PT1317559E

PT1317559E - Sistema de transfecção de adn para a produção de vírus infecciosos de arn de cadeia negativa

Info

Publication number: PT1317559E
Application number: PT01932704T
Authority: PT
Inventors: Erich Hoffmann
Original assignee: St Jude Childrens Res Hospital
Priority date: 2000-04-28
Filing date: 2001-04-27
Publication date: 2009-02-12
Also published as: EA006311B1; WO2001083794A2; DK1317559T3; US20050186563A1; US20080233560A1; JP5837891B2; US20020164770A1; CN101580849B; AU2001259211B2; DE122011100039I1; PL366064A1; CA2406100A1; SI1317559T1; EP1317559B1; WO2001083794A3; EA200201164A1; NO332080B1; UA84254C2; US8309099B2; BR0110607A

Description

DESCRIÇÃO "SISTEMA DE TRANSFECÇÃO DE ADN PARA A PRODUÇÃO DE VÍRUS INFECCIOSOS DE ARN DE CADEIA NEGATIVA"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se ao desenvolvimento de um sistema com base em plasmídeo mínimo que é um sistema de transcrição bidireccional de ADNc para a produção de vírus de ARN infecciosos de cadeia negativa, de um modo preferido, vírus influenza, de ADN clonado. Em particular, este sistema de multi-plasmídeo pol I - pol II facilita a criação de ambos os vírus recombinantes e reorganizados. Em formas de realização preferidas, a invenção compreende um sistema de oito plasmídeos pol I - pol II para a criação de vírus influenza. Também possui aplicabilidade na recuperação de outros vírus de ARN de cadeia negativa inteiramente a partir de ADNc clonado.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Ciclo de Vida de Vírus de ARN

Os genomas de vírus de ARN possuem diferentes configurações, incluindo unimolecular ou segmentados; de cadeia simples de polaridade ( + ) ou (-) ou de cadeia dupla. Todavia, dois requisitos comuns essenciais são partilhados entre os dois vírus: (1) os ARN genómicos devem ser copiados eficientemente 1 para uma forma que pode ser utilizada eficazmente para a montagem em partículas de vírus da progenia e (2) devem ser sintetizados ARNm que podem ser traduzidos eficientemente em proteínas virais. Geralmente, os vírus de ARN (excepto retrovírus) codificam e/ou comportam uma polimerase de ARN dependente de ARN para catalisar a síntese de novo ARN genómico (para montagem na progenia) e ARNm (para tradução em proteínas virais). Uma vez que as células hospedeiras eucarióticas, tipicamente, não contêm maquinaria para replicar um molde de ARN ou para traduzir polipéptidos de um molde de ARN de cadeia negativa ou de cadeia dupla, vírus compreendendo estes ácidos nucleicos nos seus genomas devem comportar uma proteína de polimerase de ARN na partícula virai. Por esta razão, as moléculas de ARN desproteinadas de vírus de ARN de cadeia negativa e de cadeia dupla (sem uma polimerase de ARN associada) não são infecciosas. Em contraste, o ARN desproteinado do genoma de um vírus de ARN de cadeia positiva é, tipicamente, infeccioso, porque as proteínas virais codificadas são traduzíveis pela maquinaria celular do hospedeiro. 0 ARN virai genómico deve ser empacotado em partículas virais de modo a que o vírus seja transmitido. Algumas cápsides de vírus de ARN estão rodeadas por membranas lipídicas das células hospedeiras infectadas e outras possuem uma capa de proteína virai exterior sem uma bicamada lipídica. Apesar destas diferenças entre cápsides virais, o processo pelo qual as partículas virais da progenia são montadas e as interacções proteína/proteína que ocorrem durante a montagem são semelhantes. As proteínas virais são geralmente classificadas como proteínas estruturais e não estruturais. Em geral, as proteínas não estruturais estão envolvidas em replicação genómica, regulação de transcrição e empacotamento. As proteínas 2 estruturais geralmente realizam três tipos de funções incluindo: (1) ligação a ARN genómico (i. e., proteína da nucleocápside para o vírus influenza A), (2) ligação entre ARN empacotado e proteínas externas (i. e., proteína matriz) e (3) construção de uma camada virai externa (i. e., proteínas de superfície, tal como hemaglutinina). A montagem em partículas de vírus assegura a transmissão eficaz do genoma do ARN de uma célula hospedeira para outra num único hospedeiro ou entre diferentes organismos hospedeiros. Vírus Influenza 0 vírus influenza A, um Orthomyxoviridae, é um vírus de ARN de sentido negativo, com um genoma segmentado. Os ARN genómicos contêm uma ou mais grelhas de leitura aberta flanqueadas por sequências não codificantes nas extremidades 5' e 3' (Desselberger et al., Gene 1980, 8:315). Os ARN virais são associados à nucleoproteína virai (NP) e a proteínas polimerases (PB1, PB2 e PA) em viriões e em células infectadas para formar complexos de ribonucleoproteína (RNP) (Hsu et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1987, 84:8140). A sua composição genética permite que este vírus evolva através de reorganização dos segmentos de genes de diferentes estirpes; esta reorganização cria novas variantes para as quais um organismo infectado de novo não possui resposta imunitária anamnéstica. Dos 15 subtipos de hemaglutinina (HA) e 9 de neuraminidase (NA) de influenza em circulação em aves aquáticas, três subtipos, H1N1, H2N2 e H3N2 são conhecidos por terem provocado pandemias em humanos (Webster et al., Microbiol. Rev. 1992, 56: 152). Há evidência de que os perigos podem servir como um hospedeiro intermediário ("frasco de mistura") para a produção de novas estirpes que são 3 patogénicas em humanos (Scholtissek et al.r Virology 1985, 147:287). 0 surto de influenza A H5N1 em Hong Kong, em 1997, demonstrou que vírus influenza A altamente patogénico pode também ser transmitido directamente a partir de espécies de aves para humanos (Claas et al., Lancet 1998, 351:472; Suarez et al., J. Virol. 1998, 72:6678; Subbarao et al.r Science 1998, 279: 393; Shortridge, Vaccine 1999, 17 (Supl. 1): S26-S29). 0 potencial de vírus influenza A para criar novas estirpes patogénicas a partir de um vasto número de estirpes em circulação no reservatório natural indica que o controlo da doença requer monitorizar estes vírus e desenvolver terapias antivirais e vacinas melhoradas. A velocidade com que novas estirpes se desenvolvem exige vigilância neste esforço de monitorização e estende a capacidade da actual tecnologia para produzir quantidades suficientes de vacina, contra uma nova estirpe patogénica identificada, para prevenir uma epidemia ou pandemia.

Para o vírus influenza A, os sistemas de genética reversa permitiram a manipulação do genoma virai (Palese et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1996, 93:11354; Neumann e Kawaoka; Adv.

Virus Res. 1999, 53:265). Ao contrário dos vírus de cadeia positiva (i. e., poliovírus), os ARN virais de sentido negativo (ARNv) de vírus influenza A não são infecciosos. Apenas moléculas de ARNv encapsidadas com as quatro proteínas do complexo da polimerase virai (PB1, PB2, PA, NP) são capazes de iniciar uma replicação virai e ciclo de transcrição. Após as ribonucleoproteínas (RNP) penetrarem no núcleo da célula, as proteínas associadas começam a transcrever as ARNv (-) em ARNm e ARN complementares de cadeia positiva (+) ARNc. Estes ARNc servem como molde para a síntese de ARNv. 0 primeiro sistema de genética reversa a ser desenvolvido para o vírus influenza A foi 4 o método da transfecção de ARN (Luytjes et al., Cell 1989, 59:1107; Enami et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1990, 87:3802) . Após transcrição in vitro de ARNv de tipo vírus pela polimerase de ARN de T7 e reconstituição das moléculas de ribonucleoproteína virai (ARNv), foram introduzidos segmentos de RNP geneticamente alterados, em células eucariotas por transfecção. A infecção com vírus influenza auxiliar resultou na criação de vírus possuindo um gene derivado do ADNc clonado. Todavia, a presença de vírus auxiliares em métodos de transfecção de ARN e ADN limita severamente o valor prático destes métodos, uma vez que é necessário um sistema de selecção forte para eliminar vírus auxiliares. O estabelecimento da síntese de moléculas de ARNv dirigido por polimerase de ARN I (pol I) in vivo permitiu a produção intracelular de complexos de ARN (Neumann e Hobom, Virology 1994, 202:477). Neste sistema, o ADNc de tipo vírus foi inserido entre as sequências do promotor e de terminação de pol I (Zobel et al., Nucl. Acids Res. 1993, 21: 3607). Ao contrário dos transcritos de ARNm sintetizados por polimerase de ARN II (pol II), os ARN criados por pol I não possuem nem uma protecção 5' nem uma cadeia 3' poli (A). As moléculas de vRNP funcionais podem ser criadas por infecção com vírus auxiliares ou por cotransfecção de plasmídeos de expressão de proteína codificando PB1, PB2, PA ou NP (Neumann e Hobom, supra; Flick et al., RNA 1996, 2:1046; Pleschka et al., J. Virol. 1996, 70:4188; Zhou et ai., Virology 1998, 246:83).

Estudos recentes demonstraram que a expressão dirigida por plasmídeos de todos os oito ARNv a partir de um promotor pol I e a co-expressão das proteínas do complexo da polimerase resultam na formação de vírus influenza A infeccioso (Neumann et al., 5

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1999, 96:9345; Fodor et al., J.

Virol. 1999, 73:9679). Devido à criação de vírus influenza A produzido inteiramente a partir de plasmídeos não necessitar de infecção com vírus auxiliares, não é necessário sistema de selecção; por isso, todos os segmentos de gene podem ser manipulados sem limitações técnicas. Neste sistema desenvolvido por Neumann et al. {supra), os oito ADNc foram inseridos entre uma sequência de promotor de pol I humana (407 pb) e uma sequência de terminação de murino (174 pb) . A expressão das quatro proteínas do complexo de RNP foi conduzida pelo promotor de citomegalovírus humano. A transfecção de 12 plasmídeos em 106 células 293T resultou na recuperação de vírus de mais de 103 pfu; esta eficiência pode ser aumentada para 5 x 107 pfu após a transfecção de 17 plasmídeos. Fodor et al. (supra) desenvolveram um sistema em que os oito ADNc foram inseridos entre uma sequência de promotor de pol I humano (250 pb) e uma sequência de ribozima genómica de vírus da hepatite delta, para assegurar a extremidade precisa 3' do ARNv. Para a expressão dos genes do complexo da polimerase, foram utilizados os plasmídeos contendo o promotor tardio principal de adenovírus de tipo 2. Após transfecção dos 12 plasmídeos de expressão em células Vero, apenas uma ou duas partículas virais infecciosas foram recuperadas a partir de 106 células transfectadas.

Todavia, o sistema livre de vírus auxiliares descrito por Neumann et al. (supra), que contém os promotores pol I e pol II com o ADNc de vírus influenza em diferentes plasmídeos, requer a construção e cotransfecção de, pelo menos, 12 plasmídeos para recuperação de vírus e 17 plasmídeos para recuperação de vírus eficiente. A transfecção de células com este número tão elevado de plasmídeos pode limitar a utilização deste sistema a linhas celulares que possuam uma eficiência de transfecção elevada. Ser 6 capaz de recuperar vírus de diferentes tipos de células pode aumentar o rendimento do vírus através do aumento da replicação do vírus influenza A nestas células e aumentar a gama de células adequadas para a produção de vacinas (Govorkova et al., J. Virol. 1996, 70:5519) .

Assim, há uma necessidade na técnica para a criação mais eficiente de vírus influenza recombinante. Além disso, há uma necessidade adicional na técnica para a criação eficiente de reorganização de vírus para a produção de vacinas em resposta a uma estirpe de vírus identificada de novo. A presente invenção debruça-se sobre esta e outras necessidades na técnica proporcionando sistemas em que a síntese de ambos os segmentos de ARN virai genómico de cadeia negativa (ARNv) e ARNm virai ocorre a partir de um molde, minimizando, assim, o número de plasmídeos necessários para a criação de vírus e permitindo reorganização eficiente e previsível. Vírus Reoviridae Vírus da família Reoviridae, incluindo vírus do género Rotavirus, compreendem um genoma de ARN segmentado de cadeia dupla. O rotavirus humano é o agente virai mais comum de diarreia infantil grave nos Estados Unidos, provocando cerca de 50 000 hospitalizações e 20 a 50 mortes por ano com um custo anual estimado de mais de 1 mil milhões de dólares. Em países em desenvolvimento, estima-se que o rotavirus seja responsável por um terço de todas as hospitalizações associadas a diarreia e provocam, aproximadamente, 850000 mortes anualmente. 7

Existe um sistema duplo de relatar serotipos de rotavírus, devido à resposta de neutralização evocada por duas proteínas virais (VP) , VP7 e VP4. Os serotipos VP7 são designados tipos G e os derivados de VP4 são descritos como tipos P. Até ao presente, pelo menos, 10 serotipos G e, pelo menos, 7 serotipos P são encontrados em humanos. Uma vez que os genes VP4 e VP7 segregam separadamente, são criados novos rotavírus por reorganização. Nos Estados Unidos, os serotipos PI até P4 e G1 até G4 são mais frequentes; foram relatadas outras combinações em países como a índia e o Egipto. A primeira vacina contra rotavírus humano licenciada, a vacina para o rotavírus rhesus, foi formulada para produzir protecção específica para o serotipo contra os quatro serotipos comuns, G1 a G4. Todavia, esta vacina foi retirada devido a uma associação entre a vacinação e taxas aumentadas de intussuscepção entre os recipientes da vacina. Assim, há uma necessidade para produzir uma vacina de rotavírus representando todos os subtipos G e P que não possuem efeitos colaterais indesejáveis. São também aqui descritos vectores, (de um modo preferido, plasmídeos), métodos e células hospedeiras que podem ser empregues para criar rotavírus inteiramente a partir de ADNc clonado.

Foram definidos treze produtos de genes primários. Para minimizar a confusão e para facilitar a comparação com proteínas com funções semelhantes de outros géneros de Reoviridae, foi empregue a seguinte nomenclatura: de acordo com a sua migração em análise por SDS-PAGE, começando com a proteína maior, às proteínas estruturais foi dado o prefixo "VP" e às proteínas não estruturais, o prefixo "NSP" e a função de cada proteína é apresentada entre parênteses rectos. Por exemplo, a abreviatura VPl(Pol) indica que a proteína maior em partículas de vírus é a polimerase de ARN dependente de ARN. As montagem das sete proteínas estruturais em partículas virais que compreendem três camadas de estrutura: (1) 0 núcleo virai interno contendo o genoma de ARN possui três proteínas associadas a este, duas das quais (VPl(Pol) e VP3 (Cap)) estão directamente associadas com o genoma, enquanto que a terceira (VP2(T2)) constitui a capa do núcleo, (2) a capa de proteína do meio do virião é constituída por 780 moléculas de VP6(T13) dispostas em 260 unidades triméricas e (3) VP4 e VP7 constituem a capa externa. A proteína do pico VP4 contém um sítio de clivagem de tripsina que é importante para a clivagem em VP5 e VP8 e esta clivagem aumenta a infectividade. Duas formas de VP7, derivadas de diferentes grelhas de leitura em grelha, pensa-se que VP7 (1) e VP7(2), são incorporadas nos viriões. É conhecido muito menos acerca das funções das seis proteínas não estruturais. De modo semelhante a outros vírus de ARN, antecipa-se que as proteínas não estruturais desempenham papéis importantes na replicação de vírus, transcrição, tradução de ARN virais e empacotamento. Na verdade, com base nas análises de virus sensível à temperatura no segmento 8, coloca-se a hipótese de que NSP2(ViP) possui um papel directo na replicação virai. Crê-se que NSP3 se liga a sequências conservadas na extremidade 3' do ARNm virai e à proteína de ligação à protecção celular eIF4G, desse modo regulando positivamente, especificamente, a tradução de ARNm de rotavírus que possuem estruturas de protecção 5', mas sem cadeias poliA 3'. NSP1 parece não ser essencial, mas desempenha, provavelmente, um papel activo na replicação de rotavírus em cultura de células. Crê-se que NSP4 está envolvido na morfogénese do virus. As duas proteínas não estruturais, NSP5 e NSP6, são codificadas por duas grelhas de leitura diferentes do segmento 11 mas a sua função no ciclo de vida virai não é conhecida. 9 0 ciclo de replicação é completado em 10-12 horas a 37 °C. Os presentes resultados sugerem que os vírus podem entrar nas células através de endocitose mediada pelo receptor, mas pode existir um mecanismo alternativo para a entrada na célula. Após entrar na célula hospedeira, a capa externa do vírus liberta a partícula de capa dupla transcricionalmente activa para o citoplasma da célula infectada. Enzimas associadas a viriões produzem ARNm não poliadenilados protegidos em 5', que são transcritos de comprimento total da cadeia negativa de cada um dos segmentos do genoma do virião. Os ARNm virais derivados de cada segmento servem duas funções: primeiro, eles são traduzidos para criar as proteínas virais codificadas pelo segmento e segundo, os ARNm virais são, também, os moldes para replicação do genoma. A montagem do segmento do genoma ocorre através da selecção dos diferentes ARNm virais necessários para formar RI pré-núcleo. A montagem dos 11 ARNm é seguida pela síntese da cadeia negativa, que ocorre em ycore-RI' e VP6(T13)-RI, que estão presentes nos yviroplasmas' que se encontram no citoplasma da célula infectada. Os passos seguintes na morfogénese dos viriões da progenia são únicos para os rotavírus e envolvem gemulação de partícula de camada dupla para o retículo endoplásmico, num processo que envolve NSP4. Isto resulta na partícula adquirir transientemente um envelope que se perde durante os passos finais de maturação quando a capa externa do virião de VP4 e VP7 é adicionada.

Um genoma segmentado, uma estrutura genómica altamente ordenada e um ciclo de replicação complexo apresentam os principais desafios para o desenvolvimento de um sistema de genética reversa para a criação de rotavírus. Também é aqui descrita a criação simples e conveniente de rotavírus. 10

Vacinas de Influenza

As vacinas de influenza actualmente licenciadas pelas autoridades de saúde pública para utilização nos Estados Unidos e na Europa são vacinas de influenza inactivadas. Os virus que apresentam estirpes de influenza A e influenza B epidemiologicamente importantes são cultivados em ovos de galinhas poedeiras embrionados e as partículas de vírus são subsequentemente purificadas e inactivadas por meios químicos. Em cada ano, a OMS selecciona os subtipos que mais provavelmente irão circular: actualmente, duas estirpes para influenza A (H1N1) e (H3N2) e uma estirpe B.

Para a produção de uma vacina segura e eficaz é importante que as estirpes de vacina seleccionadas estejam infimamente relacionadas com as estirpes em circulação, assegurando, assim, que os anticorpos na população vacinada são capazes de neutralizar o vírus antigeneticamente semelhante. Todavia, nem todos os vírus que se verifica estarem infimamente relacionados são adequados para a produção de vacinas porque crescem fracamente em ovos. Por isso, é desejável tentar criar um vírus de reorganização de crescimento elevado para combinar o rendimento elevado de uma estirpe de vírus de laboratório (A/PR/8/34) (H1N1) com as características antigénicas da estirpe patogénica antecipada. Infelizmente, a co-infecção com dois vírus influenza contendo oito segmentos resulta na criação de teoricamente 28 = 256 vírus de progenia diferentes. Para obter um vírus de crescimento elevado com os antigénios de glicoproteína necessários, é necessário um método de selecção para eliminar os segmentos de gene correspondentes da estirpe de laboratório parental de elevado crescimento. 0 processo de selecção para obter o vírus com as glicoproteínas apropriadas e a verificação 11 da constelação de genes é uma tarefa trabalhosa e demorada. Embora o sistema de RNP-transfecção (Luytjes et al., Cell 1989, 59:1107) reduz o número possível de vírus da progenia, é necessário um bom método de selecção.

Vacinas de vírus influenza atenuados vivos, administrados intranasalmente, induzem imunidade mediada por células e humoral local, da mucosa. Vírus de reorganização (CR) adaptados a frio (ca) contendo os seis genes internos de influenza vivo, atenuado, A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) ou B/Ann Arbor/1/66 e a hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) de vírus influenza de tipo selvagem contemporâneos parecem ser atenuados de forma fiável. Esta vacina parece ser eficaz em crianças e adultos jovens. Todavia, pode ser demasiado atenuada para estimular uma resposta imunitária ideal em pessoas mais velhas, o principal grupo dos 20000-40000 indivíduos nos EUA gue morrem a cada ano como resultado de infecção por influenza. Embora as sequências dos genes internos dos vírus ca tenham sido relatadas, a contribuição de cada segmento do fenótipo atenuado ainda não está bem definida. Esta informação pode ser adquirida apenas através da introdução sequencial de mutações de atenuação definidas, específicas, num vírus. Embora o método de transfecção de RNP permita a introdução de mutação no genoma de influenza, a necessidade de um sistema de selecção e as dificuldades técnicas de reconstituição de RNP virais in vitro limita a utilização para a manipulação dos genes internos.

Assim, há uma necessidade na técnica para o desenvolvimento de vacinas influenza recombinantes para evitar a utilização de vírus auxiliares, que cresçam bem em cultura (em ovos ou cultura de células), permitam de forma fiável o desenvolvimento de vírus de reorganização que possam ser propagados para o 12 desenvolvimento de novas vacinas e proporcionar mutação sistemática para desenvolver estirpes de vírus vivos atenuados para vacinação intranasal. A presente invenção aborda estas e outras necessidades na técnica.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um sistema com base em plasmídeo mínimo para a produção de um vírus de ARN de cadeia negativa infeccioso a partir de ADNc virai clonado, compreendendo um conjunto de plasmídeos, em que cada plasmídeo compreende um ADNc virai correspondendo a um segmento genómico virai autónomo inserido entre um promotor da polimerase de ARN I (pol I) e uma sequência de terminação, cujo ADNc é THVS capaz de dirigir a síntese de ARNv e cujo ADNc é também inserido entre um promotor da polimerase de ARN II (pol II) e um sinal de poliadenilação, cujo ADNc é THVS também capaz de dirigir a síntese de ARNm e em que o referido sistema à base de plasmídeo é um sistema de transcrição bidireccional de ADNc. De um modo preferido, o vírus de ARN é um vírus influenza (e. g., um vírus influenza A ou influenza B). A invenção compreende um sistema à base de plasmídeo para criar vírus de ARN de cadeia negativa infecciosos a partir de genes ou ADNc clonados. Neste sistema (sistema bidireccional), o gene ou ADNc está localizado entre um promotor de pol II a montante e um promotor de pol I a jusante. A transcrição do gene ou ADNc do promotor de pol II produz ARNm virai de sentido positivo protegido e a transcrição a partir do promotor de pol I produz ARNv de sentido negativo, não protegido. Também descrito como exemplo comparativo é outro sistema (sistema 13 unidireccional), no qual o gene ou ADNc está localizado a jusante de um promotor de pol I e um promotor de pol II. 0 promotor de pol II produz ARNm virai de sentido positivo protegido e o promotor de pol I produz ARNc virai de sentido positivo não protegido.

