CN103757032B - 一种以流感病毒为载体的hcv嵌合疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以流感病毒为载体的HCV嵌合疫苗及其制备方法。本发明公开了SEQ ID No.1所示的DNA分子。本发明公开的HCV嵌合疫苗是双价疫苗,为发展流感病毒为载体的HCV嵌合疫苗实现“一苗两用”或“一苗多用”奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种以流感病毒为载体的HCV嵌合疫苗及其制备方法。
背景技术
丙肝是危害人类健康和生命安全的致命杀手,在发展中国家防控形势尤为严峻,而丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)是引起慢性肝病的主要病原体,以血液、性生活黏膜为主要感染传播途径。据国家权威机构报告,全世界约有1.7-2.0亿人为HCV感染者,我国HCV感染者率约在4000万以上。HCV感染后,约50%-85%转为慢性肝病,其中20%-30%发展为肝硬化,部分转为肝细胞肝癌(HCC)。目前,聚乙二醇、干扰素-a和利巴韦林联合应用是丙型肝炎治疗的标准方案,其有效率仅为50%,且副作用大,费用昂贵,停药后有很高的复发率,由此许多丙肝患者失去治疗机会,已成为全球性的、严峻的公共卫生问题。
目前,疫苗接种是预防和控制传染病的最有效措施。
在过去数十年中,重组乙肝疫苗的广泛应用大大降低了乙肝感染率和发病率,为人类健康作出了巨大贡献。然而,对于丙型肝炎而言,至今还没有被批准使用的疫苗,但对于疫苗的研究一直是国际社会关注的热点。当前,HCV疫苗的研究主要集中在合成多肽疫苗、重组多表位疫苗、核酸疫苗、病毒载体疫苗等,已有几个试验疫苗正在临床前或进入临床研究阶段。从已有研究结果显示,至今没有突破性进展,仍停滞不前,有诸多关键技术瓶颈问题亟待解决。从研究看,由于HCV的基因组变异率高,交叉免疫保护抗原差,尚缺乏有效的敏感细胞和动物感染模型,对其细胞免疫和体液免疫应答在HCV感染恢复中的作用仍不十分清楚,使以诱导保护性抗体产生为目的的预防性疫苗和/或治疗性疫苗的研究步履艰难。此外,已有研究的HCV疫苗免疫后诱发机体产生免疫效果差、免疫保护不全面、且注射不能产生有效的黏膜免疫和细胞免疫效果,给丙肝疫苗的研究提出了挑战。因此,发展安全、有效的丙肝疫苗已成为当今生命科学亟待解决的重大科学问题。
HCV的基因组结构类似黄病毒属和瘟病毒属,1991年国际病毒命名委员会将其归为黄病毒科(flaviciridae)丙型肝炎病毒属(hepacivirus)。HCV基因组为单股正链RNA病毒,基因组全长9.6kb,其5’端有一个319-341nt结构较为保守的非编码区(Non-codingregion,5’-NCR),后面为一个连续的开放阅读框架(open reading frame,ORF),可编码一个多聚蛋白前体,此多聚蛋白前体由宿主和病毒的信号肽酶剪接成3个结构蛋白(Core、E1、E2)和7个非结构蛋白(P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。HCV C蛋白由191个氨基酸残基组成,是HCV基因组中较为保守的结构区域。5’-NCR区最为保守,而3’-NCR对于HCV RNA的正常复制是不可缺少的。由于HCV病原体复杂的感染致病特点,给HCV的免疫防控带来了难题。
HCV基因序列的高度变异性,丙肝疫苗的研制面临很多挑战:①HCV RNA和病毒蛋白变异性很大,至少存在6种基因型及大约70种基因亚型,中国主要流行亚型是1b,2a,也有其他亚型感染报道;②HCV准种的存在也是产生宿主免疫逃逸及容易导致慢性感染的机制之一,严重影响了HCV疫苗发展及HCV预防和治疗的成功率;③HCV在体外不能大量有效繁殖和缺乏感染的细胞、动物敏感模型,而黑猩猩是HCV感染的唯一动物实验模型,但黑猩猩受到保护而难以普遍使用;④HCV致病的免疫学机制尚未完全澄清,且性生活黏膜途径感染对注射疫苗免疫不能产生交叉免疫保护,这些都严重限制了HCV疫苗研发的进程。
