HU229101B1 - Dna transfection system for the generation of infectious influenza virus - Google Patents

Dna transfection system for the generation of infectious influenza virus Download PDF

Info

Publication number
HU229101B1
HU229101B1 HU0303036A HUP0303036A HU229101B1 HU 229101 B1 HU229101 B1 HU 229101B1 HU 0303036 A HU0303036 A HU 0303036A HU P0303036 A HUP0303036 A HU P0303036A HU 229101 B1 HU229101 B1 HU 229101B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
virus
plasmid
rna
viral
gene
Prior art date
Application number
HU0303036A
Other languages
English (en)
Inventor
Erich Hoffmann
Original Assignee
St Jude Childrens Res Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by St Jude Childrens Res Hospital filed Critical St Jude Childrens Res Hospital
Publication of HUP0303036A2 publication Critical patent/HUP0303036A2/hu
Publication of HUP0303036A3 publication Critical patent/HUP0303036A3/hu
Publication of HU229101B1 publication Critical patent/HU229101B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/00061—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2720/00063—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16161—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/16163—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16261—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/16263—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18611—Respirovirus, e.g. Bovine, human parainfluenza 1,3
    • C12N2760/18661—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/18663—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24261—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2770/24263—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/40—Systems of functionally co-operating vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/20—Vector systems having a special element relevant for transcription transcription of more than one cistron
    • C12N2830/205—Vector systems having a special element relevant for transcription transcription of more than one cistron bidirectional
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/34—Vector systems having a special element relevant for transcription being a transcription initiation element
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/36—Vector systems having a special element relevant for transcription being a transcription termination element
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

BNS TRANSZFEKCIÖS RENDSZER FERTŐZŐ INFWENZAVÖWS ELŐÁLLÍTÁSÁRA
A találmány tárgyát ntinüaálts· plazmldalapo rendszer képezi, amely hídirskcionális cDHS transzkripciós rendszer fertőző negatív szálú RNS-vLusok, előnyösen Iníhienzavlrasök kiónozott DNS-böi történő eiöáliitására. Közelebbről ez a többplazmidos poLLpöi-Π rendszer elősegíti mind rekombisáns, mind átrendezett vírusok előállítását Előnyös megvalósítási módok szerint a találmány tárgyát ayolcplaantdos pol-I~poldí rendszer képezi wfíuenzavírusok előállítására, A találmány alkalmas más negatív szálú RNS-vírnsok klónozott DHS-böl történő teljes visszanyerésére is.
Az k Ná'~v?zn.má éfeoc/á/nxe
Az RNS-vírasok genoroja kalönbőző kenDguráciéjti, lehet nnímoíekuláris vagy szegmentált; (+) vagy (-) polaritásé egyszáiú, vagy kéíszálú. Azonban a vírusoknak van- két lényeges közös tulajdonsága: (1) a genomiáiis RNS-nek hatékonyttn át keli tnásdlódnia olyan formává, amely hatékonyan alktslmazhatö «tód vírusrészecskékké történő összeszerelése és (2) virális fehérjékké hatékonyan tr&sszláUható mRNS-eknck kell szlníetízálódnínk. Általában az RNS-vintsok (kivéve a retrovlrusokat) kódolnak és/vagy headoaask. egy RRS-íllggőRNS-polimerázt az áj gsnomláiis RNS szintéziséhez (utóddá történő összeszereléshez) és snRNS-eket (virális fehérjévé történő transzláció végett). Mivel az eufeariéta gazdasejtek tipikusan nem tartalmaznak. RNS-íesaplát repHkására vágj·' polipeptidek. negatív szálú vagy kéfszálú RNS-teropíáöói történő transzlációjára szolgáló gépezetet, a geaomjukbaa ilyen mtídeinsavakát tartalmazó vírusoknak hordozniuk kell egy RNS-pölimeráz fehérjét a virális részecskében. Emiatt a negatív szál» és kétszálú RNS-vírusok depretelmzált RNS-molekuMi (amelyekben nincs RNS-poltmeráz) nem fertőzőek, Ezzel ellentétben a pozitív szálú RNS-vdrusok genorojábói származó deprnteinizált RNS tipikusan fertőzőképes, mivel a kódolt virális fehérjék tmnszláíhaíok a geaomiális sejtes mechanizmusa: által.
Á .geaomWts virális RNS-nek virális részecskékbe keli pakoíödnia annak érdekében, hogy a viras átvihető legye». Bizonyos KNS-víras kapsziáokat a fertőzött gazdasejtekből származó lípíd membránok barkóinak be, és másoknak külső virális febérjebnrka van lípíti ketíösréteg nélkül. A virális kapsztdok ezen különbséget ellenére az a folyamat, amely által sz mód vírasrészeeskék összeszerelődnek, és az összeszerelés során lejátszódó fehérje/fehérje kölcsönhatások hasonlóak, A virális fehérjéket általában szerkezeti és nem szerkezeti fehérjeként osztályozzák. Általában a nem szerkezeti fehérjék vesznek részt a gesomiális replikációban, a trmtszkrlpclőhan és a pakolás szabályozásában. A szerkezeti fehérjék általában h<homlele fuukeiót végeznek: (!) kötődés a genomiáiis RNS-hez (azaz az Influenza A vírus nukieokapszid fehérjéje), (2) kapcsolat létrehozása a pakolt RNS és a kölső fehérjék között (azaz mátrix fehérje) és (3) külső virális réteg felépítése (azaz felszíni fehérjék, mint például hemagglntmin), Á vlmsrészecskékké történő összeszerelés biztosítja sz RNS-genom hatékony átjuttatását az egyik gazdssejtbSI egy másikba egyetlen gazdán beiül, vagy különböző gazdaorgauizmusok között.