Um sistema com base em plasmídeo mínimo da invenção permite a criação de vírus infecciosos de ARN de cadeia negativa a partir de ADNc virai clonado. Um tal sistema compreende um conjunto de plasmídeos em que cada plasmídeo compreende um segmento genómico virai autónomo do vírus de ARN. Em cada plasmídeo, o ADNc virai, correspondendo ao segmento genómico virai autónomo, é inserido entre as sequências de um promotor da polimerase de ARN I (pol I) e de terminação, resultando, assim, na expressão de ARNv, que são, à vez, inseridos entre um promotor de polimerase de ARN II (pol II) e um sinal de poliadenilação, resultando, assim, na expressão de ARNm virai. Assim, este sistema emprega a tecnologia de plasmídeo bidireccional e permite que a reorganização eficiente produza vírus de ARN de cadeia negativa correspondendo às actuais estirpes patogénicas em circulação, e. g., em termos dos genes NA e HA de influenza, numa estirpe de fundo bem adaptada para crescer em cultura de células ou a partir de uma estirpe atenuada, ou ambos. De um modo preferido, o vírus é um vírus influenza A ou um vírus influenza B. A invenção proporciona células hospedeiras compreendendo o sistema à base de plasmídeos para a produção de viriões infecciosos e métodos para produzir viriões de vírus de ARN de cadeia negativa, cujos métodos compreendem cultivar a célula hospedeira em condições que permitem a produção de proteínas virais e ARNv. 14 0 sistema à base de plasmídeos, células hospedeiras e o método para produzir viriões são particularmente adequados para preparar uma vacina especifica de vírus de ARN de cadeia negativa. Esses métodos compreendem purificar viriões. Os viriões purificados podem ser inactivados ou podem ser atenuados. Podem ser utilizadas vacinas da invenção para vacinação contra uma infecção de vírus de ARN de cadeia negativa. Por exemplo pode ser administrada uma dose protectora de uma vacina compreendendo viriões inactivados através de injecção intramuscular. Alternativamente uma dose protectora de uma vacina compreendendo viriões atenuados pode ser administrada intranasalmente a um indivíduo.

Noutra forma de realização vantajosa, a invenção proporciona um método para criar um vírus de ARN de cadeia negativa atenuado. Este método compreende mutar um ou mais genes virais no sistema à base de plasmídeos e depois determinar se os vírus de ARN infeccioso produzido pelo sistema são atenuados. Esses vírus atenuados podem ser utilizados para desenvolver vacinas intranasais, incluindo vacinas intranasais com potência aumentada para induzir imunidade protectora em populações envelhecidas ou outras populações que não respondem às actuais vacinas atenuadas.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. Representação esquemática do sistema de transcrição pol I-pol II para a síntese de ARNv e ARNm. 0 ADNc de cada um dos oito segmentos de vírus influenza é inserido entre o promotor de pol I (Pih) e o terminador de pol I (11) . Esta unidade de transcrição de pol I é 15 flanqueada pelo promotor de pol II (pnCMV) do citomegalovírus humano e o sinal de poliadenilação (auBGH) do gene que codifica a hormona do crescimento bovina. Após transfecção dos oito plasmideos de expressão, são sintetizados dois tipos de moléculas. A partir do promotor de pol I humano, é sintetizado ARNv de sentido negativo através de pol I celular. 0 ARNv sintetizado contém a região não codificante (NCR) nas extremidades 5' e 3' . A transcrição por pol II produz ARNm com estruturas de protecção 5' e caudas poli A em 3' ; estes ARNm sao traduzidos em proteínas virais. 0 ATG do ADNc virai é o primeiro ATG a jusante do sitio de iniciação de transcrição de pol II.

Figura 2. 0 sistema de oito plasmideos pol I - pol II para a produção de virus influenza A. Oito plasmideos de expressão contendo os oito ADNc virais inseridos entre o promotor de pol I humano e o promotor de pol II (ver Figura 1) são transfectados em células eucariotas. Dado que cada plasmídeo contém dois promotores diferentes, ambos pol I e pol II celulares irão transcrever o molde de plasmídeo, presumivelmente em diferentes compartimentos nucleares, que resulta na síntese de ARNm virai e ARNv. Após síntese das proteínas do complexo da polimerase virai (PB1, PB2, PA, NP), o ciclo de replicação virai é iniciado. Por último, a montagem de todas as moléculas virais directamente (transcrição de pol II) ou indirectamente (transcrição de pol I e replicação virai) derivadas da transcrição celular e maquinaria de tradução resulta na interacção de todas as moléculas sintetizadas (vRNP e as proteínas estruturais HA, NA, Ml, M2, NS2/NEP) para criar vírus influenza A infeccioso. 16

Figuras 3A e 3B. Representação esquemática do método desenvolvido para a construção e transfecção dos oito plasmideos de expressão para recuperar A/Teal/HK/W312/97 (H6N1). A. 0 ARN virai foi extraído de partículas de vírus. Foi realizada RT-PCR com iniciadores contendo nucleótidos específicos para o segmento e sequências para as endonucleases de restrição de tipo II, BsmBI ou Bsal. Os oito fragmentos de PCR virai foram digeridos com BsmBI ou Bsal e inseridos em pHW2000 (linearizado com BsmBI). Esta inserção resultou em oito construções de expressão nas quais os ADNc virais são precisamente fundidos com o promotor e terminação de pol I (as sequências terminais virais AGC...ACT são apresentadas para o segmento PB2 nos rectângulos a preto). B. Os oito plasmideos de expressão com um promotor de pol I e um promotor de pol II contêm uma cópia de cada um dos ADNc virais dos oito segmentos. As grelhas de leitura aberta para as 10 proteínas virais são flanqueadas pelas regiões não codificantes específicas para o segmento (caixas cinzentas). Porque o promotor humano utilizado de pol I apresenta actividade elevada apenas em linhas celulares derivadas de humanos ou espécies relacionadas, foram co-cultivadas células 293T humanas conjuntamente com a linha celular convencional utilizada para influenza A (células MDCK-). Os vírus produzidos nas células 293T após transfecção podem então infectar células MDCK e replicar. 17

Figuras 4A e 4B. Caracterização dos vírus recuperados por RT-PCR. A. 0 ARN foi extraído a partir de partículas de vírus após duas passagens do sobrenadante de células transfectadas (ver Tabelas 1 e 2) em células MDCK. A RT-PCR foi realizada com iniciadores específicos para o segmento do gene NS e com ARNv extraído dos viriões. Os iniciadores NS utilizados não foram específicos para a estirpe; permitindo, desse modo, a amplificação de qualquer segmento NS de influenza A. Os produtos de reacção foram sujeitos a electroforese num gel de agarose a 2%. Para assegurar que os fragmentos de ADN amplificados foram derivados de ARNv e não de ADN plasmídico transportado das células transfectadas, foi realizada uma reacção sem a adição de transcritase reversa (RT) (-) . Pistas 1 e 2, A/Teal/HK/W312/97 recombinante (Tabela 1); pistas 3 e 4, M-reorganização (Tabela 2); Pistas 5 e 6, NS-reorganização (Tabela 2); pistas 7 e 8, vírus A/WSN/33 recombinante (Tabela 1); pistas 9 e 10, quádruplo-reorganização (Tabela 2). B. A digestão dos fragmentos com Ncol é apresentada em A. A identidade dos fragmentos NS foi também verificada pela análise de sequência do produto amplificado (não apresentado).

Figura 5. É também descrito um sistema de transcrição de ARN de pol I-pol II unidireccional. No sistema de transcrição unidireccional pol I-pol II, o ADNc virai é inserido na orientação de sentido positivo entre um promotor de pol I (plh) humano e sequência de terminação (ti). Esta unidade de transcrição de pol I inteira é flanqueada por um promotor de pol II (pIICMV: promotor precoce imediato do citomegalovírus humano) e o sítio de poliadenilação do gene que codifica a 18 hormona de crescimento bovina (allbgh). Após transfecção, espera-se que sejam sintetizados dois tipos de transcritos de ARN. ARNc em sentido positivo com um grupo trifosfato na sua extremidade 5' sintetizado por pol I e ARNm em sentido positivo sintetizado por pol II com uma estrutura de protecção 5' e uma cadeia poli(A) na sua extremidade 3'. Ambos os elementos do ARNm são necessários para tradução eficiente.

Figura 6. É também descrito o vector de clonagem pHWll com um pol I e um promotor de pol II dispostos em tandem. 0 plasmídeo contém o promotor de ARN de 225 pb humano de pol I (plh) e o terminador de murino de 33 pb (ti) . As sequências do promotor e terminação de pol I são flanqueadas pelo promotor da polimerase de ARN II (pIICMVj do citomegalovirus humano e o sinal de poliadenilação (alIBGH) do gene que codifica a hormona de crescimento bovina. Para a inserção de ADNc virai entre o promotor e o terminador de pol I, foram introduzidos dois sítios de restrição de BsmBI (indicado a sublinhado). A digestão do vector com BsmBI criou um fragmento do vector com extremidades protuberantes coesivas, mas não complementares. A concepção deste vector permite a fusão precisa de ADNc virai na orientação em sentido positivo em relação à sequência do promotor e terminação de pol I. Para propagação em E. coli, o plasmídeo possui uma origem de replicação (ori) e para selecção em meio contendo ampicilina, o plasmídeo contém um gene da beta-lactamase (bla).

Figuras 7A e 7B. Sistema de promotor duplo para a produção

vírus de ARN infecciosos. Uma vez que os vírus de ARN :ionam como parasitas celulares, eles devem optimizar 19 estratégias para utilizar células hospedeiras para a expressão da sua informação genética. Todos os vírus de ARN devem sintetizar ARNm que são capazes de ser traduzidos em proteínas. Geralmente, as proteínas sintetizadas são necessárias para a replicação, transcrição e produção de novas partículas de vírus da progenia. Para a replicação eficiente dos ARN genómicos, devem ser produzidos transcritos de ARN com extremidades 5' e 3' exactas. Entre as Figuras 7A e 7B, apenas 7A faz parte da invenção. 0 presente sistema compreende uma unidade de transcrição exterior e uma interior. A unidade de transcrição interior compreende um promotor de pol I (p (+ RNA) ou p(- RNA)). Os ADNc de vírus de ARN consistem em uma ou mais grelhas de leitura aberta (ORF) que são flanqueadas por regiões não codificantes (NCR). De um modo preferido, não existem sequências intervenientes entre o ADNc virai e o promotor. A ausência de sequências intervenientes é vital porque as extremidades 5' e 3' de ARNv genómico geralmente contêm sequências reconhecidas por proteínas virais necessárias para a transcrição e replicação; as sequências não virais adicionais impedem, tipicamente, o reconhecimento eficiente e a replicação de ARNv pelas proteínas virais. A ausência de sequências intervenientes permite que a cadeia de ARN (A) (-) ou de ARN (B) (+) transcrita seja utilizada eficientemente pelas proteínas de polimerase virai. A unidade de transcrição exterior possui um promotor de pol II (p(ARNm)) que dirige a transcrição de ARNm a partir do ADNc; o ARNm inclui sequências 5' (e. g., protecções de metil G) e sequências 3' (e. g., caudas poli A) que são necessárias para a iniciação da tradução e produção de proteínas virais. Uma vez que o processo de tradução é tolerante de sequências adicionais entre o promotor, da unidade de transcrição externa e o ADNc 20 virai, a presença de sequências intervenientes da unidade de transcrição interna não impede significativamente a tradução do ARNm.

Este sistema pode ser modificado e melhorado para vírus de ARN diferentes do vírus influenza utilizando diferentes elementos de terminação ou ribozimas para a síntese intracelular de ARN virai com extremidades exactas 5' e 3' (discutido infra). Podem ser empregues ribozimas de cabeça de martelo ou ribozima do vírus da hepatite delta (HDV) para a criação de ARN virai com extremidades exactas (Schnell et al., EMBO J. 1994, 13:4195;

Pleschka et al., J.Virol. 1996, 70:4188; Herold, J. et al., J.

Virol 2000, 74 (14):6394-400).

Em exemplos comparativos, a unidade de transcrição externa pode compreender um promotor pol I ou III, um promotor da polimerase de ARN de T7, um promotor da polimerase de ARN de T3, promotor da polimerase de ARN de SP6 ou qualquer outro promotor para uma polimerase de ARN dependente de ADN. Se o promotor na unidade de transcrição externa dirige a síntese de um transcrito que não tem uma protecção metilo de G, pode ser colocado um Sítio de Entrada do Ribossoma Interno (IRES) na extremidade 5' da sequência de ADNc codificante, para facilitar a iniciação da tradução (discutido infra). É de referir que o vector pHW2000 possui um promotor de T7 entre o promotor de CMV e o sítio de terminação. Os transcritos de pol II são sintetizados no núcleo, enquanto que os transcritos de T7 são sintetizados no citoplasma de células que expressam a polimerase de ARN de T7. Assim, podem ser produzidos transcritos com origem em mais do que um promotor de uma unidade de transcrição externa resultando em diferentes ARNm. Assim, os 21 plasmídeos de expressão derivados de pHW2000 permitem avaliar rapidamente se o promotor de pol II ou T7 ou a combinação de ambos é óptima para a síntese de ARNm de vírus de cadeia positiva que possuem um Sítio de Entrada de Ribossoma Interno (IRES).

Figura 8. É também descrito um sistema de promotor duplo para a produção de vírus de ARN de cadeia ( + ) . 0 sistema pode também ser adaptado para produzir vírus compreendendo uma cadeia positiva, genoma unimolecular, tal como o vírus da hepatite C. Nesta forma de realização, um ADNc compreendendo o genoma do vírus da hepatite C (aproximadamente 9500 nucleótidos) é inserido numa construção que permite a transcrição eficiente do ADNc intracelularmente em ARNm e um ARN negativo de comprimento total (abordagem bidireccional) ou ARNm e ARN positivo de comprimento total (abordagem unidireccional). O ADNc consiste numa grelha de leitura aberta (ORF) que é flanqueada pelas regiões não codificantes (NCR). Na figura, é apresentado um plasmídeo de expressão contendo o sistema bidireccional. O ADNc de comprimento total é inserido entre as sequências de um promotor pol I (pi) e terminação (ti) resultando na síntese de ARN de cadeia (-) de comprimento total após transfecção. A unidade de transcrição interna é flanqueada por uma unidade de transcrição externa que possui um promotor (p(ARNm)) para dirigir a síntese de ARNm. De um modo preferido, este promotor é um promotor de pol II. Todavia, se o ARN sintetizado possui um sítio de entrada ribossómico interno (IRES), o promotor de pol II pode ser substituído por um promotor de pol I, pol III, SP6, T7 ou T3 (a utilização de promotores T3 ou T7 requer que as proteínas da polimerase de T3 ou T7 sejam expressas quer por cotransfecção de um plasmídeo que codifica as 22 polimerases ou a utilização de uma linha celular estável que expressa as polimerases). Na extremidade 3' da unidade de transcrição externa, seja um sinal poli A ou uma sequência poli A inserida é utilizado para proporcionar uma cauda poli A para o ARNm sintetizado. 0 ARNm resultante é traduzido num precursor de poliproteína grande que é clivado co- e pós-tradução para produzir proteínas virais individuais estruturais e não estruturais.

As proteínas não estruturais NS5a e NS5b, que são as proteínas de polimerase de ARN dependentes de ARN utilizam o ARN (-) sintetizado pela unidade de transcrição interna como um molde para iniciar o ciclo de replicação/transcrição virai. Assim, o ARN (+)/ARNm é produzido que é utilizado para tradução numa proteína. Na última instância, são criados vírus infecciosos que contêm ARN (+) juntamente com proteínas estruturais virais.

Figura 9. É também descrito um sistema unidireccional de pol I-pol II para a produção de vírus Parainfluenza III humano. A presente invenção pode ser utilizada para produzir o vírus parainfluenza III que compreende um genoma de ARN de cadeia negativa, unimolecular. 0 ADNc virai pode ser inserido no sistema pol I-pol II quer numa orientação de sentido ou anti-sentido. Na figura, é apresentado o sistema unidireccional. Um promotor de pol I dirige a síntese de ARNc e um promotor de pol II dirige a síntese de ARNm. Nesta forma de realização, um promotor de pol II produz um ARNm policistrónico do qual a primeira grelha de leitura aberta é traduzida eficientemente na proteína da Nucleocápside (NP) . Esta proteína é necessária para a replicação. Plasmídeos codificando a proteína L e P, que são 23 também essenciais para a replicação e transcrição (mas não são eficientemente traduzidas a partir do ARNm policistrónico), são preparados e são co-transfectados em plasmídeos de expressão preparados. Comparados com o sistema de genética reversa desenvolvido por Durbin, A.P. et al.r Virology 1997, 235(2):323-332, o sistema pol I-pol II possui várias vantagens. Pela expressão de NP do mesmo ADNc, este sistema de plasmídeo mínimo requer a construção e transfecção de apenas três em vez de quatro plasmídeos para criar Parainfluenzavírus III humano, inteiramente a partir de ADNc clonado. Ao contrário dos sistemas de genética reversa com base na transcrição in vivo a partir do promotor de T7, o sistema pol I-pol II é inteiramente dirigido pelas polimerases de ARN dependentes de ADN eucariótico encontradas em cada célula. Além disso, a infecção de vírus vaccinia que dirige a expressão da polimerase de ARN de T7 requer a utilização de células que são permissivas para o virus vaccinia (células HeLa ou derivados tais como células Hep-2) mas não óptimas para o crescimento de vírus parainfluenza humano, limitando, assim, a utilidade desta abordagem para a produção de vírus infecciosos. Os efeitos citopáticos severos de vírus vaccinia e as precauções de segurança necessárias para utilização de agentes infecciosos são características indesejáveis deste sistema. A utilização do sistema pol I-pol II elimina a necessidade de uma infecção com vírus e permite a utilização de células LLC-MK2 para a transfecção e crescimento de virus Parainfluenza III humano, proporcionando, assim, uma tecnologia para criar vírus atenuados de um modo mais simples e seguro.

Figura 10. É também descrito um sistema à base de plasmídeos para a produção de Rotavírus a partir de ADNc clonado. Este sistema pode ser utilizado para a criação de vírus com genomas 24 de ARN de cadeia dupla segmentados (e. g., Rotavírus) . Pode ser aplicado, por exemplo, a vírus que são membros da família Reoviridae (10, 11, 12 segmentos de dsARN) ou Birnaviridae (2 segmentos dsARN). Até à data, para os vírus da família Reoviridae, não estão disponíveis sistemas de genética reversa. Esta figura ilustra como os rotavírus, que possuem 11 segmentos de dsARN, podem ser criados utilizando o presente sistema, mas podem ser empregues sistemas semelhantes para membros do género Orbivirus (10 segmentos de dsARN) ou Ortroreovírus (12 segmentos de dsARN). A seguinte discussão ilustra a criação de rotavírus A/SA11 inteiramente a partir de ADNc clonado. Todos os 11 segmentos do genoma de ARN de cadeia dupla de rotavírus símio foram determinados. Os dsRNA no genoma têm desde 3302 pb até 663 pb de comprimento e o tamanho do genoma completo é de 18550 pb. Os segmentos do genoma são numerados 1-11 de modo a aumentar a mobilidade por análise de PAGE (electroforese em gel de poliacrilamida). Os segmentos são completamente emparelhados em bases e a cadeia de sentido positivo contém uma estrutura de protecção 5' terminal (m7GpppGmGPy) mas não possui um sinal de poliadenilação próximo da sua extremidade 3'. Todos os segmentos genómicos partilham terminais 5' e 3' curtos conservados com um consenso de 10 nucleótidos na extremidade 5' e um consenso de 8 nucleótidos na extremidade 3'. Imediatamente interno a estas regiões terminais, em cada gene, há uma segunda região de conservação de, pelo menos, 30-40 nucleótidos que são específicos para o segmento. As regiões 5' não traduzidas (NTR) variam em comprimento, mas têm todas menos de 50 nucleótidos e em todos os segmentos as NTR são seguidas por, pelo menos, uma grelha de leitura aberta comprida após o primeiro AUG. Os segmentos 9 e 11 codificam duas proteínas. As NTR 3' variam em 25 comprimento variando desde 17 nts (segmento 1) até 182 nts (segmento 10). O ADNc de rotavirus é clonado num sistema de promotor duplo, de um modo preferido, um sistema pol I-pol II. Após transfecção dos plasmideos resultantes numa célula hospedeira adequada, são produzidos ARN virais e proteínas que resultam na formação de rotavirus infeccioso. É também descrito um sistema de transcrição unidireccional utilizado para produzir rotavirus. A utilização desta abordagem resulta na síntese intracelular das 11 moléculas de ARN ( + ) do genoma rotaviral que têm trifosfatos nas suas extremidades 5'. A expressão de ARNm do tipo vírus resulta na expressão de proteínas virais. A proteína virai VP3 (CAP), que possui uma actividade de guanililtransferase e metiltransferase, cataliza a adição de estruturas de protecção 5' a todos os 11 ARN rotavirais ( + ) (Chen D., et ai., Virology 1999, 265:120-130). Na verdade, foi demonstrado anteriormente que VP4 (CAP) purificado, um VP3 (CAP) rotaviral, análogo do vírus bluetogue (BTV), pode adicionar estruturas de protecção a um ARN ( + ) de tipo vírus in vitro (Ramadevi N., et al. Proc Natl Acad Sei USA. 1998, 95(23):13537-42). Antecipa-se que a transcrição in vivo de ADNc e a expressão da proteína VP3 (CAP) intracelularmente, resulta na criação de ARN protegidos para todos os 11 segmentos genómicos rotavirais. Estes ARNm são traduzidos em proteínas virais ou são empacotados em pré-núcleo-RI. Após a formação de partículas VP6(T13)-RI, o ARNm em sentido positivo é utilizado como molde para a síntese de (-)ARN. Por último, a adição de VP4 e VP7 durante a morfogénese resulta em viriões de progenia infecciosos.

Uma vez que a iniciação de replicação eficiente e morfogénese pode ser dependente da concentração óptima de cada 26 uma das proteínas virais, pode ser vantajoso criar plasmídeos separados para a síntese de ARN e expressão de proteína. Todavia, dado que o nível de expressão de proteína pode ser optimizado variando a quantidade de plasmídeos na célula hospedeira ou através da utilização de diferentes promotores para a síntese de ARNm, não é provável que a utilização de dois plasmídeos para um segmento seja necessária para a maioria dos genes. Uma vez que o ARN ( + ) é sintetizado a partir de um ARN (-), a expressão intracelular de ARN (-)e proteína podem resultar na criação de unidades competentes de replicação, que produzem ARNm virai. Assim, o sistema de promotor duplo permite o estabelecimento de um sistema de plasmídeo mínimo compreendendo um número de plasmídeos significativamente inferior a 22 que seria necessário se o ARN e os plasmídeos que expressam a proteína estejam em plasmídeos separados. A criação de rotavírus pode ser realizada de um modo semelhante ao utilizado para produzir vírus de influenza A.

Figuras 11 A-D. É também descrita a replicaçao e síntese de ARNm de genomas de vírus de ARN. (A) Os ARNm são sintetizados pelas proteínas de polimerase virai durante a infecção de vírus de cadeia (-): Um ou dois ARNm para vírus de ARN segmentados ou ARNm múltiplo para vírus com genomas unimoleculares. Os mecanismos anti-terminação resultam na síntese de cadeias (+) de comprimento total, que podem ser copiadas em ARN (-) genómico. 27 (Β) Os genomas segmentados de vírus de ARN ambi-sentido sao copiados para formar um ARNm; um segundo ARN é sintetizado a partir do complemento. (C) Nas células infectadas com vírus de ARN de cadeia dupla, o primeiro ARNm sintetizado pode ser traduzido numa proteína ou servir como moldes para a síntese de cadeias (-) , resultando em ARN genómico de cadeia dupla. (D) Para os vírus de cadeia ( + ) , o ARN genómico é também um ARNm e é copiado em ARN de cadeia (-), que pode ser copiado em ARN genómico ( + ) . 0 ARNm de alguns vírus de ARN ( + ) não contêm uma cauda poli A. Em algumas famílias são produzidos um ou mais ARN subgenómicos.

DESCRIÇÃO DETALHADA 0 ciclo de vida de todos os vírus de ARN inclui a síntese de ARN e a montagem de partículas de vírus após a síntese de proteínas; estas funções proporcionam uma estrutura conceptual para os sistemas de genética reversa da presente invenção e outros sistemas também aqui descritos que podem ser utilizadas para produzir vírus de ARN a partir de ADNc clonado. A presente invenção e outros sistemas também aqui descritos simplifica e melhoram os sistemas de genética reversa actualmente disponível estabelecendo um sistema de promotor duplo para a produção de vírus segmentados de cadeia negativa (e. g., influenza A, influenza B, Bunyaviridae) , vírus de ARN não segmentados de cadeia negativa (e. g., Paramyxoviridae, Mononegavirales) , vírus de ARN de cadeia dupla (e. g., Reoviridae, Birnaviridae) e vírus de ARN de cadeia positiva (e. g., Flaviviridae, Picornaviridae, 28

Coronaviridae, Togaviridae) . Dado que o sistema da presente invenção utiliza um ADNc virai simples para a síntese de proteínas e para a síntese de ARN genómico, este sistema reduz o número de plasmídeos necessários para a produção de vírus e permite o desenvolvimento de vacinas rapidamente e de forma não dispendiosa.

