KR100848719B1 - 감염성 인플루엔자 바이러스 생성용 ｄｎａ 트랜스펙션시스템 - Google Patents

감염성 인플루엔자 바이러스 생성용 ｄｎａ 트랜스펙션시스템 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바이러스 RNA의 효과적인 세포내 합성을 위한 이중 프로모터 시스템(바람직하게는 RNA pol I-pol II 시스템)의 개발에 기초한다. 생성된 최소 플라스미드계 시스템은 임의의 RNA 바이러스, 바람직하게는 음성 단일가닥 RNA 게놈을 가진 바이러스를 합성하는데 사용될 수 있다. 상기 시스템의 바이러스 생성물은 상기 시스템의 플라스미드가 적합한 숙주세포 내로 도입될 때 생산된다. 상기 시스템의 한가지 응용은 백신에서 항원으로 사용하기 위하여 감약된, 재분류 인플루엔자 바이러스를 생산하는 것이다. 플라스미드의 공동트랜스펙션에 의해 생성된 재분류 바이러스는 현재 집단을 감염시키는 인플루엔자 바이러스의 표면 당단백질 헤마글루티닌과 뉴라미니다제를 암호화하는 유전자 및 감약된 인플루엔자 바이러스의 내부 유전자를 포함할 수 있다. 본 발명의 유리한 특성은 이의 다재다능성이다; 상기 시스템은 임의의 RNA 바이러스의 감약된 형을 신속하고 쉽게 합성할 수 있다. 본 발명에 의해 생산된 감약된 또는 불활성화된 RNA는 비강 내 또는 근육 내를 포함하는 여러 가지 경로 중 하나에 의해 백신접종이 필요한 환자에게 투여할 수 있다.
Figure R1020077013242
인플루엔자, 바이러스, 감염성, 플라스미드

Description

감염성 인플루엔자 바이러스 생성용 ＤＮＡ 트랜스펙션 시스템 {DNA TRANSFECTION SYSTEM FOR THE GENERATION OF INFECTIOUS INFLUENZA VIRUS}
도 1. vRNA와 mRNA의 합성을 위한 pol I-pol II 전사 시스템의 개략도. 8개 인플루엔자 바이러스 단편 각각의 cDNA는 pol I 프로모터(PIh)와 pol I 터미네이터(tI) 사이에 삽입된다. 이러한 pol I 전사 단위는 인간 사이토메갈로바이러스의 pol II 프로모터(pIICMV)와 소 성장 호르몬을 암호화하는 유전자의 폴리아데닐레이션 신호(aIIBGH) 옆에 위치한다. 8개의 발현 플라스미드를 트랜스펙션시킨 후, 2가지 형태의 분자를 합성한다. 인간 pol I 프로모터로부터, 음성-센스 vRNA가 세포 pol I에 의해 합성된다, 합성된 vRNA는 5' 및 3' 말단에 비암호화영역(NCR)을 포함한다. pol II에 의한 전사에 의해 5' 캡 구조와 3' 폴리 A 테일을 가지는 mRNA가 만들어지고; 이들 mRNA는 바이러스 단백질로 번역된다. 바이러스 cDNA의 ATG는 pol II 전사개시부위 하부의 첫번째 ATG이다.
도 2a와 2b. 인플루엔자 A 바이러스를 생성하기 위한 8개의 플라스미드 pol I-pol II 시스템. 인간 pol I 프로모터와 pol II 프로모터 사이에 삽입된 8개의 바이러스 cDNA를 포함하는 8개의 발현 플라스미드(도 1 참조)를 진핵 세포에 트랜스펙션시킨다. 각 플라스미드는 2개의 다른 프로모터를 포함하기 때문에, 양 세포성 pol I 및 pol II는 아마 다른 핵 구획에서 플라스미드 주형을 전사하여, 바이러스 mRNA와 vRNA를 합성할 것이다. 바이러스 중합효소 복합체 단백질(PB1, PB2, PA, NP)을 합성한 후, 바이러스 복제 주기가 개시된다. 결국 세포성 전사 및 번역기구에서 직접(pol II 전사) 또는 간접(pol I 전사 및 바이러스 복제) 유래된 모든 바이러스 분자를 어셈블리하면 모든 합성된 분자(vRNP 및 구조단백질 HA, NA, M1, M2, NS2/NEP)가 상호작용하여 감염성 인플루엔자 A 바이러스를 생성할 수 있다.
도 3a와 3b. 8개의 발현 플라스미드를 구성하고 트랜스펙션시켜 A/Teal/HK/W312/97 (H6N1)을 회수하기 위하여 개발된 방법의 개략도. 도 3a. 바이러스 RNA를 바이러스 입자로부터 추출하였다. 타입 II 제한 엔도뉴클레아제 BsmBI 또는 BsaI에 대한 서열과 단편-특이적 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 행하였다. 8개의 바이러스 PCR 단편을 BsmBI 또는 BsaI으로 분해하고 pHW2000(BsmBI으로 선형화됨) 속에 삽입하였다. 이 삽입결과, 바이러스 cDNA가 pol I 프로모터 및 터미네이터에 정확하게 융합된 8개의 발현 구조체가 만들어졌다(바이러스 종결서열 AGC...ACT는 검은 색 직사각형 내에 PB2 단편으로 나타낸다). 도 3b. pol I 프로모터와 pol II 프로모터를 사용한 8개의 발현 플라스미드는 8개의 단편의 바이러스 cDNA 각각의 하나의 사본을 포함한다. 10개의 바이러스 단백질에 대한 오픈 리딩 프레임은 단편-특이적 비암호화 영역 옆에 위치한다(회색 박스). 사용된 인간 pol I 프로모터는 인간 또는 관련된 종에서 유래한 세포주에서만 높은 활성을 나타내기 때문에, 인간 293T 세포는 인플루엔자 A에 사용되는 표준 세포주(MDCK-세포)와 함께 공동배양하였다. 트랜스펙션 후 293T 세포에서 생산된 바이 러스는 MDCK 세포와 복제물을 감염시킬 수 있다.
도 4a와 4b. RT-PCR에 의한 회수 바이러스의 특성화. 도 4a. MDCK 세포 상의 트랜스펙션된 세포의 상등액을 2회 계대배양한 후 바이러스 입자로부터 RNA를 추출하였다(표 1 및 2 참조). 비리온으로부터 추출된 vRNA를 사용하고 NS 유전자 단편에 특이적인 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 행하였다. 사용된 NS 프라이머는 균주특이적이 아니고; 따라서, 임의의 인플루엔자 A NS 단편을 증폭시킬 수 있었다. 반응산물은 2% 아가로즈 겔에서 전기영동하였다. 증폭된 DNA 단편이 트랜스펙션된 세포로부터 옮겨진 플라스미드 DNA로부터가 아니라 vRNA로부터 유래되었다는 것을 보증하기 위하여, 역전사효소(RT)를 첨가하지 않고 한 반응을 행하였다. 레인 1과 2, 재조합 A/Teal/HK/W312/97 (표 1); 레인 3과 4, M-재분류(표 2); 레인 5와 6, NS-재분류(표 2); 레인 7과 8, 재조합 A/WSN/33 바이러스(표 1); 레인 9와 10, 4중-재분류(표 2). 도 4b. 도 4a에 도시된 단편의 NcoI 분해. NS 단편의 동일성은 증폭된 산물의 서열분석에 의해서도 확인하였다(도시하지 않음).
도 5. 일방향 RNA pol I-pol II 전사 시스템, 일방향 pol I-pol II 전사 시스템에서, 바이러스 cDNA는 인간 pol I 프로모터 (pIh)와 터미네이터 서열(tI) 사이에 양성-센스 배향으로 삽입된다. 이 완전한 pol I 전사 단위는 pol II(pIICMV: 인간 사이토메갈로 바이러스의 최초기 프로모터) 및 소의 성장호르몬을 암호화하는 유전자의 폴리아데닐레이션 부위(aIIbgh) 옆에 위치한다. 트랜스펙션 후, 2가지 형태의 RNA 전사체가 합성되는 것으로 생각된다. 5'말단에 트리포스페이트 기를 가진 양성 -센스 cRNA는 pol I에 의해 합성되고, 5'-캡 구조와 3' 말단에 폴리(A) 테일을 가지는 양성-센스 mRNA는 pol II에 의해 합성되었다. mRNA의 양 요소는 효율적인 번역에 필요하다.
도 6. 일렬로 배열된 pol I과 pol II 프로모터를 가진 클로닝 벡터 pHW11. 이 플라스미드는 225-bp 인간 RNA pol I 프로모터(pIh)와 33-bp 쥐의 터미네이터(tI)를 포함한다. pol I 프로모터와 터미네이터 서열은 인간 사이토메갈로 바이러스의 RNA 중합효소 II 프로모터(pIICMV)와 소의 성장 호르몬을 암호화하는 유전자의 폴리아데닐레이션 신호(aIIBGH) 옆에 위치한다. pol I 프로모터와 터미네이터 사이에 바이러스 cDNA를 삽입하기 위하여, 두개의 BsmBI 제한 부위(밑줄로 표시)를 도입하였다. BsmBI로 벡터를 분해하여 점착성이지만 비상보적인 돌출말단을 가진 벡터단편을 만들었다. 이 벡터의 디자인은 pol I 프로모터와 터미네이터 서열에 대하여 양성-센스 배향으로 바이러스 cDNA가 정확하게 융합하도록 한다. 대장균 내에서 증식하기 위하여, 플라스미드는 복제 출발점(ori)을 가지고, 암피실린-포함 배지에서의 선택하기 위하여, 플라스미드는 베타-락타마제 유전자(bla)를 포함한다.
도 7a와 7b. 감염성 RNA 바이러스를 생성하기 위한 이중 프로모터 시스템. RNA 바이러스는 세포 기생균으로 기능하기 때문에, 이들은 이들의 유전정보의 발현을 위해 숙주세포를 이용하는 방법을 최적화해야만 한다. 모든 RNA 바이러스는 단백질로 번역될 수 있는 mRNA를 합성해야만 한다. 일반적으로, 합성된 단백질은 복제, 전사 및 새로운 자손 바이러스 입자를 만드는데 필요하다. 게놈 RNA의 효율적 복제를 위하여, 정확한 5'과 3' 말단을 가진 RNA-전사체가 만들어져야 한다.
본 시스템은 외부 및 내부 전사단위를 포함한다. 내부 전사단위는 프로모터(p(+RNA) 또는 p(-RNA)), 바람직하게는 pol I 프로모터를 포함한다. RNA 바이러스의 cDNA는 비암호화영역(NCR) 옆에 위치한 하나 이상의 오픈 리딩 프레임(ORF)으로 구성된다. 바이러스 cDNA와 프로모터 사이에 서열이 없는 것이 바람직하다. 중간에 서열이 없는 것은 필수적인데, 이는 게놈 vRNA의 5' 및 3' 말단이 일반적으로 전사 및 복제에 필요한 바이러스 단백질이 인식하는 서열을 포함하고; 추가적인 비바이러스 서열은 바이러스 단백질이 vRNA를 효과적으로 인식하고 복제하는 것을 방해하기 때문이다. 중간에 서열이 없으면 전사된 (-)가닥 RNA(도 7a) 또는 (+)가닥 RNA(도 7b)가 바이러스 중합효소 단백질에 의해 효과적으로 사용될 수 있다. 외부 전사 단위는 프로모터(p(mRNA)), 바람직하게는 cDNA로부터 mRNA의 전사를 지시하는 pol II 프로모터를 가지고; mRNA는 번역개시와 바이러스 단백질의 생산에 필요한 5' 서열(예를 들면, 메틸 G 캡)과 3'서열(예를 들면, 폴리 A 테일)을 포함한다. 번역과정은 외부 전사단위의 프로모터와 바이러스 cDNA 사이의 추가서열에 관대하기 때문에, 내부 전사단위로부터 중간서열이 존재해도 mRNA의 번역을 그다지 방해하지 않는다.
이 시스템은 내부 전사단위에서 다른 프로모터들(예를 들면, pol II, pol III, T3, SP6, T7 또는 DNA-의존성 RNA 중합효소에 대한 임의의 다른 프로모터) 및 정확한 5' 및 3' 말단을 가진 바이러스 RNA의 세포내 합성을 위한 종결인자 또는 리보자임을 사용함으로써 인플루엔자 바이러스외의 RNA 바이러스에 대해 변형되고 개선될 수 있다(아래에서 설명). 정확한 말단을 가진 바이러스 RNA를 생성하기 위하여 귀상어 리보자임이나 델타 간염 바이러스(HDV) 리보자임을 사용할 수 있다(Schnell et al ., EMBO J. 1994, 13:4195; Pleschka et al., J. Virol. 1996, 70:4188; Herold, J. et al ., J. Virol 2000, 74(14):6394-400).
외부 전사단위는 pol I 또는 III 프로모터, T7 RNA 중합효소 프로모터, T3 RNA 중합효소 프로모터, SP6 RNA 중합효소 프로모터, 또는 DNA-의존성 RNA 중합효소용 임의의 다른 프로모터를 포함할 수 있다. 외부 전사단위의 프로모터가 메틸 G 캡이 없는 전사체의 합성을 지시한다면, 내부 리보좀 입구 부위(IRES, Internal Ribosome Entry Site)는 cDNA 암호화 서열의 5' 말단에 위치하여 번역개시를 촉진할 수 있다(아래에서 설명).
벡터 pHW2000이 CMV-프로모터 및 종결부위 사이에 T7 프로모터를 가진다는 것은 주목할만 하다. pol II 전사체는 핵에서 합성되는, 반면 T7-전사체는 T7 RNA 중합효소를 발현하는 세포의 세포질에서 합성된다. 따라서, 외부 전사단위 중 하나 이상의 프로모터에서 시작하는 전사체는 다른 mRNA들을 생산할 수 있다. 따라서, pHW2000에서 유래된 발현 플라스미드는 pol II 또는 T7 프로모터 또는 양자의 조합이 내부 리보좀 입구 부위(IRES)를 가지는 양성 가닥 바이러스의 mRNA 합성에 가장 바람직한지 여부를 빨리 평가할 수 있다.
도 8. (+)가닥 RNA 바이러스의 생성을 위한 이중 프로모터 시스템. 본 발명은 또한, C형 간염 바이러스와 같은 양성 가닥, 단일분자 게놈을 포함하는 바이러스를 생산하는데 적합할 수 있다. 이 실시형태에서, C형 간염 바이러스 게놈을 포 함하는 cDNA는 cDNA가 mRNA와 전장 음성 RNA(이방향 접근방법) 또는 mRNA와 전장 양성 RNA(일방향 접근방법) 속으로 세포 내에서 효율적으로 전사되도록 하는 구조체 속으로 삽입된다. cDNA는 비암호화 영역(NCR) 옆에 위치한 하나의 오픈 리딩 프레임(ORF)으로 구성된다. 도면에는, 이방향 시스템을 포함하는 발현 플라스미드가 도시되어 있다. 전장 cDNA는 pol I(pI) 프로모터와 종결 서열(tI) 사이에 삽입되어 트랜스펙션 후 전장 (-)가닥 RNA를 합성한다.
내부 전사단위는 mRNA 합성을 구동하는 프로모터(p(mRNA))를 가지는 외부 전사단위 옆에 위치한다. 이 프로모터는 pol II 프로모터인 것이 바람직하다. 그러나, 합성된 RNA가 내부 리보좀 입구 부위(IRES)를 가진다면, pol II 프로모터는 pol I, pol III, SP6, T7 또는 T3 프로모터로 치환될 수 있다(T3 또는 T7 프로모터를 사용하면 T3 또는 T7 중합효소 단백질이 중합효소를 암호화하는 플라스미드를 공동트랜스펙션하거나 중합효소를 발현하는 안정한 세포주를 사용함으로써 발현될 필요가 있다). 외부 전사단위의 3'-말단에서, 폴리 A 신호 또는 삽입된 폴리 A 서열 중 하나는 합성된 mRNA에 대한 폴리 A 테일을 제공하는데 사용된다.
생성된 mRNA는 번역과 함께 및 번역 후에 분해되어 개별적인 구조 및 비구조 바이러스 단백질을 생성하는 큰 폴리단백질 전구체로 번역된다.
*RNA-의존성 RNA 중합효소 단백질인 비구조 단백질 NS5a와 NS5b는 바이러스 복제/전사주기를 개시하는 주형으로 내부 전사단위에 의해 합성된 (-)RNA를 사용한다. 따라서, 단백질로 번역되는데 사용되는 (+)RNA/mRNA가 생산된다. 결국, 바이러 스 구조 단백질과 함께 (+)RNA를 포함하는 감염성 바이러스가 생성된다.
도 9. 인간 파라인플루엔자 바이러스 III의 생성을 위한 pol I-pol II 시스템. 본 발명은 음성가닥, 단일분자 RNA 게놈을 포함하는 파라인플루엔자 III 바이러스를 생산하는데 사용될 수 있다. 바이러스 cDNA는 센스 또는 안티센스 배향으로 pol I-pol II 시스템 속으로 삽입될 수 있다. 도면에는, 일방향 시스템이 제시된다. pol I 프로모터는 cRNA의 합성을 지시하고, pol II 프로모터는 mRNA의 합성을 지시한다. 이 실시형태에서, pol II 프로모터는 제1 오픈 리딩 프레임이 뉴클레오캡시드(NP) 단백질로 효과적으로 번역되는 폴리시스트로닉 mRNA을 생산한다. 이 단백질은 복제에 필요하다. L 및 P-단백질을 암호화하고, 복제와 전사에도 필수적인 (그러나 폴리시스트로닉 mRNA로부터 효과적으로 번역되지 않는) 플라스미드가 제조되어 별도의 발현 플라스미드 상에 공동트랜스펙션된다. 문헌{Durbin, A.P. et al., Virology 1997, 235(2):323-332}에서 개발된 역유전학 시스템에 비해, pol I-pol II 시스템은 여러가지 장점을 가진다. 동일한 cDNA로부터 NP가 발현됨으로써, 이 최소 플라스미드 시스템은 클로닝된 cDNA로부터 완전한 인간 파라인플루엔자 III를 생성하기 위하여 4개의 플라스미드 대신 3개의 플라스미드만 구성하여 트랜스펙션시키면 된다. T7-프로모터로부터의 생체 내 전사에 기초한 역유전학 시스템과 달리, pol I-pol II 시스템은 각 세포에서 발견되는 진핵 DNA 의존성 RNA 중합효소에 의해 완전히 구동된다. 또한, T7 RNA 중합효소의 발현을 구동하는 백시니아 바이러스를 감염시키면 백시니아 바이러스에 허용되지만 인간 파라인플루엔자 바이러스의 성장에 가장 바람직하지는 않은 세포를 사용할 필요가 있고, 따라서 감염성 바이러스의 생성을 위한 이러한 접근방식의 유용성이 제한된다. 백시니아 바이러스의 심각한 세포유해 효과와 감염성 매개자를 사용하는데 필요한 안전경고는 이 시스템의 바람직하지 못한 특징이다. pol I-pol II 시스템을 사용하면 바이러스 감염에 필요한 요건들이 필요없고, 인간 파라인플루엔자 바이러스 III의 트랜스펙션과 성장을 위해 LLC-MK2 세포를 사용할 수 있어, 더 간단하고 안전한 방식으로 감약된 바이러스를 생성하는 기술을 제공한다.
도 10. 클로닝된 cDNA로부터 로타바이러스를 생성하기 위한 플라스미드계 시스템. 이 시스템은 단편화된 이중가닥 RNA 게놈을 가진 바이러스(예를 들면, 로타바이러스)의 생성에 사용될 수 있다. 이것은 예를 들면, 레오비리대 (10, 11, 12 dsRNA 단편) 또는 버나비리대(Birnaviridae)(2 dsRNA 단편) 과에 속하는 바이러스에 사용될 수 있다. 지금까지, 레오비리대과의 바이러스에 대해, 역유전학 시스템을 이용할 수 없었다. 이 도면은 11 dsRNA 단편을 가지는 로타바이러스가 본 발명을 사용하여 어떻게 생성될 수 있는지를 나타내지만, 오르비바이러스(Orbivirus)속 (10 dsRNA 단편) 또는 오르소레오바이러스(Orthoreoviruses)속(12 dsRNA 단편)에 속하는 바이러스에 대해서 유사한 시스템을 사용할 수 있다.
하기 내용은 클로닝된 cDNA로부터 완전한 로타바이러스 A/SA11을 생성하는 것을 설명한다. 유인원 로타바이러스 이중가닥 RNA 게놈의 11 단편 모두가 확인되었다. 게놈의 dsRNA는 길이가 3302bp 내지 663bp이고, 완전한 게놈의 크기는 18,550bp이다. 게놈단편은 PAGE(폴리아크릴아미드 겔 전기영동) 분석에서 이동성이 증가하는 순도로 1-11까지 번호를 붙인다. 단편은 완전히 염기쌍을 형성하고, (+)- 센스 가닥은 5'-말단 캡 구조(m7GpppGmGPy)를 가지지만 3'-말단 근처에 폴리아데닐레이션 신호를 가지지 않는다. 모든 게놈 단편은 5'-말단에서 10 뉴클레오티드 컨센서스와 3'-말단에서 8 뉴클레오티드 컨센서스를 가진 짧은 보존성 5' 및 3' 말단을 공유한다. 각 유전자에서, 이들 말단 영역의 바로 내부에, 단편-특이적인 30 내지 40 뉴클레오티드 이상의 보존된 제2영역이 있다. 5'-비번역영역(NTR)은 길이가 다양하지만 모두 50 뉴클레오티드 이하이고 모든 단편에서 NTR 뒤에 첫번째 AUG 뒤에 하나 이상의 긴 오픈 리딩 프레임이 온다. 단편 9와 11은 2개의 단백질을 암호화한다. 3'-NTR의 길이는 17 nts(단편 1)에서 182 nts(단편 10)까지 다양하다.
로타바이러스 cDNA는 이중 프로모터 시스템, 바람직하게는 pol I-pol II 시스템으로 클로닝된다. 생성된 플라스미드를 적합한 숙주세포 속으로 트랜스펙션시킨 후, 감염성 로타바이러스를 형성하는 바이러스 RNA와 단백질을 생산한다. 바람직하게는, 로타바이러스를 생산하는데 일방향 전사시스템을 사용한다. 이 접근방법을 사용하면, 그 5' 말단에서 트리포스페이트를 가지는 로타바이러스 게놈의 11 (+)RNA 분자가 세포내 합성된다. 바이러스유사 mRNA가 발현되면 바이러스 단백질이 발현된다. 구아닐트랜스퍼라제와 메틸트랜스퍼라제 활성을 가지는 바이러스 단백질 VP3(캡)은 11 로타바이러스 (+)RNA 모두에 5'-캡 구조를 추가하는 촉매작용을 한다(Chen D., et al., Virology 1999, 265:120-130). 또한 정제된 VP4(캡), 블루토그 바이러스(bluetogue virus, BTV)의 로타바이러스 VP3(캡) 유사체가 시험관 내에서 바이러스유사 (+)RNA에 캡구조를 추가할 수 있다는 것이 이미 확인되었다(Ramadevi N., et al ., Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95(23):13537-42). cDNA 의 생체 내 전사와 세포내 VP3(캡) 단백질 발현이 11 로타바이러스 게놈 단편 모두에 대해 캡이 있는 RNA를 생성할 것으로 예상된다. 이들 mRNA는 바이러스 단백질로 번역되거나 프레코어-RI으로 패키지된다. VP6(T13)-RI 입자를 형성한 후, 양성 센스 mRNA를 (-)RNA를 합성하기 위한 주형으로 사용한다. 결국, 형태를 형성하는 동안 VP4와 VP7를 추가하면 감염성 자손 비리온이 생긴다.
복제와 형태 형성의 효과적인 개시는 각 바이러스 단백질의 최적 농도에 따라 결정될 수 있기 때문에, RNA 합성과 단백질 발현을 위한 별도의 플라스미드를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 그러나, 단백질 발현의 수준이 숙주세포에서 플라스미드의 양을 변화시키거나 mRNA 합성에 다른 프로모터들을 사용함으로써 최적화될 수 있기 때문에, 하나의 단편에 2개의 플라스미드를 사용하는 것이 대부분의 유전자에 대해 필요하지 않을 것 같다. (+)RNArk (-)RNA로부터 합성되기 때문에, (+)RNA와 단백질의 세포내 발현이 바이러스 mRNA를 생산하는 복제 적합 단위를 생성할 수 있다. 따라서 이중 프로모터 시스템은 RNA와 단백질 발현 플라스미드가 별도의 플라스미드 상에 있다면 필요할 22개 보다 상당히 적은 수의 플라스미드를 포함하는 최소 플라스미드 시스템을 만들수 있게 한다. 로타바이러스 생성은 인플루엔자 A 바이러스를 생산하는데 사용되는 것과 유사한 방식으로 행해질 수 있다.
도 11a 내지 11d. RNA 바이러스 게놈의 복제 및 mRNA 합성.
도 11a. (-)가닥 바이러스를 감염시키는 동안 바이러스 중합효소 단백질에 의해 mRNA가 합성된다: 단편화된 RNA 바이러스에 대한 1 또는 2개의 mRNA 또는 단일분자 게놈을 가진 바이러스에 대한 다중 mRNA. 항종결 메카니즘은 (-) 게놈 RNA 로 복사될 수 있는 전장 (+)가닥을 합성한다.
도 11b. 앰비센스 RNA 바이러스의 단편화된 게놈은 복사되어 하나의 mRNA를 형성한다: 두번째 RNA는 상보물로부터 합성된다.
도 11c. 이중가닥 RNA 바이러스로 감염된 세포에서, 처음으로 합성된 mRNA는 단백질로 번역되거나 (-)가닥의 합성을 위한 주형이 되어, 이중가닥 게놈 RNA를 생성할 수 있다.
도 11d. (+)가닥 바이러스에 대해, 게놈 RNA는 또한 mRNA이고 (-)가닥 RNA로 복사될 수 있고, 이는 (+)게놈 RNA로 복사될 수 있다. 일부 (+)RNA 바이러스의 mRNA는 폴리 A 테일을 포함하지 않는다. 일부 과에서, 하나 이상의 서브게놈 RNA가 생산된다.
본 출원은 전체가 인용에 의해 본 명세서에 삽입된 2000년 4월 28일에 출원된 미국 가출원번호 제60/200,679호에 대한 우선권을 주장한다.
본 발명을 이끈 연구는 알러지 및 감염성 질환 국립연구소의 공중 위생 연구 허가 AI95357, AI29680, AI08831, AI29559 및 AI29680에 의해 지원을 받았다. 따라서, 미국정부는 본 발명에 대한 일정한 권리를 가질 수 있다.
본 발명은 클로닝된 DNA로부터, 감염성 RNA 바이러스, 바람직하게는 인플루엔자 바이러스를 생성하기 위한 최소 플라스미드계 시스템의 개발에 관한 것이다. 특히, 이 다중-플라스미드 pol I - pol II 시스템은 재조합 및 재분류 바이러스 모두의 생성을 촉진한다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스를 생성하기 위한 8 플라스미드 pol I - pol II 시스템을 포함한다. 또한 클로닝된 cDNA로부터 다른 RNA 바이러스를 완전히 회수하는데 응용할 수 있다.