Az Inflncnzs Λ vírus, amely egy örtonúxovírus, egy szegmentált genontú negativ-szensz RNS-víras. A genomiáiis SNS egy vagy több nyílt leolvasási fázist tartalmaz, amelyet nem kódoló szekvenciák szegélyeznek az 5* és 3’ végen (Desseibergef és mtsaí., Cfene 8, 315. old. (I9S0)j, A virális RNS-ek virális nükleoproteinhez (HP) és polímeráz fehérjékhez (PRl, PB2 és PA) kapcsolódnak a vírionokban és fertőzött sejtekben,
977Ő5-I94Ő-LT * * φ * φ φφφ φφφφ
- 2 * ribonökleoprotem-fcompfexeket (RNP) alkotva [Hsa és mtsai., Proc, Natl Acad. Sd, USA 84, .8140. old. (1987)}. A vírus genetikai kompozíciója lehetővé teszi, hogy a vírus különböző törzsekből származó génszegmentsek átrendeződésével evolváijon; ez az átrendeződés új variánsokat hoz léte, amelyek ellen az újonnan fertőzött organizmusoknak nincs emlékező immunválasza. Az influenza vizímadarak közöd keringő altípusainak 15 hemeggte&mja (HA) és 9 ncursminidáza (NA) közül három, a H INI, H2N2 és H3N2 altípusról ismert, hogy járványokat okozok emberekben [Webster és mísak, Mierobíol Rév. SS, 152. old. (1992)), Bizonyíték van arra, hogy sertések köztes gazdaként szolgálhatnak, (”mixing véssél”) olyan új törzsek létrehozására, amelyek paíogének emberekben [Sehoitissek és mtsak, Vírology 147, 287. öld. (19S5)}, A H5NI infíwsea-A járvány Hongkongban 1997-ben megmutatta, hogy az erősen patogén influenza-A vírusok szántén közvetlenül átvihetők madárfejekről emberekre (Claas és mtsai., Láncét 351, 472. old, (1998): Suarez és misek, J. Vtrok 72. $678. old, (1998); Subbarao és írásai., Science 279, 393. old. (1998); Shoríridge, Vaocine 17 (Suppl, 1), S2S-S29. old. (1999)}. Az isflueoza-A vírusok képessége, új patogén törnek létrehozására természetes reservoárban található nagyszámú keringő törzsből azt jelzi, hogy a betegség leküzdéséhez szükséges ezen vírusok monitorozása és javított vírusellenes terápiák és vakcinák kifejlesztése. Az új törzsek kialakulásának sebessége éberséget követel ebben a monitorozási munkában, és megterheli a .jelenlegi technológia kapacitását elegendő mennyiségű vakcina termelésére az újonnan azonosított patogén törzs ellen járványok megakadályozása érdekében.
Az íafluesza-A vírus esetében reverz-genetikaí rendszerek lehetővé tették a virálís genom manipulálását (Mese és. másak. Proc. Natl. Aead, Sok USA 93, 11354, old, (3996); Neumann és Kawaoka, Ádv. Vírus Rés. .53,265. old. (1999)}, Ellentétben a pozitív szálú vírusokkal (például poliövfeussaJ), az ínffaicaza-A vírusok negatív-szensz virálís RNS-ei (vRNS) sem fertőzöek. Csak a négy1 virális poíimerázkomplex-fefeárjével (PB 1, PB2, PA, NF) beburkolt vRNS molekulák képesek virális replikádé és transzkripciós ciklus iniciálására. Min» táu a ribonukleoprotemek (RNP) átjutnak a sejtmagba, a kapcsolódd fehérjék elkezdik a (-) vRNS-ek átírását mRNS-ekké és póaaflv szensz komplementer (+> cRNS-ekké. Ezen cRKS-ek terápiáiként szolgálnak a vRNS-ek szintézisénél. Az első ínítoenza-A vírusra kifej tesztelt reverz-genetíkai rendszer az RNS-iranszfekdős eljárás volt [Luytjes és mtsaí., Ceií 59, 1107, old. (1989); Snamí és mtsaí., Proc. Natí. Acad. Seí USA 87, 38Ö2. old, (1990)}. A vífössmfl vRNS T? ENS-polúneráz általi m v&ro transzkripciója és vitális rílmnokleopmíeinek (vRNP) összeállítása után genetikailag megváltoztatott RNP-szegmeítseket juttattak be eakariófe sejtekbe WKsafekcíóvat influenza segítövírussal történő fertőzés a klónozott cDNS-ből származó gént tmdalmazó vörösök létrehozását eredményezte. Azonban a segííővirus jelenléte az RNS és DNS íranszfeksiős eíjárásrskbas komolyan korlátozza ezen eljárások gyakorlati értékét, mivel erős szelekciós rendszerre van .szükség a segítoyirá» eliminálásához.
A vRNS-molokulák RNS-polímetáz-l (pol-Ü által irányított m vivő szintézisének kialakítása lehetővé tette RNS~komplexsk. mtracdltdárls előállítását [Neumann és Hobom, Vírology 202, 477. old. (1994)}, Éhben a rendszerben vsusszerü cDNS-t inzertéinek be a pol~i promőter és termmátor szekvenciák közé [Zobel és mtsai., Nuct Actds Rés. 21, 3607. old, (1993}], Elfemétben az RNS-poíimeráz-H (pobfl) által szintetizált rnRNStrunszkríptorsokkal, a pol-1 álfel létrehozott RNS-ekben nincs sem 5’ sapka, sem 3’ poil(A)~tarok, Működőképes vRNP-moleknlákat lefest létrehozni akár segitövírassal történd fertőzéssel, akár FBI, PB2, PA vagy' NP fehérjéket kódoló expressziós plazmídok együttes transzfekeíójávsl [Hemnann és Hobom, mint fent; Piíek és mtsaL, RNÁ 2, 1046, old. (199ő); Pleschka és mtsaL, J. VíroL 70, 41S8. old. (199ó); Zhou és mtsak. Virotogy 246, 83. old. (1998)}.
**«*
-3Ujafeb vizsgálatok kimutatták, hogy a nyolc vRNS pol~í ja-omőterröl történő plazmíd-irányltoü expressziöja és a poUmerázkomplex fehérjéméi együttes expresszíója fertőző- iníluenza-A vírus kialakulását •eredményezi (Neummn és mtsal., Prec, Naü. Acad. Scí USA 96,. 9345. old, (1999); Fodor és mtsai, I. Vírol. 73. 9679·. old. (3999)], Mivel az ínfluenza-A vírus teljes mértékben pteaidok állal irányított létrehozása m igényel fertőzési segltővirassal, nincs szükség szelekciós rendszerre; tehát az összes gánszegroeost technikus korlátok nélkül manipulálhatjuk, A Neumann és mtsai, (mint feni) által kifejlesztés rendszerben a nyolc cDNS-t a humán poM promóter szekvencia (407 bp) és egér tonainátor szekvencia (174 bp) közé inzertáiják. A négy RNF-komplex fehésje expresszióját humán eitomegaíoviruB prumőterrel irányította. A 12 plazmidsak 10^2931' sejtbe történő transzfektá.lás& több mint iö? vírust eredményezett; ez a hatékonyság 5 x W pfe-ra növelhető 17 plazmád rtanszfekíéiásával, Fodor és misai. (mint fent) olyan rendszert fejlesztettek ki, amelyben nyolc cDNS-i mzsrtáltak a humán pol-l prómóter szekvencia (25Ö bp) és a hepatitisz Ő-vlras genomiális ritezirn-szekvenciájíi közé, hogy biztosítsák a vRNS pontos 3’ végét. A polimeráz-kompiex génjeinek expressziöjs érdekében az adcnovíxus 2-es típusú fő késői promőterét tórtalnrazá plazmidokat alkalmaztak. A 12 espressziös vektor Verő sejtekbe történő transzfektáiása után csak egy vagy két fertőző vlrasrészecskéi 'nyertünk 1Ö11 íranszfektált sejtből.
