ES2319864T3 - Sistema de transfeccion de adn para la generacion de virus infecciosos de arn de cadena negativa. - Google Patents

Abstract

Un sistema mínimo basado en plásmidos para la generación de un virus infeccioso de ARN de cadena negativa a partir de ADNc viral clonado que comprende un conjunto de plásmidos, en el que cada plásmido comprende un ADNc viral que se corresponde con un segmento genómico viral autónomo insertado entre un promotor de la ARN polimerasa I (pol I) y una secuencia del finalizador, dicho ADNc es así capaz de dirigir la síntesis del ARNv, y dicho ADNc está insertado también entre un promotor de la ARN polimerasa II (pol II) y una señal de poliadenilación, dicho ADNc es así también capaz de dirigir la síntesis de ARNm, y en el que dicho sistema de base plasmídica es un sistema de transcripción bidireccional de ADNc.

Description

Sistema de transfección de ADN para la generación de virus infecciosos de ARN de cadena negativa.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al desarrollo de un sistema mínimo de base plasmídica que es un sistema de transcripción bidireccional de ADNc para la generación de virus infecciosos de ARN de cadena negativa, preferiblemente, virus de la gripe, a partir de ADN clonado. En particular, este sistema multi-plasmídico pol I - pol II facilita la generación de virus tanto recombinantes como de reordenamiento. En realizaciones preferidas, la invención comprende un sistema de ocho plásmidos pol I - pol II para la generación de virus de la gripe. También puede aplicarse en la recuperación de otros virus de ARN de cadena negativa de forma completa a partir de ADNc clonado.

Antecedentes de la invención Ciclo de vida de virus de ARN

Los genomas de virus de ARN tienen diferentes configuraciones, incluyendo unimoleculares o segmentados; de cadena sencilla de polaridad (+) o (-) o de cadena doble. Sin embargo, los virus comparten dos requisitos esenciales comunes: (1) los ARN genómicos deben copiarse eficazmente en una forma en la cual puedan ser utilizados de manera efectiva para montarse en partículas virales de progenie y (2) deben sintetizarse ARNm que puedan ser eficazmente transformados en proteínas virales. Generalmente, los virus de ARN (excepto los retrovirus) codifican y/o transportan una ARN polimerasa dependiente del ARN para catalizar la síntesis de un nuevo ARN genómico (para montar en la progenie) y ARNm (para su transformación en proteínas virales). Ya que típicamente las células eucarióticas anfitrionas no contienen maquinaria para replicar un patrón de ARN para transformar polipéptidos a partir de una matriz de ARN de cadena negativa o de cadena doble, los virus que comprenden estos ácidos nucleicos en sus genomas deben transportar una proteína de ARN polimerasa en la partícula viral. Por esta razón, las moléculas de ARN desproteinizadas de virus de ARN de cadena negativa o de cadena doble (que carecen de una ARN polimerasa asociada) no son infecciosas. En contraste, el ARN desproteínizado del genoma de un virus de ARN de cadena positiva es, típicamente, infeccioso ya que las proteínas virales codificadas pueden ser transformadas por la maquinaria de la célula anfitriona.

El ARN viral genómico debe empaquetarse dentro de partículas virales para que el virus sea transmitido. Algunas cápsidas virales del ARN son encerradas por membranas lipídicas de la célula anfitriona infectada y otras tienen una cubierta externa de proteína viral sin una bicapa lipídica. A pesar de estas diferencias entre cápsidas virales, el proceso mediante el cual se montan las partículas virales de progenie y las interacciones de proteína/proteína que se producen durante el ensamblaje son similares. Las proteínas virales generalmente se clasifican como proteínas estructurales y no estructurales. En general, las proteínas no estructurales están involucradas en la replicación genómica, en la regulación de la transcripción y en el empaquetamiento. Las proteínas estructurales generalmente realizan tres tipos de funciones que incluyen: (1) la unión al ARN genómico (es decir, la proteína nucleocápsida para el virus de la gripe A), (2) el cruzamiento entre el ARN empaquetado y las proteínas externas (es decir, proteína de matriz) y (3) la construcción de una capa viral externa (es decir, proteínas superficiales tales como la hemaglutinina). El ensamblaje en partículas virales asegura la transmisión efectiva del genoma de ARN de una célula anfitriona a otra dentro de un anfitrión único o entre organismos anfitriones diferentes.

Virus de la Gripe

El virus de la gripe A, un Orthomixoviridae, es un virus de ARN de sentido negativo con un genoma segmentado. Los ARN genómicos contienen una o más estructuras de lectura abierta flanqueadas por secuencias no codificantes en los extremos 5' y 3' (Desselberger y colaboradores, Gene 1980, 8:315). Los ARN virales están asociados con nucleoproteína viral (NP) y proteínas de la polimerasa (PB1, PB2 y PA) en viriones y células infectadas para formar complejos de ribonucleoproteínas (Hsu y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 1987, 84:8140). Su composición genética permite que este virus evolucione mediante reordenamiento de segmentos genes de diferentes cepas; este reordenamiento crea nuevas variantes para las que un organismo recientemente infectado no tiene respuesta anamnésica inmune. De los 15 subtipos de hemaglutinina (HA) y de los 9 subtipos de neuraminidasa (A) de la gripe que circulan en las aves acuáticas, se sabe que tres subtipos, H1N1, H2N2 y H3N2, han provocado pandemias en humanos (Webstern y colaboradores, Microbiol. Rev. 1992, 56:152). Hay evidencias de que los cerdos pueden servir como anfitriones intermedios ("vaso mezclador") para la generación de nuevas cepas que sean patógenas para los humanos (Scholtissek y colaboradores, Virology 195, 147:287). El brote de gripe A H5N1 de Hong Kong en 1997 mostró que los virus de la gripe A altamente patógenos también podían transmitirse directamente desde especies aviares a los humanos (Claas y colaboradores, Lancet 1998, 351:472; Suárez y colaboradores, J. Virol. 1998, 72:6678; Subbarao y colaboradores, Science 1998, 279:393; Shortridge, Vaccine 1999, 17 (Supl. 1):S26-S29). El potencial de los virus de la gripe A para generar nuevas cepas patógenas a partir de un vasto número de cepas circulantes en la reserva natural indica que el control de la enfermedad requiere el seguimiento de estos virus y el desarrollo de mejores terapias y vacunas antivirales. La velocidad a la cual se desarrollan las nuevas cepas demanda vigilancia en este esfuerzo de seguimiento y pone a prueba la capacidad de la tecnología actual para producir cantidades suficientes de vacunas contra una nueva cepa patógena recientemente identificada para evitar la epidemia o la pandemia.

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Para el virus de la gripe A, sistemas de genética inversa han permitido la manipulación del genoma viral (Palese y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 1996, 93:11354; Neumann y Kawaoka; Adv. Virus Res. 1999, 53:265). A diferencia de los virus de cadena positiva (es decir, los poliovirus), los ARN virales de sentido negativo (ARNv) de los virus de la gripe A no son infecciosos. Solamente las moléculas de ARNv encapsidadas con las cuatro proteínas virales (PB1, PB2, PA, NP) del complejo de polimerasa son capaces de iniciar un ciclo de replicación y transcripción viral. Después de que las ribonucleoproteínas (RNP) penetren en el núcleo de la célula, las proteínas asociadas comienzan a transcribir los ARNv (-) en ARNm y en los ARN complementarios de sentido positivo, ARNc (+). Estos ARNc sirven como matrices para la síntesis de los ARNv. El primer sistema genético inverso a ser desarrollado para el virus de la gripe A fue el procedimiento de transfección de ARN (Luytjes y colaboradores, Cell 1989, 59:1107; Enami y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87:3802). Después de la transcripción in vitro de ARNv similar al del virus mediante la ARN polimerasa T7 y de la reconstitución de las moléculas de la ribonucleoproteína (ARNv) viral, se introdujeron segmentos de RNP genéticamente alterados dentro de células eucarióticas mediante transcepción. La infección con un virus auxiliar de la gripe dio como resultado la generación de virus que poseían un gen derivado del ADNc clonado. Sin embargo, la presencia del virus auxiliar en los procedimientos de transfección del ARN y del ADN limita severamente el valor práctico de estos procedimientos ya que se requiere un fuerte sistema de selección para eliminar el virus auxiliar.

El establecimiento de la síntesis impulsada por la ARN polimerasa I (pol I) de moléculas de ARNv in vivo permitió la producción intracelular de complejos de ARN (Neumann y Hobom, Virology 1994, 202:477). En este sistema, el ADNc similar al del virus se insertó entre el promotor de la pol I y las secuencias del finalizador (Zobel y colaboradores, Nucl. Acids Res. 1993, 21:3607). A diferencia de las transcripciones del ARNm sintetizado mediante la ARN polimerasa II (pol II), los ARN generados por la pol I carecen tanto del remate 5' como de una cola poli (A) 3'. Podrían generarse moléculas de RNPv funcionales bien mediante infección con el virus auxiliar o bien mediante cotransfección de los plásmidos de expresión de las proteínas que codifican PB1, PB2, PA, o NP (Neumann and Hobom, supra; Flick y colaboradores, RNA 1996, 2:1046; Pleschka y colaboradores, J. Virol. 1996. 70:4188; Zhou y colaboradores, Virology 1998, 246:83).

Recientes estudios han demostrado que la expresión controlada por plásmidos de la totalidad de los ocho ARNv a partir de un promotor de la pol I y la coexpresión de proteínas del complejo de polimerasa dan como resultado la formación de un virus de la gripe A infeccioso (Neumann y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96:9345; Fodor y colaboradores, J. Virol. 1999, 73:9679). Ya que la generación del virus de la gripe A completamente impulsada a partir de plásmidos no requiere infección con virus auxiliar, no es necesario un sistema de selección; por lo tanto, pueden manipularse todos los segmentos genéticos sin limitaciones técnicas. En el sistema desarrollado por Neumann y colaboradores (supra), se insertaron los ocho ADNc entre una secuencia promotora de la pol I humana (407 pb) y una secuencia del finalizador murino (174 pb). La expresión de las cuatro proteínas del complejo de RNP fue impulsada por el promotor del citomegalovirus humano. La transfección de doce plásmidos dentro de 10^{6} células 293T dio como resultado la recuperación de virus de más de 10^{3} pfu; esta eficacia podría incrementarse hasta 5 x 10^{7} pfu después de la transfección de 17 plásmidos. Fodor y colaboradores (supra) desarrollaron un sistema en el cual los ocho ADNc se insertaron entre una secuencia promotora de la pol I humana (250 pb) y una secuencia genómica del ribozoma del virus delta de la hepatitis para asegurar el final 3' preciso del ARNv. Para la expresión de los genes del complejo de polimerasa, se utilizaron plásmidos que contenían el promotor principal tardío del adenovirus tipo 2. Después de la transfección de los 12 plásmidos de expresión en células Vero se rescataron solamente una o dos partículas virales infecciosas de las 10^{6} células transfectadas.

Sin embargo, el sistema libre de virus auxiliares descrito por Neumann y colaboradores (supra), que contiene los promotores de la pol I y de la pol II con ADNc del virus de la gripe sobre diferentes plásmidos, requiere la construcción y la contrafección de al menos 12 plásmidos para la recuperación del virus y de 17 plásmidos para la recuperación eficaz del virus. La transfección de células con este gran número de plásmidos puede limitar el uso de este sistema a líneas celulares que tengan una alta eficiencia de transfección. Para poder rescatar el virus de diferentes tipos de células se debe incrementar la producción del virus mejorando la replicación del virus de la gripe A en estas células e incrementar la banda de células adecuadas para la producción de vacunas (Govorkova y colaboradores, J. Virol. 1996, 70:5519).

Así, existe la necesidad de una técnica para la generación más eficaz de virus recombinantes de la gripe. Además, existe una necesidad adicional en la técnica para la generación eficaz de virus de reordenamiento para la producción de vacunas en respuesta a las cepas del virus recientemente identificadas. La presente invención se dirige a estas y otras necesidades de la técnica suministrando sistemas en los cuales se produce la síntesis tanto de segmentos genómicos virales de ARN de cadena negativa (ARNv) como de ARNm viral a partir de una matriz, minimizando así el número de plásmidos requeridos para la generación de virus y permitiendo un reordenamiento eficaz y precedible.

Virus Reoviridae

Los virus de la familia Reoviridae que incluyen virus del género Rotavirus, comprenden un genoma de ARN segmentado de doble cadena. El rotavirus humano es el agente viral más común de la diarrea infantil intensa en los Estados Unidos, provocando aproximadamente 50.000 hospitalizaciones y entre 20 y 50 fallecimientos al año con un coste anual estimado de más de 1 billón de dólares. En los países en desarrollo, se estima que el rotavirus es responsable de un tercio de las hospitalizaciones asociadas con la diarrea y provoca aproximadamente 850.000 muertes anuales.

Existe un sistema doble para informar serotipos del rotavirus debido a la respuesta de neutralización evocada por dos proteínas virales (VP), VP7 y VP4. Los serotipos de la VP7 se designan tipos G y aquellos derivados de la VP4 se describen como tipos P. Hasta la fecha, se han encontrado al menos 10 serotipos G y al menos 7 serotipos P en los humanos. Ya que los genes VP4 y VP7 se segregan separadamente, se generan nuevos rotavirus mediante reordenamiento. En los Estados Unidos, son más frecuentes los serotipos P1 a P4 y G1 a G4; se ha informado de otras combinaciones en países como India y Egipto. La primera vacuna licenciada del rotavirus humano, la vacuna del rhesus rotavirus, se formuló para producir una protección específica para el serotipo contra los cuatro serotipos comunes G1 a G4. Sin embargo, esta vacuna fue eliminada a causa de una asociación entre la vacunación y tasas incrementadas de intususcepción en los receptores de la vacuna. Así, existe la necesidad de producir una vacuna de rotavirus que represente todos los subtipos G y P que no tenga efectos secundarios indeseados. También, aquí se describen vectores (preferiblemente plásmidos), procedimientos y células anfitrionas que pueden emplearse para generar rotavirus completamente a partir de ADNc clonado.

Se han definido trece productos genéticos primarios. Para minimizar la confusión y facilitar la comparación con proteínas con funciones similares de otros géneros de Reoviridae, se ha empleado la siguiente nomenclatura: de acuerdo con su migración en análisis SDS-PAGE, comenzando desde la proteína de mayor tamaño, las proteínas estructurales han recibido el prefijo "VP" y las proteínas no no estructurales el prefijo "NSP" y la función de cada proteína se da entre paréntesis. Por ejemplo, la abreviación VP1 (pol) indica que la proteína de mayor tamaño en las partículas del virus es ARN polimerasa dependiente del ARN. Las siete proteínas estructurales se monta en partículas virales que comprenden tres capas de estructura: (1) el núcleo viral interno que contiene el genoma de ARNds tiene tres proteínas asociadas con él, dos de las cuales (VP1(Pol) y VP3 (Cap)) están directamente asociadas con el genoma, mientras la tercera (VP2(T2)) constituye la cubierta del núcleo, (2) la cubierta media de proteínas del virion está constituida por 780 moléculas VP6(T13) dispuestas en 260 unidades triméricas y (3) la VP4 y la VP7 constituyen la cubierta exterior. La proteína pico VP4 contiene un sitio de escisión de tripsina que es importante para la escisión en VP5 y VP8, y esta escisión mejora la infectividad. Dos formas de VP7, derivadas de diferentes marcos de lectura de dentro del marco, VP7(1) y VP7(2) se ha visto que se incorporan dentro de viriones.

Se conoce mucho menos acerca de las funciones de las seis proteínas no estructurales. De forma similar a otros virus de ARN, se anticipa que las proteínas no estructurales juegan importantes roles en la replicación de los virus, la transcripción, la translación de ARN viral y el empaquetamiento. En efecto, basándose en los análisis de virus sensibles a la temperatura en el segmento 8, existe la hipótesis de que la NSP2 (ViP) tiene un rol directo en la replicación de los virus. La NSP3 se cree que se une a las secuencias conservadas en el extremo 3' de los ARNm virales y al remate celular que une la proteína elF4G regulando así específicamente la traducción de los ARNm de rotavirus que tienen estructuras de remate 5' pero no colas poliA 3'. Parece que la NSP1 no es esencial, pero probablemente juega un rol activo en la replicación de rotavirus en cultivos celulares. Se cree que la NSP4 está involucrada en la morfogénesis de los virus. Las dos proteínas no estructurales, NSP5 y NSP6, están codificadas por dos marcos de lectura diferentes del segmento 11, pero no se conoce su función en el ciclo de vida viral.

El ciclo de replicación se completa en 10-12 horas a 37ºC. Los datos actuales sugieren que los virus pueden penetrar en las células a través de endocitosis intermediada por los receptores pero puede haber un mecanismo alternativo para la entrada en las células. Después de penetrar en la célula anfitriona, la cubierta externa del virus libera la partícula de doble cubierta transcripcionalmente activa dentro del citoplasma de la célula infectada. Enzimas asociadas con los viriones producen ARNm no poliadenilados provistos de remate en 5', que son transcritos de longitud completa de la cadena menos de cada uno de los segmentos del genoma del virión. Los ARNm virales derivados de cada uno de los segmentos sirven para dos funciones: la primera, son traducidos para generar las proteínas virales codificadas por el segmento; y segundo, los ARNm virales son también las matrices para la replicación del genoma. El ensamblaje del segmento del genoma tiene lugar mediante la selección de los diferentes ARNm virales requeridos para formar el prenúcleo R1. El ensamblaje de los once ARNm es seguido por la síntesis de las cadenas menos, que se produce en el "núcleo-RI" y en VP6(T13)-RI, que están presentes en los "viroplasmas" hallados en el citoplasma de la célula infectada. Los siguientes pasos en la morfogénesis de viriones de progenie son únicos para los rotavirus y comprenden la gemación de partículas de doble capa dentro del retículo endoplásmico en un proceso que involucra la NSP4. Esto da como resultado que la partícula adquiera de forma transitoria una cubierta que se pierde durante el paso de maduración final cuando se añade la cubierta externa del virión de la VP4 y la VP7.

Un genoma segmentado, una estructura genómica altamente ordenada y un ciclo de replicación complejo presentan mayores probabilidades para el desarrollo de un sistema genético inverso para la generación de rotavirus. También en adelante se describe la generación simple y adecuada de rotavirus.

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Vacunas para la gripe

Las vacunas para la gripe actualmente autorizadas por las autoridades sanitarias públicas para su uso en los Estados Unidos y Europa son vacunas de gripe inactivada. Los virus, que presentan cepas de gripe A y de gripe B epidemiológicamente importantes, se cultivan en huevos de gallina embrionados y las partículas de los virus se purifican e inactivan subsiguientemente por medios químicos. Cada año la Organización Mundial de la Salud (WHO) selecciona los subtipos que más probablemente circularán: actualmente dos cepas para la gripe A (H1N1) y (H3N2) y una cepa para la B.

Para la producción de una vacuna segura y efectiva es importante que las cepas seleccionadas para la vacuna estén estrechamente relacionadas con las cepas circulantes, asegurando así que los anticuerpos de la población vacunada sean capaces de neutralizar el virus antigenéticamente similar. Sin embargo, no todos los virus estrechamente relacionados son adecuados para la producción de vacunas ya que crecen pobremente en los huevos. Por lo tanto, es deseable un intento para generar un virus de reordenamiento de alto crecimiento para combinar la alta producción de virus de una cepa de laboratorio (A/PR/8/34) (H1N1) con las características antigénicas de la cepa patógena anticipada. Desafortunadamente, la infección conjunta con dos virus de gripe que contengan ocho segmentos da como resultado la generación de teóricamente 2^{8} = 256 virus de progenie diferentes. Para obtener un virus de alto crecimiento con los antígenos glicoproteicos requeridos, se necesita un procedimiento de selección para eliminar los correspondientes segmentos de genes de la cepa parenteral de laboratorio de alto crecimiento. El procedimiento de selección para obtener el virus con las glicoproteínas adecuadas y la verificación de la constelación de los genes es una tarea tediosa y que consume mucho tiempo. Aunque los sistemas de transfección de RNP (Luytjes y colaboradores, Cell 1989, 59:1107) reducen el posible número de virus de progenie, aún se necesita un buen procedimiento de selección.

Las vacunas de virus vivos atenuados de la gripe administradas intranasalmente inducen una inmunidad local, mucosal, de intermediación celular y humoral. Los virus de reordenamiento (CR) adaptados al frío (ca) que contienen los seis genes internos de la gripe viva atenuada, A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) o B/Ann Arbor/1/66, y la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA) de virus de gripe contemporáneos de tipo natural parecen estar verdaderamente atenuados. Esta vacuna parece ser eficaz en niños y adultos jóvenes. Sin embargo, debe atenuarse demasiado para estimular una respuesta inmune ideal en la población de mayor edad, el principal grupo de individuos 20.000-40.000 en los EE.UU. que mueren cada año como resultado de la infección de la gripe. Aunque se han descubierto las secuencias de los genes internos de los virus ca, todavía no está bien definida la contribución de cada segmento al genotipo atenuado. Esta información puede adquirirse solamente mediante la introducción secuencial de mutaciones atenuantes específicas y definidas dentro de un virus. Aunque el procedimiento de transfección de RNP permite la introducción de mutaciones dentro del genoma de la gripe, la necesidad de un sistema de selección y las dificultades técnicas para reconstituir las RNP virales in vitro limita el uso de la manipulación de los genes internos.

Así, existe la necesidad en la técnica de desarrollar vacunas de la gripe recombinantes que evite el uso de virus auxiliares, que crezcan bien en cultivo (huevos o cultivo celular), que permita desarrollar con fiabilidad virus de reordenamiento que puedan ser propagados para el desarrollo de una nueva vacuna y que suministre mutaciones sistemáticas para desarrollar cepas de virus vivos atenuados para vacunación intranasal. La presente invención se dirige a estas y otras necesidades de la técnica.

Resumen de la invención

La presente invención suministra un sistema mínimo de base plasmídica para la generación de un virus infeccioso de ARN de cadena negativa a partir de ADNc viral clonado que comprende un conjunto de plásmidos, en el que cada plásmido comprende un ADNc viral que se corresponde con un segmento genómico viral autónomo insertado entre un promotor de la ARN polimerasa I (pol I) y una secuencia del finalizador, dicho ADNc es THVS capaz de dirigir la síntesis del ARNv y dicho ADNc también está insertado entre un promotor de la ARN polimerasa II (pol II) y una señal de poliadenilación, dicho ADNc es THVS capaz también de dirigir la síntesis del ARNm, y en el que dicho sistema de base plasmídica es un sistema de transcripción bidireccional de ADNc.

Preferiblemente, el virus de ARN es un virus de gripe (por ejemplo un virus de la gripe A o de la gripe B).

La invención comprende un sistema de base plasmídica para generar virus infecciosos de ARN de cadena negativa a partir de genes clonados o de ADNc. En este sistema (sistema bidireccional), el gen o el ADNc se sitúa entre un promotor de la pol II cadena arriba y un promotor de la pol I cadena abajo. La transcripción del gen o del ADNc a partir del promotor de la pol II produce ARNm viral de sentido positivo provisto de remate y la transcripción a partir del promotor de la pol I produce ARNv desprovisto de remate, de sentido negativo. También, descrito como ejemplo comparativo, se presenta otro sistema (sistema unidireccional), en el cual el gen o el ADNc se sitúa cadena abajo del promotor de una pol I y de una pol II. El promotor de pol la II produce ARNm viral de sentido positivo provisto de remate y el promotor de la pol I produce ARNc viral de sentido positivo desprovisto de remate.