RNA 바이러스의 생활주기
RNA 바이러스의 게놈은 단일분자 또는 단편; (+) 또는 (-) 극성의 단일가닥 또는 이중가닥을 포함하는 다른 구조들을 가진다. 그러나, 바이러스들은 2가지 필수적, 공통 요건을 공유한다: (1) 게놈 RNA는 자손 바이러스 입자 속으로 어셈블리하는데 효과적으로 사용될 수 있는 형태로 효과적으로 복사되어야만 하고 (2) 바이러스 단백질로 효과적으로 번역될 수 있는 mRNA가 합성되어야만 한다. 일반적으로 RNA 바이러스(레트로바이러스는 제외)는 (자손으로 어셈블리하기 위한) 새로운 게놈 RNA 및 (바이러스 단백질로 번역하기 위한) mRNA의 합성을 촉매작용하는 RNA-의존성 RNA 중합효소를 암호화 및/또는 가진다. 진핵 숙주세포는 RNA 주형을 복제하기 위한 또는 음성가닥 또는 이중가닥 RNA 주형으로부터 폴리펩티드를 번역하기 위한 기구를 가지고 있지 않기 때문에, 게놈에 이들 핵산을 포함하는 바이러스는 바이러스 입자 내에 RNA 중합효소 단백질을 가져야 한다. 이러한 이유로, 음성 가닥 또는 이중 가닥 RNA 바이러스의 탈단백질된 RNA 분자 (결합된 RNA 중합효소가 결여)는 비감염성이다. 이와 대조적으로, 양성 가닥 RNA 바이러스의 게놈으로부터의 탈단백질된 RNA는 암호화된 바이러스 단백질이 숙주세포 기구에 의해 번역되기 때문에 일반적으로 감염성이다.
게놈 바이러스 RNA는 바이러스가 전달되기 위하여 바이러스 입자 속에 패키징되어야만 한다. 일부 RNA 바이러스 캡시드는 감염된 숙주세포의 지질막으로 둘러싸이고 다른 RNA 바이러스 캡시드는 지질 이중층 없이 외부 바이러스 단백질 껍질을 가진다. 바이러스 캡시드 사이의 이러한 차이에도 불구하고, 자손 바이러스 입자가 어셈블리되는 과정 및 어셈블리하는 동안 일어나는 단백질/단백질 상호작용은 유사하다. 바이러스 단백질은 일반적으로 구조 및 비구조 단백질로 분류된다. 일반적으로 비구조 단백질은 게놈 복제, 전사의 조절 및 패키징에 관련된다. 구조 단백질은 일반적으로 (1) 게놈 RNA에 결합 (즉, 인플루엔자 A 바이러스용 뉴클레오캡시드 단백질), (2) 패키지된 RNA 및 외부 단백질 사이의 중개 (즉, 매트릭스 단백질) 및 (3) 외부 바이러스 층을 형성 (즉, 헤마글루티닌과 같은 표면 단백질)하는 것을 포함하는 3가지 형태의 기능을 수행한다. 바이러스 입자로의 어셈블리는 단일 숙주 내의 한 숙주세포에서 다른 숙주세포로의 또는 다른 숙주 유기체들 사이에서의 RNA 게놈의 효과적 전달을 보증한다.
인플루엔자 바이러스
인플루엔자 A 바이러스, 오르소마이소비리대(Orthomyxoviridae)는 단편화된 게놈을 가진 음성-센스 RNA 바이러스이다. 게놈 RNA는 5' 및 3' 말단에서 비암호화 서열 옆의 하나 이상의 오픈 리딩 프레임을 포함한다(Desselberger et al., Gene 1980, 8:315). 바이러스 RNA는 비리온 및 감염된 세포에서 뉴클레오단백질(NP) 및 중합효소 단백질(PB1, PB2 및 PA)와 결합하여 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체를 형성한다(Hsu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987, 84:8140). 이의 유전적 조성은 이 바이러스가 다른 균주의 유전자 단편을 재분류하여 진화될 수 있도록 하고; 이러한 재분류는 새로 감염된 유기체가 기왕증 면역반응을 가지지 않는 신규 변형체를 만든다. 수생조류에서 순환하는 인플루엔자의 15가지 헤마글루티닌(HA)및 9가지 뉴라미니다제(NA) 서브타입 중에서, 3가지인 H1N1, H2N2, 및 H3N2 서브타입은 인간에서 세계적 유행병을 일으키는 것으로 알려져 있다(Webmaster et al ., Microbiol. Rev. 1992, 56:152). 돼지가 인간에게 병원성인 신규 균주를 생성하기 위한 중간숙주("혼합용기")로서의 기능을 할 수 있다는 증거가 있다(Scholtisseket al., Virology 1985, 147:287). 1997년 홍콩에서 H5N1 인플루엔자 A가 창궐한 것은 고병원성 인플루엔자 A 바이러스가 조류 종에서 인간에게로 직접적으로 전달될 수도 있다는 것을 보여주었다(Claas et al ., Lancet 1998, 351:472; Suarez et al., J. Virol. 1998, 72:6678; Subbarao et al ., Science 1998, 279:393; Shortridge, Vaccine 1999, 17 (Suppl. 1): S26-S29). 인플루엔자 A 바이러스가 천연 저장소 내의 큰 수의 순환성 균주로부터 신규한 병원성 균주를 생성할 가능성이 있으므로 질병 제어를 위해서는 이들 바이러스를 감시하고 개선된 항바이러스 치료와 백신을 개발하는 것이 필요하다. 신규 균주를 개발하는 속도는 이러한 감시 효과에서 조심할 것을 요구하고, 유행병을 방지하기 위하여 새로 확인된 병원성 균주에 대한 충분한 양의 백신을 생산하는 현재 기술의 능력을 확대한다.
인플루엔자 A 바이러스에 대하여, 역유전학 시스템은 바이러스 게놈의 조작을 가능하게 한다(Palese et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93:11354; Neumann and Kawaoka; Adv. Virus Res. 1999, 53:265). 양성 가닥 바이러스(즉, 폴 리오바이러스)와 달리, 인플루엔자 A 바이러스의 음성-센스 바이러스 RNA(vRNA)는 감염성이 아니다. 4개의 바이러스 중합효소 복합체 단백질(PB1, PB2, PA, NP)의 막으로 둘러싸인 vRNA 분자만이 바이러스 복제 및 전사주기를 개시할 수 있다. 리보뉴클레오단백질(RNP)이 세포핵을 통과한 후, 결합단백질들이 (-) vRNA를 mRNA 및 양성 센스 상보성 RNA (+) cRNA로 전사하기 시작한다. 이들 cRNA는 vRNA 합성을 위한 주형으로 작용한다. 인플루엔자 A 바이러스용으로 개발된 제1 역유전학 시스템은 RNA-트랜스펙션 방법이었다(Luytjes et al ., Cell 1989, 59:1107; Enami et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87:3802). T7 RNA 중합효소에 의한 바이러스유사 vRNA의 시험관 내 전사와 바이러스 리보뉴클레오단백질(vRNA) 분자의 재구성 후, 유전적으로 변형된 RNP 단편을 트랜스펙션에 의해 진핵 세포 내로 도입하였다. 인플루엔자 헬퍼 바이러스로 감염시켜 클로닝된 cDNA로부터 유래된 유전자를 가공하는 바이러스를 생성하였다. 그러나, RNA 및 DNA 트랜스펙션 방법에서 헬퍼 바이러스가 존재하면 헬퍼 바이러스를 제거하기 위하여 강한 선택 시스템이 필요하기 때문에 이들 방법의 실용적인 가치를 심각하게 제한한다.
생체 내 vRNA 분자의 RNA 중합효소 I (pol-I)-구동 합성이 확립되어 RNA 복합체의 세포내 생산이 가능해졌다(Neumann and Hobom, Virology 1994, 202:477). 이 시스템에서, 바이러스 유사 cDNA는 pol I 프로모터와 터미네이터 서열 사이에 삽입되었다(Zobel et al ., Nucl. Acids Res. 1993, 21:3607). RNA 중합효소 II(pol-II)에 의해 합성된 mRNA 전사체와 달리, pol I-생성 RNA는 5' 캡과 3' 폴리(A) 테일이 결여되어 있다. 기능적 vRNP 분자는 헬퍼 바이러스로 감염시키거나 PB1, PB2, PA 또는 NP를 암호화하는 단백질 발현 플라스미드를 공동트랜스펙션시켜생성될 수 있다(상기 Neumann and Hobom; Flick et al ., RNA 1996, 2:1046; Pleschka et al., J. Virol. 1996, 70:4188; Zhou et al., Virology 1998, 246:83).
최근 연구 결과, pol I 프로모터로부터 8개의 모든 vRNA를 플라스미드-구동발현시키고 중합효소 복합체 단백질을 공동발현시키면 감염성 인플루엔자 A 바이러스가 형성되는 것으로 확인되었다(Neumann et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 246:9345; Fodor et al ., J. Virol. 1999, 73:9679). 플라스미드로부터 완전히 구동된 인플루엔자 A 바이러스를 생성하는데에는 헬퍼 바이러스를 사용한 감염이 필요하지 않기 때문에, 선택 시스템이 필요하지 않고; 따라서, 모든 유전자 단편은 기술적 제한없이 조작될 수 있다. 뉴먼 등{Newmann et al .,(상기)}이 개발한 시스템에서, 8개의 cDNA를 인간 pol I 프로모터 서열(407bp) 및 쥐의 터미네이터 서열(174bp) 사이에 삽입하였다. 4개의 RNP-복합체 단백질의 발현을 인간 사이토메갈로바이러스 프로모터로 구동하였다. 12개의 플라스미드를 106 293T 세포 속으로 트랜스펙션시켜 103 pfu 이상의 바이러스를 회수하였고; 이 효율은 17개의 플라스미드를 감염시킨 후 5×107 pfu까지 증가될 수 있었다. 포도르 등{Fodor et al., (상기)}는 8개의 cDNA가 인간 pol I 프로모터 서열(250bp)과 델타 간염 바이러스의 게놈 리보자임 서열 사이에 삽입하여 vRNA의 정확한 3' 말단을 지키는 시스템을 개발하였다. 중합효소 복합체 유전자의 발현을 위하여, 아데노바이러스 타입 2 주요 후 기 프로모터를 포함하는 플라스미드를 사용하였다. 12개의 발현 플라스미드를 베로(Vero) 세포에 트랜스펙션시킨 후, 106개의 트랜스펙션된 세포로부터 오직 1 또는 2개의 감염성 바이러스 입자만을 회수하였다.
그러나, 다른 플라스미드에 대한 인플루엔자 바이러스 cDNA를 가진 pol I 및 pol II 프로모터를 포함하는 뉴먼 등{Newmann et al .,(상기)}이 설명한 헬퍼 바이러스가 없는 시스템은 바이러스 회수를 위하여 12개 이상의 플라스미드 및 효율적인 바이러스 회수를 위하여 17개 플라스미드를 구성하여 공동트랜스펙션시켜야 한다. 이러한 많은 수의 플라스미드로 세포를 트랜스펙션시키는 것은 높은 트랜스펙션 효율을 가지는 세포주에 이 시스템을 사용하는 것을 제한할 수 있다. 다른 세포 형태로부터 바이러스를 회수할 수 있으면 이들 세포에서 인플루엔자 A 바이러스의 복제를 증진시킴으로써 바이러스 수율을 증가시키고 백신의 생산에 적합한 세포의 범위를 증가시킬 수 있다(Govorkova et al ., J.Virol. 1996, 70:5519).
따라서, 당해 기술분야에서는 재조합 인플루엔자 바이러스의 보다 효율적인 생산이 필요하다. 또한, 당해 기술분야에서는 새로 확인된 바이러스 균주에 반응하여 백신을 생산하기 위한 재분류 바이러스의 효율적인 생산이 필요하다. 본 발명은 바이러스 게놈 음성 가닥 RNA 단편(vRNA)과 바이러스 mRNA 모두를 하나의 주형으로부터 합성할 수 있어 바이러스 생성에 필요한 플라스미드의 수를 최소화하고 효율적이고 예측가능한 재분류가 가능한 시스템을 제공함으로써 당해 기술분야에서의 이러한 필요성 및 다른 필요성을 해결한다.
레오비리대 ( Reoviridae ) 바이러스
로타바이러스(Rotavirus) 속을 포함하는 레오비리대(Reoviridae)과의 바이러스는 이중가닥 단편화된 RNA 게놈을 포함한다. 인간 로타바이러스는 미국에서 심각한 어린이 설사의 가장 일반적인 바이러스 작용체로서, 연간 약 50,000명이 입원하고 20 내지 50명이 사망하게 하며 연간 10억 달러 이상의 손해를 일으킨다. 개발도상국에서, 로타바이러스는 모든 설사관련 입원환자 중 1/3의 원인이고 연간 대략 850,000명이 사망하게 한다.
로타바이러스 혈청형의 이중 시스템은 2개의 바이러스 단백질(VP)인 VP7과 VP4에 의해 유발된 중화반응때문에 존재한다. VP7 혈청형은 G 타입으로 명명하고 VP4로부터 유래된 것은 P 타입으로 기재된다. 지금까지, 적어도 10가지 G 혈청형 및 적어도 7가지 P 혈청형이 인간에게서 발견된다. VP4와 VP7 유전자는 별도로 분리되기 때문에, 새로운 로타바이러스는 재분류에 의해 생성된다. 미국에서 혈청형 P1 내지 P4 및 G1 내지 G4가 가장 흔하고; 다른 조합은 인도와 이집트와 같은 나라에서 보고되었다. 첫번째로 허가된 인간 로타바이러스 백신인 레서스(rhesus) 로타바이러스 백신은 4가지 공통 형청형 G1 내지 G4에 대한 혈청형-특이적 보호를 생산하도록 조성되었다. 그러나, 이 백신은 백신접종과 백신 수혜자 중의 장중적증의 비율증가 사이의 관련때문에 취소되었다. 따라서, 원치않는 부작용이 없는 모든 G 및 P 서브타입을 대표하는 로타바이러스 백신을 생산할 필요가 있다. 본 발명은 클로닝된 cDNA로부터 완전한 로타바이러스를 생성하는데 사용될 수 있는 벡터, (바람직하게는 플라스미드), 방법 및 숙주세포를 제공한다.
13개의 주요 유전자 산물이 정의되었다. 레오비리대의 다른 속으로부터 유사한 기능을 가진 단백질들의 비교를 촉진하고 혼동을 최소화하기 위하여, 하기 명명법을 사용하였다: SDS-PAGE 분석에서 이들의 이동에 따르면, 가장 큰 단백질부터 시작하여, 구조 단백질은 접두사 "VP"를 붙이고 비구조 단백질은 접두사 "NSP"를 붙이며, 각 단백질의 기능을 괄호 안에 나타낸다. 예를 들면, 약어 VP1(Pol)은 바이러스 입자에서 가장 큰 단백질이 RNA-의존성 RNA 중합효소라는 것을 나타낸다. 7개의 구조 단백질은 3층의 구조를 포함하는 바이러스 입자로 어셈블리된다: (1) dsRNA 게놈을 포함하는 내부 바이러스 코어는 이와 관련된 3가지 단백질을 가지고, 그중 2가지(VP1(Pol)과 VP3(Cap))는 게놈과 직접 결합하는 반면, 3번째(VP2(T2))는 코어 껍질을 구성하고, (2) 비리온의 중간 단백질 껍질은 260 트리머 단위 내에 배열된 780 VP6(T13) 분자로 구성되며, (3) VP4와 VP7은 외부 껍질을 구성한다. 스파이크 단백질 VP4는 VP5와 VP8으로 분해되는데 중요한 트립신 분해 부위를 포함하고, 이 분해는 감염성을 증진시킨다. 다른 프레임 내 리딩 프레임으로부터 유래한 VP7의 두가지 형태인 VP7(1)과 VP7(2)는 비리온 속으로 통합되고자 한다.
6가지 비구조 단백질의 기능에 대해서는 훨씬 덜 알려져 있다. 다른 RNA 바이러스와 유사하게, 비구조 단백질은 바이러스 복제, 전사, 바이러스 RNA의 번역 및 패키징에서 중요한 역할을 할 것으로 예상된다. 단편 8에서의 온도 민감성 바이러스의 분석에 근거할 때, NSP2(ViP)는 바이러스 복제에서 직접적인 역할을 하는 것으로 생각된다. NSP3는 바이러스 mRMA의 3'-말단에서 보존서열에 결합하고 세포 캡 결합 단백질 eIF4G에 결합함으로써 5'-캡 구조를 가지지만 3'-폴리A-테일을 가 지지 않는 로타바이러스 mRNA의 번역을 특이적으로 상향조절하는 것으로 생각된다. NSP1은 필수적이지 않는 것으로 보이지만, 아마도 세포배양액 중에서 로타바이러스 복제에서 활성적인 역할을 할 것이다. NSP4는 바이러스 형태형성에 관련되는 것으로 생각된다. 2개의 비구조 단백질, NSP5와 NSP6는 단편 11로부터 2개의 다른 리딩 프레임에 의해 암호화되지만, 바이러스 생활주기에서 이들의 기능을 알려져 있지 않다.
복제주기는 37℃에서 10 내지 12시간에 완료된다. 현재 데이터는 바이러스가 수용체-매개 엔도사이토시스를 통해 세포 속으로 들어갈 수 있지만 세포에 들어가기 위한 다른 메카니즘도 있을 수 있다고 제시한다. 숙주세포에 들어간 후, 외부 바이러스 껍질은 감염된 세포의 세포질 속으로 전사적 활성 이중-껍질 입자를 배출한다. 비리온-결합 효소들은 각 비리온 게놈 단편의 (-) 가닥으로부터의 전장 전사체인 5'-캡이 있는 비폴리아데닐화 mRNA를 생산한다. 각 단편에서 유도된 바이러스 mRNA는 2가지 기능을 한다: 첫째, 이들은 번역되어 단편에 의해 암호화된 바이러스 단백질들을 생성하고, 둘째, 바이러스 mRNA는 또한 게놈 복제를 위한 주형이다. 게놈 단편 어셈블리는 프레코어 RI를 형성하는데 필요한 다른 바이러스 mRNA를 선택함으로써 일어난다. 11 mRNA를 어셈블리한 후에, 감염된 세포의 세포질 내에서 발견되는 '바이러스원형질(viroplasm)' 내에 존재하는 '코어-RI' 및 VP6(T13)-RI에서 (-)가닥 합성이 일어난다. 자손 비리온의 형태형성에서 다음 단계는 로타바이러스에 특유한 것으로 NSP4를 포함하는 과정에서 소포체 속으로 출아하는 이중층 입자를 포함한다. 그 결과, VP4와 VP7의 외부 비리온 껍질이 첨가될 때 최종 성숙 단계 에서 소실되는 외피가 입자 내에 일시적으로 얻어진다.
단편화된 게놈, 고도로 배열된 게놈 구조 및 복합체 복제 주기는 로타바이러스의 생성을 위한 역유전 시스템의 개발에 대한 주요한 문제를 제시한다. 그러나, 본 발명은 단순하고 편리하게 로타바이러스를 생성하는데 사용될 수 있다.
인플루엔자 백신
현재 미국과 유럽에서 사용하도록 공중위생기관이 인가한 인플루엔자 백신은 불활성화된 인플루엔자 백신이다. 역학적으로 중요한 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B 균주를 제시하는 바이러스는 미발달 계란에서 성장하고, 바이러스 입자들은 화학적 수단에 의해 정제되고 불활성화된다. 매해, WHO는 가장 잘 순환할 것 같은 서브타입들을 선택하는데 현재는 인플루엔자 A(N1H1)과 (H3N2)에 대한 2개의 균주와 B 균주이다.
안전하고 효과적인 백신을 생산하기 위해서는, 선택된 백신 균주가 순환하는 균주와 밀접하게 관련되고, 이에 의해 백신접종된 집단의 항체가 항원적으로 유사한 바이러스를 중화시킬 수 있다는 것을 보증하는 것이 중요하다. 그러나, 밀접하게 관련된 것으로 밝혀진 모든 바이러스가 백신생산에 적합한 것은 아닌데, 이는 이들이 계란에서 잘 자라지 않기 때문이다. 따라서, 실험균주(A/PR/8/34)(H1N1)의 높은 바이러스 수율을 예상된 병원성 균주의 항원적 특성과 결합시켜 고성장 재분류 바이러스를 생성하도록 시도하는 것이 바람직하다. 불행히도, 8개의 단편을 포함하는 2개의 인플루엔자 바이러스를 공동감염시키면, 이론적으로 28 = 256개의 다 른 자손 바이러스가 생성된다. 원하는 당단백질 항원을 사용하여 고성장 바이러스를 얻기 위하여, 어버이 고성장 실험균주로부터 대응하는 유전자 단편을 제거하기 위한 선택법이 필요하다. 적절한 당단백질을 가진 바이러스를 얻기 위한 선택절차와 유전자 무리의 확인은 성가시고 시간이 많이 소모되는 작업이다. RNP-트랜스펙션 시스템(Luytjes et al ., Cell 1989, 59:1107)이 자손 바이러스의 가능한 수를 감소시키더라도, 우수한 선택법은 여전히 필요하다.
비강 내 투여된 살아있는 감약된 인플루엔자 바이러스 백신은 국부적, 점액성, 세포-매개 및 체액성 면역성을 유도한다. 살아있는 감약된 인플루엔자 A/Ann Arbor/6/60(H2N2) 또는 B/Ann Arbor/1/66의 6개 내부 유전자를 포함하는 냉-적응(ca) 재분류(CR) 바이러스, 및 동시기의 야생형 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다제(NA)는 신뢰성있게 감약되는 것으로 보인다. 이러한 백신은 어린이 및 10대 후반의 청소년에게 효과가 있는 것으로 보인다. 그러나, 너무 감약되어 인플루엔자 감염의 결과로서 매년 미국 내에서 사망하는 20,000 내지 40,000명의 주된 그룹인 노인층에서 이상적인 면역반응을 자극하지 못할 수 있다. ca 바이러스의 내부 유전자들의 서열은 보고되어 있지만, 감약된 표현형에 대한 각 단편의 기여는 아직 잘 규명되어 있지 않다. 이러한 정보는 바이러스 속으로 특이적, 정의된 감약 돌연변이를 순차적으로 도입해야만 얻어질 수 있다. RNP-트랜스펙션법은 인플루엔자의 게놈 속으로 돌연변이를 도입할 수 있게 하지만, 시험관 내에서 바이러스 RNP를 재구성하는 것이 기술적으로 어렵고 선택시스템이 필요하여 내부 유전자를 조작하는데 사용하는 것이 제한된다.
따라서, 당해 기술분야에서는 헬퍼 바이러스의 사용을 피하고, 배양액(계란 또는 세포배양액) 중에서 잘 자라고, 새로운 백신개발을 위해 증식될 수 있는 재분류 바이러스의 개발을 신뢰성있게 허용하고, 비강 내 백신접종을 위한 살아있는 감약된 바이러스 균주를 개발하기 위한 체계적 돌연변이를 제공하는 재조합 인플루엔자 백신의 개발이 필요하다. 본 발명은 당해 기술분야의 이들 및 다른 필요성에 대한 것이다.
본 발명은 RNA 중합효소 II (pol II) 프로모터 및 폴리아데닐레이션 신호 사이에 삽입된, RNA 중합효소 I (pol I) 프로모터 및 pol I 터미네이터 서열을 포함하는 발현 플라스미드를 제공한다. 이 발현 플라스미드를 본 명세서에서는 pol I-pol II 시스템, 이중 프로모터 발현 시스템 또는 이중 프로모터 발현 플라스미드라 한다. 그러한 플라스미드는 pol I 프로모터와 종결신호 사이에 삽입된 RNA 바이러스의 바이러스 유전자 단편을 포함하는 것이 가장 바람직하다. 바람직하게는, RNA 바이러스는 인플루엔자 바이러스(예를 들면, 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B 바이러스)이다.
본 발명은 클로닝된 유전자 또는 cDNA로부터 감염성 RNA 바이러스를 생성하는 2 플라스미드계 시스템을 포함한다. 한 시스템(이방향 시스템)에서, 유전자 또는 cDNA는 pol II 프로모터의 상부와 pol I 프로모터의 하부 사이에 위치한다. pol II 프로모터로부터 유전자 또는 cDNA를 전사하면 캡이 있는 양성-센스 바이러스 mRNA가 생산되고, pol I 프로모터로부터 전사하면 음성-센스, 캡이 없는 vRNA가 생 산된다. 다른 시스템(일방향 시스템)에서, 유전자 또는 cDNA는 pol I과 pol II 프로모터의 하부에 위치한다. pol II 프로모터는 캡이 있는 양성-센스 바이러스 mRNA를 생산하고 pol I 프로모터는 캡이 없는 양성-센스 바이러스 cRNA를 생산한다.
본 발명의 최소 플라스미드계 시스템은 클로닝된 바이러스 cDNA로부터 감염성 RNA를 생성할 수 있도록 한다. 그러한 시스템은 각 플라스미드가 RNA 바이러스의 하나의 자율 바이러스 게놈 단편을 포함하는 한 세트의 플라스미드를 포함한다. 각 플라스미드에서, 자율 바이러스 게놈 단편에 대응하는 바이러스 cDNA는 RNA 중합효소 I(pol I) 프로모터와 터미네이터 서열 사이에 삽입되어 vRNA를 발현시키고, 교대로 RNA 중합효소 II(pol II) 프로모터와 폴리아데닐레이션 신호 사이에 삽입되어 바이러스 mRNA를 발현시킨다. 따라서, 이 시스템은 이방향 플라스미드 기술을 사용하고, 예를 들면, 세포 배양액 중에서 잘 성장하는 배경 균주에서 또는 감약된 균주로부터, 또는 양자로부터 인플루엔자 NA 및 HA 유전자에 기초하여, 현재 순환하는 병원성 균주에 대응하는 RNA 바이러스를 생산하기 위한 효율적인 재분류를 허용한다. 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스인 것이 바람직하다.
본 발명은 감염성 비리온을 생성하는 플라스미드계 시스템을 포함하는 숙주세포, 및 바이러스 단백질과 vRNA를 생성할 수 있는 조건 하에서 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 RNA 바이러스 비리온을 생산하는 방법을 제공한다.
플라스미드계 시스템, 숙주세포 및 비리온을 생산하는 방법은 RNA 바이러스-특이적 백신을 제조하는데 특히 적합한다. 그러한 방법은 비리온을 정제하는 단계 를 포함한다. 정제된 비리온은 불활성화될 수 있거나 감약될 수 있다. 본 발명의 백신은 RNA 바이러스 감염에 대해 백신접종하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면 불활성화된 비리온을 포함하는 백신의 보호적 투여량을 근육 내 주사하여 투여할 수 있다. 선택적으로, 감약된 비리온을 포함하는 백신의 보호적 투여량을 환자에게 비강 내 투여할 수 있다.