Azonban a Neumann és mlssi, által (mint fest) leírt segitővtes-mentes rendszer, amely pol-1 és pol-Il promáten tartalmaz az influenzavírus eDNS-síveí különbőzé ptazmidokou, legalább- 12 plazmid előállításét és együttes transzfektáíását igényli a vírus visszanyeréséhez, es 17 plazmídot: igényel a hatékony vírusvisszanyeréshez. A sejtek ennyi plazaudM történő transzfektálása korlátozhatja a rendszer alkalmazását olyan sejtwnalakban, amelyeknek magas a transzfekelós hatékonysága. Azért, hogy képesek legyünk vírus kimentésére különböző sejrtfpusökből, növelhetek a vkushozamof az iróluenza-A vírus replíkációjának fokozásával ezekben a sejtekben, és növelhetjük az vakcinák előállítására alkalmas sejtek körét (Govorkova és mísak, 3. Virok 70,5519. old. (1996))
Ezáltal szükség van a szakterílkden refcombináns influenzavírusok hatékonyabb előállítására. Ezenkívül szükség van átrendezett vírusok hatékony előállítására ájoiatan azonosított vírustőrzs ellen vakcina termelése érdekében. ,A találmány megoldást kínál ezekre és .más szükségletekre, azáltal, hogy egy rendszert biztosit, amelyben egyetlen tómplátról történik mind a genomiális negatív szálú virális SNS-szegtneusek (vRNS), mind a virális nüiNS-ek szintézise, ezáltal mfeása&álja a vírus létrehozásához szükséges plawklofc. számát és lehetővé teszi a hatékony és megjósolható árteudezédést,
IsAÍÉFtek
A /fteovfetee család tagjai, köztük a Aofmnm' nemzetség vírussá kettős szálú szegmentált RNSgenomot tartalmaznak, A humán rotav&w a sőlyos gyermekkori hasmenés leggyakoribb virális ágense az Amerikai Egyesüli Államokba», amely körülbelül 5000(1 korházi kezelést és 20-50- halálesetet ekoz évente, és a becsült éves költsége több mint 1 milliárd dollár. A fejlődő országokban azt becsülik, hogy a rotavírus felelős az összes hasmenéssel kapcsolatos kórházi kezelés egyhannadáért, és megközelítőleg S5ÖÖ0D halálesetet okoz évente.
Egy kettős rendszer létezik a rötavuusok szerotípusának megállapítására, két virális fehérje (VE), a VF7 és VP4 által kiváltott semlegesítő válasz miatt. A VE? szeroüposokaí G-típusnak nevezzük, és a VE4-bél származókat pedig F-tlpnsnak. Mindeddig legalább 10 G-szerortpust és legalább 7 F-szerotipsst találtak emberekben. Mivel a VP4 és V.P7 gének külöo-küíön szegregációdnak, új rotóvirusok jönnek lébe átrendeződéssel, Az **φ ίβ «φφ«
-4Arueríkai Egyesült Államokban a P1-P4 és G1-O4 szerotípusok a leggyakoribbak; más kombisáciőkaí jelentettek olyan országokból, mist példátd India és Egyiptom. Az első engedélyezett barnán rotavírus vakcinát, a rézustnajom rotavírus vakcinát ágy szerelték ki, hogy szerotípus-specifikns védelmet hozzon létre a ségy .gyakori szerotíptrs (O1-G4) elten. Azonban ezt az vakcinát visszavonták a vakcioáíás és & vakcinát kapott személyek mrasszuszcepdójának rttegnövekedett aránya közötti' kapcsolat miatt Ezáltal szökség van olyarr rotavírusvakcina előállítására, amely az összes 0- ás P-altípsst reprezentálja, és amelynek nincsenek nemkívánatos mellékhatását A leírásban ismertetünk vektorokat (előnyösen plazsnldok), eljárásokat és gazdasejteket is, amelyek alkalmazhatók rotavírusok teljes egészében kfetőzotí cÜNS-bőí történő létrehozására.
Tizenhárom elsődleges génterméket azonosítottunk. A zavar minimalizálására és a reovítusok más nemzetségeiből származó hasonló funkciójú fehérjékkel történő összehasonlítás megkönnyítésére az alábbi nevezéktant alkalmaztuk: SDS-PAGE-ben való vándorlásuk -szettet a legnagyobb fehérjétől kezdve a szerkezeti fehérjéknek a „VP” előtagot adtak, és a nem szerkezeti fehérjéknek az „MSP” előtagot adtuk, és az egyes fehérjék feökciójáí zárőjelhett adjuk meg. Például a YPifPol) rövidítés azt jelzi, hogy a legnagyobb fehérje a vírusrészecskéköeu az RNS-függó-RNS-polúneráz. A hét szerkezeti fehérje olyan vitális részecskékké áll Össze, amelyek három szerkezeti réteget tartalmaznak; fi) A dsKNS-geaomot tartalmazó belső vírusmagban három fehérje van, amelyek közül keltő [VPlfPol) és YP3(Csp)j közvetlenül kapcsolódat a gettómhoz, míg a harmadik fVT2(T2)] alkotja a mag burkát, (2) a virion középső febérjeburkát 780 YPőfTD) molekula alkotja 260 felmer egységben (3) VP4 és VP7 alkotja a .külső burkot. A VP4 tüskefehérje tartalmaz egy tripszm hasítási helyet, amely fontos a VP5-té és VFd-cá történő hasításban, és ez a hasítás fokozza a fertőzőképességet. A VP7 két formája, amelyek a különböző olvasási fázisokból származnak, a VP7(1) és VP7(2) beépülnek a virionökha.
Sokkal kevesebbet tudunk a hat nem szerkezeti fehérje funkciójáról:, Hasonlóan más RNS-virusokhoz, várható, hogy a nem szerkezeti fehérjék fontos szerepet játszanak a vírus replikácíójában, transzkripciójában, vlráíís RNS-ekké történő transzlációjában és pakolásában. Valóban hőmérséklet-érzékeny mutánsok S, szegmensének elemzése alapján: azt feltételezték, hogy az NS.P2(ViP) fehérjének közvetlen szerepe van a vlrusreplikácíöhau. Az teSP3-ről azt gondollak, hogy konzervált régiókhoz kötődik a vírális tpRNS 3’ végén, és az eIF4G ceTloláris sapkakőfő fehérjéhez, és ezáltal specifikusan serkenti a rotavírus mRXS-efc transzlációját, amelynek varrnak 3’ sapka-szerkezete, de nincs 3TpoK-A~tarka. Úgy tűnik, hogy az NSPí nem esszenciális, de talán aktív szerepet játszik a rotavírus sejrtsnyészetben történő repllkáeiójában. Az NSP4-rőI azt gondolják, hogy részt vesz a morfegeoszisben.. Az NSPS és NSPó nem szerkezeti fehérjéket két különböző olvasási fázis kódolja all. szegmensen, de fenkeiójuk a vkáíis életciklusban nem ismert.
