈이 서로 동일할 뿐만 아니라, 마스터 바이러스 시드(MVS)와도 동일하다는 것과, 적혈구 응집반응 억제(HAI) 측정법에서 나타내듯, 31℃ 또는 33℃에서 성장한 ca B/Jilin/20/03의 항원성이 실질적으로 동일하다는 것을 나타낸다. 본 명세서의 실시예는 31℃ 또는 33℃에서 성장한 ca B/Jilin/20/03의 란 내에서의 복제가 시간 및 최적화 온도와 관련하여 동등하다는 것과, 또한 31℃ 또는 33℃에서 성장한 ca B/Jilin/20/03의 페렛의 비인두 내의 복제 역시 동등하다는 것을 보여준다. 또한, 본 명세서의 실시예에서와 같이, ca B/Jilin/20/03의 항원성은 31℃ 또는 33℃에서 성장되든지 간에 동등하다. 예를 들어, 페렛의 군을 이러한 2가지 제제로 면역화하고, 면역화 14일 후에 동물의 HAI 역가를 측정하였다. 이러한 2군의 동물의 혈청의 평균 HAI 역가는 동일하였다.
이러한 종합적 데이터는 바이러스가 33℃ 미만의 온도(예를 들어, 31℃) 또는 33℃에서 배양되든지 간에, ca B/Jilin/20/03의 생물학적 특징에 공통점이 있음을 나타낸다. 백신 균주는 시험관 내 및 생체 내에서, 동등한 생물 물리학적 특성(예를 들어, 항원성, 감염성 입자에 대한 총 입자 비율 및 서열) 뿐만 아니라, 동등한 생물학적 특성을 갖는다. 또한, 33℃ 미만(예를 들어, 31℃)의 온도에서의 ca B/Jilin/20/03의 우수한 성장은 다른 ca 인플루엔자 B 균주에도 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 FluMist? 등과 같은 백신 제조에서 사용하기 위한, 33℃ 미만의 온도(예를 들어 31℃)에서 이러한 바이러스 균주, 예를 들어, ca B/Jilin/20/03 균주, 또는 다른 ca 인플루엔자 b 균주의 성장을 포함한다.
따라서, 어떤 구체예에서는, 본 발명은 인플루엔자 바이러스의 게놈, 또는 부분적 게놈(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개(즉, 총 v RNA 단편 미만)의 vRNA 단편)을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들어, PR8, Ann Arbor B 균주 인플루엔자, B/Leningrad/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14/55, B/England/2608/76, 또는 ca B/Jilin/20/03, 또는 하나 이상의 플라스미드를 선택적으로 포함할 수 있는 6:2 유전자 재배열 바이러스와 같은 B 균주 인플루엔자 바이러스)를 인플루엔자 바이러스의 복제를 도울 수 있는 하나 이상의 숙주 란 또는 다른 숙주 세포(예를 들어, MDCK 및 Vero)에 도입하는 단계; 33℃ 미만의 온도에서 숙주 란 또는 다른 숙주 세포(예를 들어, MDCK 및 Vero)를 배양하는 단계; 및 숙주 란 또는 다른 숙주 세포(예를 들어, MDCK 및 Vero)로부터 인플루엔자 바이러스 입자를 회수하는 단계에 의한 인플루엔자 바이러스 입자를 제조하는 방법을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 33℃ 미만의 온도(예를 들어, 31℃)에서 바이러스 입자를 배양하는 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스 입자의 수율 증가 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스의 게놈 또는 부분적 게놈을 포함하는 하나 이상의 벡터를 하나 이상의 숙주 란 또는 다른 숙주 세포(예를 들어, MDCK 및 Vero)에 도입하는 단계; 33℃ 미만의 온도에서 숙주 란 또는 다른 숙주 세포를 배양하는 단계에 의한 인플루엔자 바이러스 입자의 수율 증가 방법을 포함하고, 상기 33℃ 미만의 온도에서 제조된 인플루엔자 바이러스 입자의 수율은 33℃에서 제조된 동일한 바이러스 입자의 수율보다 크다. 어떤 구체예에서는, 33℃ 미만의 온도에서 제조된 바이러스 입자의 log10 TCID50/mL 역가가 33℃에서 제조된 동일한 바이러스 입자의 역가보다 더 크다. 특정 구체예에서, 33℃ 미만의 온도에서 제조된 바이러스의 log10 TCID50/mL 역가는 약 7.0 이상, 또는 약 7.2 이상, 또는 약 7.4 이상, 또는 약 7.6 이상, 또는 약 7.8 이상, 또는 약 8.0 이상, 또는 약 8.2 이상, 또는 약 8.4 이상, 또는 약 8.6 이상, 또는 약 8.8 이상, 또는 약 9.0 이상, 또는 약 9.2 이상, 또는 약 9.4 이상, 또는 약 9.6 이상, 또는 약 9.8 이상이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 인플루엔자 바이러스(예를 들어, 유전자 재배열 바이러스)를 인플루엔자 바이러스의 복제를 도울 수 있는 하나 이상의 유정란에 도입하여, 상기 유정란을 감염시키는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 인플루엔자 바이러스(예를 들어, 유전자 재배열 바이러스)를 인플루엔자 바이러스의 복제를 도울 수 있는 숙주 세포(예를 들어, MDCK 및 Vero)에 도입하여, 상기 숙주 세포를 감염시키는 단계를 포함한다. 관련된 바이러스는 약독화 인플루엔자 바이러스, 추위적응 인플루엔자 바이러스, 온도민감성 인플루엔자 바이러스, 약독화 추위적응 온도민감성 인플루엔자 바이러스, 또는 이들의 임의의 조합을 선택적으로 포함할 수 있다. 관련된 바이러스가 6:2 유전자 재배열 바이러스인 것도 고려된다. 한 구체예에서, 관련된 바이러스는 B 균주 인플루엔자 바이러스 6:2 유전자 재배열이다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 B 균주 인플루엔자 바이러스는 PR8, Ann Arbor B 균주 인플루엔자(예를 들어, B/Ann Arbor/1/94, B/Ann Arbor/1/66), B/Leningrad/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14/55, B/England/2608/76, 또는 ca B/Jilin/20/03를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 구체예에서, 관련된 바이러스는 Ann Arbor B 균주 인플루엔자 또는 B/Leningrad/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14/55, B/England/2608/76, 및 ca B/Jilin/20/03로 구성된 군으로부터 선택된 B 바이러스의 하나 이상의 단편을 포함한다.
특정 양상에서, 숙주 란은 닭의 SPF 유정란이다. 다른 특정 양상에서, 숙주 세포는 동물 세포이다. 인플루엔자 바이러스의 제조에 유용한 동물 세포는 당업계에 알려져 있고, MDCK 세포(예를 들어, 미국특허 제4,500,413호 및 제6,455,298호 참조), Vero 세포(예를 들어, 미국특허 제6,146,873호 참조) 및 PerC6 세포(예를 들어, PCT 공개 WO 01/38362 및 WO 02/40665 참조)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 한 구체예에서, 숙주 세포는 MDCK 세포이다. 또한, 다른 양상에서, 배양은 약 29℃ 내지 약 33℃, 약 31℃ 내지 약 33℃, 또는 약 31℃ 내지 약 32℃, 또는 약 31℃에서 일어난다. 다른 양상에서, 배양은 29℃ 내지 33℃, 31℃ 내지 33℃, 또는 31℃ 내지 32℃, 또는 31℃에서 일어난다. 본 발명은 또한 본 명세서의 방법에 의해 제조된 인플루엔자 바이러스 및 이러한 바이러스를 포함하는 조성물 및 백신(예를 들어, FluMist와 같은 액체 약독화 비강내 생백신)을 포함한다.
특정 양상에서, 본 명세서의 방법은 란 또는 다른 숙주 세포(예를 들어, MDCK 및 Vero)를 33℃ 미만에서 배양한 것으로부터 나타나는 역가(log10 TCID50/mL)가 동일한 바이러스 입자(즉 동일한 바이러스 종류/균주 등)를 33℃ 이상에서 배양한 것으로부터 나타나는 역가 이상인 구체예를 포함한다. 이러한 비교는 31℃에서의 배양 및 33℃에서의 배양 간에 선택적으로 이루어진다. 다양한 구체예에서, 31℃에서의 배양으로부터의 log10 TCID50/mL 역가는 33℃에서의 배양으로부터의 log10 TCID50/mL 역가보다 약 1.01 내지 약 1.10 배 이상, 약 1.025 내지 약 1.05 배 이상, 또는 약 1.03 내지 약 1.04 배 이상이다. 다른 구체예에서, 31℃에서의 배양으로부터의 log10 TCID50/mL 역가는 33℃에서의 배양으로부터의 log10 TCID50/mL 역가보다 1.01 내지 1.10 배 이상, 1.025 내지 1.05 배 이상, 또는 1.03 내지 1.04 배 이상이다.
다른 양상에서, 본 명세서의 방법은 바이러스가 33℃ 미만(예를 들어, 31℃) 또는 33℃ 이상(예를 들어, 33℃)에서 배양된 경우, 바이러스 입자의 ca 및/또는 ts 표현형이 실질적으로 유사한 구체예를 포함한다. 또한, 특정 양상에서, 본 명세서의 방법은 33℃ 미만(예를 들어, 31℃)의 배양으로부터의 바이러스 입자의 바이러스 수율이 33℃ 이상(예를 들어, 33℃)에서 배양된 동일한 바이러스 입자의 바이러스 수율 이상인 구체예를 포함한다. 이러한 양상에서, 33℃ 미만에서 배양된 바이러스 입자로 감염된 숙주 란의 요막강액의 감염성 비리온(virion)을 측정하는 평균 조직배양감염농도(TCID50) 측정법 및 33℃ 이상에서 배양된 바이러스 입자로 감염된 숙주 란의 요막강액의 감염성 비리온을 측정하는 평균 조직배양감염농도(TCID50) 측정법을 사용하여 바이러스 수율이 선택적으로 정량화된다. 대안으로, 33℃ 미만에서 배양된 바이러스 입자로 감염된 숙주 란의 요막강액의 적혈구 응집반응 역가 및 33℃ 이상에서 배양된 바이러스 입자로 감염된 숙주 란의 요막강액의 적혈구 응집반응 역가를 사용하여 바이러스 수율이 선택적으로 정량화된다. 33℃ 미만에서 배양된 바이러스 입자로 감염된 숙주 란의 요막강액 내의 바이러스 RNA 양 및 33℃ 이상에서 배양된 바이러스 입자로 감염된 숙주 란의 요막강액 내의 바이러스 RNA 양의 비교에 의해, 바이러스 수율이 또한 선택적으로 정량화된다. 33℃ 미만에서 배양된 바이러스 입자로 감염된 숙주 란의 요막강액 내의 감염성 입자 퍼센트 및 33℃ 이상에서 배양된 바이러스 입자로 감염된 숙주 란의 요막강액 내의 감염성 입자 퍼센트의 비교에 의해, 바이러스 수율이 또한 선택적으로 정량화된다. 33℃ 미만에서 배양된 바이러스 입자로 감염된 숙주 세포의 상등액의 요막강액의 감염성 비리온을 측정하는 평균 조직배양감염농도(TCID50) 측정법 및 33℃ 이상에서 배양된 바이러스 입자로 감염된 숙주 세포의 상등액의 감염성 비리온을 측정하는 평균 조직배양감염농도(TCID50) 측정법을 사용하여 바이러스 수율이 선택적으로 정량화된다. 대안으로, 33℃ 미만에서 배양된 바이러스 입자로 감염된 숙주 세포의 상등액의 적혈구 응집반응 역가 및 33℃ 이상에서 배양된 바이러스 입자로 감염된 숙주 세포의 상등액의 적혈구 응집반응 역가를 사용하여 바이러스 수율이 선택적으로 정량화된다. 33℃ 미만에서 배양된 바이러스 입자로 감염된 숙주 세포의 상등액의 바이러스 RNA 양 및 33℃ 이상에서 배양된 바이러스 입자로 감염된 숙주 세포의 상등액의 바이러스 RNA 양의 비교에 의해, 바이러스 수율이 또한 선택적으로 정량화된다. 33℃ 미만에서 배양된 바이러스 입자로 감염된 숙주 세포의 상등액의 감염성 입자 퍼센트 및 33℃ 이상에서 배양된 바이러스 입자로 감염된 숙주 세포의 상등액의 감염성 입자 퍼센트의 비교에 의해, 바이러스 수율이 또한 선택적으로 정량화된다.