본 발명은 또한 재분류 바이러스 비리온, 및 불활성화된 비리온과 감약된 비리온을 포함하여 그러한 비리온을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 감약된 RNA 바이러스를 생성하는 방법을 제공한다. 이 방법은 플라스미드계 시스템 내의 하나 이상의 바이러스 유전자를 돌연변이시키는 단계, 및 상기 시스템에 의해 생성된 감염성 RNA 바이러스가 감약되는지 여부를 확인하는 단계를 포함한다. 그러한 감약된 바이러스는 현재 감약된 백신에 대해 반응이 없는 노인 또는 다른 집단에서 보호적 면역성을 이끌어내는 증진된 효능을 가진 비강 내 백신을 포함하여, 비강 내 백신을 개발하는데 사용될 수 있다.
모든 RNA 바이러스의 생활주기에는 RNA 합성과 단백질합성 후 바이러스 입자의 어셈블리가 포함된다; 이들 기능은 클로닝된 cDNA로부터 RNA 바이러스를 생산하는데 사용될 수 있는 본 발명의 역유전학 시스템용 개념적 골격을 제공한다. 본 발명은 음성가닥 단편화된 바이러스{예를 들면, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 분야비리대(Bunyaviridae)}, 비단편화 음성 가닥 RNA 바이러스{예를 들면, 파라마이소비 리대(Paramyxoviridae), 모노네가비랄레스(Mononegavirales)}, 이중가닥 RNA 바이러스(예를 들면, 레오비리대, 버나비리대) 및 양성가닥 RNA 바이러스{예를 들면, 플라비비리대(Flaviviridae), 피코나비리대(Picornaviridae), 코로나비리대(Coronaviridae), 토가비리대(Togaviridae)}를 생산하기 위한 이중 프로모터 시스템을 확립함으로써 현재 이용할 수 있는 역유전학 시스템을 단순화하고 개선한다. 본 발명의 시스템은 단백질 합성과 게놈 RNA 합성 모두에 단일 바이러스 cDNA를 사용하기 때문에, 이 시스템은 바이러스 생산에 필요한 플라스미드의 수를 줄이고 신속하고 싸게 백신을 개발할 수 있게 한다.
단편화된 RNA 게놈을 포함하는 바이러스가 본 발명을 이용하여 생산될 수 있다면, 표적 게놈에서 각 유전자에 대응하는 바이러스 cDNA는 본 발명의 발현 벡터 속으로 삽입된다. 본 발명은 바이러스 cDNA가 RNA 중합효소 I(pol I)프로모터와 터미네이터 서열(내부 전사단위) 사이에 삽입되는 일방향 플라스미드계 발현 시스템과 이방향 플라스미드계 발현 시스템을 포함한다. 이러한 완전한 pol I 전사단위는 RNA 중합효소 II(pol II) 프로모터와 폴리아데닐레이션 부위 옆에 위치한다(외부 전사단위). 일방향 시스템에서, pol I과 pol II 프로모터는 cDNA의 상부에 있어서 (pol I 프로모터로부터) 캡이 없는 cRNA와 (pol II 프로모터로부터) 양성-센스 캡이 있는 mRNA를 생산한다. 일방향 시스템에서 pol II 프로모터, pol I 터미네이터 서열, pol II 프로모터 및 폴리아데닐레이션 신호는 "상부에서 하부로의 배향"을 포함한다고 할 수 있다. 이방향 시스템에서, pol I 및 pol II 프로모터는 cDNA의 반대쪽에 있고, 상부 pol II 프로모터는 양성-센스 캡이 있는 mRNA를 생산하고 하 부 pol I 프로모터는 음성-센스 캡이 없는 바이러스 RNA(vRNA)를 생산한다. 이들 pol I-pol II 시스템은 아마 핵의 다른 구획 내에서, 이들 자체 프로모터로부터 2개의 세포성 RNA 중합효소의 전사를 개시하기 시작한다. 이방향 시스템에서 pol I 프로모터와 pol I 터미네이터 서열은 "하부에서 상부로의 배향"을 포함한다고 할 수 있고, 반면 이방향 시스템에서 pol II 프로모터와 폴리아데닐레이션 신호는 "상부에서 하부로의 배향"을 포함한다고 할 수 있다.
표적 바이러스가 양성 가닥을 포함한다면, 단편화된 RNA 게놈, pol I 프로모터는 내부 전사단위 내 cDNA의 상부에 위치하는 것이 바람직하다(일방향 시스템). 이 실시형태에서, 양성 가닥 RNA는 새로운 바이러스로 직접 삽입되기 위해 생성된다. 그러나, 음성가닥, 단편화된 RNA 게놈을 포함하는 표적 바이러스가 일방향 시스템을 사용하여 생산되는 실시형태들은 본 발명의 범위에 속한다.
표적 바이러스가 음성 가닥, 단편화된 RNA 게놈을 포함한다면, pol I 프로모터는 내부 전사단위 내 cDNA의 하부에 위치하는 것이 바람직하다(이방향 시스템). 이 실시형태에서, 음성 가닥 RNA는 새로운 바이러스로 직접 삽입되기 위해 생성된다. 그러나, 양성가닥, 단편화된 RNA 게놈을 포함하는 표적 바이러스가 이방향 시스템을 사용하여 생산되는 실시형태들은 본 발명의 범위에 속한다.
본 발명은 또한 감염성 또는 비감염성 비단편화 RNA 게놈(단일가닥 또는 이중가닥)을 포함하는 바이러스를 생산하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 세포 내에서 바이러스 생활주기를 개시하고 완전한 바이러스를 생산하기 위해서는 감염성 바이러스 게놈 RNA를 숙주세포 속으로 단순히 도입하는 것만으로 충분하다. 예를 들면, 완전한 피코나바이러스를 생성하기 위해서는 피코나바이러스 게놈 RNA를 숙주세포 속으로 단순히 도입하면 충분하다. 비감염성 게놈 RNA를 포함하는 바이러스의 생활주기를 개시하는 데는 일반적으로 게놈과 함께 바이러스 입자 내로 운반되는 다른 바이러스 단백질을 추가로 도입할 필요가 있다. 예를 들면, 파라인플루엔자 바이러스 III는 새로 감염된 숙주세포 내에서 바이러스 게놈 RNA 복제와 바이러스 mRNA의 전사를 개시하는데 필요한 RNA 의존성 RNA 중합효소를 가지고; 중합효소가 없으며, 파라인플루엔자 III 게놈 RNA는 감염성이 아니다. 감염성, 비단편화 게놈 RNA를 포함하는 바이러스가 생성되는 본 발명의 실시형태들에서, 바이러스 게놈을 포함하는 핵산을 운반하는, 본 발명의 이중 발현 플라스미드를 적합한 숙주세포 속으로 단순히 도입하면 완전한 바이러스 생성을 충분히 유발할 수 있다. 비감염성 비단편화 게놈 RNA를 포함하는 바이러스가 생성되는 실시형태들에서, 추가적인 발현 플라스미드들이 바이러스 게놈을 운반하는 이중 발현 플라스미드와 함께 숙주세포 속으로 도입되어야 할 수도 있다. 추가 플라스미드는 감염에 따라 숙주세포 속으로 일반적으로 도입되는 바이러스 생활주기의 개시에 필요한 단백질(들)(예를 들면 RNA 의존성 RNA 중합효소)을 발현하여야 한다.
감염성, 비단편화 RNA 게놈을 포함하는 피코나바이러스가 생산되는 실시형태들에서, 완전한 바이러스 게놈을 포함하는 cDNA는 본 발명의 이중 프로모터 발현 플라스미드 속으로 삽입된다. 외부 전사단위 내의 상부 프로모터, 바람직하게는 pol II 프로모터는 완전한 바이러스 게놈을 포함하는 양성 가닥 mRNA의 생산을 지시한다- 폴리단백질은 mRNA로부터 번역되고 개별적인 단백질들은 분해되어 폴리단 백질에서 유리된다(예를 들면 폴리단백질 내의 프로테아제에 의해). 바이러스 게놈은 양성가닥 RNA를 포함하기 때문에, 내부 전사단위 내의 제2 상부 프로모터, 바람직하게는 pol I은 게놈의 양성 가닥 복사물의 생산을 지시한다(일방향 시스템). 바이러스 게놈이 음성가닥 RNA를 포함한다면, 내부 전사단위 내의 제2 하부 프로모터, 바람직하게는 pol I은 게놈의 음성가닥 복사물의 생산을 지시할 것이다(이방향 시스템). 음성가닥, 비단편화 RNA 바이러스가 일방향 시스템을 사용하여 생산되는 실시형태들은 본 발명의 범위에 속한다. 이와 유사하게, 양성가닥, 비단편화 RNA 바이러스가 이방향 시스템을 사용하여 생산되는 실시형태들은 본 발명의 범위에 속한다.
폴리단백질이 생산되지 않는 비감염성, 비단편화 RNA 게놈을 포함하는 바이러스는 본 발명을 사용하여 생성될 수도 있다. 예를 들면, 본 시스템은 라브도비리대(rhabdoviridae) 바이러스 또는 파라마이소비리대 바이러스, 바람직하게는 파라인플루엔자 바이러스 III를 생산하는데 사용될 수 있으며, 일반적으로 그 생활주기에 바이러스 유래 RNA 의존성 RNA 중합효소에 의해 게놈, 음성가닥 RNA로부터 다중 모노시스트로닉 mRNA를 생산하는 것이 포함되고; 개별 단백질들은 모노시스트로닉 mRNA로부터 발현된다. 이들 실시형태에서, 프로모터, 바람직하게는 pol II 프로모터를 포함하는 외부 전사단위는 이로부터 제1유전자(NP)만 번역되는 것이 일반적인 바이러스 게놈의 양성가닥, 폴리시스트로닉 복사물의 생산을 지시한다. 추가적으로, 프로모터, 바람직하게는 pol I 프로모터를 포함하는 내부 전사단위는 새로운 바이러스 속으로 삽입하기 위한 게놈의 RNA 복사물의 발현을 지시한다. 파라인플루 엔자 III 바이러스 게놈은 음성가닥 RNA를 포함하기 때문에, 내부 전사단위의 프로모터는 cDNA의 하부에 위치하는 것이 바람직하다(이방향 시스템). 바이러스 게놈이 양성가닥 RNA를 포함한다면, 내부 전사단위의 프로모터는 cDNA의 상부에 위치하는 것이 바람직하다(일방향 시스템). 양성가닥 RNA 게놈을 포함하는 바이러스가 이방향 시스템을 사용하여 생산되는 실시형태들과 음성가닥 RNA 게놈을 포함하는 바이러스가 일방향 시스템을 사용하여 생산되는 실시형태들은 본 발명의 범위에 속한다. 추가적인 바이러스 단백질(폴리시스트로닉 mRNA로부터 발현되는 단백질 이외의)이 바이러스 전사와 복제에 필요하고(L과 P), 이들 단백질은 별도의 발현 플라스미드 상에 개별적으로 제공된다.
본 발명은 이중가닥, 단편화된 RNA 게놈을 포함하는 바이러스가 생성되는 실시형태들도 포함한다. 이들 실시형태에서, 표적 바이러스 게놈 내의 각 유전자를 포함하는 플라스미드는 본 발명의 이중 프로모터 발현 플라스미드에 삽입된다. 플라스미드는 일방향 플라스미드이거나 이방향 플라스미드일 수 있다. 외부 전사단위 내의 프로모터, 바람직하게는 pol II 프로모터는 암호화된 단백질로 번역되는 각 유전자의 mRNA 전사체의 발현을 지시한다. 내부 전사단위 내의 프로모터, 바람직하게는 pol I 프로모터는 양성가닥(일방향 시스템) 또는 음성가닥(이방향 시스템)의 전사를 지시한다. 이어서, 생산되는 제1가닥은 바이러스 RNA 중합효소에 의해 상보적 가닥을 생산하기 위한 주형으로 작용할 수 있다. 생성된 이중가닥 RNA 산물은 새로운 바이러스 속으로 삽입된다.
최소 플라스미드계 시스템으로부터 2개의 인플루엔자 A 바이러스, A/WSN/33(H1N1)과 A/Teal/HK/W312/97(H6N1)를 회수하여 이 시스템의 유용성을 확립하였다. 불활성화된 인플루엔자 A 백신의 생산을 위한 표준인, 표현형으로 구분할 수 없는 A/PR/8/34(H1N1) 균주를 회수하여 백신개발을 위한 이 시스템의 유용성을 확립하였다. 8개의 발현 플라스미드를 공동배양된 293T와 MDCK 세포 속으로 트랜스펙션시키고 72시간 후, 트랜스펙션된 세포의 상등액 중의 바이러스 수율은 ㎖ 당 2×105 내지 2×107개의 감염성 바이러스였다. 이러한 8개 플라스미드 시스템은 A/Teal/HK/W312/97(H6N1)과 A/WSN/33(H1N1) 사이에서 단일 및 4중 재분류 바이러스를 생성하는데 사용하였고 (cDNA와 mRNA를 생산하는) 일렬 배향 시스템으로부터 A/WSN/33 바이러스를 생성하는데 사용하였다.
pol I-pol II 시스템은 재조합 및 재분류 인플루엔자 A 바이러스 모두의 디자인과 회수를 촉진하기 때문에, 클로닝된 cDNA로부터 완전한 다른 RNA 바이러스를 회수하는 데에도 적용할 수 있다. 본 발명에 사용하는데는 cDNA가 바람직하지만, 발현되는 바이러스 유전자를 암호화하는 임의의 다른 형태의 핵산도 본 발명의 필수 요소들이 보존된다면 사용할 수 있다. 예를 들면, 바이러스 유전자를 포함하는 PCR 증폭 산물 또는 제한 단편을 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 플라스미드계 시스템에서 발혀되는 유전자는 정제/검출 태그(예를 들면, 글루타티온-S 트랜스퍼라제, 폴리히스티딘, 녹색 형광 단백질, myc 태그 및 FLAG 태그)와 같은 다른 유전자로 표지되거나 다른 유전자에 융합될 수 있다. 본 발명은 또한 부분 유전자 서열이 본 발명 시스템의 플라스미드에서 사용되는 실시형태들도 예상한다.
하기 표는 본 발명을 사용하여 생산될 수 있는 음성가닥 RNA 바이러스의 비제한적 리스트를 포함한다:
순서 과 아과 속 종의 형태
모노네가비랄레스 보나비리대 보나바이러스 보나병 바이러스
모노네가비랄레스 필로비리대 에볼라유사 바이러스 에볼라바이러스
모노네가비랄레스 필로비리대 마르버그유사 바이러스 마르버그 바이러스
모노네가비랄레스 파라마이소비리대 파라마이소비리내 레스피로바이러스 인간 파라인플루엔자 바이러스 1
모노네가비랄레스 파라마이소비리대 파라마이소비리내 모르빌리바이러스 홍역바이러스
모노네가비랄레스 파라마이소비리대 파라마이소비리내 루불라바이러스 유행성 이하선염 바이러스
모노네가비랄레스 파라마이소비리대 뉴모비리내 뉴모바이러스 인간 호흡 신시티알 바이러스
모노네가비랄레스 파라마이소비리대 뉴모비리내 메타뉴모바이러스 터키 리노트라체이티스 바이러스
모노네가비랄레스 라브도비리대 베시쿨로바이러스 소포성 구내염 인디아나 바이러스
모노네가비랄레스 라브도비리대 리사바이러스 라비에스 바이러스
모노네가비랄레스 라브도비리대 에페메로바이러스 소 에페머랄 열 바이러스
모노네가비랄레스 라브도비리대 노비라브도바이러스 감염성 조혈 괴사 바이러스
모노네가비랄레스 라브도비리대 사이토하브도바이러스 레투스 괴사성 황색 바이러스
모노네가비랄레스 라브도비리대 뉴쿠레오하브도바이러스 포테이토 황색 난장이 바이러스
모노네가비랄레스 오르소마이로비리대 인플루엔자바이러스 A 인플루엔자 A 바이러스
모노네가비랄레스 오르소마이로비리대 인플루엔자바이러스 B 인플루엔자 B 바이러스
모노네가비랄레스 오르소마이로비리대 인플루엔자바이러스 C 인플루엔자 C 바이러스
모노네가비랄레스 오르소마이로비리대 토고토바이러스 토고토 바이러스
모노네가비랄레스 분야비리대 분야바이러스 분얌웨라 바이러스
모노네가비랄레스 분야비리대 한타바이러스 한탄 바이러스
모노네가비랄레스 분야비리대 나이로바이러스 나이로비양질환 바이러스
모노네가비랄레스 분야비리대 플레보바이러스 모래파리 열 시실리안 바이러스
모노네가비랄레스 분야비리대 토스포바이러스 토마토 반점 시들음병 바이러스
모노네가비랄레스 분야비리대 테뉴이바이러스 쌀 스트라이프 바이러스
모노네가비랄레스 분야비리대 오피오바이러스 시트러스 포로시스 바이러스
모노네가비랄레스 아레나비리대 아레나바이러스 림포사이틱 코리오메닌기티스 바이러스
모노네가비랄레스 아레나비리대 델타바이러스 델타 간염 바이러스
본 발명은 vRNA 합성을 위한 RNA 중합효소 I(pol I) 프로모터와 mRNA 합성을 위한 RNA 중합효소 II(pol II)의 옆에 위치한 PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M 또는 NS를 암호화하는 바이러스 cDNA를 포함하는 이방향 전사 구조체의 개발에 부분적으로 기초한다. 이 접근방법의 유용성은 pol I/pol II-프로모터-PB1 구조체를 나머지 7개의 단편에 대한 vRNA- 및 단백질 발현 구조체와 함께 트랜스펙션시킨 후 바이러스를 생성함으로써 입증된다. 이 접근방법은 바이러스 생성에 필요한 플라스미드의 수를 줄이기 때문에, 클로닝에 필요한 작업을 감소시키고, 바이러스 생성의 효율을 증진시키고, 17개 플라스미드의 효율적인 공동트랜스펙션이 달성될 수 없는 세포주에 대해 역유전학 시스템을 사용할 수 있도록 확장한다. 바이러스 cDNA 암호화 서열의 상부에 위치한 pol I과 pol II 프로모터를 포함하는 일방향 전사 구조체도 포함된다. 양 프로모터는 유전자에 대해 공통적인 상부로부터 하부로의 배향으로 있다. 이방향 시스템이 더 높은 인플루엔자 A 바이러스 역가를 생산할 수 있지만, 일방향 시스템은 다른 적용분야에서 유용하다(예를 들면, 다른 음성가닥 바이러스 균주의 생산).
프로모터, 터미네이터 또는 폴리아데닐레이션 신호는 유전자의 시작부분(예를 들면, 첫번째 코돈)에 가깝고 유전자 말단(예를 들면, 종결코돈)에서 멀다면 유전자의 "상부"이다. 프로모터, 터미네이터 또는 폴리아데닐레이션 신호는 유전자의 말단에 가깝고 유전자의 시작부분에서 멀다면 유전자의 "하부"이다. 유전자와 기능적으로 관련된 본 발명의 플라스미드 내의 프로모터는 유전자의 센스 또는 안티센스 가닥의 전사를 촉진하도록 배향된다.
본 명세서에서 사용되는 "발현 플라스미드"는 "내부 전사단위"와 "외부 전사단위"를 포함하는 DNA 벡터이다. 상기 설명한 바와 같이, 발현 플라스미드는 임의 형태의 RNA 바이러스, 바람직하게는 양성 또는 음성가닥 RNA 바이러스, 단편화된 또는 비단편화된 게놈 RNA 바이러스 또는 이중가닥 RNA 바이러스를 생성하는데 사용될 수 있다. 외부 전사단위는 프로모터, 바람직하게는 바이러스 cDNA로부터 번역가능한 mRNA의 전사를 지시하는 pol II 프로모터를 포함한다. 외부 전사단위는 T7 RNA 중합효소 프로모터, T3 RNA 중합효소 프로모터, SP6 RNA 중합효소 프로모터 또는 번역가능한 RNA 산물의 발현을 구동할 수 있는 유전요소의 임의의 프로모터 또는 조합을 포함할 수 있다. 예를 들면, 외부 전사단위는 플라스미드로부터 발현되는 바이러스 cDNA가 전사된 RNA의 3' 말단에 폴리아데닐레이션 신호를 포함하도록 유전적으로 조작된다면 pol I 또는 pol II 프로모터를 포함할 수 있다. 이것은 종결코돈 바로 앞에 cDNA 암호화서열의 3' 말단에서 일련의 A 뉴클레오티드를 삽입함으로써 달성될 수 있다. 또한, 바이러스 cDNA는 cDNA의 5' 말단에서 내부 리보좀 입구 부위(IRES)를 포함하도록 유전적으로 조작되어 전사된 RNA로부터 번역개시를 촉진할 수 있다. 본 발명의 발현 플라스미드에서 "내부 전사단위"는 외부 전사단위 내에 위치하고 바이러스 기구에 의해 복제되어 새로운 바이러스 속으로 삽입될 수 있는 바이러스 cDNA의 전사를 지시할 수 있는 프로모터, 바람직하게는 pol I 프로모터를 포함한다. 내부 전사단위 내의 프로모터는 바람직하게는 바이러스 cDNA와 pol I 프로모터 및 터미네이터 서열과의 정확한 융합에 의해, 5' 및 3' 말단에 과량의 비바이러스 외인성 서열을 포함하지 않는 RNA를 전사하는 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명은 내부 전사단위가 5' 및 3' 추가 비바이러스 서열을 포함하는 RNA 전사체의 생산을 지시하는 프로모터(예를 들면, pol II 프로모터, pol III 프로모터, T7 RNA 중합효소 프로모터, T3 RNA 중합효소 프로모터 또는 SP6 RNA 중합효소 프로모터)를 포함하는 것을 특징으로 하는 실시형태를 포함한다. 이들 실시형태에서, 내부 전사단위로부터 생산되는 RNA가 과량의 비바이러스 서열을 포함하지 않는다는 것을 보증하는 추가서열이 발현 플라스미드에 포함될 수 있다. 예를 들면, 발현 플라스미드는 RNA의 5' 및 3' 말단의 서열이 바이러스 RNA에서 발견되는 바와 같이 생성되는 방식으로 전사된 RNA의 리보자임 부분이 전사체를 분해하는 내부 전사단위로부터 생산된 전사체의 말단에서의 리보자임 서열을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 또한, 발현 플라스미드는 바이러스 cDNA 암호화 서열의 말단에서 전사 종결을 일으키는 터미네이터 서열을 포함함으로써 전사된 RNA의 3' 말단에서 과량의 미번역 서열이 삽입되는 것을 방지하도록 유전적으로 조작될 수 있다. "발현 플라스미드"는 pol I-pol II 시스템을 사용하는 DNA 벡터인 것이 바람직하다. 따라서, 그러한 플라스미드는 RNA 중합효소 II (pol II) 프로모터와, RNA 중합효소 II (pol II) 프로모터와 폴리아데닐레이션 신호 사이에 삽입되는 RNA 중합효소 I(pol I) 터미네이터 서열을 포함한다. 이방향 시스템에서, RNA 중합효소 I 프로모터는 프로모터와 터미네이터 사이에 "안티센스" 배향으로 삽입되는 cDNA의 게놈 음성 센스 캡이 없는 RNA(이하 "vRNA"라 함)의 발현을 조절한다. RNA 중합효 소 II 프로모터는 메신저 RNA의 발현을 조절하고; pol II 프로모터와 폴리아데닐레이션 신호 사이에 "센스" 배향으로 삽입된 바이러스 유전자 cDNA 단편은 양성-센스 캡이 있는 바이러스 mRNA를 발현시킨다. 일방향시스템에서, 바이러스 cDNA는 센스배향으로 pol I과 pol II 프로모터의 하부에 삽입된다. pol II 프로모터는 양성-센스 캡이 있는 바이러스 mRNA의 발현을 구동하고, pol I 프로모터는 양성 센스 캡이 없는 바이러스 cRNA의 발현을 구동한다.
플라스미드는 베이스 플라스미드의 유전자와 기능적 비암호화 영역 모두가 존재한다면 다른 베이스 플라스미드의 "필수적인 모두"를 포함할 수 있다. 예를 들면, 폴리링커의 일부를 단순히 제거하고 외부 유전자를 삽입하여 구성된 플라스미드는 베이스 플라스미드의 필수적인 모두를 포함한다.
"음성가닥 RNA 바이러스"는 바이러스 게놈이 음성가닥 RNA를 포함하는 바이러스이다. 음성가닥 RNA는 mRNA에 상보적이고, 일반적으로 번역될 단백질에 대한 상보적 양성가닥 mRNA로 복사되어야만 한다. 일반적으로, 이들 바이러스는 숙주세포에 감염되었을 때 mRNA를 생산하기 위하여 RNA 의존성 RNA 중합효소를 패키징한다. 음성가닥 RNA 바이러스과에는 오르소마이소비리대, 아레나비리대, 및 분야비리대가 포함되지만 이에 한정되는 것은 아니다. 바이러스 게놈은 오르소마이소비리대 바이러스과의 구성원인 바이러스에서 유래하는 것이 바람직하고, 단편화된 게놈을 가지는 것이 최적이다. 오르소마이소비리대 바이러스과에는 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 인플루엔자 C, 토고토바이러스, 홍역 및 유행성 이하선염 바이러스(파라마이소바이러스) 또는 라비에스 바이러스(라브도바이러스)가 포함되지만 이에 한정되 는 것은 아니다.
"양성가닥 RNA 바이러스"는 양성가닥 RNA 게놈을 포함하는 바이러스이다. 양성가닥 RNA 바이러스의 예에는 폴리오바이러스(피코나바이러스), 토가바이러스 및 플라비바이러스가 포함된다. 이들 바이러스의 게놈 RNA는 mRNA와 동일한 센스이고 mRNA로서 기능할 수 있다. 이들 바이러스는 단편화된 또는 비단편화된 게놈을 포함할 수 있다.
"이중가닥 RNA 바이러스"는 이중가닥 RNA 게놈을 포함한다. 레오바이러스는 이중가닥 RNA 바이러스이다.
바이러스 게놈은 단편화되거나 비단편화(단일분자)될 수도 있다. 단편화된 게놈은 각각이 하나 이상의 바이러스 유전자를 암호화하는 둘 이상의 핵산을 포함한다. 바람직하게는, 단편화된 게놈은 각 바이러스 유전자에 대한 별도의 핵산을 포함한다. 오르소마이소바이러스(인플루엔자 A, B 또는 C 바이러스), 분야바이러스 및 아레나바이러스는 단편화된 RNA 게놈을 포함한다. 비단편화된 게놈은 모든 바이러스 유전자를 포함하는 단일핵산을 포함한다. 모노네가비랄레스 바이러스, 라브도바이러스, 플라비비리대 바이러스, 피코나비리대 바이러스, 코로나비리대 바이러스, 토가비리대 바이러스 및 파마마이소바이러스는 비단편화된 RNA 게놈을 포함한다.
이중가닥 RNA는 "dsRNA"로 표시할 수 있다. 단일가닥 RNA는 "ssRNA"로 표시할 수 있다. 단일, 음성가닥 RNA는 "-ssRNA"로 표시할 수 있다. 단일, 양성가닥 RNA는 "+ssRNA"로 표시할 수 있다.
"바이러스 유전자 단편"은 RNA 바이러스 게놈으로부터 게놈 RNA 분자에 대응하는 클로닝된 cDNA인 것이 바람직하다. 이 용어는 RNA 바이러스로부터 유래된 유전자를 포함하는 임의의 유전자 또는 유전자단편(예를 들면, PCR 산물 또는 제한단편)을 포함할 수도 있다.