A repHkáeiős ciklus 10-12 óra alatt zajlik le 37^0-00, Jelenlegi adatok azt sugallják, hogy a vírusok receptor-közvediett endodtózissal jutnak be a sejtekbe, de lehetnek alternatív mechanizmusok is sejtbe történő bejutásra. A guzdasejtbe történő bejutás után a külső virasburok felszabadítja a transzkripciósán aktív kettős burkú részecskét a fertőzött sejt citopiazsTsáláha. Virion-asszocsáií fehérjék S’-sapkázoft, nem-polisdeniláh mRNS-eket állítanak elő, amelyek teljes hosszúság)! trartszJffiptumok a videó egyes gesoraiális szegmenseit alkotó negatív szálakról. Az egyes szegmensekről származó virálís raRNS-eknek két funkciója van: először, íranszlálódnak a szegmens által kódolt vírális fehérjék létrehozására, másodszor terápiátok a gettóra rephkáeiójához. A gesontszegraensek összeszerelése a különböző vírális mRNS-ek kiválasztásával megy végbe, amelyek a „preeore Sí kialakításához szükségesek. A 11 mRNS összeszerelését kőveti a negatív szál szintézise, amely a „core-RF-beo és VPőfTl Sj-kl-ben történik, amelyek a fertőzőit sejtek eitopfezraájáhaa található «< » * ·' » ♦ , ♦♦♦ » .«» ♦ » ♦ » ,
-5„vlropíaztnsban” vannak jelen , Az atód virionok moríogenezisénefe követező lépése egyedi a rotavtrttsok esőiében, és a kétréfegú részecskék endöplazmaiitess -tetsktátasban történő bimbózása j átszik benne szerepet, az NSP4 részvételével Ez art. eredményezi, hogy a részecske átmenetileg beburkolődik, amely elveszik a végső érési lépések során, ásókor a VP4-ből és VP7-böi álló külső idrionburok hozzáadása megtörténik.
A szegmentált genom, magasan szervezett geaomiálts szerkezet és komplex replikáciős ciklus nagy kihívást jelent a rotavírusak reverz-genetíkai rendszerének kifejlesztésénél A leírásban ismertetjük xotednisok egyszerű és kényelmes előállítását is.
JOfWWgwag
A közegészségügyi hatóságok által az Amerikai Egyesüli Államokban és Európában jelenleg engedélyezett mfiuenza-vakcmák iaaktivált mfimm-vakcsnák. A járványügyheg fontos influenza-A és infiuenza-B törzseket képviselő vírusokat embriót tartalmazó tyúktojásokban tenyésztik, és a vlrusrészecskékeí azután tisztítják és kémiai ötön insktiválják. Évente a WHÖ kiválasztja azokat az altípusokat, amelyek legvalószínűbb, hogy el ingnak terjedni: ezek jelenleg két inítenza-A törzs, .(HIN 1) és (H3N2), és egy B törzs.
Biztonságos ás hatékony vakcina előállítása érdekében fontos, hogy a kiválasztott vakcina-törzsek közeli rokonai legyenek a keringő törzseknek, ezáltal biztosítsák, hogy a vakcináit populációban található ellenanyagok képesek semlegesíteni az .sntigemfcum hasonló vírust. Azsasbas nem minden közeli rokonnak talált vírus alkalmas vakcina-termelésre, mert azok gyengén nőnek tojásokban. Tehát kívánatos erős növekedésű átrendeződd vírus előállításának megkísérlése, hogy kombináljuk egy laboratóriumi törzs, az (A./pR.'SGdXHíNI) magas vírushozamái a feltételezett patogén törzs antigén tulajdonságaival.. Sajnos két, nyolc szesmenst tartalmazó vírussal való együttes- fertőzés elméletileg 2s-25ő különböző utődvírus kialakulását eredményezi, Erős növekedésű, a szükséges gíiköprotem antigéneket tartalmazd vírus előállítása érdekében szelekciós eljárásra van szükség, hogy eiímináliuk a megfelelő gésssegmenseket az erősen növekvő iaboratórísnri törzsből. A megfelelő ghkoproteisekkd rendelkező vírus előállítására szolgáló szelekciós eljárás és a génösszetétel igazolása nehéz Ős időigényes feladat. Habár az RNE-traaszfekcíős rendszer [Luytjes és sásai., Cell 59, 1107. old. (i 9S9>] csökkenti az ntódvLresok lehetséges számát, még mindig szükség van jő szelekciós eljárásra.
Az intranazálisan beadott legyengítek élő vsrusvakeinák lokális, nyálkahártya!, sejt-kőzvetitett. és humorai Is immunitást váltanak ki. Azok a hidegre adaptált (ca) átrendeződött (CS.) vírusok, amelyek tartalmazzák az élő, legyengített inftoesza-Á/Aaa Arbor.''ő/őö(H2N2) vagy B/Aaa Arbor/l/óő hat belső génjét, és s jelenkori vad típusú inEuenzavirusok hstnagglutinmját (HA) és nearamisidázát (NA}, látszanak megbízható módon legyesgithetönek. Ez a vakcina hatékonynak tűnik gyermekekben és fiatal felnőttekben. Azonban túlzottan legyengített lehet ideális immunválasz stlmulálására idős emberekben, akik az Amerikai Egyesült Államokban minden évben az influenzafertőzés eredményeképpen elhaíálozá 2Ö0ÖÖ-4ÖÖSO személy tő csoportját képezik. Habár g ea-virusok belső génjeinek szekvenciáját leközölték, az egyes szegmensek hozzájárulása a legyengített fenotipushoz még nem jól definiált. Ezt az mformáciöt csak speeífíkns, meghatározott legyengítő mutációknak a vírusba történő sorozatos beépítésével lehet megszerezni, Habár az RNF-transztékciós eljárás lehetővé teszi mutációk beépítését az milnenza. genomjába, a szelekciós rendszer szükségessége és a virális RNE-k ó? víírn feloldásának technikai nehézségei limitálják belső gének manipulálásának alkalmazását.
***» ****
-őígy szükség van a árterülete» olyan rekoffifetefe Mueaza-vakcteák kifejlesztésére, amelyek elkerülik segítövfrus alkalmazását, jól nőnek tenyészetben (tojás vagy setenyészel), megbízható módos tehetővé teszik olyan átrendeződött vírusok kifejlesztését amelyek szaporíthatok áj vakcinák kitej iesztésérs, és szisztematikus mutációt biztosítanak élő Icgyengltsít virestörzssk kialakítására intranazális vakcináW céljára. A találmány megoldást kínál ezekre ás más igényekre a szakterülete».
A találmány tárgya minimális plazaddalapú rendszer fertőző negatív-szálú RNS-vfrasok klónozott vitális eDNS-höi történő előállítására, amely olyan plazmidok készletét tartalmazza, amelyek mindegyike egv autonóm vitális génszegmensnek megfelelő vitális eDNS tartalmaz, amely RNS-pöílmeráz-í (poi-I) pfsssóter és tenamátor szekvenciák közé vaa inzeríáivs, ezáltal 3 cDMS képes vRNS cxpresszíójánsk irányítására, és amely cDNS inzertéivé. vanRNS-poiimeráz-lí (pol-il) promófer és egy poliadeniiáeiós -szignál közé is, ezáltal 2 cDNS képes mRNS exprsssziójásak irányítására is, és ahol a plszmid rendszer cDNS biáirekcionslis plazntid rendszer.