在过去数年中,HCV疫苗的研究一直是科学家们关注的焦点。在早期的研究中,以真核表达El/E2免疫原为主,Ralston等用重组痘苗病毒载体转染哺乳动物细胞表达了HCV全长结构蛋白,发现虽可获得高效表达,所表达的El和E2包膜糖蛋白易形成复合物,用纯化的包膜糖蛋白E1/E2复合物免疫黑猩猩可产生高滴度的抗E1和E2抗体。而应用El包膜糖蛋白仅能刺激机体产生弱的免疫反应,提示E1/E2包膜糖蛋白形成的异源二聚体可能对激发强免疫应答与保护是必要的。另有学者Lagging等构建了C基因(第1-191aa)重组质粒pcDNA HCV Core,0.2mg质粒肌肉注射免疫BALB/c小鼠2-3次后,于第6周处死小鼠,可检测到较高水平的抗C抗体,免疫2次或3次的抗体滴度相似。以上实验说明,HCV C区构建的重组质粒均能在真核细胞中表达,且能诱导出特异性体液免疫和细胞免疫应答,但未能保护性传播途径的黏膜免疫保护。也有学者Duenas-Carrera等运用编码HCV-C,E蛋白的DNA疫苗免疫兔子和恒河猴,初次免疫28周后,所有兔子产生了较强的抗C、E反应,免疫52周后,恒河猴出现高滴度的抗HCV结构区抗原的抗体。近年来,人们在临床研究方面也取得了一定成果,Leroux-Roels等在Ⅰ期临床中,用1b型E1(aa192-326)的共同序列在重组痘苗病毒中表达纯化后对20位志愿者肌肉注射后,结果提示三次免疫后可以引起明显的E1抗体反应,通过第4次加强免疫后反应增强,在所有的志愿者中都可以诱发针对E1的强烈的细胞免疫反应,在临床应用中E1治疗性候选疫苗具有良好的安全性和免疫效果方面。Baryluk等用含有HCVE1的质粒和重组腺病毒进行的治疗性疫苗的研究,在I期临床研究证明安全性的基础上并已进入Ⅱ期临床研究。在Ⅱ期临床研究中,重组的E1疫苗可激发强烈的针对E1的T细胞反应,部分病人血清ALT水平明显下降。2012年的《科学--转化医学》杂志上,英国牛津大学等机构的研究人员报告了他们研发的一种HCV疫苗临床试验取得的结果,该疫苗是以一种黑猩猩腺病毒为载体模仿了其内部相对长期稳定不变的结构,临床试验取得初步成效,41名志愿者接种疫苗后,跟踪研究发现疫苗效果至少能持续一年,并且副作用明显减弱,但DNA疫苗安全性及全面应答与保护受限。尽管以上临床前及进入临床研究的这些HCV候选疫苗取得了重要进展,但疫苗免疫后诱发机体产生免疫效果欠佳、交叉免疫保护不全面、注射免疫不能产生有效的黏膜免疫细胞免疫效应,并且腺病毒为载体的DNA疫苗存在潜在安全隐患等问题。
近年来,反向遗传学技术(Reverse genetics,RG)在流感病毒领域广泛应用。美国Medimmune公司是RG技术用于疫苗研制领域最成功的典范,2003年6月,该公司生产的流感三价减毒活疫苗Flumist被FDA批准和投入使用,适用于2-49岁人群,通过鼻腔免疫,使用简便,应用广泛,临床实验结果显示具有安全、有效和交叉免疫保护效果,使得以冷适应流感减毒活疫苗为递送系统表达外源基因研制其他疫苗带来了新的契机。与其他载体如腺病毒,痘苗病毒等逆转录病毒为载体相比,流感病毒在复制周期不会形成DNA中间产物,由此不会整合进宿主的染色体,使得应用更好的安全性。用于流感病毒基因组操作的策略有:外源蛋白嵌入表面糖蛋白NA和HA,产生另外的基因片段,改造非结构蛋白NS1,PB2基因缺失等。目前,已有大量报道将流感病毒作为病毒疫苗载体成功制备了能够达到有效免疫保护的重组嵌合疫苗候选株,如流感嵌合体病毒(A/B)、副流感、呼吸道合胞病毒(RSV)、衣原体、结核杆菌、疟疾、艾滋、B.anthracis和肿瘤等均有报道,为以流感病毒为载体的多价疫苗研究拓宽了发展空间。值得我们注意的是,同样是以血液、性传播途径为主的HIV病毒,AnnaL.de Goedea等将HIV-1p17Gag基因插入流感病毒NA基因,成功构建了流感病毒为载体的复制缺陷型rFlu-p17疫苗候选株,结果表明rFlu-p17能够诱导产生较强的特异性体液免疫和细胞免疫反应。而将流感病毒作为HCV疫苗研制的载体,在国内外还未见报道。所以,采用反向遗传技术制备流感病毒为载体的HCV候选疫苗株将是HCV疫苗研究领域的新里程碑。
发明内容
本发明的目的是提供一种以流感病毒为载体的HCV嵌合疫苗及其制备方法。