"최소 플라스미드계 시스템"은 RNA 바이러스로부터의 각 자율 바이러스 게놈 단편을 포함하는, 상기 정의한 바와 같은, 발현플라스미드이다. 따라서, 바이러스 게놈 서열을 포함하는 플라스미드의 총 수는 공급원 RNA 바이러스로부터의 유전자 단편의 총 수를 초과하지 않을 것이다. 본 발명은 바이러스 서열을 포함하지 않는 다른 플라스미드가 선택적으로 숙주세포 속으로 공동트랜스펙션될 수 있는 실시형태를 포함한다. 이것은 숙주세포 내의 시스템을 설정하는데 필요한 플라스미드의 총 수를 제한하고, 헬퍼 바이러스의 필요성을 제거하고, 재분류 바이러스의 효과적 생성을 허용함으로써 상당한 이점을 제공한다.
본 발명의 최소 플라스미드계 시스템 내의 특정 바이러스 유전자는 PR/8/34 (H1N1) 도는 WSN/33(H1N1) 균주와 같은 세포 배양액에서 잘 성장하는 바이러스 균주, A/Ann Arbor/6/60 (H2N2)와 같은 감약된 균주, 또는 인플루엔자 B/Ann Arbor/1/66로부터 유래할 수 있다. 감약된 균주도 세포배양액에서 잘 성장하는 것이 바람직하다. 특히, 인플루엔자 A에 대하여, 플라스미드계 시스템 내의 바람직한 바이러스 유전자 단편은 세포배양액에서 잘 자라는 균주 또는 감약된 균주 또는 양자로부터 바이러스 중합효소 복합체 단백질, M 단백질, 및/또는 NS 단백질을 암호화한다. 본 명세서에서는 이들 단백질은 "바이러스 내부 단백질" 또는 바이러스 " 비당단백질"이라고 한다.
인플루엔자 A 바이러스의 게놈은 일반적으로 10개의 다른 단백질을 암호화한다: 전사효소일 것으로 생각되는 PB2, 전사효소일 것으로 생각되는 PB1, 전사효소일 것으로 생각되는 PA, 헤마글루티닌일 것으로 생각되는 HA, RNA 결합 뉴클레오단백질일 것으로 생각되는 NP, 뉴라미니다제일 것으로 생각되는 NA, 각각 매트릭스 단백질 및 필수 막 단백질일 것으로 생각되는 M1/M2, RNA 가공 및 운반에 영향을 미칠 수 있는 비구조 단백질일 것으로 생각되는 NS1/NS2. PB1, PB2, NP 및 PA는 인플루엔자 바이러스 전사 중합효소 복합체의 부분일 것으로 생각된다.
바람직하게는, 본 명세서에서 사용되는 "세포배양액"이라는 용어는 숙주세포 내에서의 시험관 내 세포배양액 뿐 아니라 미발달된 계란과 가은 백신생산용 바이러스를 증식시키기 위하여 상업적으로 허용되는 방법을 말한다(Furminger, In: Nicholson, Webster and May(eds.), Textbook of Influenza , Chapter 24, pp. 324-332, 특히 pp. 328-329를 참조).
이와 유사하게, 플라스미드계 시스템은 보호적 면역학적 반응을 생산하는데 필요한 항원용 유전자 단편을 포함할 것이다. "보호적 면역학적 반응"은 면역화된(백신접종된) 환자에서 비리온과 감염된 세포를 제거하는데 효과적인 체액성(항체) 또는 세포성 성분 또는 양자를 포함한다. 따라서, 보호적 면역반응은 인플루엔자 바이러스와 같은 RNA 바이러스 감염을 방지하거나 해결할 수 있다. 항원은 "표면항원", 즉 감염된 세포의 표면 또는 비리온의 표면에서 발현되는 표면항원인 것이 바람직하다. 표면항원은 당단백질인 것이 보다 바람직하다. 인플루엔자에 대해, 1차 당단백질 항원은 헤마글루티닌(HA 또는 A) 및 뉴라미니다제(NA 또는 N)이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "면역원성"이라는 용어는 체액성 또는 세포성 면역반응, 및 바람직하게는 양자 모두 유도할 수 있는 폴리펩티드를 의미한다. 면역원성 존재는 또한 항원성이다. 면역원성 조성물은 동물에게 투여되었을 때 체액성 또는 세포성 면역반응을 유도하는 조성물이다. 분자는 면역글로불린(항체) 또는 T 세포 항원 수용체와 같은 면역 시스템의 항원인식분자와 특이적으로 상호작용할 수 있을 때 "항원성"이다. 항원성 폴리펩티드는 약 5개 이상, 바람직하게는 약 10개 이상의 아미노산으로 된 에피토프를 포함한다. 에피토프라고도 불리는 폴리펩티드의 항원성 부분은 항체 또는 T 세포 수용체 인식인식을 위한 면역우세한 부분일 수 있고, 또는 면역화를 위한 담체 폴리펩티드에 항원성 부분을 접합함으로써 분자에 대한 항체를 생성하는데 사용되는 부분일 수 있다. 항원성인 분자는 그 자체가 면역원성, 즉 담체가 없이 면역반응을 유도할 수 있어야 할 필요는 없다.
본 명세서에서 사용되는 "병원성 바이러스 균주"는 질환을 유발할 수 있는 임의의 바이러스 균주; 바람직하게는 현재 WHO(World Health Organization), CDC(Centers for Disease Control and Prevention), 또는 유사 순환성 바이러스의 다른 공중위생기관 리스트에 있는 바이러스를 말한다. 그러한 바이러스에는 간염바이러스과, 레오바이러스과, 오르소마이소바이러스과, 파라마이소바이러스과, 필로비리대과, 보나비리대과, 분야비리대과, 아레나비리대과, 코로나비리대과, 폴리오바이러스과 또는 라브도바이러스과의 구성원들이 포함될 수 있다. 본 발명은 잔여 바이러스 유전자가 원하는 배양 및/또는 감약 특성을 가지고, 따라서 백신생산에 적합한 항원성 배경의 바이러스 양을 생산하는 것을 특징으로 플라스미드계 시스템 속으로 그러한 균주로부터의 1차 항원에 대한 유전자를 삽입하는 것을 제공한다. 예를 들면, 파라마이소바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스 3의 유전자들(뉴클레오캡시드 유전자, 인단백질 유전자, 매트릭스 유전자, 융합 유전자, 헤마글루티닌-뉴라미니다제 단백질 유전자 및 큰 유전자)은 파라인플루엔자 바이러스 3 비리온을 생산하기 위해 본 발명의 플라스미드 속에 위치하는 것이 편리할 수 있다.
따라서, 본 발명의 바람직한 "재분류" 바이러스는 병원성 바이러스 균주로부터의 항원성 단백질을 암호화하는 유전자 단편이 바이러스 중합효소 복합체를 암호화하는 유전자단편 또는 배양액에서 성장하기에 적합한 바이러스(또는 감약된 바이러스)로부터의 다른 유사한 유전자(예를 들면, M 유전자와 NS 유전자를 포함하는, 비당단백질 유전자)와 결합된 바이러스이다. 따라서, 재분류바이러스는 원하는 항원적 특성을 상기와 같이 숙주세포 내에서 효과적으로 생산할 수 있는 배경으로 운반한다. 그러한 재분류바이러스는 백신을 생산하기 위하여 비리온을 생산하기 위한 바람직한 "바이러스 시드"이다(상기 Furminger 참조).
"숙주세포"라는 용어는 세포에 의하여 재조합 RNA 비리온, 바람직하게는 음성가닥 단편화된 RNA 비리온을 생산하기 위하여 임의의 방식으로 선택, 변형, 형질전환, 성장 또는 사용 또는 조작된 임의의 유기체의 임의의 세포를 의미한다. 예시적인 숙주세포에는 MDCK(MAdin-Darby Canine Kidney) 세포, VERO 세포, CV1 세포, COS-1 세포 및 COS-7 세포, 및 BHK-1 세포가 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 실시형태에서, 일시적 공동배양이 비리온을 생산하는데 바람직하다. 공동배양 은 293T 세포와 같은 수용적 세포의 효과적인 트랜스펙션을 허용하고, 이어서 MDCK 세포와 같은 바이러스 성장이 허용되는 세포의 감염을 허용한다.
"RNA 바이러스 비리온"이라는 용어는 처음 생산되었을 때 완전히 감염성인, 본 발명의 플라스미드계 시스템으로 트랜스펙션되었거나 공동트랜스펙션된 숙주세포로부터의, 바이러스 입자를 말한다. 그러한 시스템은 vRNA와 (바이러스 mRNA 번역으로부터)바이러스 단백질을 생산하여, 감염성 바이러스 입자(비리온)를 어셈블리한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "RNA 바이러스-특이적 백신"은 환자에게 투여되었을 때 RNA에 대한 보호적 면역성을 유도할 수 있는 조성물이다. "백신"이라는 용어는 수혜자에서 보호적 면역성을 유도하는데 사용할 수 있는 바이러스, 불활성화된 바이러스, 감약된 바이러스, 분열 바이러스, 또는 바이러스 단백질, 즉 표면항원을 포함하는 조성물을 말한다(상기 Furminger 참조). 일부 개체들은 강건한 또는 보호적 면역반응을 개시할 수 없거나, 또는 일부의 경우, 어떤 면역반응도 개시할 수 없기 때문에, 효과적이기 위해서, 본 발명의 백신이 집단의 일부에서 면역성을 유도할 수 있어야 한다는 것을 알아야 한다. 이러한 무능력은 개체의 유전적 배경으로부터 또는 면역결핍조건(후천적 또는 선천적) 또는 면역억제(예를 들면, 기관거부반응을 방지하거나 자가면역조건을 억제하기 위한 면역억제제를 사용한 치료) 때문에 생길 수 있다. 효능은 동물모델에서 설정될 수 있다.
백신의 "보호적 투여량"은 단독으로 또는 보조제와 결합하여 수혜환자에서 보호적 면역반응을 유도하는데 효과적인 양이다. 보호는 예를 들면, 근육 내(불활 성화된 백신에 대해 바람직함) 또는 비강 내(감약된 백신에 대해 바람직함)와 같은 투여 경로에 따라 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "환자"라는 용어는 물새, 닭, 돼지 및 사람을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 RNA 바이러스 감염을 유지하는 동물을 말한다. 특히, 상기 용어는 인간을 말한다.
"보조제"는 면역원에 대한 면역반응을 강화시키는 분자 또는 조성물이다. 보강제는 하기 정의하는 바와 같이, 약제학적으로 허용가능할 때 "인간에게 사용하기에 적합하다". 보조제의 예는 하기에 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "분리된" 이라는 용어의 의미는 인용물질이 세포와 같은 천연환경으로부터 제거된 것을 의미한다. 따라서, 분리된 생물학적 물질은 일부 또는 모든 세포성 성분, 즉 천연물질이 자연적으로 나타나는 세포의 성분(예를 들면, 세포질 또는 막성분)이 없을 수 있다. 물질은 세포추출물 또는 상등액에 존재한다면 분리된 것으로 생각할 수 있다. 핵산분자의 경우, 분리된 핵산에는 PCR 산물, 분리된 mRNA, cDNA, 또는 제한단편이 포함된다. 다른 실시형태에서, 분리된 핵산은 이것이 발견될 수 있는 염색체로부터 절개되는 것이 바람직하고, 염색체에서 발견될 때 분리된 핵산분자가 포함된 유전자의 상부 또는 하부에 위치하는 비암호화영역 또는 다른 유전자에 인접하거나 결합되지 않는 것이 보다 바람직하다(그러나 천연 조절성 영역 또는 이의 부분에 결합될 수 있다). 또다른 실시형태에서, 분리된 핵산은 하나 이상의 인트론이 결여되어 있다. 분리된 핵산분자에는 키메라 재조합 핵산 구조체의 일부를 형성할 때, 플라스미드, 코스미드, 인 공 염색체 등으로 삽입되는 서열이 포함된다. 따라서, 특정 실시형태에서, 재조합 핵산은 분리된 핵산이다. 분리된 단백질은 세포 내에서 이와 결합하는 다른 단백질 또는 핵산, 또는 양자 모두, 또는 막결합 단백질이라면 세포막과 세포막과 결합될 수 있다. 분리된 세포기관, 세포, 또는 조직은 유기체 내에서 발견되는 해부학적 부위에서 제거된다. 분리된 물질은 정제될 수 있지만 반드시 필요한 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 "정제된"이라는 용어는 물질이 얻어지는 천연물질을 포함하여, 관련없는 물질, 즉 오염물이 존재하는 것을 감소시키거나 제거하는 조건 하에서 분리되는 물질을 말한다. 예를 들면, 정제된 비리온은 조직배양액 또는 계란단백질을 포함하는 숙주세포 또는 배양성분, 비특이적 병원체 등이 실질적으로 없는 것이 바람직하다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "실질적으로 없는"이라는 용어는 물질의 분석적 시험과 관련하여 조작상으로 사용된다. 오염물이 실질적으로 없는 정제된 물질은 50% 이상 순수하고; 바람직하게는 90% 이상 순수하고, 더 바람직하게는 99% 이상 순수하다. 순도는 크로마토그래피, 겔 전기영동, 면역분석, 조성분석, 생물학적 분석, 및 당해 기술분야에서 공지된 다른 방법들에 의해 평가할 수 있다.
정제방법은 당해 기술분야에서 공지되어 있다. 바이러스 입자는 한외여과, 초원심분리, 바람직하게는 연속 원심분리에 의해 정지될 수 있다(상기 Furminger 참조). 다른 정제방법들도 가능하며 본 명세서에서 고려된다. 정제된 물질은 약 50% 이하, 바람직하게는 약 75% 이하, 및 가장 바람직하게는 약 90% 이하의 이것이 원래 결합되었던 세포성 성분, 배지, 단백질 또는 다른 원치않는 성분 또는 불순 물(상황이 필요로 하는 바에 따라)을 포함할 수 있다. "실질적으로 순수한"이라는 용어는 당해 기술분야에서 통상의 정제기술을 사용하여 달성될 수 있는 최고정도의 순도를 나타낸다.
특정 실시형태에서, "약" 또는 "대략"이라는 용어는 주어진 값 또는 범위의 20% 내, 바람직하게는 10% 내, 및 보다 바람직하게는 5% 내를 의미한다. 선택적으로 생물학에서 사용되는 로그적 용어, "약"이라는 용어는 주어진 값의 크기의 차수 내, 및 바람직하게는 값의 크기의 차수의 1/2 내를 의미할 수 있다.
플라스미드계 시스템의 유전적 조작
본 발명에 따르면, 당해 기술분야 내인 통상적인 분자생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술을 사용할 수 있다. 그러한 기술은 문헌에 자세히 설명되어 있다{Sambrook, Fitsch & Maniatis, Molecular Cloning : A Laboratory Manual , Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York ("Sambrook et al., 1898"이라 함); DNA Cloning : A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Flover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; Transcription And Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994)}.
이러한 통상적인 기술은 본 발명의 pol I-pol II 플라스미드 시스템의 제조, 바이러스 유전자 단편 cDNA 클론의 분리, 그러한 DNA의 플라스미드 속으로의 삽입, 및 플라스미드 또는 플라스미드계 시스템을 사용한 세포의 트랜스펙션에 적용한다. 특히, 위치지정 돌연변이유발 또는 유전자변형의 통상적인 기술은 RNA 바이러스, 바람직하게는 음성가닥 단편화된 RNA 바이러스 유전자를 변형시켜 하기 설명하는 바와 같이 감약된 바이러스; 또는 뉴라미니다제 경상부에서와 같은 신규한 에피토프를 포함하는 바이러스 단백질을 개발하거나 불완전 바이러스를 만들수 있게 한다.
본 명세서에서 사용되는 DNA의 "증폭"은 DNA 서열의 혼합물 내의 특정 DNA 서열의 양을 증가시키기 위하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 사용하는 것을 말한다. PCR의 설명은 문헌(Sakai et al., Science 1988, 239:487)을 참조한다.
"핵산분자"는 리보뉴클레오시드(아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 사이티딘; "RNA 분자") 또는 데옥시리보뉴클레오시드(데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘, 또는 데옥시사이티딘; "DNA 분자")의 인산 에스테르 중합형태, 또는 단일가닥형태 또는 이중가닥 나선의 포스포로티오에이트와 티오에스테르와 같은 이의 임의의 포스포에스테르 유사체를 말한다. "재조합 DNA 분자"는 분자생물학 조작을 한 DNA 분자이다.
"폴리뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드 서열"은 DNA와 RNA 중의 일련의 뉴클레오티드 염기("뉴클레오티드"라고도 함), 및 둘 이상의 뉴클레오티드의 임의의 사슬을 의미한다. 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 단백질을 만들기 위해 세포기구에 의해 사용되는 정보를 포함하는, 유전정보를 운반한다.
본 명세서에서 폴리뉴클레오티드는 프로모터, 내부 리보좀 입구부위(IRES; Ghattas, et al., Mol. Cell. Biol. 11:5848-5859, 1991) 및 다른 리보좀 결합부위 서열, 인헨서, 반응요소, 서프레서, 신호서열, 폴리아데닐레이션 서열, 인트론, 5' 및 3'-비암호화영역 등을 포함하는, 이종 서열의 옆에 위치할 수 있다. 핵산은 당해 기술분야에서 공지된 많은 수단에 의해 변형될 수도 있다. 그러한 변형의 비제한적 실시예에는 메틸레이션, 5'-7-메틸-G(5')ppp(5')N 캡과 같은 "캡", 하나 이상의 천연발생 뉴클레오티드를 유사체로 치환, 및 뉴클레오티드간 변형이 포함된다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 단백질(예를 들면, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 인터킬레이터(예를 들면, 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이터(예를 들면, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬레이터와 같은 하나 이상의 추가적 공유결합 잔기를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 메틸 또는 에틸 포스포트리에스테르 또는 알킬 포스포라미데이트 결합을 형성하여 유도화될 수 있다. 또한, 본 명세서에서 폴리뉴클레오티드는 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 제공할 수 있는 라벨로 변형될 수도 있다. 라벨의 예에는 방사성 동위원소, 형광분자, 바이오틴 등이 포함된다.
폴리펩타이드와 같은 "암호화서열" 또는 발현산물을 "암호화하는" 서열은 발현될 때 그 폴리펩티드를 생산하는 뉴클레오티드 서열이다, 즉 뉴클레오티드 서열은 그 폴리펩티드에 대한 아미노산 서열을 암호화한다. 단백질에 대한 암호화 서열 에는 개시코돈(일반적으로 AUG)과 종결코돈이 포함될 수 있다.
"구조 유전자"라고도 하는 "유전자"라는 용어는 하나 이상의 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 포함하고, 예를 들면 유전자가 발현되는 조건을 결정하는 프로모터 서열과 같은 조절성 DNA 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 아미노산의 특정서열에 대응하거나 암호화하는 DNA 서열을 의미한다.
또한 본 발명에서, 모든 변형체들이 필요로 하는 면역보호효과를 보유한다면, RNA 바이러스 유전자 단편, 바람직하게는 음성가닥 RNA 바이러스 유전자단편의 다양한 돌연변이체, 서열보존적 변형체, 및 기능 보존적 변형체를 사용할 수 있다. 또한, 본 발명은 체계적 방식으로 감약된 바이러스 균주를 개발하기 위한 돌연변이유발을 허용한다.
"돌연변이체" 및 "돌연변이"라는 용어는 DNA와 같은 유전물질에서의 검출가능한 변화, 또는 그러한 변화의 과정, 메카니즘 또는 결과를 의미한다. 이에는 유전자의 구조(예를 들면, DNA 서열)가 변화되는 유전자 돌연변이, 이의의 돌연변이과정에서 생기는 임의의 유전자 또는 DNA, 및 변형된 유전자 또는 DNA 서열에 의해 발현되는 임의의 발현산물(예를 들면, 단백질)이 포함된다. "변형체"라는 용어는 변형된 유전자, DNA 서열, 효소, 세포 등, 즉, 모든 종류의 돌연변이체를 나타내는데 사용될 수 있다. 돌연변이는 무작위 돌연변이유발 기술, 또는 PCR계 서열 변형을 포함하는 위치지정 돌연변이유발에 의해 도입될 수 있다. 상기 설명하고 하기 상세하게 설명하는 바와 같이, RNA 바이러스(예를 들면, 음성가닥 단편화된 RNA 바이러스)의 하나 이상의 개별적 유전자 단편을 돌연변이유발시키면 감약 메카니즘을 설명할 수 있을 뿐 아니라 감약된 바이러스를 개발할 수 있다. 또한, 본 발명의 플라스미드계 시스템은 효과적인 선택 시스템의 제한과 같은, 돌연변이유발에 의해 감약된 바이러스를 개발하는 이전의 노력들의 단점을 극복한다{Bilsel and Kawaoka, In: Nicholson, Webster and May (eds.), Textbook of Influenza, Chapter 32, pp. 422-434, 특히 pp. 423-425 참조}.
폴리뉴클레오티드 서열의 "서열보존성 변이체"는 주어진 코돈 위치 내에서의 하나 이상의 뉴클레티드의 변화가 그 위치에서 암호화되는 아미노산에서 변화를 일으키지 않는 것이다. 대립유전자 변형체는 서열보존성 변형체일 수 있다.
"기능보존성 변이체"는 하나의 아미노산을 유사한 특성(예를 들면, 극성, 수소결합 포텐셜, 산성, 염기성, 소수성, 방향성 등)을 가지는 것으로 대체하는 것을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 폴리펩티드의 기능과 전체 구조를 변화시키지 않고 단백질 또는 효소 내 주어진 아미노산 잔기가 변화된 것을 말한다. 일부 대립유전자 변형은 아미노산 치환이 단백질 기능에 그다지 영향을 미치지 않는, 기능보존성 변형체를 만든다. 이와 유사하게, 상동성 단백질은 기능보존성 변형체일 수 있다. 유사한 특성을 가진 아미노산은 당해 기술분야에서 공지되어 있다. 예를 들면, 아르기닌, 히스티딘 및 리신은 친수성-염기성 아미노산이고 교체할 수 있다. 이와 유사하게, 소수성 아미노산인 이소류신은 류신, 메티오닌 또는 발린으로 대체될 수 있다. 그러한 변화는 단백질 또는 폴리펩티드의 외관상 분자량 또는 등정점에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않을 것으로 예상된다. 보존되는 것으로 나타나는 것이 아닌 단백질은 유사한 기능을 가진 임의의 두 단백질 사이의 % 단백질 또 는 아미노산 서열 유사성이 다양할 수 있고, 예를 들면 유사성이 MEGALIGN 알고리즘에 근거하는 것을 특징으로 하는 클러스터법(Cluster Method)에 의하는 것과 같은 배열방법에 따라 확인되는 바와 같이 70% 내지 99%일 수 있다. "기능보존성 변형체"에는 파라미터가 참조서열의 전장에 대해 시험되는 서열들 사이의 최대 대등성을 나타내도록 선택되는 BLAST 또는 FASTA 알고리즘에 의해 확인된 바와 같이 60% 이상의 아미노산 동일성, 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 8%% 이상 및 가장 바람직하게는 90% 이상이고, 비교되는 천연 또는 어버이 단백질 또는 효소와 동일하거나 실질적으로 유사한 특성 또는 기능을 가지는 폴리펩티드 또는 효소가 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 이의 모든 문법적 형태 및 스펠링 변형에서 "상동적"이라는 용어는 상과(예를 들면, 면역글로불린 상과)로부터의 단백질 및 다른 종으로부터의 상동적 단백질(예를 들면, 마이오신 경쇄 등)(REECK, et al., Cell 50:667, 1987)을 포함하는 "공통의 진화적 기원"을 가지는 단백질들 사이의 관계를 말한다. 그러한 단백질(및 이의 암호화 유전자)은 특정 잔기 또는 모티브의 존재 또는 % 유사성에 관하여, 이의 서열 유사성에 의해 반영되는 바와 같은, 서열 상동성을 가진다.
따라서, 이의 모든 문법적 형태에서 "서열 유사성"이라는 용어는 공통의 진화적 기원을 공유하거나 공유하지 않는 단백질의 핵산 또는 아미노산 서열 사이의 동일성 또는 대응성의 정도를 말한다(상기 Reeck et al . 참조). 그러나, 일반적인 용법에서 및 본 출원에서, "매우"와 같은 부사로 변형될 때 "상동적"이라는 용어는 서열 유사성을 나타낼 수 있고 공통의 진화적 기원과 관련되거나 관련되지 않을 수 있다.
특정 실시형태에서, 2개의 DNA 서열은 충분한 수의 뉴클레오티드가 BLAST, FASTA, DNA 스트라이더, 및 파라미터가 시험되는 서열들 사이의 최대 대등성을 나타내도록 선택되는 다른 방법과 같은 서열 비교 알고리즘에 의해 확인된 바와 같이, 서열을 다른 서열과 구별하도록 정해진 길이의 DNA 서열에 대해 대등한 경우 "실질적으로 상동적"이거나 "실질적으로 유사"하다. 실질적으로 상동적인 서열은 서열 데이터 뱅크에서 입수할 수 있는 표준 소프트웨어를 사용하여 서열들을 비교함으로써, 또는 특정 시스템에 대해 정의된 바와 같은 예를 들면 엄격한 조건 하에서 서던 하이브리디제이션 실험에서 확인할 수 있다. 그러한 엄격한 조건은 당업자에게 공지되어 있고 문헌{Current Protociols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.}에서 확인할 수 있다. 엄격한 하이브리디제이션 조건의 비제한적 실시예는 약 45℃에서 6X 염화나트륨/시트르산 나트륨(SSC)에서 하이브리디제이션한 후, 50℃에서, 바람직하게는 55℃에서, 보다 바람직하게는 60℃ 또는 65℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 1회 이상 세척하는 것이다.
이와 유사하게, 특정 실시형태에서, 충분한 아미노산이 서열을 다른 서열과 구별하도록 정해진 길이에 대해 동일하거나 유사(기능적으로 동일)한 경우 두 아미노산 서열은 "실질적으로 상동적"이거나 "실질적으로 유사"하다. 바람직하게는, 유사 또는 상동적 서열은 예를 들면, GCG(Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin) 파일업 프로그램 또는 상기 설명한 프로그램들(BLAST, FASTA 등) 중 하나를 사용한 배열에 의해 확인된다. BLAST에 관한 다음 문헌들은 인용에 의해 본 명세서에 삽입된다 [BLAST ALGORITHMS: Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W.& Lipman, D.J., J.Mol. Biol. 215:403-410, 1990; Gish, W.& States, D.J., Nature Genet. 3:266-272, 1993: Madden, T.L., Tatusov, R.L. & Zhang, J., Meth. Enzymol. 266:131-141, 1996; Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J., Nucleic Acid Res. 25:3389-3402, 1997; Zhang, J. & Madden, T.L., Genome Res. 7:649-656, 1997; Wootton, J.C. & Federhen, S., Comp. Chem. 17:149-163, 1993; Hancock, J. M. & Armstrong, J.S., Comput. Appl. Biosci. 10:67-70-, 1994; ALIGNMENT SCORING SYSTEMS: Dayhoff, M.O., Schwartz, R.M. & Orcutt, B.C. (1978) "A model of evolutionary change in proteins." In "Atlas of Protein Sequence and Structure", vol.5, suppl. 3. M.O. Dayhoff(ed.), pp.345-352, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Schwartz, R.M. & Dayhoff, M.O. (1978) "Matrices for detecting distant relationships." In "Atlas of Protein Sequence and Structure", vol.5, suppl. 3. M.O. Dayhoff(ed.), pp.353-358, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Altschul, S.F., J.Mol.Biol. 219:555-565, 1991; States, D.J., Gish, W., Altschul, S.F., Methods 3:66-70, 1991; Henikoff, S. & Henikoff, J.G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992; Altschul,S.F., J. Mol. Evol. 36:290-300, 1993; ALIGNMENT STATISTICS : Karlin, S. & Altschul, S.F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990; Karlin, S. & Altschul, S.F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993; Dembo, A., Karlin, S. & Zeitouni, O., Ann. Prob. 22:2022-2039, 1994 and Altschul, S.F.(1997) "Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignment." In "Theoretical and Computation Methods in Genome Research." (S.Suhai, ed.), pp.1-14, Plenum, New York].