임의의 다른 양상에서, 본 발명의 방법은 33℃ 미만에서 배양된 감염성 바이러스 입자의 핵산 서열이 33℃ 이상에서 배양된 감염성 바이러스 입자의 핵산 서열과 동일한 것을 포함한다. 임의의 다른 양상에서, 본 발명의 방법은 33℃ 미만에서 배양된 바이러스 입자의 항원성이 33℃ 이상에서 배양된 동일한 바이러스 입자(즉, 동일한 바이러스 종류 등)의 항원성과 실질적으로 동일한 것을 포함한다. 이러한 항원성은 HAI 측정법에 의해 선택적으로 측정된다. 다른 임의의 양상에서, 본 발명의 방법은 바이러스 입자가 개체(예를 들어, 페렛, 인간, 인간 이외의 영장류, 포유동물)내에서 면역 반응을 일으키는 것을 포함하며, 이는 33℃ 이상에서의 배양에 의해 제조된 동일한 종류의 바이러스 입자에 의해 동일한 개체(또는 개체 종류)내에서 일어나는 면역 반응과 실질적으로 동일하거나 유사한 정도이다.
실시예
: 31℃ 및 33℃에서 성장한 B/
JILIN
/20/03 및 다른 B 바이러스의 특성/비교
ca
B/
Jilin
/20/03 및 다른
ca
인플루엔자 B 균주의 성장 곡선
본 실시예에서 보는 바와 같이, ca 인플루엔자 B 균주의 최적 수율은 닭의 특정 병원체 부재(SPF) 유정란을 3O℃ 내지 32℃에서 배양 후에 최고였다. SPF 유정란을 약 2.1 log10TCID50/란으로 다양한 여러 ca 인플루엔자 B 균주로 접종하고, 28℃ 내지 35℃ 범위의 온도에서 60-72시간 동안 배양하였다. 배양 후에, 감염된 란의 요막강액을 회수하여 역가측정하였다. 도 1의 표 및 도 2의 그래프에 나타낸 바와 같이, 배양 최적 온도는 33℃ 미만이었고, 일반적으로 31℃ 내지 32℃였다. 보는 바와 같이, wt 인플루엔자 B에 대해 유의한 임상적 효과를 갖는 ca B/Ann Arbor/1/94(예를 들어, Belshe, et al., Phil. Trans. R. Soc. Lond. B, 2001, 356:1947-1951, 및 Belshe, et al., Pediatrics, 2001, 108:24+ 참조) 및 최근 인플루엔자 시즌에 특히 중요한 균주인 ca B/Jilin/20/03를 포함하는, 모든 시험된 균주에서 온도 프로파일이 유사하였다. 도 2 및 도 3을 참조한다.
각 균주에 대한 배양의 최적 온도는 각 균주에서의 데이터 값을 통과는 최적의 다항식 선(polynomial line)의 보간(interpolation)에 의해 결정되었다. Yamagata lineage(B/Ann Arbor/1/94, B/Victoria/504/2000, 및 B/Johannesburg/5/99) 및 Victoria lineage(B/Yamanashi/166/98, B/Brisbane/32/2002 및 B/Beijing/243/97)의 표본을 포함한 7가지 ca 인플루엔자 B 균주가 다양한 온도에서 배양되고, 감염 후 60 내지 72시간에 회수되었다. 최적 온도는 33℃ 미만이었고, 일반적으로 31℃ 내지 32℃였다. 도 2를 참조한다. ca B/Jilin/20/03의 온도 프로파일의 3회 독립적 반복결과를 도 3에 표시하였다. 나타낸 바와 같이, ca B/Jilin/20/03에서 배양 최적 온도는 약 31℃였다.
추위적응(
ca
:
cold
-
adaptation
) 및 온도민감성(
ts
:
temperature
sensitivity
) 표현형 측정-1차 병아리 신장 세포에서 25℃, 33℃, 및 37℃에서의 바이러스
역가
비율
SPF 유정란에서 29℃ 내지 33℃에서 성장된 추위적응 인플루엔자 B 균주는 ca 및 ts 표현형의 특성을 나타냈다. 배양 조건이 생성되는 백신의 생물학적 특성에 영향을 주지 않음을 증명하기 위하여, 다양한 온도에서 배양된 물질이 ca 및 ts 표현형의 특성을 갖는지 평가하였다. 모든 균주는 이러한 특성을 나타냈고, 이는 란의 배양 온도가 백신 균주에 영향을 주지 않음을 나타낸다. 도 4를 참조한다.
적혈구 응집(
HA
)
역가
, 바이러스
RNA
의 양, 및 감염성 입자의 퍼센트를 통한 바이러스 수율의 측정
바이러스 수율의 다른 측정은 감염성 바이러스의 수율과 일치한다. 다양한 온도에서 회수한 바이러스의 샘플의 HA 활성을 측정하고, 바이러스 RNA의 양을 정량적 역전사 PCR(QRT-PCR)로 정량하였다. 도 5 및 6에 나타낸 결과는 TCID50 결과와 일치하였다. 최고 HA 활성 및 vRNA 양은 31℃에서 배양된 란에서 관찰되었다.
다양한 온도에서 배양되고 감염 후 72시간 후에 회수된, 감염된 란의 요막강액 내의 HA 유전자 단편 바이러스 RNA의 양을 도 6에 나타낸다.
감염성 입자에 대한 게놈 복제수 또는 투과전자현미경(TEM)으로 측정된 총 입자의 비율도 본 명세서의 실시예에서 평가되었다. TCID50에 대한 복제수의 비율(도 7)은 31℃ 또는 33℃에서 배양된 샘플 간에 TCID50에 대한 복제수의 일정한 비율이 있음을 나타냈다.
실시예에서, TEM은 선택된 샘플에서의 TCID50에 대한 바이러스 입자수 비율을 측정하는데 사용되었다. 게놈:TCID50 비율과 유사하게, 이러한 분석은 31℃에서 성장한 B/Jilin/20/03의 약 3.3%의 총 입자가 감염성임을 나타냈다. 도 8을 참조한다. 31℃에서 성장한 B/Jilin/20/03의 감염성 입자의 퍼센트는 33℃에서 얻어진 값에 필적하고, 31℃ 또는 33℃에서 성장한 B/AnnArbor/01/94에서 얻어진 값과도 유사하다. 이러한 비율은 사전에 보고된 다른 ca 인플루엔자 B 백신 균주의 비율 범위 내이다.
31℃ 또는 33℃에서 성장한 B/
Jilin
/20/03 바이러스의 게놈 서열 분석
본 명세서의 실시예에서와 같이, 바이러스 RNA(vRNA)는 31℃ 및 33℃에서 성장한 바이러스로부터 추출되고, 시퀀싱되었다. 여러 온도에서 성장한 이러한 바이러스의 게놈 서열은 서로 동일하고, MVS와 동일하다. 도 9를 참조한다.
31℃ 또는 33℃에서 성장한
ca
B/
Jilin
/20/03의
HAI
가 나타내는 항원성
실시예에서의 바이러스는 이들의 항원 특성이 공통적인지를 확인하고자 시험하였다. 31℃ 및 33℃에서 성장한 ca B/Jilin/20/03의 HAI 역가를 대조 B/Jilin/20/03 항혈청에 대해 측정하였다. HAI 역가는 각각 2배 이내였고, 이는 이들의 항원성이 동일함을 나타낸다. 도 10을 참조한다.
31℃ 또는 33℃에서 성장한 바이러스의 생체 내 특성
2가지 온도에서 배양된 백신의 성능을 평가하기 위하여, 5마리 페렛(혈청음성)의 군을 31℃ 또는 33℃에서 성장한 7.0 log10TCID50의 바이러스로 비강내 접종하였다. 면역화 후 여러 시점에서 비세척표본 내의 바이러스 역가를 측정함으로써, 이러한 동물의 비인두 내의 백신의 복제를 확인하였다. 상기 2군 간의 백신 바이러스 복제는 양 및 기간 모두에서 동등하였다. 도 11을 참조한다. 또한, 면역화한 14일 후에 동물을 채혈하여, wt B/Jilin/20/03에 대한 혈청 내의 항체의 역가를 HAI로 측정하였다. 면역화에 대한 항체 반응은 이러한 2군의 동물 사이에서 동일하였고, 이는 31℃ 또는 33℃ 중 어디에서 성장되어도 백신이 동등하게 면역성임을 나타낸다. 도 11을 참조한다.
ca B/Jilin/20/03를 31℃에서 성장시키는 것이 인간 비인두에서 발견되는 것과 유사한 온도에서의 성장 능력에 영향이 없음을 증명하기 위하여, 31℃ 및 33℃에서 성장된 백신을 SPF 란에 접종하고, 30℃ 내지 33℃의 온도에서 배양하였다. 도 13에서 나타내듯이, 2가지 백신은 동등한 온도 프로파일로 복제되고 약 31℃(인간 상기도(upper airways)에서 발견될 것으로 예상되는 온도)에서 최고 역가를 산출하였다.
본 명세서의 실시예에서 나타내는 데이터는 31℃ 또는 33℃에서 배양되는 경우, ca B/Jilin/20/03의 생물학적 및 생물물리학적 특성이 동등함을 보여준다. 이러한 2가지 온도에서 배양된 백신 균주는 다른 온도에서의 ca 및 ts 표현형의 발현, 동물에서의 복제 및 면역성, 및 란 내에서의 복제를 포함하여, 시험관 내 및 생체 내에서, 동등한 생물 물리학적 특성(항원성, 감염성 입자에 대한 총 입자의 비율 및 서열)뿐 아니라, 동등한 생물학적 특성을 갖는다. 그러나, 33℃에서 성장한 것과 달리 31℃에서 성장한 바이러스는 더 높은 바이러스의 제조를 나타냈다. 또한, 31℃에서 ca B/Jilin/20/03의 우수한 성장은 본 명세서의 다른 시험된 ca 인플루엔자 B 균주에서도 나타난다. 따라서, 본 명세서의 실시예는 예를 들어, FluMist? 등과 같은 백신 제조에서 사용하기 위한, 란 또는 다른 숙주 세포(예를 들어, MDCK 및 Vero) 내에서 33℃ 보다는 33℃ 미만의 온도, 예를 들어, 31℃(또는 선택적으로 약 29℃ 내지 약 32℃)의 온도에서의 ca B/Jilin/20/03 균주(및 다른 ca 인플루엔자 B 균주)의 성장에 있어 본 발명의 청구항을 뒷받침한다.