Se um vírus compreendendo um genoma de ARN segmentado se quer produzir utilizando a presente invenção, um ADNc virai correspondendo a cada gene no genoma alvo é inserido num plasmídeo de expressão da invenção. A invenção compreende um plasmídeo bidireccional com base no sistema de expressão em que o ADNc virai é inserido entre uma sequência de promotor e de terminação de polimerase de ARN I (pol I) (unidade de transcrição interna). Esta unidade de transcrição de pol I inteiro é flanqueada por um promotor de polimerase de ARN II (pol II) e um sítio de poliadenilação (unidade de transcrição externa). É também descrito um sistema unidireccional, em que os promotores de pol I e de pol II estão a montante do ADNc e produzem ARNc não protegido em sentido positivo (a partir do promotor de pol I) e ARNm protegido em sentido positivo (a partir do promotor de pol II). 0 promotor pol I, a sequência de terminação de pol I, promotor de pol II e sinal de poliadenilação no sistema unidireccional podem ser referidos como compreendendo uma "orientação de a montante-para-jusante". No sistema bidireccional da presente invenção, os promotores de pol e de pol II estão em lados opostos do ADNc no qual um promotor a montante de pol II produz ARNm protegido em sentido positivo e um promotor de pol I a jusante produz ARN virai não protegido em sentido positivo (ARNv). Estes sistemas de pol I -pol II começam com a iniciação de transcrição das duas enzimas de polimerase de ARN celulares dos seus próprios promotores, 29 presumivelmente em diferentes compartimentos do núcleo. As sequências de promotor de pol I e terminação de pol I no sistema bidireccional podem ser referidas como compreendendo uma "orientação de a jusante-para-montante" enquanto que o promotor de pol II e sinal de poliadenilação no sistema bidireccional pode ser referido como compreendendo uma "orientação a montante-para-a jusante".

Se o virus alvo compreende um genoma de ARN de cadeia positiva, segmentado, um promotor de pol I está, de um modo preferido, localizado a montante do ADNc na unidade de transcrição interna (sistema unidireccional) . Neste caso, o ARN de cadeia positiva é gerado para dirigir a incorporação em novos virus. Todavia, quando o virus alvo compreende cadeia negativa, são produzidos genomas de ARN segmentados utilizando o sistema unidireccional.

Se o virus alvo compreende um genoma de ARN segmentado de cadeia negativa, o promotor de pol I está, de um modo preferido, localizado a jusante do ADNc na unidade de transcrição interna (sistema bidireccional). Nesta forma de realização, o ARN de cadeia negativa é criado para incorporação directa em novos virus. É também descrito que os virus alvo compreendendo genomas de ARN segmentado de cadeia positiva, são produzidos com o sistema bidireccional. A presente invenção também pode ser utilizada para produzir virus compreendendo genomas de ARN de cadeia negativa infecciosos ou não infecciosos. Em geral, a simples introdução de ARN genómico virai infeccioso numa célula hospedeira é suficiente para provocar a iniciação do ciclo de vida virai na célula e a eventual produção de virus completo. Por exemplo, a 30 simples introdução de ARN genómico picornaviral numa célula hospedeira é suficiente para provocar a criação de picornavírus completos. A iniciação do ciclo de vida de um virus compreendendo ARN genómico não infeccioso, tipicamente, requer a introdução adicional de outras proteínas virais que são normalmente comportadas numa partícula virai juntamente com o genoma. Por exemplo, o vírus parainfluenza III comporta uma polimerase de ARN dependente de ARN cuja presença é necessária numa célula hospedeira infectada de novo para iniciação de replicação de ARN genómico virai e transcrição de ARNm virai; na ausência da polimerase, o ARN genómico de parainfluenza III é não infeccioso. Em formas de realização da presente invenção em que são criados vírus compreendendo ARN genómicos de cadeia negativa infeccioso, não segmentados, a simples introdução de um plasmídeo de expressão dupla da invenção, comportando um ácido nucleico incluindo o genoma virai, numa célula hospedeira adequada é suficiente para provocar a criação de vírus completo. Em formas de realização em que são criados vírus compreendendo ARN genómico não segmentado não infecciosos, também podem ter que ser introduzidos plasmídeos de expressão adicionais numa célula hospedeira juntamente com um plasmídeo de expressão dupla comportando o genoma virai. 0 plasmídeo adicional deve expressar a(s) proteína(s) necessária(s) para a iniciação do ciclo de vida virai que são normalmente introduzidos numa célula hospedeira após infecção (e. g., polimerases de ARN dependentes de ARN).

No caso em que é produzido picornavírus, que compreendendo um genoma de ARN de cadeia positiva não segmentado, infeccioso, o ADNc compreendendo o genoma virai completo é inserido num plasmídeo de expressão de promotor duplo da invenção. Num promotor a montante numa unidade de transcrição externa, de um modo preferido, um promotor de pol II, dirige a produção de um 31 ARNm de cadeia positiva compreendendo o genoma virai completo -uma é traduzida poliproteína a partir do ARNm e as proteínas individuais são clivadas e libertadas da poliproteína (e. g., por uma protease na poliproteína). Se o genoma virai compreende ARN de cadeia negativa, um segundo promotor a jusante, numa unidade de transcrição interna (sistema bidireccional) , de um modo preferido, pol I, iria dirigir a produção de uma cópia de cadeia negativa do genoma. Casos em que são produzidos vírus de ARN de cadeia positiva, não segmentados, utilizando o sistema bidireccional, são também descritos. Vírus compreendendo genomas de ARN de cadeia negativa não infecciosos, não segmentados, em que uma poliproteína não é produzida também pode ser criada com a presente invenção. Por exemplo, o presente sistema pode ser utilizado para produzir vírus rhabdoviridae ou vírus paramyxoviridae, de um modo preferido, vírus parainfluenza III, cujo ciclo de vida normalmente inclui a produção de ARNm monocistrónico múltiplo a partir de ARN genómico, de cadeia negativa através de uma polimerase de ARN dependente de ARN derivada viralmente; as proteínas individuais são expressas a partir do ARNm monocistrónico. Nestas formas de realização, uma unidade de transcrição externa compreendendo um promotor de pol II dirige a produção de uma cópia policistrónica de cadeia positiva, do genoma virai do qual, geralmente, apenas o primeiro gene (NP) é traduzido. Adicionalmente, uma unidade de transcrição interna compreendendo um promotor de pol I dirige a expressão de uma cópia de ARN do genoma para incorporação no vírus novo. Uma vez que o genoma virai de parainfluenza III compreende ARN de cadeia negativa, o promotor da unidade de transcrição interna está localizado a jusante do ADNc (sistema bidireccional). Se o genoma virai compreende ARN de cadeia positiva, o promotor da 32 unidade de transcrição interna é descrito como estando localizado a montante do ADNc (sistema unidireccional) . São descritos casos em que os virus compreendendo um genoma de ARN de cadeia positiva são produzidos utilizando o sistema bidireccional. Proteinas virais adicionais (diferentes da proteína expressa a partir de ARNm policistrónico) são necessárias para transcrição e replicação virai (L e P) e estas proteínas são proporcionadas individualmente em plasmídeos de expressão separados. São também descritos casos em que são criados vírus compreendendo genomas de ARN de cadeia dupla, segmentados. Nestes casos, um plasmídeo compreendendo cada gene no genoma virai alvo é inserido num plasmídeo de expressão de promotor duplo. 0 plasmídeo é um plasmídeo bidireccional. Um promotor numa unidade de transcrição externa, de um modo preferido, um promotor de pol II, dirige a expressão de um transcrito de ARNm de cada gene que é traduzido na proteína codificada. Um promotor numa unidade de transcrição interna, de um modo preferido, um promotor de pol I, dirige a transcrição de uma cadeia negativa (sistema bidireccional). Subsequentemente, a primeira cadeia que é produzida pode actuar como um molde para a produção da cadeia complementar através da polimerase de ARN virai. 0 produto de ARN de cadeia dupla resultante é incorporado em novos vírus. A recuperação dos dois vírus de influenza A de um sistema minimal à base de plasmídeos, A/WSN/33 (H1N1) e A/Teal/HK/W312/97 (H6N1), estabeleceu a utilidade deste sistema. A recuperação de uma estirpe fenotipicamente indistinguível A/PR/ 8/34 (H1N1) , que é a convencional para a produção de vacina de influenza A inactivado, estabeleceu a utilidade deste sistema para o desenvolvimento de vacinas. Setenta e duas horas 33 após a transfecção de oito plasmídeos de expressão em células co-cultivadas 293T e MDCK, o rendimento de vírus no sobrenadante das células transfectadas estava entre 2 x 105 e 2 x 107 vírus infecciosos por mL. Este sistema de oito plasmídeos foi também utilizado para criar vírus de reorganização simples e quádruplo entre A/Teal/HK/W312/97 (H6N1) e A/WSN/33 (H1N1) e para criar vírus A/WSN/33 a partir de um sistema orientado em tandem (que produz ARNc e ARNm).

Dado que o sistema pol I - pol II facilita a concepção e recuperação de ambos dos vírus influenza A recombinantes e de reorganização, é também aplicável para a recuperação de outros vírus de ARN inteiramente a partir de ADNc clonado. Embora o ADNc seja preferido, para utilização na presente invenção, qualquer outro tipo de ácido nucleico que codifica um gene virai que se quer expressar pode ser utilizado se os elementos essenciais da invenção forem preservados. Por exemplo, podem ser utilizados os produtos amplificados por PCR ou fragmentos de restrição compreendendo genes virais. Além disso, os genes expressos no sistema da invenção à base de plasmídeo podem ser fundido com ou marcado com outros genes, tais como marcadores de purificação/detecção (e. g., glutationa-S transferase, poli-histidina, proteína verde fluorescente, marcadores myc e marcadores FLAG). A presente invenção também antecipa formas de realização em que as sequências de genes parciais são utilizadas em plasmídeos do presente sistema. A seguinte tabela inclui uma lista não limitante de vírus de ARN de cadeia negativa que podem ser produzidos utilizando a presente invenção: 34

Ordem Família Subfamília Género Espécie Tipo Mononegavirales Bornaviridae Bornavirus virus da doença de Boma Mononegavirales Piloviridae Vírus de tipo Ébola Virus Ébola Mononegavirales Piloviridae Virus do tipo Marburgo Virus Marburgo Mononegavirales Paramyxoviridae Paramyxovirinae Respirovirus virus parainfluenza 1 Humano Mononegavirales Paramyxoviridae Paramyxovirinae Morbilivirus Virus do sarampo Mononegavirales Paramyxoviridae Paramyxovirinae Rubulavirus Vírus da papeira Mononegavirales Paramyxoviridae Pneumovirinae Pneumovírus vírus do sincício Respiratório Humano Mononegavirales Paramyxoviridae Pneumovirinae Metapneumovírus Vírus de rinotraqueíte da Turquia Mononegavirales Rhabdovir idae Vesiculovirus virus da estomatite Vesicular de Indiana Mononegavirales Rhabdovir idae Lyssavirus Virus da raiva Mononegavirales Rhabdovir idae Ephemerovirus Virus da febre efemoral bovina Mononegavirales Rhabdovir idae Novirhabdovirus Virus da necrose hematopoiética Infeccioso Mononegavirales Rhabdovir idae Cytorhabdovirus Virus da necrose amarela da alface Mononegavirales Rhabdovir idae Nucleorhabdo- virus Virus no nanismo da batata amarelo Mononegavirales Orthomyxoviridae Influenzavirus A Virus influenza A Mononegavirales Orthomyxoviridae Influenzavirus B Virus influenza B Mononegavirales Orthomyxoviridae Influenzavirus c virus Influenza C Mononegavirales Orthomyxoviridae Ihogotovirus Virus Thogoto Mononegavirales Bunyaviridae Bunyavirus virus Bunyamwera Mononegavirales Bunyaviridae Hantavirus Virus Hantaan Mononegavirales Bunyaviridae Nairovirus Virus da doença ovina de Nairobi 35 (continuação)

Ordem Família Subfamília Género Espécie Tipo Mononegavirales Bunyaviridae Phlebovirus Vírus Siciliano da febre de Flebótomos Mononegavirales Bunyaviridae Tospovirus Vírus do bronzeamento do tomateiro Mononegavirales Bunyaviridae Tenuivirus Virus do descame do arroz Mononegavirales Bunyaviridae Ophiovirus Vírus da Psorosis dos Citrinos Mononegavirales Arenaviridae Arenavirus Vírus da Coriomeningite Linfocítico Mononegavirales Arenaviridae Deltavirus Vírus da Hepatite Delta A presente invenção é ainda baseada, em parte, no desenvolvimento de uma construção de transcrição bidireccional que contém ADNc virai codificando PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M ou NS flanqueados por um promotor da polimerase de ARN I (pol I) para a síntese de ARNv e um promotor de polimerase de ARN II (pol II) para a síntese de ARNm virai. A utilidade desta abordagem é demonstrada pela criação de vírus após transfectar a construção pol I/pol II-promotor-PBl juntamente com ARNv- e construções de proteína-expressão para os restantes sete segmentos. Dado que esta abordagem reduz o número de plasmídeos necessários para a criação de vírus, também reduz o trabalho necessário para clonagem, aumenta a eficiência da criação de vírus e expande a utilização do sistema de genética reversa para linhas celulares para o qual a cotransfecção eficiente de 17 plasmídeos não pode ser alcançada. É também descrita uma construção de transcrição unidirecional compreendendo promotores de pol I e de pol II colocados a montante de uma sequência codificante de ADNc virai. Ambos os promotores estão numa orientação comum a montante-para-a jusante em relação ao gene. 36

Embora o sistema bidireccional produza um título virai de influenza A superior, o sistema unidireccional é útil para outras aplicações (e. g., produção de outras estirpes virais de cadeia negativa).

Um promotor, terminação ou sinal de poliadenilação está "a montante" de um gene se estiver próximo do início do gene (e. g., o primeiro codão) e distai à extremidade do gene (e. g., o codão de terminação). Um promotor, terminação ou sinal de poliadenilação está "a jusante" de um gene se estiver próximo da extremidade do gene e distai ao início do gene. Os promotores nos plasmídeos da invenção, que estão funcionalmente associados com um gene, estão orientados de modo a promover a transcrição de uma cadeia de sentido ou anti-sentido do gene.

Como aqui utilizado "plasmídeo de expressão", é um vector de ADN compreendendo uma "unidade de transcrição interna" e uma "unidade de transcrição externa". Como discutido acima, os plasmídeos de expressão podem ser utilizados para criar qualquer tipo de vírus de ARN, de um modo preferido, vírus de ARN de cadeia positiva negativa, vírus de ARN de genoma segmentados ou não segmentados ou vírus de ARN de cadeia dupla. A unidade de transcrição externa compreende um promotor, de um modo preferido, um promotor de pol II, que dirige a transcrição, a partir de um ADNc virai, de ARNm que é traduzível. A unidade de transcrição externa pode compreender um promotor de ARN de polimerase de T7, um promotor de ARN polimerase de T3, um promotor da polimerase de ARN de SP6 ou qualquer promotor ou combinação de elementos genéticos capazes de dirigir a expressão e um produto de ARN traduzível. Por exemplo, a unidade de transcrição externa pode compreender um promotor de pol I ou de pol II se o ADNc virai, que se deve expressar a partir do 37 plasmídeo, é geneticamente construído para incluir um sinal de poliadenilação na extremidade 3' do ARN transcrito. Isto pode ser realizado inserindo um conjunto de nucleótidos A na extremidade 3' da sequência codificante de ADNc imediatamente antes do codão de terminação. Além disso, o ADNc virai pode ser geneticamente construído para incluir um Sítio de entrada ribossómico interno (IRES) na extremidade 5' do ADNc para facilitar a iniciação da tradução a partir do ARN transcrito. Uma "unidade de transcrição interna" nos plasmídeos de expressão da invenção está localizada na unidade de transcrição externa e compreende um promotor, de um modo preferido, um promotor de pol I, que pode dirigir a transcrição de um ADNc virai que pode ser replicado pela maquinaria virai e incorporado em novos vírus. De um modo preferido, o promotor na unidade de transcrição interna transcreve o ARN que não compreende sequências em excesso, não virai estranhas, nas extremidades 5' e 3', de um modo preferido, por fusão precisa de ADNc virai com sequências do promotor e terminação de pol I. Todavia, a invenção inclui formas de realização em que a unidade de transcrição interna compreende um promotor que dirige a produção de transcritos de ARN compreendendo sequência de não vírus 5' e 3' adicionais (e. g., promotores de pol II, promotores de pol III, promotor da polimerase de ARN de T7, promotores da polimerase de ARN de T3 ou promotores da polimerase de ARN de SP6). Nestas formas de realização, as sequências adicionais podem ser incluídas no plasmídeo de expressão que assegura que o ARN que é produzido a partir da unidade de transcrição interna não inclui sequência de não vírus em excesso. Por exemplo, o plasmídeo de expressão pode ser geneticamente construídos para incluir sequências ribozimais nas extremidades dos transcritos produzidos a partir da unidade de transcrição interna em que as porções ribozimais do ARN transcrito cliva o transcrito de modo 38 a que as sequências dos terminais 5' e 3' dos ARN são criados como encontrados nos ARN dos virus. Além disso, os plasmídeos de expressão podem ser geneticamente construídos para incluir sequências de terminação que provocam a terminação de transcrição na extremidade da sequência codificante o ADNc virai prevenindo, desse modo, a incorporação de sequências não traduzíveis em excesso na extremidade 3' do ARN transcrito. De um modo preferido, um "plasmídeo de expressão" é um vector de ADN empregando o sistema pol I-pol II. Assim, um tal plasmídeo compreende sequências de um promotor da polimerase de ARN I (pol I) e de terminação de pol I, que estão inseridas entre um promotor de polimerase de ARN II (pol II) e um sinal de poliadenilação. No sistema bidireccional, um promotor da polimerase de ARN I controla a expressão de ARN não protegido de sentido negativo genómico (aqui denominado "ARNv") do ADNc que é inserido numa orientação "anti-sentido" entre o promotor e o terminador. Um promotor da polimerase de ARN II controla a expressão do ARN mensageiro; um segmento de ADNc do gene virai inserido numa orientação "de sentido" entre o promotor de pol II e o sinal de poliadenilação resulta na expressão de ARNm protegido em sentido positivo virai. No sistema unidireccional, que é aqui descrito o ADNc virai é inserido a jusante dos promotores pol I e de pol II numa orientação em sentido. 0 promotor de pol II dirige a expressão de ARNm virai protegido em sentido positivo e o promotor de pol I dirige a expressão de ARNc virai não protegido de sentido positivo.

Um plasmídeo pode compreender "essencialmente todos" os outros plasmídeos base se todos os genes e regiões não codificantes funcionais do plasmídeo base estão presentes. Por exemplo, um plasmídeo construído por mera remoção de uma porção 39 de um sítio múltiplo de ligação e a inserção de um gene estranho compreende essencialmente todos os plasmídeos base.

Um "vírus de ARN de cadeia negativa" é um vírus em que o genoma virai compreende ARN de cadeia negativa. 0 ARN de cadeia negativa é complementar ao ARNm e, geralmente, deve ser copiado para o ARNm complementar de cadeia positiva para que as proteínas sejam traduzidas. Tipicamente, estes vírus empacotam uma polimerase de ARN dependente de ARN para a produção de ARNm após infecção da célula hospedeira. As famílias de vírus de ARN de cadeia negativa incluem, mas não estão limitadas a, Orthomyxoviridae, Arenaviridae e Bunyaviridae. De um modo preferido, o genoma virai é de um vírus que é um membro da família de vírus Orthomyxoviridae e, optimamente, possui um genoma segmentado. Membros da família de vírus Orthomyxovirdae incluem, mas não estão limitados a influenza A, influenza B, influenza C, Thogotovírus, vírus do Sarampo e da Papeira (Paramyxovirus) ou vírus da Raiva (Rhabdovirus) .

Um "vírus de ARN de cadeia positiva" é um vírus compreendendo um genoma de ARN de cadeia positiva. Exemplos de vírus de ARN de cadeia positiva incluem Poliovírus (Picornavírus), Togavírus e Flavivírus. 0 ARN genómico destes vírus está no mesmo sentido que o ARNm e pode funcionar como ARNm. Estes vírus podem compreender um genoma segmentado ou não segmentado.

Um "vírus de ARN de cadeia dupla" compreende um genoma de ARN de cadeia dupla. Reovírus são vírus de ARN de cadeia dupla.

Um genoma virai também pode ser segmentado ou não segmentado (unimolecular). Um genoma segmentado compreende dois ou mais 40 ácidos nucleicos codificando cada um, um ou mais genes virais. De um modo preferido, um genoma segmentado compreende um ácido nucleico separado para cada gene virai. Orthomyxovírus (vírus Influenza A, B ou C), Bunyavírus e Arenavírus compreendem genomas de ARN segmentados. Um genoma não segmentado compreende um ácido nucleico simples compreendendo todos os genes virais. Vírus Mononegavirales, Rhabdovírus, vírus Flaviviridae, vírus Picornaviridae, vírus Coronaviridea, vírus Togaviridae e

Paramyxovírus compreendem um genoma de ARN não segmentado. 0 ARN de cadeia dupla pode ser abreviado como "dsARN". 0 ARN de cadeia simples pode ser abreviado como "ssARN." 0 ARN simples, de cadeia negativa pode ser abreviado como "-ssARN". 0 ARN simples, de cadeia positiva pode ser abreviado como " + SSARN."

Um "segmento de gene virai" é, de um modo preferido, um ADNc clonado correspondendo a uma molécula de ARN genómico de um genoma de vírus de ARN. Este termo pode também incluir qualquer gene ou segmento de gene (e. g., um produto de PCR ou fragmento de restrição) compreendendo um gene derivado de um vírus de ARN.

Um "sistema com base em plasmídeo mínimo" é um sistema em que há um plasmídeo de expressão, como definido acima, contendo cada um, um segmento genómico virai autónomo a partir de um vírus de ARN. Assim, o número total de plasmídeos que contêm sequências genómicas virais não excederá o número total de segmentos de gene a partir da fonte de vírus de ARN. A invenção inclui formas de realização em que outros plasmídeos que não contêm sequências virais, podem ser opcionalmente co-transfectados para as células hospedeiras. Isto proporciona vantagens significativas, limitando o número total de plasmídeos 41 necessários para estabelecer o sistema numa célula hospedeira, eliminando a necessidade de virus auxiliares, eliminando a necessidade para um processo de selecção e permitindo a criação eficiente de virus de reorganização.

Certos genes virais num sistema com base em plasmídeo mínimo da invenção podem ser desde uma estirpe virai bem adaptada ao crescimento em cultura de células, tal como a estripe PR/8/34 (H1N1) ou WSN/33 (H1N1), ou a partir de uma estirpe atenuada, tal como A/Ann Arbor/6/60 (H2N2), ou para influenza B/Ann Arbor/1/66. De um modo preferido, uma estirpe atenuada está também bem adaptada ao crescimento em cultura de células. Em particular, para influenza A, segmentos de gene virai preferidos no sistema à base de plasmídeos codificam proteínas do complexo da polimerase virai, proteínas M, e/ou proteínas NS a partir de uma estirpe bem adaptada para o crescimento em cultura de células ou a partir de uma estirpe atenuada, ou ambas. Estas proteínas são aqui denominadas "proteínas internas virais" ou "não glicoproteína" virai. 0 genoma do vírus influenza A codifica, tipicamente, 10 proteínas diferentes: PB2, que se crê ser uma transcritase, PB1, que se crê ser uma transcritase, PA que se crê ser uma transcritase, HA que se crê ser uma hemeaglut inina, NP que se crê ser uma nucleoproteína de ligação ao ARN, NA que se crê ser uma neuraminidase, M1/M2 que se crê ser uma proteína de matriz e uma proteína de membrana integral, respectivamente e NS1/NS2 que se crê serem proteínas não estruturais que podem afectar o processamento do ARN e o transporte. Crê-se que PB1, PB2, NP e PA sejam parte de um complexo de polimerase de transcrição de vírus influenza. 42 0 termo "cultura de células", como aqui utilizado, de um modo preferido, refere-se a um método comercialmente aceitável para propagar vírus para a produção de vacinas, e. g., ovos de galinha embrionados, assim, como para a cultura de células in vitro numa célula hospedeira (ver Furminger, In: Nicholson, Webster e May (eds.), Textbook of Influenza, Capítulo 24, pp. 324-332, particularmente pp. 328-329).