Előnyősén az RNS-víras innuanzüvfras (például i»Raenza-A vagy iníluenza-B vírus).
A találmány tárgyát píazmidalapű rendszer képezi fertőző negatív szálú RNS-vfeusok előállítására klónozott génekről vagy cDNS-rŐl. A rendszerben Cbidireketeáiisrendszer) a negatív szálú gén vagy cÖNS leolvasással ellentétes irányban lévő pol-11 promóísr és leolvasással megegyező irányban lévő poW prontóter között miálható. A gén vagy eDNS transzkripciója a poi-l promóterröí pozitív-szensz sapkázott vitális mRNS-t hoz létre, és a transzkripció a pol-l promótcrról negatív-szensz, sapkázaüan vRNS-t hoz létre. Összehasonlító példaként ismertetőnk egy snásík rendszert (mdirekcionálls rendszer), amelyben a gén vagy eDNS pol-i és poHI promóíertől leolvasással megegyező iránybss helyezkedik el. A pol-il promóísr sapfeázotí pozitív-szensz vitális mRNS-t hoz létre, és a poM promóter sapkázatlan pozitív-szensz vitális cRNS-t koz létre.
A találmány szerinti minimális plazmídalapú rendszer lehetővé teszi fertőző negatív szálú RNS-virasok előállítását klónozott vitális cDNS-rSl. ilyen rendszer olyan plazmidok készletét tartalmazza, amelyek az 8NSvíros autonóm vitális genomiáhs szegmenst tartalmazzák. Mindegyik plazmádban a vitális cDNS, amely megfelel az autonóm virális geaomiáiís szegmensnek, RNS-poíímeraz-l (pol-1) prométer és tenaínáter szekvenciák közé van mzertálva ezáltal a vRNS expressziója következik be), ami pedig RNS-pölimeráz-ll (pol-il) promóísr és poliadeniíációs szignál közé van inzertálva (ezáltal a vitális taRNS expressziőja következik be). így ez a rendszer a bidirekeiouáiis plazmid technológiát alkalmazza, és hatékony átrendeződést tesz lehetővé a keringésben lévő jelenlegi patogén törzseknek megfelelő negatív szálú RNS-virnsök előállítására, például az influenza NA és HA. gének tekintetében, egy olyan: háttér törzsben, amely jól adaptálódott a sejttenyészetben való ttövekedéshez, vagy legyengített törzsben, vagy mindkettőben. Előnyösen a vírus íniluenzs-Á vírus vagy iniluensa-B vírus.
A találmány tárgyát képezik gszdasejlek, amelyek turtatínszzák a fertőző vlrionok léírehozására szolgáló plszmldalapú rendszert, és eljárások negatív száló RNS-víras virítotok előállítására, amelyek szerint a gazdasejteí tenyészíjdk olyan körílteénysk közölt, amelyek lehetővé teszik virális Fehérjék és vRNS termelését
A vírioaok előállítására alkalmas plazmídslspn rendszer, gazdasejtek és eljárások különösen megfelelőek negatív szálú RNS-vftwa specifikus vakcisa előállítására, ilyen eljárások virítotok tisztítását is magukban foglalják. A tisztított vlrtonok lehetnek inaktiváiíak vagy legyengítettek. Á találmány szerinti vakcinák alkalmazfeatók. RNS-virns-íetlőzés elleni vákcinálásra. A leírásban 'ismertetjük, hogy inaktíváit vadonokat tartalmazó vakcina védő dózisát beadhatjuk feü&muszkoiáris injekcióval. A leírásban ismertetjük, hogy legyengített virionokat tartalmazó vakcina védő dózisát beadhatjuk íntranazálissn egy szentélynek.
***φ ΧΦ * * * *φφ « « * ♦ Φ* φφφ«
Φ X «Φ*
A találmány tárgyát képezik továbbá átrendeződött virionok, és ílysa. virionokat tartalmazó vskeinakészltmények, beleértve inaktíváit és legyengített víríonokaf
Egy másik előnyős megvalósítási mód szerint a találmány tárgya eljárás legyengített negatív száló RNS-virus előállítására. Ezen eljárás szerint egy vagy több virális gént mutáltatok a plazn?idaispá rendszerben, és azután meghatározzak, hogy a rendszer által termelt fertőző vírusok legyengitettek-e, ilyen legyengíteti vírusok alk&ímazhatők íntranazálís vakcinák kifejlesztésére;, beleértve olyan intrsnazális vakcinákat, amelyeknek fokozott a hatásossága védő immunitás kialakítására idős vagy egyéb populációkban, melyek nem reagálnak a jelenlegi legyengített vakcinákra.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz tartozó ábrákat:
Az 1. ábrán a vRNS és mRNS szintézisére alkalmas pol-i-pol-íi transzkripciós rendszer sematikus ábrázolását mutatjuk be. A nyolc influenzavírus szegmens cDNS-e mzertáíva van a poí-1 promóter (p&) és a pol-í. termmátor (¾) közé. Ezt a poí-1 s-srsszkripciös egységet a humán eitomegafevírus poí-0 promótere (pbsmv) & szarvasmarha növekedési bonbont kódoló gén poliadenilációs szignálja szegélyezi. A nyolc expressziós plazmiá transzfektálása után kétfajta molekula sziuíetízálódik, A humán poW promóterről negatív-szesss vRNS szinteíízálódik a .sejtbe® poM által. A. szmtetizálódotí vRNS tartalmazza a nem kódoló régiét (NCR) az 5’ és 3’ végeken. A pöi-U általi transzkripció olyas mRNS-eket eredményez, amelyeknek van 5’ sapkaszerkezete és 3’ poií-Á farka; ezen nrRbiS-ek virális fehérjékké rianszláiédsak. A vir&lis cDNS ATO kodooja az első ATG a leolvasással megegyező irányban, a pol-ίϊ transzkripciós starthelytől.