실시예
: 재료 및 방법
표현형 측정-
ca
및
ts
표현형 측정은 3일된 병아리로부터 얻은 1차 병아리 신장(PCK) 세포에서 수행하였다. 샘플의 ca 및 ts 표현형을 측정하였다. 간략하게, PCK 세포를 무혈청배지(PAM)로 세척하고, 샘플의 역가검정에 사용하였다. 세척된 세포층을 적절한 바이러스로 접종하고, 지시된 온도에서 배양하였다. 세포층은 그 후 세포의 사멸을 가져오는 바이러스의 복제에 의해 야기되는 세포의 세포병리학적 효과를 관찰하였다. 표현형을 하기와 같이 배정하였다: ca - 33℃ 및 25℃ 사이의 TCID50 평균 역가 차이는 로그 2 이하였고; ts - 37℃ 또는 39℃ 및 33℃ 사이의 TCID50 평균 역가 차이는 로그 2 이상이었다. 샘플을 25℃, 33℃, 및 37℃에서 2회씩 시험하였다. 플레이트를 6일간(ts 표현형) 또는 10일간(ca 표현형) 배양하고, 배양 마지막에 CPE 리딩을 수행하였다. 본 명세서의 실시예에서 역가를 평균 TCID50 /mL±SD로 나타냈다.
HA
및
HAI
측정
적혈구 응집(HA) 측정법을 PBS 내에서 제조한 0.5% 병아리 RBC를 사용하여 수행하였다. 샘플을 50㎕ 부피의 96 웰 플레이트 내에서 2배로 연속 희석하였다. 연속희석된 샘플에, 50㎕의 0.5% 병아리 RBC을 첨가하여 혼합하고, HA 활성을 리딩하기 전에 플레이트를 최소 30분간 배양하였다. 각 샘플을 2회씩 시험하였고, HA 역가를 2회 반복의 평균으로 나타냈다.
HAI 측정법에서, 혈청 샘플을 처리하고, 25㎕ 부피의 1:4 희석에서 시작하여 2배 연속 희석하였다. 4 HA 유닛에 상응하는, 25㎕ 부피의 바이러스를 첨가하고, 혼합하고, 샘플을 30분간 상온에서 배양하였다. 배양 마지막에, 50㎕의 0.5% 병아리 RBC을 첨가하여 혼합하고, HAI 활성을 리딩하기 전에 플레이트를 최소 30분간 배양하였다.
페렛에서의
복제 및 면역성
페렛(생후 7주)을 얻어, 제어된 시설에서 2주간 격리하였다. 인플루엔자 바이러스 스톡(stock)을 1xSPG에서 7.05 1og10 TCID50의 최종 농도로 희석하여, 5마리의 각 페렛에 1mL씩을 투여하기에 충분한 부피의 접종원을 갓 제조하였다.
동물을 채혈하여 면역화 전 혈청 샘플을 얻고, 31℃ 또는 33℃에서 성장한 1 mL(비공당 0.5ml)의 ca B/Jilin/20/03로 비강내로 면역화하였다. 접종 후, 면역화 후 8 내지 168시간의 특정 간격에서, 1 mL의 멸균 인산버퍼식염수로 비관을 세척함으로써 각 페렛으로부터 비강 샘플을 채취하였다. 회수된 비강 세척 샘플을 곧바로 냉동시키고, 바이러스 역가 검정에 사용될 때까지 -80℃에서 저장하였다. HAI 반응 측정을 위하여, 혈청을 0, 14, 21 및 28일에 채취하였다.
비강 세척 샘플 내의 바이러스 역가 측정을 위하여, MDCK 세포를 96-웰 평면바닥(flat-bottom) 조직배양 플레이트 내에 시딩하고, 37℃ 및 5% CO2에서 100% 합류(confluency)가 되도록 성장시켰다. 비강 세척 샘플을 측정하기 바로 전에, 세포 성장 배지를 각 웰로부터 제거하고, 세포를 TPCK-트립신이 없는 불완전한 바이러스 성장 배지(VGM)로 2회 세척하고, 그 후 완전한 VGM(0.18 mL), TPCK-트립신을 각 웰에 가하였다. 동시에, 비강 세척 샘플을 해동시키고, 완전한 VGM에서 연속 희석하였다. 희석된 바이러스의 분주(aliquot)(0.02 mL) 또는 배지(음성 대조)만을 그 후 트리플리케이트 플레이트 위의 8개의 웰 각각에 가하였다. 플레이트를 33℃ 및 5% CO2 에서 6일간 방치하고, 현미경으로 바이러스의 세포병리학적 효과(CPE)의 존재를 각 웰마다 등급화하였다. 플레이트마다 CPE-양성 웰의 수를 Karber법을 사용하여 평균감염농도(TCID50/mL) 수치로 변환하였다.
란 내의 복제
여러 ca B 균주의 바이러스 함유 요막강액을 제조하기 위하여, 특정 병원체 부재(SPF) 란을 수취한 후, 7일 미만 동안 14±2℃에서 보관하고, 37.5±1℃ 및 70±10% 상대 습도에서 264±12시간 동안 배양하였다. 배양 후에, 란을 옮겨, 캔들링하고, 그리고 사용 가능한 란을 약 2.1 1og1O TCID50/란의 바이러스로 접종하고, 그리고 28℃ 내지 35℃ 범위의 온도에서 48, 60, 72 또는 84시간 동안 배양하였다. 그 후 란을 캔들링하고, 회수하기 전에 5±3℃에서 12-24시간 동안 냉각시켰다. 란은 70% v/v 에탄올로 스프레이하여 표면 소독하고, 생물안전 캐비넷(BSC)에 옮기고, 에어 건조하였다. BSC 내의 란을 란 펀치(puncher)를 사용하여 란의 윗부분을 펀칭함으로써 회수할 수 있게 준비하였다. 멸균 스테인레스 스틸 압설자를 사용하여 펀칭된 난각(eggshell)을 제거하고, 이어서 요막강액을 10 mL 피펫을 사용하여 회수하였다. 각 회수 시점에 회수된 요막강액을 수집하고, 샘플을 분주하고, 역가검정 전에 -60℃ 이하에서 저장하였다.
TCID
50
측정
TCID50 측정법을 하기 방법에 따라 수행하였다. 물론, 다른 유사한 측정법이 사용되는 것도 바람직할 것이다. 4일된 100% 합류 원위세뇨관(MDCK:Madin Darby Canine Kidney) 세포의 96-웰 플레이트가 측정법에 사용되었다. SkatronTM Cell Washer를 사용하여 세포 배양 플레이트를 바이러스 성장 배지(VGM)로 2회 세척하였다.웰당 180㎕의 완전한 VGM과 트립신을 각 플레이트에 가하고, 플레이트를 접종할 때까지 33℃ 및 5% CO2에 방치하였다. 동시에, 테스트 바이러스 및 대조 바이러스 샘플을 해동시키고, 96-웰 예비희석 블록 내에서 트립신과 VGM에 미리 희석시켰다. 샘플을 시리얼메이트 피펫팅 스테이션(SerialMate pipetting station)을 사용하여, 10배로 연속 희석하여 10-3 내지 10-4가 되었다. 그 후 바이러스 샘플을 예비희석 블록으로부터 VGM과 트립신으로 채워진 갓 제조된 희석 블록의 제1 및 제12 컬럼으로 옮겼다. 샘플은 시리얼메이트 피펫팅 스테이션으로 더욱 연속 희석되어 10-5 내지 10-10이 되었다. VGM과 트립신을 함유한 MDCK 세포 배양 플레이트를 배양기로부터 꺼내 시리얼메이트 피펫팅 스테이션을 사용하여 희석된 바이러스 샘플로 접종하였다. 플레이트를 6일 동안 33℃ 및 5% CO2에 방치하였다.
메틸티아졸테트라졸리움(MTT) 색소를 조직 배양 플레이트에 가하고 세포병리학적 효과(CPE)를 측정하였다. 그 후 플레이트를 분광광도계로 읽어서, 조직 배양 플레이트 내의 CPE 웰의 수를 측정하였다. 샘플의 TCID50의 역가를 총 CPE 웰의 수에 근거하여 계산하였다.
서열 분석
3가지 바이러스 물질을 시퀀싱으로 분석하였다. 2가지 바이러스 증식, Z0015 PD 16AprO4, DQ NB 773 및 Z0015 PD 16AprO4, DQ NB 773를 33℃ 및 31℃에서 각각 성장시켰다. 31℃에서 성장된 제조사의 Lot, Batch No. 600054C를 연구에 포함시켰다. 대조로서, B/Jilin/20/03 MVS, Lot No. 0141900073를 사용하였다.
시퀀싱을 위해, QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen, Venlo, The Netherlands)을 사용하여 바이러스 RNA를 분리하고, 템플레이트로서 cDNA를 RT-PCR로 증폭시켰다. 서열 반응은 제조사 지시에 따라, 특정 서열 프라이머의 세트 및 각각의 증폭된 cDNA 템플레이트와 ABI PRISM TM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용하여 수행하였다. 서열 확장 생성물을 정제하고, ABI Genetic Analyzer 3730(Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용하여 모세관 전기영동으로 분석하였다. 서열 결과를 DNA Sequencing Analysis (Applied Biosystems) 및 Sequencer (Gene Codes Corp.)를 사용하여 분석하였다.
게놈
복제수
측정을 위한 Q
RT
-
PCR
게놈 복제수 측정을 위하여, RNA를 Qiagen QIAamp Viral RNA mini kit를 사용하여 2세트로 또는 3세트로 추출하였다. RNA를 High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 2세트로 역전사하였다. cDNA를 ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems) 위의 TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems)를 사용하고, 인플루엔자 B 바이러스의 HA 유전자에 특수한 프로브 및 프라이머를 사용하여, Q-PCR 단독 분석하였다. 결과를 Sequence Detection Software, Version 1.9 (Applied Biosystems)를 사용하여 분석하고, 수치를 마이크로 소프트 엑셀에서 복제수/mL로 변화하였다.
바이러스 RNA 양을 B/Yamanashi HA 유전자를 포함하는 플라스미드의 연속 희석으로 생성된 표준 곡선을 사용하여 측정하였다. 플라스미드는 반응당 10 pg 에서 1 fg로 희석되었다. 반응당 양을 fg HA RNA/반응 x 4,000,000(예비 추출에서 1:10 희석된 바이러스, RT 단계 중 1:10 희석된 RNA, fg HA 플라스미드당 약 200 분자의 바이러스 RNA로 분석된 5㎕의 cDNA)으로 곱하여 바이러스/mL로 변환하였다. 이러한 계산은 모든 단계의 100% 효능 및 여분의 바이러스 RNA가 존재하지 않는 것으로 간주된다.
투과전자현미경을 사용한 총 입자 계수(
Count
)
투과전자현미경에 의한 총 입자 계수 측정이 Advanced Biotechnologies, Inc., Columbia, MD에 의해 수행되었다. 각 제제를 교반하고(vortexed), 격렬히 재분산시켰다. 18 마이크로리터의 각 샘플을 별도의 마이크로 튜브(microfuge tube) 내에서 동일한 부피의 라텍스 스페어 표준 함유 용액과 혼합하였다(110 nM 지름 라텍스 스페어; 밀리리터 당 1.5 x 1010 입자; Structure Probe Inc., West Chester, PA). 바이러스 입자/라텍스 스페어 혼합물을 별도의 마이크로 튜브 내에서 초정제수로 1:10으로 희석하고, 교반하고, 격렬히 재분산시켰다. 그리드를 제조하기 위해, 폼바(formvar) 및 탄소로 코팅된 300 메시 구리 그리드를 꽉 고정하고, 포셉(forcep)으로 단단하게 하였다. 각 그리드를 0.01% 소 혈청 알부민으로 헹궈내고, 과량의 용액을 여과지를 사용하여 빨아들였다. 각 샘플을 초정제수로 희석하여, 1:3 내지 1:15 범위의 다양한 희석액을 형성하였다. 각 희석 샘플의 2.5 마이크로리터의 분주를 별도의 그리드에 올려놓고 약 5분간 에어 건조되도록 하였다. 5분 후에, 과량의 물질을 여과지를 사용하여 빨아들였다. 각 그리드가 완전히 에어건조된 후에, 샘플을 고정하고, 각 그리드 위에 위치하는 20 마이크로리터의 2.0% 수용성 포스포텅스텐산(phosphotungstic acid)으로 염색시키고, 30초간 배양하였다. 임의의 과량의 염료를 여과지로 제거하였다. 각 샘플을 철저히 조사하고, 총 바이러스 입자를 Hitachi HU-12A 투과전자현미경을 사용하여 계수하였다.