本发明提供的SEQ ID No.1所示的DNA分子。
一种重组病毒也属于本发明的保护范围,该病毒按照如下方法制备:
将分别含有冷适应、减毒流感病毒的PB2基因、冷适应、减毒流感病毒的PB1基因、冷适应、减毒流感病毒的PA基因、冷适应、减毒流感病毒的NP基因、冷适应、减毒流感病毒的M基因和冷适应、减毒流感病毒的NS基因的表达质粒,以及分别含有靶标流感病毒的HA基因和靶标流感病毒的NA基因的表达质粒共转染宿主细胞,培养得到重组流感病毒;
在如下所述基因中的至少一种基因的开放读码框中的任意位置插入或替换为HCV的结构蛋白基因:
(1)所述冷适应、减毒流感病毒的PB2基因;
(2)所述冷适应、减毒流感病毒的PB1基因;
(3)所述冷适应、减毒流感病毒的PA基因;
(4)所述冷适应、减毒流感病毒的NP基因;
(5)所述冷适应、减毒流感病毒的M基因;
(6)所述冷适应、减毒流感病毒的NS基因;
(7)所述靶标流感病毒的HA基因;
(8)所述靶标流感病毒的NA基因;
所述冷适应、减毒流感病毒的PB2基因、PB1基因、PA基因、NP基因、M基因和NS基因,以及靶标流感病毒的HA基因和NA基因位于不同的表达质粒上;
所述HCV的结构蛋白基因为HCV的核心蛋白C全基因、包膜蛋白E1/E2全基因、核心蛋白C的优势抗原表位基因和/或包膜蛋白E1/E2的优势抗原表位基因。
上述病毒中,所述宿主细胞为MDCK、Vero、293T、COS细胞或MDCK/293T、MDCK/COS共培养的细胞;
所述HCV的结构蛋白基因为HCV的核心蛋白C的优势抗原表位基因和包膜蛋白E1/E2的优势抗原表位基因的融合基因。
上述任一所述的病毒中,所述HCV为1型HCV、2型HCV、3型HCV、4型HCV、5型HCV或6型HCV;
所述1型HCV具体为1b亚型HCV。
上述任一所述的病毒中,所述HCV的核心蛋白C的优势抗原表位基因和包膜蛋白E1/E2的优势抗原表位基因的融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
上述任一所述的病毒中,所述HCV的结构蛋白基因插在所述冷适应、减毒流感病毒的NS基因的开放读码框的自5’末端起第375位至第376位核苷酸之间;
所述HCV的结构蛋白基因与所述冷适应、减毒流感病毒的NS基因的开放读码框的自5’末端起第375位核苷酸之间连有5’-UAAUG-3’序列;
和/或,
所述HCV的结构蛋白基因是将所述冷适应、减毒流感病毒的M基因的开放读码框的自5’末端起第223位核苷酸至第760位核苷酸替换;
和/或,
所述HCV的结构蛋白基因将所述靶标流感病毒的NA基因的开放读码框的自5’末端起第184位核苷酸至第1253位核苷酸替换。
上述任一所述的病毒中,所述冷适应、减毒流感病毒为冷适应、减毒A型流感病毒或冷适应、减毒B型流感病毒;
所述冷适应、减毒A型流感病毒具体为H2N2亚型冷适应、减毒流感病毒,再具体为冷适应、减毒流感病毒株A/Ann Arbor/6/60(H2N2);
所述靶标流感病毒为A型流感病毒或B型流感病毒,所述A型流感病毒具体为H1亚型-H16亚型中的任意一种,再具体为H1N1亚型流感病毒,再具体为流感病毒株A/California/07/2009(H1N1);
所述靶标流感病毒为未经过任何处理的(如未经过减毒、未经过冷适应)的普通野生型流感病毒。
上述任一所述的病毒中,所述HCV的结构蛋白基因插在所述冷适应、减毒流感病毒的NS基因的开放读码框的自5’末端起第375位至第376位核苷酸之间所得序列为SEQ IDNo.2中第51-1466位核苷酸所示;
所述HCV的结构蛋白基因是将所述冷适应、减毒流感病毒的M基因的开放读码框的自5’末端起第223位核苷酸至第760位核苷酸替换所得序列为SEQ ID No.3中第40-1053位核苷酸所示;
所述HCV的结构蛋白基因将所述靶标流感病毒的NA基因的开放读码框的自5’末端起第184位核苷酸至第1253位核苷酸替换所得序列为SEQ ID No.4中第35-944位核苷酸所示。
构建所述表达质粒时,上述PB2基因、PB1基因、PA基因、NP基因、M基因、NS基因、HA基因或NA基因,均在各自的5’端连接有各自基因的3’NCR序列,均在各自的3’端均连接有各自基因的5’NCR序列;