De um modo semelhante, o sistema à base de plasmídeos irá incorporar segmentos de gene para antigénios necessários para produzir uma resposta imunológica protectora. Uma "resposta imunológica protectora" compreende um componente humoral (anticorpo) ou celular, ou ambos, eficazes para eliminar viriões e células infectadas num indivíduo imunizado (vacinado). Assim, uma resposta imunitária protectora pode prevenir ou resolver uma infecção com vírus de ARN, e. g., vírus influenza. De um modo preferido, os antigénios são "antigénios de superfície", i. e., expressos na superfície do virião ou na superfície de células infectadas. De um modo mais preferido, os antigénios de superfície são glicoproteínas. Para influenza, os antigénios de glicoproteína primários são hemaglutinina (HA ou H) e neuraminidase (NA ou N).

Como aqui utilizado, o termo "imunogénico" significa que o polipéptido é capaz de induzir uma resposta imunitária humoral ou celular e, de um modo preferido, ambas. Uma entidade imunogénica é também antigénica. Uma composição imunogénica é uma composição que origina uma resposta imunitária humoral ou celular, ou ambas, quando administrada a um animal. Uma molécula é "antigénica" quando é capaz de interagir especificamente com uma molécula de reconhecimento de antigénio do sistema imunitário, tal como uma imunoglobulina (anticorpo) ou receptor 43 de antigénio de células T. Um polipéptido antigénico contém um epitopo de, pelo menos, cerca de cinco e, de um modo preferido, pelo menos, cerca de 10, aminoácidos. Uma porção antigénica de um polipéptido, também aqui denominada de epitopo, pode ser aquela porção que é imunodominante para o reconhecimento pelo anticorpo ou por receptor de células T, ou pode ser uma porção utilizada para criar um anticorpo contra uma molécula conjugando a porção antigénica com um polipéptido transportador para imunização. Uma molécula que é antigénica não precisa de ser ela própria imunogénica, i. e., capaz de induzir uma resposta imunitária sem um veiculo. O termo "estirpe de vírus patogénico" é aqui utilizado para se referir a qualquer estirpe de vírus que é capaz de provocar doença; de um modo preferido, o vírus está na lista actual de vírus prováveis em circulação da Organização Mundial de Saúde (WHO), Centros para o Controlo e Prevenção de Doença (CDC), ou outra autoridade de saúde pública. Esses vírus podem incluir membros da família de vírus da hepatite, família de reovírus, família de orthomyxovírus, a família de paramyxovírus, a família filoviridae, a família bornaviridae, a família bunyaviridae, a família arenaviridae, família coronaviridae, família de poliovírus ou a família de rhabdovírus. A invenção proporciona vantajosamente a inserção de genes para os antigénios primários de cada estirpe num sistema à base de plasmídeos, em que os genes virais restantes possuem a cultura desejada e/ou características de atenuação, proporcionando, assim, a produção de quantidades de vírus do fundo antigénico apropriado para a produção de vacinas. Por exemplo, os genes de paramyxovírus, vírus parainffuenza 3 humano (gene nucleocápside, gene de fosfoproteína, gene de matriz, gene de fusão, gene da proteína hemaglutinina-neuraminidase e gene grande), podem ser colocado 44 convenientemente nos plasmídeos da invenção para a produção de viriões de virus parainfluenza 3.

Assim, um virus de "reorganização" preferido, da invenção é um vírus em que os segmentos de gene codificando proteínas antigénicas de uma estirpe de vírus patogénico são combinados com os segmentos de gene que codificam o complexo de polimerase virai ou outros genes semelhantes (e. g., genes de não glicoproteína, incluindo genes M e genes NS) de vírus adaptados para crescimento em cultura (ou vírus atenuados). 0 vírus de reorganização que comportam as características antigénicas desejadas num fundo que permite a produção eficiente numa célula hospedeira, como descrito acima. Um tal vírus de reorganização é um "vírus semente" desejável para a produção de viriões para produzir vacina (ver Furminger, supra). 0 termo "célula hospedeira" significa qualquer célula de qualquer organismo que é seleccionado, modificado, transformado, cultivado, ou utilizado ou manipulado de qualquer modo, para a produção de viriões de ARN recombinantes, de um modo preferido, viriões de ARN segmentados de cadeia negativa, pela célula. Células hospedeiras exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, células de Rim Canino Madin-Darby (MDCK), células VERO, células CV1, células COS-1 e COS-7 e células BHK-1, por exemplo e não a título de limitação. Numa forma de realização específica, uma co-cultura transiente é preferida para produzir viriões. A co-cultura permite a transfecção eficiente de uma célula receptiva, tal como uma célula 293T, com infecção subsequente de uma célula permissiva para crescimento virai, tal como uma célula MDCK. 45 0 termo "viriões de vírus de ARN" refere-se às partículas virais, que quando primeiro produzidas são totalmente infecciosas, de células hospedeiras transfectadas ou co-transfectadas com um sistema à base de plasmídeos da invenção. Um tal sistema produz ARNv e proteínas virais (a partir da tradução de ARNm virai), resultando na montagem de partículas virais infecciosas (viriões).

Como aqui utilizado, uma "vacina específica para vírus de ARN" é uma composição que pode induzir imunidade protectora contra um vírus de ARN quando administrado a um indivíduo. 0 termo "vacina" refere-se a uma composição contendo vírus, vírus inactivados, vírus atenuados, vírus de separação ou proteína virai, i. e., um antigénio de superfície, que podem ser utilizados para induzir imunidade protectora num recipiente (ver Furminger, supra) . Pode ser observado que, para ser eficaz, uma vacina da invenção pode induzir imunidade numa porção da população, na medida em que alguns indivíduos podem não conseguir estruturar uma resposta imunitária robusta ou protectora, ou, em alguns casos, qualquer resposta imunitária. Esta incapacidade pode ter origem a partir do fundo genético individual ou devido a um estado de imunodeficiência (seja adquirida ou congénita) ou imunossupressão (e. g., tratamento com fármacos imunossupressores para prevenir a rejeição de órgão ou suprimir um estado autoimunitário). A eficácia pode ser estabelecida em modelos animais.

Uma "dose protectora" de uma vacina é uma quantidade, isolada ou em conjunção com um adjuvante, eficaz para induzir uma resposta imunitária protectora num indivíduo recipiente. A protecção também pode depender da via de administração, e. g., 46 intramuscular (preferida para uma vacina inactivada) ou intranasal (preferida para vacinas atenuadas). 0 termo "indivíduo", como aqui utilizado, refere-se a um animal que suporta uma infecção por vírus de ARN, incluindo, mas não limitado a, aves aquáticas, galinhas, porcos e humanos. Em particular, o termo refere-se a um humano.

Um "adjuvante" é uma molécula ou composição que potência a resposta imunitária para um imunogénio. Um adjuvante é "aceitável para utilização num humano" quando é farmaceuticamente aceitável, como definido abaixo. Exemplos de adjuvantes são proporcionados abaixo.

Como aqui utilizado, o termo "isolado" significa que o material referenciado é removido do seu ambiente nativo, e. g., uma célula. Assim, um material biológico isolado pode estar livre de alguns ou todos os componentes celulares, i. e., componentes das células em que o material nativo ocorre naturalmente (e. g., componente citoplásmico ou de membrana). Um material será considerado isolado se estiver presente num extracto ou sobrenadante celular. No caso de moléculas de ácido nucleico, um ácido nucleico isolado inclui um produto de PCR, um ARNm isolado, um ADNc ou um fragmento de restrição. Noutra forma de realização, um ácido nucleico isolado é, de um modo preferido, excisado do cromossoma em que pode ser encontrado e, de um modo mais preferido, já não é unido ou está próximo a regiões não codificantes (mas pode ser unido às suas regiões nativas reguladoras ou porções destas), ou de outros genes, localizados a montante ou a jusante do gene contido pela molécula de ácido nucleico isolado quando se encontra no cromossoma. Ainda noutra forma de realização, o ácido nucleico 47 isolado não tem um ou mais intrões. As moléculas de ácido nucleico isolado incluem sequências inseridas nos plasmídeos, cosmideos, cromossomas artificiais e semelhantes, i. e., quando forma uma parte de uma construção de ácido nucleico quimérica recombinante. Assim, numa forma de realização específica, um ácido nucleico recombinante é um ácido nucleico isolado. Uma proteína isolada pode ser associada a outras proteínas ou ácidos nucleicos, ou ambos, com os quais se associa na célula, ou com membranas celulares se for uma proteína associada à membrana. Um organelo, célula, ou tecido isolado é removido do sítio anatómico em que se encontra num organismo. Um material isolado pode ser, mas não tem que ser, purificado. 0 termo "purificado", como aqui utilizado, refere-se a material que foi isolado em condições que reduzem ou eliminam a presença de materiais não relacionados, i. e., contaminantes, incluindo materiais nativos a partir dos quais o material é obtido. Por exemplo, um virião purificado é, de um modo preferido, substancialmente isento de células hospedeiras ou componentes de cultura, incluindo cultura de tecidos ou proteínas do ovo, patogénicos não específicos e semelhantes. Como aqui utilizado, o termo "substancialmente isento" é utilizado operacionalmente, no contexto de testar analiticamente o material. De um modo preferido, o material purificado substancialmente isento de contaminantes está, pelo menos, 50% puro; de um modo mais preferido, pelo menos, 90% puro e, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, 99% puro. A pureza pode ser avaliada por cromatografia, electroforese em gel, imunoensaio, análise de composição, ensaio biológico e outros métodos conhecidos na técnica. 48 Métodos para purificação são bem conhecidos na técnica. As partículas virais podem ser purificadas por ultrafiltração ou ultracentrifugação, de um modo preferido, centrifugação contínua (ver Furminger, supra). São possíveis outros métodos de purificação e estão aqui contemplados. Um material purificado pode conter menos de cerca de 50%, de um modo preferido, menos do que cerca de 75% e, de um modo mais preferido, menos de cerca de 90%, dos componentes celulares, meios, proteínas, ou outros componentes não desejáveis ou impurezas (conforme o contexto requeira), com os quais foi originalmente associado. O termo "substancialmente puro" indica o grau mais elevado de pureza que pode ser alcançado utilizando técnicas de purificação convencional conhecidas na técnica.

Numa forma de realização específica, o termo "cerca de" ou "aproximadamente" significa dentro de 20%, de um modo preferido, em 10% e, de um modo mais preferido, dentro de 5% de um dado valor ou intervalo. Alternativamente, os termos logarítmicos utilizados em biologia, o termo "cerca de" pode significar dentro de uma ordem de grandeza de um dado valor e, de um modo preferido, dentro de metade de uma ordem de grandeza do valor.

Engenharia Genética de Sistemas à Base de Plasmideos

De acordo com a presente invenção podem ser empregues técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia e ADN recombinante dentro do âmbito do especialista na técnica. Essas técnicas são explicadas exaustivamente na literatura. Ver, e. g., Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição (1989) Cold Spring Harbor

Nova Iorque (aqui

Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 49 "Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I e II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acids Hybridization [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; Transcription and Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells and Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).

Estas técnicas de rotina aplicam-se à preparação de sistemas de plasmideo de pol I-pol II, isolamento de clones de ADNc de segmentos de gene virai, inserção desses ADNs em plasmídeos e transfecção de células com um plasmideo ou sistema à base de plasmídeos da invenção. Em particular, técnicas de rotina de mutagénese dirigida ou modificação genética permitem a modificação do ARN virai, de um modo preferido, genes virais de ARN de cadeia negativa segmentada, para desenvolver vírus atenuados, como apresentado abaixo; ou proteínas virais que incorporam novos epitopos, e. g., no tronco da neuraminidase; ou para criar vírus deficientes. A " amplificaçao" de AND, como aqui utilizado, descreve a utilização da reacçao da polimerase em cadeia (PCR) para aumentar a quantidade de uma sequência de ADN particular numa mistura de sequências de ADN. Para uma descrição de PCR ver

Saiki et al., Science 1988, 239:487.

Uma "molécula de ácido nucleico" refere-se à forma polimérica de éster de fosfato de ribonucleósidos (adenosina, guanosina, uridina ou citidina; "moléculas de ARN") ou desoxirribonucleósidos (desoxiadenosina, desoxiguanosina, 50 desoxitimidina, ou desoxicitidina; "moléculas de ADN"), ou quaisquer análogos fosfoéster destes, tais como fosforotioatos e tioésteres, em forma de cadeia simples ou em hélice de cadeia dupla. Uma "molécula de ADN recombinante" é uma molécula de ADN que sofreu uma manipulação biológica molecular.

Um "polinucleótido" ou "sequência de nucleótidos" é uma série de bases de nucleótidos (também denominados "nucleótidos") em ADN e ARN e significa qualquer cadeia de dois ou mais nucleótidos. Uma sequência de nucleótidos comporta, tipicamente, informação genética, incluindo a informação utilizada pela maquinaria celular para produzir proteínas.

Os polinucleótidos aqui podem ser flanqueados por sequências heterólogas, incluindo promotores, sítios de entrada de ribossoma interna (IRES; Ghattas, et al., Mol. Cell. Biol. 11:5848-5859, 1991) e outras sequências de sítio de ligação ao ribossoma, intensificadores, elementos de resposta, supressores, sequências sinal, sequências de poliadenilação, intrões, regiões não codificantes 5'- e 3'- e semelhantes. Os ácidos nucleicos podem também ser modificados através de qualquer meio conhecido na técnica. Exemplos não limitantes dessas modificações incluem metilação, "protecções" tais como protecções 5'-7-metil- G (5 ') ppp (5 ') N, substituição de um ou mais dos nucleótidos que ocorrem naturalmente, com modificações de um análogo e internucleótido. Os polinucleótidos podem conter uma ou mais unidades ligadas covalentemente adicionais, tais como, por exemplo, proteínas (e. g., nucleases, toxinas, anticorpos, péptidos sinal, poli-L-lisina, etc.), intercalados (e. g., acridina, psoralen, etc.), quelantes (e. g., metais, metais radioactivos, ferro, metais oxidativos, etc.) e alquiladores. Os polinucleótidos podem ser derivativos pela formação de uma 51 ligação metilo ou fosfotriéster de etilo ou uma alquil fosforamidato. Além disso, os polinucleótidos apresentados, podem também ser modificados com um marcador capaz de proporcionar um sinal detectável, quer directamente ou indirectamente. Marcadores exemplares incluem radioisótopos, moléculas fluorescentes, biotina e semelhantes.

Uma "sequência codificante" ou uma sequência "codificando" um produto da expressão, tal como um polipéptido, é uma sequência de nucleótidos que, quando expressa, resulta na produção desse polipéptido, i. e., a sequência de nucleótidos codifica uma sequência de aminoácidos para esse polipéptido. Uma sequência codificante para uma proteína pode incluir um codão de iniciação (normalmente ATG) e um codão de terminação. 0 termo "gene", também denominado um "gene estrutural" significa uma sequência de ADN que codifica para, ou corresponde a, uma sequência de aminoácidos particular, que compreende a totalidade ou parte de um ou mais polipéptidos e pode incluir ou não sequências de ADN reguladoras, tais como sequências de promotor, que determinam, por exemplo, as condições em que o gene é expresso.

Adicionalmente, a presente invenção permite a utilização de vários mutantes, variantes de sequência conservadoras e variantes funcionalmente conservadoras de segmentos de gene de vírus de ARN, de um modo preferido, segmentos de gene de vírus de ARN de cadeia negativa, desde que todas essas variantes retenham o efeito imunoprotector necessário. Na verdade, a invenção permite, vantajosamente, mutagénese para desenvolver estirpes virais atenuadas de um modo sistemático. 52

Os termos "mutante" e "mutação" significam qualquer alteração detectável no material genético, e. g. ADN, ou qualquer processo, mecanismo, ou resultado dessa alteração. Isto inclui as mutações genéticas, em que a estrutura (e. g. sequência de ADN) de um gene é alterado, qualquer gene ou ADN que surja de qualquer processo de mutação e qualquer produto de expressão (e. g. proteína) expressa por um gene modificado ou sequência de ADN. 0 termo "variante" pode também ser utilizado para indicar um gene modificado ou alterados, sequência de ADN, enzima, célula, etc., i. e., qualquer tipo de mutante. Podem ser introduzidas mutações através de técnicas de mutagénese aleatória, ou através de mutagénese dirigida, incluindo modificação de sequências à base de PCR. Como referido acima e discutido em detalhe abaixo, a mutagénese de um ou mais segmentos de gene individuais de um vírus de ARN (e. g., um vírus de ARN segmentado de cadeia negativa) permite o desenvolvimento de vírus atenuados, bem como a elucidação do mecanismo de atenuação. Além disso, o sistema à base de plasmídeos da invenção sobrepõe-se às desvantagens dos esforços anteriores para desenvolver vírus atenuados por mutagénese, tais como as restrições de um sistema de selecção eficiente (ver Bilsel e Kawaoka, In: Nicholson, Webster e May (eds.), Textbook of Influenza, Capítulo 32, pp. 422-434, especialmente pp. 423-425). "Variantes de sequências conservadoras" de uma sequência de polinucleótido são aquelas em que uma alteração de um ou mais nucleótidos numa dada posição do codão resulta na ausência de alteração no aminoácido codificado nessa posição. As variantes alélicas podem ser variantes dessa sequência conservadora. 53 "Variantes de função conservadora" são aquelas em que um dado resíduo de aminoácido numa proteína ou enzima foi alterado sem alterar a conformação e função global do polipéptido, incluindo, mas não limitado a, substituição de um aminoácido com um possuindo propriedades semelhantes (tais como, por exemplo, polaridade, potencial de ligação ao hidrogénio, acídico, básico, hidrofóbico, aromático e semelhantes). Algumas variações alélicas resultam em variantes funcionais-conservadoras, de modo a que uma substituição de aminoácido não afecta dramaticamente a função da proteína. De um modo semelhante, as proteínas homólogas podem ser variantes de função-conservadoras. Aminoácidos com propriedades semelhantes são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, arginina, histidina e lisina são aminoácidos hidrofílicos-básicos e podem ser intermutáveis. De um modo semelhante, a isoleucina, um aminoácido hidrofóbico, pode ser substituído por leucina, metionina ou valina. Espera-se que essas alterações tenham pouco ou nenhum efeito no peso molecular aparente ou ponto isoeléctrico da proteína ou polipéptido. Aminoácidos diferentes daqueles indicados como conservados podem diferir numa proteína ou enzima de modo a que a percentagem de semelhança da proteína ou sequência de aminoácidos entre quaisquer duas proteínas de função semelhante pode variar e pode ser, por exemplo, desde 70% até 99% como determinado de acordo com um esquema de alinhamento, tal como pelo Método de Cluster, em que a semelhança é baseada no algoritmo MEGALIGN. Uma "variante de função conservadora" também inclui um polipéptido ou enzima que possui, pelo menos, 60% de identidade de aminoácidos como determinado pelos algoritmos BLAST ou FASTA em que os parâmetros são seleccionados para produzir o maior emparelhamento entre as sequências testadas, ao longo de todo o comprimento da sequência de referência, de um modo preferido, pelo menos, 75%, de um modo muito preferido, 54 pelo menos, 85% e, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, 90% e que possui as mesmas, ou substancialmente semelhantes, propriedades ou funções que a proteína nativa ou parental ou enzima com a qual é comparada.

Como aqui utilizado, o termo "homólogo", em todas as suas formas gramaticais e variações de soletragem refere-se à relação entre proteínas que possuem uma "origem evolutiva comum", incluindo proteínas de superfamílias (e. g., a superfamília das imunoglobulinas) e proteínas homólogas de diferentes espécies (e. g., cadeia leve da miosina, etc.) (Reeck, et al., Cell 50:667, 1987). Essas proteínas (e os seus genes codificantes) possuem homologia de sequência, como reflectido pela sua semelhança de sequências, quer em termos de percentagem de semelhança ou a presença de resíduos ou motivos específicos.

Deste modo, o termo "semelhança de sequências" em todas as suas formas gramaticais refere-se ao grau de identidade ou correspondência entre as sequências de ácido nucleico ou de aminoácidos de proteínas que podem ou não partilhar uma origem evolutiva comum (ver Reeck, et ai., supra). Contudo, na utilização comum e no presente pedido, o termo "homólogos," quando modificado com um advérbio tal como "altamente", pode referir-se a semelhança de sequência e pode ou não relacionar-se com uma origem evolutiva comum.

Numa forma de realização específica, duas sequências de ADN são "substancialmente homólogas" ou "substancialmente semelhantes" quando um número suficiente de nucleótidos coincide com o comprimento definido das sequências de ADN para diferenciar as sequências de outras sequências, como determinado pelos algoritmos de comparação de sequências, tais como BLAST, 55 FASTA, DNA Strider e outros em que os parâmetros são seleccionados para dar a maior coincidência entre as sequências testadas, ao longo de todo o comprimento da sequência de referência. As sequências que são substancialmente homólogas podem ser identificadas por comparação de sequências utilizando programas de computador convencionais disponíveis em bancos de dados de sequências, ou numa experiência de hibridação de Southern sob, por exemplo, condições restringentes como definido para esse sistema particular. Estas condições restringentes são conhecidas dos especialistas da técnica e podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.I. (1989), 6.3.1-6.3.6. Um exemplo não limitante de condições restringentes de hibridação são hibridação em 6 X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45 °C., seguido por uma ou mais lavagens em 0,2X SSC, 0,1% de SDS a 50 °C., de um modo preferido, a 55 °C. e, de um modo mais preferido, a 60 °C ou 65 °C.

De modo semelhante, numa forma de realização particular, duas sequências de aminoácidos são "substancialmente homólogas" ou "substancialmente semelhantes" quando aminoácidos suficientes são idênticos ou semelhantes (funcionalmente idênticos) ao longo de um comprimento definido para diferenciar as sequências de outras sequências. De um modo preferido, as sequências semelhantes ou homólogas são identificadas por alinhamento utilizando, por exemplo, o programa "pileup" do GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Versão 7, Madison, Wisconsin) , ou qualquer dos programas acima descritos (BLAST, FASTA, etc.), as referências que se seguem relacionadas com o algoritmo BLAST são aqui incorporadas por referência: ALGORITMOS BLAST: Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990; Gish, W. & 56

States, D.J., Nature Genet. 3:266-272, 1993; Madden, T.L.,

Tatusov, R.L. & Zhang, J., Meth. Enzymol. 266:131-141, 1996;

Altschul, S.F., Madden, T.L., Scháffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Zhang, J. & Madden, T.L., Genome Res. 7:649-656, 1997;

Wootton, J.C. & Federhen, S., Comput. Chem. 17:149-163, 1993;

Hancock, J.M. & Armstrong, J.S., Comput. Appl. Biosci. 10:67-70, 1994; SISTEMAS DE AVALIAÇÃO DOS ALINHAMENTOS: Dayhoff, M.O., Schwartz, R.M. & Orcutt, B.C. (1978) "A model of evolutionary change in proteins." Em "Atlas of Protein Sequence and Structure", vol. 5, supl. 3. M.O. Dayhoff (ed.), PP· 345-352,

Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Schwartz, R.M. &

Dayhoff, M.O. (1978) "Matrices for detecting distant relationships." In "Atlas of Protein Sequence and Structure", vol. 5, supl. 3. M.O. Dayhoff (ed.), pp. 353-358, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Altschul, S.F., J. Mol. Biol. 219: 555-565, 1991; States, D.J., Gish, W., Altschul, S.F., Methods 3:66-70, 1991; Henikoff, S. & Henikoff, J.G., Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 89:10915-10919, 1992; Altschul, S.F., J. Mol. Evol. 36:290-300, 1993; ESTATÍSTICA DOS ALINHAMENTOS: Karlin, S. &

Altschul, S.F., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:2264-2268,1990; Karlin, S. & Altschul, S.F., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5877, 1993; Dembo, A., Karlin, S. & Zeitouni, O., Ann. Prob. 22:2022-2039, 1994 e Altschul, S.F. (1997) "Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments." Em "Theoretical and Computational Methods in Genome Research." (S. Suhai, ed.), pp. 1-14, Plenum, Nova Iorque.