Un sistema mínimo de base plasmídica de la invención permite la generación de virus infecciosos de ARN de cadena negativa a partir de ADNc viral clonado. Dicho sistema comprende un conjunto de plásmidos en el que cada plásmido comprende un segmento genómico viral autónomo del virus de ARN. En cada plásmido, el ADNc viral que se corresponde con el segmento genómico viral autónomo, se inserta entre un promotor de la ARN polimerasa I (pol I) y secuencias del finalizador, dando así como resultado la expresión de ARNv, que a su vez se insertan en un promotor de la ARN polimerasa II (pol II) y una señal de poliadenilación, dando así como resultado la expresión de ARNm viral. De esta forma, este sistema emplea la tecnología plasmídica bidireccional y permite el reordenamiento eficaz para producir virus de ARN de cadena negativa que se corresponden con las cepas patógenas actualmente en circulación, por ejemplo, en términos de los genes de la gripe NA y HA, en una cepa de fondo bien adaptada al crecimiento en un cultivo celular o a partir de una cepa atenuada, o ambos casos. Preferiblemente, el virus es un virus de la gripe A o un virus de la gripe B.

La invención suministra células anfitrionas que comprenden el sistema de base plasmídica para la generación de viriones infecciosos así como procedimientos para producir los viriones de virus de ARN de cadena negativa, dichos procedimientos comprenden el cultivo de las células anfitrionas bajo condiciones que permitan la producción de proteínas virales y ARNv.

El sistema de base plasmídica, las células anfitrionas y el procedimiento para producir viriones son particularmente adecuados para preparar una vacuna específica para virus de ARN de cadena negativa. Dichos procedimientos comprenden la purificación de viriones. Los viriones purificados pueden ser inactivados o pueden ser atenuados. Las vacunas de la invención pueden utilizarse para la vacunación contra una infección por virus de ARN de cadena negativa. Se describe que una dosis protectora de una vacuna, que comprenda los viriones inactivados, puede ser administrada mediante inyección intramuscular. También se describe que una dosis protectora de una vacuna, que comprenda viriones atenuados, puede ser administrada intranasalmente a un sujeto.

La invención suministra además viriones de virus de reordenamiento y composiciones de vacunas que comprenden dichos viriones, incluyendo viriones inactivados y atenuados.

En otra realización ventajosa, la invención suministra un procedimiento para generar un virus de ARN de cadena negativa atenuado. Este procedimiento comprende la mutación de uno o más genes virales en el sistema de base plasmídica y posteriormente la determinación de sí los virus de ARN infecciosos producidos por el sistema están atenuados. Dichos virus atenuados pueden usarse para desarrollar vacunas intranasales, incluyendo vacunas intranasales con potencia mejorada para proporcionar inmunidad protectora a poblaciones de edad avanzada u otras poblaciones que no sean sensibles a las vacunas atenuadas actuales.

Descripción de los dibujos

Figura 1. Representación esquemática del sistema de transcripción de pol I - pol II para la síntesis de ARNv y ARNm. El ARNc de cada uno de los ocho segmentos del virus de la gripe está insertado entre el promotor de la pol I (p_{ih}) y el finalizador de la pol I (t_{i}). Esta unidad de transcripción de la pol I está flanqueada por el promotor de la pol II (p_{II}CMV) del citomegalovirus humano y la señal de poliadenilación (a_{ii}BGH) del gen que codifica la hormona bobina del crecimiento. Después de la transfección de los ocho plásmidos de expresión, se sintetizan dos tipos de moléculas. A partir del promotor de la pol I humana, se sintetiza ARNv de sentido negativo mediante la pol I celular. El ARNv sintetizado comprende la región no codificante (NCR) en los extremos 5' y 3'. La transcripción mediante la pol II produce ARNm con estructuras de remate 5' y colas poliA 3'; estos ARNm son traducidos en proteínas virales. La ATG del ADN viral es la primera ATG cadena abajo del sitio de inicio de la transcripción de la pol II.

Figura 2. Sistema pol I - pol II de ocho plásmidos para la generación del virus de la gripe A. Ocho plásmidos de expresión que contienen los ocho ADNc virales insertados entre el promotor de la pol I humana y el promotor de la pol II (véase la figura 1) son transceptados dentro de células eucarióticas. Ya que cada plásmidos contiene dos promotores diferentes, tanto de la pol I como de la pol II celulares, transcribirán las matrices plasmídicas, presumiblemente en diferentes compartimentos nucleares, lo que dará como resultado la síntesis de ARNm y ARNv virales. Después de la síntesis de las proteínas virales (PB1, PB2, PA, NP) del complejo de la polimerasa, se inicia el ciclo de replicación viral. Finalmente, el ensamblaje de todas las moléculas virales directamente (transcripción de la pol II) o indirectamente (transcripción y replicación viral de la pol I) derivado de la transcripción celular y de la maquinaria de traducción, da como resultado la interacción de todas las moléculas sintetizadas (RNPv y las proteínas estructurales HA, NA, M1, LM2, NS2/NEP) para generar el virus infeccioso de la gripe A.

Figuras 3A y 3B. Representación esquemática del procedimiento desarrollado para la construcción y transfección de los ocho plásmidos de expresión para recuperar A/Teal/HK/W312/97 (H6N1). A. Se extrajo ARN viral de partículas de virus. Se realizó una RT-PCR con los nucleótidos y secuencias específicos para el segmento que contenían cebadores para las endonucleasas de restricción de tipo II BsmBI o BsaI. Los ocho fragmentos virales de la PCR fueron digeridos con BsmBI o BsaI y se insertaron dentro del pHW2000 (linearizado con BsmBI). Esta inserción dio como resultado ocho construcciones de expresión donde los ADNc virales se fundieron de forma precisa con el promotor de la pol I y el finalizador (en los rectángulos negros se muestran las secuencias terminales virales AGC...ACT para el segmento PB2). B. Los ocho plásmidos de expresión con un promotor de la pol I y un promotor de la pol II contienen una copia de cada uno de los ADNc virales de los ocho segmentos. Los marcos de lectura abiertos para las diez proteínas virales están flanqueados por regiones no codificantes específicas para el segmento (cajas grises). Ya que el promotor de la pol I humana que se utilizó muestra alta actividad solamente en líneas celulares derivadas de los humanos o de especies relacionadas, se cultivaron células humanas 293T junto con la línea celular estándar utilizada para la gripe A (células MDCK). Los virus producidos en las células 293T después de la transfección pueden entonces infectar las células MDCK y replicarse.

Figuras 4A y 4B. Caracterización de los virus recuperados mediante RT-PCR. A. Se extrajo ARN de partículas de virus después de dos pasadas del sobrenadante de células transfectadas (véase tablas 1 y 2) sobre células MDCK. Se realizó una RT-PCR con cebadores específicos para el segmento de gen NS y con ARNv extraído de viriones. Los cebadores NS usados no eran específicos para la cepa; permitiendo así la amplificación de cualquier segmento NS de la gripe A. Los productos de la reacción fueron expuestos a electroforesis sobre un gel de agarosa al 2%. Para asegurarse que los fragmentos de ADN amplificado se derivaban del ARNv y no del ADN plasmídico transportado desde las células transfectadas, se efectuó una reacción sin la adición de transcriptasa inversa (RT) (-). Carriles 1 y 2, A/Teal/HK/W312/97 recombinante (Tabla 1); carriles 3 y 4, reordenamiento de M (Tabla 2); carriles 5 y 6, reordenamiento de NS (Tabla 2); carriles 7 y 8, virus A/WSN/33 (Tabla 1); carriles 9 y 10, reordenamiento cuádruple (Tabla 2). B. digestión Ncol de los fragmentos mostrados en A. También se verificó la identidad de los fragmentos NS mediante análisis de secuencia del producto amplificado (no se muestra).

Figura 5. También se describe un sistema unidireccional de transcripción ARN pol I - pol II. En el sistema unidireccional de transcripción de pol I - pol II, se inserta ADNc viral en la orientación de sentido positivo entre un promotor de la pol I humana (plh) y una secuencia de finalizador (ti). Esta unidad de transcripción de pol I completa está flanqueada por un promotor de pol II (pIICMV: promotor inmediato del citomegalovirus humano) y el sitio de poliadenilación del gen que codifica la hormona bobina del crecimiento (aIIbgh). Después de la transfección se esperan que se sinteticen dos tipos de transcriptos de ARN, ARNc de sentido positivo con un grupo de trifosfato en su extremo 5' sintetizado por pol I y ARNm de sentido positivo sintetizado por pol II con estructura de remate 5' y una cola poli(A) en su extremo 3'. Ambos elementos del ARNm son necesarios para una traducción eficaz.

Figura 6. También se describe el vector de clonación pHW11 con un promotor de la pol I y pol II dispuesto en tándem. El plásmido contiene el promotor de la ARN pol I humana (plh) de 225-pb y el finalizador murino (tl) de 33-pb. Las secuencias del promotor de la pol I y del finalizador están flanqueadas por el promotor de la ARN polimerasa II (pIICMV) del citomegalovirus humano y la señal de poliadenilación (aIIBGH) del gen que codifica la hormona bobina del crecimiento. Para la inserción de ADNc viral entre el promotor de la pol I y el finalizador, se introdujeron dos sitios (indicados por el subrayado) de restricción BsmBI. La digestión del vector con BsmBI creó un fragmento de vector con extremos sobresalientes cohesivos pero no complementarios. El diseño de este vector permite la fusión precisa de ADNc viral en la orientación de sentido positivo con respecto al promotor de la pol I y a la secuencia del finalizador. Para la propagación en el E. coli, el plásmido tiene un origen de replicación (ori) y para la selección en un medio que contenga ampicilina, el plásmido contiene un gen de beta-lactamasa (bla).

Figuras 7A y 7B. Sistema promotor doble para la generación de virus de ARN infecciosos. Ya que los virus de ARN funcionan como parásitos celulares deben optimizar estrategias para utilizar células anfitrionas para la expresión de su información genética. Todos los virus de ARN deben sintetizar ARNm que sean capaces de trasladarse dentro de las proteínas. Generalmente, se requieren proteínas sintetizadas para la replicación, transcripción y producción de nuevas partículas de virus de progenie. Para una eficaz replicación de los ARN genómicos, deben hacerse transcritos de ARN con extremos 5' y 3' exactos. Entre las figuras 7A y 7B, solamente 7A es parte de la invención.

El presente sistema comprende una unidad de transcripción externa y una unidad de transcripción interna. La unidad de transcripción interna comprende un promotor de la pol I (p(ARN+) o p(ARN-)). Los ADNc de virus de ARN constan de uno o más marcos de lectura abiertos (ORF) que están flanqueados por regiones no codificantes (NCR). Preferiblemente, no hay secuencias que intervengan entre el ADNc viral y el promotor. La carencia de secuencias intervinientes es vital ya que los extremos 5' y 3' del ARNv genómico contienen generalmente secuencias reconocidas por proteínas virales necesarias para la transcripción y la replicación; secuencias adicionales diferentes de las de los virus impiden típicamente el reconocimiento y la replicación eficaz del ARNv por las proteínas virales. La carencia de secuencias intervinientes permite que los transcritos de ARN (A) de cadena (-) o de ARN (B) de cadena (+) sean eficazmente utilizados por las proteínas de polimerasas virales. La unidad de transcripción exterior tiene un promotor de la pol II (p(ARNm)) que dirige la transcripción del ARNm a partir del ADNc; el ARNm incluye secuencias 5' (por ejemplo, remates de metil G) y secuencias 3' (por ejemplo colas poli A) que se necesitan para la iniciación traduccional y la producción de proteínas virales. Ya que el proceso de traducción es tolerante a secuencias adicionales entre el promotor, de la unidad de transcripción externa, y al ADNc viral, la presencia de secuencias intervinientes de la unida de trascripción interna no impide significativamente la traducción del ARNm.

Este sistema puede modificarse y mejorarse para virus de ARN diferentes del virus de la gripe utilizando diferentes elementos de finalización o ribozimas para la síntesis intracelular del ARN viral con extremos exactos 5' y 3' (analizado infra). Pueden emplearse ribozimas de cabeza de martillo o la ribozima del virus de la hepatitis delta (HDV) para la generación de ARN viral con extremos exactos (Schnell y colaboradores, EMBO J. 1994. 13:4195; Pleschka y colaboradores, J. Virol. 1996, 70:4188; Herold y colaboradores, J. Virol 2000, 74(14):6394-400).

En los ejemplos comparativos, la unidad de transcripción puede comprender un promotor de la pol I o de la pol II, un promotor de la ARN polimerasa T7, un promotor de la ARN polimerasa T3, un promotor de la ARN polimerasa SP6 o cualquier otro promotor para una ARN polimerasa dependiente del ADN. Si el promotor en la unidad de transcripción externa dirige la síntesis de un transcrito que carece de remate de metil G, puede colocarse un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) en el extremo 5' de la secuencia de codificación del ADNc para facilitar la iniciación traduccional (analizado infra).

Es digno de mención que el vector pHW2000 tiene un promotor T7 entre el promotor del CMV y el sitio de finalización. Los transcritos de pol II se sintetizan en el núcleo, mientras que los transcritos T7 se sintetizan en el citoplasma de células expresando ARN polimerasa T7. Por lo tanto, pueden producirse transcritos que se originen de más de un promotor de una unidad de transcripción externa, dando como resultado ARNm diferentes. Así, los plásmidos de expresión derivados del pHW2000 permiten la rápida evaluación de sí el promotor de la pol II o de la T7 o la combinación de ambos, es óptima para la síntesis de ARNm de virus de cepa positiva que tengan un sitio interno de entrada de ribosoma (IRES).

Figura 8. También se describe un sistema promotor doble para la generación de virus de ARN de cadena (+). El sistema también puede adaptarse para producir virus que comprendan una cadena positiva, un genoma unimolecular, tal como el virus de la hepatitis C. En esta realización, un ADNc que comprende el genoma del virus de la hepatitis C (aproximadamente 9.500 nucleótidos) está insertado en una construcción que permite una transcripción eficaz del ADNc intracelular en ARNm y ARN negativo de longitud completa (enfoque bidireccional) o ARNm y ARN positivo de longitud completa (enfoque unidireccional). El ADNc consta de un marco de lectura abierto (ORF) que está flanqueado por las regiones no codificantes (NCR). En la figura, se muestra un plásmido de expresión que contiene el sistema bidireccional. El ADNc de longitud completa está insertado entre un promotor de la pol I (pI) y secuencias del finalizador (tI) que dan como resultado la síntesis de ARN de cadena (-) de longitud completa después de la transfección.

La unidad de transcripción interna está flanqueada por una unidad de transcripción externa que tiene un promotor (p(ARNm)) para dirigir la síntesis del ARNm. Preferiblemente, este promotor es un promotor de la pol II. Sin embargo, si el ARN sintetizado tiene un sitio interno de entrada ribosómica (IRES), el promotor de la pol II puede sustituirse por un promotor de la pol I, pol III, SP6, T7 o T3 (el uso de promotores de la T3 o T7 requiere que las proteínas de la polimerasa T3 o T7 se expresen bien mediante cotransfección de un plásmido, que codifique la polimerasa, o bien mediante el uso de una línea celular estable, que exprese la polimerasa. En el extremo 3' de la unidad de transcripción externa, se utiliza bien una señal poli A o bien una secuencia poli A insertada para proporcionar una cola poli A para el ARNm sintetizado.

El ARN resultante se traduce en un precursor de una poliproteína grande que se divide cotraduccionalmente y postraduccionalmente para dar como resultado proteínas estructurales individuales y proteínas no estructurales virales.

Las proteínas no estructurales NS5a y NS5b, que son proteínas de ARN polimerasa dependientes del ARN utilizan el ARN (-) sintetizado por la unidad de transcripción interna como matriz para iniciar el ciclo de replicación/transcripción viral. Así se produce ARN (+), ARNm que se usa para la traducción en proteínas. Finalmente se generan virus infecciosos que contiene ARN (+) junto con proteínas estructurales virales.

Figura 9. También se describe un sistema unidireccional pol I - pol II para la generación del virus paragripal III humano. La presente invención puede utilizarse para producir un virus paragripal III que comprenda una cadena negativa, genoma de ARN unimolecular. El ADNc viral puede insertarse dentro del sistema pol I - pol II en una orientación homosentido o antisentido. En la figura se presenta el sistema unidireccional. El promotor de pol I dirige la síntesis del ARNc y un promotor de la pol II dirige la síntesis del ARNm. En esta realización, el promotor de la pol II produce un ARNm policistrónico a partir del cual el primer marco de lectura abierto se traduce eficientemente en una proteína nucleocápsida (NP). Esta proteína es necesaria para la replicación. Los plásmidos que codifican la proteína L y la proteína P, que son también esenciales para la replicación y transcripción (pero que no se traducen eficientemente a partir del ARNm policistrónico), se preparan y se cotransfectan sobre plásmidos de expresión separados. En comparación con el sistema de genética inversa desarrollado por Durban, A.P. y colaboradores, Virology 1997, 235(2):323-332, el sistema pol I - pol II tiene varias ventajas. Mediante la expresión de la NP a partir del mismo ADNc, este sistema plasmídico mínimo necesita la construcción y transfección de solo tres plásmidos en lugar de cuatro para generar el virus paragripal III humano completamente a partir de ADNc clonado. A diferencia de los sistemas genéticos inversos basados en la transcripción in vivo a partir del promotor de la T7, el sistema pol I - pol II está completamente controlado por las ARN polimerasas dependientes del ADN eurocariótico que se encuentra en cada célula. Además, la infección del virus vacunal que controla la expresión de la ARN polimerasa T7 requiere el uso de células que sean permisivas para el virus vacunal (células HeLa o derivadas tales como las células Hep-2) pero que no son óptimas para el crecimiento del virus paragripal humano (analizado infra), limitando así la utilidad de este enfoque para la generación de virus infecciosos. Los efectos citopáticos graves del virus vacunal y las precauciones de seguridad necesarias para el uso de agentes infecciosos son características no deseables de este sistema. El uso del sistema pol I - pol II elimina el requisito de una infección vírica y permite el uso de células LLC-MK2 para la transfección y el crecimiento del virus paragripal III humano, suministrando así una tecnología para generar virus atenuados de forma más simple y segura.

Figura 10. También se describe un sistema de base plasmídica para la generación de un rotavirus a partir de ADNc clonado. Este sistema puede utilizarse para la generación de virus con genomas de ARN segmentados, de cadena doble (por ejemplo rotavirus) puede aplicarse, por ejemplo, a virus que sean miembros de la familia Reoviridae (10, 11, 12 segmentos de ARNds) o Birmaviridae (2 segmentos de ARNds). Hasta la fecha, no estaban disponibles sistemas genéticos inversos para virus de la familia Reoviridae. Esta figura ilustra cómo pueden generarse rotavirus, que tienen 11 segmentos de ARNds, usando el presente sistema, pero pueden emplearse sistemas generales para miembros del género Orbivirus (10 segmentos ARNds) u Orthoreovirus (12 segmentos de ARNds).

El siguiente análisis ilustra la generación del rotavirus A/SA11 completamente a partir de ADNc clonado. Se ha determinado la totalidad de los 11 segmentos del genoma de ARN de doble cadena del rotavirus de los simios. Los ARNds del genoma son entre 3.302 pb y 663 pb de largo, y el tamaño del genoma completo es de 18.550 pb. Los segmentos del genoma se numeran del 1 al 11 para incrementar la movilidad mediante análisis PAGE (electroforesis de gel de poliacrilamida). Los segmentos están completamente pareados en la base y la cadena de sentido positivo contiene una estructura de remate de terminal 5' (m7GpppGmGPy), pero no tiene una señal de poliadenilación cerca de su extremo 3'. Todos los segmentos genómicos comparten terminales 5' y 3' de corta conservación con un consenso de 10 nucleótidos en el extremo 5' y un consenso de 8 nucleótidos en el extremo 3'. En la parte inmediatamente interna a estas regiones, en cada gen, hay una segunda región de conservación de al menos 30-40 nucleótidos que son específicos del segmento. Las regiones no traducidas (NTR) 5' varían en longitud pero todas son inferiores a 50 nucleótidos y en todos los segmentos las NTR están seguidas por al menos un marco de lectura abierto largo después del primer AUG. Los segmentos 9 y 11 codifican dos proteínas. Las NTR 3' varían en longitud oscilando entre 17 NTS (segmento 1) a 182 NTS (segmento 10).

El ADNc del rotavirus se clona en un sistema promotor doble, preferiblemente un sistema pol I - pol II. Después de la transfección de los plásmidos resultantes dentro de una célula anfitriona adecuada, se producen ARN virales y proteínas que dan como resultado la formación de un rotavirus infeccioso. También se describe un sistema de transcripción unidireccional usado para producir rotavirus. Usando este enfoque se obtiene la síntesis intracelular de 11 moléculas de ARN (+) del genoma rotaviral que tienen trifosfatos en sus terminales 5'. La expresión del ARNm similar al del virus da como resultado la expresión de proteínas virales. La proteína viral VP3 (Cap), que tiene una actividad de guanililtransferasa y metiltransferasa, cataliza la adición de estructuras de remate 5' a la totalidad de los 11 ARN (+) rotavirales (Chen D. y colaboradores, Virology 1999, 265:120-130). En efecto, previamente se ha demostrado que la VP4 (Cap) purificada, una análoga de VP3 (Cap) retroviral del virus de la lengua azul (BTV), puede añadir estructuras de remate a un ARN (+) similar al vírico in vitro (Ramadevi N. y colaboradores. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998, 95(23):13537-42). Se anticipa que la transcripción in vivo de ADNc y la expresión de la proteína VP3 (Cap) intracelularmente da como resultado la generación de ARN desprovistos de remate para la totalidad de los 11 segmentos genómicos retrovirales. Esos ARNm se traducen en proteínas virales o se empaquetan dentro del prenúcleo-RI. Después de la formación de partículas de VP6 (T13-RI), el ARNm de sentido positivo se utiliza como matriz para la síntesis de ARN (-). Finalmente, la adición de VP4 y VP7 durante la morfogénesis da como resultado viriones de progenie infecciosos.

Ya que la iniciación eficaz de la replicación y la morfogénesis puede depender de la concentración óptima de cada una de las proteínas virales, puede ser ventajoso generar plásmidos separados para la síntesis de ARN y para la expresión proteica. Sin embargo, ya que el nivel de expresión proteica puede optimizarse variando la cantidad de plásmidos en la célula anfitriona o mediante el uso de diferentes promotores para la síntesis del ARNm, probablemente no será necesario el uso de dos plásmidos para un segmento en la mayoría de los genes. Ya que el ARN (+) se sintetiza a partir de ARN (-), la expresión intracelular de ARN (-) y de proteína puede dar como resultado la generación de unidades competentes para la replicación que produzcan ARNm viral. Así, el sistema promotor doble permite el establecimiento de un sistema plasmídico mínimo que comprende un número de plásmidos significativamente menor que los 22 que sería necesarios si el ARN y la proteína que expresan los plásmidos estuvieran sobre plásmidos separados. La generación rotaviral puede realizarse de forma similar a la utilizada para producir el virus de la gripe A.