所述表达质粒的出发质粒为双向转录表达载体pAD3000;
构建所述表达质粒时,均将各基因插在双向转录表达载体pAD3000的BsmBI位点。
上述任一所述的病毒制备得到的嵌合疫苗也属于本发明的保护范围。
上述DNA分子在制备预防和/或治疗流感病毒和/或HCV引起的疾病的产品中的应用也属于本发明的保护范围;
和/或,
上述任一所述的病毒在制备预防和/或治疗流感病毒和/或HCV引起的疾病的产品中的应用也属于本发明的保护范围;
和/或,
上述嵌合疫苗在制备预防和/或治疗流感病毒和/或HCV引起的疾病的产品中的应用也属于本发明的保护范围;
所述流感病毒为A型流感病毒或B型流感病毒,所述A型流感病毒具体为H1亚型-H16亚型中的任意一种;
所述HCV为1型HCV、2型HCV、3型HCV、4型HCV、5型HCV或6型HCV;
所述1型HCV具体为1b亚型HCV。
本发明提供的HCV嵌合疫苗可以覆盖HCV传染病病原体,保护更多人群免受流感病毒和HCV之害,为实现“一苗两用”或“一苗多用”目的奠定了基础。
附图说明
图1为构建以流感病毒为载体的HCV嵌合疫苗的重组策略示意图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
pAD3000在文献“Hoffmann E,Mahmood K,Yang CF,Webster RG,Greenberg HB,Kemble G.Rescue of influenza B virus from eight plasmids.Proc Natl AcadSci.2002;99(17):11411–6.”中公开过,公众可从中国人民解放军军事医学科学院获得。
BALB/c小鼠购自军事医学科学院实验动物中心。
10-12周龄的雪貂购自中国无锡Angora安哥鲁公司。
2012-2013年流感病毒当年流行株A/California/07/2009(H1N1)由国家流感中心提供,公众可从中国人民解放军军事医学科学院获得。分别扩增该病毒株的HA、NA基因,再分别插入到双向转录/表达载体pAD3000的BsmBI位点,构建得到该病毒株的重组质粒pD-HA、pD-NA。
冷适应、减毒流感病毒株A/Ann Arbor/6/60(H2N2)(简写A/AA/6/60)在文献“YangP,Duan Y,Wang C,Xing L,Gao X,Tang C,Luo D,Zhao Z,Jia W,Peng D,Liu X,WangX.Immunogenicity and protective efficacy of a live attenuated vaccine againstthe2009pandemic A H1N1in mice and ferrets.Vaccine.2011Jan17;29(4):698-705.”中公开过,公众可从中国人民解放军军事医学科学院获得。该病毒株的6个内部基因PB2、PB1、PA、NP、NS、M,分别插入到双向转录/表达载体pAD3000的BsmBI位点,构建得到该病毒的重组质粒pD-PB2、pD-PB1、pD-PA、pD-NP、pD-NS、pD-M。
下述实施例中的NCR代表非编码区。
实验例1、以流感病毒为载体的嵌合HCV-C/E1/E2优势抗原表位的HCV嵌合疫苗rFLU-HCV/NS1的制备
一、1b亚型的HCV中HCV-C/E1/E2优势抗原表位序列如SEQ ID No.1所示,经动物实验和临床病人血清验证,符合下一步实验要求。
二、构建重组质粒pC/E1/E2-NS1
以冷适应、减毒流感病毒株A/AA/6/60的NS1基因片段为插入HCV-C/E1/E2优势抗原表位基因的靶点,利用分子生物学方法构建重组质粒pC/E1/E2-NS1,具体策略如图1A所示。
具体是将上述获得的HCV-C/E1/E2优势抗原表位基因插入到冷适应、减毒流感病毒株A/AA/6/60的NS基因开放阅读框(ORF)的自5’末端起第375位核苷酸之后,中间加入linker(5′-UAAUG-3′)连接,linker既有终止子作用,又有启动子作用,最后是NS基因开放阅读框的自5’末端起第376位至第838位核苷酸,将构建好的重组质粒命名为pC/E1/E2-NS1。