백신 제조의 일반적 단계의 설명
논의 및 설명의 편의를 위하여, 일반적인 백신 조성물 제조의 다양한 단계는 4가지 넓은 군을 포함하거나 또는 이에 포함되는 것으로 생각될 수 있다. 제1군은 공동 감염, 재분류, 유전자 재배열의 선택, 및 유전자 재배열의 클로닝과 같은 형태를 포함한다. 제2군은 정제 및 유전자 재배열의 증식과 같은 형태를 포함한다. 제3군은 란 또는 다른 숙주 세포(예를 들어, MDCK 및 Vero) 내의 유전자 재배열의 추가적 증식 단계, 이어지는 회수 단계, 및 이러한 회수된 바이러스 용액의 정제단계를 포함한다. 제4군은 회수된 바이러스 용액의 안정화 단계 및 바이러스 용액의 효능/무능력 측정법을 포함한다. 그러나, 본 발명의 형태를 상기 4가지 일반적 카테고리로 분할하는 것은 단지 설명적/조직적 목적이지, 단계의 상호 의존성 등에 대한 여하의 추론을 거치지 않은 것임을 이해하여야 한다. 또한, 다른 단계(유사하거나 다른 단계)가 선택적으로 본 발명의 방법(예를 들어, 배양 방법, 예를 들어, 31℃에서 2차 란 배양)에 사용되는 것이 바람직할 것이다.
상기한 바와 같이, 논의 및 설명의 편의를 위하여, 백신 제조의 다양한 단계는 4개의 넓은 군을 포함하는 것으로 생각할 수 있다. 제1군은 공동 감염, 재분류, 유전자 재배열의 선택, 및 유전자 재배열의 클로닝과 같은 양상을 포함한다.
제1군
제1군에 속하는 것으로서 본 명세서에서 넓게 분류된 백신 조성물 제조의 형태는 특별히 원하는 유전자 재배열 바이러스를 제조하기 위한 세포 배양 라인의 공동감염, 예를 들어 마스터 공여 바이러스와 하나 이상의 야생형 바이러스의 공동감염의 최적화와 관련된 방법 및 조성물; 적절한 유전자 재배열 바이러스의 선택 단계; 및 선택된 유전자 재배열 바이러스의 클로닝 단계를 포함한다. 인플루엔자 바이러스 균주의 유전자 재배열은 당업자에게 공지되어 있다. 인플루엔자 A 바이러스와 인플루엔자 B 바이러스의 유전자 재배열은 유전자 재배열 바이러스 균주를 제조하기 위해 세포 배양 및 란에서 사용되어 왔다. 예를 들어, Tannock et al., Preparation and characterisation of attenuated cold-adapted influenza A reassortants derived from the A/Leningrad/134/17/57 donor strain, Vaccine (2002) 20:2082-2090를 참조한다. 인플루엔자 균주의 유전자 재배열은 플라스미드 조립에서도 알려졌다. 예를 들어, 상기한 PCT 공개 WO 03/091401를 참조한다.
간단히 말해, 유전자 재배열은 일반적으로 다른 바이러스로부터의 유전자 단편의 (예를 들어, 란 또는 세포 배양 내에서의) 혼합 단계를 포함한다. 예를 들어, 인플루엔자 B 바이러스 균주의 일반적인 8개의 단편은 예를 들어, 관심이 되는 에피토프(epitope)를 갖는 야생형 균주와 예를 들어, 추위적응 균주를 포함하는 "공여" 균주 사이에 혼합될 수 있다. 2 바이러스 종류 사이의 유전자 재배열은 특히 하나의 단편을 위한 야생형 에피토프 균주 및 다른 단편을 위한 추위적응 균주를 포함한 바이러스를 생성할 수 있다. 불행히, 원하는 유전자 재배열을 생성하기 위해, 때로 많은 수의 재분류가 필요할 수도 있다. 유전자 재배열된 후에, (예를 들어, 원하는 유전자 재배열을 찾기 위해) 바이러스가 선택될 수 있다. (예를 들어, 수를 증식시키기 위해) 원하는 유전자 재배열이 클로닝될 수도 있다.
인플루엔자 B 바이러스의 원하는 유전자 재배열을 위한 일반적인 최적화, 선택, 및 클로닝은, 일반적으로 바이러스 균주를 세포 배양(예를 들어, CEK 세포) 내로 공동감염시키고, 적절한 항체, 예를 들어 모체 바이러스 중의 하나로부터의 물질에 대한 항체를 이용하여 선택하고(일반적으로 란 내에서 수행됨), 그리고 일반적으로 세포 배양에서 이루어지는 바이러스의 클로닝 또는 증식 등에 의하여 일어난다. 그러나, 이러한 일반적인 유전자 재배열은 수천의 유전자 재배열이 원하는 단편 혼합을 위해 필요하다는 결점이 있다. 이러한 유전자 재배열이 일어나는 경우, 진정한 랜덤 유전자 재배열이 최종 생성물이 아닌 것이 명백하다. 다시 말해, 상기 방법에 대한 편중된 압력이 시스템 내에 존재한다. 그러나, 인플루엔자 A 균주에서는 이러한 방법이 이러한 편중을 갖지는 않는 것으로 보인다. A 균주에서, 균주의 공동 감염(일반적으로 CEK 세포와 같은 세포 배양 내로)은 이후 역시 세포 배양 내에서 선택 및 클로닝 단계를 동시에 거치게 된다.
유전자 재배열의 최적화
제1군의 단계를 사용하는 다양한 구체예는 필요한 재분포의 수를 줄이기 위해(그리고 이에 따라 백신 제조 방법의 처리량/안정성을 높이기 위해), 유전자 재배열 방법을 최적화할 수 있다. 이러한 최적화 기법을 사용한 단계는 일반적으로 인플루엔자 B 균주의 유전자 재배열을 구체화하고, 일반적으로 세포 배양, 예를 들어, CEK 세포 내에서 이루어진다. 예를 들어, PCT 공개 WO 05/014862 참조.
인플루엔자 바이러스의 유전자 재배열의 다른 방법은 선택적으로 마스터 공여 바이러스(MDV)와 야생형 바이러스의 희석액이 혼합되고(예를 들어, 각 용액의 농도 변화없이 1:5 희석액), 그 후 25℃ 및 33℃에서 24 및 48 시간 배양될 수 있다. 이러한 접근은 종종 인플루엔자 A 균주에는 적용가능하지만, 인플루엔자 B 균주에는 이러한 방법으로는 일반적으로 긍정적인 결과를 가져오지 못한다. 예를 들어, 적절한 6:2 분류(즉 MDV로부터의 6 유전자 및 야생형 바이러스로부터 2 유전자, NA 및 HA)를 달성하기 위해서는, 수천가지 유전자 재배열이 일어나야만 한다.
유전자 재배열의 선택 및
클로닝
제1군의 단계는 유전자 재배열된 인플루엔자 바이러스의 선택 단계도 포함한다. 유전자 재배열된 인플루엔자 A 균주는 세포 배양(예를 들어, CEK 세포) 또는 란 내에서 선택이 가능하다. 그러나, 유전자 재배열된 인플루엔자 B 균주는 세포 배양 내에서 유전자 재배열되는 경우(예를 들어, CEK 세포 내에서 선택되는 경우) 문제를 갖는다. CEK 세포가 인플루엔자 B 균주 내의 M 유전자와 간섭하여, 모든 제조를 감소시키는 것으로 생각된다. 백신 조성물 제조의 다양한 방법(예를 들어, PCT 공개 WO 05/014862 참조)은, 바이러스 유전자 재배열, 예를 들어, 선택 등을 위해 다양한 단계를 사용하는데, 이러한 다양한 단계는 본 명세서의 백신 조성물 등에 사용되는 바이러스를 제조하는데 선택적으로 사용될 수 있다.
유전자 재배열의 특성
바이러스/백신 제조의 다른 방법은 본 명세서에서 사용된 인플루엔자 바이러스의 유전자 배치를 결정하기 위해, 아직까지 높은 처리량의 단일 나선 구조 다형성/모세관 전기영동(SSCP/CE) 측정법의 사용을 이용한다. 인플루엔자 바이러스는 8개의 유전자 단편을 포함하고, 상기한 것처럼, 2가지 다른 인플루엔자 균주로 단일 세포를 공동 감염시켜 원래의 것들과 구별되는 신규 유전자 배치를 갖는 유전자 재배열 바이러스를 제조할 수 있다. 따라서, 몇몇 방법은 신속하게 많은 수의 인플루엔자 바이러스 샘플의 유전자 단편의 배치를 결정하기 위하여 SSCP/CE 측정법을 사용할 수 있다. 인플루엔자 바이러스 유전자 단편은 선택적으로 8개의 단편 각각에 특수한 형광-표지 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 증폭될 수 있다. Arvin et al. (2000) J. Clin. Micro. 38(2):839-845를 참조한다.
박테리아 오염의 방지
바이러스/백신 제조의 몇몇 방법은 인플루엔자 바이러스가 제조되는 란 또는 다른 숙주 세포 배양의 미생물 오염을 검출 및/또는 방지/검출하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 미생물 검출 기법은 고속/고 처리량 미생물 검출에 유용하고 이에 따라, 다른 많은 단계에서도 처리량을 높이는데 유용하고, 바이러스/백신 제조에서 제조를 증가시켰다.
본 명세서의 발명이 선택적으로 사용될 수 있는, 많은 최근의 인플루엔자 백신 제조 기법은 구성요소로서 특정 병원체 부재 닭의 수정란에서의 일반적인 인플루엔자 바이러스 증식용 방법을 사용한다. 미생물 오염이 란에서 바이러스를 제조하는 여러 시점에서 일어날 수 있다. 불행하게도, 란은 몇몇 미생물을 자연 세균균의 일부로서 바깥쪽 껍질에 가지고 있을 수 있다. 닭 배아의 발생 중에 난각의 내부에 미생물을 갖는 것도 가능하다. 닭의 수정란은 배의 발생을 위해 높은 습도에서, 37℃에서 배양되는데, 이는 많은 종류의 미생물 오염에 적절한 배양 조건을 이루기도 한다. 미생물 오염이 가능한 다른 시간은 란을 접종하기 위하여 껍질이 펀칭될 때에 발생한다. 바이러스 접종 전이라고 하여도, 란은 종종 알코올을 스프레이처리되어, 여전히 미생물이 란 내로 들어갈 수 있는 기회가 있다.
란 내에서 2 내지 3일간 바이러스의 증식 후에, 란 내의 바이러스를 함유한 요막강액의 회수를 위하여, 난각의 상부가 일반적으로 제거된다. 상기 내용을 참조한다. 이러한 회수 단계는 미생물의 오염이 일어날 수 있는 또 다른 시점이다. 불행하게도, 이러한 오염된 미생물을 갖는 란은 검출되지 않을 수도 있어서, MPA 시험에 부적합하여 전체 로트가 거절되는 것을 최소화하기 위해 다중 용기 내로의 도입이 필수적이다. 3가지 인플루엔자 균주가 일반적으로 백신 제조에 사용되기 때문에, 3가지 균주의 혼합이 최종 벌크에서 요구된다. 공정중 MPA(미생물학적 순도 측정) 테스트가 예를 들어, 혼합되어 사용되기 전의 바이러스 회수 시에 수행되고, 무균 생성물임을 보증한다.