Figuras 11A-D. También se describe la replicación y síntesis de ARNm de genomas de virus de ARN.

(A)

Los ARNm se sintetizan mediante proteínas de polimerasa viral durante la infección de virus de cepa (-): uno o dos ARNm para virus de ARN segmentado o múltiples ARNm para virus con genomas unimoleculares. Los mecanismos antifinalización dan como resultado la síntesis de cadenas (+) de longitud completa que pueden copiarse dentro del ARN genómico (-).

(B)

Los genomas segmentados de los virus de ARN ambisentido son copiados para formar un ARNm; se sintetiza un segundo ARN a partir del complemento.

(C)

En células infectadas con virus de ARN de cadena doble, los ARNm sintetizados en primer lugar pueden ser traducidos en proteína o servir como matrices para la síntesis de cadenas (-), dando como resultado ARN genómico de cadena doble.

(D)

Para virus de cadena (+), el ARN genómico es también un ARNm y se copia en un ARN de cadena (-), que puede copiarse en ARN genómico (+). Los ARNm de algunos virus de ARN (+) no contienen una cola poli A. En algunas familias se producen uno o más ARN subgenómicos.

Descripción detallada

El ciclo de vida de todos los virus de ARN incluye la síntesis de ARN y el ensamblaje de partículas de virus después de la síntesis de proteínas; estas funciones suministran una estructura conceptual para los sistemas genéticos inversos de la presente invención y también se describen otros sistemas en lo que sigue que pueden utilizarse para producir virus de ARN a partir de ADNc clonado. La presente invención y otros sistemas también descritos en lo que sigue, simplifican y mejoran los sistemas genéticos inversos actualmente disponibles estableciendo un sistema promotor doble para la producción de virus segmentados de cadena negativa (por ejemplo gripe A, gripe B, Bunyaviridae), virus de ARN de cadena negativa no segmentados (por ejemplo, Paramyxoviridae, Mononegavirales), virus de ARN de doble cadena (por ejemplo, Reoviridae, Birnaviridae) y virus de ARN de cadena positiva (por ejemplo, Flaviviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Togaviridae). Ya que el sistema de la presente invención utiliza un ADNc viral simple tanto para la síntesis de proteínas como para la síntesis de ADN genómico, este sistema reduce el número de plásmidos requeridos para la producción de virus y permite el desarrollo de vacunas de forma rápida y barata.

Si se tiene que producir un virus que comprenda un genoma de ARN segmentado usando la presente invención, se inserta un ADNc viral que se corresponde con cada gen en el genoma diana dentro de un plásmido de expresión de la invención. La invención comprende un sistema de expresión basado en plásmidos bidireccionales en el que un ADNc viral está insertado entre un promotor de la ARN polimerasa I (pol I) y secuencias del finalizador (unidad de transcripción interna). Esta unidad completa de transcripción de la pol I está flanqueada por un promotor de la ADN polimerasa II (pol II) y un sitio de poliadenilación (unidad de transcripción externa). También se describe un sistema unidireccional, en el cual los promotores de la pol I y de la pol II están cadena arriba del ADNc y producen ARNc de sentido positivo desprovisto de remate (a partir del promotor de la pol I) y ARNm de sentido positivo provisto de remate (a partir del promotor de la pol II). El promotor de la pol I, la secuencia del finalizador de la pol I, el promotor de la pol II y la señal de poliadenilación en el sistema unidireccional puede decirse que comprenden una "orientación de arriba a abajo". En el sistema bidireccional de la presente invención, los promotores de la pol I y de la pol II están sobre lados opuestos del ADNc en el que el promotor de la pol II situado cadena arriba produce ARNm de sentido positivo provisto de remate y un promotor de la pol I situado cadena abajo produce el ARN viral de sentido negativo desprovisto de remate (ARNv). Estos sistemas pol I - pol II comienzan con la iniciación de la transcripción de las dos enzimas de la ARN polimerasa celular a partir de sus propios promotores, presumiblemente en compartimentos diferentes del núcleo. El promotor de la pol I y la secuencia del finalizador de la pol I en el sistema bidireccional puede decirse que comprenden una "orientación de abajo a arriba" mientras que el promotor de la pol II y la señal de poliadenilación en el sistema bidireccional puede decirse que comprenden una "orientación de arriba a abajo".

Si el virus diana comprende una cadena positiva, genoma de ARN segmentado, un promotor de la pol I está, preferiblemente, situado cadena arriba del ADNc en la unidad de transcripción interna (sistema unidireccional). En este caso se genera ARN de cadena positiva para su incorporación directa dentro de nuevos virus. Sin embargo, cuando los virus diana comprenden genomas de ARN segmentados de cadena negativa se producen utilizando el sistema unidireccional.

Si el virus diana comprende un genoma de ARN segmentado de cadena negativa, el promotor de la pol I está, preferiblemente, situado cadena abajo del ADNc en la unidad de transcripción interna (sistema bidireccional). En esta realización se generan ARN de cadena negativa para su incorporación directa dentro de nuevos virus. También se describe que los virus diana que comprenden genomas de ARN segmentados de cadena positiva se producen con el sistema bidireccional.

La presente invención también puede usarse para producir virus que comprendan genomas de ARN de cadena negativa no infectados no infecciosos. En general, la introducción simple de ARN genómico viral infeccioso dentro de una célula anfitriona es suficiente para provocar la iniciación del ciclo de vida viral dentro de la célula y la eventual producción de virus completos. Por ejemplo, la introducción simple de ARN genómico picornaviral dentro de una célula anfitriona es suficiente para provocar la generación de picornavirus completos. La iniciación del ciclo de vida de un virus que comprenda ARN genómico no infeccioso, típicamente, requiere la introducción adicional de otras proteínas virales que son transportadas habitualmente dentro de la partícula viral junto con el genoma. Por ejemplo, el virus paragripal III lleva ARN polimerasa dependiente del ARN cuya presencia es necesaria dentro de la célula anfitriona recientemente infectada para la iniciación de la replicación del ARN genómico viral y la transcripción de los ARNm virales; en la ausencia de polimerasa, el ARN genómico del paragripal III no es infeccioso. En realizaciones de la presente invención en las que se generan virus que comprenden ARN genómicos de cadena negativa no segmentados e infecciosos, la introducción simple de un plásmido de expresión dual de la invención, que lleva un ácido nucleico que incluye el genoma viral, dentro de una célula anfitriona adecuada es suficiente para provocar la generación de virus completos. En realizaciones en las que se generan virus que comprenden ARN genómico no segmentado no infeccioso, los plásmidos de expresión adicionales también puede que tengan que ser introducidos dentro de una célula anfitriona junto con el plásmido de expresión dual que lleva el genoma viral. El plásmido adicional debe expresar las proteínas necesarias para la iniciación del ciclo de vida viral que normalmente se introducen dentro de la célula anfitriona después de la infección (por ejemplo, las ARN polimerasa dependientes del ARN).

En el caso de que se haya producido el picornavirus, que comprende un genoma de ARN infeccioso de cadena positiva no segmentada, se inserta el ADNc que comprende el genoma viral completo dentro de un plásmido de expresión de un promotor dual de la invención. Un promotor cadena arriba en una unidad de transcripción externa, preferiblemente, un promotor de la pol II, dirige la producción de un ARNm de cadena positiva que comprende un genoma viral completo -una poliproteína se traduce a partir del ARNm y proteínas individuales se dividen y se libran de la poliproteína (por ejemplo, mediante una proteasa dentro de la poliproteína). Si el genoma viral comprendía ARN de cadena negativa, un segundo promotor cadena abajo, en una unidad de transcripción interna (sistema bidireccional), preferiblemente de la pol I, dirigiría la producción de una copia de cadena negativa del genoma. También se describen casos en los que se producen virus de ARN no segmentado de cadena positiva usando el sistema bidireccional.

Con la presente invención también pueden generarse virus que comprenden genomas de ARN infeccioso de cadena negativa no segmentada en los que no se produce una poliproteína. Por ejemplo, el presente sistema puede utilizarse para producir virus rhabdoviridae o paramyxoviridae, preferiblemente el virus paragripal III cuyo ciclo de vida normalmente incluye la producción de múltiples ARNm monocistrónicos a partir de ARN genómico de cadena negativa mediante ARN polimerasa dependiente del ARN víricamente derivado; las proteínas individuales se expresan a partir de los ARNm monocistrónicos. En estas realizaciones, una unidad de transcripción externa que comprende un promotor de la pol II dirige la producción de una copia policistrónica de cadena positiva del genoma viral a partir del cual, generalmente, se traduce solamente el primer gen (NP). Adicionalmente, una unidad de transcripción interna que comprende un promotor de la pol I dirige la expresión de una copia del ARN del genoma para su incorporación dentro de nuevos virus. Ya que el genoma viral paragripal III comprende ARN de cadena negativa, el promotor de la unidad de transcripción interna se sitúa cadena abajo del ADNc (sistema bidireccional). Si el genoma viral comprende ARN de cadena positiva, el promotor de la unidad de transcripción interna se describe como situado cadena arriba del ADNc (sistema unidireccional). Se describen casos en los que se producen virus que comprenden un genoma de ARN de cadena positiva usando el sistema bidireccional. Se requieren proteínas virales adicionales (diferentes de la proteína expresada a partir del ARNm policistrónico) para la transcripción y replicación viral (L y P) y estas proteínas son suministradas de forma individual sobre plásmidos de expresión separados.

También se describen casos en los que se generan virus que comprenden genomas de ARN segmentados de doble cadena. En estos casos, se inserta un plásmido que comprende cada gen en el genoma viral diana dentro de un plásmido de expresión del promotor doble. El plásmido es un plásmido bidireccional. Un promotor en una unidad de transcripción externa, preferiblemente un promotor de la pol II, dirige la expresión de un transcrito de ARNm de cada gen que se traduce en la proteína codificada. Un promotor en una unidad de transcripción interna, preferiblemente un promotor de la pol I, dirige la transcripción de una cadena negativa (sistema bidireccional). Subsiguientemente, la primera cadena que se produce puede actuar como matriz para la producción de la cadena complementaria mediante la ARN polimerasa viral. El producto resultante de ARN de doble cadena se incorpora en los nuevos virus.

La recuperación de dos virus de la gripe A, a partir de un sistema mínimo de base plasmídica, A/WSN/33 (H1N1) y A/Teal/HK/W312/97 (H6N1), estableció la utilidad de este sistema. La recuperación de una cepa fenotípicamente indistinguible A/PR/8/34 (H1N1), que es el estándar para la producción de la vacuna de la gripe A inactivada, estableció la utilidad de este sistema para el desarrollo de vacunas. Setenta y dos horas después de la de la transfección de ocho plásmidos de expresión en células 293T y MDCK cocultivadas, el virus producido en el sobrenadante de las células transfectadas estaban entre 2 x 10^{5} y 2 x 10^{7} virus infecciosos por mililitro. Este sistema de ocho plásmidos también se usó para generar virus de reordenamiento simple y cuádruple entre A/Teal/HK/W312/97 (H6N1) y A/WSN/33 (H1N1) y para generar virus A/WSN/33 a partir de un sistema orientado en tándem (que produce ARNc y ARNm).

Ya que el sistema pol I y pol II facilita el diseño y la recuperación de virus de la gripe A tanto recombinantes como de reordenamiento, también puede aplicarse a la recuperación de otros virus de ARN completamente a partir de ADNc clonado. Aunque se prefiere ADNc para su uso en la presente invención, puede ser útil cualquier otro tipo de ácido nucleico que codifique un gen viral que tenga que ser expresado, si se conservan los elementos esenciales de la invención. Por ejemplo, pueden utilizarse productos amplificados de la PCR o fragmentos de restricción que comprendan genes virales. Además, los genes expresados en el sistema de base plasmídica de la invención pueden fundirse o marcarse con otros genes como marcas de purificación/detección (por ejemplo, glutation-S transferasa, polihistidina, proteína fluorescente verde, marcas myc y marcas FLAG). La presente invención también anticipa realizaciones en las que se utilizan secuencias parciales de gen en plásmidos del presente sistema.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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La presente tabla incluye una lista no limitativa de virus de ARN de cadena negativa que pueden producirse usando la presente invención:

1

La presente invención se basa además, en parte, en el desarrollo de una construcción de transcripción bidireccional que contiene ADNc viral que codifica PB2, PB1, PA, HA, NP, NA M o NS flanqueadas por un promotor de la ARN polimerasa I (pol I) para la síntesis de ARNv y un promotor de la ARN polimerasa II (pol II) para la síntesis de ARNm viral. La utilidad de este enfoque está probada por la generación de virus después de transfectar la construcción de pol I/pol II -promotor - PB1 junto con ARNv- y construcciones de expresión de proteínas para los siete segmentos restantes. Ya que este enfoque reduce el número de plásmidos requeridos para la generación de virus, también se reduce el trabajo necesario para la clonación, se mejora la eficacia de la generación de virus y expande el uso del sistema de genética inversa a líneas celulares para las cuales no se podía conseguir una cotransfección eficaz con diecisiete plásmidos. También se describe una construcción transcripcional unidireccional que comprende promotores de la pol I y de la pol II situados cadena arriba de una secuencia de codificación de ADNc viral. Ambos promotores están en una orientación común de arriba a abajo en relación con el gen. Aunque el sistema bidireccional produce un mayor título viral de gripe A, el sistema unidireccional es útil para otras aplicaciones (por ejemplo la producción de cepas virales de cadena negativa).

Un promotor, finalizador o señal de poliadenilación está "cadena arriba" de un gen sí está próximo al inicio del gen (por ejemplo, el primer codón) y distal del final del gen (por ejemplo, el codón de finalización). Un promotor, finalizador o señal de poliadenilación está "cadena abajo" de un gen si está próximo al final del gen y distal del inicio del gen. Los promotores en los plásmidos de la invención, que están funcionalmente asociados con un gen, están orientados de forma que promuevan la transcripción de una cadena homosentido o antisentido del gen.

Según aquí se usa "plásmido de expresión" es un vector de ADN que comprende una "unidad de transcripción interna" y una "unidad de transcripción externa". Tal como se analizó anteriormente, los plásmidos de expresión pueden utilizarse para generar cualquier tipo de virus de ARN, preferiblemente virus de ARN de cadena positiva o negativa, virus de ARN de genoma segmentado o no segmentado o virus de ARN de cadena doble. La unidad de transcripción externa comprende un promotor, preferiblemente un promotor de la pol II, que dirige la transcripción, a partir de un ADNc viral, de un ARNm que es traducible. La unidad de transcripción externa puede comprender un promotor de la ARN polimerasa T7, un promotor de la ARN polimerasa T3, un promotor de la ARN polimerasa SP6 o cualquier promotor o combinación de elementos genéticos capaz de controlar la expresión de un producto de ARN traducible. Por ejemplo, la unidad de transcripción exterior puede comprender un promotor de la pol I o de la pol II si el promotor de ADNc viral, que tiene que expresarse a partir del plásmido, está genéticamente modificado para incluir una señal de poliadenilación en el extremo 3' del ARN transcrito. Esto puede realizarse insertando una cadena de nucleótidos A en el extremo 3' del ADNc que codifica la secuencia inmediatamente antes del codón de terminación. Además, el ADNc viral puede ser genéticamente modificado para incluir un sitio interno de entrada ribosomal (IRES) en el extremo 5' del ADNc para facilitar la iniciación traduccional a partir del ARN transcrito. Una "unidad de transcripción interna" de los plásmidos de expresión de la invención se sitúa dentro de la unidad de transcripción externa y comprende un promotor, preferiblemente un promotor de la pol I, que puede dirigir la transcripción de un ADNc viral que puede ser replicado por la maquinaria viral e incorporarse dentro de los nuevos virus. Preferiblemente, el promotor de la unidad de transcripción interna transcribe ARN que no comprenda un exceso de secuencias extrañas no víricas en los extremos 5' y 3', preferiblemente mediante fusión precisa de ADNc viral con el promotor de la pol I y las secuencias del finalizador. Sin embargo, la invención incluye realizaciones en las que la unidad de transcripción interna comprende un promotor que no dirige la producción de transcritos de ARN que comprendan promotores de secuencias adicionales no víricas (por ejemplo, promotores de la pol II, promotores de la pol III, promotor de la ARN polimerasa T7, promotores de la ARN polimerasa T3 o promotores de la ARN polimerasa SP6). En estas realizaciones, pueden incluirse secuencias adicionales en el plásmido de expresión que aseguran que el ARN que se produce a partir de la unidad de transcripción interna no incluya una secuencia no vírica extra. Por ejemplo, la expresión del plásmido puede modificarse genéticamente para incluir secuencias ribozomales en los extremos de los transcritos producidos a partir de la unidad de transcripción interna donde las partes ribozomales del ARN transcrito dividen el transcrito de forma tal que las secuencias de los terminales 5' y 3' de los ARN se generen tal como se encuentran en el ARN del virus. Además, los plásmidos de expresión pueden modificarse genéticamente para incluir secuencias del finalizador que provoquen la finalización transcripcional en el extremo del ADNc viral que codifica la secuencia evitando así la incorporación de un exceso de secuencias no traducibles en el extremo 3' del ARN transcrito. Preferiblemente, un "plásmido de expresión" es un vector de ADN que emplea el sistema pol I - pol II. Así, dicho plásmido comprende un promotor de la ARN polimerasa I (pol I) y secuencias del finalizador de la pol I, que se insertan entre un promotor de la ARN polimerasa II (pol II) y una señal de poliadenilación. En el sistema bidireccional, un promotor de la ARN polimerasa I controla la expresión del ARN genómico de sentido negativo desprovisto de remate (denominado aquí "ARNv") del ADNc que se inserta en una orientación "antisentido" entre el promotor y el finalizador. Un promotor de la ARN polimerasa II controla la expresión del ARN mensajero; un segmento de ADNc de un gen vírico insertado en una orientación "homosentido" entre el promotor de la pol II y la señal de poliadenilación da como resultado la expresión de ARNm viral de sentido positivo y provisto de remate. En el sistema unidireccional, que aquí se describe, el ADNc viral se inserta cadena abajo de los promotores de la pol I y de la pol II en una orientación homosentido. El promotor de la pol II controla la expresión del ARNm viral de sentido positivo provisto de remate y el promotor de la pol I controla la expresión de ARNc viral de sentido positivo desprovisto de remate.

Un plásmido puede comprender "esencialmente la totalidad" de otro plásmido de base si todos los genes y regiones funcionales no codificantes del plásmido de base están presentes. Por ejemplo, un plásmido construido mediante la mera eliminación de una parte de un polienlazador y la inserción de un gen extraño comprende esencialmente la totalidad del plásmido de base.

Un "virus de ARN de cadena negativa" es un virus en el cual el genoma viral comprende ARN de cadena negativa. El ARN de cadena negativa es complementario del ARNm y, generalmente, debe copiarse dentro del ARNm complementario de cadena positiva para la traducción de proteínas. Típicamente, estos virus empaquetan una ARN polimerasa que depende del ARN para la producción de ARNm después de la infección de la célula anfitriona. Las familias de virus de ARN de cadena negativa incluyen, aunque no en sentido limitativo, Orthomyxoviridae, Arenaviridae y Bunyaviridae. Preferiblemente, el genoma viral es de un virus que es un miembro de la familia de virus Orthomyxoviridae, y óptimamente tiene un genoma segmentado. Miembros de la familia de virus Orthomyxoviridae incluyen, aunque no en sentido limitativo, la gripe A, la gripe B, la gripe C, el Thogotovirus, los virus del sarampión y de las paperas (Paramyxovirus) o el virus de la rabia (Rhabdovirus).

Un "virus de ARN de cadena positiva" es un virus que comprende un genoma de ARN de cadena positiva. Ejemplos de virus de ARN de cadena positiva incluyen el virus de la polio (Picomavirus), los Togavirus y los Flavivirus. El ARN genómico de estos virus es del mismo sentido que el del ARNm y puede funcionar como ARNm. Estos virus pueden comprender un genoma segmentado o no segmentado.

Un "virus de ARN de cadena doble" comprende un genoma de ARN de cadena doble. Los reovirus son virus de ARN de doble cadena.

Un genoma viral puede también ser segmentado o no segmentado (unimolecular). Un genoma segmentado comprende dos o más ácidos nucleicos cada uno de los cuales codifica uno o más genes virales. Preferiblemente, un genoma segmentado comprende un ácido nucleico separado para cada gen viral. Los Orthomyxovirus (virus de la gripe A, la gripe B, la gripe C), los Bunyavirus y Arenavirus comprenden genomas de ARN segmentados. Un genoma no segmentado comprende un ácido nucleico simple que comprende cada gen viral. Los virus Mononegavirales, los Rhabdovirus, los virus Flaviviridae, los virus Picornaviridae, los virus Coronaviridae, los virus Togaviridae y los Paramyxovirus comprenden un genoma de ARN no segmentado.

Los ARN de cadena doble pueden abreviarse como "ARNds". Los ARN de cadena simple pueden abreviarse como "ARNss". Los ARN de cadena negativa simple pueden abreviarse como "ARNss-". Los ARN de cadena simple positiva pueden abreviarse como "ARNss+".

Un "segmento de gen viral" es, preferiblemente, un ADNc clonado que se corresponde con una molécula de ARN genómico de un genoma de un virus de ARN. Este término puede incluir también cualquier gen o segmento de gen (por ejemplo, un producto de la PCR o fragmento de restricción) que comprenda un gen derivado de un virus de ARN.

Un "sistema mínimo de base plasmídica" es un sistema en el cual hay un plásmido de expresión, según se definió anteriormente, que contiene cada segmento genómico viral autónomo de un virus de ARN. Así, el número total de plásmidos que contienen secuencias genómicas virales no excederá del número total de segmentos de gen del virus de ARN fuente. La invención incluye realizaciones en las que otros plásmidos, que no contienen secuencias virales, pueden cotransfectarse opcionalmente dentro de las células anfitrionas. Esto suministra ventajas significativas, limitando el número notal de plásmidos necesarios para establecer el sistema en una célula anfitriona, eliminando la necesidad de virus auxiliares, eliminando la necesidad de un proceso de selección y permitiendo la generación eficaz de virus de reordenamiento.

Ciertos genes virales en un sistema mínimo de base plasmídica de la invención pueden ser de una cepa viral bien adaptada a crecer en un cultivo celular, tal como la cepa PR/8/34 (H1N1) o WSN/33 (H1N1), o de una cepa atenuada, tal como la A/Ann Arbor/6/60 (H2N2), o para la gripe la B/Ann Arbor/1/66. Preferiblemente, una cepa atenuada está también perfectamente adaptada para el crecimiento en un cultivo celular. En particular, para la gripe A, se prefieren segmentos de un gen viral en el sistema de base plasmídica que codifique las proteínas del complejo de polimerasa viral, las proteínas M y/o las proteínas NS de una cepa bien adaptada a crecer en un cultivo celular o de una cepa atenuada, o de ambas. Estas proteínas se denominan en lo que sigue "proteínas internas virales" o "no glicoproteína" viral.

El genoma del virus de la gripe A codifica típicamente diez proteínas diferentes: PB2, que se cree que es una transcriptasa, PB1, que se cree que es una transcriptasa, PA que se cree que es una transcriptasa, HA, que se cree que es una hemaglutinina, NP, que se cree que es una nucleoproteína de unión del ARN, NA, que se cree que es neuraminidasa, M1/M2, que se cree que son una proteína de matriz y una proteína de membrana integral, respectivamente y NS1/NS2, que se cree que son proteínas no estructurales que pueden afectar al procesamiento y transporte del ARN. PB1, PB2, NP y PA que se cree que son parte del complejo de polimerasa transcripcional del virus de la gripe.