步骤如下:
(一)合成SEQ ID No.2所示的DNA分子,SEQ ID No.2中自5’端起第1位至第24位为酶切位点,第25位至第51位为NS基因的3’NCR,第51位至第425位为冷适应、减毒流感病毒株A/AA/6/60NS基因开放阅读框(ORF)的自5’末端起第1位至第375位核苷酸,第426位至第430位为linker,第431位至第1003位为HCV-C/E1/E2优势抗原表位基因,第1004位至第1466位为NS基因开放阅读框(ORF)的自5’末端起第376位至第838位核苷酸,第1467位至第1495位为NS基因的5’NCR,第1496位至第1517位酶切位点。
(二)AarI酶切SEQ ID No.2所示的DNA分子,得到目的基因片段;BsmBI酶切pAD3000,得到载体大片段;将基因片段与载体大片段连接,得到重组质粒,将其命名为pC/E1/E2-NS1,将重组质粒送测序结果正确。
三、将重组质粒pC/E1/E2-NS1与冷适应、减毒流感病毒株A/AA/6/60的内部病毒基因骨架PB2、PB1、PA、NP、M分别构建的重组质粒pD-PB2、pD-PB1、pD-PA、pD-NP、pD-M,及流感病毒当年流行株A/California/07/2009(H1N1)的HA、NA基因构建的重组质粒pD-HA、pD-NA,共8种质粒各0.2μg,等量混合加入10μL转染试剂(Effectene,购自Qiagen公司)室温作用10min,共转染MDCK细胞,33℃,5%CO2,培养48-60h,得细胞悬液,将细胞悬液接种9日龄SPF鸡胚,33℃培养72h,收获鸡胚尿囊液测定HA血凝效价,HA血凝效价的检测结果是1:256-512,获得嵌合HCV-C/E1/E2优势抗原表位的HCV嵌合疫苗株(rFLU-HCV/NS1)。
四、对步骤三获得的疫苗株进行鉴定,电镜观察病毒形态,结果表明该疫苗株符合流感病毒典型形态特征,病毒颗粒大小在80-120nm之间。
五、将rFLU-HCV/NS1接种9-11日龄SPF鸡胚(购自北京实验动物研究中心)传代,取第二代鸡胚尿囊液提取病毒RNA,经过RT-PCR,扩增出PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M和NS1共8个基因片段,分别将基因片段送公司测序,结果与预期基因序列一致。
六、将rFLU-HCV/NS1经鸡胚大量培养,超滤浓缩、蔗糖梯度离心纯化后,跑SDS-PAGE电泳,凝胶染色、脱色后,可检测到相应大小的NP、HA1、HA2、NEP蛋白,表明抗原的主要成分没有丢失。
七、rFLU-HCV/NS1的温度敏感(Temperature sensitive,ts)、冷适应(Coldadapted,ca)和减毒(Attenuated,att)表型检测
将rFLU-HCV/NS1接种MDCK细胞或9-11日龄鸡胚,分别于25、33、37和39℃条件下培养3天,收集细胞上清或鸡胚尿囊液测定病毒滴度。结果表明,该疫苗株具有ts、ca表型。同时,该疫苗株在BALB/c小鼠和雪貂动物上表现减毒表型。
八、rFLU-HCV/NS1在小鼠体内的免疫效果
将rFLU-HCV/NS1经超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心纯化后,制备该疫苗的减毒活疫苗剂型。
选用6-8周龄BALB/c小鼠,分为疫苗组和对照组,每组20只。
疫苗组:将该疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠,免疫2次,间隔2周,每次免疫剂量为105.5-106.5TCID50,免疫体积为20μl。
对照组:PBS代替疫苗,同时免疫方式、免疫体积及免疫时间与疫苗组一致。
将疫苗组和对照组分别于初次免疫后、二次免疫后2周,经小鼠尾静脉采血,离心收集各组小鼠的血清。
采用HI方法测定血清中针对野生型流感病毒A/California/07/2009(H1N1)的抗体效价,同时采用微量中和方法检测血清中针对HCV的特异性抗体产生情况,结果如表1所示。