A 2. ábrán az mSuenza-A víras létrehozására alkalmas nyolepiazmiáos poH-pol-H rendszert matatjuk be. A humán pol~l promóter és a pol-IÍ promóter közé inzertéit (lásd az 1, ábrát) nyolc virális cDNS-t tartaímazó nyolc piaztuidoí iranszíekiálotsk eukarióta sejtekbe. Mivel mindegyik plazmid két különbőzó promótert tartalmaz, mind a sejtbeli poM, mind a pol-.il átírja a piazrnidtemplátot, feltehetőleg különböző sejtmagon belöli kompartmentekben, ami virális mRNS-ek és vRNS~ek szintézisét eredményest, A virálts polímeráz-komplex fehérjéinek (PB 1, PB2, PA, NP) szintézise után beindul a v:ralis replikációs ciklus. Végső soron a sejtbeli transzkripciós és transzlációs gépezettől közvetlenül (pol~lí transzkripció) vagy közvetve (pol-l transzkripció és virális repltkáció) származó összes virális molekula összeszerelése a szintetizált molekulák (vBNP-k és HA, NA, Ml, M2, NS2/NBP szerkezeti fehérjék) kölcsönhatását eredményezi, fertőző mfmenza-A vírust létrehozva,
A 3 A. és 3B. ábrán az ATeaklIKAVS 12/97(H6N1) visszanyerésére szolgáló nyolc pl&zr&íd előállítására és transzfektálására kifejlesztett eljárás sematikus ábrázolását mutatjuk be, A. Virális RNS-t extraháltunk vírusrészecskékből RT-PCR-t hajtottunk végre olyan láoeindiíókkal, amelyek szegtnerrs-speciftkus uukfeöíídokat és a íis-típosnak megfelelő SsntBí és Bsal restrikciós endosukfeáz helyeket tartalmaztak. A nyolc virális PCR-feagmeast cmésrtettök BsnsBí vagy Bsal eszimekkeh és a BsmBí enzimmel Imesrizált pHW2Ö9ő plazmádba ínzertátfuk. Ez az iuzertáiás nyolc expressztós vektort eredményezett, amelyekben a virális eDNS pontosan fezfeoáltatva van a poM promőterhez és temmátorboz (A PB2 szegmens ÁGC...ÁCT virális végszekvenciáit mutatjuk be a fekete téglalapokban), 8, A pol-í promptért és poi-H promótert tartídmazó nyolc expressziős piaxmidba a nyolc szegmens virális cDNS-ének egy-egy kópiáját tartalmazza. A lő virális fehérje nyílt leolvasási fázisát szegmens-specifikus nem kódoló régiók (szürke téglalapok) szegélyezik. Mivel az alkalmazott humán pol-í promóter csak emberekből vagy rokon fajokból származó sejrvonalakban mutat magas aktivitást, barnán 293T sejteket együtt tenyésztettünk az Ísfuenzs-A vírus esetén szokásos sejtvonallal ***♦ ·* **>» <·♦♦♦ ♦** * « *** *«»» **♦* *«»φ
-S(MDCK-sejíek). A tosszíektálás tan a 29.3Τ sejtekben termelt vírusok azután megfertőzhetik az MDVR sejteket ás replikáíöd&aütak,
A 4Á. és 4B. ábrás az RT-PCR-rel kapott vírusok jellemzéséi mulatjuk be. A, RRS-t extraháltunk vtrusrészecskékből, írttsszfektált sejtek feiülüszőjánek MDCK sejteken történő két passzálása után (lásd az 1. és 2, táblázatot). RT-PCR-t végeztünk az NS géaszegmeosrs speeífikas iáocindítókkul, és vRNS-t extraháltunk a virlo.nokből. Az alkalmazott NS-láseinditók asm voltak törzs-specifikusak; Így lehetővé tették bármilyen iafluenza-A NS-szegtnens ampllfikáíását A reakcíólermékeket 2% ag&rózgélen elektroforetízálttjk. Annak biztosítására, hogy az amplifikált DNS-fragmensek a vRhíS-hői származtak és sem a trasszfekfált sejtekből átvitt p'lazmtd DNS-bőI, egy' reakciót reverz-íranszkrlptéz (RT) hozzáadása nélkül hajtottunk végre (-), L és 2. sáv; Rekombináns A''Teal'TIK'‘W312/97 (I. táblázat); 3. és 4, sáv; M-átrendeződás (2. táblázat); 5. és 6. sáv; NS~ ártenáezödés (2. táblázat); 7. és S, sáv:, rekombináns A/WSN/23 vírus (1. táblázat); 9. és W, sáv; négyesátrendeződés (2. táblázat). 8, Az A pontba® bemutatott fragmessek Neol emésztése. Az NS-fragmenseket azonosítotok az arnptifikálí termék szekvendaetenzésével is (adatokat nem köziünk),
Az 5. ábrás az asídírekclooális RMS-pol-I-pol-U transzkripciós rendszert ismertetjük. Az onítiirekeionális poi-í-pol-fi rendszerbe,'! vitális c8NS-t inzertálnnk pozitív-szensz irányítottságban a barnáit poí-l promóter (p&} és tetóhátsr szekvencia (k) közé. Ezt & teljes pol-I transzkripciós egységet a humán citomegalovkus pol-11 promőíere (pacMv- & humán eitomegsiovírus azonnali tetői promőtere) és a szarvasmarha növekedési hormont kódoló gén poliademláeiós szignálja (aíii!s!!) szegélyezi. A transzfektálás után kétfajta RNStnmszfcrtptBta szintesbe várható. Pozitiv-saessz cKNS szlntetizálódik trlfoszfát-csoporttal as 5’ végén a pol-i által, és pozitív—-szensz mRNS szintetizáhsdík a poi-H által 5’ sapka-szerkezettel és poií-(A)-farokkai a 3’ végén. Az tnRHS mindkét eleme szükséges a hatékony transzlációhoz.
A ő. ábrán a pHWl 1 klónozó vektort ismertetjük tandem elhelyezett pol-1 és pol-S promóterre), A píazmid tartalmazza a 225 kp hosszúságú humán RNS-pol-1 promótert (pád és a 33 bp hosszúságú egér tennínátort (ts). A pol-I promóter és ferrsssrátör szekvenciát a .tanán ciíomeg&lovírns pol-H promótere (jsbcmv) 8 szarvasmarha növekedési hormont kódoló gén poiiadeotiácíós szignálja <aÍSiGnj szegélyezd, A vírúlís cD-NS pol-I promöter és ferminátor közé történő íiizertáláxához két BstnBl restrikciós helyet (aláhúzással jelölve) építettünk be. A vektor BsmBI «zömei történő emésztése ragadós, de nem komplementer végű vektoríragmenst hozott létre. Ezen vektor felépítése lehetővé teszi a vitális cDNS pontos fúzióját pozitlv-szeosz trányítottsághan a pol-I promóterlsez és terminátor szekvenciához viszonyítva. Az £ eori'-bns történő szaporításhoz a plazmíá tartalmaz repllteácíős origót (őri), és ampietilin-fertatetú tápközegbes történő szelekcióhoz, a plazsud β-laktatoáz gént (b)a) tartalmaz.
A 7 A. és 78.. ábrán fertőző RNS-vImsck előállítására szolgáló, két prottiófert tartalmazó rendszert mutatunk be. Mivel az RNS-vírusok edlttiáris paraziták, opttoalízábíuk kell a stratégiájukat a gazdasejtek alkalmazására a genetikai információjuk exprcssslója érdekében. Minden RNS-vírusttak szintetizálnia kell roRNSeket, amelyek fehérjékké transzlálhatók, Általában a szintetizált fehérjék a replikáméhoz, transzkripcióhoz és új utód vírusrészecskék előállításához szükségesek. A genomiáii's RNS-ek hatékony repiikácíájához pontos 5’ és 3’ végű RNS-tonszkriptumokat kel· készítési. A 7A. és 78. ábrák közül csak a 7A. ábra képezi a találmány tárgyát.