"프로모터 서열"은 세포 내의 RNA 중합효소에 결합할 수 있고 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절성 영역이다. 본 발명을 한정할 목적으로, cDNA의 상부에 위치한 프로모터 서열은 전사개시부위에 의해 이의 3' 말단에 결합되고 배경 이상의 검출가능한 수준에서 전사를 개시하는데 필요한 최소 수의 염기 또는 요소를 포함하도록 상부(5' 방향)로 연장된다. ((-)RNA를 발현하기 위해) cDNA의 하부에 위치하는 프로모터 서열은 전사개시부위에 의해 이의 5' 말단에서 결합되고 배경 이상의 검출가능한 수준에서 전사를 개시하는데 필요한 최소 수의 염기 또는 요소를 포함하도록 하부(3' 방향)로 연장된다. 본 발명의 이방향 시스템에는 상부 및 하부 프로모터가 모두 포함되며; 일방향 시스템에는 상부 프로모터만 포함된다. 프로모터 서열 내에는 RNA 중합효소의 결합에 관여하는 단백질 결합 도메인(컨센서스 서열)뿐 아니라, (예를 들면, 뉴클레아제 S1으로 맵핑함으로써 편리하게 정의되는) 전사개시부위도 발견될 것이다.
본 발명의 필수요소가 보존되는 한 임의의 공지 프로모터가 본 발명에서 사용될 수 있다. 예를 들면, 유전자 발현을 조절하는데 사용될 수 있는 pol II 프로 모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(미국특허 제5,385,839호 및 제5,168,062), SV40 초기 프로모터 영역(Benoist and Chambon, Nature 290:304-310, 1981), 라우스 사르코마 바이러스의 3'길이 말단 반복서열에 포함된 프로모터(Yamamoto, et al ., Cell 22:787-797, 1980), 헤르페스 티미딘 카이나제 프로모터(Wagner, et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445, 1981), 메탈로티오네인 유전자의 조절성 서열(Brinster, et al., Nature 296:39-42, 1982); T7 RNA 중합효소 프로모터; T3 RNA 중합효소 프로모터; SP6 RNA 중합효소 프로모터 및 관심있는 숙주세포에서 효과적인 다른 프로모터가 포함되지만 이에 한정되는 것은 아니다. 캡이 없는 RNA의 발현을 위한 pol I 프로모터는 모든 진핵세포의 도처에 존재하고 인간 RNA 중합효소 I이 포함된다(Molecular Cell Biology , Darnell et al. eds 1986, pp.311,365-6 참조). RNA 중합효소 III 프로모터도 본 발명에서 사용될 수 있다.
암호화 서열은 RNA 중합효소가 암호화서열을 RNA, 예를 들면, mRNA 또는 vRNA로 전사할 때 세포 내에서 전사 및 번역조절 서열(예를 들면, pol I 또는 pol II 프로모터)의 "조절하에 있거나", "기능적으로 관련되거나" 또는 "작동적으로 관련된다".
"발현하다" 및 "발현"이라는 용어는 유전자 또는 DNA 서열 내의 정보가 대응하는 유전자 또는 DNA 서열의 전사 및 번역에 관련되는 세포기능을 활성화시킴으로써 (cRNA, vRNA 및 바이러스 mRNA를 포함하는) RNA 또는 단백질을 생산하는 것과 같이 나타나도록 하는 것을 의미한다. DNA 서열은 단백질과 같은 "발현 산물"을 형 성하기 위하여 세포 내에서 또는 세포에 의해 발현된다. 생성된 단백질과 같은 발현 산물은 세포에 의해 "발현된다"고 할 수도 있다.
"트랜스펙션"이라는 용어는 숙주세포가 도입된 유전자 또는 서열에 의해 암호화되는 원하는 폴리펩티드를 생산하기 위하여 도입된 유전자 또는 서열을 발현하도록 외부 핵산을 세포 속으로 도입하는 것을 의미한다. 도입된 유전자 또는 서열은 "클로닝된" 또는 "외부" 유전자 또는 서열이라고도 할 수 있고, 개시, 종결, 프로모터, 신호, 분비 또는 세포의 유전기구에 의해 사용되는 다른 서열들과 같은 조절성 또는 조절서열을 포함할 수 있다. 유전자 또는 서열은 비기능성 서열 또는 기능이 알려지지 않은 서열을 포함할 수 있다. 도입된 DNA 또는 RNA를 수용하고 발현하는 숙주세포는 "형질전환"되었고 "형질전환체" 또는 "클론"이다. 숙주세포에 도입되는 DNA 또는 RNA는 숙주세포와 동일한 속 또는 종의 세포, 또는 다른 속 또는 종의 세포를 포함하는, 임의의 공급원으로부터 올 수 있다.
"벡터", "클로닝 벡터" 및 "발현 벡터"라는 용어는 그것에 의해 DNA 또는 RNA 서열(예를 들면, 외부 유전자)이 숙주세포 속으로 도입되어 숙주를 형질전환시키고 도입된 서열의 발현(예를 들면, 전사 및 번역)을 촉진할 수 있는 비히클을 의미한다. 본 발명의 바람직한 벡터는 플라스미드이다.
벡터는 일반적으로 외부 DNA가 삽입될 수 있는 전달제의 DNA를 포함한다. 하나의 DNA 단편을 다른 DNA 단편 속으로 삽입하는 일반적인 방법에는 제한부위라 불리는 특정 부위(특정그룹의 뉴클레오티드)에서 DNA를 분해하는 제한효소라 불리는 효소를 사용하는 것이 포함된다. "카세트"는 정해진 제한부위에서 벡터 속으로 삽 입될 수 있는 발현산물을 암호화하는 DNA 암호화서열 또는 DNA의 단편을 말한다. 카세트 제한 부위는 적합한 리딩 프레임 내에 카세트를 삽입하도록 디자인된다. 일반적으로, 외부 DNA는 벡터 DNA의 하나 이상의 제한부위에서 삽입된 후 전달성 벡터 DNA를 따라 숙주세포 속으로 벡터에 의해 운반된다. 발현벡터와 같은 삽입되거나 첨가된 DNA를 가지는 DNA의 단편 또는 서열을 "DNA 구조체"라고 부를 수도 있다. 벡터의 일반적인 형태는 일반적으로 이중가닥 DNA의 자가포함 분자이고, 추가(외부) DNA를 쉽게 수용할 수 있고, 적합한 숙주세포 속으로 쉽게 도입될 수 있는 "플라스미드"이다. 플라스미드 벡터는 때때로 암호화 DNA와 프로모터 DNA를 포함하고, 외부 DNA를 삽입하기에 적합한 하나 이상의 제한부위를 가진다. 암호화 DNA는 특정 단백질 또는 효소에 대한 특정 아미노산서열을 암호화하는 DNA 서열이다. 프로모터 DNA는 암호화 DNA의 발현을 개시, 조절, 또는 매개 또는 제어하는 DNA서열이다. 프로모터 DNA와 암호화 DNA는 동일한 유전자 또는 다른 유전자로부터 올 수 있고, 동일하거나 다른 유기체로부터 올 수 있다. 재조합 클로닝 벡터는 때로 클로닝 또는 발현을 위한 하나 이상의 복제 시스템, 항생제 내성과 같은 숙주에서 선택하기 위한 하나 이상의 마커, 및 하나 이상의 발현 카세트를 포함할 것이다.
"발현 시스템"이라는 용어는 벡터에 의해 운반되고 숙주세포로 도입된 외부 DNA에 의해 암호화되는 단백질의 발현을 위한 것과 같은, 적합한 조건 하의 숙주세포와 양립가능 벡터를 의미한다.
"이종성"은 천연적으로 발생하지 않는 요소의 조합을 말한다. 예를 들면, 이종성 DNA는 세포 내 또는 세포의 염색체부위 내에 천연적으로 위치하지 않는 DNA를 말한다. 바람직하게는 이종성 DNA는 세포에 이질인 유전자를 포함한다. 이종 발현 조절 요소는 천연에서 작동적으로 관련되는 것과 다른 유전자와 작동적으로 관련된 그러한 요소이다. 본 발명과 관련하여, 서열 라이브러리로부터의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 클로닝 또는 발현을 위해 삽입되는 벡터 DNA에 이종성이고, 이것이 발현되는 그러한 벡터를 포함하는 숙주세포에 이종성이다.
상기와 같이, 본 발명은 이종성 바이러스 유전자를 사용한 재분류 바이러스를 생성할 수 있다. 배양액에서 잘 자라는 바이러스 균주의 유전적 배경 내에 바이러스 항원에 대한 유전자를 삽입하는 것외에도, 본 발명은 인플루엔자 A 배경 내의 인플루엔자 B 항원과 같은 교차종 재분류를 만들 수 있다.
백신
상기한 바와 같이, 본 발명은 RNA 바이러스 감염, 바람직하게는 음성가닥 RNA 바이러스 감염을 치료하거나 방지하기 위한 백신을 생산하는 효율적이고 경제적인 방법을 제공한다. 본 발명의 최소 플라스미드계 시스템은 선택의 필요성을 제거하고, 재분류 바이러스의 정밀한 조절을 제공한다. 불활성화된 인플루엔자 백신을 제조하기 위하여, 고수율 균주(예를 들면, PR/8/34 (H1N1))로부터의 비 당단백질 단편(예를 들면, PB1 , PB2 , PA , NP , M 및 NS)을 포함하는 6개의 플라스미드를 제시된 백신 서브타입의 HA 및 NA cDNA를 포함하는 2개의 발현 플라스미드와 공동트랜스펙션시킬 수 있다. 헬퍼 바이러스가 필요하지 않기 때문에, 생성된 바이러스는 원하는 유전자 무리를 가진 인플루엔자 바이러스이다. 유사한 접근방법이 백신에서 사용하기 위한 임의의 다양한 불활성화된 재분류 RNA 바이러스를 생산하는데 사용될 수 있다. 표적 바이러스에 대한 바이러스 유전자단편(예를 들면, 비당단백질 단편)을 포함하는 발현 플라스미드는 주어진 감염성 바이러스 서브타입(예를 들면, 집단 내에서 현재 순환하는 바이러스 서브타입)에 대응하는 단백질을 암호화하는 다른 발현 플라스미드와 공동트랜스펙션될 수 있다. 본 발명에 따라 생산된 바이러스는 백신접종에 대한 전통적 또는 새로운 접근방법에{Bilsel and Kawaoka, In: Nicholson, Webster and May(eds.), Textbook of Influenza, Chapter 32, pp.422-434 참조}, 특히 살아있는 감약된 백신의 개발에 사용될 수 있다(아래에서 보다 상세하게 설명). 특히 본 발명은 제한된 숙주범위 또는 예측할 수 없는 감약를 가진 재분류바이러스를 개발하는 것과 관련하여, 현재 기술의 단점을 극복한다.
인플루엔자 백신을 개발하는데 많은 노력이 있어 왔다{Wood and Williams, In: Nicholson, Webster and May(eds.), Textbook of Influenza, Chapter 23, pp.317-323 참조}. 이 부분의 많은 부분은 인플루엔자 백신과 관련되지만, 본 발명의 범위는 모든 RNA 바이러스, 바람직하게는 음성가닥 단편화된 RNA 바이러스 백신 및 특히 오르소마이소비리대 백신까지 확대된다.
3가지 형태의 불활성화된 인플루엔자 백신을 현재 이용할 수 있다: 전체 바이러스, 분열산물 및 표면항원백신{Wood, In: Nicholson, Webster and May(eds.), Textbook of Influenza, Chapter 25, pp.333-345 참조}. 본 발명은 배양액 중에서 허용가능한 성장특성을 가지는 원하는 재분류 바이러스를 신속하게 개발할 수 있게 하기 때문에, 백신 제조자들이 공중위생 요구를 만족시키고 임상적인 양의 백신을 생산할 필요가 있기 때문에 현재 완화된 중요한 요건인 표준화, 일반적으로 8 내지 9개월 기간을 보증하는 충분한 양의 백신을 생성하도록 할 수 있어 유리하다(상기 Wood, p.333).
백신안정성도 문제이다{Wiselka, In: Nicholson, Webster and May(eds.),Textbook of Influenza, Chapter 26, pp.346-357 참조}. 본 발명의 백신이 정해진 세포배양시스템에서 생산될 수 있기 때문에, 미발달 계란에서 제조된 시판 백신 내에 존재할 수도 있는 비특이적 병원균, 박테리아 및 알러지성 단백질을 피하게 된다.
보조제가 백신(예를 들면, 인플루엔자 백신)과 함께 사용되어 왔다(상기 Wood and Williams). "보조제"라는 용어는 항원에 대한 면역반응을 증진시키는 화합물 또는 혼합물을 말한다. 보조제는 항원을 서서히 배출하는 조직 축적소로 및 면역반응을 비특이적으로 증진시키는 림프계 활성제로서 기능을 할 수 있다(Hood, et al., Immunology , Second Ed ., 1984, Benjamin/Cummings: Menlo Park, California, p.384). 때로는 보조제없이 항원 단독으로 1차 면역성검사를 하면 체액성 또는 세포성 면역반응이 유도되지 않을 것이다. 보조제에는 프룬드 보조제, 불완전 프룬드 보조제, 사포닌, 수산화알루미늄과 같은 미네랄겔, 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리애니언, 펩티드, 오일 또는 탄화수소 에멀젼과 같은 표면활성물질, 및 BCG(bacille Calmette - Guerin)와 코린박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)과 같은 잠재적으로 유용한 인간 보조제가 포함되지만 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 합성 보조제의 예는 QS-21이다. 선택적으로 또는 추가적으로, 하기 설명하는 바와 같이 면역자극 단백질은 보조제로서 또는 백신에 대한 면역반응 을 증가시키기 위해 제공될 수 있다. 바람직하게는, 보조제는 약제학적으로 허용가능하다.
"약제학적으로 허용가능한"이라는 것은 생리학적으로 허용가능하고, 인간에게 투여하였을 때 일반적으로 위장장애, 졸음 등과 같은 알러지성 또는 유사한 불리한 반응을 일으키지 않는 분자체 및 조성물을 말한다. 바람직하게는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "약제학적으로 허용가능한"이라는 용어는 연방 또는 주정부의 규제국에 의해 승인되고 미국약전 또는 동물, 보다 특이적으로는 인간에게 사용하도록 일반적으로 승인된 다른 약전에 나열된 것을 의미한다. "담체"라는 용어는 화합물이 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 말한다. 살균수 또는 수용액 염용액 및 덱스트로즈 및 글리세롤 수용액은 담체로, 특히 주사용액으로 사용하기에 바람직하다. 적합한 약제학적 담체는 마틴(E.W. Martin)의 "레밍턴 약제학적 과학(Remington's Pharmaceutical Sciences)"에 기재되어 있다.
백신접종 효과는 면역자극, 면역강화, 또는 전염증성 사이토카인, 림포카인 또는 케모카인과 같은 면역자극 분자(Salgaller and Lodge, J. Surg. Oncol. 1998, 68:122)를 백신, 특히 벡터 백신과 공동투여함으로써 증진될 수 있다. 예를 들면, 일부 키 공동자극분자 또는 이의 유전자(예를 들면, B7.1, B7.2) 뿐 아니라 IL -1, IL-2, IL -3, IL -4, IL -12, IL -13, 과립구-마크로파지(GM)-콜로니자극인자(CSF) 및 다른 콜로니자극인자, 마크로파지 염증성 인자, Flt3 리간드(Lyman, Curr. Opin. Hematol., 5:192, 1998)와 같은 사이토카인 또는 사이토카인 유전자도 사용할 수 있다. 이들 면역자극분자는 분자의 발현을 암호화하는 벡터의 발현에 의해 또는 단 백질로서 전신적으로 또는 국부적으로 전달될 수 있다.
수지상세포 ( Dendritic Cell ) 표적화 . 백신접종은 수지상세포의 표적화를 통해 달성될 수도 있다(Steinman, J. Lab. Clin. Med., 128:531, 1996; Steinman, Exp. Hematol., 24:859, 1996; Taite et al ., Leukemia, 13:653, 1999; Avigan, Blood Rev., 13:51, 1999; DiNicola et al ., Cytokines Cell. Mol. Ther., 4:265, 1998). 수지상 세포는 T-세포 의존성 면역성의 활성화에서 중요한 역할을 한다. 수지상 세포를 증식시키면 단백질 항원을 그 자리에서 면역원성 형태로 포획한 후 이들 항원이 T 세포에 의해 인식되어 T 세포를 자극할 수 있는 형태로 존재하도록 하는데 사용할 수 있다(예를 들면, Steinman, Exper. Hematol. 24:859-862, 1996; Inaba, et al., J. Exp. Med., 188:2163-73, 1998 및 미국특허 제5,851,756호 참조). 생체 외 자극을 위해, 수지상 세포를 배양접시에 도말하고 바이러스 항원이 수지상 세포에 결합하기에 충분한 시간 및 충분한 양으로 바이러스에 노출(바이러스로 펄스)시킨다. 이 후 펄스된 세포는 예를 들면, 정맥주사에 의해 치료중인 환자에게 다시 이식될 수 있다. 형태-적합 공여자로부터 얻거나 (바람직하게는 원하지 않는 MHC 분자의 발현을 억제하고) 원하는 MHC 분자를 발현하도록 수지상 세포를 유전자 조작하여 얻어질 수 있는 MHC-클래스 II-적합 수지상세포를 사용할 수도 있지만, 자가 수지상 세포, 즉 치료중인 환자로부터 얻은 수지상세포를 사용하는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 수지상 세포는 바이러스 또는 바이러스 서브유닛의 섭취를 위하여 생체 내에서 특이적으로 표적화될 수 있다. DEC-205(Swiggard et al., Cell. Immunol., 165:302-11, 1995; Steinman, Exp. Hematol., 24:859, 1996) 및 Fc 수용체와 같은 항원제시를 매개하는 수용체를 이용함으로써 생체 내에서 수지상 세포를 표적화하기 위한 다양한 방법을 이용할 수 있다.
불활성화된 백신
불활성화된 바이러스 백신은 RNA 바이러스 감염(예를 들면, 인플루엔자)에 대한 백신접종에 대해 잘 확립되어 있다{Nichol, In: Nicholson, Webster and May (eds.), Textbook of Influenza, Chapter 27, pp. 358-372 참조}. 불활성화된 백신을 제조하기 위하여, 트랜스펙션된 바이러스는 세포 배양액 중에서 또는 미발달 계란에서 성장시킨다. 바이러스는 포름알데하이드, 베타-프로피오락톤, 에테르, (Tween-80과 같은) 계면활성제와 에테르, 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB) 및 Triton N101, 나트륨 데옥시콜레이트 및 트리(n-부틸) 포스페이트를 사용해 처리하여 불활성화될 수 있다(상기 Furminger; 상기 Wood and Williams). 불활성화는 (계란에서 생산된 바이러스로부터의) 요막유체를 정화하기 전 또는 후에 할 수 있으며; 원심분리에 의해 비리온을 분리하고 정제할 수 있다(상기 Furminger, p.326 참조). 백신의 효력을 평가하기 위하여, SRD(single radial immunodiffusion) 시험을 사용할 수 있다(Schild et al., Bull. World Health Organ. 1975, 52:43-50 and 223-31 Mostow et al., J. Clin. Microbiol. 1975, 2:531). 만족스러운 면역반응에 필요한 투여량은 표준화되었고 15㎍ HA/균주/투여량이다. 불활성화된 백신은 주사에 의해 근육 내 투여될 수 있다.
살아있는 감약된 인플루엔자 백신
감약된 냉 적응 살아있는 RNA 바이러스 백신(인플루엔자 백신)을 개발했다{Keitel and Piedra, In: Nicholson, Webster and May (eds.), Textbook of Influenza, Chapter 28, pp. 373-390; Ghendon, In: Nicholson, Webster and May (eds.), Textbook of Influenza, Chapter 29, pp. 391-399 참조}. 8개의 플라스미드로부터 완전한 인플루엔자 바이러스를 생성하는 능력에 의해 백신 균주의 감약를 조절하고 임의의 표적 집단에 최적인 백신 균주를 개발할 수 있다(상기 Bilsel and Kawaoka 참조). 인플루엔자 균주 A/Ann Arbor/6/60(H2N2) 또는 인플루엔자 B/Ann Arbor/1/66이 현재 살아있는 감약된 백신을 제조하는데 사용되기 때문에, pHW2000과 같은 플라스미드 속에 인플루엔자의 내부유전자(PB2 , PB1 , PA , NP , M, NS)의 6개 cDNA를 각각 삽입할 것이다. 관련 인플루엔자 균주의 당단백질 HA 및 NA를 포함하는 2개의 플라스미드는 비글리코실화 인플루엔자 단백질을 암호화하는 6개의 마스터 플라스미드와 함께 구성되어 공동트랜스펙션될 것이다.
내부 유전자의 암호화 또는 비암호화영역을 유전적 변형시키면 감약된 바이러스를 개발할 수 있을 뿐 아니라, 백신의 안정성, 감염성, 면역원성 및 보호적 효능이 개선될 것으로 기대된다.
HA 유전자의 조작이 또한 백신 균주의 안정성을 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스의 H5 또는 H7 당단백질의 연결펩티드에서 발견된 염기성 아미노산을 제거하면 백신의 안정성을 증가시킬 수 있다.
점막 백신접종. 점막 백신방법은 감염이 점막을 통해 일어나기 때문에 많은 병원성 바이러스에 특히 효과적이다. 점막은 EBNA-1 백신과 면역치료에 대한 중요 한 표적인 수지상 세포를 포함한다. 따라서, 불활성화된 및 감약된 바이러스 백신에 대한 점막 백신접종법이 고려된다. 점막은 백신의 국부적 전달에 의해 표적화될 수 있지만, 면역원성 단백질을 점막까지 운반하기 위해 다양한 방법들이 사용되고 있다.
특정 실시형태에서, 백신은 콜레라 독소 B 또는 콜레라 독소 A/B 키메라와 같은 콜레라 독소와의 접합체 또는 키메라 융합단백질로서 또는 이와의 혼합물로 투여될 수 있다(Hajishengallis, J. Immunol., 154:4322-32, 1995; Jobling and Holmes, Infect Immun., 60:4915-24, 1992). 콜레라 독소 B 서브유닛의 사용에 기초한 점막 백신이 설명되어 있다(Lebens and Holmgren, Dev Biol Stand 82:215-27, 1994). 다른 실시형태에서, 열민감성 엔테로톡신(LT)과의 혼합물이 점막 백신접종을 위해 제조될 수 있다.
다른 점막 백신접종법에는 마이크로캡슐 내에 바이러스를 캡슐화시키는 방법(미국특허 재5,075,109호, 제5,820,883호 및 제5,853,763호) 및 면역강화 막 담체를 사용하는 방법(WO 98/0558)이 포함된다. 경구 투여된 면역원의 면역원성은 적혈구세포(rbc) 또는 rbc 고스트를 사용하거나(미국특허 제5,643,577호) 청색 혀 항원을 사용하여(미국특허 제5,690,938호) 증진될 수 있다.
본 발명은 본 발명을 제한하지 않고 설명하는 하기 실시예를 참조하여 보다 잘 이해될 것이다.
(실시예 1)
인플루엔자 A 바이러스를 생성하기 위한 " 앰비센스 " 접근방법 : 하나의 주형으로부터 vRNA 및 mRNA 합성
플라스미드의 수를 감소시키는 첫번째 단계로서, 본 실시예는 동일한 플라스미 상에 pol I 및 pol II-프로모터 모두를 포함하는 플라스미드를 구성하여 트랜스펙션시키고 이 시스템이 하나의 주형으로부터 vRNA와 단백질을 발현할 수 있다는 증거를 제시한다. 본 실시예는 공개되었다(Hoffmann et al ., Virology 2000, 267:310).
재료 및 방법
플라스미드의 클로닝 . 모든 클로닝 및 PCR 반응은 표준 프로토콜에 따라 행하였다. 간단하게 말하면, A/WSN/33의 중합효소 복합체 유전자에 대한 발현 플라스미드는 인간 사이토메갈로바이러스(CMV)의 최초기 프로모터 및 소 성장호르몬(BGH)을 암호화하는 유전자의 폴리 A 부위를 포함하는 pcDNA3(Invitrogen)에서 유래하였다. 바이러스 cDNA는 발현구조체 pHW25-NP, pHW23-PA, pHW21-PB2, pHW22-PB1을 얻기 위하여 플라스미드 pWNP143, pWSNPA3, pWSNPB2-14, pGW-PB1에서 유래하였다. pHW12는 pol II-프로모터와 폴리 A- 부위 사이에 인간 pol I 프로모터와 터미네이터 서열을 삽입함으로써 생성하였다. 플라스미드 pHW52는 HindIII와 XhoI 부위에 의해 연장된 PB1의 비암호화영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 먼저 삽입한 후 이들 부위에 pHW22-PB1의 PB1-암호화 영역을 삽입함으로써 pHW12에서 유래하였다. 플라스미드 pHW82-PB1은 CMV-프로모터 서열의 결실에 의해 pHW52-PB1으로부터 유래하였다. 리포터 구조체 pHW72-EGFP 내의 증진 녹색 형광 단백질(EGFP)에 대한 암호 화 영역은 주형으로서 pEGFP-N1(Clontech)을 사용하고 인간 pol I 프로모터와 쥐의 터미네이터와 SacII/XhoI 부위에 의해 분리된 M-단편의 비암호화영역을 포함하는 플라스미드 pHW72 속으로 SacII/XhoI 분해 후 cDNA를 삽입하여 PCR-증폭한 후 얻었다. pHW127-M과 pHW128-NS는 BsmBI 분해된 벡터 pHH21 속으로 삽입하기 위한 BsmBI 부위와 단편특이적 서열을 포함하는 프라이머를 사용하여 바이러스 RNA를 RT-PCR 증폭하여 구성하였다(E. Hoffmann, Ph.D. Thesis 1997, Justaus Liebig University, Giessen, Germany; Neumann et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96:9345). 플라스미드 pPolI-WSN-PB1; pPol-WSN-PB2, pPolI-WSN-PA, pPolI-WSN-NP, pPolI-WSN-HA, pPolI-WSN-NA, pEWSN-HA 및 pCAGGS-WNA15의 회수는 다른 곳에 설명되어 있다(상기 Neumann et al . 참조)
세포 배양 및 트랜스펙션 . MDCK(Madin-Darby canine kidney) 세포를 10% 우태아혈청(FBS)을 포함하는 MEM(modified Eagle Medium)에서 유지하고, 293T 인간 미발달 신장세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle Medium)에서 배양하였다. TransIT LT-1 (Panvera, Medison, Wisconsin)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 1×106 293T 세포를 트랜스펙션시켰다. 다른 양의 플라스미드(표 1)를 TransIT LT-1 (1㎍의 DNA 당 2㎕ TransIT LT-1)과 혼합하고, 실온에서 45분 동안 배양하고, 세포에 첨가하였다. 6시간 후, DNA-트랜스펙션 혼합물을 0.3% 우혈청알부민(BSA)과 0.01% FBS를 포함하는 Opti-MEM I(Gibco/BRL, Gaithersburg, Maryland)로 대체하였다. 트랜스펙션시키고 48시간 후, 바이러스를 포함하는 상등 액을 MDCK 세포에서 적정하였다.