表1rFLU-HCV/NS1的免疫效果检测
表1表明,以流感病毒为载体的HCV嵌合疫苗(rFLU-HCV/NS1)免疫动物后,血清中可检测到针对HCV和流感病毒的抗体效价,表明该疫苗免疫后可诱导机体产生针对HCV和流感病毒的双重免疫应答。
实验例2、以流感病毒为载体的嵌合HCV-C/E1/E2优势抗原表位的HCV嵌合疫苗rFLU-HCV/M的制备
一、1b亚型的HCV中HCV-C/E1/E2优势抗原表位序列如SEQ ID No.1所示,按照实施例1的步骤一的方法经免疫动物验证,符合下一步实验要求。
二、构建重组质粒pC/E1/E2-M
以冷适应、减毒流感病毒株A/AA/6/60的M基因片段为插入HCV-C/E1/E2优势抗原表位基因的靶点,利用分子生物学方法构建重组质粒pC/E1/E2-M,具体策略如图1B所示。
具体是将上述获得的HCV-C/E1/E2优势抗原表位基因插入到冷适应、减毒流感病毒株A/AA/6/60的M基因开放阅读框(ORF)的前222位核苷酸和后222位核苷酸之间,将构建好的重组质粒命名为pC/E1/E2-M。
(一)合成SEQ ID No.3所示的DNA分子,SEQ ID No.3中自5’末端起第1位至第14位为酶切位点,第15位至第39位为M基因的3’NCR,第40位至第261位为冷适应、减毒流感病毒株A/AA/6/60M基因开放阅读框(ORF)的自5’末端起从第1位到第222位核苷酸,第262位至第831位为HCV-C/E1/E2优势抗原表位基因,第832位至第1053位为冷适应、减毒流感病毒株A/AA/6/60M基因开放阅读框(ORF)的自5’末端起从第761位到第982位核苷酸,第1054位至第1074位为M基因的5’NCR,第1075位至第1088位为酶切位点。
(二)BsmBI酶切SEQ ID No.3所示的DNA分子,得到目的基因片段;BsmBI酶切pAD3000,得到载体大片段;将基因片段与载体大片段连接,得到重组质粒,将其命名为pC/E1/E2-M,将重组质粒送测序结果正确。
三、将重组质粒pC/E1/E2-M,与冷适应、减毒流感病毒株A/AA/6/60的内部病毒基因骨架PB2、PB1、PA、NP和NS分别构建的重组质粒pD-PB2、pD-PB1、pD-PA、pD-NP、pD-NS,及流感病毒当年流行株A/California/07/2009(H1N1)的HA、NA基因构建的重组质粒pD-HA、pD-NA,按照实施例1的步骤三的方法将8种质粒共转染MDCK细胞,37℃,5%CO2,培养48-60h,得细胞悬液,将细胞悬液接种9日龄SPF鸡胚,35℃培养72h,收获鸡胚尿囊液获得嵌合HCV-C/E1/E2优势抗原表位的HCV嵌合疫苗株(rFLU-HCV/M)。
四、对步骤三获得的疫苗株进行鉴定,电镜观察病毒形态,结果表明该疫苗株符合流感病毒典型形态特征。
五、将rFLU-HCV/M接种9-11日龄SPF鸡胚(购自北京实验动物研究中心)传代,取第二代鸡胚尿囊液提取病毒RNA,经过RT-PCR,扩增出PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M和NS1共8个基因片段,分别将基因片段送公司测序,结果与预期基因序列一致。
六、将rFLU-HCV/M经鸡胚大量培养,超滤浓缩、蔗糖梯度离心纯化后,跑SDS-PAGE电泳,抗原的主要成分存在。
七、rFLU-HCV/M的温度敏感(Temperature sensitive,ts)、冷适应(Coldadapted,ca)和减毒(Attenuated,att)表型检测
将rFLU-HCV/M接种MDCK细胞或9-11日龄鸡胚,分别于25、33、37和39℃条件下培养3天,收集细胞上清或鸡胚尿囊液测定病毒滴度。结果表明,该疫苗株具有ts、ca表型。同时,该疫苗株在BALB/c小鼠和雪貂动物上表现减毒表型。
八、rFLU-HCV/M在小鼠体内的免疫效果
将rFLU-HCV/M经超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心纯化后,制备该疫苗的减毒活疫苗剂型。
选用6-8周龄BALB/c小鼠,分为疫苗组和对照组,每组20只。