El término "cultivo celular" tal como aquí se utiliza se refiere preferiblemente a un procedimiento comercialmente aceptable para propagar el virus para la producción de vacunas, por ejemplo en huevos de gallina embrionados, así como un cultivo in vitro en una célula anfitriona (véase Furminger, In: Nicholson, Webster y May (eds.), Textbook of Influenza, Capítulo 24, pag. 324-332, particularmente las pag. 328-329).

Similarmente, el sistema de base plasmídica incorporará segmentos de gen para antígenos necesarios para producir una respuesta inmunológica protectora. Una "respuesta inmunológica protectora" comprende un componente humoral (anticuerpo) o celular, o ambos, efectivo para eliminar viriones y células infectadas en un sujeto inmunizado (vacunado). Así, la respuesta protectora inmune puede evitar o resolver una infección de un virus, por ejemplo de la gripe. Preferiblemente, los antígenos son "antígenos superficiales", es decir, expresados sobre la superficie del virión o sobre la superficie de las células infectadas. Más preferiblemente, los antígenos superficiales son glicoproteínas. Para la gripe, los antígenos gliprotéicos primarios son la hemaglutinina (HA o H) y la neuraminidasa (NA o N).

Tal como aquí se usa, el término "inmunogénico" significa que el polipéptido es capaz de provocar una respuesta inmune humoral o celular, y preferiblemente ambas. Una entidad inmunogénica es también antigénica. Una composición inmunogénica es una composición que provoca una respuesta inmune humoral o celular, o ambas, cuando se administra a un animal. Una molécula es "antigénica" cuando es capaz de interactuar específicamente con una molécula de reconocimiento de antígenos del sistema inmune, tal como un receptor del antígeno de una inmunoglobulina (anticuerpo) o de las células T. Un polipéptido antigénico contiene un epítopo de al menos aproximadamente 5 y preferiblemente al menos, aproximadamente 10 aminoácidos. Una parte antigénica de un polipéptido, también denominada aquí el epítopo, puede ser esa parte que es inmunodominante para el reconocimiento del receptor de anticuerpos o de las células T, o puede ser una parte usada para generar un anticuerpo para la molécula conjugando la parte antigénica con un polipéptido portador para la inmunización. Una molécula que es antigénica no necesita ser en si misma inmunogénica, es decir, capaz de producir una respuesta inmune sin un portador.

El término "cepa de virus patógeno" se usa aquí para referirse a cualquier cepa de virus que sea capaz de provocar una enfermedad; preferiblemente el virus consta en las actuales listas de la Organización Mundial de la Salud (WHO), Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC), u otras autoridades sanitarias, o los virus circulantes similares. Dichos virus pueden incluir miembros de la familia del virus de la hepatitis, de la familia del reovirus, de la familia del orthomyxovirus, de la familia del paramyxovirus, de la familia filoviridae, de la familia bornaviridae, de la familia bunyaviridae, de la familia arenaviridae, de la familia coronaviridae, de la familia del virus de la polio o de la familia del rhabdovirus. La invención facilita de forma ventajosa la inserción de genes para los antígenos primarios de dichas cepas dentro de un sistema de base plasmídica, en donde los genes virales restantes tienen características deseadas de cultivo y/o atenuación, facilitando así la producción de cantidades de virus de las características antigénicas adecuadas para la producción de vacunas. Por ejemplo, los genes del paramyxovirus, del virus paragripal III humano (gen de nucleocápsida, gen fosfoprotéico, gen de matriz, gen de fusión, gen de la proteína hemaglutinina - neuraminidasa y gen largo) pueden colocarse de forma adecuada en plásmidos de la invención para la producción de viriones del virus paragripal III.

Así, un virus de "reordenamiento" preferido de la invención es un virus en el cual los segmentos de gen que codifican las proteínas antigénicas de una cepa patógena del virus se combinan con segmentos de gen que codifican un complejo de polimerasa viral u otros genes similares (por ejemplo, genes no glicoproteicos, incluyendo genes M y NS) de virus adaptados para su crecimiento en cultivo (o virus atenuados). El virus de reordenamiento que lleva la característica antigénica deseada en un entorno que permite una producción eficaz en una célula anfitriona, según se describió anteriormente. Dicho virus de reordenamiento es una "semilla de virus" deseable para producción de viriones para producir vacunas (véase Furminger, supra).

El término "célula anfitriona" se refiere a cualquier célula o cualquier organismo que sea seleccionado, modificado, transformado, cultivado o usado o manipulado de cualquier forma, para la producción de viriones de ARN recombinante, preferiblemente viriones de ARN segmentado de cadena negativa, mediante la célula. Células anfitrionas ejemplares incluyen, pero en sentido limitativo, las células del riñón canino de Madin-Darby (MDCK), las células VERO, las células CV1, las células COS-1 y COS-7, las células BHK-1, como ejemplo y no a modo de limitación. En una realización específica, se prefiere un cocultivo transitorio para la producción de viriones. El cocultivo permite la transfección eficaz de una célula receptora, tal como una célula 293T, con la infección subsiguiente de una célula permisiva para el crecimiento viral, tal como una célula MDCK.

El término "viriones de virus de ARN" se refiere a las partículas virales, que cuando se producen en principio son completamente infecciosas, de células anfitrionas transfectadas o cotransfectadas con un sistema de base plasmídica de la invención. Dicho sistema produce ARNv y proteínas virales (a partir de la traducción del ARNm viral) dando como resultado un ensamblaje de partículas virales infecciosas (viriones).

Según aquí se utiliza, una "vacuna específica para un virus de ARN" es una composición que puede provocar inmunidad protectora frente un virus de ARN cuando se administra a un sujeto. El término "vacuna" se refiere a una composición que contiene virus, virus inactivados, virus atenuados, virus divididos o una proteína viral, es decir, un antígeno superficial, que pueda utilizarse para provocar inmunidad protectora en un receptor (véase Furminger, supra). Debe observarse que para ser efectiva, una vacuna de la invención puede provocar inmunidad en una parte de la población, mientras que en algunos individuos puede fallar en el ensamblaje de una respuesta inmune robusta o protectora, o, en algunos casos, no se provoca ninguna respuesta inmune. Esta incapacidad puede provenir del entorno genético de los individuos o a causa de una condición de inmunodeficiencia (bien adquirida o congénita) o a causa de la inmunosupresión (por ejemplo, el tratamiento con medicamentos inmunosupresores para evitar el rechazo de órganos o suprimir una condición autoinmune). La eficacia debe establecerse en modelos animales.

Una "dosis protectora" de una vacuna es una cantidad, sola o en conjunción con un coadyuvante, efectiva para provocar una respuesta inmune protectora en un sujeto receptor. La protección también puede depender de la forma de administración, por ejemplo intramuscular (preferida para una vacuna inactivada) o intranasal (preferida para una vacuna atenuada).

El término "sujeto" tal como aquí se utiliza se refiere a un animal que soporta una infección de un virus de ARN, incluyendo, pero no en sentido limitativo, aves acuáticas, gallinas, cerdos y humanos. En particular, el término se refiere a un humano.

Un "coadyuvante" es una molécula o una composición que potencia la respuesta inmune a un inmunógeno. Un coadyuvante es "aceptable para su uso en un humano" cuando es farmacéuticamente aceptable, tal como se define más adelante. Ejemplos de coadyuvantes se proporcionan más adelante.

Según se usa aquí, el término "aislado" significa que el material referenciado se saca de su entorno nativo, por ejemplo una célula. Así, un material biológico aislado puede estar libre de algunos o de todos los componentes celulares, es decir, componentes de las células en las cuales el material nativo se produce de forma natural (por ejemplo, un componente citoplasmático de membrana). Un material se presumirá aislado si está presente en un extracto celular o sobrenadante. En el caso de moléculas de ácido nucleico, un ácido nucleico aislado incluye un ARNm aislado, un ADNc o un fragmento de restricción. En otra realización, un ácido nucleico aislado está preferiblemente escindido del cromosoma en el cual puede encontrarse y más preferiblemente ya no está unido o próximo a las regiones no codificantes (pero puede estar unido a sus regiones reguladores nativas o a sus partes) o a otros genes, situado cadena arriba o cadena abajo del gen contenido por la molécula del ácido nucleico aislado cuando se encuentra en el cromosoma. En otra realización adicional, el ácido nucleico aislado carece de uno o más intrones. Las moléculas de ácido nucleico aislado incluyen secuencias insertadas dentro de plásmidos, cósmidos, cromosomas artificiales y similares, es decir cuando forma parte de una construcción de ácido nucleico recombinante quimérico. Así, en una realización específica, el ácido nucleico recombinante es un ácido nucleico aislado. Una proteína aislada puede estar asociada con otras proteínas o ácidos nucleicos, o con ambos, con los cuales se asocia en la célula, o con membranas celulares si es una proteína asociada a la membrana. Una organela, célula o tejido aislado se saca de la zona anatómica en la cual se encuentra en un organismo. Un material aislado puede estar, aunque no necesariamente, purificado.

El término "purificado" según se usa aquí, se refiere al material que ha sido aislado bajo condiciones que reducen o eliminan la presencia de materiales no relacionados, es decir contaminantes, incluyendo materiales nativos a partir de los cuales se obtuvo el material. Un virión purificado está preferiblemente substancialmente libre de componentes de las células anfitrionas o del cultivo, incluyendo el cultivo celular, o de las proteínas del huevo, patógenos no específicos y similares. Según aquí se utiliza, el término "substancialmente libre" se utiliza operacionalmente, en el contexto de la comprobación analítica del material. Preferiblemente, un material purificado substancialmente libre de contaminantes es al menos un 50% puro; más preferiblemente al menos un 90% puro y más preferiblemente aun al menos un 99% puro. La pureza puede evaluarse mediante cromatografía, electroforesis de gen, inmunoensayo, análisis de la composición, ensayo biológico y otros procedimientos conocidos en la técnica.

Los procedimientos de purificación son bien conocidos en la técnica. Las partículas virales pueden purificarse mediante ultrafiltrado o ultracentrifugación, preferiblemente centrifugación continua (véase Furminger, supra). Otros procedimientos de purificación son posibles y están aquí contemplados. Un material purificado puede contener menos de aproximadamente un 50%, preferiblemente menos de aproximadamente un 75% y más preferiblemente menos de aproximadamente un 90% de componentes celulares, medio, proteínas u otros componentes o impurezas no deseables, como lo requiera el contexto, con los cuales estaba originalmente asociado. El término "substancialmente puro", indica el mayor grado de pureza que puede conseguirse usando técnicas de purificación convencionales conocidas en las técnica. En una realización específica, el término "aproximadamente" significa dentro de un 20%, preferiblemente dentro de un 10% y más preferiblemente dentro de un 5% de un valor o banda dados. Alternativamente, en términos logarítmicos usados en biología, el término "aproximadamente" puede significar dentro de un orden de magnitud de un valor dado y preferiblemente dentro de la mitad de un orden de magnitud del valor.

Ingeniería genética de sistemas de base plasmídica

De acuerdo con la presente invención puede emplearse biología molecular convencional, microbiología y técnicas de ADN recombinante dentro de los conocimientos de la técnica. Dichas técnicas están completamente explicadas en la literatura. Véase, por ejemplo Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (en adelante, "Sambrook y colaboradores, 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes I y II (D.N. Glover editores 1985); Olignonucleotide Síntesis (M.J. Gait editores 1984); Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames y S.J. Higgins editores (1985)]; Transcription and Traslation [B.D. Hames y S.J. Higgins, ediciones (1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, editores (1986)]; Immobilized Cells and Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984), F.M. Ausubel y colaboradores (ediciones), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley y Sons, Inc (1994).

Estas técnicas rutinarias se aplican a la preparación de sistemas plasmídicos pol I - pol II, al aislamiento de clones de ADNc de segmentos de genes virales, a la inserción de dichos ADN dentro de plásmidos y a la transfección de células con un plásmido o un sistema de base plasmídica de la invención. En particular, las técnicas rutinarias de mutagénesis dirigida al sitio o de modificación genética permiten la modificación del ARN viral, preferiblemente, genes virales de ARN segmentados de cadena negativa para desarrollar virus atenuados tal como se manifestará a continuación; o proteínas virales que incorporen nuevos epítopos, por ejemplo en el tallo de la neuraminidasa, o para crear virus defectuosos.

La "amplificación" del ADN según aquí se usa se refiere a la utilización de la reacción de la cadena de polimerasa (PCR) para incrementar la cantidad de una secuencia de ADN particular dentro de una mezcla de secuencias de ADN. Para una descripción de la PCR véase Saiki y colaboradores, Science 1988, 239:487.

Una "molécula de ácido nucleico" se refiere a la forma polimérica del éster de fosfato de ribonucleósidos (adenosina, guanosina, uridina o citidina; "moléculas de ARN") o de deoxirribonucleósidos (deoxiadenosina, deoxiguanosina, deoxitimidina o deoxicitidina; "moléculas de ADN"), o de cualquiera de sus análogos fosfoéster, tal como fosforotioatos y tioésteres, tanto en forma simple como en una hélice de doble cadena. Una "molécula de ADN recombinante" es una molécula de ADN que ha sufrido una manipulación biológica molecular.

Un "polinucleótido" o una "secuencia nucleótida" es una serie de bases nucleótidas (también denominadas "nucleótidos") en el ADN y el ARN y hace referencia de dos o más nucleótidos. Una secuencia de nucleótidos lleva típicamente información genética, incluyendo la información utilizada por la maquinaria celular para hacer proteínas.

Aquí los polinucleótidos pueden estar flanqueados por secuencias heterólogas, incluyendo promotores, sitios internos de entrada de ribosomas (IRES; Gatas y colaboradores, Mol. Cell. Biol. 11:5848-5859, 1991) y otras secuencias de sitios de unión de ribosomas, potenciadores, elementos de respuesta, supresores, secuencias de señales, secuencias de poliadenilación, intrones, regiones no codificantes 5' y 3' y similares. Los ácidos nucleicos también pueden ser modificados por muchos medios conocidos en la técnica. Ejemplos no limitativos de dichas modificaciones incluyen la metilación, "remates" tales como los remates 5'-7-metil-G(5')ppp(5')N, la sustitución de uno o más nucleótidos que se producen naturalmente con un análogo y modificaciones internucleótidas. Los polinucleótidos pueden contener una o más moléculas adicionales covalentemente unidas, tal como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señales, poli - L - lisina, etc), intercaladores (por ejemplo acridina, psolareno, etc), queladores (por ejemplo, metales, metales radioactivos, hierro, metales oxidativos, etc) y alquiladores. Los polinucleótidos pueden derivarse mediante la formación de un fosfotriéster de metilo o etilo o un enlace de fosforoamidato de alquilo. Además, aquí los polinucleótidos también pueden ser modificados con una etiqueta capaz de suministrar una señal detectable, bien directa o bien indirectamente. Etiquetas ejemplares incluyen radioisótopos, moléculas fluorescentes, biotina y similares.

Una "secuencia de codificación" o una secuencia "codificante" de un producto de expresión, tal como un polipétido, es una secuencia de nucleótidos que, cuando se expresa, da como resultado la producción de ese polipéptido, es decir, la secuencia de nucleótidos codifica una secuencia de aminoácidos para ese polipéptido. Una secuencia de codificación para una proteína puede incluir un codón de inicio (habitualmente ATG) y un codón de finalización.

El término "gen", también denominado "gen estructural" designa una secuencia de ADN que codifica o se corresponde con una secuencia particular de aminoácidos que comprenden la totalidad o parte de uno o más polipétidos y puede incluir o no secuencias reguladoras de ADN, tales como secuencias promotoras, que determinan por ejemplo las condiciones bajo las cuales se expresa el gen.

Además, la presente invención permite el uso de varios mutantes, variantes conservadoras de secuencias, y variantes funcionalmente conservadores de segmentos de genes de virus de ARN, preferiblemente segmentos de genes de virus de ARN de cadena negativa, teniendo en cuenta que dichas variantes retengan el efecto inmunoprotector requerido. En efecto, la invención permite de forma ventajosa la mutagénesis para desarrollar cepas virales atenuadas de una manera sistemática.

Los términos "mutante" y "mutación" se refieren a cualquier cambio detectable en el material genético, por ejemplo el ADN o cualquier proceso, mecanismo o resultado de dicho cambio. Esto incluye mutaciones genéticas, en las cuales la estructura (por ejemplo, la secuencia de ADN) de un gen se altera, cualquier gen o ADN que surja de cualquier proceso de mutación o cualquier producto de expresión (por ejemplo, una proteína) expresado mediante un gen o una secuencia de ADN modificados. El término "variante" también puede utilizase para indicar un gen, secuencia de ADN, enzima, célula, etc alterados, es decir, cualquier tipo de mutante. Las mutaciones pueden ser introducidas mediante técnicas de mutagénesis aleatorias o mediante mutagénesis dirigida al sitio, incluyendo la modificación de secuencias basada en la PCR. Tal como se observó anteriormente, y se analiza con más detalle a continuación, la mutagénesis de uno más segmentos genéticos individuales de un virus de ARN (por ejemplo, un virus de ARN segmentado de cadena negativa) permite el desarrollo de virus atenuados, así como la dilucidación del mecanismo de atenuación. Además, el sistema de base plasmídica de la invención supera los inconvenientes de esfuerzos anteriores para desarrollar virus atenuados mediante mutagénesis, tal como las restricciones de un sistema de selección eficaz (véase Bilser y Kawaoka, In: Nicholson, Webster y May (ediciones), Textbook of influenza, capítulo 32, pág. 422-434, especialmente pág. 423-425).

"Variantes conservantes de la secuencia" de una secuencia de polinucleótidos son aquellas en las cuales el cambio de uno o más nucleótidos de una posición de codón dada, no da como resultado la alteración del aminoácido codificado en esa posición. Las variantes alélicas pueden ser variantes conservadoras de la secuencia.

"Variantes conservadoras de la función" son aquellas en las cuales un residuo de aminoácido dado en una proteína o enzima se ha cambiado sin alterar la conformación y función general del polipéptido, incluyendo, aunque no en sentido limitativo, la sustitución de un aminoácido con uno que tenga propiedades similares (tal como, por ejemplo, polaridad, potencial de unión al hidrógeno, ácido, alcalino, hidrófobo, aromático y similares). Algunas variaciones alelícas dan como resultado variantes conservadoras de la función, de manera que la sustitución de un aminoácido no afecta dramáticamente a la función proteica. Similarmente, proteínas homólogas pueden ser variantes conservadoras de la función. Aminoácidos con propiedades similares son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la arginina, la histidina y la lisina son aminoácidos hidrófilos - alcalinos y pueden ser intercambiables. Similarmente la isoleucina, un aminoácido hidrófobo, puede sustituirse con leucina, metionina o valina. Se espera que dichos cambios tengan poco o ningún efecto sobre el peso molecular aparente o sobre el punto isoeléctrico de la proteína o el polipéptido. Aminoácidos diferentes a los indicados como conservadores pueden diferenciarse en una proteína o enzima de manera que la similitud porcentual de la proteína o de la secuencia de aminoácidos entre dos proteínas cualesquiera de función similar puede variar y puede ser, por ejemplo, entre un 70% y un 99% según se determina de acuerdo con un esquema de alineamiento tal como mediante el procedimiento Cluster, en el que la similitud se basa en el algoritmo de MAGALIGN. Una "variante conservadora de la función" también incluye un polipéptido o una enzima que tenga al menos un 60% de identidad de aminoácidos según se determina mediante los algoritmos BLAST o FASTA en los que los parámetros se seleccionan para dar la mayor concordancia entre las secuencias analizadas, a lo largo de la longitud completa de la secuencia de referencia, preferiblemente al menos el 75%, más preferiblemente al menos el 85% e incluso más preferiblemente al menos el 90%, y para que tenga las mismas o propiedades o funciones substancialmente similares a las de la proteína o enzima nativa o progenitora con la cual se compara.

Según aquí se utiliza, el término "homólogo" en todas sus formas gramaticales y variaciones de deletreo se refiere a las relaciones entre proteínas que poseen un "origen evolutivo común" incluyendo proteínas procedentes de superfamilias (por ejemplo, la superfamilia de la inmunoglobulina) y proteínas homólogas de diferentes especies (por ejemplo, la cadena ligera de la miosina, etc) (Reeck y colaboradores, Cell 50:667, 1987). Dichas proteínas (y sus genes codificantes) tienen homología de secuencia, según se refleja mediante la similitud de sus secuencias, bien en términos de similitud porcentual o bien mediante la presencia de residuos o motivos específicos.

Consecuentemente, el término "similitud de secuencias", en todas sus formas gramaticales se refiere al grado de identidad o de correspondencia entre secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos de proteínas que pueden o no compartir un origen evolutivo común (véase Reeck y colaboradores, supra). Sin embargo, en el uso común y en la presente solicitud, el término "homólogo" cuando se modifica con un adverbio tal como "altamente" puede referirse a similitud de secuencia y puede estar relacionado o no con un origen evolutivo común.

En una realización específica, dos secuencias de ADN son "substancialmente homólogas" o "sustancialmente similares" cuando un número suficiente de nucleótidos coinciden a lo largo de la longitud definida de las secuencias de ADN para diferenciar las secuencias de otras secuencias, según se determina mediante algoritmos de separación de secuencias, tal como BLAST, FASTA, DNA Strider y otros en los que los parámetros se seleccionan para dar la concordancia más alta entre las secuencias analizadas, a lo largo de la longitud completa de la secuencia de referencia. Secuencias que sean substancialmente homólogas pueden identificarse comparando las secuencias utilizando software estándar disponible en los bancos de datos de secuencias o en un experimento de hibridación Southern bajo, por ejemplo, condiciones estrictas según se defina por ese sistema en particular. Dichas condiciones estrictas son conocidas por aquellos expertos en la materia y pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Nueva York (1989), 6.3.1-6.3.6. Como ejemplo no limitativo de condiciones estrictas de hibridización está la hibridización en 6 X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45ºC, siguiendo con uno o más lavados en 0,2 X SSC, 0,1% SDS a 50ºC, preferiblemente a 55ºC, y más preferiblemente a 60ºC o 65ºC.