Uma "sequência de promotor" é uma região reguladora de ADN capaz de ligar a polimerase de ARN numa célula e iniciar a transcrição de uma sequência. Com o propósito de definir a presente invenção, uma sequência de promotor que está localizada 57 a montante de um ADNc é ligada ao seu terminal 3' através de um sítio de iniciação de transcrição e estende-se a montante (direcção 5') para incluir o número de bases mínimo ou elementos necessários para iniciar a transcrição a níveis detectáveis acima do ruído de fundo. Uma sequência de promotor que está localizada a jusante de um ADNc (para expressar um ARN(-)) é ligada ao seu terminal 5' pelo seu sítio de iniciação de transcrição e estende-se a jusante (direcção 3') para incluir o número de bases mínimo ou elementos necessários para iniciar a transcrição a níveis detectáveis acima do ruído de fundo. 0 sistema bidireccional da invenção inclui ambos os promotores a montante e a jusante; o sistema unidireccional descrito inclui apenas promotores a montante. Na sequência do promotor encontra-se um sítio de iniciação de transcrição (convenientemente definido, por exemplo, por mapeamento com nuclease Sl) , assim, como domínios de ligação de proteína (sequências de consenso) responsáveis pela ligação da polimerase de ARN.

Qualquer promotor conhecido pode ser utilizado na presente invenção desde que os elementos essenciais da invenção sejam preservados. Por exemplo, promotores de pol II que podem ser utilizados para controlar a expressão de genes incluem, mas não estão limitados a, promotor do citomegalovírus (CMVj (Patente U.S. N° 5385839 e 5168062), a região do promotor precoce de SV40 (Benoist e Chambon, Nature 290:304-310, 1981), o promotor contido na repetição termina longa 3' do vírus do sarcoma de Rous (Yamamoto, et ai., Cell 22 :787-797, 1980), o promotor da cinase de timidina de herpes (Wagner, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78:1441-1445, 1981), as sequências reguladoras do gene da metalotioneína (Brinster, et ai., Nature 296:39-42, 1982); promotores da polimerase T7 de ARN; promotores da polimerase T3 de ARN; promotores polimerase SP6 de ARN e outros 58 promotores eficazes na célula hospedeira de interesse. Os promotores de pol I para a expressão de ARN não protegido são ubíquos em todos os eucariotas e incluem a polimerase de I de ARN humana (ver Molecular Cell Biology, Darnell et al., eds 1986, pp. 311, 365-6). Podem também ser utilizados na presente invenção os promotores da polimerase III de ARN.

Uma sequência codificante está "sob o controlo de", "funcionalmente associada com" ou "operacionalmente associada com" sequências de controlo de transcrição e de tradução (e. g., um promotor de pol I ou de pol II) numa célula quando a polimerase de ARN transcreve a sequência codificante em ARN, e. g. , ARNm ou ARNv.

Os termos "expresso" e "expressão" significam permitir ou causar a informação num gene ou sequência de ADN para se manifestar, por exemplo produzindo um ARN (incluindo ARNc, ARNv e ARNm de vírus) ou proteína através da activação das funções celulares envolvidas na transcrição e tradução de um gene ou sequência de ADN correspondente. Uma sequência de ADN é expressa numa ou por uma célula para formar um "produto de expressão" tal como uma proteína. 0 produto de expressão por si, e. g., a proteína resultante, pode também ser referida como sendo "expressa" pela célula. 0 termo "transfecção" significa a introdução de um ácido nucleico estranho numa célula de modo a que a célula hospedeira expresse o gene ou sequência introduzidos para produzir um polipéptido desejado, codificado pelo gene ou sequência introduzidos. 0 gene ou sequência introduzidos podem também ser chamados de gene ou sequência "clonada" ou "estranha", podem incluir sequências de regulação ou de controlo, tais como o 59 sinal, secreção ou outras início, interrupção, promotor, sequências utilizadas pela maquinaria genética da célula. 0 gene ou sequência podem incluir sequências não funcionais ou sequências sem função conhecida. Uma célula hospedeira que recebe e expressa o ADN ou ARN introduzido foi "transformada" e é um "transf ormante" ou um "clone." 0 ADN ou ARN introduzido numa célula hospedeira pode prevenir de qualquer fonte, incluindo células do mesmo género ou espécie como a célula hospedeira, ou células de um género ou espécie diferente.

Os termos "vector", "vector de clonagem" e "vector de expressão" significam o veículo pelo qual uma sequência de ADN ou de ARN (e. g. um gene estranho) pode ser introduzida numa célula hospedeira, de modo a transformar o hospedeiro e promover a expressão (e. g. transcrição e tradução) da sequência introduzida. Os plasmídeos são vectores preferidos da invenção.

Os vectores compreendem, tipicamente, o AND de um agente transmissível, em que o ADN estranho é inserido. Uma forma comum de inserir um segmento de AND em outro segmento de ADN envolve a utilização de enzimas denominadas enzimas de restrição que clivam o ADN em sítios específicos (grupos específicos de

nucleótidos) denominados sítios de restrição. Uma "cassete" refere-se a uma sequência codificante de ADN ou segmento de ADN que codifica para um produto de expressão que pode ser inserido num vector em sítios de restrição definidos. Os sítios de restrição das cassetes são concebidos para assegurar a inserção da cassete na grelha de leitura correcta. Geralmente, o AND estranho é inserido num ou mais sítios de restrição do ADN do vector e, então, é transportado pelo vector numa célula hospedeira em conjunto com o ADN vector transmissível. Um segmento ou sequência de ADN que possui ADN inserido ou 60 adicionado, tal como um vector de expressão, pode também ser denominado uma "construção de ADN". Um tipo comum de vector é um "plasmídeo" que, geralmente, é uma molécula de ADN autónoma de cadeia dupla, normalmente de origem bacteriana, que pode prontamente aceitar ADN adicional (estranho) e que pode ser rapidamente introduzido numa célula hospedeira adequada. Um vector plasmídeo contém, frequentemente, ADN codificante e ADN promotor e possui um ou mais sítios de restrição adequados para inserção de ADN estranho. 0 ADN codificante é uma sequência de ADN que codifica uma particular sequência de aminoácidos para uma proteína ou enzima particular. 0 ADN promotor é uma sequência de ADN que inicia, regula ou, de alguma forma, medeia ou controla a expressão do ADN codificante. 0 ADN do promotor e o ADN codificante podem ser do mesmo gene ou de diferentes genes e podem ser do mesmo ou de diferentes organismos. Os vectores de clonagem recombinantes incluem, frequentemente, um ou mais sistemas de replicação para clonagem ou expressão, um ou mais marcadores para selecção no hospedeiro, e. g., resistência a antibiótico e uma ou mais cassetes de expressão. 0 termo "sistema de expressão" significa uma célula hospedeira e vector compatível sob condições adequadas, e. g. para a expressão de uma proteína codificada por um ADN estranho transportado pelo vector e introduzido na célula hospedeira. 0 termo "heterólogo" refere-se a uma combinação de elementos que não ocorrem naturalmente. Por exemplo, ADN heterólogo refere-se a ADN não naturalmente localizado na célula ou no sítio do cromossoma da célula. De um modo preferido, o ADN heterólogo inclui um gene estranho à célula. Um elemento de regulação da expressão heteróloga é um elemento operacionalmente associado com um gene diferente daquele com que está 61 operacionalmente associado na natureza. No contexto da presente invenção, um gene que codifica um polipéptido compreendendo uma sequência de uma biblioteca de sequências é heterólogo ao ADN vector em que está inserido para clonagem ou expressão e é heterólogo a uma célula hospedeira contendo este vector, em que é expressa.

Como notado acima, a invenção permite a produção de vírus de reorganização utilizando genes heterólogos virais. Adicionalmente à incorporação de genes para antigénios virais na base genética de uma estirpe de vírus adaptada a crescer bem em cultura, a invenção permite a criação de espécies cruzadas reorganizadas, e. g. , um antigénio de influenza B numa base de influenza A.

Vacinas

Como acima notado, a presente invenção proporciona uma estratégia eficiente e económica para a produção de vacinas para o tratamento ou prevenção de infecções de ARN virai, de um modo preferido, infecções de vírus de ARN cadeia negativa. 0 sistema baseado no plasmídeo mínimo da invenção elimina a necessidade de selecção e proporciona o controlo próximo do virus de reorganização. Para a produção de uma vacina de influenza inactivada seis plasmídeos contendo os segmentos não glicoproteína (e. g. , PBl, PB2, PA, NP, M e NS) de uma estirpe de elevado rendimento (e. g., PR/8/34 (H1N1)) podem ser co-transfectados com dois plasmídeos de expressão contendo o ADNc de HA e NA do subtipo de vacina recomendado. Uma vez que não é necessário um vírus auxiliar, o vírus produzido é um vírus influenza com a desejada constelação de genes. Pode ser 62 utilizada uma abordagem análoga para produzir gualquer variedade de virus de reorganização de ARN inactivados, para utilização numa vacina. Os plasmídeos de expressão compreendendo segmentos de genes virais para um vírus alvo (e. g. , segmentos de não glicoproteína) pode ser co-transfectados com outros plasmídeos de expressão que codificam proteínas correspondentes a um determinado subtipo virai infeccioso (e. g., um subtipo virai que é normalmente circulante na população). 0 vírus produzido de acordo com a invenção pode ser utilizado em abordagens de vacinação tradicionais ou novas (ver Bilsel e Kawaoka, Em: Nicholson, Webster e May (eds.), Textbook of Influenza, Capítulo 32, pp. 422-434), particularmente no desenvolvimento de vacinas vivas, atenuadas (discutidas em maior detalhe infra). Em particular, a presente invenção ultrapassa as deficiências da tecnologia corrente, em relação ao desenvolvimento de vírus de reorganização com uma gama limitada de hospedeiros ou de atenuação imprevisível (id.).

Tem sido dispendido muito esforço no desenvolvimento de vacinas influenza (ver Wood e Williams, Em: Nicholson, Webstern e May (eds.), Textbook of Influenza, Capítulo 23, pp. 317-323). Embora a maior parte desta secção se refira a vacinas de influenza, o âmbito da presente invenção estende-se a todas as vacinas de vírus de ARN segmentados de cadeia negativa e particularmente a vacinas de Orthomyxoviridae.

Estão normalmente disponíveis três tipos de vacinas de influenza inactivadas: vírus completo, produto clivado e vacinas de antigénio de superfície (ver Wood, Em: Nicholson, Webster e May (eds.), Textbook of Influenza, Capítulo 25, pp. 333-345).

Porque a presente invenção permite o rápido desenvolvimento de vírus com um vírus de reorganização desejado com características 63 aceitáveis de crescimento em cultura, posiciona vantajosamente o fabricante da vacina para produzir uma quantidade suficiente de vacina para suprir as necessidades de saúde pública e assegurar a padronização, que é um importante requisito normalmente mitigado pela necessidade de produzir quantidades clinicas de vacina, normalmente num período de 8 a 9 meses (Wood, supra, p. 333) . A segurança da vacina é também uma preocupação (ver Wiselka, Em; Nicholson, Webster e May (eds.), Textbook of Influenza, Capítulo 26, pp. 346-357). Porque as vacinas da invenção permitem a produção em sistemas definidos de cultura de células, evitam patogénicos não específicos, bactérias e proteínas alergénicas que podem estar presentes em vacinas comerciais preparadas em ovos embrionados.

Os adjuvantes foram utilizados com vacinas (e. g., vacinas de influenza) (Wood e Williams, supra). 0 termo "adjuvante" refere-se a um composto ou mistura que estimula a resposta imunitária a um antigénio. Um adjuvante pode servir como um depósito de tecido que liberta lentamente o antigénio e também como um activador do sistema linfóide que estimula não especificamente a resposta imunitária (Hood, et ai., Immunology, Segunda Ed., 1984, Benjamin/Cummings: Menlo Park, Califórnia, p. 384) . Frequentemente, uma exposição primária com um antigénio isolado, na ausência de um adjuvante, falha na estimulação de uma resposta imunitária humoral ou celular. Os adjuvantes incluem, mas não estão limitados a, adjuvante completo de Freund, adjuvante incompleto de Freund, saponina, géis minerais tais como hidróxido de alumínio, substâncias activas de superfície tais como lisolecitina, polióis plurónicos, polianiões, péptidos, emulsões de óleo ou de hidrocarboneto e 64 adjuvantes humanos potencialmente úteis, tais como BCG (bacilo Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum. Um exemplo de um adjuvante sintético preferido, é QS-21. Alternativamente, ou adicionalmente, podem ser proporcionadas proteínas imunoestimuladoras, como a seguir descrito, como um adjuvante ou para aumentar a resposta imunitária a uma vacina. De um modo preferido, o adjuvante é farmaceuticamente aceitável. A frase "farmaceuticamente aceitável" refere-se a entidades moleculares e composições que são fisiologicamente toleráveis e não produzem, tipicamente, uma reacção desagradável alérgica ou semelhante, tal como distúrbio gástrico, vertigens e semelhantes, quando administrados a um humano. De um modo preferido, como aqui utilizado, o termo "farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por uma agência reguladora Federal ou um programa governamental ou uma lista na U.S. Pharmacopeia ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para utilização em animais e mais particularmente em humanos. 0 termo "veículo" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente, ou veículo com que o composto é administrado. Água estéril ou soluções salinas de solução aquosa e soluções aquosas de dextrose e glicerol são, de um modo preferido, empregues como veículos, particularmente para soluções injectáveis. Os veículos farmacêuticos adequados estão descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E.W. Martin. A eficácia da vacinação pode ser estimulada por co-administração de uma molécula imunoestimuladora (Salgaller e Lodge, J. Surg. Oncol. 1998, 68:122), tal como uma citocina, linfocina, ou quimiocina imunoestimuladora, imunopotenciadora, ou pró-inflamatória, com a vacina, particularmente com uma vacina vector. Por exemplo, citocinas ou genes de citocinas, 65 tais como interleucina IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13, factor estimulador de colónias (CSF) de granulócitos-macrófagos (GM) e outros factores estimuladores de colónias, factor inflamatório de macrófagos, ligando Flt3 (Lyman, Curr. Opin. Hematol., 5:192, 1998), assim, como podem ser utilizadas algumas moléculas chave co-estimuladoras ou seus genes (e. g., B7.1, B7.2). Estas moléculas imunoestimuladoras podem ser distribuídas sistemicamente ou localmente como proteínas ou por expressão de um vector que codifica para a expressão da molécula.

Direccionamento para Células Dendríticas. A vacinação pode ser alcançada através do direccionamento para células dendríticas (Steinman, J. Lab. Clin. Med., 128:531, 1996;

Steinman, Exp. Hematol., 24 :859, 1996; Taite et al., Leukemia, 13:653, 1999; Avigan, Blood Rev., 13:51, 1999; DiNicola et al.,

Cytokines Cell. Mol. Ther., 4:265, 1998). As células dendríticas desempenham um papel crucial na activação da imunidade dependente de células T. As células dendríticas proliferativas podem ser utilizadas para capturar antigénios proteína numa forma imunogénica in situ e, depois, apresentar estes antigénios numa forma que pode ser reconhecida e estimula as células T (ver, e. g., Steinman, Exper. Hematol. 24:859-862, 1996; Inaba, et al., J. Exp. Med., 188 :2163-73, 1998 e Pat. U.S. N°. 5 851 756). Para estimulação ex vivo, as células dendríticas são plaqueadas em placas de cultura e expostas a (pulsadas com) viriões numa quantidade suficiente e durante um período de tempo suficiente para permitir que os antigénios virais se liguem às células dendríticas. As células pulsadas podem então ser transplantadas de novo no indivíduo sujeito ao tratamento, e. g., por injecção intravenosa. De um modo preferido, as células dendríticas autólogas, 1. e., células dendríticas sao obtidas a partir do indivíduos sujeito a tratamento, 66 utilizadas, embora seja possível a de utilização células dendríticas compatíveis com MHC-Classe II, que podem ser obtidas a partir de uma dador de tipo compatível ou por engenharia genética das células dendríticas para expressar as moléculas MHC desejadas (e, de um modo preferido, suprimem a expressão de moléculas MHC indesejadas).

De um modo preferido, as células dendríticas são especificamente visadas in vivo para a incorporação de vírus ou subunidades virais. Estão disponíveis várias estratégias para atingir células dendríticas in vivo aproveitando a vantagem de receptores que medeiam a apresentação de antigénios, tais como DEC-205 (Swiggard et al., Cell. Immunol., 165:302-11, 1995; Steinman, Exp. Hematol., 24 :859, 1996) e receptores Fc.

Vacinas Inactivadas

As vacinas de vírus inactivados estão bem estabelecidas para vacinação contra infecção de ARN virai (e. g, influenza) (ver Nichol, In: Nicholson, Webster e May (eds.), Textbook of Influenza, Capítulo 27, pp. 358-372). Para preparar vírus inactivados, o vírus transfectado é cultivado em cultura de células ou em ovos embrionados. Os vírus podem ser inactivados por tratamento com formaldeído, beta-propiolactona, éter, éter com detergente (tal como Tween-80), brometo de cetiltrimetilamónio (CTAB) e Triton N101, desoxicolato de sódio e fosfato de tri(n-butilo) (Furminger, supra; Wood e Williams, supra). A inactivação pode ocorrer após ou antes da clarificação do fluido alantóico (do vírus produzido em ovos); os viriões são isolados e purificados por centrifugação (Furminger, supra, ver p. 326). Para avaliar a potência da vacina, pode ser utilizado 67 um único teste de imunodifusão radial (SRD) (Schild et al., Buli. World Health Organ. 1975, 52 :43-50 e 223-31 Mostow et al., J. Clln. Microbiol. 1975, 2:531). A dose necessária para uma resposta imunitária satisfatória foi padronizada e é 15 de pg de HA/estirpe/dose. A vacina inactivada pode ser formulada para administração intramuscular por injecção.

Vacinas de Influenza Vivas Atenuadas

Foram desenvolvidas vacinas atenuadas de ARN virai vivas adaptadas ao frio (vacinas influenza) (ver Keitel e Piedra, Em: Nicholson, Webster e May (eds.), Textbook of Influenza, Capítulo 28, pp. 373-390; Ghendon, In: Nicholson, Webster e May (eds.),

Textbook of Influenza, Capítulo 29, pp. 391-399). A capacidade para produzir vírus influenza totalmente a partir de oito plasmídeos permite o ajuste da atenuação de uma estirpe de vacina e permite o desenvolvimento de uma estirpe de vacina optimamente adequada para qualquer população alvo (ver, Bilsel e Kawaoka, supra). Porque as estirpes influenza A/Ann Arbor/ 6/60 (H2N2), ou influenza B/Ann Arbor/1/66, são normalmente utilizadas para preparação de vacinas vivas atenuadas, inseriu-se cada um dos seis ADNc dos genes internos de influenza (PB2, PBl, PA, NP, M, NS) num plasmídeo tal como pHW2000. Dois plasmídeos contendo as glicoproteínas HA e NA de uma estirpe influenza relevante será construída e co-transfectada com os seis plasmídeos principais que codificam as proteínas de influenza não glicosiladas.

Espera-se que a modificação genética da região codificante ou não codificante dos genes internos melhora a segurança, 68 infectividade, imunogenicidade e eficácia protectora da vacina, em adição a permitir o desenvolvimento de vírus atenuados. A manipulação do gene HA pode também aumentar a segurança de uma estirpe de vacina. Por exemplo, a remoção de aminoácidos básicos encontrados no péptido de ligação das glicoproteínas H5 ou H7 do vírus influenza aviário altamente patogénico pode aumentar a segurança da vacina.

Vacinação na Mucosa. As estratégias de vacina na mucosa são particularmente eficazes para muitos vírus patogénicos, uma vez que a infecção ocorre frequentemente via mucosa. A mucosa comporta células dendríticas, que são alvos importantes para as vacinas EBNA-1 e imunoterapia. Deste modo, são contempladas as estratégias de vacinação em mucosa para vacinas de vírus inactivados e atenuados. Embora a mucosa possa ser atingida por distribuição local de uma vacina, foram empregues várias estratégias para distribuir as proteínas imunogénicas na mucosa.

Numa forma de realização específica, a vacina pode ser formulada para administração numa mistura com, ou como um conjugado ou proteína de fusão quimérica com, toxina da cólera, tal como a toxina da cólera B ou a quimera toxina da cólera A/B (Hajishengallis, J Immunol., 154:4322-32, 1995; Jobling e Holmes, Infect Immun., 60:4915-24, 1992). As vacinas de mucosa baseadas na utilização da subunidade da toxina da cólera B têm sido descritas (Lebens e Holmgren, Dev Blol Stand 82:215-27, 1994) . Em outra forma de realização, pode ser preparada uma mistura com enterotoxina lábil ao calor (LT) para vacinação em mucosa. 69

Outras estratégias de imunização de mucosa incluem a encapsulação do vírus em microcápsulas (Patentes U.S. N° 5075109, N° 5820883 e N° 5853763) e utilizando um veículo membranoso imunopotenciador (documento WO 98/0558). A imunogenicidade de imunogénios administrados oralmente podem ser estimulada utilizando glóbulos vermelhos do sangue (rbc) ou rbc fantasmas (Patente U.S. N° 5643577), ou utilizando o antigénio da língua azul (Patente U.S. N° 5690938).

EXEMPLOS A presente invenção será melhor compreendida por referência aos exemplos que se seguem, que ilustram a invenção sem a limitarem. EXEMPLO 1: Abordagem "Ambisentido" para a produção de virus influenza A: síntese de ARNv e ARNm a partir de um molde

Como um primeiro passo para a redução do número de plasmídeos, este Exemplo reporta a construção e transfecção de plasmídeos contendo ambos pol I e promotor de pol II no mesmo plasmídeo e apresenta evidência de que este sistema permite a expressão de ARNv e proteína a partir de um molde. Este Exemplo foi publicado (Hoffmann et ai., Virology 2000,267:310).