배양 후에, 캔들링의 "일반적" 방법이 무정 란 및 자연적 원인 또는 미생물 오염에 의해 죽을 수 있는 죽은 란을 확인하는데 사용된다(즉, 죽은 란은 바이러스 감염 및/또는 미생물의 증식 때문에 발생하고, 이러한 란의 검출 및 제거 모두가 요구된다). 캔들링은 예를 들어, 암실 내의 광원 앞에서 란을 들고 발생된 배를 볼 수 있는 방법을 포함한다. 죽은 란은 바이러스 접종으로부터 제외된다.
또한, 미생물 오염은 세포 배양 내에서 바이러스를 제조하는 여러 시점, 예를 들어, 출발 숙주 세포가 숙주 세포의 최초 배양 전에 미생물에 의해 오염될 수 있는 경우에 일어날 수 있다. 마스터 세포 은행(MCB)의 제제는 백신 물질용 바이러스 제조에 필수적으로 사용된다. MCB는 미생물의 부존재를 확인하는 폭넓은 시험을 하고, MCB는 선택적으로 종양성 및/또는 발암성을 시험할 수도 있다. 바꾸어, 미생물은 숙주 세포를 배양하는데 사용되는 배양 용기(예를 들어, 발효조)의 개방을 요구하는 어떠한 단계에서도 도입될 수 있다. 배양 용기의 개방을 요구하는 단계는 예를 들어, 배양에 단백분해효소 또는 다른 보조제를 첨가하는 동안 및 숙주 세포에 바이러스를 감염시키는 동안을 포함한다. 배양 용기의 개방을 최소화하기 위해 고안된 방법의 개발과 관련된 무균 배지 및 부속물질의 사용은 오염의 위험을 최소화하는데 필수적이다.
상기 시점에서 볼 수 있듯이, 미생물 오염의 검출은 인플루엔자 백신의 제조 과정에서 여러 단계에서 필요할 수 있다. 조류 및 환경적 미생물을 제거하거나 줄이는 것이 필요하고, 환경 미생물 및 인간 미생물의 도입을 제거하거나 줄이는 것이 필요하다. 미생물 오염을 검출하는 최근의 방법은 예를 들어, 컴펜디얼법(compendial methods)(MPA 및 BioBurden)을 포함한다. 최근의 방법은 예를 들어, 란의 접종 전/후 과정에서의 란의 캔들링(일반적으로 약 500 란/시간/인의 속도로 수동으로 이루어짐); 일반적으로 수동으로 이루어지고, MPA의 경우 약 14일이 소요되고, BioBurden의 경우 약 3일이 소요되는 MPA 및 BioBurden 시험(MCB의 제조 및 바이러스 회수 중에 이루어짐); 수동으로 이루어지고 약 28일이 소요되는 미생물 시험(바이러스 회수 중에 이루어짐); 및 일반적으로 수동으로 이루어지고 56일이 소요되는 마이코박테리아 시험(바이러스 회수 중에 이루어짐)을 포함한다. 또한, 본 발명에 사용가능한 다양한 기법에 관하여, 예를 들어, PCT 공개 WO 05/014862을 참조한다.
제2군
제2군에 속하는 바이러스/백신 제조의 형태는 추가의 정제과정 및 바이러스 증식단계 등을 포함한다. 정확한 유전자 재배열 및 유전자 재배열의 클로닝의 과정 후에(예를 들어, 6:2 바이러스), 이러한 유전자 재배열 바이러스 입자는 유정란에서 더욱 정제되고, 정확한 클론이 양적으로 증식되어(역시 란 내의 성장을 통해) 마스터 바이러스 균주(MVS) 또는 마스터 바이러스 시드를 형성하고, 그 후, 더욱 증식되어, 마스터 워킹 바이러스 균주(MWVS) 또는 제조사 워킹 바이러스 시드를 형성한다. 바이러스 입자의 정제의 많은 형태 및 바이러스 입자의 양을 증식하기 위하여 이러한 정제된 바이러스를 다른 란에 접종하는 용도는 당업자에게 공지되어있다. 많은 이러한 기법들이 본 바이러스 제조에 일반적으로 사용되고 40년 이상 사용되어 왔다. 예를 들어, Reimer, et al. Influenza virus purification with thezonal ultracentrifuge, Science 1966, 152:1379-81을 참조한다. 정제 과정은 예를 들어, 수크로오스 기울기(예를 들어, 10-40% 수크로오스) 등에서의 초고속 원심분리 단계를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서와 같이, 다른 군에서 열거된 다른 과정, 예를 들어, 미생물 오염의 예방 등이 선택적으로 제2군에 사용될 수 있다.
제3군
제3군의 명목하에 속하는 바이러스/백신 제조의 형태는 예를 들어, 유정란 또는 다른 숙주 세포의 조건화(예를 들어, 바이러스 감염된 란 또는 다른 숙주 세포의 배양에 관련된 특정 취급 및 환경적 조건) 및 인플루엔자 바이러스를 란의 요막강액으로부터 또는 숙주 세포의 배양 상등액으로부터 회수하는 단계 및 정제하는 단계를 포함한다.
예를 들어, 백신에 사용되는 유전자 재배열 바이러스를 포함하는 란의 조건화, 세척, 캔들링, 및 배양 단계; 이러한 란의 접종, 실링 등의 단계; 이러한 란의 캔들링 단계; 란으로부터 바이러스 용액(예를 들어, 요막강액)의 회수 단계; 숙주 세포의 배양 및 접종 단계; 숙주 세포로부터 바이러스 용액(예를 들어, 세포 배양 상등액)을 회수하는 단계; 및 바이러스 용액을 정제하는 단계는 이러한 범주에 속한다. 또한, 제2군의 단계에 적용될 수 있는 여러 기법들(예를 들어, 캔들링 등)이 동일하게 제3군의 단계에서 적용될 수 있다. 제3군을 포함하는 바이러스/백신 제조의 여러 형태는 당업자에게 공지되어 있다. 다양한 형태의 바이러스 제조에서의 란의 캔들링 및 바이러스로 란의 접종 및 이러한 바이러스의 세척, 배양 등은 란에서 바이러스/백신을 제조하는 데 있어 잘 알려진 기법들이다. 물론, 이러한 잘 알려진 기법들이 본 발명의 특수하고 새로운 형태와 결합되어 사용되는 것이 바람직할 것이다. 또한, PCT 공개 WO 05/014862는 록킹(rocking) 등의 단계를 더욱 제공하여, 본 발명의 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 다른 유사한 단계가 조성물의 특수 여과 및 워밍에 다시 포함될 수 있고, 또한 PCT 공개 WO 05/014862를 참조한다.
여과 및 워밍(
warming
)
또한, PCT 공개 WO 05/014862는 본 발명의 방법 및 조성물에 선택적으로 사용될 수 있는 다른 여과 및 워밍 단계를 제공한다. 기술된 바와 같이, FluMistTM 제조 방법은 유정란을 사용하여, 마스터 바이러스 시드(MVS), 제조사 워킹 바이러스 시드(MWVS) 및 바이러스 하비스트(VH)를 생성할 수 있다. 시드 및 바이러스 하비스트는 bioburden(일반적으로 박테리아 오염)을 포함할 수 있고, 시드 또는 벌크 바이러스 생성물 로트를 백신 제조 과정에서 거부당하게 할 수 있다. 물론, 특별한 언급이 없는 한, 사용되는 특정 생성물 종류의 특수한 열거 또는 설명, 크기 등이 본 발명을 제한하는 것으로 생각되어서는 안된다.
제4군
백신 제조의 형태의 제4군은 예를 들어, 주로 바이러스를 포함하는 용액의 안정화(예를 들어, 성분의 첨가, 버퍼/NAF 비율의 변경 등을 통해) 및 효능/무능력 측정법과 주로 관련된 단계를 포함한다. 몇몇의 구체예에서, 본 발명의 최종 바이러스 용액/백신은 인플루엔자 백신 시즌 동안(예를 들어, 일반적으로 북반구에서 약 9월 내지 3월) "필드 내에서" 저장하기에 충분한 기간 동안(예를 들어, 2-8℃, 4℃, 5℃ 등에서 냉장보관되어, 판매 및 상업화되는 동안) 용액 형태에서 안정한 생바이러스를 포함할 수 있다. 따라서, 바이러스/백신 조성물은 그들의 효능을 보유하거나, 저장 기간 동안 적절한 속도로 효능을 잃게 되는 것이 바람직하다. 다른 구체예에서, 이러한 용액/백신은 약 2℃ 내지 약 8℃, 예를 들어, 냉장고 온도에서 용액 형태로 안정하다. 따라서, 본 발명을 통해 제조된 바이러스/백신 및 본 발명의 방법은 이러한 절차 등에 의해 및/또는 이러한 절차 등을 사용하여 제조가능하다. 또한 PCT 공개 WO 05/014862를 참조한다.
바이러스
하비스트의
농도/정용여과(
Diafiltration
)
몇몇 백신 조성물 제조 방법에 있어, 바이러스 하비스트는 선택적으로 적절한 컬럼을 사용하여 농축될 수 있다. PCT 공개 WO 05/014862를 참조한다.
안정화제
/버퍼
백신 조성물 제조는 원하는 바이러스 및 예를 들어, 수크로오스, 아르기닌, 젤라틴, EDTA 등의 조합을 포함하는 다양한 NAF의 희석액(일반적으로 비분획화된 NAF)을 선택적으로 포함할 수 있다. 여러 백신 제제에 가능한 다양한 조합의 예로서, 예를 들어, PCT 공개 WO 05/014862를 참조한다. 이러한 방법 및 조성물은 특정 구체예에서 선택된 기간(일반적으로 6 개월 이상, 9개월 이상, 12 개월 이상, 15 개월 이상, 18 개월 이상, 24개월 이상 등)에 걸쳐 원하는 온도(예를 들어, 일반적으로 4℃, 5℃, 8℃, 약 2℃ 내지 약 8℃ 또는 2℃ 초과 등)에서 안정하다(즉, 바람직하지 않은 효능의 감소가 없음).
몇몇의 제제, 조성물은 젤라틴 또는 젤라틴 관련 및/또는 젤라틴 유도 생성물(예를 들어, 젤라틴 히드록실레이트)와 조합으로 또는 이를 대체하여, 예를 들어, 아르기닌(약 7.0 내지 약 7.2의 pH)의 안정화제를 포함할 수 있다. PCT 공개 WO 05/014862를 참조한다. 많은 바이러스 용액/백신 용액에서, SPG(수크로오스, 포타슘 포스페이트 및 모노소듐 글루타메이트)의 베이스 용액이 선택적으로 사용된다.
또한, PCT 공개 WO 05/014862는 바이러스/백신 조성물 안정화의 다른/추가의 방법, 예를 들어, NAF 양 조정 등을 제공한다.
정의
다르게 정의되지 않는 한, 모든 과학적 및 기술적 용어는 이들이 속하는 당업계에서의 일반적인 의미와 동일하게 이해되어야 한다. 본 발명의 목적에서, 하기 용어들은 다음와 같이 정의된다.
용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드", "폴리뉴클레오티드 서열" 및 "핵산 서열"은 단일 가닥 또는 이중 가닥 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 폴리머, 또는 키메라 또는 이의 유사체를 나타낸다. 본 명세서에 사용된, 상기 용어는 자연적으로 발생된 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 단일 가닥 핵산에 하이브리드화된, 자연적 뉴클레오티드의 본성을 갖는 자연 발생 뉴클레오티드 유사체의 폴리머(예를 들어, 펩타이드 핵산)를 선택적으로 포함한다. 다른 것을 한정하지 않는 한, 특정 핵산 서열은 명백히 지시하는 서열뿐만 아니라 선택적으로 상보적 서열을 포함한다.