Similarmente, en una realización particular, dos secuencias de aminoácido son "substancialmente homólogas" o "substancialmente similares" cuando suficientes aminoácidos son idénticos o similares (funcionalmente idénticos) a lo largo de una longitud definida para diferenciar las secuencias de otras secuencias. Preferiblemente, las secuencias similares u homólogas se identifican mediante alineamiento usando, por ejemplo, el programa de acumulación GCG (Genetics Computer Group, Manual del programa para el paquete GCG, Versión 7, Madison, Wisconsin) o cualquier otro de los programas anteriormente descritos (BLAST, FASTA, etc). Las siguientes referencias que se refieren al algoritmo BLAST se incorporan aquí por referencia: Algoritmos BLAST: Altschul, S.F., Gish, W., Millar, W., Myers, E.W. y Lipman, D. J., Mol. Biol. 215:403-410, 1990; Gish, W & Status, D.J. Nature Genet. 3:266-272, 1993;
Madden, T.L. Tatusov, R.L. & Zhang, J., Meth. Enzymol, 266: 131-141, 1996, Alatschul, S.F., Madden, T.L.,
Schäffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Zhang, J & Madeen, T.L., Genome Res, 7:649-656; 1997, Wootton, J. C. & Federhen, S., Comput. Chem. 17: 17; 149-163, 1993, Hancock, J.M & Armstrong, J.S., Comput. Appl. Biosci. 10:67-70, 1994; Sistemas de puntuación por alineamiento: Dayhoff, M.O., Schwartz, R.M & Orcutt, B.C. (1978) "A model of evolutionary change in proteins". In Schwartz, R.M. & Dayhoff, M.O. (1978) "Matrices for detecting distant relationships". En "Atlas of Protein Sequence and Structure", vol. 5, supp. 3. M.O. Dayhoff (ediciones), pág. 353-358, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Altschul, S.F., J. Mol. Biol. 219; 555-565, 1991; States, D.J., Gish, W., Altschul, S.F., Methods 3:66-70, 1991; Henikoff, D & Henikolff, J.G., Proc. Natl. Acd. Sci. EE.UU. 89:10915-10919, 1992; Altschul, S.F., J. Mol. Evol. 36:290-300, 1993; Estadística de alineamiento: Karlin, S. & Altschul, S.F., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87:2264-2268, 1990; Karlin, S. & Altschul, S.F. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90:5873-5877, 1993, Dembo, A., Karlin, S & Zeitouni, O., Ann. Prob. 22:2022-2039, 1994 y Altschul. S.F. (1997) "Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments". En "Theoretical and Computational Methods in Genome Research" (S. Suhai, ediciones), pág. 1-14, Plenum, New York.

Una "secuencia de promotor" es una región reguladora del ADN capaz de unir la ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia. Para propósitos definitorios de la presente invención, una secuencia de promotor que esté situada cadena arriba de un ADNc está unida en su terminal 3' mediante un sitio de iniciación de transcripción y se extiende cadena arriba (en dirección a 5') hasta incluir el mínimo número de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del entorno. Una secuencia de promotor que se sitúe cadena abajo de un ADNc (para expresar un ARN (-)) está unida en su terminal 5' mediante un sitio de iniciación de la transcripción y se extiende cadena abajo (en dirección a 3') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del entorno. El sistema bidireccional de la invención incluye promotores tanto cadena arriba como cadena abajo; el sistema unidireccional descrito incluye solamente promotores cadena arriba. Dentro de la secuencia del promotor encontraremos un sitio de iniciación de la transcripción (convenientemente definido por ejemplo, mediante mapeo con nucleasa S1), así como dominios de unión de las proteínas (secuencias de consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa.

En la presente invención puede utilizarse cualquier promotor conocido en tanto que se preserven los elementos esenciales de la invención. Por ejemplo, los promotores de la pol II que pueden usarse para controlar la expresión de los genes, incluyen, pero no en sentido limitativo, el promotor del citomegalovirus (CMV) (patentes de EE.UU. num. 5.385.839 y 5.168.062), la región del promotor precoz de SV40 (Benoist y Chambon, Nature 290:304-310, 1981), el promotor contenido en la repetición del terminal largo 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto y colaboradores, Cell 22:787-797, 1980), el promotor de la timidina quinasa del herpes (Wagner y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78:1441-1445, 1981), las secuencias reguladoras del gen de la metalotioneina (Brinster y colaboradores, Nature 296:39-42, 1982); los promotores de la ARN polimerasa T7, los promotores de la ARN polimerasa T3M; los promotores de la ARN polimerasa SP6 y otros promotores efectivos en la célula anfitriona de interés. Los promotores de la pol I para la expresión de ARN sin remate son omnipresentes en todas las eucariotas e incluyen la ARN polimerasa I humana (véase Molecular Cell Biology, Darnell y colaboradores, ediciones 1986, pág. 311, 365-6). En la presente invención también pueden utilizarse promotores de la ARN polimerasa III.

Una secuencia de codificación está "bajo el control de", "funcionalmente asociada con" u "operativamente asociada con" secuencias de control transcripcional y traduccional (por ejemplo un promotor de la pol I o de la pol II) en una célula cuando la ARN polimerasa transcribe la secuencia de codificación en un ARN, por ejemplo, ARNm o ARNv.

Los términos "expresar" y "expresión" significa permitir o provocar la formación de un gen o una secuencia de ADN a poner de manifiesto, por ejemplo, producir un ARN (incluyendo ARNc, ARNv y ARNm de virus) o una proteína activando las funciones celulares comprometidas en la transcripción y traducción de un gen correspondiente o de una secuencia de ADN. Una secuencia de ADN se expresa en o mediante una célula para formar un "producto de expresión" tal como una proteína. También puede decirse que el producto de expresión en sí mismo, por ejemplo la proteína resultante, es "expresado" por la célula.

El término "transfección" significa la introducción de un ácido nucleico extraño dentro de una célula, de forma que la célula anfitriona expresará el gen o la secuencia introducida para producir un polipéptido deseado, codificado por el gen o la secuencia introducida. El gen o la secuencia introducida también pueden denominarse un gen o secuencia "clonada" o "extraña", puede incluir secuencias reguladoras o de control, tal como inicio, finalización, promotor, señal, secreción u otras secuencias utilizadas por la maquinaria genética de una célula. El gen o la secuencia pueden incluir secuencias no funcionales o secuencias con una función conocida. Una célula anfitriona que recibe y expresa ADN o ARN introducido ha sido "transformada" y es un "transformado" o un "clon". El ADN o el ARN introducido en la célula anfitriona pueden venir de cualquier fuente, incluyendo células del mismo género o especie que la célula anfitriona, o de células de un género o especie diferente.

Los términos "vector", "vector de clonación" y "vector de expresión" significan el vehículo mediante el cual una secuencia de ADN o de ARN (por ejemplo un gen extraño) puede introducirse dentro de una célula anfitriona, de manera que transforme el anfitrión y promueva la expresión (por ejemplo la transcripción y la traducción) de la secuencia introducida. Los plásmidos son los vectores preferidos de la invención.

Los vectores comprenden típicamente el ADN de un agente transmisible, dentro del cual se inserta el ADN extraño. Un modo común de insertar un segmento de ADN dentro de otro segmento de ADN comprende el uso de enzimas denominadas enzimas de restricción que escinden el ADN en sitios específicos (grupos específicos de nucleótidos) denominados sitios de restricción. Una "casete" se refiere a una secuencia de codificación de ADN o a un segmento de ADN que codifica un producto de expresión que puede insertarse dentro de un vector en sitios de restricción definidos. Los sitios de restricción de la casete se designan para asegurar la inserción de la casete en el marco de lectura adecuado. Generalmente, el ADN extraño se inserta en uno o más sitios de restricción del ADN del vector y luego es transportado por el vector al interior de una célula anfitriona junto con el ADN del vector transmisible. Un segmento o secuencia de ADN que tiene ADN insertado o añadido, tal como un vector de expresión, también puede denominarse "construcción de ADN". Un tipo común de vector es un "plásmido", que generalmente es una molécula autocontenida de ADN de doble cadena, habitualmente de origen bacteriano, que puede aceptar fácilmente ADN adicional (extraño) y que puede introducirse fácilmente dentro de una célula anfitriona adecuada. Un vector plasmídico contiene a menudo ADN codificante y ADN promotor y tiene uno o más sitios de restricción adecuados para la inserción del ADN extraño. ADN codificante es una secuencia de ADN que codifica una secuencia particular de aminoácidos para una proteína o enzima particular. ADN promotor es una secuencia de ADN que inicia, regula o intermedia o controla de cualquier otra forma la expresión de ADN codificante. El ADN promotor y el ADN codificante pueden ser del mismo gen o de genes diferentes, y pueden ser de los mismos o de diferentes organismos. Los vectores de clonación recombinantes a menudo incluyen uno o más sistemas de replicación para clonar o expresar uno o más marcadores de selección en el anfitrión, por ejemplo, resistencia al antibiótico, y una o más casetes de expresión.

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El término "sistema de expresión" se refiere a una célula anfitriona y a un vector compatible bajo condiciones adecuadas, por ejemplo, para la expresión de una proteína codificada por ADN extraño, transportado por el vector e introducido en la célula anfitriona.

El término "heterólogo" se refiere a una combinación de elementos que no se produce de forma natural. Por ejemplo, ADN heterólogo se refiere a ADN que se sitúa de forma no natural en la célula, o en un sitio cromosómico de la célula. Preferiblemente, el ADN heterólogo incluye un gen extraño a la célula. Un elemento heterólogo regulador de la expresión es un elemento operativamente asociado con un gen diferente del que está operativamente asociado en la naturaleza. En el contexto de la presente invención, un gen que codifica un polipéptido comprende una secuencia de una biblioteca de secuencias es heterólogo para el ADN del vector en el cual se inserta para efectuar la clonación o la expresión, y es heterólogo para una célula anfitriona que contiene dicho vector, en la cual se expresa.

Tal como se observó anteriormente, la invención permite la generación de virus de reordenamiento utilizando genes virales heterólogos. Además de incorporar genes para antígenos virales en un entorno genético de una cepa de virus adaptados para crecer bien en un cultivo, la invención permite la creación por reordenamiento de especies cruzadas, por ejemplo, un antígeno de la gripe B en un entorno de gripe A.

Vacunas

Tal como se observó anteriormente, la presente invención proporciona una estrategia eficaz y económica para la producción de vacunas para el tratamiento o prevención de infecciones virales de ARN, preferiblemente, infecciones de virus de ARN de cadena negativa. El sistema mínimo de base plasmídica de la invención elimina la necesidad de la selección y proporciona un estrecho control sobre los virus de reordenamiento. Para la producción de una vacuna de gripe inactivada, seis plásmidos que contienen los segmentos no glicoproteicos (por ejemplo, PB1, PB2, NP, M y NS) de una cepa de alto rendimiento (por ejemplo PR/8/34 (H1N1)) pueden transfectarse con dos plásmidos de expresión que contienen el ADNc de HA y de NA del subtipo de vacuna recomendado. Ya que no se necesita ningún virus auxiliar, el virus generado es un virus de gripe con la constelación genética deseada. Puede utilizarse un enfoque análogo para producir cualquier variedad de virus inactivados de ARN de reordenamiento para su uso en una vacuna. Los plásmidos de expresión que contienen segmentos del gen viral para un virus diana (por ejemplo, segmentos no glicoproteicos) pueden cotransfectarse con otros plásmidos de expresión que codifiquen proteínas que se correspondan con un subtipo viral infeccioso dado (por ejemplo un subtipo viral que esté actualmente en circulación en la población). Los virus producidos de acuerdo con la invención pueden utilizarse en enfoques nuevos o tradicionales para la vacunación (véase Bilsel y Kawaoka, In: Nicholson, Webster y May (ediciones), Texbook of Influenza, capítulo 32, pag. 422-434), particularmente en el desarrollo de vacunas vivas atenuadas (analizadas con mayor detalle infra). En particular, la presente invención supera los defectos de la tecnología actual, con respecto al desarrollo de virus de reordenamiento con una gama anfitriona limitada o con una atenuación impredecible.

Se han empleado muchos esfuerzos en el desarrollo de vacunas para la gripe (véase Wood, In: Nicholson, Webster y May (ediciones), Textbook of Influenza, capítulo 23, pag. 317-323). Aunque mucho de esta sección se refiere a vacunas para la gripe, el alcance de la presente invención se extiende a todas las vacunas para virus de ARN segmentado de cadena negativa y particularmente a vacunas para los Orthomyxoviridae.

Actualmente están disponibles tres tipos de vacunas de gripe inactivada: vacunas de virus completos, vacunas de producto dividido y vacunas de antígenos superficiales (véase Wood, In; Nicholson, Webster y May (ediciones), Texbook of Gripe, capítulo 25, pag. 333-345). Ya que la presente invención permite el rápido desarrollo de un virus de reordenamiento deseado con características de crecimiento aceptables en cultivo, el fabricante de vacunas está facultado para generar una cantidad suficiente de vacuna para satisfacer las necesidades de la sanidad pública y asegura una estandarización, que es un requisito importante actualmente mitigado por la necesidad de producir cantidades clínicas de vacunas, habitualmente en períodos de entre 8 y 9 meses (Wood, supra, pag. 333).

También existe la preocupación de la seguridad de la vacuna (véase Wiselka, In: Nicholson, Webster y May (ediciones), Texbook of Influenza, capítulo 26, pag. 346-357). Ya que las vacunas de la invención permiten la producción en sistemas definidos de cultivo celular, evitan los patógenos no específicos, las bacterias y las proteínas alergénicas que pueden estar presentes en las vacunas comerciales preparadas en huevos embrionados.

Con las vacunas se han utilizado coadyuvantes, por ejemplo, con vacunas de la gripe (Wood y Williams, supra). El término "coadyuvante" se refiere a un compuesto o a una mezcla que mejora la respuesta inmune a un antígeno. Un coadyuvante puede servir como un depósito de tejido que libera lentamente el antígeno y también como un activador del sistema linfoide que mejora de forma no específica la respuesta inmune (Hood y colaboradores, Immunology, Segunda edición, 1984, Benjamín/Cummings: Menlo Park, California, pag. 384). A menudo, un desafío primario con un antígeno solo en ausencia de un coadyuvante, fallará en la obtención de una respuesta inmune humoral o celular. Los coadyuvantes incluyen, pero no en sentido limitativo, el coadyuvante de Freund completo, el coadyuvante de Freund incompleto, saponina, geles minerales tales como hidróxido de aluminio, substancias de activación superficial, tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceites o hidrocarburos y coadyuvantes humanos potencialmente útiles tales como el BCG (bacilo Calmette - Guerin) y el Corynebacterium parvum. Un ejemplo de un coadyuvante sintético preferido es QS-21. Alternativamente, o además, pueden administrarse proteínas inmunoestimuladoras, tal como se describe a continuación, como coadyuvantes para incrementar la respuesta inmune a la vacuna. Preferiblemente, el coadyuvante es farmacéuticamente aceptable.

La fase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y a composiciones que sean fisiológicamente tolerables y que típicamente no produzcan una reacción alérgica o similarmente perjudicial, tal como alteraciones gástricas, mareos o similares, cuando se administra a un humano. Preferiblemente, según aquí se utiliza "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora de un gobierno federal o estatal o incluido en la lista de farmacopea de los EE.UU. u otras farmacopeas generalmente reconocidas para su uso en animales, y más particularmente en los humanos. El término "portador" se refiere a un diluyente, coadyuvante, excipiente o vehículo con el cual se administra el compuesto. Soluciones salinas de agua estéril o de solución acuosa y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol se emplean preferiblemente como vehículos, particularmente para soluciones inyectables. Vehículos farmacéuticos adecuados se describen en "Remington Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin.

La efectividad de la vacunación puede mejorarse coadministrando una molécula inmunoestimuladora (Salgaller y Lodge, J. Surg. Oncol. 1998, 68:122) tal como una citocina, limfocina o quimiocina inmunoestimuladora, inmunopotenciadora o proinflamatoria junto con la vacuna, particularmente con una vacuna de vectores. Por ejemplo, pueden utilizarse citocinas o genes de citocinas tales como interleucina IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13, factor (CSF) de estimulación de la colonia de granulocitos - macrófagos (GM) y otros factores estimuladores de colonias, factor inflamatorio macrófago, ligante Fit 3 (Lyman, Curr. Opin. Hematol, 5:192, 1998), así como alguna molécula coestimuladora clave o sus genes (por ejemplo, B7.1, B7.2). Estas moléculas inmunoestimuladoras pueden administrarse sistemática o localmente como proteínas o mediante la expresión de un vector que codifique la expresión de la molécula.

Direccionamiento a las células dendríticas. La vacunación puede realizarse a través del direccionamiento a células dendríticas (Steinman, J. Lab. Clin. Med., 128:531, 1996; Steinman, Exp. Hematol., 24:859, 1996; Taite y colaboradores, Leucemia, 13:653, 1999; Avigan, Blood Rev., 13:51, 1999, DiNicola y colaboradores, Cytokines Cell. Mol. Ther., 4:265, 1998). Las células dendríticas juegan un papel crucial en la activación de la inmunidad dependiente de las células T. La proliferación de células dendríticas puede utilizarse para capturar antígenos proteicos en una forma inmunogénica in situ y luego presentar estos antígenos en una forma que pueda ser reconocida por las células T y que las estimule (véase, por ejemplo Steinman, Exp. Hematol., 24:859-862, 1996; Inaba y colaboradores, J. Exp. Med., 188:2163-73, 1998 y la patente de EE.UU. num. 5.851.756). Para su estimulación ex vivo, las células dendríticas se disponen en placas de cultivo expuestas a (pulsadas con) viriones en una cantidad suficiente y durante un período de tiempo suficiente para permitir que los antígenos virales se unan a las células dendríticas. Las células pulsadas pueden entonces trasplantarse de nuevo al sujeto que sufre el tratamiento, por ejemplo, mediante inyección intravenosa. Preferiblemente se utilizan células dendríticas antólogas, es decir células dendríticas obtenidas del sujeto que sufre el tratamiento, aunque puede ser posible utilizar células dendríticas que coincidan con las MHC-Class II, que pueden obtenerse de un donante compatible o mediante ingeniería genéticas de células dendríticas para expresar las moléculas MHC deseadas (y preferiblemente suprimir la expresión de las moléculas MHC no deseables).

Preferiblemente, las células dendríticas son específicamente reconocidas in vivo para la retención de virus o subunidades virales. Están disponibles varias estrategias para el direccionamiento a las células dendríticas in vivo aprovechando los receptores que intermedian la presentación de antígenos, tal como los receptores DEC-205 (Swiggard y colaboradores, Cell. Immunol., 165:302-11, 1995; Steinman, Exp. Hematol., 24:859, 1996) y Fc.

Vacunas inactivadas

Las vacunas de virus inactivados son bien conocidas para la vacunación contra infecciones virales de ARN (por ejemplo, la gripe) (véase Nichol, In: Nicholson, Webster y May (ediciones), Texbook of Influenza, capítulo 27, pag. 358-372). Para preparar virus inactivados, el virus transfectado se hace crecer bien en cultivo celular o bien en huevos embrionados. Los virus pueden inactivarse mediante el tratamiento con formaldehído, beta-propiolactona, éter, éter con detergente (tal como Twee-80), bromuro de cetil trimetil amonio (CTAB) y Triton N101, deoxilato de sodio y tri(n-butil) fosfato (Furminger, supra; Word y Williams, supra). La inactivación puede producirse después o antes de la clarificación del fluido alantoideo (a partir de los virus producidos en huevos); los viriones son aislados y purificados mediante centrifugación (Furminger, supra, véase pag. 326). Para establecer la potencia de la vacuna, puede utilizarse el ensayo de inmunodifusión radial simple (SRD) (Schild y colaboradores, Bull. World Health Organ. 1975, 52:43-50 y 223-31; Mostow y colaboradores, J. Clin. Microbiol. 1975, 2:531). La dosis necesaria para una respuesta inmune satisfactoria ha sido estandarizada y es 15 \mug dosis/cepa/HA. La vacuna inactivada puede formularse para su administración intramuscular mediante inyección.

Vacuna de gripe viva atenuada

Se han desarrollado vacunas virales de ARN vivas adaptadas al frío y atenuadas (vacunas de gripe) (véase Keitel y Piedra, In: Nicholson, Webster y May (ediciones), Texbook of Influenza, capítulo 28, pag. 373-390; Ghendon, In: Nicholson, Webster y May (ediciones), Texbook of Influenza, capítulo 29, pag. 391-399). La capacidad de generar virus de gripe completamente a partir de ocho plásmidos permite el ajuste de la atenuación de la cepa de la vacuna y hace posible el desarrollo de una cepa de vacuna óptimamente adecuada para cualquier población diana (véase Bilsel y Kawaoka, supra). Ya que en la actualidad las cepas de la gripe A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) o de la gripe B/Ann Arbor/1/66, se usan para la preparación de vacunas atenuadas vivas, se podría insertar cada uno de los seis ADNc de los genes integrales (PB2, PB1, PA, NP, M, NS) de la gripe dentro de un plásmido tal como pHW2000. Dos plásmidos que contengan las glicoproteínas HA y NA de una cepa de gripe relevante podrían construirse y cotransfectarse con seis plásmidos maestros que codifiquen las proteínas no glicosiladas de la gripe.

Se espera que la modificación genética de la región codificante o no codificante de los genes internos mejore la seguridad, infectividad, inmunogenicidad y eficacia protectora de la vacuna, además de permitir el desarrollo de virus atenuados.

La manipulación del gen HA también puede aumentar la seguridad de una cepa de vacuna., Por ejemplo, la eliminación de los aminoácidos básicos hallados en el péptido de conexión de las glicoproteínas H5 y H7 de los virus de la gripe A aviar altamente patogénica, puede aumentar la seguridad de la vacuna.

Vacunación mucosal. Las estrategias de vacunas mucosales son particularmente efectivas para muchos virus patógenos, ya que la infección se produce a menudo a través de la mucosa. La mucosa esconde células dendríticas que son dianas importantes para vacunas EBNA-1 y la inmunoterapia. Así, se contemplan las estrategias de vacunación mucosal para vacunas de virus inactivados y atenuados. Aunque que la mucosa puede convertirse en diana para la administración local de una vacuna, se han empleado diferentes estrategias para administrar proteínas inmunogénicas a la mucosa.

En una realización específica, la vacuna puede formularse para su administración en una mezcla, o como un conjugado o proteína de fusión quimérica, con una toxina del cólera, tal como la toxina B del cólera o una quimera de la toxina A/B del cólera (Hajishengallis, J Immunol., 154:4322-32, 1995; Jobling y Colmes Infect Immun., 60:4915-24, 1992). Se han descrito vacunas mucosales que se basan en el uso de la subunidad de la toxina B del cólera (Lebens y Holmgren, Dev Biol Stand 82:215-27, 1994). En otra realización, puede prepararse una mezcla con enterotoxina lábil (LT) caliente para vacunación mucosal. Otras estrategias de inmunización mucosal incluyen la encapsulación del virus en microcápsulas (patentes de EE.UU. num. 5.075.109, 5.820.883 y 5.853.763) y utilizando un portador membranoso inmunopotenciador (WO 98/0558). La inmunogenicidad de inmunógenos oralmente administrados pueden mejorar utilizando glóbulos rojos (rbc) o acrónimos de rbc (patente de EE.UU. num. 5.643.577) o utilizando el antígeno de la lengua azul (patente de EE.UU. num. 5.690.938).

Ejemplos

La presente invención se entenderá mejor con referencia a los siguientes ejemplos que ilustran la invención sin limitarla.

Ejemplo 1 "Enfoque ambisentido" para la generación de virus de la gripe A: síntesis de ARNv y ARNm a partir de una matriz

Como un primer paso en la reducción del número de plásmidos, este ejemplo informa de la construcción y transfección de plásmidos que contienen el promotor de la pol I y de la pol II sobre el mismo plásmido y presenta evidencias de que este sistema permite la expresión de ARNv y proteína a partir de una matriz. Este ejemplo ha sido publicado (Hoffmann y colaboradores, Virology 2000, 267:310).