RNA 분리 및 RT - PCR . 바이러스 RNA를 제조자의 지시에 따라 Rneasy-Kit(Qiagen, Valencia, California)를 사용하여 분리하였다. 재조합 인플루엔자 바이러스의 특성화를 위하여, 제공된 프로토콜을 따라 Access RT-PCR 키트(Promega, Medison, Wisconsin)를 사용하였다. 하기 프라이머를 RT-PCR 실험에 사용하였다: Seq-PB1#1: 5'-AGG ATG GGA TTC CTC AAG G-3' (SEQ ID NO:1); Seq-PB1#2: 5'-GCT ATG GTT TCC AGA GCC CG-3' (SEQ ID NO:2); Bm-PB1-1: 5'-TAT TCG TCT CAG GGA GCG AAA GCA GGC A-3' (SEQ ID NO:3); Bm-PB1-2341R: 5'-ATA TCG TCT CGT ATT AGT AGA AAC AAG GCA TTT-3'(SEQ ID NO:4). PTC-200 DNA 엔진을 사용하여 RT-PCR 실험을 행하였다(MJ Research, Watertown, Massachusetts). 증폭프로그램은 48℃에서 45분 동안 1주기(제1가닥 cDNA 합성), 및 94℃에서 2분 동안 1주기(AMV 역전사효소의 불활성화 및 cDNA 변성)로 시작하였다. 이들 주기는 94℃에서 20초, 52℃에서 30초, 및 72℃에서 30초 동안 40주기 반복하고(PCR 증폭); 프로그램을 72℃에서 5분동안 1주기로 종료하였다. PCR 산물을 아가로즈 겔 전기영동으로 분석하고 프라이머 Seq-PB1#1 또는 Seq-PB1#2로 서열확인하였다.
유세포분석 . 트랜스펙션시키고 48시간 후, 293T 세포를 PBS(phosphate-buffered saline)로 세척하고, 펠렛화하고 PBS + 5% FBS에 재현탁시켰다. FACS 칼리버 유세포분석기(Becton Dickinson)를 사용하여 유세포분석을 하고 셀퀘스트(CellQuest) 소프트웨어 패키지를 사용하여 데이터를 분석하였다. EGFP 발현 분석을 위하여, EGFP 매개 형광 검출을 위한 EGFP에 대한 고감도를 얻기 위하여 530nm(FL1)의 방출 파장을 사용하였다.
결과 및 토의
2개의 진핵 프로모터를 포함하는 클로닝벡터 pHW12 의 디자인 및 특성. 인플루엔자 A 바이러스는 음성 센스 극성을 가진 RNA를 포함하는 단편화된 바이러스이다. 복제주기동안, 8개의 vRNA 단편의 5' 및 3'-구조를 리보뉴클레오단백질 복합체 단백질(PB2, PB1, PA, NP)이 인식하여 인플루엔자 바이러스 유전자를 복제 및 전사한다. 말단서열 요소가 매우 보존되어 있다는 사실은 전사된 인공 RNA가 5'- 및 3'-말단의 것과 동일한 서열을 가져야한다는 것을 나타낸다(Luo et al ., Virol. 1991, 65:2861; Flick et al., RNA 1996, 2:1046). 제한 엔도뉴클레아제 BsmBI를 사용하여 pol I 프로모터와 터미네이터 사이에 관심있는 서열을 삽입할 수 있는 클로닝벡터 pHW12를 구성하였다. pol I 전사단위는 사이토메갈로바이러스(CMV)의 pol II 프로모터와 소 성장호르몬을 암호화하는 유전자의 폴리아데닐레이션 신호 옆에 위치한다. CMV-프로모터, 폴리 A 부위 및 플라스미드의 골격은 클로닝 벡터 pcDNA3에서 유래한다.
pol I/ pol II 이방향 전사시스템에서의 PB1 단백질 발현. pol I/pol II 원 플라스미드 전사 시스템을 시험하기 위하여, A/WSN/33 바이러스의 PB1 유전자의 cDNA를 클로닝벡터 pHW12에 삽입하여 플라스미드 pHW52-PB1을 만들었다. HindIII 및 XhoI 제한부위를 이 유전자의 5' 및 3' 비암호화 영역에 삽입하였다. 생성된 재조합 바이러스가 RT-PCR에 의해 확인될 수 있음을 확인하기 위하여 이들 유전 태그를 포함시켰다. 이 플라스미드로 트랜스펙션된 인간세포가 2가지 형태의 RNA를 생 산할 수 있을 것으로 기대하였다: 세포성 pol I에 의해 합성된 PB1-vRNA 및 pol II에 의해 합성된 5'-캡 구조를 가진 mRNA. mRNA를 번역하면 PB1-단백질이 합성될 것이다.
PB1-단백질이 이 구조체로부터 생산되는지 여부를 조사하기 위하여, CMV-프로모터의 조절 하에서 A/WSN/33의 PB2, PA 및 NP 단백질을 암호화하는 cDNA를 포함하는 발현 플라스미드 pHW21-PB2, pHW23-PA 및 pHW25-NP를 구성함으로써 인공 vRNA의 복제와 전사를 시험하였다. 인공 vRNA의 생체 내 합성을 위하여, M-단편의 비암호화 영역과 인간 pol I-프로모터와 쥐의 터미네이터 서열 옆에 위치한 EGFP cDNA를 포함하는 리포터 플라스미드 pHW72-EGFP를 구성하였다. 5개의 플라스미드{2㎍ pHW21-PB2, 2㎍ pHW52-PB1 (pol I/pol II 프로모터 구조체), 2㎍ pHW23-PA, 2㎍ pHW25-NP, 및 1㎍ pHW72-EGFP}를 293T 세포 속으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션시키고 24시간 및 48시간 후, 형광현미경으로 세포를 분석하였다. 24시간 후 형광세포를 관찰하였다. 이 결과는 24시간 내에 중합효소 단백질이 EGFP-vRNA의 인플루엔자 바이러스 특이적 말단을 인식하기에 충분한 농도로 합성된다는 것을 보여준다. 이들 단백질은 EGFP로 번역되는 mRNA를 합성한다.
이 시스템의 효능을 평가하기 위하여, 형광세포의 수를 계수하기 위하여 유세포분석을 행하였다. 5개의 플라스미드를 트랜스펙션시키고 48시간 후, 세포집단의 18.72%가 형광을 나타내었다. pHW52-PB1 플라스미드가 첨가되지 않았을 때 오직 배경수준의 형광세포(0.06%)만이 관찰되었고; 이러한 발견은 4가지 RNP 복합체 단백질 모두가 vRNA의 증폭에 필요하다는 것을 보여주는 이전 연구와 일치한다(Huang et al., J. Virol. 1990, 64:5669). 이 결과는 PB1-cDNA 전사와 다른 RNP 복합체 단백질과 함께 PB1 단백질의 생성된 농도가 바이러스 전사/복제 과정을 개시하는데 충분하다는 것을 나타낸다.
재조합 인플루엔자 A 바이러스의 생성. 감염성 인플루엔자 A 바이러스를 생성하기 위해서는, 플라스미드 pHW52-PB1이 PB1 mRNA와 단백질 뿐 아니라 충분한 양의 PB1-vRNA를 제공하여 자손 바이러스 속으로 패키징될 수 있어야 한다. 남은 7개의 vRNA를 위해, 인간 pol I 프로모터와 쥐의 터미네이터 옆에 위치한 A/WSN/33 바이러스의 전장 RNA에 대한 cDNA를 포함하는 플라스미드를 사용하였다. 이들 플라스미드를 트랜스펙션시키면 신규한 vRNP를 형성하는 중합효소 단백질에 의해 복제되고 전사되는 8개의 바이러스 RNA 모두가 합성된다. 구조 단백질을 합성한 후, RNP는 신규 바이러스 입자 속으로 패키징될 것이다.
플라스미드 pPolI-WSN-PB2, pPolI-WSN-PA, pPolI-WSN-HA, pPolI-WSN-NP, pPolI-WSN-NA, pHW127-M, pHW128-NS (각각 1㎍)와 함께 다른 양의 pHW52-PB1 플라스미드(0, 2, 4㎍)로 293T 세포를 트랜스펙션시켰다. 단백질 발현 플라스미드 pHW21-PB2 (1㎍), pHW23-PA (0.1㎍), pHW25-NP (1㎍), pEWSN-HA (1㎍) 및 pCAGGS-WNA15 (1㎍)을 공동트랜스펙션시켰다. 헤마글루티닌(HA)과 뉴라미니다제(NA)에 대한 발현 플라스미드를 포함시켜 트랜스펙턴트 바이러스의 수율을 증가시켰다.
트랜스펙션시키고 48시간 후, 1차 트랜스펙션된 293T 세포의 상등액을 MDCK 세포로 전달하였다. pHW52-PB1 플라스미드가 첨가된 모든 트랜스펙션 실험에서, 계대배양 24시간 후 바이러스-유도된 세포유해효과를 관찰하였다. PB1-발현 플라스미 드가 트랜스펙션 반응에 포함되지 않으면 세포유해효과가 나타나지 않았다. 바이러스 역가는 MDCK 세포에 트랜스펙션된 세포의 상등액을 적정함으로써 확인하였고; 상등액은 2×104 - 2×105pfu/㎖를 포함하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 발견은 (발현 플라스미드과 함께) PB-pol I/pol II-프로모터 플라스미드를 트랜스펙션시킨 후, PB1 vRNA와 PB1 단백질이 감염성 인플루엔자 A 바이러스를 생성하는데 충분한 수준으로 인간세포주 293T 세포에서 합성되었음을 보여준다. 두개의 플라스미드(pHW82-PB1과 pHW22-PB1) 상에서 분리된 PB1-cDNA를 포함하는 플라스미드를 사용한 공동트랜스펙션 실험에서, 2×104pfu/㎖의 바이러스 역가가 확인되었고; 야생형 PB1서열을 가진 플라스미드(pPolI-WSN-PB1와 pHW22-PB1)를 사용한 유사한 실험에서 바이러스 역가는 3×106pfu/㎖였다.
이전 연구에 사용된 pol II-프로모터를 사용한 발현 구조체(Neumann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96:9345)와 달리, CMV-프로모터와 폴리아데닐레이션 부위 사이에 삽입된 pol I-전사단위에서 유래된 서열을 포함하는 플라스미드 pHW52-PB1을 사용하였다. EGFP 리포터 유전자의 발현은 이 시스템에서 PB1-단백질의 전체 발현이 EGFP-RNP 복합체를 형성하는데 충분하다는 것을 나타낸다. pol I-프로모터/터미네이터 영역은 pol I 특이적 전사 및 종결인자에 대한 인식서열을 포함하고 있지만(Beckmann et al ., Science 1995, 270:1506; Bell et al ., Science 1988, 241:1192; Kuhn et al., EMBO J. 1994, 13:416), 이들 DNA결합 단백질은 pol II-매개 전사를 저해하지 않는 것으로 보인다. 이러한 발견은 pol I-특이적 DNA 결 합 단백질이 세포성 rDNA-전사가 일어나는 구획인 핵에서 가장 풍부하다는 발견과 일치한다(Evers et al ., EMBO J. 1995, 14:1248). 이러한 결과는 pol I/pol II-프로모터 구조체가 세포 속으로 트랜스펙션된 후, 플라스미드의 일부가 pol I-매개 전사가 일어나는 핵으로 운반되고, 일부는 이들이 RNA 중합효소 II에 의해 전사되는 핵 내에 유지된다는 것을 나타낸다.
리포터 구조체 pHW52-PB1은 개시코돈 앞 및 종결코돈 뒤의 비암호화 영역 내에 추가적인 비인플루엔자 바이러스 서열(제한부위)을 포함하고 있기 때문에, 이들 서열이 바이러스 PB1 RNA 단편 내에 안정하게 유지되는지 여부에 관심이 있었다. 따라서, 트랜스펙턴트 바이러스를 MDCK 세포에서 2대 계대배양한 후 vRNA를 분리하고 역전사-PCR 분석을 하였다. PB1-특이적 프라이머를 사용하여 vRNA를 증폭시킨 결과 원하는 크기의 cDNA -단편이 생성되었다. 동일한 바이러스 RNA 및 프라이머를 사용했지만 역전사효소를 첨가하지 않으면, 증폭산물이 얻어지지 않아, 플라스미드 DNA에서가 아니라 바이러스 RNA에서 유래한 cDNA가 트랜스펙션된 세포의 상등액으로부터 옮겨진다는 것을 나타낸다.
PCR-산물의 서열확인 결과 양 제한부위 서열이 RNA 분자 내에 존재하는 것으로 나타났다. 이 결과는 pol I/pol II 전사 시스템이 감염성 재조합 바이러스를 회수할 수 있도록 하고 PB1 유전자의 비암호화 영역 내에 외부 서열을 가진 바이러스가 생존가능하다는 것을 보여준다. 이 변형된 PB1-단편은 여전히 복제되고, 전사되고 바이러스 입자로 패키징된다. 이전에, RNP 트랜스펙션 시스템을 사용함으로써, 인플루엔자 A 바이러스 단편의 비암호화영역이 변화되었다. NA 유전자의 비암호화 영역을 인플루엔자 B 트랜스펙턴트 인플루엔자 바이러스의 NS-단편의 대응서열로 치환함으로써 얻어졌다(Muster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, 88:5177; Bergmann and Muster, J. Gen. Virol. 1995, 76:3211). 키메라 NA를 가진 이 형태의 바이러스는 마우스에서 감약된 표현형을 나타내고 야생형 인플루엔자 바이러스 감염의 감염에 대해 비치사적인 투여량으로 접종된 마우스를 보호하였다. 이 결과는 RNA 단편의 비암화화 영역의 유전적 변형이 트랜스펙턴트 바이러스의 생물학적 특성을 변화시킬 수 있다는 것을 보여준다. 여기서, 비인플루엔자 바이러스 서열도 PB1 단편의 비암호화영역 내로 삽입될 수 있다는 것을 처음으로 보고한다.
pol I/pol II 전사 시스템을 사용하여, 지금은 PB1 단편의 비암호화 영역 내의 이들 서열 요소를 체계적으로 변형시키고 이러한 유전적 조작이 재조합 바이러스의 생물학적 특성을 변화시킬 수 있는지 여부를 평가할 수 있다. 또한, 야생형 바이러스에 비해 돌연변이된 PB1 단편의 바이러스 수율이 낮은 것은 삽입된 서열이 바이러스 성장에 부정적으로 영향을 미친다는 것을 나타낸다.
최근 개발된 플라스미드계 시스템이 인플루엔자 바이러스를 생성하는데 매우 효과적이지만, 14-17 플라스미드를 클로닝하는 것도 포함된다. 이 연구에서, 인플루엔자 A/WSN/33 바이러스 균주의 효율적인 회수에 필요한 플라스미드의 수를 13개까지 낮추었다. 이러한 접근방식에 의해 달성되는 플라스미드 수의 감소는 293T 세포 외의 세포주에 대한 트랜스펙션의 효율을 증가시키고, 따라서 14개 플라스미드의 효율적인 운반이 어려운 세포주에 유전자를 운반할 수 있을 것으로 기대된다. 포도르 등(Fodor et al., J. Virol. 1999, 73:9679)은 12개의 플라스미드를 트랜스 펙션시킨 후 인플루엔자 바이러스를 얻을 수 있었지만, 그 연구에서 바이러스 수율이 106개의 트랜스펙션된 베로(Vero) 세포 당 1-2개의 감염성 바이러스 입자였다.
(실시예 2)
최소 플라스미드계 시스템으로부터 재조합 인플루엔자 A 바이러스의 구성
이 실시예는 클로닝된 cDNA로부터 완전한 인플루엔자 A 바이러스를 얻기 위한 플라스미드계 트랜스펙션 시스템의 사용을 설명한다. 확립된 플라스미드계 시스템과 달리, 인플루엔자 A 바이러스를 생성하기 위한 이 시스템은 각각 바이러스 유전자 단편에 대응하는 다른 바이러스 cDNA의 사본 하나를 포함하는 단지 8개의 발현 플라스미드를 구성하고 트랜스펙션시켰다. 이 역유전학 시스템은 인플루엔자 A 바이러스의 회수에 필요한 플라스미드의 수를 감소시키고 재분류 바이러스의 예측가능하고 효율적인 생성을 할 수 있다.
재료 및 방법
플라스미드의 클로닝 . 플라스미드 pHW2000(도 3a)은 pHW12에서 유래하였다(실시예 1). pHW2000 클로닝 벡터는 두개의 BsmBI 부위에 의해 분리된 쥐의 터미네이터 서열 중 33bp와 인간 pol I 프로모터 중 225bp를 포함한다. pol I 프로모터와 터미네이터 요소는 인간 사이토메갈로바이러스의 절단형 최초기 프로모터(pcDNA3에서 발견되는 바와 같은 전사시작부위의 대략 350bp 상부에서 시작, Invitrogen, Carlsband, California) 및 소 성장호르몬을 암호화하는 유전자의 폴리아데닐레이션 신호 옆에 위치한다. 바이러스 A/WSN/33 (H1N1)의 cDNA를 포함하는 8개의 플라 스미드(pHW181-PB2, pHW182-PB1, pHW183-PA, pHW184-HA, pHW185-NP, pHW186-NA, pHW187-M, 및 pHW188-NS)를 pHW2000의 ApaI-SalI 벡터 단편 속에 플라스미드 pPolI-WSN-PB2, pPolI-WSN-PB1, pPolI-WSN-PA, pPolI-WSN-NP, pPolI-WSN-HA, pPolI-WSN-NA(Neumann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96:9345), pHW127-M, 및 pHW128-NS(실시예 1)의 ApaI-SalI 단편을 삽입하여 구성하였다. A/Teal/HK/W312/97 (H6N1)의 cDNA를 포함하는 8개의 플라스미드(pHW241-PB2, pHW242-PB1, pHW243-PA, pHW244-HA, pHW245-NP, pHW246-NA, pHW247-M 및 pHW248-NS)를 바이러스 RNA의 역전사효소 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 증폭에 의해 구성하였다. PCR 반응에 사용된 프라이머는 그 3' 말단에 단편-특이적 서열과 그 5' 말단에 BsmBI 또는 BsaI 제한부위서열을 포함하였다. BsmBI 또는 BsaI을 사용하여 PCR 산물을 분해한 후, 단편을 벡터 pHW2000(도 3a) 속으로 클로닝하였다. A/Teal/HK/W312/97 (H6N1)의 게놈을 증폭하는데 사용한 프라이머의 서열은 다음과 같다. 프라이머는 왼쪽에서 오른쪽이 5' 및 3' 말단에 대응하도록 표시된다. 인플루엔자 A 특이적 뉴클레오티드는 밑줄로 표시한다.
NS:
Bm-NS#1: TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTG (SEQ ID NO:5)
Bm-NS#2: ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTT (SEQ ID NO:6)
M:
Bm-M#1: TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAG (SEQ ID NO:7)
Bm-M#2: ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTTT (SEQ ID NO:8)
NA:
Bm-NA1-1: TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGTTTAACATG (SEQ ID NO:9)
Bm-NA-1413R: ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTT (SEQ ID NO:10)
HA:
Bm-H6-1: TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGGAAAATG (SEQ ID NO:11)
Bm-NS#2: ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTT (SEQ ID NO:12)
(주: HA와 NS 단편은 비암호화영역의 이 부분에서 동일한 서열을 가진다)
NP:
Ba-NP-1: TATTGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGGTA (SEQ ID NO:13)
Ba-NP1565R: ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTATT (SEQ ID NO:14)
PA:
Bm-PA1-1: TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTACTGATCC (SEQ ID NO:15)
Bm-PA1-2231R: ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTACTTTTT (SEQ ID NO:16)
PB1:
Bm-PB1a-1: TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGCAAACC (SEQ ID NO:17)
Bm-PB1-2341R: ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGCATTT (SEQ ID NO:18)
PB2:
Ba-PB2-1: TATTGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTCAATTATATTC (SEQ ID NO:19)
Ba-PB2-2341R: ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTCGTTTTT (SEQ ID NO:20)
RT-반응은 프라이머 5'-AGCAAAAGCAGG-3'(SEQ ID NO:21)을 사용하여 행하였다. 발현 플라스미드 내 RT-PCR 증폭에서 유래된 바이러스 cDNA가 원치않는 돌연변이를 가지지 않았다는 것을 보증하기 위하여 삽입된 cDNA의 서열을 확인하였다.
바이러스와 세포배양. 인플루엔자 바이러스 A/WSN/33 (H1N1)과 A/Teal/HK/W312/97 (H6N1)을 10일된 계란에서 증식시켰다. MDCK 세포를 10% FBS를 포함하는 MEM 배지에 유지시켰다. 293T 인간 미발달 신장 세포를 5% FBS를 포함하는 Opti-MEM I(Life Technologies, Gaithersburg, Maryland)에서 배양하였다. 트랜스펙션 실험을 위하여, 6조 조직배양 플레이트를 사용하였다. 트랜스펙션시키기 전날, 75㎠ 플라스크 속의 융합하는 293T와 MDCK 세포를 트립신처리하고 각 세포주의 10%를 18㎖ OptiMEM I에 혼합하고; 이 세포현탁액 3㎖를 6조 플레이트 중 한 조 속에 접종하였다. 공동배양된 MDCK와 293T 세포(각조당 0.2 - 1×106 세포)를 트랜스펙션 실험에 사용하였다. TransIT LT-1 (Panvera, Madison, Wisconsin)을 제조자 지시에 따라 세포를 트랜스펙션시키는데 사용하였다. 간단하게 말하면, 1㎍의 DNA 당 2㎕의 TransIT LT-1을 혼합하고, 실온에서 45분 동안 배양하고, 세포에 첨가하였다. 6시간 후, DNA-트랜스펙션 혼합물을 Opti-MEM I로 대체하였다. 트랜스펙션시키고 30시간 후, TPCK-트립신을 포함하는 Opti-MEM I 1㎖를 세포에 첨가하였고; 이 첨가 결과 세포 상등액 중 TPCK-트립신의 최종농도가 0.5㎍/㎖였다. 세포 상등액의 바이러스 역가는 MDCK 세포 상에 상등액을 적정하여 확인하였다.
RNA 분리 및 RT - PCT . 제조자 지시에 따라 사용된 RNeasy-Kit (Qiagen, Valencia, California)를 사용하여 바이러스 입자로부터 바이러스 RNA를 분리하였다. 재조합 인플루엔자 바이러스를 특성화하기 위하여, Access RT-PCR kit(Promega, Madison, Wisconsin)를 제공된 프로토콜에 따라 사용하였다. 하기 프라이머를 RT-PCR 실험에 사용하였다: Bm-NS#1 (5'-TAT TCG TCT CAG GGA GCA AAA GCA GGG TG-3'; SEQ ID NO:5) 및 Bm-NS#2 (5'-ATA TCG TCT CGT ATT AGT AGA AAC AAG GGT GTT TT-3'; SEQ ID NO:12). RT-PCT 실험은 PTC-200 DNA 엔진(MJ Research, Watertown, Massachusetts)을 사용하여 행하였다. 증폭프로그램은 48℃에서 45분 및 94℃에서 2분을 1주기로 시작하였다. 이들 주기 후 94℃에서 20초, 52℃에서 30초, 및 72℃에서 40초 동안 40주기를 행하였고; 72℃에서 5분 동안의 1주기로 프로그램을 종료하였다. PCR 산물을 아가로즈 겔 전기영동으로 분석하고 프라이머 Bm-NS#1을 사용하여 서열확인하였다. 성쥬드 어린이 연구병원의 생물공학센터(The Center for Biotechnology at St. Jude Children's Research Hospital)는 AmpliTaq
Figure 112007042568118-pat00001
DNA 중합효소 FS(Perkin-Elmer, Applied Biosystems, Inc. [PE/ABI], Foster City, CA) 및 합성 올리고뉴클레오티드와 함께 로다민 또는 d로다민 염료-터미네이터 주기 서열확인 준비반응키트를 사용하여 주형 DNA의 서열을 확인하였다. 시료를 전기영동, 검출 및 PE/ABI 모델 373, 모델 373 스트레치 또는 모델 377 DNA 서열확인기에서 분석하였다.
결과
A/ WSN /33( H1N1 )의 생성을 위한 pol I- pol II 시스템의 확립. 인플루엔자 A 바이러스의 게놈이 8개의 단편을 포함하기 때문에, pol I 프로모터와 pol II 프로 모터 사이에 8개의 인플루엔자 A cDNA를 모두 삽입하면 모두 바이러스 RNA인 8개의 vRNA가 전사되고 모두 10개의 바이러스 단백질이 합성되어야 한다(도 1). 모든 바이러스 리보뉴클로오단백질을 구조 단백질과 어셈블리한 후, 감염성 인플루엔자 A 바이러스가 형성되어야 한다(도 2a와 2b).
감염성 인플루엔자 A 바이러스가 이 cDNA-이방향 전사 시스템으로 얻어질 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, A/WSN/33 (H1N1)의 8개의 cDNA를 포함하는 8개의 발현 플라스미드(pHW181-PB2, pHW182-PB1, pHW183-PA, pHW184-HA, pHW185-NP, pHW186-NA, pHW187-M, 및 pHW188-NS)를 구성하였다. 8개의 플라스미드(각 플라스미드 1㎍)(표 1)를 일시적으로 공동배양된 293T-MDCK 세포 속으로 공동트랜스펙션시켰다. 양 세포주를 트랜스펙션시키기 전날 하나의 세포배양 조에서 공동배양하여 인플루엔자 A 바이러스의 높은 DNA 트랜스펙션효율(293T 세포) 및 높은 복제효율(MDCK 세포)을 위한 조건을 확실하게 하였다. 48시간 및 72시간 후, MDCK 세포는 바이러스 유도된 세포유해효과를 나타냈지만, PB1-발현 구조체없이 7개의 플라스미드를 트랜스펙션시킨 후에는 세포유해효과가 관찰되지 않았다(표 1). 상등액의 바이러스 역가를 MDCK 세포 내에서의 적정에 의해 트랜스펙션 후 다른 시간에 확인하였다. 트랜스펙션 24시간 후, 세포 상등액은 1㎖ 당 1×103 바이러스를 포함하였고; 1㎖ 당 감염 72시간 후에 2×107 감염성 바이러스가 생성되었다(표 1). 회수된 바이러스는 MDCK 세포 상에서 2회 계대배양하였다. 생성된 바이러스가 디자인된 A/WSN 바이러스라는 것을 확인하기 위하여, RT-PCR에 의해 NS 유전자에 대한 cDNA를 생산하였 다(도 4a, 레인 8). 제한 엔도뉴클레아제 NcoI (도 4b, 레인 8)을 사용하여 분해한 후 2개의 단편을 생성하고 증폭된 단편의 서열분석을 하여 회수된 바이러스가 디자인된 A/WSN 바이러스라는 것을 확인하였다. 이러한 발견은 8개의 주형으로부터 vRNA와 mRNA를 pol I 및 pol II-구동 합성하면 감염성 인플루엔자 A 바이러스가 생성된다는 것을 보여준다.