용어 "유전자"는 생물학적 기능과 연관된 임의의 핵산을 나타내는 것으로 넓게 사용된다. 따라서, 유전자는 코딩 서열 및/또는 이들의 발현에 필요한 조절 서열을 포함한다. 용어 "유전자"는 특정 게놈 서열뿐만 아니라, 게놈 서열이 인코딩하는 cDNA 또는 mRNA에도 사용된다.
유전자는 발현되지 않는 핵산 단편, 예를 들어, 다른 단백질의 인식 서열을 형성하는 것도 포함한다. 발현되지 않는 조절 서열은 전사 인자와 같은 조절 단백질이 결합하여, 인접 또는 근처의 서열의 전사를 일으키는, "프로모터" 및 "인핸서(enhancer)"를 포함한다. "조직 특이적" 프로모터 또는 인핸서는 특정 조직 종류 또는 세포 종류에서 전사를 조절하는 것이다.
용어 "벡터"는 핵산이 증식되고 및/또는 유기체, 세포, 또는 세포 성분 간에 이동할 수 있다는 의미를 나타낸다. 벡터는 자가 복제할 수 있고 숙주 세포의 염색체에 끼어들어갈 수 있는, 플라스미드, 바이러스, 박테리오파지, 프로-바이러스, 파지미드(phagemids), 트랜스포존(transposons), 및 인공적 염색체, 및 이의 유사체를 포함한다. 벡터는 또한 자가 복제할 수 있는, 그대로의(naked) RNA 폴리뉴클레오티드, 그대로의 DNA 폴리뉴클레오티드, 동일한 가닥 내에 DNA 및 RNA로 구성된 폴리뉴클레오티드, 폴리-라이신-접합 DNA 또는 RNA, 펩타이드-접합 DNA 또는 RNA, 리포솜-접합 DNA, 또는 이의 유사체일 수 있다.
"발현 벡터"는 발현을 촉진할 수 있을 뿐만 아니라 이에 혼입된 핵산의 복제가 가능한, 플라스미드와 같은 벡터이다. 일반적으로, 발현되는 핵산은 프로모터 및/또는 인핸서와 "사용가능하게 결합되어" 있고, 프로모터 및/또는 인핸서에 의해전사가 조절 억제된다.
"양방향 발현 벡터"는 두 프로모터 간에 위치한 핵산에 대하여 반대 방향에서 유래되는 2가지 대체 프로모터에 의해 특징지어지고, 이러한 발현은 양방향에서 시작되어, 예를 들어, 모두 플러스(+) 또는 센스 가닥, 및 네거티브(-) 또는 안티센스 가닥 RNA의 전사를 가져온다.
본 명세서에서, 용어 "분리된"은 자연 발생적 환경 내에서 일반적으로 수반되거나 상호작용하는 성분으로부터 실질적으로 자유로운, 핵산 또는 단백질과 같은 생물학적 물질을 나타낸다. 분리된 물질은 자연 환경에서는 발견되지 않는 물질, 예를 들어, 세포를 선택적으로 포함한다. 예를 들어, 상기 물질이 세포와 같이 자연 환경에 있다면, 상기 물질은 세포 내의 위치(예를 들어, 게놈 또는 유전적 요소)에 존재해온 것이지, 그 환경에서 발견되는 자연적 물질은 아니다. 예를 들어, 자연적으로 발생되는 핵산(예를 들어, 코딩 서열, 프로모터, 인핸서 등)은 비자연적 유도가 개입되어 게놈의 영역(예를 들어, 벡터, 예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 또는 증폭산물(amplicon))을 의미한다면 분리되나, 핵산이 자연적인 것은 아니다. 이러한 핵산은 또한 "비상동성" 핵산을 나타낸다.
용어 "유전자 재조합"은 물질(예를 들어, 핵산 또는 단백질)이 인공적으로 또는 합성적으로(비자연적으로) 변경된 것을 의미한다. 변경은 물질 내에서 수행될 수도 있고, 이의 자연적 환경 또는 상태로부터 제거될 수도 있다. 특히, 바이러스, 예를 들어, 인플루엔자 바이러스를 지칭하는 경우 이것이 유전자 재조합 핵산의 발현에 의해 생성되는 경우에 유전자 재조합이다.
바이러스를 지칭하는 경우, 용어 "유전자 재배열"은 바이러스가 하나 이상의 모체 바이러스 균주 또는 원(source)으로부터 유도된 유전적 및/또는 폴리펩타이드 성분을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 7:1 유전자 재배열은 제1 모체 바이러스로부터 유도된 7개의 바이러스 게놈 단편(또는 유전자 단편) 및 제2 모체 바이러스로부터의 예를 들어, 헤마글루티닌 또는 뉴라미니다제를 인코딩하는 하나의 상보적 바이러스 게놈 단편을 포함한다. 6:2 유전자 재배열은 6개의 게놈 단편, 가장 일반적으로는 제1 모체 바이러스로부터의 6개의 내부 유전자, 및 2개의 상보적 단편, 예를 들어, 다른 모체 바이러스로부터의 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제를 포함한다.
비상동성 또는 분리된 핵산을 나타내는 경우의 용어 "도입된"은 핵산이 진핵 세포 또는 원핵 세포로의 혼입됨을 나타내고, 여기서 핵산이 세포의 게놈에 혼입될 수 있고(예를 들어, 염색체, 플라스미드, 플라스티드 또는 미토콘드리아 DNA), 자가 복제, 또는 일시적 발현(예를 들어, 트랜스펙션된 mRNA)이 일어난다. 상기 용어는 "감염", "트랜스펙션(transfection)", "형질전환" 및 "형질도입"을 포함한다. 본 발명에서, 핵산을 원핵 세포내로 도입하는데 일렉트로포레이션, 칼슘 포스페이트 침전, 지질 매개 트랜스펙션(리포펙틴) 등을 포함하여 다양한 방법이 사용될 수 있다.
용어 "숙주 세포"는 비상동성 핵산, 예를 들어, 벡터를 포함하고, 핵산의 복제 및/또는 발현을 보조하는 세포를 의미한다. 숙주 세포는 E. coli와 같은 원핵 세포, 또는 인간 세포를 포함하여, 효모, 곤충, 양서동물, 조류 또는 포유동물 세포와 같은 진핵 세포일 수도 있다. 본 발명에서 숙주 세포의 예는 Vero (African green monkey kidney) 세포, BHK (baby hamster kidney) 세포, primary chick kidney (PCK) 세포, Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) 세포, Madin-Darby Bovine Kidney (MDBK) 세포, 293 세포(예를 들어, 293T 세포), 및 COS 세포(예를 들어, COSl, COS7 세포)를 포함한다.
인플루엔자 바이러스
본 명세서의 조성물 및 방법은 주로 백신용 인플루엔자 바이러스의 제조와 관련된다. 인플루엔자 바이러스는 단편화된 단일 가닥 RNA 게놈 및 매트릭스 단백질로 연결된 리포프로테인 외피를 포함하는 내부 리보뉴클레오프로테인 코어로 구성된다. 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B 바이러스는 각각 단일 가닥 네거티브 센스 RNA의 8개의 단편을 포함한다. 인플루엔자 A 게놈은 11개의 폴리펩타이드를 인코딩한다. 단편 1-3은 3개의 폴리펩타이드를 인코딩하여, RNA-기초 RNA 폴리머레이즈를 만든다. 단편 1은 폴리머레이즈 복합체 단백질 PB2를 인코딩한다. 남은 폴리머레이즈 단백질 PB1 및 PA는 단편 2 및 단편 3에 의하여 각각 인코딩된다. 또한, 일부 인플루엔자 균주의 단편 1은 PB1 코딩 영역 내의 대체 리딩 프레임으로부터 제조되는, 작은 단백질, PBl-F2를 인코딩한다. 단편 4는 세포 부착 및 감염시의 입장과 관련된 헤마글루티닌(HA) 표면 당단백질을 인코딩한다. 단편 5는 바이러스 RNA와 관련된 주 구조 성분인 뉴클레오캡시드 뉴클레오프로테인(NP) 폴리펩타이드를 인코딩한다. 단편 6은 뉴라미니다제(NA) 외피 당단백질을 인코딩한다. 단편 7은 차별적으로 스플라이싱된 mRNA로부터 번역된, Ml 및 M2라 부르는 2개의 매트릭스 단백질을 인코딩한다. 단편 8은 2개의 대체 스플라이싱된 mRNA 변이체로부터 번역되는 비구조 단백질, NS1 및 NS2를 인코딩한다.
인플루엔자 B의 8개의 게놈 단편은 11개의 단백질을 인코딩한다. 3개의 가장 큰 유전자는 RNA 폴리머레이즈의 성분, PB1, PB2 및 PA를 인코딩한다. 단편 4는 HA 단백질을 인코딩한다. 단편 5는 NP를 인코딩한다. 단편 6은 NA 단백질 및 NB 단백질을 인코딩한다. NB 및 NA 단백질 모두는 비스시스트로닉(biscistronic) mRNA의 오버랩핑 리딩 프레임으로부터 번역된다. 인플루엔자 B의 단편 7은 2개의 단백질: M1 및 BM2를 인코딩한다. 가장 작은 단편은 2개의 생성물, 전체 길이 RNA로부터 번역되는 NS1 및 스플라이싱된 mRNA로부터 번역되는 NS2를 인코딩한다.
인플루엔자 바이러스 백신
역사적으로, 인플루엔자 바이러스 백신은 주로 적절한 균주의 경험적 예측에 근거하여 선택된 바이러스의 균주를 사용한 닭의 유정란에서 제조되어왔다. 최근, 선택된 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제 항원을 승인된 약독화, 온도민감성 마스터 균주의 것에 혼입한 유전자 재배열 바이러스가 제조되고 있다. 닭의 란에서 다중 계대를 통한 바이러스의 배양 후에, 인플루엔자 바이러스는 회수되고, 선택적으로, 예를 들어, 포름알데히드 및/또는 β-프로피오락톤을 사용하여(또는 대안으로 약독화 생백신 내에서 사용) 비활성화된다.
그러나, 이러한 방법으로의 인플루엔자 백신의 제조는 여러 유의할 점이 있다. 예를 들어, 닭의 란이 보유하는 오염물은 매우 항원성 및/또는 발열성일 수 있고, 투여 중 종종 유의한 부작용을 가져올 수 있다. 따라서, 다른 방법은 란 성분의 일부 퍼센트를 동물 부재 배지로 대체하는 것을 포함한다. 더욱 중요한 것은, 백신 제조용 바이러스 균주는 일반적으로 다음 독감 시즌에 몇 달 앞서 선택되고 공급되어, 제조 시간 및 인플루엔자 백신의 불활성화가 가능하여야 한다. 또한, 생성물 손실을 최소화하기 위하여, 보존 기간 내에서의 안정성 및/또는 편리한 온도(예를 들어, 약 2-8 ℃의 냉장고 온도)에서의 보존의 안정성의 향상이 매우 바람직하다.