Materiales y procedimientos

Clonación de plásmidos. Todas las reacciones de clonación y PCR se realizaron de acuerdo con protocolos estándar. Brevemente, los plásmidos de expresión para los genes del complejo de la polimerasa de A/WSN/33 se derivaron del ADNpc3 (Invitrógeno) que contenía el promotor precoz inmediato del citomegalovirus (CMV) humano y el sitio poli A del gen que codifica la hormona del crecimiento bobina (BGH). Los ADNc virales se derivaron de los plásmidos pWNP-143, pWSNPA3, pWSNPA3, pWSNPB2-14, pGW-PB1 para producir las construcciones de expresión pHW25-NP, pHW23-PA, pHW21-PB2, pHW22-PB2, pHW22-PB1. Se generó pHW12 insertando secuencias del promotor de la pol I humana y del finalizador entre el promotor de la pol II y el sitio poli A. Se derivó el plásmido pHW52 a partir de pHW12 insertando primero oligonucleótidos que contenían la región no codificante de PB1 extendida por los sitios HindIII y XhoI e insertando entonces la región de codificación de PB1 a partir de pHW22-PB1 dentro de estos sitios. Se derivo el plásmido pHW82-PB1 a partir de pHW52-PB1 mediante eliminación de las secuencias promotoras del CMV. Se obtuvo la región de codificación para la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) en la construcción informadora pHW72-EGFP después de la amplificación por PCR usando pEGFP-N1 (Clontech) como matriz, insertando el ADNc después de la digestión de SacI/XhoI dentro del plásmido pHW72 que contiene el promotor de la pol I humana y el finalizador murino y la región no codificante del segmento M separada por los sitios SacI/XhoI. Se construyeron los pHW127-M y pHW128-NS mediante amplificación RT-PCR del ARN viral con secuencias específicas del segmento que contenían cebadores y los sitios de BsmBI para su inserción dentro del vector pHH21 digerido por BsmBI (E, Hofmann, Ph. D. Thesis 1997, Universidad Justus Liebig, Giessen, Alemania; Neumann y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU 1999, 96:9345). La construcción de los plásmidos pPolI-WSN-PB2, pPolI-WSN-PA, pPolI-WSN-NP, pPolI-WSN-Ha, PpolI-WSN-NA, pEWSN-HA, y pCAGGS-WNA15 ha sido descrita en otros documentos (Nuemann y colaboradores, supra).

Cultivo de células y transfección. Se mantuvieron células del riñón canino de Madin-Darby (MDCK) en Eagle Medium modificado (MEM) que contenía un 10% de suero bovino fetal (FBS), se cultivaron células del riñón embriónico humano 293T en el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía un 10% de FBS. Se utilizó TransI LT-1 (Panvera, Madison, Wisconsin) de acuerdo con las instrucciones del fabricante para transfectar 1 x 106 células 293T. Se mezclaron diferentes cantidades de plásmidos (Tabla 1) con TransIT LT-1 (2 \mul de TransIT LT-1 x 1 \mug de ADN), se incubaron a temperatura ambiente durante 45 minutos y se añadió a las células. Seis horas más tarde, la mezcla de transfección de ADN se sustituyo por Opti-MEM (Gibco/BRL, Gaithersburg, Maryland) que contenía un 0,3% de albúmina de suero bovino (BSA) y un 0,01% de FBS. Cuarenta ocho horas después de la transfección, los sobrenadantes que contenían el virus se titularon en células MDCK.

Aislamiento del ARN y RT-PCR. Se aisló ARN viral de partículas de virus con el uso del equipo RNeasy (Qiagen, Valencia, California) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la caracterización de virus de gripe recombinantes se utilizó el equipo Access RT-PCR (Promega, Madison, Wisconsin) de acuerdo con el protocolo suministrado. Se utilizaron los siguientes cebadores en los experimentos de RT-PCR: Sec-PB1nº1: 5'-AGG ATG CGA TTC CTC AAG G-3' (número de identificación de secuencia:1); Sec-PB1nº2: 5'GCT ATG GTT TCC AGA GCC CG-3' (número de identificación de secuencia:2); Bm-PB1-1: 5'-TAT TCG TCT CAG GGA GCG AAA GCA GGC A-3' (número de identificación de secuencia:3); Bm-PB1-2341R: 5'-ATA TCG TCT CGT ATT AGT AGA AAC AAG GCA TTT-3' (número de identificación de secuencia:4). Se realizaron experimentos de RT-PCR usando el motor de ADN PTC-200 (MJ Research, Watertown, Massachussets). El programa de amplificación se inició con un ciclo a 48ºC durante 45 minutos (síntesis de ADNc de primera cadena) y un ciclo a 94ºC durante 2 minutos (inactivación de la transcriptasa inversa AMV y desnaturalización del ADNc). Estos ciclos fueron seguidos de un ciclo a 72ºC durante 45 minutos. Los productos de la PCR se analizaron mediante electroforesis de gel de agarosa y se secuenciaron con el cebador Sec-PB1nº1 o Sec-PB1nº2.

Citometría de flujo. 48 horas después de la transfección, se lavaron las células 293T con una solución salina neutralizada con fosfato (PBS), en forma de píldora, y resuspendida en PBS más un 5% de FBS. Se realizó un análisis de citometría de flujo usando un citómetro de flujo FACS Calibur (Becton Dickinson) y se analizaron los datos utilizando el paquete de software CellQuest. Para el análisis de expresión de EGFP se utilizó una longitud de onda de emisión de 530 nm (FL1) para conseguir una alta sensibilidad para la detección de fluorescencia intermediada por EGFP.

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Resultados y análisis

Diseño y características del vector de clonación pHW12 que contiene dos promotores eucarióticos. Los virus de la gripe A son virus segmentados que contienen moléculas de ARN con polaridad de sentido negativo. Durante el ciclo de replicación, el reconocimiento de las estructuras 5' y 3' de los ocho segmentos de ARNv efectuado por las proteínas del complejo de ribonucleoproteínas (PB2, PB1, PA, NP) da como resultado la replicación y transcripción de los genes del virus de la gripe. El hecho de que los elementos de la secuencia del terminal se conserven en gran medida indica que el ARN artificial transcrito debe tener secuencias que sean iguales que las de los extremos 5' y 3' (Luo y colaboradores, J. Virol, 1991, 65:2861, Flick y colaboradores, RNA 1996, 2:1046). Se construyó el vector de clonación pHW12, permitiendo la inserción de secuencias de interés entre el promotor de la pol I y el finalizador usando la endonucleasa de restricción BsmBI. La unidad de transcripción de la pol I está flanqueada por el promotor de la pol II del citomegalovirus (CMV) y por la señal de poliadenilación del gen que codifica la hormona bovina del crecimiento. El promotor del CMV, el sitio poli A y el esqueleto del plásmido se derivan del ADNpc3 del vector de clonación.

Expresión de la proteína PB1 en el sistema de transcripción bidireccional pol I/pol II. Para comprobar el sistema de transcripción de un plásmido pol I/pol II, se insertó ADNc del gen PB1 del virus A/WSN/33 dentro del vector de clonación pHW12 para dar como resultado el plásmido pHW52-PB1. Se insertaron los sitios de restricción HindIII y XhoI dentro de las regiones no codificantes 5' y 3' de este gen. Se incluyeron estos marcadores genéticos para asegurarse que el virus recombinante generado pudiera ser identificado mediante RT-PCR. Se esperaba que las células humanas transfectadas con este plásmido producirían dos tipos de ARN: ARNv - PB1 sintetizado por la pol I celular y un ARNm con estructura de remate 5' sintetizado por la pol II. La traducción del ARNm daría como resultado la síntesis de la proteína PB1.

Para examinar si se produjo la proteína PB1 a partir de esta construcción, se comprobó la replicación y transcripción de un ARNv artificial construyendo los plásmidos de expresión pHW21-PB2, pHW23-pA y pHW25-NP, que contenían ADNc que codificaba las proteínas PB2, PA y NP del A/WSN/33 bajo el control del promotor del CMV. Para la síntesis in vivo de un ARNv artificial se construyó el plásmido indicador pHW72-EGFP que contenía el ADNc de EGFP flanqueado por la región no codificante del segmento M y el promotor de la pol I humana y la secuencia del terminador murino. Se transfectaron cinco plásmidos (2 \mug de pHW21-PB2, dos \mug de pHW52-PB1 (construcción de promotor de pol I/pol II), 2 \mug de pHW23-PA, 2 \mug de pHW25-NP, y 1 \mug de pHW72-EGFP) dentro de células 293T. Veinticuatro y cuarenta y ocho horas después de la transfección, se analizaron las células mediante microscopía de fluorescencia. Después de veinticuatro horas se observaron células fluorescentes. Este resultado muestra que dentro de las veinticuatro horas se sintetizaron las proteínas de polimerasa en una concentración suficiente para permitir el reconocimiento de extremos específicos del virus de la gripe de ARNv de EGFP. Estas proteínas sintetizan ARNm que se traduce en EGFP.

Para evaluar la eficacia de este sistema, se realizó un análisis citométrico de flujo para contar el número de células fluorescentes. Cuarenta y ocho horas después de la transfección de los cinco plásmidos, el 18,72% de la población celular mostró fluorescencia. Solamente se observó un nivel de fondo de células fluorescentes (0,06%) cuando no se añadió el plásmido pHW52-PB1; este hallazgo es consistente con los de estudios anteriores que mostraban que eran necesarias todas las proteínas del complejo RNP para la amplificación del ARNv (Huang y colaboradores, J. Virol. 1990, 64:5669). Los resultados indican que la transcripción del ARNv - PB1 y la concentración resultante de proteína PB1 junto con otras proteínas del complejo RNP es suficiente para iniciar un proceso de transcripción/replicación.

Generación de un virus recombinante de la gripe A. Para la generación de un virus infeccioso de la gripe A, es necesario que el plásmido pHW52-PB1 suministre no solo ARNm - PB1 y proteína sino también cantidades suficientes de ARNv - PB1 que puedan empaquetasen dentro del virus de progenie. Para los siete ARNv restantes, se utilizaron plásmidos que contenían los ADNc para los ARN de longitud completa del virus A/WSN/33, flanqueados por el promotor de la pol I humana y el finalizador murino. La transfección de estos plásmidos debería dar como resultado la síntesis de la totalidad de los ocho ARN virales que son replicados y transcritos por las proteínas de polimerasa que forman nuevas RNPv. Después de la síntesis de las proteínas estructurales, las RNP se empaquetarían dentro de nuevas partículas de virus.

Se transfectaron células 293T con diferentes cantidades de plásmido pHW52-PB1 (0, 2, 4 \mug) junto con los plásmidos pPoII - WSN-PB2, pPoII-WSN-PA, pPoII-WSN-HA, pPoII-WSN-NP, pPoII-WSN-NA, pHW127-M, pHW128-NS (1 \mug de cada uno). Se cotransfectaron los plásmidos de expresión de las proteínas pHW21-PB2 (1 \mug), pHW23-PA (0,1 \mug), pHW25-NP (1 \mug), pEWSN-HA (1 \mug) y pCAGGS-WNA 15 (1 \mug). Se incluyeron los plásmidos de expresión para la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA) para incrementar la producción de virus transfectantes.

Cuarenta y ocho horas después de la transfección, el sobrenadante de las células 293T primarias transfectadas fue transferido a células MDCK. En todos los experimentos de transfección en los cuales se añadió el plásmido pHW52-PB1, l veinticuatro horas después del paso se observó un efecto citopático inducido por el virus. No fue visible ningún efecto citopático si no se incluía el plásmido de expresión de PB1 en la reacción de transfección. El título de virus se determinó mediante titulación del sobrenadante de las células transfectadas sobre células MDCK; se halló que el sobrenadante contenía 2 x 10^{4} - 2 x 10^{5} pfu/ml. Este hallazgo muestra que después de la transfección del plásmido de PB1 - promotor de pol I/pol II (junto con los plásmidos de expresión) se sintetizaron ARNv - PB1 y proteínas PB1 en la línea celular humana 293T a un nivel suficiente para la generación de virus infecciosos de la gripe A. En los experimentos de transfección con plásmidos que contenían el ARNc - PB1 separado sobre dos plásmidos (pHW82-PB1 y pHW22-PB1), se halló un título de virus de 2 x 10^{4} pfu/ml; el experimento análogo usando los plásmidos con secuencias de PB1 de tipo natural (pPol I-WSN-PB1 y pHW22-PB1) dio como resultado un título de virus de 3 x 10^{6} pfu/ml.

A diferencia de la construcción de expresión con un promotor de la pol II usado en un estudio previo (Neumann y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 1999, 96:9345) se usó el plásmido pHW52-PB1 que contenía secuencias derivadas de la unidad de transcripción de la pol I que se insertó entre el promotor del CMV y el sitio de poliadenilación. La expresión del gen informador EGFP demuestra que la expresión completa de la proteína PB1 en este sistema es suficiente para la formación de complejos EGFP-RNP. Aunque la región del promotor de la pol I/finalizador contiene secuencias de reconocimiento para la transcripción específica de la pol I y factores de finalización (Beckmann y colaboradores, Sciencie 1995, 270:1506, Bell y colaboradores, Sciencie 1988, 241:1192; Kuhn y colaboradores, EMBO J. 1994, 13:416), estas proteínas de unión del ADN parece que no inhiben la transcripción intermediada por la pol II. Estos hallazgos son consistentes con el hallazgo de que las proteínas de unión del ADN específicas para la pol I son más abundantes en el núcleo, el compartimento en el cual tiene lugar la transcripción del ADNr celular (Evers y colaboradores, EMBO J. 1995, 14:1248). Estos resultados indican que después de la transfección de la construcción del promotor de la pol I/pol II dentro de la célula, algunos de los plásmidos son suministrados al núcleo, donde se produce la transcripción intermediada por la pol I y algunos son retenidos en el núcleo, donde son transcritos por la ARN polimerasa II.

Ya que la construcción informadora pHW52-PB1 contenía secuencias adicionales diferentes de las del virus de la gripe (sitios de restricción) en la región no codificante antes del codón de inicio y después del codón final, se interesó si estas secuencias se mantenían de forma estable en el segmento ARN - PB1 viral. Por lo tanto, se aisló el ARNv después de la segunda pasada del virus transfectante sobre células MDCK y se realizó un análisis PCR de transcripción inversa. La amplificación del ARNv con cebadores específicos para la PB1 dio como resultado la generación de fragmentos de ADNc de los tamaños esperados. Con los mismos ARN viral y cebadores, pero sin la adición de transcriptasa inversa, no se obtuvo producto de amplificación, mostrando que el ADNc se originó a partir del ARN viral y no a partir del ADN plasmídico llevado por el sobrenadante de células transfectadas.

La secuenciación de los productos de la PCR reveló que ambas secuencias del sitio de restricción estaban presentes en la molécula de ARN. Los resultados muestran que el sistema de transcripción de pol I/pol II permite la recuperación de virus infecciosos recombinantes y esos virus, con secuencias extrañas en la región no codificante del gen PB1, son viables. Este segmento modificado de PB1 aún se replica, transcribe y empaqueta dentro de partículas de virus. Previamente, usando el sistema de transfección de RNP, se cambió la región no codificante de segmentos del virus de la gripe A. Sustituyendo la región no codificante del gen NA con la secuencia correspondiente del segmento NS de la gripe B, se obtuvieron virus de gripe transfectantes (Muster y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 1991, 88:5177; Bergmann y Muster, J. Gen. Virol. 1995, 76:3211). Este tipo de virus con un segmento NA quimérico mostró un fenotipo atenuado en ratones y protegió a los ratones inoculados con una dosis no letal contra la infección del virus de la gripe de tipo natural. Estos resultados mostraron que la alteración genética de la región no codificante de un segmento de ARN puede cambiar las propiedades biológicas de un virus transfectante. Aquí, se informa por primera vez de que pueden insertarse secuencias, incluso de virus diferentes al de la gripe, dentro de la región no codificante del segmento PB1.

Con el sistema de transcripción de pol I/pol II ahora es posible modificar sistemáticamente estos elementos de la secuencia en la región no codificante del segmento PB1 y evaluar si estas manipulaciones genéticas dan como resultado cambios en las propiedades biológicas de los virus recombinantes. En efecto, el menor rendimiento de los virus con el segmento PB1 mutado en comparación con el virus de tipo natural indica que las secuencias insertadas influencian negativamente el crecimiento del virus.

Aunque el sistema de base plasmídica recientemente desarrollado (Neumann y colaboradores, supra) es altamente eficaz para la generación del virus de la gripe, supone la clonación de 14-18 plásmidos. En este estudio, el número de plásmidos se ha reducido a los 13 necesarios para la recuperación eficaz de la cepa del virus A/WSN/33 de la gripe. La reducción del número de plásmidos conseguida por este enfoque promete aumentar la eficacia de la transfección en líneas celulares diferentes de las células 293T, permitiendo así el suministro de genes a líneas celulares para las cuales el suministro eficaz de 14 plásmidos es difícil de conseguir. Fodor y colaboradores (J. Virol. 1999. 73:9679) fueron capaces de rescatar el virus de la influencia después de transfectar 14 plásmidos, pero el virus obtenido en este estudio fue solamente 1-2 partículas del virus infeccioso por 10^{6} células Vero transfectadas.

Ejemplo 2 Construcción de virus recombinantes de la gripe A a partir de un sistema mínimo de base plasmídica

Este ejemplo describe el uso de un sistema de transfección de base plasmídica para la recuperación de un virus de la gripe A completamente a partir de ADNc clonado. A diferencia de los sistemas de base plasmídica establecidos, este sistema para la generación del virus para la gripe A emplea la construcción y transfección de sólo ocho plásmidos de expresión, cada uno de los cuales contiene una copia de un ADNc viral diferente que se corresponde con un segmento de gen viral. Este sistema de genética inversa reduce el número de plásmidos necesarios para la recuperación de virus de la gripe A y permite la generación predecible y eficaz de virus de reordenamiento.

Materiales y procedimientos

Clonación de plásmidos. Se derivó el plásmido pHW2000 (figura 3A) a partir de pHW12 (ejemplo 1). El vector de clonación pHW2000 contiene 225 pb del promotor de la pol I humana y 33 pb de la secuencia del finalizador murino separados por dos sitios BsmBI. Los elementos del promotor de la pol I y del finalizador están flanqueados por un promotor intermedio precoz truncado del citomegalovirus humano (comenzando aproximadamente 350 pb cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción en el ADNpc3, Invitrogen, Carlsband, California) y por la señal de poliadenilación del gen que codifica la hormona bovina del crecimiento. Los ocho plásmidos que contiene el ADN del virus A/WSN/33 (H1N1) (pHW181-PB2, pHW182-PB1, pHW183-PA, pHW184-HA, pHW185-NP, pHW186-NA, pHW187-M y pHW188-NS) se construyeron insertando fragmentos ApaI-SalI (con ADNc viral y secuencias del promotor de la pol I y del terminador) de los plásmidos pPoII - WSN-PB2, pPoII-WSN-PB1, pPoII-WSN-PA, pPoII-WSN-NP, pPoII-WSN-HA, pPoII-WSN-NA (Neumann y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 1999, 96:9345), pHW127-M y pHW128-NS (Ejemplo I) dentro del fragmento del vector ApaI-SalI del pHW2000. Los ocho plásmidos que contienen el ADNc del A/Teal/HK/W312/97 (H6N1) (pHW241-PB2, pHW242-PB1, pHW243-PA, pHW244-HA, pHW245-NP, pHW246-NA, pHW247-M y pHW248-NS) se construyeron mediante amplificación de la reacción de la cadena de polimerasa transcriptasa inversa (RT-PCR) del ARN viral. Los cebadores usados en la reacción PCR contenían secuencias específicas de los segmentos en su extremo 3' y secuencias del sitio de restricción de BsmBI o BsaI en su extremo 5'. Después de la digestión de los productos de la PCR con BsmBI o BsaI, los fragmentos fueron clonados en el vector pHW2000 (figura 3A). Las secuencias de los cebadores usados para la amplificación del genoma de A/teal/HK/W312/97 (H6N1) se dan a continuación. Los cebadores se muestran de izquierda a derecha en correspondencia con los extremos 5' y 3'. Los nucleótidos específicos para la gripe A están subrayados.

NS:

Bm - NS nº 1: TAT TCG TCT CAG GGA GCA AAA GCA GGG TG

(núm. de identificación de secuencia: 5)

Bm - NS nº 2: ATA TCG TCT CGT ATT AGT AGA AAC AAG GGT GTT T

(num. de identificación de secuencia: 6)

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M:

Bm - M nº 1: TAT TCG TCT CAG GGA GCA AAA GCA GGT AG

(núm. de identificación de secuencia: 7)

Bm - M nº 2: ATA TCG TCT CGT ATT AGT AGA AAC AAG GTA GTT TTT T

(núm. de identificación de secuencia: 8)

\vskip1.000000\baselineskip

NA:

Bm - NA1 - 1: TAT T CG TCT CAG GGA GCA AAA GCA GGA GTT TAA CAT G

(núm. de identificación de secuencia: 9)

Bm - NA - 1413R: ATA TCG TCT CGT ATT AGT AGA AAC AAG GAG TTT TT

(núm. de identificación de secuencia: 10)

\vskip1.000000\baselineskip

HA:

Bm - H6 - 1: TAT TCG TCT CAG GGA GCA AAA GCA GGG GAA AAT G

(núm. de identificación de secuencia: 11)

Bm - NS nº 2: ATA TCG TCT CGT ATT AGT AGA AAC AAG GGT GTT T

(núm. de identificación de secuencia: 12)

(nota: los segmentos HA y NS tienen la secuencia idéntica en esta parte de la región no codificante)

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NP:

Ba - NP - 1: TAT TGG TCT CAG GGA GCG AAA GCA GGG TA

(núm. de identificación de secuencia: 13)

Ba - NP1565R: ATA TGG TCT CGT ATT AGT AGA AAC AAG GGT ATT

(núm. de identificación de secuencia: 14)

\vskip1.000000\baselineskip

PA:

Bm - PA1 - 1: TAT TCG TCT CAG GGA GCG AAA GCA GGT ACT GAT CC

(núm. de identificación de secuencia: 15)

Bm - PA1 - 2231R: ATA TCG TCT CGT ATT AGT AGA AAC AAG GTA CTT TTT

(núm. de identificación de secuencia: 16)

\vskip1.000000\baselineskip

PB1:

Bm - PB1a - 1: TAT TCG TCT CAG GGA GCG AAA GCA GGC AAA CC

(núm. de identificación de secuencia: 17)

Bm - PB1 - 2341R: ATA TCG TCT CGT ATT AGT AGA AAC AAG GCA TTT

(núm. de identificación de secuencia: 18)

\vskip1.000000\baselineskip

PB2:

Ba - PB2 - 1: TAT TGG TCT CAG GGA GCG AAA GCA GGT CAA TTA TAT TC

(núm. de identificación de secuencia: 19)

Ba - PB2 - 2341R: ATA TGG TCT CGT ATT AGT AGA AAC AAG GTC GTT TTT

(núm. de identificación de secuencia: 20)

\newpage

La reacción RT se realizó con el cebador 5' - AGC AAA AGC AGG - 3' (núm. de identificación de secuencia: 21). Para asegurarse que los ADNc virales derivados de la amplificación RT-PCR en los plásmidos de expresión no tenían mutaciones indeseadas, se secuenciaron los ADNc insertados.