[표 1]
A/WSN/33(H1N1) 및 A/Teal/HK/W312/97(H6N1) 바이러스의 회수에 사용된 플라스미드 세트
단편 A/WSN/33 (N1N1) A/Teal/HK/W312/97 (H6N1)
1 pHW181-PB2 pHW181-PB2 pHW241-PB2 pHW241-PB2
2 --- pHW181-PB1 --- pHW241-PB1
3 pHW183-PA pHW183-PA pHW243-PA pHW243-PA
4 pHW184-HA pHW184-HA pHW244-HA pHW244-HA
5 pHW185-NP pHW185-NP pHW245-NP pHW245-NP
6 pHW186-NA pHW186-NA pHW246-NA pHW246-NA
7 pHW187-M pHW187-M pHW247-M pHW247-M
8 pHW188-NS pHW188-NS pHW248-NS pHW248-NS
바이러스 역가§
t=24h 0 1×103 0 0
t=48h 0 2×106* 0 2×103
t=72h 0 2×107* 0 2×105*
§수는 트랜스펙션 24h, 48h 및 72h 후 확인된 트랜스펙션된 세포 상등액의 ㎖당 감염성 바이러스 입자를 나타낸다. * 배양된 MDCK 세포 중의 세포유해효과를 관찰하였다.
8개의 플라스미드를 공동트랜스펙션시켜 A/ Teal / HK / W312 /97 ( H6N1 )을 회수. 1918년부터 인간 인플루엔자 유행성 균주에서 원래 유래된 인플루엔자 A/WSN/33 (H1N1)(Goto and Kawaoka, Proc. Acad. Sci. USA 1998, 95:10224; Reid et al., Proc. Acad. Sci. USA 1999, 96:1651)을 마우스 뇌에서 계대배양하고 세포배양액에 서 잘 증식되도록 하였다. 이전에는 세포 배양액에서 잘 성장하지 않는 클로닝된 cDNA로부터 바이러스를 생성하는 8-플라스미드 시스템의 효율을 평가하기 위하여, 바이러스 A/Teal/HK/W312/97 (H6N1)의 생성을 클로닝된 cDNA 만으로 시도하였다. 이 H6N1은 1997년 홍콩에서 H5N1가 창궐한 동안 사망한 쇠오리에서 분리하였다. 이 바이러스의 유전분석결과 병원성 H5N1 바이러스 균주와 97% 이상의 뉴클레오티드 상동성을 가진 7개의 단편을 가진다는 것이 밝혀졌다. 감염된 요막유체로부터 RNA를 추출하고, RT-PCR-증폭 cDNA를 pHW2000 속으로 삽입하였다; 이 삽입결과, 8개의 발현 플라스미드가 얻어졌다(도 3a 내지 3d). 공동배양된 293T-MDCK 세포 속으로 pHW241-PB2, pHW242-PB1, pHW243-PA, pHW244-HA, pHW245-NP, pHW246-NA, pHW247-M 및 pHW248-NS (각각 1㎍)를 트랜스펙션시키고 72시간 후, 바이러스-유도 세포유해효과를 MDCK 세포에서 관찰하였다(표 1). 바이러스 수율은 트래스펙션된 세포의 상등액 1㎖ 당 2×105 감염성 바이러스였다. 도 4a와 4b(레인 2)에 도시된 바와 같이, 회수된 바이러스의 동일성은 NS 단편의 특성화에 의해 확인하였다. 이 결과는 이 플라스미드 시스템이 하나의 플라스미드 벡터 속으로 8개의 cDNA만 클로닝하는 것을 필요로 하고 8개 발현 플라스미드를 트랜스펙션시켜 이전에는 포유동물 세포에서 성장하지 않던 바이러스의 항원성을 가진 인플루엔자 A 바이러스를 회수할 수 있게 되었음을 나타낸다.
재분류 인플루엔자 A 바이러스의 회수. 재분류 바이러스를 생성하기 위하여 8-플라스미드 시스템의 유용성을 시험하였다. 이 DNA 트랜스펙션 시스템이 어떤 선 택 시스템을 필요로 하지 않기 때문에, 재분류 바이러스의 회수는 트랜스펙션 반응 내에서 발현 플라스미드를 적절히 조합하여 달성할 수 있어야 한다. A/Teal/HK/W312/97 (H6N1)의 cDNA를 포함하는 7개의 발현 플라스미드를 A/WSN/33 (H1N1)의 cDNA를 포함하는 하나의 발현 플라스미드와 공동트랜스펙션시켰다(표 2). WSN 바이러스의 M 단편 또는 NS 단편 및 상기 쇠오리 바이러스의 7개 단편을 포함하는 재분류 바이러스에 대해 높은 바이러스 수율이 얻어졌다. NA 및 HA-재분류 바이러스에 대해 낮은 바이러스 수율이 얻어졌다(표 2). 단일 재분류 바이러스가 8-플라스미드 시스템으로부터 얻어졌기 때문에, 다음 단계는 바이러스가 하나의 바이러스에서 유래한 다중 단편을 가지도록 회수될 수 있는지 여부를 확인하는 것이었다. 따라서, H6N1 바이러스의 RNP-복합체 유전자의 cDNA를 포함하는 4개의 발현 플라스미드(pHW241-PB2, pHW242-PB1, pHW243-PA, 및 pHW245-NP)를 WSN 바이러스의 cDNA를 포함하는 플라스미드 pHW184-HA, pHW186-NA, pHW187-M, 및 pHW188-NS와 함께 트랜스펙션시켰다(표 2). 세포상등액 1㎖당 4×106 바이러스가 회수되었다. 도 4a와 4b에 도시된 바와 같이(레인 10), 4중 재분류 바이러스의 증폭된 NS 단편을 NcoI으로 분해하였고; 따라서 NS 단편은 WSN 바이러스에서 유래된다. 이 결과는 8-플라스미드 트랜스펙션 시스템이 단일 및 4중 재분류 바이러스를 회수할 수 있다는 것을 보여준다.
[표 2]
8개의 플라스미드를 공동트랜스펙션시킴으로써 A/Teal/HK/W312(H6N1)와 A/WSN/33 (H1N1) 사이의 재분류 인플루엔자 A 바이러스의 생성
단편* HA NA M NS HA-NA-M-NS
1 pHW241-PB2 pHW241-PB2 pHW241-PB2 pHW241-PB2 pHW241-PB2
2 pHW242-PB1 pHW242-PB1 pHW242-PB1 pHW242-PB1 pHW242-PB1
3 pHW243-PA pHW243-PA pHW243-PA pHW243-PA pHW243-PA
4 pHW245-NP pHW245-NP pHW245-NP pHW245-NP pHW245-NP
5 pHW184 - HA pHW244-HA pHW244-HA pHW244-HA pHW184 - HA
6 pHW246-NA pHW186 - NA pHW246-NA pHW246-NA pHW186 - NA
7 pHW247-M pHW247-M pHW187 -M pHW247-M pHW187 -M
8 pHW248-NS pHW248-NS pHW248-NS pHW188 - NS pHW188 - NS
바이러스역가§ 2×102 2×103 2×105 2×107 4×106
* A/WSN/33 (H1N1)의 Cdna를 포함하는 플라스미드를 굵게 표시한다. §수는 트랜스펙션 72h 후 확인된 트랜스펙션된 세포 상등액의 ㎖당 감염성 바이러스 입자를 나타낸다.
토의
A/Teal/HK/W312(H6N1) 또는 A/WSN/33 (H1N1)의 cDNA를 포함하는 8개의발현 플라스미드를 트랜스펙션시킨 후 인플루엔자 A 바이러스를 회수하는 능력은 pol I-pol II 전사 시스템이 감염성 인플루엔자 A 바이러스를 형성하기에 충분한 양의 vRNA와 바이러스 단백질을 제공한다는 것을 입증한다. 비암호화 영역이 다른 2가지 형태의 mRNA가 합성된다(도 1). 모든 바이러스 단백질을 암호화하는 mRNA 형태는 pol II에 의해 직접 전사된다. 비암호화영역(NCR)의 인플루엔자 바이러스 서열 외에도, 이들 mRNA는 pol I 프로모터와 쥐의 터미네이터 영역으로부터의 서열을 포함한다. 중요한 것은, 개발된 pol I-pol II 발현 시스템이 쥐의 터미네이터 서열 중 33bp만을 포함한다는 것이다. 리포터 유전자 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT)와 녹색 형광 단백질(GFP)을 이용한 이전 연구는 174bp 터미네이터 영역에 서의 서열이 단백질의 pol II-매개 발현을 감소시킨다는 것을 보여주었다(Hoffmann, E., Ph.D. Thesis 1997, Justus Liebig University, Giessen, Germany). 두번째 mRNA 형태는 바이러스 복제 및 전사 과정이 개시된 후 생성된다(도 2). 이 mRNA는 바이러스 중합효소 단백질에 의해 합성되고, 인플루엔자 바이러스 비암호화 서열 전 캡 확보에 의해 세포성 RNA에서 유래된 5 캡 구조를 포함한다. 양 mRNA로부터 번역된 구조 단백질은 RNP 복합체와 결합하여 새로운 바이러스 입자를 형성한다. 트랜스펙턴트 바이러스가 출아한 후, 생성된 바이러스 입자를 293T 세포 내에서 및 공동배양된 MDCK 세포 내에서 복제할 수 있다.
상기 본 발명의 배경에서 설명된 접근방식들과 달리, 본 발명의 방법은 pol I 프로모터 서열 중 225bp와 터미네이터 서열 중 33bp를 포함하는 8개의 플라스미드 중의 8개의 cDNA를 사용한다. pol I-pol II 시스템에서, 모든 10개의 바이러스 단백질이 인간 사이토메갈로바이러스의 절단형 최초기 프로모터로부터 발현된다. 17-플라스미드 시스템(Neumann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96:9345) 및 8-플라스미드 시스템(본 연구)을 사용한 모든 구조 단백질의 발현이 RNP 복합체 단백질을 발현하는 플라스미드를 공동트랜스펙션시키는 것보다 바이러스 회수 효율이 더 높다는 사실(상기 Neumann et al., Fodor et al., J. Virol. 1999, 73:9679)은 감염성 인플루엔자 A 바이러스의 생성이 트랜스펙션 후 조기에 HA, NA, M1, M2, 및 NS2 단백질을 제공함으로써 증진된다는 생각을 지지한다.
바이러스 복제 주기에는 바이러스 단백질 상호간 및 다른 세포성 인자들과의 복잡한 상호작용이 포함된다(Ludwig et al., Virol. Immunol. 1999, 12:175). 따 라서, 감염성 바이러스를 생성하기 위하여, 바이러스 분자의 플라스미드-구동 합성은 복제주기의 개시와 바이러스유사 입자의 형성을 위한 최정 농도의 바이러스 단백질을 제공하여야 한다. 8-플라스미드 시스템이 효과적인 것으로 입증되었지만, 바이러스의 생산을 더 증가시킬 수도 있을 것이다. RNP 복합체 단백질을 발현하는 트랜스펙션된 플라스미드와 M1 단백질의 발현의 비율은 전사효소활성에 영향을 미치는 것으로 나타났다(Pleschka et al., J. Virol. 1996, 70:4188; Perez and Donis, Virology 1998, 249:52). 또한 바이러스유사 입자의 형성효율은 구조 바이러스 단백질의 농도에 따라 결정된다(Mena et al ., J. Virol. 1996, 70:5016; Gomez-Puertas et al., J. Gen. Virol., 1999, 80:1635; Neumann et al ., J. Virol. 2000, 74:547). 따라서 pol I-pol II 시스템을 사용한 감염성 바이러스 생성효율은 트랜스펙션 반응에 사용되는 플라스미드 농도를 변화시키거나 다른 pol II 프로모터를 가진 발현 플라스미드를 사용함으로써 더 증가될 수 있다. 세포성 인자에 의해 매개된 스플라이싱 효율은 인플루엔자 A 바이러스가 복제하는 능력에 영향을 미치기 때문에(Lau and Scholtissek, Virology 1995, 212:225), 293T 세포 외의 다른 세포를 사용하여 어떤 인플루엔자 A 균주에 대한 바이러스 효율을 증가시킬 수 있다. 4중 재분류의 높은 바이러스수율(표 2)은 배양된 세포 중의 A/WSN/33(H1N1)의 신속한 복제가 HA, NA 및 M 단편에 의해 매개된다는 발견과 일치한다(Goto and Kawaoka, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95:10224; Schulman and Palese, J. Virol. 1977, 24:170; Yesuda et al ., J.Virol. 1994, 68:8141).
조류 H6N1 바이러스와 인간 H1N1 바이러스 간의 생존가능한 재분류체를 생성 하는 것(표 2)은 이 H6N1 바이러스가 멀리 관련된 바이러스로부터 유전자 단편을 얻을 수 있다는 것을 나타낸다. 유전분석은 병원성 H5N1 바이러스가 재분류에 의해 생성된다는 것을 제시한다(Xu et al ., Virology 1999, 261:15). H5N1유사 유전자 단편은 H6N1과 H9N2 서브타입에서 발견되고(Guan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96:9363), 이 발견은 이들 바이러스가 병원성 H5N1 바이러스의 전구체일 수 있다는 것을 나타낸다. 새로운 병원성 인플루엔자 바이러스를 만들 수 있는 재분류는 미래에 발생할 가능성이 있다. 그러나, 본 연구에서 개발된 단순화된 방법으로 이들 바이러스를 생성하고 조작할 수 있는 능력은 연구자들이 이들 신규 바이러스의 생물학적 특성을 더 잘 이해하고 이들로부터 집단을 보호하기 위한 효율적인 백신을 개발하는 것을 도울 것이다. 신규 병원성 균주와 백신의 제조 사이의 시간 길이는 백신접종 프로그램의 효과에서 중요한 변수이다. 단지 8개의 바이러스만들 클로닝함으로써 바이러스를 생성할 수 있는 능력은 잠재적인 백신 후보의 생성에 필요한 시간을 줄이고 바이러스 생성을 단순화시키고 백신의 총 생산비용을 줄임으로써 현재의 역유전학 시스템을 개선한다.
pol I 프로모터와 pol II 프로모터 사이의 바이러스 cDNA를 바이러스를 회수하기 위하여 진핵세포 속으로 도입한다는 개념은 오르소마이소비리대과의 다른 구성원을 생성하는데도 적용할 수 있다. 인플루엔자 B 바이러스에 대해, 이 방법은 8개 플라스미드를 구성하고 공동트랜스펙션시키는 것을 필요로 할 것이고; 인플루엔자 C 에 대해서는 7개; 및 토고토바이러스에 대해서는 6개를 필요로 할 것이다. 동일한 cDNA 주형으로부터의 vRNA 뿐 아니라 5'-캡 mRNA의 생체 내 전사도 다른 RNA 바이러스를 위한 플라스미드계 시스템을 단순화시키고 다른 과(예를 들면, 아레나비리대, 분야비리대)의 바이러스를 위한 pol I-pol II 시스템의 확립을 촉진시킬 수 있다.
(실시예 3)
클로닝된 cDNA 로부터 완전한 인플루엔자 B 바이러스를 생성하기 위한 RNA pol I/pol II 시스템
인플루엔자 A와 B 바이러스는 각각 음성 극성을 가진 단일가닥 RNA 의 8개 단편을 포함한다(Lamb and Krug. "Orthomyxoviridae: The viruses and their replication"; in Fields (Ed.), Virology; p1353-1395). 인플루엔자 A와 달리, 인플루엔자 B의 8개의 단편은 11개의 단백질을 암호화한다. 3개의 가장 큰 유전자는 RNA 중합효소, PB1, PB2 및 PA를 암호화하고; 단편 4는 헤마글루티닌을 암호화한다. 단편 5는 바이러스 RNA와 결합된 주요 구조 성분인 뉴클레오단백질을 암호화하고, 단편 6은 뉴라미니다제(NA)와 NB 단백질을 암호화한다. 양 단백질 NB와 NA는 바이시스토닉 mRNA의 중첩 리딩 프레임으로부터 번역된다. 인플루엔자 B의 단편 7은 또한 2개의 단백질을 암호화한다: BM1과 BM2. 가장 작은 단편은 2개의 단편을 암호화한다: NS1은 전장 RNA로부터 번역되고, NS2는 스플라이싱된 mRNA로부터 번역된다.
인플루엔자 B의 cDNA를 포함하는 발현플라스미드를 구성하는데는 인플루엔자 A 바이러스 A/teal/HK/W312/97 (H6N1)을 생성하기 위해 설명한 바와 같은 방법이 포함된다. 제1 RNA는 감염된 요막유체로부터 얻어진 바이러스입자, 즉 B/Lee/40에 서 분리한다. 비암호화영역의 보존성 서열에 기초하여, RT-PCR용 프라이머를 제조하여 cDNA를 합성하는데 사용한다. 5'-말단에서, 이들 프라이머는 제한 엔도뉴클레아제 BsmBI 또는 BsaI에 대한 서열을 포함한다. BsmBI 또는 BsaI을 사용하여 PCR 산물을 분해하면 BsmBI로 선형화된 클로닝벡터 pHW2000(또는 pHW11) 속으로 삽입할 수 있게 된다. 플라스미드 내의 cDNA가 PCR을 하는 동안 중합효소에 의한 오류때문에 원하지 않는 돌연변이를 가지지 않는다는 것을 확인하기 위하여, 구조체의 서열확인을 해야한다.
공동배양된 293T-MDCK 세포(또는 COS-1-MDCK 세포)를 공동트랜스펙션시키고 트립신을 첨가하면 감염성 인플루엔자 B 바이러스가 생성된다. 그 다음에 트랜스펙션된 세포의 상등액을 새로운 MDCK 세포 위에서 계대배양한다. 생성된 바이러스 역가는 HA 분석 및 플라크 분석과 같은 표준방법으로 확인할 수 있다. 각 유전자 단편에 대한 특이적 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 행하면 재조합 인플루엔자 B 바이러스로부터 RNA를 증폭시킬 수 있다. 생성물의 서열을 확인하여 생성된 바이러스가 원하는 인플루엔자 B 바이러스라는 것을 확인한다.
(실시예 4)
마스터 균주 인플루엔자 A 바이러스용 8-플라스미드 회수 시스템
백신의 생산을 위한 이 플라스미드계 시스템의 상업적 유용성을 확인하기 위하여, 실시예 2에서 설명한 바와 같은 클로닝된 cDNA로부터 완전한, 현재 불활성화된 백신의 생산에 사용되는, 마스터균주 A/PR/8/34 (H1N1)를 생성하였다. 재조합 바이러스를 계란에서 배양한 후 HA 분석에 의해 확인한 바이러스 수율은 어버이 야 생형 바이러스의 바이러스 수율만큼 높았다. 이 결과는 생성된 재조합 바이러스가 어버이 계란 성장 바이러스와 동일한 성장특성을 나타내고 8-플라스미드 트랜스펙션 방법이 백신 바이러스를 생산하는데 현재 사용되는 방법을 개선할 가능성이 있다는 것을 입증한다.
재료 및 방법
바이러스와 트랜스펙션 . 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34 (H1N1)를 성쥬드 어린이 연구병원의 기탁소에서 얻어 10일 된 미발달 계란에서 증식시켰다. MDCK 세포를 10% FBS를 포함하는 MEM에 유지시켰다. 293T 인간 미발달 신장세포와 베로세포를 5% 우태아혈청(FBS)를 포함하는 Opti-MEM I(Life Technologies, Gaithersburg, MD)에서 배양하였다. 트랜스펙션실험을 위하여, 6조 조직배양 플레이트를 사용하였다. 공동배양된 MDCK와 293T 세포(조당 0.21×106개의 각 세포)를 트랜스펙션실험에 사용하였다. TransIT LT-1(Panvera, Madison, WI)를 제조자 지시에 따라 세포를 트랜스펙션시키는데 사용하였다. 간단하게 말하면, 1㎍의 DNA 당 2㎕의 TransIT LT-1을 혼합하고, 실온에서 45분 동안 배양하고, 세포에 첨가하였다. 6시간 후, DNA-트랜스펙션 혼합물을 Opti-MEM I로 대체하였다. 트랜스펙션시키고 24시간 후, TPCK-트립신을 포함하는Opti-MEM I 1㎖를 세포에 첨가하였다; 이 첨가의 결과 세포 상등액에서 TPCK-트립신의 최종농도는 0.5㎍/㎖였다. 바이러스 역가는 플라크 분석에 의해 MDCK 세포에서 세포 상등액을 계대배양하여 확인하였다.
RT - PCR 과 플라스미드의 구성. 바이러스 RNA를 Qiagen Rneasy Kit를 사용하여 미발달 계란의 요막유체를 포함하는 바이러스 200㎕로부터 추출하였다. 각 바이러스 유전자 단편을 증폭시키는데 2단계 RT-PCR을 사용하였다. 간단하게 말하면, RNA를 제공된 프로토콜에 따라 AMV 역전사효소(Roche Diagnostics, Germany)를 사용하여 cDNA로 전사한 후 cDNA를 Expand High Fidelity PCR 시스템(Roche Diagnostics, Germany)을 사용하여 증폭시켰다. 증폭프로그램은 94℃에서 2분의 1주기로 시작하여, 94℃에서 20초, 54℃에서 30초, 72℃에서 3분을 30주기 행하고, 72℃에서 5분의 1주기로 프로그램을 종료하였다. 사요된 프라이머는 BsaI 또는 BsmBI에 대한 서열 중 하나를 포함하여 분해된 PCR-단편이 클로닝벡터 pHW2000 속으로 정확하게 삽입되도록 한다(실시예 2 참조).
HA , NP , NA , M, NS 유전자를 클로닝하기 위하여, PCR-단편을 BsmBI 또는 BsaI로 분해하고 클로닝 벡터 pHW2000 속에 연결하였다. P-유전자를 클로닝하기위하여, 2개(PB2 , PA) 또는 3개(PB1) 단편을 분리하고, 분해하고, pHW2000-BsmBI 속에 연결하였다. 유전자가 원하지 않는 돌연변이를 일으키지 않았다는 것을 보증하기 위하여, PCR-유래 단편의 서열을 확인하였다. A/PR/8/34 (H1N1)의 전장 cDNA를 포함하는 8개의 플라스미드를 pHW191-PB2, pHW192-PB1, pHW193-PA, pHW194-HA, pHW195-NP, pHW196-NA, pHW197-M 및 pHW198-NS로 명명하였다. 성쥬드 어린이 연구병원의 생물공학센터는 AmpliTaq
Figure 112007042568118-pat00002
DNA 중합효소 FS(Perkin-Elmer, Applied Biosytems, Inc. [PE/ABI], Foster City, CA)와 함께 로다민 또는 d로다민 염료-터미네이터 주기 서열확인 준비반응키트를 사용하여 주형 DNA의 서열을 확인하였다. 시료를 전기영동, 검출 및 PE/ABI 모델 373, 모델 373 스트레치 또는 모델 377 DNA 서열확인기에서 분석하였다.
결과
바이러스유사 vRNA와 mRNA를 세포내 합성하기 위하여, RNA pol I-pol II 발현 시스템을 확립하였다(실시예 2 참조). 이 시스템에서 바이러스 cDNA는 RNA 중합효소 I(pol I) 프로모터와 터미네이터 서열 사이에 삽입된다. 이 완전한 pol I 전사단위는 RNA 중합효소 II(pol II) 프로모터와 폴리(A) 부위 옆에 위치한다. 두 전사단위의 배향은 하나의 바이러스 cDNA 주형으로부터 음성-센스 바이러스 RNA와 양성-센스 mRNA를 합성할 수 있도록 한다. 이 pol I-pol II 시스템은 아마 핵의 다른 구획에서, 2개의 세포성 RNA 중합효소가 이들 자신의 프로모터로부터 전사를 개시하기 시작한다(도 1 참조). 8개의 플라스미드를 293T 세포 속으로 트랜스펙션시키면 세포성 및 바이러스 전사 및 번역 기구로부터 유래된 모든 분자들이 상호작용하여 궁극적으로 감염성 인플루엔자 A 바이러스가 생성된다. 이 시스템은 인플루엔자 바이러스 A/WSN/33 (H1N1) 및 A/Teal/HK/W312/97 (H6N1)을 형성하는데 매우 효과적인 것으로 입증되었다(실시예 2).
불활성화된 인플루엔자 백신을 생산하기 위한 현재 마스터 균주가 A/PR/8/34 (H1N1)이기 때문에, 클로닝된 cDNA로부터 이 바이러스를 완전히 생성하고자 시도하였다. 8개의 RNA-단편을 나타내는 cDNA를 벡터 pHW2000에 삽입하였다. 생성된 플라스미드(pHW191-PB2, pHW192-PB1, pHW193-PA, pHW194-HA, pHW195-NP, pHW196-NA, pHW197-M 및 pHW198-NS)를 공동배양된 293T-MDCK 또는 베로-MDCK 세포 속으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션시키고 72시간 후, MDCK 세포 내에서 적정하여 바이러스 역가를 확인하였다. 공도배양된 베로-MDCK 세포의 상등액은 ㎖당 1×104 pfu를 포함하였고, 공동배양된 293T-MDCK 세포의 상등액은 2×106 pfu를 포함하였다. 293T-MDCK 세포에서의 수율이 더 높은 것은 베로세포에 비해 293T 세포의 트랜스펙션효율이 더 높기 때문인 것 같다. 이 결과는 8-플라스미드 시스템이 클로닝된 cDNA로부터 A/PR/8/34 (H1N1)을 생성할 수 있다는 것을 보여준다.
야생형 바이러스와 생성된 재조합 바이러스의 성장을 비교하기 위하여, 미발달 계란에 야생형 바이러스 또는 재조합 바이러스를 접종하였다. 감염시키고 48시간 후 요막유체를 모았다. HA-분석에 의해 바이러스 수율을 확인하였다. HA-역가가 개별적인 계란마다 달랐지만, 양 바이러스가 5120 내지 10240 헤마글루티네이션 단위 사이의 HA-역가를 가져 양 바이러스가 고수율 분리물이라는 것을 나타내는 것을 확인하였다. 따라서, DNA 트랜스펙션에 의해 생성된 재조합 바이러스는 어버이 분리물만큼 강한 배양 표현형을 가진다.