Materiais e Métodos

Clonagem de plasmídeos. Todas as clonagens e reacçoes de PCR foram efectuadas de acordo com protocolos convencionais. 70

Resumidamente, os plasmídeos de expressão para os genes do complexo de polimerase de A/WSN/33 foram derivados de pcDNA3 (Invitrogen) contendo o promotor imediato precoce do citomegalovirus humano (CMV) e o sitio poli A do gene gue codifica a hormona bovina do crescimento (BGH). Os ADNc virais foram derivados dos plasmídeos pWNP143, pWSNPA3, pWSNPB2-14, pGW-PBl para produzir as construções de expressão pHW25-NP, pHW23-PA, pHW21-PB2, pHW22-PBl. 0 pHW12 foi produzido pela inserção do promotor de pol I humano e as seguências de terminação entre o promotor de pol II e o sítio poliA. 0 plasmídeo pHW52 foi derivado de pHW12, primeiro, por inserção de oligonucleótidos contendo a região não codificante de PB1 estendida pelos sítios HindiII e Xhol e, depois, inserindo a região codificante de PB1 de pHW22-PBl nestes sítios. 0 plasmídeo pHW82-PBl foi derivado de pHW52-PBl por deleção das sequências do promotor de CMV. A região codificante para a proteína verde fluorescente estimulada (EGFP) na construção repórter pHW72-EGFP foi obtida após amplificação por PCR utilizando pEGFP-Nl (Clontech) como molde e inserindo o ADNc após digestão com SacII/Xhol, no plasmídeo pHW72 contendo o promotor de pol I humano e terminação de murino e a região não codificante do segmento M separado pelos sítios SacII/Xhol. pHWl27-M e pHW12 8-NS foram construídos por amplificação por RT-PCR de ARN virai com os iniciadores contendo sequências específicas do segmento e sítios BsmBI para a inserção nos

vectores pHH21 digeridos com BsmBI (E. Hoffmann, Tese de Doutoramento. 1997, Justus Liebig University, Giessen, Alemanha; Neumann et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1999, 96: 9345). A construção dos plasmídeos pPolI-WSN-PBl; pPolI-WSN-PB2, pPolI-WSN-PA, pPolI-WSN-NP, pPolI-WSNHA, pPolI-WSN-NA, pEWSN-HA e pCAGGS-WNA15 foi descrita noutro trabalho (Neumann et al., supra). 71

Cultura de células e transfecção. As células de rim canino Madin-Darby (MDCK) foram mantidas em meio de Eagle modificado (MEM) contendo 10% de soro de bovino fetal (FBS), as células 293T de rim embrionário humano foram cultivadas em meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 10% de FBS. Foi utilizado TransIT LT-1 (Panvera, Madison, Wisconsin) de acordo com as instruções do fabricante para transfectar 1 x 106 células 293T. Foram misturadas diferentes quantidades de plasmídeos (Tabela 1) com TransIT LT-1 (2 pL de TransIT LT-1 por 1 pg de ADN) , incubados à temperatura ambiente durante 45 min e adicionados às células. Seis horas depois, a mistura de transfecção de ADN foi substituída por Opti-MEM (Gibco/BRL, Gaithersburg, Maryland) contendo 0,3% de albumina de soro bovino (BSA) e 0,01% de FBS. Quarenta e oito horas após transfecção, os sobrenadantes contendo vírus foram titulados em células MDCK.

Isolamento de ARN e RT—PCR. O ARN virai foi isolado a partir de partículas de vírus com a utilização do RNeasy-Kit (Qiagen, Valência, Califórnia) de acordo com as instruções do fabricante. Para a caracterização do vírus influenza recombinante foi utilizado o Access RT-PCR kit (Promega, Madison, Wisconsin) de acordo com o protocolo fornecido. Foram utilizados os seguintes iniciadores nas experiências de RT-PCR: Seq-PBl N° 1: 5'-AGG ATG GGA TTC CTC AAG G-3' (SEQ ID N°:l); Seq-PBl N° 2: 5'-GCT ATG GTT TCC AGA GCC CG-3 ' (SEQ ID N°:2); Bm-PBl-1: 5'-TAT TCG TCT CAG GGA GCG AAA GCA GGC A-3' (SEQ ID N°:3); Bm-PB1-2341R: 5'-ATA TCG TCT CGT ATT AGT AGA AAC AAG GCA TTT-3' (SEQ ID N°:4). As experiências de RT-PCR foram efectuadas utilizando a máquina PTC-200 DNA (MJ Research, Watertown, Massachusetts) . O programa de amplificação iniciou-se com 1 ciclo a 48 °C durante 45 min (síntese da primeira cadeia de ADNc) e 1 ciclo a 94 °C durante 2 min (inactivação da transcritase reversa de AMV e desnaturação 72 de ADNc). Estes ciclos foram seguidos por 40 ciclos a 94 °C durante 20 seg, 52 °C durante 30 s e 72 °C durante 30 s (amplificação por PCR); o programa terminou com um ciclo a 72 °C durante 5 min. Os produtos de PCR foram analisados por electroforese em gel de agarose e sequenciados com o iniciador Seq-PBl N° 1 ou Seq-PBl N° 2.

Citometria de fluxo. Quarenta e oito horas após transfecção, as células 293T foram lavadas com solução salina tamponado com fosfato (PBS), precipitadas e ressuspendidas em PBS mais 5% de FBS. A análise de citometria de fluxo foi efectuada utilizando um citómetro de fluxo FACS Calibur (Becton Dickinson) e os dados foram analisados utilizando o pacote de programas CellQuest. Para a análise de expressão de EGFP utilizou-se o comprimento de onda de emissão de 530 nm (FL1) para alcançar uma elevada sensibilidade para a detecção de fluorescência mediada por EGFP.

Resultados e Discussão

Concepção e características do vector de clonagem pHW12 contendo dois promotores eucarióticos. Os vírus influenza A são vírus segmentados que contêm moléculas de ARN com polaridade de sentido negativo. Durante o ciclo de replicação, o reconhecimento das estruturas 5' e 3' dos oito segmentos de ARNv pelas proteínas do complexo de ribonucleoproteínas (PB2, PB1, PA, NP) resulta na replicação e transcrição dos genes do vírus influenza. O facto de que os elementos de sequência terminal são altamente conservados indica que um transcrito de ARN artificial deve ter sequências que são as mesmas das extremidades 5' e 3' (Luo et al., J. Virol. 1991, 65 :2861; Flick et al., RNA 1996, 2:1046). O vector de clonagem pHW12 foi construído, permitindo a 73 inserção de sequências de interesse entre o promotor de pol I e o terminador utilizando a endonuclease de restrição BsmBI. A unidade de transcrição de pol I é flanqueada pelo promotor de pol II do citomegalovirus (CMV) e pelo sinal de poliadenilação do gene que codifica a hormona bovina de crescimento. 0 promotor de CMV, o sitio poli A e a estrutura do plasmideo são derivados do vector de clonagem pcDNA3.

Expressão da proteína PBl no sistema de transcrição bidireccional pol Ι/pol II. Para testar o sistema de transcrição de um plasmideo pol I/pol II, o ADNc do gene PBl do vírus A/WSN/33 foi inserido no vector de clonagem pHW12 para produzir o plasmideo pHW52-PB 1. Os sítios de restrição HindiII e Xho I foram inseridos nas regiões não codificantes 5' e 3' deste gene. Estas etiquetas genéticas foram incluídas para assegurar que os vírus recombinantes produzidos podiam ser identificados por RT-PCR. Esperava-se que células humanas transfectadas com este plasmideo produzissem dois tipos de ARN: ARNv de PBl sintetizado por pol I celular e um ARNm com uma estrutura 5' -protegida sintetizada pela pol II. A tradução de ARNm deve resultar na síntese da proteína PBl.

Para verificar se a proteína PBl é produzida a partir desta construção, testou-se a replicação e transcrição de um ARNv artificial através da construção dos plasmídeos de expressão pHW21-PB2, pHW23-PA e pHW25-NP, que contêm ADNc que codificam as proteínas PB2, PA e NP de A/WSN/33 sob o controlo do promotor de CMV. Para a síntese in vivo de um ARNv artificial, construiu-se o plasmideo repórter pHW72-EGFP, contendo o ADNc de EGFP flanqueado pela região não codificante do segmento M e o promotor de pol I humano e a sequência de terminação de murino.

Cinco plasmídeos (2 pg de pHW21- PB2, 2 pg de pHW52-PBl 74 (construção promotor pol I/pol II), 2 pg de pHW23-PA, 2 pg de pHW25-NP e 1 pg de pHW72-EGFP) foram transfectados em células 293T. Vinte e quatro e 48 h após transfecção, as células foram analisadas por microscopia de fluorescência. Após 24 horas foram observadas células fluorescentes. Este resultado mostra que em 24 horas as proteínas polimerase são sintetizadas numa concentração suficiente para permitir o reconhecimento das extremidades específicas do vírus influenza do EGFPARNv. Estas proteínas sintetizam ARNm que é traduzido em EGFP.

Para avaliar a eficiência deste sistema, efectuou-se a análise de citometria de fluxo para contar o número de células fluorescentes. Quarenta e oito horas após transfecção dos cinco plasmídeos, 18, 72% da população de células apresentou fluorescência. Apenas foi observado um nível de ruído de fundo de células fluorescentes (0,06%) quando o plasmídeo pHW52-PBl não foi adicionado; esta observação é consistente com os de estudos anteriores que mostram que todas as quatro proteínas do complexo RNP são necessárias para a amplificação do ARNv (Huang et al., J. Virol. 1990, 64:5669). Os resultados indicam que a transcrição do ADNc de PB1 e a concentração resultante da proteína PB1 em conjunto com as outras proteínas do complexo RNP é suficiente para iniciar um processo de transcrição/replicação virai.

Produção de vírus influenza A recombinantes. Para a produção de vírus influenza A infecciosos, é necessário que o plasmídeo pHW52-PBl proporcione não só o ARNm e proteína de PB1 mas também quantidades suficientes de PBl-ARNv, que podem ser empacotados na progenia dos vírus. Para os restantes sete ARNv, utilizaram-se plasmídeos que contêm os ADNc para os ARN de comprimento total do vírus A/WSN/33, flanqueada pelo promotor humano de 75 pol I e o terminador de murino. A transfecção destes plasmídeos deve resultar na síntese de oito ARN virais que são replicados e transcritos pelas proteínas polimerase que formam novos vRNP. Após a síntese das proteínas estruturais, os RNP serão empacotados em novas partículas de vírus.

Transfectaram-se células 293T com diferentes quantidades de plasmídeo pHW52-PBl (0, 2, 4 yg) em conjunto com os plasmídeos pPolI-WSN-PB2, pPolI-WSN-PA, pPolI-WSN-HA, pPolI-WSN-NP, pPolI-WSN-NA, pHWl27-M, pHW128-NS (1 yg cada). Os plasmídeos de expressão de proteína pHW21-PB2 (1 yg) , pHW23-PA (0,1 yg) , pHW25-NP (1 yg), pEWSN-HA (1 yg) e pCAGGS-WNAl5 (1 yg) foram co-transfectados. Os plasmídeos de expressão para a hemaglutinina (HA) e a neuraminidase (NA) foram incluídos para aumentar o rendimento de vírus transfectantes.

Quarenta e oito horas após transfecção, o sobrenadante das células 293T primárias transfectadas foi transferido para células MDCK. Em todas as experiências de transfecção em que foi adicionado o plasmídeo pHW52-PBl, 24 horas após a passagem observou-se um efeito citopático induzido por vírus. Não foi visível efeito citopático se o plasmídeo que expressa PB1 não fosse incluído na reacção de transfecção. O título de vírus foi determinado por titulação do sobrenadante das células transfectadas em células MDCK; verificou-se que o sobrenadante continha 2 x 104 - 2 x 105 pfu/mL. Esta observação mostra que após transfecção do plasmídeo PBl-pol I/pol II-promotor (em conjunto com os plasmídeos de expressão) são sintetizados ARNv de PB1 e proteína PB1 na linha de célula humana 293T a um nível suficiente para a produção de vírus influenza A infecciosos. Nas experiências de co-transfecção com plasmídeos contendo o ADNc de PB1 separado em dois plasmídeos (pHW82-PBl e pHW22-PB 1), foi 76 encontrado um título de vírus de 2 xlO4 pfu/mL; a experiência análoga utilizando os plasmídeos com sequências de PB1 do tipo selvagem (ppol I-WSN-PB1 e pHW22-PBl) resultou num título de vírus de 3 x 106 pfu/mL.

Ao contrário da construção de expressão com um promotor de pol II utilizado num estudo anterior (Neumann et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1999, 96:9345), utilizou-se o plasmídeo pHW52-PBl que contém sequências derivadas da unidade de transcrição de pol I que estão inseridas entre o promotor de CMV e o sítio de poliadenilação. A expressão do gene repórter EGFP demonstra que a expressão global da proteína PB1 neste sistema é suficiente para a formação de complexos EGFP-RNP. Embora a região pol I-promotor/terminação contenha sequências de reconhecimento para os factores de transcrição e terminação específicos de pol I (Beckmann et al., Science 1995, 270:1506; Bell et al., Science 1988, 241:1192; Kuhn et al., EMBO J. 1994, 13:416), estas proteínas de ligação ao ADN não parecem inibir a transcrição mediada por pol II. Estas observações são consistentes com a observação de que as proteínas de ligação ao ADN específicas de pol I são mais abundantes no nucléolo, o compartimento em que ocorre a transcrição do ADNr celular (Evers et al., EMBO J. 1995, 14:1248). Estes resultados indicam que após transfecção da construção pol I/pol II-promotor na célula, alguns dos plasmídeos são distribuídos no nucléolo, onde ocorre a transcrição mediada por pol I e alguns são retidos no núcleo, onde são transcritos pela polimerase II de ARN.

Porque a construção repórter pHW52-PBl continha sequências adicionais de vírus não influenza (sítios de restrição) na região não codificante antes do codão de iniciação e após o codão de terminação, interessava se estas sequências eram 77 estavelmente mantidas no segmento PB1 de ARN virai. Deste modo, isolou-se ARNv após a segunda passagem de vírus transfectante em células MDCK e efectuou-se a análise de transcrição reversa-PCR. A amplificação de ARNv com iniciadores específicos para PB1 resultou na produção de fragmentos de ADNc dos tamanhos esperados. Com o mesmo ARN virai e iniciadores, mas sem a adição de transcritase reversa, não foi obtido produto de amplificação, mostrando que o ADNc teve origem no ARN virai e não no ADN do plasmídeo existente no sobrenadante das células transfectadas. A sequenciação dos produtos de PCR revelou que ambas as sequências de sítios de restrição estavam presentes na molécula de ARN. Os resultados mostram que o sistema de transcrição pol I/pol II permite a recuperação de vírus infecciosos recombinantes e que vírus com sequências estranhas na região não codificante do gene PB1 são viáveis. Este segmento PB1 modificado é ainda replicado, transcrito e empacotado em partículas de vírus. Anteriormente, utilizando o sistema de transfecção de RNP foi alterada a região não codificante dos segmentos do vírus influenza A. Por substituição da região não codificante do gene NA com a sequência correspondente do segmento NS do influenza B transfectante foram obtidos vírus influenza (Muster et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1991, 88 :5177; Bergmann e Muster, J. Gen. Virol. 1995, 76 :3211). Este tipo de vírus com um segmento quimérico de NA apresentou um fenótipo atenuado em murganhos e murganhos protegidos contra a infecção inoculados com uma dose não letal de infecção de vírus influenza do tipo selvagem. Estes resultados mostram que a alteração genética da região não codificante de um segmento de ARN pode alterar a propriedade biológica de um vírus transfectante. Aqui, reporta-se, pela primeira vez, que mesmo 78 sequências de vírus não influenza podem ser inseridas na região não codificante do segmento PB1.

Com o sistema de transcrição pol I/pol II é agora possível modificar de forma sistemática estes elementos de sequência na região não codificante do segmento PB1 e avaliar se estas manipulações genéticas resultam em alterações nas propriedades biológicas do vírus recombinante. De facto, o menor rendimento do vírus com o segmento mutado PB1 em comparação com o vírus do tipo selvagem indica que as sequências inseridas influenciam negativamente o crescimento do vírus.

Embora o sistema com base em plasmídeo desenvolvido recentemente (Neumann et al., supra) seja altamente eficiente na produção de vírus influenza, envolve a clonagem de 14-17 plasmídeos. Neste estudo reduziu-se o número de plasmídeos para 13, necessários para a eficiente recuperação da estirpe de vírus influenza A/WSN/33. A redução no número de plasmídeos conseguidos por esta abordagem promete aumentar a eficiência de transfecção para outras linhas de células além das células 293T, permitindo, assim, a distribuição de genes a linhas de células para as quais é difícil conseguir a eficiente distribuição de 14 plasmídeos. Fodor et al. (J. Virol. 1999, 73 : 9679) foram capazes de recuperar vírus influenza após transfecção de 12 plasmídeos, mas o rendimento do vírus nesse estudo foi de apenas 1-2 partículas de vírus infecciosos por 106 células Vero transfectadas. 79 EXEMPLO 2: Construção de Vírus Influenza A Recombinantes a partir de um Sistema Baseado em Plasmídeos Mínimos

Este exemplo descreve a utilização do sistema de transfecção baseado em plasmídeo para a recuperação de vírus influenza A totalmente a partir de ADNc clonado. Ao contrário do sistema estabelecido com base em plasmídeos, este sistema para a produção de vírus influenza A emprega a construção e transfecção de apenas oito plasmídeos de expressão, cada um contendo uma cópia de um ADNc virai diferente correspondente a um segmento de genes virais. Este sistema de genética reversa reduz o número de plasmídeos necessários para a recuperação de vírus influenza A e permite a produção previsível e eficiente de vírus de reorganização.

Materiais e Métodos

Clonagem de plasmídeos. 0 plasmídeo pHW2000 (Figura 3A) foi derivado de pHW12 (Exemplo 1) . 0 vector de clonagem pHW2000 contém 225 pb do promotor humano de pol I e 33 pb da sequência de terminação de murino separadas por dois sítios BsmBI. Os elementos do promotor de pol I e terminação são flanqueados por um promotor imediato-precoce truncado do citomegalovírus humano (com início, aproximadamente, 350 pb a montante do sítio de início da transcrição como encontrado no pcDNA3, Invitrogen, Carlsband, Califórnia) e pelo sinal de poliadenilação do gene que codifica a hormona bovina de crescimento. Os oito plasmídeos contendo o ADNc do vírus A/WSN/33 (H1N1) (pHW181-PB2, pHW182-PBl, pHWl83-PA, pHWl 8 4 HA, pHW185-NP, pHW186-NA, pHWl8 7-M e pHWl8 8-NS) foram construídos pela inserção de fragmentos Apal-Sall (com ADNc virai e sequências do promotor de 80 pol I e de terminação) dos plasmídeos pPolI-WSN-PB2, pPolI-WSN-PBl, pPolI-WSNPA, pPolI-WSN-NP, pPolI-WSN-HA, pPolI-WSN-NA (Neumann et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1999, 96:9345), pHW127-M e pHW128-NS (Exemplo 1) no fragmento Apal-Sall do vector pHW2000. Os oito plasmídeos contendo o ADNc de A/Teal/HK/W312/97 (H6N1) (pHW241-PB2, pHW242-PB 1, pHW243-PA, pHW2 4 4-HA, pHW2 45-NP, pHW246-NA, pHW247-M e pHW248-NS) foram construídos por amplificação por reacção de polimerase em cadeia e transcritase reversa (RT-PCR) do ARN virai. Os iniciadores utilizados na reacção de PCR continha sequências específicas para o segmento na sua extremidade 3' e sequências dos sítios de restrição BsmBI ou BsaI na sua extremidade 5'. Após digestão dos produtos de PCR com BsmBI ou Bsal, os fragmentos foram clonados no vector pHW2000 (Figura 3A) . As sequências dos iniciadores utilizados para amplificação do genoma de A/teal/HK/W312/97 (H6N1) estão a seguir. Os iniciadores são apresentados da esquerda para a direita correspondente às extremidades 5' e 3'. Os nucleótidos específicos para influenza A estão sublinhados. NS :

Bm-NS N° 1: TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTG (SEQ ID N°:5)

Bm-NS N° 2: ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTT (SEQ ID N°:6) M;

Bm-M N° 1: TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAG (SEQ ID N°:7)

Bm-M N° 2: ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTTT (SEQ ID N°:8) 81 ΝΑ;

Bm-NAl-1: TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGTTTAACATG (SEQ ID N°:9)

Bm-NA-1413R: ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTT (SEQ ID N°:10) HA;

Bm-H6-1: TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGGAAAATG (SEQ ID N°:ll) Bm-NS N° 2: ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTT (SEQ ID N°:12) (nota; os segmentos HA e NS possuem sequência idêntica nesta parte da região não codificante) NP;

Ba-NP-1: TATTGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGGTA (SEQ ID N°:13) Ba-NP1565R: ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTATT (SEQ ID N°:14) PA;

Bm-PAl-1: TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTACTGATCC (SEQ ID N°:15) Bm-PA1-2231R: ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTACTTTTT (SEQ ID N°:16) PB1 ;

Bm-PBla-1: TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGCAAACC (SEQ ID N°:17) Bm-PB1-2341R: ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGCATTT (SEQ ID N°:18) 82 ΡΒ2 ;

Ba-PB2-1: TATTGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTCAATTATATTC (SEQ ID N°:19)

Ba-PB2-2341R: ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTCGTTTTT (SEQ ID N°:20) A reacção de RT foi efectuada com o iniciador 5'- AGCAAAAGCAGG-3’ (SEQ ID N°:21). Para assegurar que os ADNc virais derivados da amplificação por RT-PCR nos plasmídeos de expressão não possuem mutações indesejadas, os ADNc inseridos foram sequenciados. Vírus e cultura de células. Os vírus Influenza A/WSN/33 (H1N1) e A/Teal/HK/W312/97 (H6N1) foram propagados em ovos com 10 dias de idade. As células de rim canino Madin-Darby (MDCK) foram mantidas em Meio de Eagle modificado (MEM) contendo 10% de FBS. As células 293T de rim embrionário humano foram cultivadas em Opti-MEM I (Life Technologies, Gaithersburg, Maryland) contendo 5% de FBS. Para as experiências de transfecção foram utilizadas placas de cultura de tecidos de seis poços. No dia antes da transfecção, células confluentes 293T e MDCK num frasco de 75 cm2 foram tripsinizadas e 10% de cada linha de células foi misturada em 18 mL de OptiMEM I; 3 mL desta suspensão celular foi semeada num poço de uma placa de seis poços. As células MDCK e 293T co-cultivadas (0,2 - 1 x 106 células por poço cada) foram utilizadas para as experiências de transfecção. Foi utilizado TransIT LT-1 (Panvera, Madison, Wisconsin) de acordo com as instruções do fabricante para transfectar as células.

Resumidamente, foram misturados 2 pL de TransIT LT-1 por 1 pg de ADN, incubados à temperatura ambiente durante 45 min e adicionados às células. Seis horas mais tarde, a mistura de 83 transfecção de ADN foi substituída por Opti-MEM I. Trinta horas após transfecção, foi adicionado às células 1 mL de Opti-MEM I contendo TPCK-tripsina; esta adição resultou numa concentração final de TPCK-tripsina de 0,5 pg/mL no sobrenadante celular. O título de vírus do sobrenadante celular foi determinado por titulação do sobrenadante em células MDCK.

Isolamento de ARN e RT-PCR. O ARN virai foi isolado a partir de partículas de vírus com o RNeasy-Kit (Qiagen, Valência, Califórnia), que foi utilizado de acordo com as instruções do fabricante. Para caracterização do vírus influenza recombinante, foi utilizado o kit Access RT-PCR (Promega, Madison, Wisconsin) de acordo com o protocolo fornecido. Foram utilizados os seguintes iniciadores nas experiências de RT-PCR: Bm-NS N° 1 (5 ’ -TAT TCG TCT CAG GGA GCA AAA GCA GGG TG-3; SEQ ID N°:5) e Bm-NS N° 2 (5'-ATA TCG TCT CGT ATT AGT AGA AAC AAG GGT GTT TT-3;

SEQ ID N°:12). As experiências de RT-PCR foram efectuadas utilizando a máquina PTC-200 DNA (MJ Research, Watertown, Massachusetts). O programa de amplificação começou com 1 ciclo a 48 °C durante 45 min e 1 ciclo a 94 °C durante 2 min. Estes ciclos foram seguidos por 40 ciclos a 94 °C durante 20 s, 52 °C durante 30 s e 72 °C durante 40 seg; o programa terminou com um ciclo a 72 °C durante 5 min. Os produtos de PCR foram analisados por electroforese em gel de agarose e sequenciados com o iniciador Bm-NS N° 1. O Center for Biotechnology no St. Jude Children's Research Hospital determinou a sequência do ADN molde utilizando "rhodamine ou dRhodamine dye-terminação cycle sequencing ready reaction kits" com AmpliTaq® DNA polimerase FS (Perkin-Elmer, Applied Biosystems, Inc. [PE/ABI], Foster City, CA) e oligonucleótidos sintéticos. As amostras foram sujeitas a electroforese, detecção e análise em sequenciadores de ADN PE/ABI modelo 373, modelo 373 Stretch ou modelo 377. 84

Resultados

Estabelecimento do sistema pol I - pol IJ para a produção de A/WSN/33 (H1N1). Porque o genoma do vírus influenza A contém oito segmentos, foi pensado que a inserção de todos os oito ADNc de influenza A entre um promotor de pol I e um promotor de pol II deveria resultar na transcrição dos oito ARNv, todos virais nos ARN e na síntese de todas as 10 proteínas virais (Figura 1). Após montagem de todas as ribonucleoproteínas virais com as proteínas estruturais, os vírus influenza A infecciosos deverão, então, ser formados (Figura 2).