A rendszer egy külső és egy belső iranszkripciós egységet tartalmaz- A belső transzkripciós egység egy pol-I promótert [{$> (* RNA) vagy p (- SNA)). Az RNS-vlrusok cDNS-e egy' vagy több nyílt leolvasási fázist **** ** χ0 * 0 4 Φ » « «χχ χ * * .Jf φ .
*’* *»«♦ »«« 00
-9~ (ÖSF) tamhnsz, amelyeket nem kódoló régiók (NCR) szegélyeznek Előnyösen nincsenek szekvenciák a viráüs cDNS és a promötér között A közbenső szekvenciák hiánya életfontosságú,, mert .a genomiális vRNS 5’ és 3’ vége általában a transzkripcióhoz és rephkáelóhoz szükséges vitális fehérjék általi felismeréshez szükséges szekvenciákat tartalmaz; további nem vlrális szekvenciák tipikusan megakadályozzák a vSNS virslis fehérjék általi hatékony felismerését és replíkációját A közbenső szekvenciák hiánya leitetővé teszi az átírt (♦) szálú RNS (A) vagy {·*-) szálú RNS (8) virális polimeráz fehérjék általi hatékony alkalmazását, A külső transzkripciós egységben van egy pol-íí promóíer (p(ínRNA)), amely Irányítja &z snRHS átírását a cSNS-röl; az mRNS tartalmaz 5' szekvenciákat (például nsetö-G sapkákat) és 3’ szekvenciákat (például pdí-A-fmlcakat}, amelyek szükségesek a transzláció míciálósához és virális fehérjék előállításához. Mivel a transzláció folyamata toleráns további szekvenciák iránt a külső transzkripciós egység promótere és a virális eDNS közölt, közbenső szekvenciák jelenléte a belső transzkripciós egységből nem akadályozza szignifikánsan az asRNS transzlációját.
Ezt a rendszert módosíthatjuk és Javíthatjuk az. infiuenzavirustóí eltérő egyéb 'KNS-vhnsdí számára, más terminációs elemek vagy ribozímek alkalmazásával a virális RNS pontos 5' és 3’ végekkel történő íBtracellulám szintéziséhez (amint fent tárgysituk). Kalapácsfej riboztmok vagy a hepatitisz-ó vírus (HÖV) ribosátn alkalmazható pontos végű virális RNS létrehozására [Schneli és ratsai,, EM80 J. 13,.4195., old. (1994); Pleschfca és misak, J. Vhol. 70,4188, old, 09%); Hereiá, I és mtsaL 3. Virol. 74, S394-S400, old, (2Ö00)].
összehasonlító példákban a külső irasszkripcíős egység tartalmazhat poH vagy' poiimeráz-ííl promótert, T? RNS-pollmeráz promptért, T3 RNS-polimeráz promótert SPő RNS-polimeráz premőiert, vagy bármely más ÖNS-Slggó-RNS-poiítneráz promóísst. Ha a külső transzkripciós egységben lévő promőter olyan transzkriptumok szintézisét irányítja, amelyen nincs metíl-G sapka, egy „internál Rihosöíoe Eníry Sim” helyet (IRBS) helyezhetünk a eDNS kódoló szekvencia 5’ végére, hogy' elősegítsük a transzláció inieiácíójár (amist fent tárgyaltok),
Figyelemreméltó, hogy a p.HW2öÖ0 vektorban vas egy T7-premóter a CMV-promóter ás a iermináclós hely közöli. A poi-0 traaszkriptumok a sejtmagban színtetizálódnak, őrig a 17 tratsszkripíumok a T? RNSpohmerázt expresszáíő sejtek cííopiazmsjáfean szintetizálődsak. így a. külső transzkripciós egység egynél több promőteréről származó tíanszkríptttusök állíthatók elő, különböző mRNS-ekst eredményezve. így a pHW2Ő0Ö vektorból származó expressziős piazmidok lehetővé teszik annak gyors értékelését, hogy a pol-íl vagy T7 promóter vagy mindkettő kombinációja optimális-e olyan pozitív-szeasz szálú vitások mKNS-ének szintézisére, amelyeknek van „Internál Ribnseme Entíy Slte helye (ÍRES),
A 8.· ábrán ismertetünk (+) szálú RNS-vírusok létrehozására szolgáló kettős premóiiírú rendszert is, A találmányt adaptálhatjuk pozitív szálú, uatswlekuláris genomá vírusok, mint például hepatitisz-C vírus előállítására is. Ezen megvalósítási mód szerint a hepuíitísz-C vírus genomját tartalmazó cDNS-t (megközelítőleg 9500 aukleotítí) iuzertáijuk olyan konstrukcióba, amely lehetővé teszi a cDNS hatékony íntraeeihtíáris transzkripcióját mRNS~sé, és teljes hosszúságú negatív RNS-ső (bidirekcionális .megközelítési mód) vagy m.RNS-sé és teljes hosszúságú pozitív RNS-sé (uaidirekcfenáib megközelítési .mód). A cDNS egy nyílt leolvasási fázist (ORF) tartalmaz, amelyet nem kódoló régiók (NCR) szegélyeznek. Az ábrán btáirekesonális rendszert tartalmazó plaztnídot mulatunk he. A teljes hosszúságú eDNS-t pol-I (pO promóter és termináeiós szekvenciák (t5) közé inzertáljuk, teljes hosszúságú (-) szálú RNS-t eredményezve traoszfektálás után.
A belső transzkripciós egységet egy külső transzkripciós egység szegélyezi, amelyben vart egy promótér [p(mRNA)j az mRNS-szintézls irányítására. Előnyösen ez a pretnéter a poi-lí promóter. íkzonhaa ha a φφφ ’ »*»» *
- 10színtetízált KNS-aek vas egy „internál ribssnmal entry súe helye (IR.ES). akkor a pui-H promótert helyettesíthetjük polimeráz-l, poSmetfe-iH, SP$, T7 vagy T3 prornőterrel (» T3 vagy T7 promóter alkalmazása azt követeli meg, hogy a T3 vagy T? polimeráz fehérje expresszáíódjon, tikár a ©olimerázi kódoló plazmád együttes tmsszfektálása, akár a peHmerázt stabila» espresszáté sejtvonal alkalmazása útján). A külső ímstópctős egység 3’ végén vagy psli-A szignált vagy inzertéit poli-A szekvenciát alkalmazunk, hogy a szintetizált mRNS«ek legyen poli-A-farks.
A kapott mRNS egy nagy pókpártéin prekurzomá öanszlálódík, amely a transzláció során és után elhasítódik egyedi, szerkezeti és nem szerkezeti virális fehérjéket eredményezve,
Áz NSSa ás NS5h nem szerkezeti fehérjék, amelyek RNS-iüggó-RNS-pölirneráz fehérjék, íetnplütkéní alkalmazzák a belső transzkripciós egység által szintetizált (-) RNS-í a virális repiikációs/trsnszkripeios ciklus míelálásám. Így {+) KNSAaR.HS keletkezik, amely fehérjévé transziálddtk. Végső soron fertőző vfessok keletkeznek, amelyek (+) RNS-í és virális szerkezeti fehérjéket tartalmaznak.