Virus y cultivo celular. Los virus de la gripe A/WSN/33 (H1N1) y A/Teal/HK/W312/97 (H6N1) se propagaron en huevos embrionados de diez días. Se mantuvieron células del riñón canino Madin-Darby (MDCK) en Eagle Médium modificado (MEM) que contenía un 10% de FBS. Se cultivaron células del riñón embriónico humano 293T en Opti-MEMI (Life Technologies, Gaithersburg, Maryland) que concontenía un 5% de FBS. Para los experimentos de transfección se utilizaron seis placas de cultivo de tejido en alvéolos. El día antes de la transfección, se tripsinizaron células confluentes 293T y MDCK en un matraz de 75 cm^{2} y se mezcló un 10% de cada línea celular en 18 ml de Opti-MEM I; 3 ml de esta suspensión celular se sembró en un alvéolo de una placa de seis alvéolos. Las células cocultivadas MDCK y 293T (0,2-1 x 10^{6} células por cada alvéolo) se utilizaron para los experimentos de transfección. Se utilizó transIT LT-1 (Panvera, Madison, Wisconsin) de acuerdo con las instrucciones del fabricante para transceptar las células. Brevemente, se mezcló 2 \mul de transIT LT-1 por 1 \mug de ADN, se incubó a temperatura ambiente durante 45 minutos y se añadió a las células. Seis horas más tarde, la mezcla de transfección de ADN se sustituyó por Opti-MEM I. Treinta horas después de la transfección, se añadió a las células 1 ml de Opti-MEM I que contenía TPCK-tripsina; esta adición dio como resultado una concentración final de TPCK-tripsina de 0,5 \mug/ml en el sobrenadante de células. Se determinó el título de virus del sobrenadante de células mediante titulación del sobrenadante sobre células MDCK.

Aislamiento del ARN y RT-PCR. Se aisló RNA viral a partir de partículas de virus con el equipo RNeasy (Qiagen, Valencia, California), que se utilizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la caracterización de los virus recombinantes de la gripe, se utilizó el equipo Access RT-PCR (Promega, Madison, Wisconsin) de acuerdo con el protocolo suministrado. Se utilizaban los siguientes cebadores en los experimentos RT-PCR: Bm - NS#1 (5' - TAT TCG TCT CAG GGA GCA AAA GCA GGG TG - 3; (núm. de identificación de secuencia: 5) y Bm - NS#2 (5' - ATA TCG TCT CGT ATT AGT AGA AAC AAG GGT GTT TT - 3; (núm. de identificación de secuencia: 12). Se realizaron experimentos RT-PCR utilizando el motor de ADN PTC-200 (MJ Research, Watertown, Massachussets). El programa de amplificación se inició con un ciclo a 48ºC durante cuarenta y cinco minutos y un ciclo a 94ºC durante dos minutos. Estos ciclos fueron seguidos por cuarenta ciclos a 94ºC durante veinte segundos, a 52ºC durante treinta segundos y a 72ºC durante cuarenta segundos; el programa finalizó con un ciclo a 72ºC durante cinco minutos. Se analizaron los productos de la PCR mediante electroforesis de gel de agarosa y se secuenciaron con el cebador BmNS#1. El Centro de Biotecnología de St. Jude Children's Research Hospital determinó la secuencia del ADN de la matriz usando rodamina o equipos de reacción listos para la secuenciación de ciclo de finalizador de tinte con AmpliTaq® ADN polimerasa FS (Perkin-Elmer, Applied Biosystems, Inc. [PE/ABI], Foster City, California) y oligonucleótidos sintéticos. Las muestras se expusieron a electroforesis, detección y análisis sobre secuenciadores de ADN PE/ABI modelo 373 Stretch o modelo 377.

Resultados

Establecimiento del sistema pol I - pol II para la generación de A/WSN/33 (H1N1). Ya que el genoma del virus de la gripe A contiene ocho segmentos, se razonó que la inserción de la totalidad de los ocho ADNc de la gripe A entre un promotor de pol I y un promotor de pol II debería dar como resultado la transcripción de los ocho ARNv, todos los ARN virales, y la síntesis de la totalidad de las 10 proteínas virales (figura 1). Entonces, después del ensamblaje de todas las ribonucleoproteínas con las proteínas estructurales, debería formarse el virus infeccioso de la gripe A (figura 2).

Para comprobar si con este sistema de transcripción bidireccional podía recuperarse el virus de la gripe A, se construyeron los ocho plásmidos de expresión (pWH181-PB2, pWH182-PB1, pWH183-PA, pWH184-HA, pWH185-NP, pWH186-NA, pWH187-M y pWH188-NS) (tabla 1) que contenían los ocho ADNc deA/WSN/33 (H1N1). Los ocho plásmidos (1 \mum de cada plásmido) se cotransfectaron dentro de células 293T - MDCK transitoriamente cocultivadas. Ambas líneas celulares fueron cocultivadas en un alvéolo de cocultivo celular el día anterior a la transfección para asegurar unas condiciones de alta eficiencia de transfección de ADN (células 293T) y una alta eficiencia de replicación (células MDCK) del virus de la gripe A. Después de 48 y 72 horas, las células MDCK mostraron un efecto citopático inducido por el virus, pero no se observó efecto citopático después de la transfección de siete plásmidos sin la construcción de expresión de PB1 (tabla 1). Se determinó el título de virus en el sobrenadante en diferentes momentos después de la transfección mediante titulación en las células MDCK. Veinticuatro horas después de la transfección el supernadante de células contenía 1 x 10^{3} virus por ml; 72 horas después de la transfección se generaron 1 x 10^{7} virus infecciosos por ml (tabla 1). Los virus recuperados se hicieron pasar dos veces por células MDCK. Para verificar que el virus generado era el virus A/WSN designado, se produjo el ADNc para el gen NS mediante RT-PCR (figura 4A, carril 8). La generación de dos fragmentos después de la digestión con la endonucleasa de restricción Ncol (figura 4B, carril 8) y el análisis de la secuencia de los fragmentos amplificados confirmaron que el virus recuperado era en efecto el virus A/WSN designado. Estos hallazgos muestran que la síntesis controlada por pol I - pol II del ARNv y del ARNm a partir de ocho matrices da como resultado la generación del virus infeccioso de la gripe A.

TABLA 1 Conjuntos de plásmidos usados para la recuperación de virus A7WSN/33 y A/Teal/HK/W312/97

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Recuperación de A/Teal/HK/W312/97 (H6N1) cotransfectando los ocho plásmidos. El virus de la gripe A/WSN/33 (H1N1), originalmente derivado de la cepa pandémica de la gripe humana de 1918 (Goto y Kawaoka, Proc. Acad. Sci. EE.UU. 1998, 95:10224; Reid y asociados, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 1999, 96:1651), ha sido pasado en cerebro de ratón y está bien adaptado para crecer en cultivo celular. Para evaluar la eficacia del sistema de ocho plásmidos para la generación de un virus a partir del ADNc clonado que no está todavía adaptado al crecimiento en cultivo celular, se intentó la generación del virus A/Teal/HK/W312/97 (H6N1) a partir de ADNc clonado solo. Este virus fue aislado de una cerceta muerta durante el brote del H5N1 en Hong Kong en 1997. El análisis genético del virus reveló que había siete segmentos con más de un 97% de homología de nucleótidos con las cepas del virus patógeno H5N1. Se extrajo ARN del fluido alantoideo infectado y se insertaron los ADNc amplificados mediante RT-PCR dentro del pHW2000; esta inserción dio como resultado ocho plásmidos de expresión (figura 3). Setenta y dos horas después de la transfección de los pWH241-PB2, pWH242-PB1, pWH243-PA, pWH244-HA, pWH245-NP, pWH246NA, pWH247-M y pWH248-NS (1 \mum cada uno) dentro de células 293T - MDCK cocultivadas, se observo un efecto citopático inducido por el virus en las células MDCK (tabla 1). La producción de virus fue de 2 x 10^{5} virus infecciosos por ml del sobrenadante de células transfectadas. Según se muestra en la figura 4 (A y B, carril 2), se verificó la identidad del virus recuperado mediante caracterización del segmento NS. Estos resultados indican que este sistema plasmídico requiere la clonación de solamente ocho ADNc dentro de un vector plasmídico y que la transfección de los ocho plásmidos de expresión permite la recuperación de un virus de la gripe A con la actividad antigénica de un virus todavía no adaptado al crecimiento en células de mamíferos.

Recuperación de virus de reordenamiento de la gripe A. Se comprobó la utilidad del sistema de ocho plásmidos para la generación de virus de reordenamiento. Ya que el sistema de transfección de ADN no requiere ningún sistema de selección, puede conseguirse la recuperación de virus de reordenamiento mediante combinaciones adecuadas de plásmidos de expresión en las reacciones de transfección. Siete plásmidos de expresión que contenían el ADNc del A/Teal/HK/W312/97 (H6N1) fueron cotransfectados con un plásmido de expresión que contenía el ADNc de A/WSN/33 (H1N1) (tabla 2). Se obtuvieron altas producciones de virus de reordenamiento que contenían siete segmentos del virus de la cerceta y el segmento M o el segmento NS del virus WSN. Se obtuvo una menor producción de virus de reordenamiento NA y HA (tabla 2). Ya que con el sistema de ocho plásmidos fueron rescatados virus de reordenamiento simple, el siguiente paso fue determinar si podía rescatarse un virus con múltiples segmentos derivados de un virus. Por consiguiente, se transfectaron cuatro plásmidos de expresión que contenían el ADNc de los genes del complejo RNP del virus H6N1 (pWH241-PB2, pWH242-PB1, pWH243-PA y pWH245-NP) junto con los plásmidos pWH184-HA, pWH186-NA, pWH187-M y pWH188-NS que contenían el ADNc del virus WSN (tabla 2). Se recuperaron 4 x 10^{6} virus por ml de sobrenadante de células. Según se muestra en la figura 4 (carril 10), el segmento NS amplificado del virus de cuádruple reordenamiento fue dividido por Ncol; así, el segmento NS se deriva del virus WSN. Estos resultados muestran que el sistema de transfección de ocho plásmidos permite la recuperación de virus de reordenamiento simple y cuádruple.

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TABLA 2 Generación de virus de reordenamiento de la gripe A entre A/Teal/HK/W312/97 (H6N1) y A/WSN/33 (H1N1) cotransfectando los ocho plásmidos

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Análisis

La capacidad de recuperación de virus de gripe A después de la transfección de los ocho plásmidos de expresión que contenían el ADNc de A/Teal/HK/W312/97 (H6N1) o de A/WSN/33 (H1N1) prueba que el sistema de transcripción de pol I - pol II proporciona cantidades de ARNv y de proteínas virales suficientes para la formación de virus infecciosos de la gripe A. Se sintetizaron dos tipos de ARNm que se diferencian en sus regiones de codificación (figura 1). El tipo de ARNm que codifica todas las proteínas virales fue transcrito directamente por pol II. Además de las secuencias del virus de la gripe de las regiones no codificantes (NCR), estos ARNm contienen secuencias del promotor de pol I y de las regiones del finalizador murino. En gran medida, el sistema de expresión de pol I - pol II desarrollado contenía sólo 33 pb de secuencias del finalizador murino. Estudios previos usando los genes indicadores cloramfenicol acetiltransferasa (CAT) y proteína fluorescente verde (GFP) mostraron que las secuencias en la región del finalizador de 174-pb reducían la expresión intermediada mediante pol II de la proteína (Hoffmann, E. Ph.D. Thesis 1997, Universidad de Justus Liebig, Giessen, Alemania). Después de la iniciación de la replicación viral y del proceso de transcripción se genera un segundo tipo de ARNm (figura 2). Este ARNm es sintetizado por proteína de polimerasa viral y contiene una estructura de remate 5 derivada de ARN celulares apropiándose del remate que precede las secuencias no codificantes del virus de la gripe. Las proteínas estructurales traducidas a partir de ambos ARNm se asocian con los complejos RNP para formar nuevas partículas de virus. Después de la gemación de los virus transfectados, las partículas de virus generadas pueden replicarse en las células 293T y en las células MDCK cocultivadas.

A diferencia de los enfoques analizados en los Antecedentes de la invención, supra, el procedimiento de la invención despliega los ocho ADNc en ocho plásmidos que contenían 225 pb de las secuencias del promotor de pol I y 33 pb de las secuencias del finalizador. En el sistema pol I - pol II, la totalidad de las 10 proteínas virales se expresan a partir de un promotor truncado inmediato - precoz del citomegalovirus humano. El hecho de que la expresión de todas las proteínas estructurales con el sistema de 17 plásmidos (Neumann y asociados, Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU. 1999, 96:9345) y con el sistema de 8 plásmidos (este estudio) diera como resultado una eficacia de recuperación de virus mayor que con la cotransfección de plásmidos que expresan las proteínas del complejo RNP (Neumann y asociados, supra; Fodor y asociados, J. Virol. 1999, 73:9679) soporta la idea de que la generación de virus de la gripe A se mejora suministrando las proteínas HA, NA, M1, M2 y NS2 precozmente después de la transfección.

El ciclo de replicación viral involucra una interacción compleja de las proteínas virales entre sí y con factores celulares (Ludwig y asociados, Virol. Immunol. 1999, 12:175). Así, para la generación de virus infecciosos, la síntesis controlada por plásmidos de moléculas virales debe proporcionar concentraciones óptimas de proteínas virales para la iniciación del ciclo de replicación y para la formación de partículas similares a las de los virus. Aunque el sistema de ocho plásmidos demostró ser eficaz, puede que sea posible aumentar adicionalmente la producción de virus. Se observó que la razón de plásmidos transfectados que expresan las proteínas del complejo RNP y la expresión de la proteína M1 ejerce influencia sobre la actividad de la transcriptasa (Pleschka y asociados, J. Virol. 1996, 70:4188; Pérez y Donis, Virology 1998, 249:52). La eficacia de la formación de partículas similares a las de los virus depende también de la concentración de proteínas virales estructurales (Mena y asociados, J. Virol. 1996, 70:5016; Gómez-Puertas y asociados, J. Gen. Virol. 1999, 80:1635; Neumann y asociados, J. Virol. 2000, 74:547). La eficacia de la generación de virus infecciosos con el sistema pol I - pol II podría incrementarse adicionalmente por lo tanto variando las concentraciones de plásmidos utilizados en la reacción de transfección o usando plásmidos de expresión con promotores de pol II diferentes. Ya que la eficacia de la escisión intermediada por factores celulares tiene influencia en la capacidad de replicación de las cepas del virus de la gripe A (Lau y Scholtissek, Virology 1995, 212:225), el uso de líneas celulares diferentes de las 293T puede aumentar la producción de virus para ciertas cepas de la gripe A. La alta producción de virus de reordenamiento cuádruple (tabla 2) es consistente con el hallazgo de que la rápida replicación de A/WSN/\cdot\cdot (H1N1) en células cultivadas está intermediada por los segmentos HA, NA y M (Goto y Kawaoka, porc. Hatl. Acad. Sci. EE.UU. 1998, 95:10224; Schulman y Palese, J. Virol. 1977, 24:170; Yesuda y asociados, J. Virol. 1994, 68:8141).

La generación de reordenaciones viables (tabla 2) entre el virus aviar H6N1 y el virus humano H1N1 indica que este virus H6N1 puede adquirir segmentos de genes de un virus poco relacionado. Análisis genéticos sugirieron que los virus patógenos H5N1 se generaron mediante reordenamiento (Xu y asociados, Virology 1999, 261:15). Se hallaron segmentos de genes similares al H5N1 en los subtipos H6N1 y H9N2 (Guan y asociados, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 1999, 96:9363), un hallazgo que indica que estos virus podrían haber sido precursores de los virus patógenos H5N1. Es probable que en el futuro se produzcan eventos de reordenamiento que podrían crear nuevos virus patógenos de la gripe. Sin embargo, la capacidad de generar y manipular estos virus mediante el procedimiento simplificado desarrollado en este estudio ayudará a los investigadores a entender mejor las propiedades biológicas de estos virus y a desarrollar vacunas eficaces para proteger a la población contra ellos. El periodo transcurrido entre la emergencia de una nueva cepa patógena y la preparación de la vacuna es una variable crucial en la eficacia de un programa de vacunación. La capacidad de generar virus clonando solamente ocho plásmidos reduce el tiempo necesario para la generación de potenciales candidatas para la vacuna y mejora los sistemas de genética inversa existentes simplificando la creación de virus y reduciendo el coste total de producción de una vacuna.

El concepto de introducción de ADNc viral entre un promotor de pol I y un promotor de pol II dentro de células eucarióticas para la recuperación de virus puede aplicarse también a la generación de otros miembros de la familia Orthomyxoviridae. Para el virus de la gripe B, esta estrategia requeriría la construcción y cotransfección de ocho plásmidos; para la gripe C, siete y para el Thogotovirus, seis. La transcripción in vivo de ARN provisto de remate 5' así como de ARNv desde la misma matriz de ADNc puede simplificar también los sistemas de base plasmídica para otros virus de ARN o incluso facilitar el establecimiento de sistemas pol I - pol II para virus de otras familias (por ejemplo, Arenaviridae, Bunyaviridae).

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Ejemplo 3 Sistema de ARN pol I/pol II para la generación de virus de la gripe B a partir de ADNc clonado

Virus de la gripe A y B cada uno de los cuales contiene ocho segmentos de ARN de cadena simple con polaridad negativa (para verificación véase Lamb y Krug, "Orthomyxoviridae: The viruses and their replication"; en Fields (ediciones), Virology; páginas 1353-1395). A diferencia de la gripe A, los ocho segmentos de la gripe B codifican 11 proteínas. Los tres genes de mayor tamaño codifican los componentes de la ARN polimerasa, PB1, PB2 y PA; el segmento 4 codifica la hemaglutinina. El segmento 5 codifica la nucleoproteína, el mayor componente estructural asociado con el ARN viral, el segmento 6 codifica la neuraminidasa (NA) y la proteína NB. Ambas proteínas, NB y NA, se traducen a partir de marcos de lectura superpuestos de ARNm biscistrónico. El segmento 7 de la gripe B también codifica dos proteínas: BM1 y BM2. El segmento más pequeño codifica dos productos: NS1 se traduce a partir del ARN de longitud completa, mientras que NS2 se traduce a partir de ARNm escindido.

La construcción de los plásmidos de expresión que contienen el ADNc de la gripe B supone la misma estrategia que la descrita para la generación del virus de la gripe A A/Teal/HK/W312/97 (H6N1). Primero se aísla el ARN a partir de partículas de virus obtenidas del fluido alantoideo infectado, por ejemplo, B/Lee/40. Basándose en las secuencias conservadas de la región no codificante, se preparan cebadores para la RT-PCR y se utilizan para la síntesis de ADNc. En el extremo 5' esos cebadores contienen secuencias para la restricción de las endonucleasas BSmBI y BsaI. La digestión de los productos de la PCR con BSmBI o BsaI permite la inserción dentro del vector de clonación pHW2000 (o pHW11) linealizado con BSmBL. Para asegurarse que el ADNc de los plásmidos no tiene mutaciones indeseadas debido a errores cometidos por la polimerasa durante la PCR, las construcciones tienen que ser secuenciadas.

La cotransfección de células 293T - MDCK (o COS-1 - MDCK) cocultivadas y la adición de tripsina da como resultado la generación del virus infeccioso de la gripe B. Los sobrenadantes de células transfectadas se hacen pasar entonces sobre nuevas células MDCK. El título de virus resultante puede determinarse mediante procedimientos estándar, por ejemplo, el ensayo de HA y el ensayo de placa. La RT-PCR realizada con cebadores específicos para cada segmento de gen permite la amplificación del ARN del virus recombinante de la gripe B. La secuenciación de los productos confirma que el virus generado es realmente el virus deseado de la gripe B.

Ejemplo 4 Sistema de recuperación de ocho plásmidos para el virus de la gripe A de cepa maestra

Para determinar la utilidad comercial de este sistema de base plasmídica para la producción de vacunas, se generó la cepa maestra A/PR/8/34 (H1N1), actualmente usada para la producción de una vacuna inactivada, completamente a partir de ADNc clonado tal como se describió en el ejemplo 2. La producción de virus, según se determino mediante ensayo HA después de pasar el virus recombinante al interior de huevos, fue tan alta como la producción de virus del virus parenteral de tipo natural. Estos resultados prueban que el virus recombinante generado tiene el potencial de mejorar los procedimientos actualmente usados para la producción de virus para vacunas.

Materiales y procedimientos

Virus y transfección. El virus de la gripe A/PR/8/34 (H1N1) se obtuvo a partir del repositorio de St Jude Childrens's Research Hospital y se propagó en huevos de gallina embrionados de 10 días. Células Madin-Darby del riñón canino (MDCK) se mantuvieron en MEM que contenía un 10% de FBS. Se cultivaron células del riñón embrionario humano 293T y células Vero en Opti-MEM (Life Technologies, Gaithersburg, MD) que contenía un 5% de suero bovino fetal (FBS). Para los experimentos de transfección se utilizaron placas de cultivo de tejido de seis alvéolos. Las células MDCK y 293T cocultivadas (0,21 x 10^{6} de cada una de las células por alvéolo) se utilizaron para los experimentos de transfección. Se utilizó TransIT LT-1 (Pavera, Madison, WI) de acuerdo con las instrucciones del fabricante para transfectar las células. Brevemente, se mezcló 2 \mum de TransIT LT-1 por 1\mum de ADN, se incubó a temperatura ambiente durante 45 min y se añadieron a las células. Seis horas más tarde, la mezcla de transfección de ADN se sustituyó por Opti-MEM L. Veinticuatro horas después de la transfección, se añadió 1 ml de Opti-MEM I que contenía tripsina TPCK a las células; esta adición dio como resultado una concentración final de tripsina TPCK de 0,5 \mum/ml en el sobrenadante de células. El título de virus fue determinado mediante el paso del sobrenadante de células sobre células MDCK por ensayo de placa.

RT-PCR y construcción de plásmidos. Se extrajo ARN viral de 200 \mum de fluido alantoideo de huevos embrionados usando el Qiagen RNeasy Kit. Se empleó RT-PCR de dos pasos para amplificar cada uno de los segmentos del gen viral. Brevemente, el ARN se transcribió en ADNc usando transcriptasa inversa AMV (Roche Diagnostics, Alemania) de acuerdo con el protocolo suministrado y se amplificó el ADNc usando el sistema PCR Expand High Fidelity (Roche Diagnostics, Alemania). El programa de amplificación se inició con 1 ciclo a 94ºC durante 2 minutos; seguido de 30 ciclos a 94ºC durante 20 segundos, 54ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 3 minutos; el programa finalizo con un ciclo a 72ºC durante 5 minutos. Los cebadores usados contenían cualquiera de las secuencias para BsaI o BsmBI para permitir la inserción precisa de fragmentos de la PCR digeridos dentro del vector de clonación pHW2000 (véase el ejemplo 2).