백신 제조용으로 승인된 일부 균주가 표준 세포 배양 조건 하에서 효과적으로 배양하는 것이 어려워, 세포 내에서 유전자 재조합 및 유전자 재배열 백신의 제조의 시도가 방해를 받아왔다. 따라서, 발명자 및 벡터 시스템을 제공한 공동 연구자에 의한 선 연구, 그리고 세포 내에서 유전자 재조합 및 유전자 재배열 바이러스를 제조하는 방법이 바이러스의 하나 이상의 선택된 항원성 균주에 상응하는 백신의 신속한 제조를 가능하게 하였다. 예를 들어, 상기한 PCT 공개 WO 03/091401를 참조한다. 물론 이러한 유전자 재배열은 닭의 란 내에서 선택적으로 더욱 증식될 수 있다. 일반적으로 배양은 시스템 내에서, 예를 들어 세포 배양 인큐베이터에서, 조절된 습도 및 CO2 하에서, 온도가 35℃를 초과하지 않도록 하는 온도계와 같은 온도 조절기를 사용하여 일정 온도에서 유지된다. 다른 백신 제조뿐만 아니라 이러한 선구자적 업적은 본 발명의 전체적 또는 부분적 사용을 통하여 더욱 최적화될 것이다.
유전자 재배열 인플루엔자 바이러스는 원하는 균주로부터 얻어진 상보적 단편(예를 들어, 원하는 항원성 변이체)과 조합으로, 마스터 인플루엔자 바이러스의 게놈 단편에 상응하는 벡터(예를 들어, 바이러스, 플라스미드 등)의 부분을 도입함으로써 쉽게 얻을 수 있다. 일반적으로 마스터 균주는 백신 투여에 적합한 원하는 특성에 근거하여 선택된다. 예를 들어, 백신 제조를 위해, 예를 들어, 약독화 생백신의 제조를 위해, 마스터 도어 바이러스 균주가 약독화 표현형, 추위적응 및/또는 온도 민감성을 위해 선택될 수 있다.
FluMist?
상기한 바와 같이, 인플루엔자 백신의 다양한 실시예 및 종류가 존재한다. 인플루엔자 백신의 예는 어린이 및 어른을 인플루엔자 질병으로부터 보호해 주는 약독화 생백신 FluMist이다.(Belshe et al. (1998) The efficacy of live attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenza virus vaccine in children N. Engl . J. 0 Med . 338:1405-12; Nichol et al.(1999) Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy, working adults: a randomized controlled trial JAMA 282:137-44). 일반적인 실시예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 FluMist 백신의 제조에 선택적으로 적응되거나 또는 FluMist 백신의 제조와 함께 사용된다. 그러나, 당업자에 의해 본 명세서의 단계/조성물이 유사하거나 심지어 동일한 바이러스 백신 및 이들의 조성물의 제조에도 적응가능한 것이 바람직할 것이다.
FluMistTM 백신 균주는 예를 들어, 야생형 균주로부터 유도된 HA 및 NA 유전자 단편을 포함하고, 상기 백신은 마스터 공여 바이러스(MDV)로부터의 6개의 유전자 단편, PBl, PB2, PA, NP, M 및 NS을 따라 만들어진다. FluMist의 인플루엔자 A 균주용 MDV(MDV-A)는 성공적으로 낮은 온도에서의 1차 병아리 신장 조직 배양에서 야생형 A/Ann Arbor/6/60(A/AA/6/60) 균주의 연속 계대에 의해 생성된다(Maassab (1967) Adaptation and growth characteristics of influenza virus at 25 degrees C Nature 213:612-4). MDV-A는 25℃(ca, 추위적응)에서 효과적으로 복제되지만, 그 성장은 38 및 39℃에서(ts, 온도민감성) 제한된다. 또한, 이러한 바이러스는 감염된 페렛(att, 약독화)의 폐에서 복제되지 않는다. ts 표현형은 호흡기계의 차가운 영역을 제외한 모든 부분에서 그 복제를 제한함으로써 인간에서의 백신의 약독화에 기여하는 것으로 생각된다. 이러한 특성의 안정성은 동물 모델 및 임상 연구에서 확인되었다. 화학적 돌연변이에 의한 인플루엔자 균주의 ts 표현형과 대조적으로, MDV-A의 ts 특성은 감염된 햄스터 또는 아이들로부터 분리된 쉐드(shed)를 통한 이어지는 계대를 복귀시키지 않는다(최신 자료로, Murphy & Coelingh (2002) Principles underlying the development and use of live attenuated cold-adapted influmza.A and B virus vaccines Viral Immunol . 15:295-323 참조).
12개의 개별 6:2 유전자 재배열 균주와 관련된, 20,000명의 성인 및 아이들을 대상으로 한 임상 연구는 이러한 백신이 약독화되고, 안전하고, 그리고 효과적임을 나타냈다(Belshe et al. (1998) The efficacy of live attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenza virus vaccine in children N. Engl . J. Med . 338:1405-12; Boyce et al. (2000) Safety and immunogenicity of adjuvanted and unadjuvanted subunit influenza vaccines administered intranasally to healthy adults Vaccine 19:217-26; Edwards et al. (1994) A randomized controlled trial of cold adapted and inactivated vaccines for the prevention of influenza A disease J. Infect . Dis . 169:68-76; Nichol et al. (1999) Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy, working adults: a randomized controlled trial JAMA 282:137-44). 야생형 바이러스의 MDV-A의 6개의 내부 유전자 및 2개의 HA 및 NA 유전자 단편을 갖는 유전자 재배열은(즉 6:2 유전자 재배열) 계속하여 ca, ts 및 att 표현형을 유지하였다(Maassab et al. (1982) Evaluation of a cold-recombinant influenza virus vaccine in ferrets J. Infect . Dis . 146:780-900). 그러나 인플루엔자 B 균주를 사용한 이러한 유전자 재배열 바이러스의 제조는 더욱 어렵다.
최근의 연구(예를 들어, 상기한 PCT 공개 WO 03/091401 참조)는 클로닝된 cDNA로부터의 전체 인플루엔자 B 바이러스의 제조를 위한 8개의 플라스미드 시스템 및 백신 제제, 예를 들어, 비강 투여용 바이러스 생백신 제제에 적합한 약독화 생 인플루엔자 A 및 B 바이러스의 제조 방법을 나타냈다. 본 발명은 또한 B 균주 제조의 향상된 방법을 나타낸다.
상기한 시스템 및 방법은 FluMist?와 같은 비강 투여에 적절한 백신과 같은 약독화 생백신을 포함하는, 백신으로 사용하기에 적절한 바이러스를 포함하는, 유전자 재조합 및 유전자 재배열 인플루엔자 A 및 B 바이러스의 신속한 제조에 유용하다. 본 명세서의 본 발명의 방법은 예를 들어, 더 안정되고, 일관성있고 그리고 생산성있는 방법으로 백신용 바이러스를 제조하기 위한 백신 제조용 유전자 재배열 인플루엔자 바이러스와 관련된 이러한 상기 연구와 함께 또는 조합으로 선택적으로 사용된다.
세포 배양에서 바이러스 복제
상기한 바와 같이, 인플루엔자 바이러스는 선택적으로 세포 배양에서 배양될 수 있다. 일반적으로 바이러스의 증식은 숙주 세포가 일반적으로 배양되는 배지 조성물 내에서 수행된다. 인플루엔자 바이러스의 복제에 적절한 숙주 세포는 예를 들어, Vero 세포, BHK 세포, MDCK 세포, 293T 세포를 포함하는 293 세포 및 COS 세포, COS7 세포를 포함한다. 일반적으로, 상기 세포 라인의 2가지를 포함하는 공동 배양, 예를 들어, MDCK 세포 및 293T 또는 COS 세포는 복제 효능을 높이기 위해서 예를 들어, 1:1의 비율로 사용된다. 일반적으로, 세포는 중성 버퍼 pH(예를 들어, 7.0 내지 7.2의 pH)를 유지하기에 적절한 제어된 습도 및 CO2 농도 하에서, 표준 상업적 배양 배지, 예를 들어, Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with serum (예를 들어, 0.5-10% 소태아혈청), 또는 혈청부재 배지(예를 들어 Iscove's medium, ultra CHO medium (BioWhittaker), EX-CELL (JRH Biosciences)), 또는 동물 단백질부재 배지(예를 들어 PF-CHO (JRH Biosciences) 내에서 배양된다. 선택적으로, 배지는 박테리아 성장을 방지하기 위한 항생제, 예를 들어, 페니실린, 스트렙토마이신 등, 및/또는 추가적 영양분, 예를 들어, L-글루타민, 소듐 파이루베이트, 비필수 아미노산, 적절한 성장 특성을 촉진하는 추가적 보조제, 예를 들어, 트립신, β-메르캅토에탄올, 및 이의 유사물을 포함한다.
배양 내에서 포유동물 세포를 유지하는 방법은 널리 보고되었고, 당업자에게 공지되었다. 일반적인 과정이 예를 들어, Freshney (1983) Culture of Animal Cells: Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, New York; Paul (1975) Cell and Tissue Culture, 5th ed., Livingston, Edinburgh; Adams (1980) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Cell Culture for Biochemists, Work and Burdon (eds.) Elsevier, Amsterdam에 제공된다. 시험관내에서 인플루엔자 바이러스의 제조에서 특정한 원하는 조직 배양방법에 관한 추가적 설명은 예를 들어, Merten et al. (1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation in Cohen and Shafferman (eds.) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines을 포함한다. 또한, 본 발명에 적응되는 이러한 방법에서의 변이가 쉽게 일반적 실험을 통하여 결정되고, 당업자에게 친숙할 것이다.
인플루엔자 바이러스 제조용 세포는 혈청을 포함하거나 또는 혈청 부재이거나 또는 동물 단백질 부재 배지 내에서 배양될 수 있다. 몇몇의 경우에, 예를 들어, 정제된 바이러스의 제조에서, 혈청 부재 또는 동물 단백질 부재 조건에서 숙주 세포를 배양하는 것이 일반적으로 바람직하다. 세포는 기재(예를 들어, 마이크로캐리어) 위에서 부착 세포로 배양되거나, 어느 기재에도 부착하지 않고 세포 현탁액으로 배양될 수 있다. 세포는 작은 규모, 예를 들어, 25 ml 미만의 배지, 배양 튜브 또는 플라스크 내에서, 또는 교반기가 달린 큰 플라스크 내에서, 회전 용기 내에서, 또는 플라스크, 용기 또는 배양 반응기 내의 마이크로캐리어 비드(예를 들어, DEAE-덱스트란 마이크로캐리어 비드, 예를 들어, Dormacell, Pfeifer & Langen; 슈퍼비드, Flow Laboratories; 스티렌 공중합체-트리-메틸아민 비드, 예를 들어, Hillex, SoloHill, Ann Arbor) 위에서 배양될 수 있다. 세포 배양의 부피 당 부착 세포 성장에 있어 큰 표면적을 제공하는 마이크로캐리어 비드는 작은 구형(100-200 미크론의 지름)이다. 예를 들어, 배지 1 리터는 8000 제곱 센티미터 이상의 성장 표면을 제공하는 2천만 이상의 마이크로캐리어 비드를 포함할 수 있다. 바이러스의 상업적 제조에 있어, 예를 들어, 백신 제조에 있어, 생물반응기 또는 발효조에서 세포를 배양하는 것이 바람직하다. 생물반응기는 1 리터 이하에서부터 100 리터 이상까지의 부피에서 사용가능하고, 예를 들어, Cyto3 Bioreactor (Osmonics, Minnetonka, MN); NBS bioreactors (New Brunswick Scientific, Edison, N.J.); laboratory and commercial scale bioreactors from B. Braun Biotech International (B. Braun Biotech, Melsungen, Germany)가 있다.