按照实施例1的步骤八的方法对小鼠进行rFLU-HCV/M的免疫,同时按照实施例1设置对照组。
将疫苗组和对照组分别于初次免疫后、二次免疫后2周,经小鼠尾静脉采血,离心收集各组小鼠的血清。
采用HI方法测定血清中针对野生型流感病毒A/California/07/2009(H1N1)的抗体效价,同时采用实施例1中步骤八的方法检测血清中针对HCV的特异性抗体产生情况,结果如表2所示。
表2rFLU-HCV/M的免疫效果检测
表2表明,以流感病毒为载体的HCV嵌合疫苗(rFLU-HCV/M)免疫动物后,血清中可检测到针对HCV和流感病毒的抗体效价,表明该疫苗免疫后可诱导机体产生针对HCV和流感病毒的双重免疫应答。
实施例3、以流感病毒为载体的嵌合HCV-C/E1/E2优势抗原表位的HCV嵌合疫苗rFLU-HCV/NA的制备
一、1b亚型的HCV中HCV-C/E1/E2优势抗原表位序列如SEQ ID No.1所示,按照实施例1的步骤一的方法经免疫动物验证,符合下一步实验要求。
二、构建重组质粒pC/E1/E2-NA
以A/California/07/2009(H1N1)的NA基因片段为插入HCV-C/E1/E2优势抗原表位基因的靶点,利用分子生物学方法构建重组质粒pC/E1/E2-NA,具体策略如图1C所示。
具体是将上述获得的HCV-C/E1/E2优势抗原表位基因插入到当年流行流感病毒株H1N1亚型A/California/07/2009的NA基因开放阅读框(ORF)的前183位核苷酸和后157位核苷酸之间,将构建好的重组质粒命名为pC/E1/E2-NA。
(一)合成SEQ ID No.4所示的DNA分子,SEQ ID No.4中自5’端起第1位至第14位为酶切位点,第15位至第35位为NA基因的3’NCR,第35位至第217位为流感病毒当年流行株H1N1亚型的NA基因开放阅读框(ORF)的自5’末端起第1位至第183位核苷酸,第218位至第787位为HCV-C/E1/E2优势抗原表位基因,第788位至第944位为NA基因开放阅读框(ORF)的自5’末端起第1254位至第1410位核苷酸,第945位至第975位为NA基因的5’NCR,第976位至第987位为酶切位点。
(二)BsaI酶切SEQ ID No.4所示的DNA分子,得到目的基因片段;BsmBI酶切pAD3000,得到载体大片段;将基因片段与载体大片段连接,得到重组质粒,将其命名为pC/E1/E2-NA,将重组质粒送测序结果正确。
三、将重组质粒pC/E1/E2-NA,与冷适应、减毒流感病毒株A/AA/6/60的内部病毒基因骨架PB2、PB1、PA、NP、M和NS分别构建的重组质粒pD-PB2、pD-PB1、pD-PA、pD-NP、pD-M和pD-NS,及流感病毒当年流行株A/California/07/2009(H1N1)的HA基因构建的重组质粒pD-HA,按照实施例1的步骤三的方法将8种质粒共转染MDCK细胞,37℃,5%CO2,培养48-60h,得细胞悬液,将细胞悬液接种9日龄SPF鸡胚,33℃培养72h,收获鸡胚尿囊液获得嵌合HCV-C/E1/E2优势抗原表位的HCV嵌合疫苗株(rFLU-HCV/NA)。
四、对步骤三获得的疫苗株进行鉴定,电镜观察病毒形态,结果表明该疫苗株符合流感病毒典型形态特征。
五、将rFLU-HCV/NA接种9-11日龄SPF鸡胚(购自北京实验动物研究中心)传代,取第二代鸡胚尿囊液提取病毒RNA,经过RT-PCR,扩增出PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M和NS1共8个基因片段,分别将基因片段送公司测序,结果与预期基因序列一致。
六、将rFLU-HCV/NA经鸡胚大量培养,超滤浓缩、蔗糖梯度离心纯化后,跑SDS-PAGE电泳,抗原的主要成分存在。
七、rFLU-HCV/NA的温度敏感(Temperature sensitive,ts)、冷适应(Coldadapted,ca)和减毒(Attenuated,att)表型检测
将rFLU-HCV/NA接种MDCK细胞或9-11日龄鸡胚,分别于25、33、37和39℃条件下培养3天,收集细胞上清或鸡胚尿囊液测定病毒滴度。结果表明,该疫苗株具有ts、ca表型。同时,该疫苗株在BALB/c小鼠和雪貂动物上表现减毒表型。