토의
본 발명의 8-플라스미드 시스템은 단백질 발현을 위한 별도의 플라스미드를 사용할 필요가 없고(발명의 배경 참조), 따라서 클로닝된 cDNA로부터 완전한 인플루엔자 A 바이러스를 생성하는 방법을 단순화한다. 백신의 생산에는 계란 중에서 또는 세포배양액 중에서 백신바이러스를 생산하기 위한 바이러스 시드로 사용되는 바이러스를 생성하는 것이 포함된다. 백신접종 프로그램의 효능은 백신접종된 집단에서의 높은 특정 항체 역가를 자극하기에 가까운 순환성 병원성 균주에 일치하는 서브타입을 선택하여 효과적인 보호를 하는 것에 달려있다. 내부 인플루엔자 A 마이러스를 암호화하는 6개의 A/PR/8/34 마스터 플라스미드(pHW191-PB2, pHW192-PB1, pHW193-PA, pHW194-HA, pHW195-NP, pHW196-NA, pHW197-M 및 pHW198-NS)를 현재 순환하는 균주의 당단백질 HA와 NA를 암호화하는 플라스미드와 공동트랜스펙션시키는데 사용할 수 있다. 각 유전자 단편을 조작할 수 있는 능력은 어느 유전자 단편이 세포배양액 뿐 아니라 계란에서 재분류 바이러스가 고수율 성장을 하는데 중요한지를 평가할 수 있게 할 것이다.
단지 8개의 플라스미드를 공동트랜스펙션시킴으로써 2개의 실험용 인플루엔자 바이러스 균주(A/WSN/33 (H1N1) 및 A/PR/8/34 (H1N1))와 한분야 분리물(A/Teal/HK/W312/97 (H6N1))을 생성할 수 있다는 사실은 이 시스템을 살아있는 감약된 인플루엔자 백신의 개발에 적용할 수 있다는 것을 제시한다. 비강 내 투여된 살아있는 감약된 인플루엔자 바이러스 백신은 국부적, 점액성, 세포매개 및 체액성 면역성을 유도한다. 살아있는 감약된 인플루엔자 A/Ann Arbor/6/60(H2N2)의 6개의 내부유전자와 동시기의 야생형 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(HA)과 뉴라미니다제(NA)를 포함하는 냉적응(ca) 재분류(CR) 바이러스는 신뢰성있게 감약된 것으로 보인다. 이 백신은 어린이 및 10대 후반의 청소년에서 효과적인 것으로 나타났다(Keitel & Piedra In Textbook of Influenza, Nicholson et al ., eds. 1998, 373-390). 그러나, 너무 감약되어 인플루엔자 감염의 결과로 매년 미국 내에서 사망하는 20,000 내지 40,000명의 주된 그룹인 노인층에서 이상적인 면역반응을 자극할 수 없을 수도 있다. 감약된 표현형의 각 단편의 기여는 아직 완전히 확인되지 않고 있다(상기 Keitel & Piedra). 이 정보는 특이적, 한정된 감약 돌연변이를 바이러스에 연속적으로 도입함으로써만 얻어질 수 있다. 상세한 분석을 위해서는 많은 수의 조작된 바이러스가 필요하기 때문에, 오직 8개의 플라스미드를 구성하여 트랜스펙션시키는 것은 이 작업을 단순화하고 이 목적을 달성하기 위한 시간과 비용을 줄인다.
(실시예 5)
8개 플라스미드로부터 인플루엔자 A 바이러스를 생성하기 위한 일방향 RNA 중합효소 I-중합효소 II 전사시스템
이전 실시예들은 이로부터 음성-센스 vRNA와 양성-센스 mRNA가 발현되는 단지 8개의 플라스미드를 공동트랜스펙션시킴으로써 인플루엔자 A 바이러스를 생성하는 시스템을 설명한다(이 작업은 연속적으로 발표되었다; Hoffmann et al., 2000, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 97, 6108-6113 참조). 본 실시예는 바이러스유사 RNA의 발현을 위한 다른 전사시스템을 확립하여, 하나의 주형으로부터 캡이 없는 양성-센스 cRNA와 5'-캡 mRNA를 세포내 합성할 수 있도록 하는 것을 설명한다. A/WSN/33 (H1N1)의 cDNA를 포함하는 8개의 A/WSN/33 (H1N1) pol I-pol II 일렬 프로모터 플라스미드를 공동트랜스펙션시키면 이방향 시스템보다 바이러스 수율이 낮기는 하지만 감염성 인플루엔자 A 바이러스가 생성된다. 최소 세트의 플라스미드로부터 세포 내에서 vRNA와 mRNA 또는 cRNA와 mRNA 중 어느 것을 생산하는 우리의 접근방법은 다른 RNA 바이러스의 역유전학 시스템의 확립 또는 최적화에 유용하다.
본 실시예에서 보고된 결과는 발표되었다(Hoffmann and Webster, J. Gen. Virol. 2000, 81:2843 참조).
음성-센스 RNA 바이러스를 생성하기 위하여, 음성-센스 vRNA나 양성-센스 cRNA 중 하나를 주형으로 사용할 수 있다. 바이러스의 회수에 필요한 플라스미드의 수를 줄이기 위하여, 우리는 세포성 RNA pol I 및 pol II가 하나의 주형으로부터 cRNA와 mRNA를 합성할 수 있다고 생각했다. 따라서, 우리는 일방향 pol I-pol II 전사 시스템을 개발하고자 하였다(도 5). 바이러스 cRNA는 RNA pol I 프로모터와 터미네이터 서열 사이에 양성-센스 배향으로 삽입된다. 이 전체 pol I 전사 단위는 RNA pol II 프로모터와 폴리아데닐레이션 부위 사이에 양성-센스 배향으로 삽입된다(도 5). 이와 달리, 음성-센스 vRNA와 양성-센스 mRNA가 우리의 이방향 전사 시스템에서 생성되었고(도 1), 두가지 형태의 양성-센스 RNA가 합성될 것으로 기대되었다. pol II 프로모터로부터, 5'-캡 구조를 가진 mRNA는 핵질에서 전사되어야만 한다. 이 전사체는 단백질로 번역되어야 한다. 핵에서, 세포성 pol I은 5' 말단에 트리포스페이트 그룹을 가진 전장, 양성-센스 인플루엔자 바이러스 cRNA를 합성하는 것으로 기재된다(도 5). 인공 cDNA 단편을 삽입하는데 사용될 수 있는 클로닝 벡터 pHW11을 구성하였다(도 6). 이 플라스미드는 pol I 터미네이터 서열과 폴리(A) 서열의 상부에 있는 인간 pol I 프로모터와 pol II 프로모터(인간 사이토메갈로바이러스의 최초기 프로모터)를 포함한다.
감염성 인플루엔자 A 바이러스가 단일 주형으로부터 cRNA와 mRNA를 합성함으로써 생성될 수 있는지 여부를 시험하기 위하여, 8개의 플라스미드를 구성하였다. 플라스미드 pHW171-PB2, pHW172-PB1, pHW173-PA, pHW174-HA, pHW175-NP, pHW176-NA, pHW177-M 및 pHW178-NS는 인플루엔자 A 균주 A/WSN/33 (H1N1)의 8개의 유전자 단편을 나타내는 cDNA를 포함한다. 이들 cDNA는 모두 pol I과 pol II 프로모터에 대해 양성-센스 배향으로 있다. 8개의 플라스미드(각 플라스미드 1㎍)를 실시예 2에서 설명한 바와 같이 MDCK 세포와 공동배양하거나 하지 않은 293T 또는 COS-1 세포에 트랜스펙션시켰다.
다른 시간에 트랜스펙션된 세포의 상등액에서의 바이러스 수율을 MDCK 세포 상의 계대배양 후 플라크분석하여 확인하였다. 트랜스펙션시키고 48시간 후, 2 - 5×103 감염성 비리온이 생산되었다(표 3). 트랜스펙션시키고 72시간 후, 상등액은 293T 트랜스펙션 후 4×104 pfu/㎖ 또는 COS-1 세포 트랜스펙션 후 2×104 pfu/㎖를 포함하였다. 72시간 후 바이러스 수율은 293T 또는 COS-1 세포를 MDCK 세포와 공동배양함으로써 증가될 수 있었다(표 3).
바이러스의 생성은 8개의 플라스미드를 트랜스펙션시킨 후, RNA pol I 은 8개의 캡이 없는, 양성-센스 cRNA를 합성하였다는 것을 입증한다. 세포성 RNA pol II-합성된 전사체로부터 번역된 4개의 바이러스 중합효소 단백질은 바이러스유사 노출 cRNA와 결합하여 cRNP를 형성한다. 중합효소 서브유닛 PB1은 종결구조를 인식하고 바이러스유사 cRNA가 결합하는데 중요하다(Gonzalez & Ortin, EMBO J. 1999, 18:3767; Gonzalez & Ortin, J. Virol. 1999, 73:631; 및 Li et al., EMBO J. 1998, 17:5844). 다른 중합효소 단백질과 상호작용하여 복제-전사 주기를 시작하 여, vRNP와 바이러스 mRNA를 합성하였다(Toyoda et al., J. Gen. Virol. 1996, 77:2149; Gonzalez et al., Nucl. Acids Res. 1996, 29:4456). pol I-pol II 전사 시스템에서, 두가지 다른 mRNA 형태가 합성되었다. 하나는 RNA pol II에 의해 플라스미드-DNA로부터 직접 전사되어 5' 말단에 225-nt pol I 프로모터 서열과 3' 말단에 pol I 터미네이터 서열을 포함한다. 다른 mRNA는 주형으로 vRNA를 사용하는 바이러스 중합효소 복합체 단백질에 의해 합성된다. 이 mRNA의 5' 캡 구조는 중합효소 서브유닛 PB2가 세포성 RNA로부터 캡을 가져가는 캡-획득 메카니즘에 의해 얻어진다(Ulmanen et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1981, 21:3607). 양 mRNA 형태가 이의 5' 및 3' 비암호화영역에서 다르지만, 이들은 모든 바이러스 단백질에 대해 동일한 오픈 리딩 프레임을 포함한다. vRNA와 함께 번역된 구조 단백질은 어셈블리되어 감염성 인플루엔자 A 바이러스를 생성한다.
[표 3]
Figure 112007042568118-pat00003
8개의 일렬-프로모터 플라스미드로 트랜스펙션된 세포에서 WSN-바이러스를 생성하는 것이 매우 신뢰성있는 것으로 입증되었지만, 이 cRNA-mRNA 접근방법에 의한 바이러스 수율은 vRNA와 mRNA 전사체를 생산하는 이방향시스템보다 낮았다(표 3). 293T 또는 COS-1 세포를 이방향 pol I-pol II 전사 시스템을 포함하는 8개의 플라스미드로 트랜스펙션시키고 72시간 후(도 1; 실시예 2; Hoffmann et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97:6108; pHW181-PB2, pHW182-PB1, pHW183-PA, pHW184-HA, pHW185-NP, pHW186-NA, pHW187-M 및 pHW188-NS 참조), 바이러스 역가 는 1×107 pfu/㎖ 였다(표 3). COS-1 또는 293T 세포를 트랜스펙션시키고 72시간 후, 0.4 - 1×103 pfu/㎖가 상등액에서 발견되었다. 이 데이터는 8개 플라스미드 이방향 시스템이 12개 또는 17개 플라스미드의 공동트랜스펙션을 필요로 하는 보다 복잡하고 번거로운 다플라스미드 시스템과 유사한 동역학으로 바이러스 생성에 동일한 효율을 나타낸다는 것을 보여준다(Neumann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96:9345).
8개의 일렬 프로모터 플라스미드로 트랜스펙션시키고 24시간 후에는 감염성 바이러스가 발견되지 않았다(표 3). 이 결과는 vRNA-mRNA 및 cRNA-mRNA 접근방법 사이의 차이가 1차 pol I 전사체의 극성이 다르기 때문이라는 것을 제시한다. 이방향 시스템은 vRNA의 세포내 합성으로 개시하며, 이 상황은 vRNP가 핵으로 운반되고 vRNA가 처음으로 mRNA와 cRNA 합성을 위한 주형으로 작용하는 천연 인플루엔자 A 감염과 유사하다. 일방향 시스템에서, cRNP는 생산된 제1 복제-적합 단위이다. mRNA를 생산하기 위하여, cRNA를 vRNA로 복제해야 하고, 궁극적으로 vRNP는 자손 바이러스 입자로 패키징된다(Hsu et al., J. Gen. Virol. 1987, 77:2575). cRNP에서 vRNP를 생성하는데 추가 반응이 필요하기 때문에, 일방향 시스템에서 바이러스의 형성은 이방향 시스템에 의해 바이러스형성을 하는 것보다 더 늦은 시간에 일어난다.
두 시스템의 바이러스 수율에 차이가 나는데 대한 다른 가능한 이유는 cDNA에서의 서열 요소가 전사를 종결함으로써 전사의 효율을 감소시키거나 RNA 전사체 에서의 서열이 pol I 또는 pol II 전사체의 안정상태 수준을 감소시키는 것이다. 8개의 바이러스유사 cRNA 또는 mRNA 중 단 하나의 농도가 낮아도 이 시스템의 전체 효율이 감소되는데 이는 모든 vRNP와 구조 단백질이 바이러스 복제와 바이러스 어셈블리에 최적인 농도에서 합성되어야 하기 때문이다.
인플루엔자 A 바이러스를 생산하는데 8-플라스미드 시스템의 효율이 높은 것은 이 시스템을 인플루엔자 B 바이러스, 인플루엔자 C 바이러스 및 토고토바이러스와 같은 다른 오르소마이소바이러스에도 적용할 수 있다는 것을 나타낸다. 본 연구의 결과는 vRNA-mRNA 시스템이 플라스미드로부터 이들 바이러스를 완전히 생성하기 위한 가장 효과적인 방법일 것이라고 제시한다. 본 발명은 파라마이소비리대, 아레나비리대 도는 분야비리대와 같은 오르소마이소비리대과의 구성원이 아닌 RNA 바이러스를 생산하기 위한 pol I계 시스템을 확립할 수 있게 한다(Roberts, A. & Rose, J.K., Virology 1998, 247:1-6; Elliot, Proc. NAtl. Acad. Sci. USA 1996, 93:15400; Lee et al., J. Virol. 2000, 74:3470). 오르소마이소바이러스와 달리, 대부분의 RNA 바이러스는 감염된 세포의 세포질에서 복제한다. 진화하는 동안, 이들 바이러스의 RNA는 스플라이싱과 같은 핵에서 발견되는 선택압력을 받지 않는다. 일반적으로, 비단편화 음성가닥 RNA 바이러스의 역유전학 시스템은 라비에스바이러스를 회수하기 위한(Schnell et al., EMBO J. 1994, 13:4195) 콘젤만(Conzelmann)과 동료들이 개척한 바와 같이 T7 프로모터로부터의 세포내 전사에 기초한다. 바이러스유사 RNA의 발현은 재조합 백시니아 바이러스로 감염시키거나 T7 RNA 중합효소를 구조적으로 발현하는 세포주를 사용함으로써 제공된 T7 RNA 중합효소에 의해 구 동된다. 핼에서 일어나는 pol I 전사와 달리, T7 RNA 중합효소에 의한 전사는 세포질에서 일어난다. 세포질성 RNA 바이러스에 대해 pol I 전사 시스템을 사용하면 RNA 전사체가 핵 밖으로 운반되어야 할 필요가 있을 것이다. pol I 전사체가 핵 밖으로 운반된다는 것은 이의 5' 비암호화영역 속으로 삽입된 내부 리보좀 입구 부위를 가지는 pol I 전사체를 포함하는 세포에서 다낵질이 생산되는 것을 검출함으로써 지지된다(Palmer et al., Nucl. Acids. Res. 1993, 21:3451). 정보가 pol I 전사체의 배출 및 보유에 중요한 서열에만 한정되어 있기 때문에, 음성-센스 또는 양성-센스 RNA의 합성은 핵 배출의 효과를 다르게 할 수 있다. 또한, 큰 pol II-생성 코로나바이러스유사 전사체(30,000nt 보다 큰 것)를 핵으로부터 배출하는 것(Almazan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97:5516)은 전사체의 길이보다 특이적 RNA 서열이 배출에 중요할 수 있다는 것을 나타낸다. 우리가 개발한 pol I-pol II 클로닝 벡터와 타입 II 제한 엔도뉴클레아제의 사용에 기초한 효과적인 클로닝 방법은 핵에서 합성된 양성 및 음성-센스 RNA가 합당한 비용 및 합당한 시간 내에 세포질성 RNA 바이러스를 생성할 수 있도록 할 것이다.
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본 발명은 본 명세서에서 설명된 특정 실시형태에 의해 그 범위가 제한되지 않는다. 본 명세서에 기재된 것에 추가하여 본 발명의 다양한 변형은 상기 상세한 설명 및 첨부한 도면으로부터 당업자에게 자명할 것이다. 그러한 변형은 첨부된 특허청구범위의 범위에 속한다.
모든 값은 유사하고 설명을 위해 제공되는 것으로 이해해야 한다.
본 명세서에서 인용된 모든 특허, 특허출원, 간행물 및 다른 자료는 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 삽입된다.
내부 유전자의 암호화 또는 비암호화영역을 유전적 변형시키면 감약된 바이러스를 개발할 수 있을 뿐 아니라, 백신의 안정성, 감염성, 면역원성 및 보호적 효능이 개선될 것으로 기대된다.
HA 유전자의 조작이 또한 백신 균주의 안정성을 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스의 H5 또는 H7 당단백질의 연결펩티드에서 발견된 염기성 아미노산을 제거하면 백신의 안정성을 증가시킬 수 있다.
다른 점막 백신접종법에는 마이크로캡슐 내에 바이러스를 캡슐화시키는 방법(미국특허 재5,075,109호, 제5,820,883호 및 제5,853,763호) 및 면역강화 막 담체를 사용하는 방법(WO 98/0558)이 포함된다. 경구 투여된 면역원의 면역원성은 적혈구세포(rbc) 또는 rbc 고스트를 사용하거나(미국특허 제5,643,577호) 청색 혀 항원을 사용하여(미국특허 제5,690,938호) 증진될 수 있다.
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  7. 각 플라스미드가 인플루엔자 바이러스의 하나의 바이러스 게놈 단편을 포함하고, 상기 바이러스 게놈 단편에 대응하는 바이러스 cDNA는 정확한 3' 말단을 갖는 vRNA 또는 cDNA의 발현을 일으키는 RNA 중합효소 I(pol I) 프로모터 및 조절요소 사이에 삽입되고, 이것은 다시 바이러스 mRNA 및 대응하는 바이러스 단백질의 발현을 야기하는 RNA 중합효소 II(pol II) 프로모터 및 폴리아데닐화 신호 사이에 삽입되어 있으며, 상기 플라스미드 세트로부터 vRNA 또는 cRNA 및 바이러스 단백질이 발현되면 재분류 인플루엔자 바이러스가 제공되고, 상기 재분류 인플루엔자 바이러스의 2 이상의 바이러스 게놈 단편들은 2 이상의 상이한 인플루엔자 바이러스로부터 얻어진 것인, 헬퍼 바이러스 없이 숙주 세포에 도입되었을 때 재분류 인플루엔자 바이러스를 생성하는 한 세트의 플라스미드를 포함하는 최소 플라스미드-기반 시스템.
  8. 제7항에 있어서, 하나 이상의 바이러스 게놈 단편은 인플루엔자 A 바이러스로부터 얻어진 것이고, 하나 이상의 바이러스 게놈 단편은 인플루엔자 B 바이러스로부터 얻어진 것인 플라스미드-기반 시스템.
  9. 제7항에 있어서, 2 이상의 상이한 인플루엔자 바이러스가 인플루엔자 A/Ann Arbor/6/60, 인플루엔자 B/Ann Arbor/1/66, 인플루엔자 A/Teal/HK/W312/97, 인플루엔자 A/WSN/33, 및 인플루엔자 A/PR/8/34로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 플라스미드-기반 시스템.
  10. 제7항에 있어서, 2 이상의 상이한 인플루엔자 바이러스가 인플루엔자 A/WSN/33 및 인플루엔자 A/Teal/HK/W312인 플라스미드-기반 시스템.
  11. 제7항에 있어서, pHW241-PB2, pHW242-PB1, pHW243-PA, pHW245-NP, pHW184-HA, pHW246-NA, pHW247-M, 및 pHW248-NS의 맵을 갖는 8개의 플라스미드들로 필수적으로 이루어지는 플라스미드-기반 시스템.
  12. 제7항에 있어서, pHW241-PB2, pHW242-PB1, pHW243-PA, pHW245-NP, pHW244-HA, pHW186-NA, pHW247-M, 및 pHW248-NS의 맵을 갖는 8개의 플라스미드들로 필수적으로 이루어지는 플라스미드-기반 시스템.
  13. 제7항에 있어서, pHW241-PB2, pHW242-PB1, pHW243-PA, pHW245-NP, pHW244-HA, pHW246-NA, pHW187-M, 및 pHW248-NS의 맵을 갖는 8개의 플라스미드들로 필수적으로 이루어지는 플라스미드-기반 시스템.
  14. 제7항에 있어서, pHW241-PB2, pHW242-PB1, pHW243-PA, pHW245-NP, pHW244-HA, pHW246-NA, pHW247-M, 및 pHW188-NS의 맵을 갖는 8개의 플라스미드들로 필수적으로 이루어지는 플라스미드-기반 시스템.
  15. 제7항에 있어서, pHW241-PB2, pHW242-PB1, pHW243-PA, pHW245-NP, pHW184-HA, pHW186-NA, pHW187-M, 및 pHW188-NS의 맵을 갖는 8개의 플라스미드들로 필수적으로 이루어지는 플라스미드-기반 시스템.
  16. 제7항의 플라스미드-기반 시스템을 포함하는 조성물.
  17. 제7항의 플라스미드-기반 시스템을 포함하는 숙주 세포.
  18. 제17항에 있어서, 베로(Vero) 세포, 마딘-다비 카닌 신장(Mardin-Darby Canine Kidney)(MDCK) 세포, CV1 세포, COS-1 세포, COS-7 세포, BHK-1 세포, 및 2 이상 세포들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 숙주 세포.
  19. (a) 제7항의 최소 플라스미드-기반 시스템을 숙주 세포에 도입시키는 단계, 및
    (b) 바이러스 단백질 및 vRNA 또는 cRNA의 생성을 허용하는 조건 하에서 숙주 세포를 배양함으로써, 재분류 인플루엔자 바이러스를 생성하는 단계를 포함하는 재분류 인플루엔자 바이러스 생성 방법.
  20. 제19항에 있어서, 하나 이상의 바이러스 게놈 단편은 인플루엔자 A 바이러스로부터 얻어진 것이고, 하나 이상의 바이러스 게놈 단편은 인플루엔자 B 바이러스로부터 얻어진 것인 생성 방법.
  21. 제19항에 있어서, 2 이상의 상이한 인플루엔자 바이러스가 인플루엔자 A/Ann Arbor/6/60, 인플루엔자 B/Ann Arbor/1/66, 인플루엔자 A/Teal/HK/W312/97, 인플루엔자 A/WSN/33, 및 인플루엔자 A/PR/8/34로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 생성 방법.
  22. 제19항에 있어서, 2 이상의 상이한 인플루엔자 바이러스가 인플루엔자 A/WSN/33 및 인플루엔자 A/Teal/HK/W312인 것인 생성 방법.
  23. 제19항에 있어서, 플라스미드 세트가 pHW241-PB2, pHW242-PB1, pHW243-PA, pHW245-NP, pHW184-HA, pHW246-NA, pHW247-M, 및 pHW248-NS의 맵을 갖는 8개의 플라스미드들로 필수적으로 이루어지는 것인 생성 방법.
  24. 제19항에 있어서, 플라스미드 세트가 pHW241-PB2, pHW242-PB1, pHW243-PA, pHW245-NP, pHW244-HA, pHW186-NA, pHW247-M, 및 pHW248-NS의 맵을 갖는 8개의 플라스미드들로 필수적으로 이루어지는 것인 생성 방법.
  25. 제19항에 있어서, 플라스미드 세트가 pHW241-PB2, pHW242-PB1, pHW243-PA, pHW245-NP, pHW244-HA, pHW246-NA, pHW187-M, 및 pHW248-NS의 맵을 갖는 8개의 플라스미드들로 필수적으로 이루어지는 것인 생성 방법.
  26. 제19항에 있어서, 플라스미드 세트가 pHW241-PB2, pHW242-PB1, pHW243-PA, pHW245-NP, pHW244-HA, pHW246-NA, pHW247-M, 및 pHW188-NS의 맵을 갖는 8개의 플라스미드들로 필수적으로 이루어지는 것인 생성물.
  27. 제19항에 있어서, 플라스미드 세트가 pHW241-PB2, pHW242-PB1, pHW243-PA, pHW245-NP, pHW184-HA, pHW186-NA, pHW187-M, 및 pHW188-NS의 맵을 갖는 8개의 플라스미드들로 필수적으로 이루어지는 것인 생성물.
  28. 각 플라스미드가 인플루엔자 바이러스의 하나의 바이러스 게놈 단편을 포함하고, 하나 이상의 바이러스 게놈 단편은 하나 이상의 돌연변이를 포함하며, 상기 바이러스 게놈 단편에 대응하는 바이러스 cDNA는 정확한 3' 말단을 갖는 vRNA 또는 cDNA의 발현을 일으키는 RNA 중합효소 I(pol I) 프로모터 및 조절요소 사이에 삽입되고, 이것은 다시 바이러스 mRNA 및 대응하는 바이러스 단백질의 발현을 야기하는 RNA 중합효소 II(pol II) 프로모터 및 폴리아데닐화 신호 사이에 삽입되어 있고, 상기 플라스미드 세트로부터 vRNA 또는 cRNA 및 바이러스 단백질이 발현되면 감약된 인플루엔자 바이러스가 제공되는, 헬퍼 바이러스 없이 숙주 세포에 도입되었을 때 감약된 인플루엔자 바이러스를 생성하는 한 세트의 플라스미드를 포함하는 최소 플라스미드-기반 시스템.
  29. 제28항에 있어서, 감약된 인플루엔자 바이러스가 온도 민감성인 것인 플라스미드-기반 시스템.
  30. 제29항에 있어서, 감약된 인플루엔자 바이러스가 냉 적응된 것인 플라스미드-기반 시스템.
  31. 제28항에 있어서, 하나 이상의 바이러스 게놈 단편이 확립된 감약된 인플루엔자 바이러스로부터 얻어진 것인 플라스미드-기반 시스템.
  32. 제28항에 있어서, 바이러스 게놈 단편이 인플루엔자 A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) 또는 인플루엔자 B/Ann Arbor/1/66으로부터 얻어진 것인 플라스미드-기반 시스템.
  33. 제28항에 있어서, HA 유전자가 돌연변이된 플라스미드-기반 시스템.
  34. 제28항에 있어서, NS 유전자가 돌연변이된 플라스미드-기반 시스템.
  35. 제28항의 플라스미드-기반 시스템을 포함하는 조성물.
  36. 제28항의 플라스미드-기반 시스템을 포함하는 숙주 세포.
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