배양 부피를 고려하지 않고도, 많은 바람직한 형태에서, 여과를 위한 바이러스 용액의 가열, 온도 의존 다중 플라스미드 시스템(예를 들어, 상기한 PCT 공개 WO 03/091401 참조)을 사용하는 바이러스 복제 및/또는 유전자 재조합 및/또는 유전자 재배열 인플루엔자 바이러스의 효율적 회수를 위해, 배양 온도가 적절히 유지되는 것이 중요하다. 일반적으로 조절기, 예를 들어, 세포 배양 시스템 및/또는 다른 용액의 온도를 감지하고 유지하는 온도계, 또는 다른 장치들은 적절한 기간(예를 들어, 바이러스 복제 등) 동안 온도가 정확한 수준임을 확인하고 보증하기 위하여 사용된다.
몇몇 방법에서(예를 들어, 유전자 재배열 바이러스가 벡터의 단편으로부터 제조되는 것인 방법), 인플루엔자 게놈 단편을 포함하는 벡터는 예를 들어, 칼슘 포스페이트 공동침전, 일렉트로포레이션, 마이크로인젝션, 리포펙틴, 및 폴리아민 트랜스펙션 시약을 사용한 트랜스펙션을 포함한, 비상동성 핵산을 진핵 세포 내로 도입하는 공지된 방법에 따라 숙주 세포 내로 도입된다(예를 들어, 트랜스펙션됨). 예를 들어, 벡터, 예를 들어, 플라스미드는 유전자 재배열 바이러스 등을 제조하기 위하여 숙주 세포, 예를 들어, COS 세포, 293T 세포 또는 COS 또는 293T 세포와 MDCK 세포의 조합 내로 제조사 지시에 따라 폴리아민 트랜스펙션 시약 TransIT-LT1 (Minis)을 사용하여 트랜스펙션될 수 있다. 숙주 세포 내로 도입되어야 할 각 벡터의 약 1㎍과 약 2㎍의 TransIT-LT1을 160㎕의 배지, 바람직하게는 혈청부재 배지로 희석하여 총 부피 200㎕로 하였다. DNA:트랜스펙션 시약 혼합물을 상온에서 45 분간 배양하고, 800 ㎕의 배지를 가하였다. 트랜스펙션 혼합물을 숙주 세포에 가하고, 세포를 상기한 바대로 또는 당업자에게 공지된 다른 방법을 통해 배양하였다.그리고, 세포 배양 내에서 유전자 재조합 또는 유전자 재배열 바이러스의 제조를 위하여, 각각의 8개의 게놈 단편(PB2, PBl, PA, NP, M, NS, HA 및 NA)을 혼입한 벡터를 약 20㎕의 TransIT-LT1과 혼합하고, 숙주 세포 내로 트랜스펙션하였다. 선택적으로, 혈청-함유 배지를 트랜스펙션 전에 혈청부재 배지, 예를 들어, Opti-MEM I로 교환하고 4-6 시간 동안 배양하였다.
대안으로, 일렉트로포레이션이 인플루엔자 게놈 단편을 혼입한 이러한 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는데 사용될 수 있다. PCT 공개 WO 05/062820을 참조한다. 예를 들어, 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B 바이러스를 혼입한 플라스미드 벡터는 다음의 방법에 따른 일렉트로포레이션을 통해 Vero 세포에 호의적으로 도입된다. 간략하게, 예를 들어, 10% 소태아혈청(FBS)을 포함한 Modified Eagle's Medium(MEM)에서 배양된 약 5 x 106 Vero 세포를 0.4 ml의 OptiMEM으로 재현탁하고, 일렉트로포레이션 큐벳에 위치시킨다. 25㎕ 이하의 부피 내의 20 ㎍의 DNA를 큐벳 내의 세포에 가하고, 그 후 탭핑에 의해 가볍게 혼합하였다. 일렉트로포레이션은 제조사의 지시(예를 들어, BioRad Gene Pulser II with Capacitance Extender Plus connected)에 따라 300 볼트, 950 마이크로페렛에서 28-33 msec의 시간으로 수행된다. 세포를 탭핑으로 가볍게 다시 혼합하고, 일렉트로포레이션 약 1-2분 후에, 10% FBS를 포함한 0.7 ml MEM을 직접 큐벳에 가하였다. 세포를 그 후 2 ml MEM, 10% FBS을 포함하는 표준 6-웰 조직 배양 접시의 2개의 웰에 옮겼다. 큐벳을 남은 세포의 회수를 위해 세척하고, 세척한 현탁액을 2개의 웰에 나누어 넣었다. 최종 부피는 약 3.5 mL이다. 세포를 그 후 바이러스 배양에 적합한 조건, 예를 들어, 추위적응 균주의 경우 약 33℃에서 배양하였다.
몇몇 방법(예를 들어, 숙주 세포가 백신 제조용 바이러스 제조에 사용되는 경우)에서, 숙주 세포가 배양되고, 당업자에게 공지된 방법에 따라 바이러스로 감염된다. 예를 들어, 배양된 세포의 감염은 바람직하게는 세포가 최적 세포 밀도를 나타낼 때(예를 들어, 약 5x105 내지 2Ox1O6 세포/ml, 사용되는 배양 조건에 따라)에 수행된다. 숙주 세포는 약 0.001 내지 약 10 (선택적으로, 약 0.002 내지 약 0.5의 m.o.i.)의 감염 다중도(m.o.i.:multiplicity of infection)에서 감염된다. 일반적으로, 동물 세포 내에서의 효과적인 바이러스의 복제는 프로테아제(예를 들어, 세린 프로테아제, 예를 들어, 트립신)의 첨가가 필요하고, 필요에 따라 프로테아제는 감염 조금 전에, 동시에, 또는 감염 조금 후에 배양액에 첨가될 수 있다. 본 발명에 따라, 바이러스 감염 후에, 감염된 세포는 바이러스를 복제하기 위하여 33℃ 미만의 온도, 예를 들어, 31℃(또는 선택적으로 약 29℃ 내지 약 32℃에서)에서 최대 세포병리학적 효과 또는 최대 양의 바이러스가 관찰될 때까지 더욱 배양하였다(예를 들어, TCID50 측정법 및 Q RT-PCR 측정법). 선택적으로, 감염된 세포의 배양은 약 2 내지 약 10일간 수행되었다. 바이러스 함유 세포 상등액의 제조에 유용한 특정 방법은 당업계에 공지되었다(예를 들어, 미국특허 4,500513, 6,656,720, 6,455,298 및 6,146,873 참조). 다른 단계(유사하거나 동일한)가 선택적으로 본 발명의 방법에 사용되는 것이 바람직할 것이다.
키트
본 발명의 방법 및 조성물의 사용을 촉진하기 위하여, 실험실적으로 또는 치료 백신 목적으로의, 인플루엔자 바이러스의 패키징 및 감염에 유용한, 임의의 백신 성분 및/또는 조성물, 예를 들어, 다양한 제제 등에 있는 바이러스, 및 추가적 성분, 예를 들어, 버퍼, 세포, 배양 배지가 키트의 형태로 묶일 수 있다. 일반적으로, 키트는 상기 성분들과 함께 예를 들어, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 지시서, 포장 물질, 및 컨테이너를 포함하는 추가적 물질을 포함한다.
명확성 및 이해를 위하여 발명이 상기 자세히 기술되었지만, 본 발명의 진정한 범위를 벗어나지 않는 한, 이 개시물을 읽는 당업자에게는 다양한 형태 및 구체적 사항의 변형이 가능하다는 것이 명확할 것이다. 예를 들어, 상기한 모든 기법 및 기구들이 다양한 조합으로 사용될 수 있다. 모든 공지물, 특허, 특허 출원, 또는 본 명세서에서 인용된 다른 문헌들은 각 개별 공지물, 특허, 특허 출원, 또는 다른 문헌이 개별적으로 모든 목적을 위해 참조로 통합된 것과 같은 정도로, 모든 목적을 위하여, 참조로서 본 명세서에 그 전체가 통합된다. 또한, 2004년 12월 8일에 출원된 미국 특허가출원 제60/634,690호는 모든 목적을 위해 그 전체가 본 명세서에 참조로서 통합된다.
Claims (24)
- a. 인플루엔자 바이러스의 게놈 또는 부분적 게놈을 포함하는 하나 이상의 벡터를 하나 이상의 숙주 란에 도입하는 단계;
b. 33℃ 미만의 온도에서 상기 숙주 란을 배양하는 단계; 및
c. 상기 숙주 란으로부터 인플루엔자 바이러스 입자를 회수하는 단계
를 포함하는, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 입자의 제조 방법. - 제1항에 있어서, 상기 바이러스가 인플루엔자 B 균주 바이러스를 포함하는 것인 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 게놈 또는 부분적 게놈이 약독화 인플루엔자 바이러스, 추위적응 인플루엔자 바이러스, 온도민감성 인플루엔자 바이러스, 약독화 추위적응 인플루엔자 바이러스, 또는 약독화 온도민감성 인플루엔자 바이러스, 또는 추위적응 온도민감성 인플루엔자 바이러스, 또는 약독화 추위적응 온도민감성 바이러스의 게놈 또는 부분적 게놈인 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 게놈 또는 부분적 게놈이 ca B/Jilin/20/03, PR8, ca B/Ann Arbor/1/94, B/Leningrad/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14/55, 또는 B/England/2608/76 인플루엔자 바이러스 균주의 게놈 또는 부분적 게놈인 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 숙주 란이 닭의 SPF 유정란을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 숙주 란이 31℃ 내지 33℃에서 배양되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 숙주 란이 31℃ 내지 32℃에서 배양되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 숙주 란이 31℃에서 배양되는 것인 방법.
- 제1항의 방법에 의하여 제조되는 인플루엔자 바이러스.
- 제9항의 바이러스를 포함하는 냉장고에서 안정한(refrigerator-stable) 조성물.
- 제9항의 바이러스를 포함하는 인플루엔자 백신.
- 제11항에 있어서, 상기 백신이 액체 약독화 비강내 생백신을 포함하는 것인 백신.
- 제1항에 있어서, 33℃ 미만에서의 배양으로부터 생성된 회수된 바이러스 입자가 33℃ 이상에서 배양된 동일한 바이러스 입자로부터 생성된 수율 이상의 수율을 갖는 것인 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 33℃ 미만에서의 배양이 31℃에서의 배양이고, 상기 33℃ 이상에서의 배양이 33℃에서의 배양인 것인 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 수율은 33℃ 미만에서 배양된 바이러스 입자로 감염된 숙주 란의 요막강액(allantoic fluid)의 1og10 TCID50/mL 역가(titer)의 측정 및 33℃에서 배양된 바이러스 입자로 감염된 숙주 란의 요막강액의 1og10 TCID50/mL 역가의 측정에 의해 정량화되는 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 31℃에서의 배양으로부터의 1og10 TCID50/mL 역가가 33℃에서의 1og10 TCID50/mL 역가보다 약 1.01 내지 약 1.10 배 이상, 약 1.025 내지 약 1.05 배 이상, 또는 약 1.03 내지 약 1.04 배 이상인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 바이러스 입자가 개체내에서 면역 반응을 일으키고, 상기 반응은 33℃ 이상에서의 배양에 의해 제조된 바이러스 입자에 의해 상기 개체 내에서 일어나는 면역 반응과 실질적으로 유사한 것인 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 개체가 페렛(ferret)인 것인 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 개체가 인간인 것인 방법.
- 숙주 내의 인플루엔자 바이러스를 33℃ 미만의 온도에서 배양하는 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스 입자의 수율 증가 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 숙주 내의 인플루엔자 바이러스가 31℃ 내지 32℃에서 배양되는 것인 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 숙주 내의 인플루엔자 바이러스가 약 31℃에서 배양되는 것인 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스가 추위적응 온도민감성 약독화 인플루엔자 바이러스인 것인 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스가 Ann Arbor B 균주 인플루엔자의 하나 이상의 vRNA 게놈 단편을 포함하는 것인 방법.
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