Para testar se os vírus influenza A infecciosos podem ser recuperados com este sistema de transcrição bidireccional de ADNc, os oito plasmídeos de expressão (pHW181-PB2, pHW182-PBl, pHWl83-PA, pHWl8 4-HA, pHW185-NP, pHW186-NA, pHW187-M e pHW188-NS) foram construídos contendo os oito ADNc de A/WSN/33 (H1N1) . Os oito plasmídeos (1 pg de cada plasmídeo) (Tabela 1) foram co-transfectados em células 293T-MDCK transientemente co-cultivadas. Ambas as linhas de células foram co-cultivadas num poço de cultura células no dia anterior à transfecção para assegurar condições para uma elevada eficiência de transfecção de ADN (células 293T) e para eficiência de replicação de vírus influenza A (células MDCK) . Após 48 e 72 horas, as células MDCK apresentaram um efeito citopático induzido por vírus, mas não foi observado nenhum efeito citopático após transfecção de sete plasmídeos sem a construção de expressão de PB1 (Tabela 1). O título de vírus do sobrenadante foi determinado em diferentes tempos pós-transfecção por titulação em células MDCK. Vinte e quatro horas pós-transfecção o sobrenadante celular continha 85 1 x IO3 vírus por mL; foram produzidos 2 x 107 vírus infecciosos 72 horas pós-transfecção (Tabela 1) por mL. Os vírus recuperados foram passados duas vezes em células MDCK. Para verificar que o vírus produzido foi o vírus A/WSN concebido, o ADNc foi produzido para o gene NS por RT-PCR (Figura 4A, pista 8) . A produção de dois fragmentos após digestão com a endonuclease de restrição NcoI (Figura 4B, pista 8) e a análise da sequência do fragmento amplificado confirmou que o vírus recuperado foi, de facto, o vírus A/WSN concebido. Estas observações mostram que a síntese de ARNv e ARNm conduzida por pol I e pol II a partir dos oito moldes resulta na produção de vírus influenza A infecciosos.

Tabela 1.Conjuntos de plasmídeos utilizados para a recuperação de Virus A/WSN/33 (H1N1) e A/Teal/HK/W312/97 (H6N1)

Segmento A/WSN/33 (H1N1) A/Teal/HK/W312/97 (H6N1) 1 pHW181-PB2 pHW181-PB2 pHW241-PB2 pHW241-PB2 2 — pHW182-PBl — pHW2 42-PB1 3 pHW183-PA pHW183-PA pHW2 43-PA pHW2 43-PA 4 pHW184-HA pHWl8 4-HA pHW244-HA pHW244-HA 5 pHW185-NP pHW185-NP pHW2 45-NP pHW245-NP 6 pHW186-NA pHW186-NA pHW246-NA pHW246-NA 7 pHW187-M pHW187-M pHW247-M pHW247-M 8 pHW188-NS pHW188-NS pHW248-NS PHW248-NS título de vírus§ t=24h 0 1 x 103 0 0 t=48h 0 2 x 106* 0 2 x 103 t=72h 0 2 x 107* 0 2 x 105* §0s números representam partículas de vírus infecciosos por mL do sobrenadante das células transfectadas como determinado às 24 h, 48 h e 72 h após transfecção. *Foi observado efeito citopático nas células MDCK co-cultivadas. 86

Recuperação de A/Teal/HK/W312/97 (H6N1) por co-transfecção de oito plasmideos. 0 vírus influenza A/WSN/33 (H1N1), originalmente derivado da estirpe pandémica de influenza humana de 1918 (Goto e Kawaoka, Proc. Acad. Sei. USA 1998, 95; 10224; Reid et al. , Proc. Natl . Acad. Sei. USA 1999, 96 :1651) , foi passada em cérebro de murganho e está bem adaptada para crescimento em cultura de células. Para avaliar a eficiência do sistema de oito plasmideos para a produção de um vírus a partir de ADNc clonado que não está prontamente adaptado para crescimento em cultura de células, a produção dos vírus A/Teal/HK/W312/97 (H6N1) foi tentada a partir de ADNc clonado isoladamente. Este vírus H6N1 foi isolado a partir de um pato morto durante a fuga de H5N1 em Hong Kong em 1997. A análise genética deste vírus revelou que tem sete segmentos com mais do que 97% de homologia em nucleótidos com as estirpes de vírus H5N1 patogénico. 0 ARN foi extraído a partir de fluido alantóico infectado e os ADNc amplificados por RT-PCR foram inseridos no pHW2000; esta inserção resultou em oito plasmideos de expressão (Figura 3). Setenta e duas horas após transfecção de pHW241-PB2, pHW2 42-PB1, pHW243-PA, pHW244-HA, pHW245-NP, pHW246-NA, pHW247-M e pHW248-NS (1 pg cada) em células 293T-MDCK co-cultivadas, foi observado um efeito citopático induzido por vírus em células MDCK (Tabela 1) . 0 rendimento do vírus foi 2 x 105 vírus infecciosos por mL do sobrenadante das células transfectadas. Como apresentado na Figura 4 (A e B, pista 2), a identidade dos vírus recuperados foi verificada por caracterização do segmento NS. Estes resultados ilustram que este sistema de plasmídeo exige a clonagem de apenas oito ADNc num plasmídeo vector e a transfecção dos oito plasmideos de expressão permite a recuperação de um vírus influenza A com a antigenicidade de um 87 vírus nao prontamente adaptado ao crescimento em células de mamífero.

Recuperação de vírus de reorganização influenza A. A utilidade do sistema de oito plasmídeos foi testada para a produção de vírus de reorganização. Porque este sistema de transfecção de ADN não exige nenhum sistema de selecção, a recuperação de vírus de reorganização pode ser conseguida por combinações apropriadas de plasmídeos de expressão nas reacções de transfecção. Sete plasmídeos de expressão contendo o ADNc de A/Teal/HK/W312/97 (H6N1) foram co-transfectados com um plasmídeo de expressão contendo o ADNc de A/WSN/33 (H1N1) (Tabela 2). Foram obtidos elevados rendimentos do vírus para o vírus de reorganização contendo sete segmentos do vírus de pato e o segmento M ou segmento NS do vírus WSN. Foram obtidos menores rendimentos do vírus para o vírus de reorganização NA e HA (Tabela 2). Porque foram recuperados vírus de reorganização únicos com o sistema de oito plasmídeos, o passo seguinte foi determinar se um vírus podia ser recuperado com segmentos múltiplos derivados de um vírus. Deste modo, quatro plasmídeos de expressão contendo o ADNc dos genes do complexo RNP do vírus H6N1 vírus (pHW241-PB2, pHW242-PBl, pHW243-PA e pHW245-NP) foram transfectados em conjunto com os plasmídeos pHW184-HA, pHW186-NA, pHWl8 7-M e pHW188-NS contendo o ADNc do vírus WSN (Tabela 2) . Foram recuperados 4 x 106 vírus por mL de sobrenadante celular. Como apresentado na Figura 4 (pista 10), o segmento NS amplificado do vírus de reorganização quádruplo foi clivado por NcoI; deste modo, o segmento NS é derivado do vírus WSN. Estes resultados mostram que o sistema de transfecção de oito plasmídeos permite a recuperação de vírus de reorganização únicos e quádruplos. 88

Tabela 2. Produção de vírus influenza A reorganizados entre A/Teal/HK/W312 (H6N1) e A/WSN/33 (H1N1) por transfecção de oito plasmídeos segmento* HA NA M NS HA-NA-M-NS 1 pHW241-PB2 pHW241-PB2 pHW241-PB2 pHW241-PB2 pHW241-PB2 2 pHW242—PB1 pHW242-PBl pHW242—PB1 pHW242-PBl pHW242-PBl 3 pHW2 43—PA pHW243-PA pHW243—PA pHW243-PA pHW243-PA 5 pHW2 45—NP pHW245-NP pHW2 45—NP pHW245-NP pHW245-NP 4 pHW184-HA pHW244-HA pHW2 44—HA pHW244-HA pHW184-HA 6 pHW246—NA pHW186—NA pHW246—NA pHW246-NA pHH186—NA 7 pHW2 4 7-M pHW247-M pHW187—M pHW247-M pHW187-M 8 pHW2 48-NS pHW248-NS pHW248-NS pHH188—NS pHW188—NS título dos vírus 2 x 102 2 x 103 2 x 105 2 x 107 4 x 106 * plasmídeos contendo o ADNc de A/WSN/33 (H1N1) são apresentados em negrito § Os números representam partículas de vírus infecciosos por mL de sobrenadante de células transfectadas como determinado 72 h após transfecção.

Discussão A capacidade para capturar vírus influenza A após transfecção dos oito plasmídeos de expressão contendo o ADNc de A/Teal/HK/W312/97 (H6N1) ou A/WSN/33 (H1N1) prova que o sistema de transcrição pol I-pol II proporciona quantidades suficientes de ARNv e proteínas virais para a formação de vírus infecciosos influenza A. São sintetizados dois tipos de ARNm que diferem nas suas reqiões não codificantes (Fiqura 1). 0 tipo de ARNm que codifica todas as proteínas virais é directamente transcrito pela pol II. Adicionalmente às sequências das regiões não codificantes (NCR)do vírus influenza, estes ARNm contêm sequências do promotor de pol I e regiões de terminação de murino. De modo importante, o sistema de expressão pol I-pol II desenvolvido continha apenas 33 pb das sequências de terminação de murino. Estudos anteriores utilizando os genes repórter cloranfenicol acetiltransferase (CAT) e proteína verde fluorescente (GFP) mostraram que as sequências na região de 89 terminação de 174-pb reduziam a expressão de proteína mediada por pol II (Hoffmann, E., Tese Ph.D. 1997, Justus Liebig University, Giessen, Alemanha) . É produzido um segundo tipo de ARNm após o início da replicação virai e processo de transcrição (Figura 2). Este ARNm é sintetizado pelas proteínas polimerase virais e contêm uma estrutura de protecção em 5 derivada dos ARN celulares por sequestro da protecção antes das sequências não codificantes do vírus influenza. As proteínas estruturais traduzidas de ambos os ARNm associam-se com os complexos de RNP para formar novas partículas virais. Após o aparecimento dos vírus transfectantes, as partículas de vírus produzidas podem então replicar nas células 293T e nas células MDCK co-cultivadas.

Ao contrário das abordagens discutidas nos Antecedentes da Invenção, supra, o método da presente invenção posiciona os oito ADNc em oito plasmídeos que continham as sequências do promotor de pol I de 225 pb e 33 pb das sequências de terminação. No sistema pol I - pol II, todas as 10 proteínas virais são expressas a partir de um promotor imediato-precoce truncado do citomegalovírus humano. O facto de que a expressão de todas as proteínas estruturais com o sistema dos 17 plasmídeos (Neumann et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1999, 96 :9345) e com o sistema dos 8 plasmídeos (este estudo) resultou numa maior eficiência de recuperação de vírus do que na co-transfecção de plasmídeos que expressam as proteínas do complexo RNP (Neumann et al., supra; Fodor et al., J.Virol. 1999, 73 :9679) apoia a ideia de que a produção de vírus infecciosos influenza A é estimulada proporcionando as proteínas HA, NA, Ml, M2 e NS2 precocemente após a transfecção. 90 0 ciclo de replicação virai envolve uma complexa interacção entre as proteínas virais umas com as outras e com factores celulares (Ludwig et al., Virol. Immunol. 1999, 12:175). Deste

modo, para a produção de vírus infecciosos, a síntese conduzida por plasmídeo de moléculas virais deve proporcionar concentrações óptimas de proteínas virais para a iniciação do ciclo de replicação e para a formação de partículas do tipo virai. Embora o sistema de oito plasmídeos provasse ser eficiente, pode ser possível aumentar ainda a produção de vírus. Foi demonstrado que a proporção de plasmídeos transfectados que expressam o complexo de proteínas RNP e a expressão da proteína Ml influencia a actividade de transcritase (Pleschka et al., J.Virol. 1996, 70:4188; Perez e Donis, Virology 1998, 249:52). A eficiência da formação de partículas do tipo virai também depende da concentração de proteínas virais estruturais (Mena et al., J. Virol. 1996, 70:5016; Gomez-Puertas et al., J. Gen.

Virol., 1999, 80:1635; Neumann et al., J. Virol. 2000, 74:547). A eficiência da produção de vírus infecciosos com o sistema pol I-pol II pode, deste modo, ser ainda aumentado por variação das concentrações de plasmídeo utilizadas na reacção de transfecção ou utilizando plasmídeos de expressão com diferentes promotores de pol II. Uma vez que a eficiência de excisão/ligação mediada por factores celulares influencia a capacidade do vírus influenza A replicar (Lau e Scholtissek, Virology 1995, 212:225), a utilização de linhas de células além de 293T pode aumentar o rendimento do vírus para certas estirpes de influenza A. O elevado rendimento de vírus da reorganização quádrupla (Tabela 2) é consistente com a observação de que a rápida replicação de A/WSN/33 (H1N1) em células cultivadas é mediada pelos segmentos HA, NA e M (Goto e Kawaoka, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1998, 95:10224; Schulman e Palese, J.Virol. 1977, 24:170; Yesuda et al., J.Virol. 1994, 68:8141). 91 A produção de reorganizados viáveis (Tabela 2) entre o virus aviário H6N1 e o virus humano H1N1 indica que este virus H6N1 pode adquirir segmentos de genes de um virus distantemente relacionado. A análise genética sugere que o virus H5N1 patogénico foi produzido por reorganização (Xu et al., Virology 1999, 261:15). São encontrados segmentos de genes do tipo H5N1 nos subtipos H6N1 e H9N2 (Guan et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1999, 96:9363), uma observação indicativa de que estes virus podem ter sido precursores do virus H5N1 patogénico. É provável que os eventos de reorganização que podem criar novos vírus influenza patogénicos ocorram no futuro. Contudo, a capacidade para produzir e manipular estes vírus pelo método simplificado desenvolvido neste estudo ajudará os investigadores a melhor compreender as propriedades biológicas destes novos vírus e a desenvolver vacinas eficientes para proteger uma população contra estes. A duração do período de tempo entre a emergência de uma nova estirpe patogénica e a preparação de uma vacina é uma variável crucial na eficácia de um programa de vacinação. A capacidade para produzir vírus por clonagem de apenas oito plasmídeos reduz o tempo necessário para a produção de potenciais candidatos a vacina e melhora os sistemas genéticos reversos simplificando a criação do vírus e reduzindo o custo geral de produção de uma vacina. 0 conceito de introduzir ADNc virai entre um promotor de pol I e um promotor de pol II em células eucarióticas para a recuperação de vírus é também aplicável para a produção de outros membros da família Orthomyxoviridae. Para vírus influenza B, esta estratégia exige a construção e co-transfecção de oito plasmídeos; para influenza C, sete; e para Thogotovírus, seis. A transcrição in vivo de ARNm 5' -protegido, assim, como ARNv do mesmo ADNc molde pode também simplificar o sistema com 92 base em plasmídeos para outros vírus de ARN ou mesmo facilitar o estabelecimento de sistemas pol I - pol II para vírus de outras famílias (e. g. Arenaviridae, Bunyaviridae) . EXEMPLO 3: Sistema de pol I /pol II de ARN para a produção de vírus influenza B totalmente a partir de ADNc clonado

Os vírus influenza A e B contêm, cada um, oito segmentos de ARN de cadeia simples com polaridade negativa (para revisão ver Lamb e Krug, "Orthomyxoviridae: The virus and their replication"; Em Fields (Ed.), Virology; pl353-1395). Ao contrário de influenza A, os oito segmentos de influenza B codificam 11 proteínas. Os três maiores genes codificam para os componentes da polimerase de ARN, PB1, PB2 e PA; o segmento 4 codifica a hemaglutinina. 0 segmento 5 codifica a nucleoproteína, o componente estrutural principal associado com o ARN virai, o segmento 6 codifica a neuraminidase (NA) e a proteína NB. Ambas as proteínas, NB e NA, são traduzidas a partir de grelhas de leitura sobreponiveis de um ARNm biscistrónico. 0 segmento 7 de influenza B também codifica duas proteínas: BM1 e BM2. 0 segmento mais pequeno codifica dois produtos: NS1 é traduzida a partir do ARN de comprimento total, enquanto NS2 é traduzida a partir de um ARNm processado. A construção de plasmídeos de expressão contendo o ADNc de influenza B envolve a mesma estratégia descrita para a produção do vírus influenza A A/teal/HK/W312/97 (H6N1). Primeiro, o ARN é isolado a partir de partículas de vírus obtidas a partir de fluido alantóico infectado, e. g., B/Lee/40. Com base nas sequências conservadas da região não codificante, os iniciadores para a RT-PCR são preparados e utilizados para a síntese de 93 ADNc. Na extremidade 5' estes iniciadores contêm sequências para as endonucleases de restrição BsmBI ou BsaI. A digestão dos produtos de PCR com BsmBI ou Bsa I permite a inserção no vector de clonagem pHW2000 (ou pHWll) linearizado com BsmBL. Para assegurar que os ADNc nos plasmídeos não possuem mutações indesejadas devido a erros feitos pela polimerase durante a PCR, as construções têm de ser sequenciadas. A co-transfecção de células 293T - células MDCK co-cultivadas (ou C0S-1-MDCK) e a adição de tripsina resulta na produção de virus influenza B infecciosos. Os sobrenadantes de células transfectadas são então passados para novas células MDCK. 0 titulo de virus resultante pode ser determinado por métodos convencionais, e. g., o ensaio HA e ensaio em placa. A RT-PCR efectuada com iniciadores específicos para cada segmento de genes permite a amplificação do ARN a partir do vírus influenza B recombinante. A sequenciação dos produtos confirma que os vírus produzidos são, de facto, os vírus influenza B desejados.

EXEMPLO 4: Sistema de Captura de Oito-plasmídeos para a Estirpe Principal de Vírus Influenza A

Para determinar a utilidade comercial deste sistema com base em plasmídeo para a produção de vacinas, produziu-se a estirpe principal A/PR/8/34 (H1N1), normalmente utilizada para a produção de vacina inactivada, totalmente a partir de ADNc clonados como descrito no Exemplo 2. 0 rendimento do vírus, como determinado pelo ensaio HA após passagem do vírus recombinante em ovos foi tão elevado como o rendimento virai do vírus parental do tipo selvagem. Estes resultados provam que os vírus 94 recombinantes produzidos têm as mesmas propriedades de crescimento do virus parental cultivado no ovo e indica que o método de transfecção de oito-plasmideos tem o potencial para melhorar os métodos normalmente utilizados para a produção de virus para vacina.

Materiais e Métodos Vírus e Transfecção. 0 vírus Influenza A/PR/8/34 (H1N1) foi obtido a partir do repositório de St. Jude Childrens's Research Hospital e propagado em ovos de galinha embrionados com 10 dias de idade. As células de rim canino Madin-Darby (MDCK) foram mantidas em MEM contendo 10% de FBS. As células de rim embrionário humanas 293T e células Vero foram cultivadas em Opti-MEM I (Life Technologies, Gaithersburg, MD) contendo 5% de soro de bovino fetal (FBS). Para as experiências de transfecção, foram utilizadas placas de cultura de tecidos de seis poços. As células MDCK e 293T co-cultivadas (0,21 x 106 cada de células por poço) foram utilizadas para as experiências de transfecção. O TransIT LT-1 (Panvera, Madison, WI) foi utilizado de acordo com as instruções do fabricante para transfectar as células. Resumidamente, 2 pL de TransIT LT-1 por 1 pg de ADN foram misturados, incubados à temperatura ambiente durante 45 min e adicionados às células. Seis horas depois, a mistura de ADN para transfecção foi substituída por Opti-MEM L vinte e quatro horas após transfecção, 1 mL de Opti-MEM I contendo TPCK-tripsina foi adicionado às células; esta adição resultou numa concentração final de TPCK-tripsina de 0,5 pg/mL no sobrenadante celular. O título de vírus foi determinado pela passagem do sobrenadante celular em células MDCK por ensaio em placa. 95 RT-PCR e Construção de Plasmídeos. 0 ARN virai foi extraído a partir de 200 pL de vírus contendo fluido alantóico de ovo embrionado utilizando o Kit Qiagen RNeasy Two-step RT-PCR foi empregue para amplificar cada um dos segmentos de genes virais. Resumidamente, o ARN foi transcrito em ADNc utilizando transcritase reversa de AMV (Roche Diagnostics, Alemanha) de acordo com o protocolo fornecido e depois o ADNc foi amplificado utilizando sistema Expand High Fidelity PCR (Roche Diagnostics, Alemanha). O programa de amplificação foi iniciado com 1 ciclo a 94 °C durante 2 min; seguido por 30 ciclos a 94 °C durante 20 segundos, 54 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 3 min; o programa terminou com um ciclo a 72 °C durante 5 minutos. Os iniciadores utilizados continham seguências para Bsal ou BsmBI para permitir a inserção precisa dos digeridos fragmentos de PCR no vector de clonagem pHW2000 (ver Exemplo 2).

Para clonar os genes HA, NP, NA, M, NS os fragmentos de PCR foram digeridos com BsmBI ou Bsal e ligados ao vector de clonagem pHW2000. Para clonar os genes P, foram isolados dois (PB2, PA) ou três (PB1) fragmentos, digeridos e ligados a pHW2000-BsmBI. Para assegurar que os genes estavam isentos de mutações indesejadas, os fragmentos derivados de PCR foram sequenciados. Os oito plasmídeos contendo o ADNc de comprimento total de A/PR/8/34 (H1N1) foram designados pHW191-PB2, pHWl92-PB1, pHWl93-PA, pHW194-HA, pHW195-NP, pHWl96-NA, pHW197-M e pHW198-NS. O Center for Biotechnology no St. Jude Children's Research Hospital determinou a sequência do ADN molde utilizando rodamina ou "dRhodamine dye-terminação ciclo sequencing ready reaction kits" com AmpliTaq® DNA polimerase FS (Perkin-Elmer, Applied Biosystems, Inc. [PE/ABI], Foster City, CA) e oligonucleótidos sintéticos. As amostras foram sujeitas a 96 electroforese, detecção e análise em sequenciadores de ADN PE/ABI modelo 373, modelo 373 Stretch, ou modelo 377 DNA.

RESULTADOS

Para permitir a síntese intracelular de ARNv e ARNm do tipo virai, estabeleceu-se o sistema de expressão pol I-pol II de ARN (ver Exemplo 2) . Neste sistema o ADNc virai é inserido entre o promotor humano de polimerase de ARN I (pol I) e sequências de terminação. Esta unidade de transcrição completa pol I é flanqueada por um promotor de polimerase de ARN II (pol II) e um sítio poli(A). A orientação das duas unidades de transcrição permite a síntese de ARN virai de sentido negativo e ARNm de sentido positivo a partir de um ADNc virai molde. Este sistema pol I-pol II começa com o início da transcrição das duas enzimas celulares de polimerase de ARN a partir dos seus próprios promotores, presumivelmente em diferentes compartimentos do núcleo (ver Figura 1). A transfecção de oito plasmídeos em células 293T resulta na interacção de todas as moléculas derivadas da maquinaria celular e de transcrição e tradução virai, produzindo, por último, o vírus influenza A infeccioso. Este sistema mostrou ser muito eficiente na formação do vírus influenza A/WSN/33 (H1N1) e A/ Teal/HK/W312/97 (H6N1) (Exemplo 2) .