八、rFLU-HCV/NA在小鼠体内的免疫效果
将rFLU-HCV/NA经超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心纯化后,制备该疫苗的减毒活疫苗剂型。
选用6-8周龄BALB/c小鼠,分为疫苗组和对照组,每组20只。
按照实施例1的步骤八的方法对小鼠进行rFLU-HCV/NA的免疫,同时按照实施例1设置对照组。
将疫苗组和对照组分别于初次免疫后、二次免疫后2周,经小鼠尾静脉采血,离心收集各组小鼠的血清。
采用HI方法测定血清中针对野生型流感病毒A/California/07/2009(H1N1)的抗体效价,同时采用采用实施例1中步骤八的方法检测血清中针对HCV的特异性抗体产生情况,结果如表3所示。
表3rFLU-HCV/NA的免疫效果检测
表3表明,以流感病毒为载体的HCV嵌合疫苗(rFLU-HCV/NA)免疫动物后,血清中可检测到针对HCV和流感病毒的抗体效价,表明该疫苗免疫后可诱导机体产生针对HCV和流感病毒的双重免疫应答。
Claims (6)
1.一种重组病毒,该病毒按照如下方法制备:
将分别含有冷适应、减毒流感病毒的PB2基因、冷适应、减毒流感病毒的PB1基因、冷适应、减毒流感病毒的PA基因、冷适应、减毒流感病毒的NP基因、冷适应、减毒流感病毒的M基因和冷适应、减毒流感病毒的NS基因的表达质粒,以及分别含有靶标流感病毒的HA基因和靶标流感病毒的NA基因的表达质粒共转染宿主细胞,培养得到重组流感病毒;
其中,在所述冷适应、减毒流感病毒的NS基因的开放读码框的自5’末端起第375位至第376位核苷酸之间插入HCV的结构蛋白基因,所述HCV的结构蛋白基因与所述冷适应、减毒流感病毒的NS基因的开放读码框的自5’末端起第375位核苷酸之间连有5’-UAAUG-3’序列;
或,将所述冷适应、减毒流感病毒的M基因的开放读码框的自5’末端起第223位核苷酸至第760位核苷酸替换为HCV的结构蛋白基因;
或,将所述靶标流感病毒的NA基因的开放读码框的自5’末端起第184位核苷酸至第1253位核苷酸替换为HCV的结构蛋白基因;
所述HCV的结构蛋白基因如SEQ ID No.1所示;
所述冷适应、减毒流感病毒为冷适应、减毒A型流感病毒;
所述冷适应、减毒A型流感病毒为冷适应、减毒流感病毒株A/Ann Arbor/6/60;
所述靶标流感病毒为A型流感病毒,所述靶标A型流感病毒为流感病毒株A/California/07/2009。
2.根据权利要求1所述的病毒,其特征在于:所述宿主细胞为MDCK、Vero、293T、COS细胞或MDCK/293T、MDCK/COS共培养的细胞。
3.根据权利要求1或2所述的病毒,其特征在于:所述HCV的结构蛋白基因插在所述冷适应、减毒流感病毒的NS基因的开放读码框的自5’末端起第375位至第376位核苷酸之间所得序列为SEQ ID No.2中第51-1466位核苷酸所示;
所述HCV的结构蛋白基因是将所述冷适应、减毒流感病毒的M基因的开放读码框的自5’末端起第223位核苷酸至第760位核苷酸替换所得序列为SEQ ID No.3中第40-1053位核苷酸所示;
所述HCV的结构蛋白基因将所述靶标流感病毒的NA基因的开放读码框的自5’末端起第184位核苷酸至第1253位核苷酸替换所得序列为SEQ ID No.4中第35-944位核苷酸所示。
4.由权利要求1-3任一所述的病毒制备得到的嵌合疫苗。
5.权利要求1-3任一所述的病毒在制备预防和/或治疗流感病毒和/或HCV引起的疾病的产品中的应用;
所述流感病毒为A型流感病毒,所述A型流感病毒为H1亚型或H2亚型;
所述HCV为1型HCV;
所述1型HCV为1b亚型HCV。
6.权利要求4所述的嵌合疫苗在制备预防和/或治疗流感病毒和/或HCV引起的疾病的产品中的应用;
所述流感病毒为A型流感病毒,所述A型流感病毒为H1亚型或H2亚型;
所述HCV为1型HCV;
所述1型HCV为1b亚型HCV。
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