Para la clonación de los genes HA, NP, NA, M, NS los fragmentos de la PCR fueron digeridos con BsaI o BsmBI y ligados dentro del vector de clonación pHW2000. Para clonar los genes P se aislaron dos (PB2, PA) o tres (PB1) fragmentos, se digirieron y se ligaron dentro del pHW2000 - BsmBI. Para asegurarse que los genes estaban libres de mutaciones no deseadas, se secuenciaron los fragmentos derivados de la PCR. Los ocho plásmidos que contenían el ADNc de longitud completa de A/PR/8/34 (H1N1) se designaron pHW191-PB2, pHW192-PB1, pHW193-PA, pHW194-HA, pHW195-NP, pHW196-NA, pHW197-M y pHW198-NS. El Centro de Biotecnología del St Jude Childrens's Research Hospital determinó la secuencia del ADN de la matriz usando equipos de reacción listos para la secuenciación del ciclo finalizador-tinte de rodamina o de dRhodamina con ADN polimerasa FS de AmpliTaq® (Perkin-Elmer, Applied Giosystems, Inc. [PE/ABI], Foster City, CA) y oligonucleótidos sintéticos. Se expusieron muestras a electroforesis, detección y análisis sobre el modelo 373 PE/ABI, el modelo 373 de Stretch o el modelo 377 de secuenciadores de ADN.

Resultados

Para permitir la síntesis intracelular de ARNv y ARNm similares a los de los virus, se ha establecido el sistema de expresión de la ARN pol I - pol II (véase el ejemplo 2). En este sistema se inserta ADNc entre el promotor de la ARN polimerasa humana (pol I) y unas secuencias de finalización. Esta unidad completa de transcripción de pol I está flanqueada por un promotor de la ARN polimerasa II (pol II) y un sitio poli(A). La orientación de las dos unidades de transcripción permite la síntesis de ARN viral de sentido negativo y de ARNm de sentido positivo a partir de una matriz de ADNc viral. Este sistema pol I - pol II comienza con la iniciación de la transcripción de las dos enzimas de la ARN polimerasa celular a partir de sus propios promotores, presumiblemente en compartimentos separados del núcleo (véase la figura 1). La transfección de los ocho plásmidos en las células 293T da como resultado la interacción de todas las moléculas derivadas de la maquinaria de transcripción y la traducción celular y viral, generando finalmente el virus infeccioso de la gripe A. Este sistema demostró ser muy eficaz para la formación de los virus de la gripe A/WSN/33 (H1N1) y A/Teal/HK/W312/97 (H6N1) (ejemplo 2).

Como la cepa maestra actual para la producción de la vacuna de la gripe inactivada es A/PR/8/34 (H1N1), se intentó generar este virus completamente a partir de ADNc clonado. Los ADNc que representaban los ocho segmentos de ARN se insertaron dentro del vector pHW2000. Los plásmidos resultantes (pHW191-PB2, pHW192-PB1, pHW193-PA, pHW194-HA, pHW195-NP, pHW196-NA, pHW197-M y pHW198-NS) se transfectaron dentro de células cocultivadas 293T - MDCK o Vero - MDCK. Setenta y dos horas después de la transfección se determinó el título de virus mediante titulación en células MDCK. El sobrenadante de células cocultivadas Vero - MDCK contenía 1 x 10^{4} pfu y el sobrenadante de células cocultivadas 293T - MDCK contenía 2 x 10^{6} pfu por ml. La producción más alta en células 293T - MDCK probablemente está provocado por la mayor eficiencia de transfección de las células 293T en comparación con la células Vero. Estos resultados muestran que el sistema de ocho plásmidos permite la generación de A/PR/8/34 (H1N1) a partir de ADNc clonado.

Para comparar el crecimiento entre los virus de tipo natural y los virus recombinantes generados, se inocularon huevos de gallina embrionados con el virus de tipo natural o el virus recombinante. El fluido alantoideo se recogió 48 horas después de la infección. El rendimiento del virus se determinó mediante ensayo HA. Aunque los títulos HA fueron diferentes entre huevos individuales, se encontró que ambos virus tenía títulos HA de entre 5120 y 10240 unidades de hemaglutinación, que indicaban que ambos virus tienen aislados de alto rendimiento. Así, el virus recombinante que se generó mediante transfección de ADN tiene el mismo fenotipo robusto de cultivo que el aislado parenteral.

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Análisis

El sistema de ocho plásmidos de la invención evita el uso de plásmidos separados para la expresión de proteínas (véase los antecedentes de la invención), simplificando así el procedimientos de generación del virus de la gripe A completamente a partir de ADN clonado. La producción de vacunas comprende la generación de un virus que se usa como semilla de virus para la producción de un virus de vacuna bien en huevos o bien en cultivo celular. La eficacia de un programa de vacunación depende de la selección de un subtipo que concuerde en gran medida con las cepas patógenas circulantes para estimular un alto título de anticuerpos específicos en la población vacunada, dando como resultado una protección eficaz. Los seis plásmidos maestros del A/PR/8/34 (pHW191-PB2, pHW192-PB1, pHW193-PA, pHW195-NP, pHW197-M y pHW197-M) que codifican los genes internos de la gripe A pueden ahora utilizarse en contransfección con plásmidos que codifican las glicoproteínas HA y NA de una cepa actualmente circulante. La capacidad para manipular cada segmento de gen también nos permitirá evaluar qué segmentos de gen son importantes para el crecimiento de alta producción de los virus de reordenamiento en huevos así como en cultivo celular.

El hecho de que seamos capaces de generar dos cepas A/WSN/33 (H1N1) y A/PR/8/34 (H1N1)) y un aislado de campo (A/Teal/HK/W312/97 H6N1)) cotransfectando solamente ocho plásmidos sugiere que este sistema es aplicable para el desarrollo de vacunas de gripe viva atenuada. Las vacunas de virus de la gripe vivos y atenuados, intranasalmente administradas, inducen inmunidad local, mucosal, de intermediación celular y humoral. Los virus de reordamiento (CR) adaptados al frío (ca) que contienen los seis genes internos de la gripe atenuada A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) y la hemaglutinina (HA), y la neuraminidasa (NA) de los virus de la gripe de tipo natural actuales parecen estar atenuados de manera fiable. Esta vacuna ha demostrado ser eficaz en niños y adultos jóvenes (Keitel & Piedra en Textbook of influenza, Nicholson y asociados, ed. 1998, 373-390). Sin embargo, parecen estar demasiado atenuados para estimular una respuesta inmune ideal en gente mayor edad, el principal grupo de los 20.000 a 40.000 individuos que mueren cada año en EE.UU. como resultado de la infección por gripe. La contribución de cada segmento al fenotipo atenuado todavía no está bien definida (Keitel & Piedra, supra). Esta información puede adquirirse sólo mediante la introducción secuencial de mutaciones específicas de atenuación definida dentro de un virus. Ya que un análisis detallado requiere la comprobación de un gran número de virus manipulados, la construcción y transfección de sólo ocho plásmidos simplifica esta tarea y reduce el tiempo y el coste de consecución de esta objetivo.

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Ejemplo comparativo 5

Sistema de transcripción unidireccional de ARN polimerasa I - polimerasa II para la generación de un virus de la gripe A a partir de ocho plásmidos

Los ejemplos previos describen un sistema para la generación de un virus de la gripe A cotransfectando solamente ocho plásmidos a partir de los cuales se expresan ARNv de sentido negativo y ARNm de sentido positivo (este trabajo fue subsiguientemente publicado; véase Hoffmann y asociados, 2000, Proceedings of the National Academy of Sciences, EE.UU. 97, 6108-6113). Este ejemplo describe el establecimiento de un sistema de transcripción diferente para la expresión de ARN similares a los de los virus, que permiten la síntesis intracelular de ARNc de sentido positivo carentes de remate y ARNm con remate en 5' a partir de una matriz. La cotransfección de ocho plásmidos promotores en tándem de la ARN pol I - pol II que contenían el ADNc de A/WSN/33 (H1N1) dio como resultado la generación del virus infeccioso de la gripe A, aunque con una menor producción de virus que en el sistema bidireccional. Nuestro enfoque para la producción bien de ARNv y ARNm o bien de ARNc y ARNm intracelularmente a partir de un conjunto mínimo de plásmidos es útil para el establecimiento u optimización de sistemas de genética inversa de otros virus de ARN.

Los resultados expuestos en este ejemplo fueron publicados (véase Hoffmann y Webster, J. Gen. Virol. 2000, 81:2843).

Para la generación de virus de ARN de sentido negativo puede servir como matriz bien ARNv de sentido negativo o bien ARNc de sentido positivo. Para reducir el número de plásmidos para la recuperación del virus, razonamos que podría ser posible para la ARN pol I y pol II celular sintetizar ARNc y ARNm a partir de una matriz. Por lo tanto, se intentó desarrollar un sistema de transcripción de pol I - pol II unidireccional (figura 5). El ADNc viral se inserta en la orientación del sentido positivo entre un promotor de la ARN pol I y una secuencia del finalizador. Esta unidad completa de transcripción de pol I se inserta en la orientación del sentido positivo entre un promotor de la ARN pol II y un sitio de poliadenilación (figura 5). De forma diferente, se esperaba que el ARnv de sentido negativo y el ARNm de sentido positivo generados en nuestro sistema de transcripción bidireccional (figura 1) sintetizasen dos tipos de ARNv de sentido positivo. A partir del promotor de pol II, en el nucleoplasma debería transcribirse un ARNm con una estructura de remate 5'. Este transcrito debería traducirse en proteína. En el nucleolo, se espera que la pol I celular sintetice ARNc del virus de la gripe de sentido positivo de longitud completa con un grupo de tiofosfato en el extremo 5' (figura 5). Se construyó un vector de clonación, pHW11, que puede usarse para la inserción de fragmentos arbitrarios de ADNc (figura 6). Este plásmido contiene el promotor de la pol II (promotor inmediato del citomegalovirus humano) y el promotor de la pol I humana que está cadena arriba de una secuencia del finalizador de pol I y un sitio poli(A).

Para comprobar si puede generarse un virus infeccioso de la gripe A sintetizando ARNc y ARNm a partir de una matriz única, se construyeron ocho plásmidos. Los plásmidos pHW171-PB2, pHW172-PB1, pHW173-PA, pHW174-HA, pHW175-NP, pHW176-NA, pHW177-M y pHW178-NS contienen los ADNc que representan los ocho segmentos de gen de la cepa A/WSN/33 (H1N1) de la gripe A. Todos estos ADNc están en la orientación del sentido positivo con respecto a los promotores de pol I y pol II. Los ocho plásmidos (1\mum de cada plásmido) fueron transfectados dentro células 293T o COS-1 con o sin cocultivo con células MDCK según se describe en el ejemplo 2. Se determinó la producción del virus en el supernadante de células transfectadas en diferentes momentos mediante ensayo de placa después de pasar sobre células MDCK. Cuarenta y ocho horas después de la transfección se produjeron 2-5 x 10^{3} viriones infecciosos (tabla 3). Setenta y dos horas después de la transfección el supernadante contenía 4 x 10^{4} pfu/ml después de la transfección de células 293T ó 2 x 10^{4} pfu/ms después de la transfección de células COS-1. La producción de virus después de 72 h podría aumentarse mediante el cocultivo de células 293T o células COS-1 con células MDCK (tabla 3).

La generación de virus prueba que después de la transfección de los ocho plásmidos, la ARN pol I sintetizó los ocho ARNc de sentido positivo desprovistos de remate. Las cuatro proteínas de polimerasa viral traducidas a partir de la ARN pol II celular sintetizó transcritos unidos a los ARNc desnudos similares a los del los virus para formar RNPc. La subunidad de polimerasa PB1 es importante para el reconocimiento de la estructura de terminales y la unión los ARNc similares a los de los virus (González & Ortín EMBO J. 1999, 18:3767; González & Ortín, J. Virol. 1999, 73:631; y 1999b; Li y asociados, EMBO J. 1998, 17:5844). La interacción con otras proteínas de la polimerasa inició el ciclo de replicación - transcripción, que dio como resultado las síntesis de RNPv y de ARNm virales (Toyoda y asociados, J. Gen. Virol. 1996, 77:2149; González y asociados, Nucl. Acids Res. 1996, 29:4456). En el sistema de transcripción de pol I - pol II, se sintetizan dos tipos de ARNm diferentes. Uno se transcribe directamente a partir del ADN plasmídico mediante la ARN pol II y contiene la secuencia del promotor de pol I 225-nt en el extremo 5' y la secuencia del finalizador de pol I en el extremo 3'. Se sintetiza otro ARNm mediante proteínas virales del complejo de polimerasa que utiliza el ARNv como matriz. La estructura del remate 5' de este ARNm se adquiere mediante el mecanismo de apropiación de remates en el cual la subunidad PB2 de polimerasa toma el remate de los ARN celulares (Ulmanen y asociados, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 1981, 21:3607). Aunque ambos tipos de ARNm se diferencian en sus regiones no codificantes 5' y 3', contienen los mismos marcos abiertos de lectura para todas las proteínas virales. Las proteínas estructurales traducidas junto con las RNPv se montan para crear el virus infeccioso de la
gripe A.

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(Tabla pasa a página siguiente)

6

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Aunque la generación de virus WSN a partir de células transfectadas con ocho plásmidos de promotores en tándem demostró ser muy fiable, el rendimiento viral conseguido mediante este enfoque de ARNc - ARNm fue menor que el del sistema bidireccional que produce transcripciones de ARNv y ARNm (tabla 3). Setenta y dos horas después de que las células 293T y COS-1 hubieran sido transfectadas con los ocho plásmidos que contenían el sistema de transcripción bidireccional pol I - pol II (figura 1; ejemplo 2; véase Hoffmann y asociados, Natl. Acad. Sci. EE.UU. 2000, 97:6108; pHW181-PB2, pHW182-PB1, pHW183-PA, pHW184-HA, pHW185-NP, pHW186-NA, pHW187-M y pHW188-NS), el título de los virus era 1 x 10^{7} pfu/ml (tabla 3). Veinticuatro horas después de la transfección de las células COS-1 ó 293T se encontraron 0,4 x 10^{3} pfu/ml en el sobrenadante. Estos datos muestran que el sistema bidireccional de ocho plásmidos tiene la misma eficacia para la generación de virus con cinética similar que el sistema de plásmidos múltiples, más complicado y tedioso, que requiere la transfección de 12 ó 17 plásmidos (Neumann y asociados, Proc Natl. Acad. Sci. EE.UU. 1999, 96:9345).

No se encontraron virus infecciosos 24 h después de la transfección con ocho plásmidos de promotores en tándem (tabla 3). Estos resultados sugieren que las diferencias en la producción de virus entre los enfoques de ARNv - ARNm y ARNc - ARNm se deben a las diferentes polaridades de las transcripciones primarias de la pol I. El sistema bidireccional comienza con la síntesis intracelular del ARNv, una situación que se asemeja a la infección natural de la gripe A en la cual los ARNv son transportados al núcleo y los ARNv sirven inicialmente como matrices para la síntesis de ARNm y ARNc. En el sistema unidireccional, las RNP son las primeras unidades competentes en la replicación que se producen. Para producir ARNm, el ARNc tiene que replicarse en ARNv, y finalmente los ARNv son empaquetados en partículas de virus de progenie (Hsu y asociados, J. Gen. Virol. 1987, 77:2575). A causa de las reacciones adicionales requeridas para la generación de RNPv a partir de RNP, la formación de virus en el sistema unidireccional se produce en un momento posterior al momento de la formación de los virus mediante el sistema bidireccional.

Otras posibles razones para las diferencias en la producción de virus de los dos sistemas son que los elementos de la secuencia en el ADNc disminuyen la eficacia de la transcripción finalizando la transcripción, o que las secuencias en los transcritos del ARN reducen el nivel de estado de disponibilidad de los transcritos de la pol I o de la pol II. Una concentración menor de sólo uno de los ocho ARNc o ARNm similares a los de los virus reduce la eficacia total del sistema a causa de que la totalidad de las RNPv y de las proteínas estructurales tienen que sintetizarse en concentraciones que sean óptimas para la replicación de los virus y para el ensamblaje de los virus.

La alta eficiencia del sistema de ocho plásmidos para la generación del virus de la gripe A indica que este sistema se adapta a otros Orthomyxovirus, por ejemplo el virus de la gripe B, el virus de la gripe C y el Thogotovirus. Los resultados de este estudio sugieren que el sistema ARNv - ARNm será la forma más eficaz para generar estos virus completamente a partir de plásmidos. La presente invención permite el establecimiento de sistemas basados en la pol II para la generación de virus de ARN diferentes a los de la familia Orthomyxoviridae, por ejemplo, miembros de los Paramyxoviridae, Arenaviridae o Bunyaviridae (Roberts, A. & Rose, J.K., Virology 1998, 247:1-6; Fridgen & Elliot, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 1996, 93:15400; Lee y asociados, J. Virol. 2000, 74:3470). A diferencia de los Orthomyxovirus, la mayoría de los virus de ARN se replican en el citoplasma de las células infectadas, Durante su evolución, los ARN de estos virus no tienen que estar expuestos a las presiones de selección halladas en el núcleo, por ejemplo, el corte y empalme. Generalmente, los sistemas de genética inversa para virus de ARN de cadena negativa no segmentada se basan en la transcripción intracelular desde un promotor T7 tal como hicieron por vez primera Conzelmann y sus colegas para el rescate de rabiesvirus (Schnell y asociados, EMBO J. 1994, 13:4195). La expresión de ARN similares a los de los virus es controlada por la ARN polimerasa T7 suministrada bien mediante infección con un virus vacunal recombinante o bien mediante el uso de líneas celulares que constitutivamente expresen la ARN polimerasa T7. A diferencia de la transcripción de la pol I, que se produce en el núcleo, la transcripción mediante ARN polimerasas T7 tiene lugar en el citoplasma. El uso del sistema de transcripción de la pol I para virus de ARN citoplásmico requeriría que los transcritos de ARN tuvieran que ser transportados fuera del núcleo. En realidad que los transcritos de pol I sean transportados fuera del núcleo está sostenido por la detección de la producción de proteínas en las células que contienen los transcritos de la pol I que tuviesen un sitio interno de entrada ribosómica insertado dentro de su región 5' no codificante (Palmer y asociados, Nucl. Acids. Res. 1993, 21:3451). Ya que la información está limitada a las secuencias cruciales para la exportación o retención de transcritos de la pol I, la síntesis de ARN de sentido negativo o de sentido positivo puede dar como resultado diferentes eficacias de exportación nuclear. Además, la exportación de un gran transcrito similar al del coronavirus generado por la pol II (que tenga más de 30.000 nt) desde el núcleo (Almazán y asociados, Proc. Natl. Acad Sci. EE.UU. 2000, 97:5516) indica que secuencias específicas de ARN, en vez de la longitud del transcrito, pueden ser cruciales para la exportación. Los vectores de clonación de pol I - pol II que hemos desarrollado y el eficaz procedimiento de clonación basado en el uso de endonucleasas de restricción de tipo II permitirá que el ARN de sentido negativo sintetizado en el núcleo genere virus de ARN citoplasmático a costes razonables y dentro de un periodo de tiempo razonable.

Claims (27)

1. Un sistema mínimo basado en plásmidos para la generación de un virus infeccioso de ARN de cadena negativa a partir de ADNc viral clonado que comprende un conjunto de plásmidos, en el que cada plásmido comprende un ADNc viral que se corresponde con un segmento genómico viral autónomo insertado entre un promotor de la ARN polimerasa I (pol I) y una secuencia del finalizador, dicho ADNc es así capaz de dirigir la síntesis del ARNv, y dicho ADNc está insertado también entre un promotor de la ARN polimerasa II (pol II) y una señal de poliadenilación, dicho ADNc es así también capaz de dirigir la síntesis de ARNm, y en el que dicho sistema de base plasmídica es un sistema de transcripción bidireccional de ADNc.

2. El sistema de base plasmídica de la reivindicación 1, en el que dicha secuencia del finalizador es una secuencia del finalizador de ARN polimerasa I (pol I).

3. El sistema de base plasmídica de la reivindicación 1, en el que dicha secuencia del finalizador es una secuencia de ribozima.

4. El sistema de base plasmídica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho ARNv comprende un extremo 3' exacto.

5. El sistema de base plasmídica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho virus de ARN es un ortomixovirus.

6. El sistema de base plasmídica de la reivindicación 5, en el que dicho ortomixovirus es un virus de la gripe A.

7. El sistema de base plasmídica de la reivindicación 5, en el que dicho ortomixovirus es un virus de la gripe B.

8. El sistema de base plasmídica de una cualquiera de las reivindicaciones 5-7, en el que dicho segmento genómico viral codifica una proteína seleccionada entre el grupo que consta de una proteína de complejo de polimerasa viral, una proteína M y una proteína NS, donde dicho segmento genómico viral es de una cepa bien adaptada al crecimiento en un cultivo celular o de una cepa atenuada o de ambas.

9. El sistema de base plasmídica de una cualquiera de las reivindicaciones 5-7, en el que dicho segmento genómico viral comprende un gen de hemaglutinina (HA) o un gen de neuramimidasa (NA) o de ambos; donde dichos genes son de un virus patógeno de la gripe.

10. El sistema de base plasmídica de la reivindicación 7, que comprende un plásmido seleccionado entre el grupo que consta de un plásmido que comprende el gen PB2, un plásmido que comprende el gen PB1, un plásmido que comprende el gen PA, un plásmido que comprende el gen HA, un plásmido que comprende el gen NP, un plásmido que comprende el gen NA, un plásmido que comprende el gen M y un plásmido que comprende el gen NS.

11. Una célula anfitriona que comprende el sistema de base plasmídica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10.

12. Un procedimiento para producir un virus infeccioso de ARN de cadena negativa, que comprende el cultivo de la célula anfitriona de la reivindicación 11 bajo condiciones que permitan la producción de proteínas virales y ARNv.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que dicho virus de ARN es patógeno.

14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13, en el que dicho virus de ARN es un ortomixovirus.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que dicho ortomixovirus es un virus de la gripe A.

16. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que dicho ortomixovirus es un virus de la gripe B.

17. Un procedimiento para generar un virus atenuado de ARN de cadena negativa, comprendiendo dicho procedimiento:

(a)

mutar uno o más segmentos genómicos virales en el sistema de base plasmídica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10; y

(b)

determinar si el virus de ARN de cadena negativa producido por el sistema de base plasmídica se atenúa después de su introducción en una célula anfitriona adecuada.

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18. Un procedimiento para producir un virus infeccioso de ARN de cadena negativa para su uso en vacunas, comprendiendo dicho procedimiento:

(a)

cultivar una célula anfitriona que comprenda el sistema de base plasmídica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 para la generación de dicho virus; y

(b)

purificar dicho virus producido por dicha célula anfitriona.

19. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 17 y 18, en el que dicho virus de ARN es un ortomixovirus.

20. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que dicho ortomixovirus es un virus de la gripe A.

21. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que dicho ortomixovirus es un virus de la gripe B.

22. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 12-21, en el que dicha célula anfitriona se selecciona entre el grupo que consta de: célula renal canina de Madin-Darby (MDCK), célula Vero, célula CV1, célula COS-1, célula COS-7 y célula BHK-1.

23. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que la célula anfitriona es una célula VERO.

24. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 12-15, 17-20 y 22-23, en el que al menos un plásmido del sistema de base plasmídica comprende un segmento genómico viral de la cepa A/PR/8/34 de la gripe.

25. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 12-15, 17-20 y 22-23, en el que al menos un plásmido del sistema de base plasmídica comprende un segmento genómico viral de la cepa A/Ann Arbor/6/60 de la gripe.

26. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, 16-19 y 22-23, en el que al menos un plásmido del sistema de base plasmídica comprende un segmento genómico viral de la cepa B/Ann Arbor/1/66 de la gripe.

27. El uso del sistema de base plasmídica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una infección viral, siendo dicha infección una infección de gripe.