Uma vez que a estirpe principal corrente para a produção de vacina de influenza inactivada é A/PR/8/34 (H1N1), tentou-se produzir este vírus totalmente a partir de ADNc clonado. Os ADNc que representam os oito segmentos de ARN foram inseridos no vector pHW2000. Os plasmídeos resultantes (pHW191-PB2,

PHW192-PB1, pHW193-PA, pHW194-HA, pHW195-NP, pHW196-NA, pHW197-M 97 e pHW198-NS) foram transfectados em células em co-cultura 293T-MDCK ou Vero-MDCK. Setenta e duas horas após transfecção o título de vírus foi determinado por titulação em células MDCK. 0 sobrenadante de células em co-cultura Vero-MDCK continha 1 x 104 pfu e o sobrenadante de células em co-cultura 293T-MDCK continha 2 x 106 pfu por mL. 0 rendimento elevado em células 293T-MDCK é mais provavelmente, causado pela eficiência de transfecção mais elevada das células 293T em comparação com as células Vero. Estes resultados mostram que o sistema de oito plasmídeos permite a produção de A/PR/8/34 (H1H1) a partir de ADNc clonado.

Para comparar o crescimento entre o vírus de tipo selvagem e os vírus recombinantes produzidos, ovos de galinha embrionados foram inoculados com vírus do tipo selvagem ou virus recombinante. 0 fluido alanóico foi recolhido 48 horas após infecção. 0 rendimento do vírus foi determinado pelo ensaio HA. Embora os títulos de HA difiram entre os ovos individuais, verificou-se que ambos os vírus possuíam títulos de HA entre as 5120 e 10240 unidades de hemaglutinação, indicando que ambos os vírus são isolados altamente produzidos. Deste modo, o vírus recombinante que foi produzido por transfecção de ADN possui o mesmo fenótipo de cultura robusto do isolado parental.

Discussão O sistema de oito plasmídeos da invenção evita a utilização de plasmídeos separados para a expressão de proteína (ver Antecedentes da Invenção), simplificando, deste modo, o método de produção do vírus influenza A totalmente a partir de ADNc clonado. A produção de vacinas envolve a produção de um vírus 98 que é utilizado como semente de vírus para a produção de uma vacina de vírus em ovos ou em cultura de células. A eficácia de um programa de vacinação depende da selecção de um subtipo que se assemelha de forma próxima com as estirpes patogénicas circulantes para estimular um título de anticorpo específico elevado na população vacinada, resultando em protecção eficiente. Os seis plasmídeos principais A/PR/8/34 (pHW191-PB2, PHW192-PB1, pHWl93-PA, pHW195-NP, pHW197-M e pHWl98-NS) que codificam os genes de influenza A internos podem agora ser utilizados na co-transfecção com plasmídeos que codificam as glicoproteínas HA e NA de uma estirpe normalmente circulante. A capacidade para manipular cada segmento de gene permite também avaliar que segmento(s) de genes são importantes para o crescimento com rendimento elevado do vírus reorganizado em ovos, assim, como em cultura de células. 0 facto de se ter sido capaz de produzir duas estirpes do vírus influenza de laboratório (A/WSN/33 (H1N1) e A/PR/8/34 (H1N1)) e um isolado de campo (A/Teal/HK/W312/97 (H6N1)) por co-transfecção de apenas oito plasmídeos sugere que este sistema é aplicável para o desenvolvimento de vacinas de influenza vivas atenuadas. As vacinas de vírus influenza vivos atenuados administradas intranasalmente induzem imunidade local, das mucosas, mediada por células e humoral. Os vírus reorganizados (CR) adaptados ao frio (ca) contendo os seis genes internos de influenza vivo, atenuado A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) e a hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) de vírus influenza do tipo selvagem contemporâneos parecem estar fiavelmente atenuados. Foi demonstrado que esta vacina é eficaz em crianças e jovens adultos (Keitel & Piedra In Textbook of Influenza, Nicholson et ai., eds. 1998, 373-390. Contudo, pode estar demasiado atenuada para estimular uma resposta imunitária ideal 99 em pessoas idosas, o grupo principal de 20 000 a 40 000 indivíduos nos EUA que morre a cada ano como resultado de infecção de influenza. A contribuição de cada segmento para o fenótipo atenuado não está ainda bem definida (Keitel & Piedra, supra) . Esta informação pode ser adquirida apenas pela introdução sequencial de mutações definidas como atenuantes, específicas, num vírus. Uma vez que uma análise detalhada requer o teste de um grande número de vírus manipulados, a construção e transfecção de apenas oito plasmídeos simplifica esta tarefa e reduz o tempo e custos para conseguir este objectivo. EXEMPLO COMPARATIVO 5: Sistema de transcrição unidireccional de polimerase I-polimerase II de ARN para a produção de vírus influenza A a partir de oito plasmídeos

Os Exemplos anteriores descrevem um sistema para a produção de vírus influenza A através de co-transfecção de apenas oito plasmídeos a partir dos quais são expressos o ARNv de sentido negativo e o ARNm de sentido positivo (este trabalho foi subsequentemente publicado; ver Hoffmann et al., 2000, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 97, 6108-6113). Este Exemplo descreve o estabelecimento de um diferente sistema de transcrição para a expressão de ARN do tipo virai, permitindo a síntese intracelular de ARNc não protegido de sentido positivo e ARNm 5'-protegido a partir de um molde. A co-transfecção de oito plasmídeos com promotores pol I pol II de ARN em tandem contendo o ADNc de A/WSN/33 (H1N1) resultou na produção de vírus infecciosos influenza A, embora com um menor rendimento de vírus do que com o sistema bidireccional. Esta abordagem de produzir ARNv e ARNm ou ARNc e ARNm intracelularmente a partir de um conjunto mínimo de plasmídeos é 100 útil para estabelecer ou optimizar os sistemas genéticos reversos de outros vírus de ARN.

Os resultados reportados neste Exemplo foram publicados (ver Hoffmann e Webster, J. Gen. Virol. 2000, 81:2843).

Para a produção de vírus de ARN de sentido negativo, ARNv de sentido negativo ou ARNc de sentido positivo podem servir como um molde. Para reduzir o número de plasmídeos necessários para a recuperação de vírus, pensou-se que seria possível que a pol I de ARN e pol II celulares sintetizassem ARNc e ARNm a partir de um molde. Deste modo, tentou-se desenvolver um sistema de transcrição unidireccional pol I-pol II (Figura 5). O ADNc virai é inserido na orientação de sentido positivo entre um promotor de pol I de ARN e uma sequência de terminação. Esta unidade completa de transcrição de pol I é inserida na orientação de sentido positivo entre um promotor de pol II de ARN e um sítio de poliadenilação (Figura 5) . De modo diferente, do ARNv de sentido negativo e o ARNm de sentido positivo produzidos neste sistema de transcrição bidireccional (Figura 1), esperava-se que fossem sintetizados dois tipos de ARN de sentido positivo. A partir do promotor de pol II, pode ser transcrito um ARNm com uma estrutura 5'-protecção no nucleoplasma. Este transcrito pode ser traduzido em proteína. No nucléolo, espera-se que a pol I celular sintetize o ARNc do vírus influenza de sentido positivo de comprimento total, com um grupo trifosfato na extremidade 5' (Fig. 5) . Foi construído um vector de clonagem, pHWll, que pode ser utilizado para inserção de fragmentos de ADNc arbitrários (Figura 6). Este plasmídeo contém o promotor de pol II (promotor precoce imediato do citomegalovírus humano) e o promotor pol I humano que são a montante de uma sequência de terminação de pol I e um sítio poli(A). 101

Para testar se os vírus influenza A infecciosos podem ser produzidos através da síntese de ARNc e ARNm a partir de um único molde, foram construídos oito plasmídeos. Os plasmídeos pHWl71-PB2, pHWl72-PB1, pHW173-PA, pHW174-HA, pHW175-NP, pHW176-NA, pHW177-M e pHW178-NS contêm os ADNc que representam os oito segmentos de genes da estirpe de influenza A A/WSN/33 (H1N1). Todos estes ADNc estão na orientação com sentido positivo em relação aos promotores de pol I e pol II. Os oito plasmídeos (1 pg de cada plasmídeo) foram transfectados em células 293T ou COS-1 com ou sem co-cultura com células MDCK como descrito no Exemplo 2. 0 vírus produzido no sobrenadante de células transfectadas em diferentes tempos foi determinado por ensaio em placa após passagem em células MDCK. Quarenta e oito horas após transfecção foram produzidos 2 - 5 x 103 viriões infecciosos (Tabela 3).

Setenta e duas horas após transfecção, o sobrenadante continha 4 x 104 pfu/mL após transfecção de 293T ou 2 x 104 pfu/mL após transfecção de células COS-1. 0 rendimento do vírus após 72 h pode ser aumentada por co-cultura de células 293T ou células COS-1 com células MDCK (Tabela 3). A produção de vírus prova que após transfecção dos oito plasmídeos, pol I de ARN sintetizou os oito ARNc não protegidos, de sentido positivo. As quatro proteínas virais da polimerase traduzidas a partir dos transcritos celulares sintetizados pela poli II de ARN ligaram-se aos ARNc nus do tipo virai para formar cRNP. A subunidade PBl da polimerase é importante para o reconhecimento da estrutura terminal e ligação dos ARNc do tipo virai (González & Ortín EMBO J. 1999, 18:3767; Gonzalez & Ortin, J. Virol. 1999, 73 :631; e 1999b; Li et al. , EMBO J. 1998, 17:5844). A interacção com outras proteínas polimerase iniciou o 102 ciclo de replicação-transcrição, que resultou na síntese de vRNP e ARNm virais (Toyoda et al., J. Gen. Virol. 1996, 77:2149; González et al., Nucl. Acids Res. 1996, 29 :4456). No sistema de transcrição pol I-pol II, são sintetizados dois diferentes tipos de ARNm. Um é directamente transcrito a partir do ADN de plasmídeo pela poli II de ARN e contém uma sequência de promotor de pol I de 225-nt na extremidade 5' e uma sequência de terminação de pol I na extremidade 3'. É sintetizado outro ARNm pelo complexo de proteínas polimerase virais que utilizam o ARNv como molde. A estrutura de protecção 5' deste ARNm é adquirida pelo mecanismo de sequestro da protecção em que a subunidade PB2 da polimerase captura a protecção dos ARN celulares (Ulmanen et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1981, 21 :3607). Embora ambos os tipos de ARNm difiram nas suas regiões 5' e 3' não codificante, estas contêm as mesmas grelhas de leitura aberta para todas as proteínas virais. As proteínas estruturais traduzidas em conjunto com os vRNP montam-se para criar vírus influenza A infecciosos. 103

Tabela 3. Conjunto de plasmídeos utilizados para a produção de A/WSN/33 (H1N1). Plasmídeos* Segmento de genes do virus sistema unidireccional sistema bidireccional 1 pHWl71- PB2 pHWl71- PB2 pHW171- PB2 pHW171- PB2 pHW181- PB2 pHW181- PB2 pHWl81-PB2 pHW181- PB2 2 pHWl72- PB1 pHWl72-PB1 pHWl 72-PB1 pHW172- PB1 lpHW182— PB1 pHWl82-PB1 pHW182- PB1 pHW182— PB1 3 pHWl73-PA pHWl73- PA pHWl73-PA pHWl73-PA pHW183- PA pHWl83-PA pHW183— PA pHW183- PA 4 pHW174- HA pHW174- HA pHW174- HA pHWl74— HA pHW184— HA pHW184— HA pHW184— HA pHW184- HA 5 pHW175- NP pHWl75-NP pHW175- NP pHWl75-NP pHW185- NP pHW185- NP pHW185— NP pHWl85- NP 6 pHWl76-NA pHWl76-NA pHWl76-NA pHWl76— NA pHWl86-NA pHW186- NA pHWl86— NA pHWl86-NA 7 pHWl77-M pHW177- M pHW177- M pHW177-M pHWl8 7-M pHW187- M pHWl8 7— M pHWl87-M 8 pHWl78— NS pHWl78— NS pHWl78-NS pHWl78-NS pHW188- NS pHW188- NS pHW188— NS pHW188- NS 293T COS-1 COS-1 293T 293T COS-1 COS-1 células transfectadas * 293T + MDCK + MDCK + MDCK + MDCK Transcritost ARNc e ARNm ARNv e ARNm Título do vírus (pfu/mL)s t-2 4h 0 0 0 0 5 x 102 4 x 102 1 x 103 1 x 103 t-48h 4 x 103 5 x 103 2 x 103 5 x 103 8 x 106 1 x 107 6 x 106 1 x 107 t —72h 4 x 104 2 x 105 2 x 104 4 x 105 1 x 107 2 x 108 1 x 107 3 x 108 * Os plasmídeos com as unidades de transcrição unidireccional e os plasmideos com unidades de transcrição bidireccional (Fig. 1) contêm ADNc que representam os oito segmentos de genes de A/WSN/33 (H1N1) . N° As células 293T ou COS-1 foram transfectadas sem ou com as células MDCK co—cultivadas. 'Transcritos de ARN sintetizados por pOl I ou pol II. § Titulo dos virus do sobrenadante foi determinado nos tempos indicados (24h, 48h, 72h) após transfecção por ensaio em placa em células MDCK.

Embora tenha sido provado que a produção de vírus WSN a partir de células transfectadas com oito plasmídeos com promotor em tandem era muito fiável, o vírus produzido por esta abordagem ARNc-ARNm foi menos do que pelo sistema bidireccional que produz transcritos de ARNv e ARNm (Tabela 3). Setenta e duas horas após as células 293T ou COS-1 terem sido transfectadas com os oito plasmídeos contendo o sistema de transcrição bidireccional 104 pol I-pol II (Figura 1; Exemplo 2; ver Hoffmann et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 2000, 97:6108; pHW181-PB2, pHW182-PBl, pHWl83-PA, pHWl8 4-HA, pHW185-NP, pHW186-NA, pHW187-M e pHW188-NS), o título do vírus foi 1 x 107 pfu/mL (Tabela 3). Vinte e quatro horas após a transfecção de células COS-1 ou 293T foram encontrados no sobrenadante 0,4 - 1 x 103 pfu/mL. Estes dados mostram que o sistema bidireccional de oito plasmídeos tem a mesma eficiência para a produção de vírus com cinética semelhante uma vez que o sistema multi-plasmídeo mais complicado e moroso necessita de co-transfecção de 12 ou 17 plasmídeos (Neumann et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1999, 96:9345). Não foram encontrados vírus infecciosos 24 h pós-transfecção com oito plasmídeos com promotor em tandem (Tabela 3) . Estes resultados sugerem que as diferenças no rendimento do vírus entre as abordagens ARNv-ARNm e ARNc-ARNm são devidas às diferentes polaridades dos transcritos primários de pol I. O sistema bidireccional começa com a síntese intracelular de ARNv, uma situação que se assemelha à infecção natural com influenza A em que vRNP são transportados para o núcleo e os ARNv servem inicialmente como moldes para a síntese de ARNm e ARNc. Nos sistemas unidireccionais, os cRNP são as primeiras unidades competentes de replicação que são produzidas. Para produzir ARNm, os ARNc têm de ser replicados em ARNv e os vRNP são, por último, empacotados nas partículas da progenia dos vírus (Hsu et al., J. Gen. Virol. 1987, 77:2575). Devido às reacções adicionais necessários para a produção de vRNP de cRNP, a formação de vírus no sistema unidireccional ocorre numa altura mais tardia do que a formação de vírus pelo sistema bidireccional. 105

Outras razões possíveis para as diferenças no rendimento do vírus dos dois sistemas são que elementos de sequência no ADNc diminuem a eficiência de transcrição terminando a transcrição, ou as sequências nos transcritos de ARN reduzam o nível de estado estacionário dos transcritos de pol I ou pol II. Uma menor concentração de apenas um dos oito ARNc ou ARNm do tipo virai reduz a eficiência gobal deste sistema porque todos os vRNP e proteínas estruturais têm de ser sintetizados em concentrações que são óptimas para replicação de virus e montagem de vírus. A elevada eficácia do sistema de oito plasmídeos para a produção de vírus influenza A indica que este sistema se aplica a outros ortomixovírus, e. g., vírus influenza B, vírus influenza C e Thogotovírus. Os resultados neste estudo sugerem

que o sistema ARNv-ARNm será a maneira mais eficiente para produzir estes vírus completos a partir de plasmídeos. A presente invenção permite estabelecer os sistemas com base em pol I para a produção de vírus de ARN além dos membros da

família Orthomyxoviridae, e. g., membros de Paramyxoviridae, Arenaviridae ou Bunyaviridae (Roberts, A. & Rose, J.K., Virology 1998, 247:1-6; Bridgen & Elliot, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1996, 93:15400; Lee et al., J. Virol. 2000, 74: 3470).

Diferentes dos ortomixovírus, a maioria dos vírus de ARN replica no citoplasma de células infectadas. Durante a sua evolução os ARN destes vírus não foram sujeitos a pressões de selecção encontradas no núcleo, e. g. excisão/ligação. Geralmente, os sistemas genéticos reversos para cadeias negativas não segmentadas de vírus de ARN são baseados na transcrição

intracelular de um promotor T7 como iniciado por Conzelmann e colegas para a captura de vírus da raiva (Schnell et al., EMBO J. 1994, 13:4195) . A expressão de ARN do tipo virai é conduzida 106 pela polimerase de ARN T7 proporcionada pela infecção com um vírus vaccinia recombinante ou utilizando linhas de células que expressam constitutivamente a polimerase de ARN T7. Diferentemente da transcrição de pol I, que ocorre no núcleo, transcrição pela polimerase de ARN T7 tem lugar no citoplasma. A utilização do sistema de transcrição de pol I para vírus de ARN citoplasmáticos exige que os transcritos de ARN sejam transportados para fora do núcleo. 0 transporte dos transcritos de pol I para fora do núcleo é apoiado pela detecção da produção de proteína em células contendo transcritos de pol I que tinham um sítio de entrada interno no ribossoma inserido na sua região 5' não codificante (Palmer et al. , Nucl. Acids. Res. 1993, 21:3451). Porque a informação acerca das sequências cruciais para exportação ou retenção de transcritos de pol I é limitada, a síntese de ARN de sentido negativo ou de sentido positivo podem resultar em diferentes eficiências de exportação nuclear. Adicionalmente, a exportação de um grande transcrito do tipo coronavírus produzido por pol II (possuindo mais do que 30 000 nts) a partir do núcleo (Almazán et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA 2000, 97:5516) indica que sequências específicas de ARN são cruciais para exportação em vez do comprimento de um transcrito. Os vectores de clonagem pol I-pol II que foram aqui desenvolvidos e o eficiente método de clonagem baseado na utilização das endonucleases de restrição de tipo II permitem que seja sintetizado ARN positivo e negativo, no núcleo, para a produção de vírus de ARN citoplasmático com custos razoáveis e num período de tempo razoável.

Lisboa, 30 de Janeiro de 2009 107

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Sistema com base em plasmídeo mínimo para a produção de um vírus de ARN infeccioso de cadeia negativa a partir de ADNc virai clonado compreendendo um conjunto de plasmídeos, em que cada plasmídeo compreende um ADNc virai correspondente a um segmento genómico virai autónomo inserido entre um promotor de polimerase de ARN I (pol I) e uma sequência de terminação, ADNc esse que é, deste modo, capaz de dirigir a síntese de ARNv e esse ADNc é, também, inserido entre um promotor de polimerase de ARN II (pol II) e um sinal de poliadenilação, esse ADNc é, deste modo, também capaz de dirigir a síntese de ARNm e em que o referido sistema com base em plasmídeo é um sistema de transcrição de ADNc bidireccional.
2. Sistema com base em plasmídeo da reivindicação 1, em que a referida sequência de terminação é uma sequência de terminação de polimerase de ARN I (pol I ) · 3. Sistema com base em plasmídeo da reivindicação 1, em que a referida sequência de terminação é uma sequência de ribozima. 4 . Sistema com base em plasmídeo de qualquer uma das reivindicações 1-3, em que o referido ARNv compreende uma extremidade 3 ' exacta. 5. Sistema com base em plasmídeo de qualquer uma das reivindicações 1-4, em que o referido vírus de ARN é um ortomixovírus.
6. Sistema com base em plasmídeo da reivindicação 5, em que o referido ortomixovírus é um vírus influenza A.
7. Sistema com base em plasmídeo da reivindicação 5, em que o referido ortomixovírus é um vírus influenza B.
8. Sistema com base em plasmídeo de qualquer uma das reivindicações 5-7, em que o referido segmento virai genómico codifica uma proteína seleccionada a partir do grupo consistindo num complexo de proteína polimerase virai, uma proteína M e uma proteína NS; em que o referido segmento virai genómico é de uma estirpe bem adaptada para crescer bem em cultura de células ou de uma estirpe atenuada, ou ambas.
9. Sistema com base em plasmídeo de qualquer uma das reivindicações 5-7, em que o referido segmento virai genómico compreende um gene de hemaglutinina (HA), um gene de neuramimidase (NA), ou ambos; em que os referidos genes são de um vírus influenza patogénico.
10. Sistema com base em plasmídeo da reivindicação 7, que compreende um plasmídeo seleccionado do grupo consistindo num plasmídeo compreendendo o gene PB2, um plasmídeo compreendendo o gene PB1, um plasmídeo compreendendo o gene PA, um plasmídeo compreendendo o gene HA, um plasmídeo compreendendo o gene NP, um plasmídeo compreendendo o gene NA, um plasmídeo compreendendo o gene M e um plasmídeo compreendendo o gene NS.
11. Célula hospedeira compreendendo o sistema com base em plasmídeo de qualquer uma das reivindicações 1-10. 2
12. Método para produzir vírus de ARN infeccioso de cadeia negativa, compreendendo a cultura da célula hospedeira da reivindicação 11 sob condições que permitem a produção de proteínas virais e ARNv.
13. Método da reivindicação 12, em que o referido vírus de ARN é patogénico.
14. Método de qualquer uma das reivindicações 12 ou 13, em que o referido vírus de ARN é um ortomixovírus.
15. Método da reivindicação 14, em que o referido ortomixovírus é um vírus influenza A.
16. Método da reivindicação 14, em que o referido ortomixovírus é um vírus influenza B.
17. Método para produzir uma cadeia negativa de vírus de ARN atenuado, método este que compreende: (a) mutação de um ou mais segmentos virais genómicos no sistema com base em plasmídeo de qualquer uma das reivindicações 1-10; e (b) determinação de se a cadeia negativa de vírus de ARN produzido pelo sistema com base em plasmídeo, após introdução numa célula hospedeira adequada, é atenuada.
18. Método para produzir vírus de ARN infeccioso de cadeia negativa para utilização em vacinas, compreendendo o referido método: 3 (a) a cultura de uma célula hospedeira compreendendo o sistema com base em plasmídeo de qualquer uma das reivindicações 1-10 para a produção do referido vírus; e (b) purificar o referido vírus produzido pela referida célula hospedeira.
19. Método de qualquer uma das reivindicações 17 e 18, em que o referido vírus de ARN é um ortomixovírus.
20. Método da reivindicação 19, em que o referido ortomixovírus é um vírus influenza A.
21. Método da reivindicação 19, em que o referido ortomixovírus é um vírus influenza B.
22. Método de qualquer uma das reivindicações 12-21, em que a referida célula hospedeira é seleccionada do grupo consistindo em: células de Rim Canino Madin-Darby (MDCK), células VERO, células CV1, células COS-1, células COS-7 e células BHK-1.
23. Método da reivindicação 22, em que a referida célula hospedeira é uma célula VERO.
24. Método de qualquer uma das reivindicações 12-15, 17-20 e 22-23, em que, pelo menos, um plasmídeo do sistema com base em plasmídeo compreende um segmento virai genómico da estirpe de influenza A/PR/8/34. Método de qualquer uma das reivindicações 12-15, 17-20 e 22-23, em que, pelo menos, um plasmídeo do sistema com base 4 25. em plasmídeo compreende um segmento virai genómico da estirpe de influenza A/Ann Arbor/6/60.
26. Método de qualquer uma das reivindicações 12-14, 16-19 e 21-23, em que, pelo menos, um plasmídeo do sistema com base em plasmídeo compreende um segmento virai genómico estirpe de influenza B/Ann Arbor/1/66.
27. Utilização do sistema com base em plasmídeo de qualquer uma das reivindicações 1-10 na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma infecção virai, em que a referida infecção é uma infecção de influenza. Lisboa, 30 de Janeiro de 2009 5