A 9. ábrán -egy pol-fepoi-II unidirekdonális rendszert is ismertetünk teásán parawfioenzavfm-ίϊϊ létrehozására, A találmányt alkalmazhatjuk pmmfinenzavfeus-íM előállftásárs, amely negatív szálú ummolekuláris RNS-geaomot tartalmaz. Virális cDNS-t inzertáihatunk a pol-i-poMI rendszerbe, akár szensz, akár antíssensz irányítottságban. Az ábrán az wákekdonálís rendszert mutatjuk be. Egy poM promótsr irányítja a cJRNS szintézisét, és egy pol-H promótsr irányítja az mRNS szintézisét. Ezen megvalósítási mód szerint a pol-11 protnóter polfeíszíroKos rnRNS-t hoz létre, -amelyről az első nyílt leolvasási fázis hatékonyan sukleokapssíd (NP) fehérjévé trasszlálödik, Ez a fehérje szükséges a rstplikáciöhoz. A replikádéhoz és transzkripcióhoz szintén esszenciális L és F-fehérjét kódoló piazmidokat (ttmelyek aem tr&nszlálódnak hatékonyan & polidsztroxtös mRNS-ről) állítunk elő, és íranszfekíálank különálló expresszíős plazmidokon. Összehasonlítva Dorbm föurbin, A.P. és mísai,, Vaology 235, .323-332. old. (1997)] rsverz-genetikas rendszerrel, a pol-l-pol-U rendszernek számos előnye van. Az MP azonos cDNS-ről történd expressziója révén ez a minimális plazmád rendszer négy helyett csak hárem plazmíá előállítását és transzfektáíssát igényli humán pamnBuenzavíms-flí teljes egészében klónozott cDNS-ről történő létrehozásához. Ellentétben a T7-promóteírői történő m vfeo tenszkripciós alapuló reverz-geoetík&i rendszerekkel, a pol-I-pol-Ii rendszert teljes egészében a minden sejtben megtalálható eakaríőts DNS-feggő-RNS-polintsrázók irányítják. Ezenkívül a kscemár vírussal történd fertőzéshez, amely a ?7 RNS-poünteráz expresszióját irányítja, olyan sejtek alkalmazása szükséges, amelyek perttssszívek a ftósfe vírus iránt (Heta sejtek vagy származékai, mist például Hep-2 sejtek), de .amelyek sem optimálisak humán paraíniluenzavírns tenyésztésére, ezáltal limitálják ezen megközelítési mód alkatezhatóságát fertőzd vírusok létrehozására. Ezen rendszer nemkívánatos tulajdonságai s Rácctefo vírus súlyos eitopádás hatásai és a fertőző ágensek alkalmazásánál szükséges biztonsági előírások . A pol-í-poMl rendszer alkalmazása elimisálja a vírus&rtdzés szükségességét, és lehetővé teszi 1EC-MK2 sejtek alkalmazását barnán parafeíiuenzavims-HI transzfelcíálására és tenyésztésére, Így technológiát biztosít legyengített vírusok egyszerűbb és biztosabb létrehozására.
A 10, ábrán- ptankfelapö rendszert is ismertetünk be rotavírus klónozott cDNS-ről történő előállítására. Ezt a. rendszert alkalmazfealjök szegmentált, kétszáiú RNS-genornú vírusok (például rotavlrus) létrehozására. Alkalmazható például a rsovlrusok családjába tartozó vírusok esetében (lö, 11, 12 ásRNS szegmens) vagy feírnavírasok esetében (2 ásRNS szegmens). Mindmáig a reovlrusok csaladjára netniétezed reverz-genctikai rendszer. Ezen az ábrán szí mutatjuk he, hogy a 11 dsRNS szegmensé rotevírosok hogyan állíthatók elő a read♦ ♦·* ♦ ** szerre], de hasonló rendszerek aíkahnazhalók az orblvirusök nemzetségének tagjai esetében (lö ősRNS szegz»ess) vagy ortoreovimsek esetében 02 dsRNS szegmens).
Az alábbi tárgyalás szemlélteti az A/SA U roísvtrus teljes egészében klónozod cDNS-bői történő létrehozását. A majom retavtes ketszálá RNS genemjának miad a 11 szegmensét meghatároztuk. A genom dsRNSei 3302 bp és 663' bp feSzölti méretűek, és a teljes genom mérete Ϊ 85-50· bp. A genomszegmenseket 1-1 Mg számozzak a PAGB (poliakrilamaíd-géleieiítfoferézis) elemzésben matatott növekvő mobilitás serreudjében, A szegmensek teljesen bázispárosodottak és a piasz-szensz szál 5’ végi sapkaszerkezetet (m7GpppömöPy) tartalmaz, de nincs poBadenilációs szignál a 3' vég közelében. Mindegyik genemiális szegmensben van egy közös konzervált 5’ és 3’ terminális, 10 mikleotíd konszenznssal az 5’ végen és S nukteotíd konszenzussal a.3’ végen. Közvetlenül ezen terminális régiók mellett befelé mindegyik génben van egy második konzervált régió, amely legalább 3Ö-40 uukleotidből áll, és szegmens-speeirikuis. Az 5’ nem Ranszlálödő régiók (NTR) hossza változó, de mindegyik kisebb, mint 50 snkíeotid, és az összes szegmensben az NTR.~t legalább egy hosszá nyílt leolvasási fázis követi sz első Alid után, A 9. és 11. szegmens két fehérjét kódol. A 3-NTR. hossza vjUtozó, 17 nnkleotid (1. szegmens) és 182 nukleoiid (10; szegmens) közötti.
A retavírtss cDNS-t két promóteh tartatom» rendszerben klónozzuk, előnyösen a poM-pol-II rendszerben. A kapott plazmidok megfelelő gszdasejtbe történő íranszíektálása alán virálls RNS-ek és fehérjék termelődnek, amik fertőző rotavfnts· kialakulását eredményezi. Ismertetünk egy nnldirékcionslis transzkripciós rendszert is rotóvíras előállítására. Ezen megközelítési mód alkalmazása a roiavlrus genomját alkotó 11 (v) RNS-moiskuia intraeelMárts szintézisét eredményezi, amelyeknek trifoszfái van az 5s végén, A virusszerü mRNS-ek exprexsziőjs virális fehériék expresszióját eredményezi A VP3(cap) vitális fehérje, amelynek guaníhranszferáz és meishranszferáz aktivitása vast, katalizálja az 5’ sapkaszerkezet addídóját mind a 11 rotavires (+) RNS-hez (Chsa D,, és mísai., Viretegy 265, 120-130. old, <1999)), Sőt, korábban azt is kimutatták, hogy a tisztítod VP4(eap), a rotavlros VP3<eap) analógja a bfuetogite ylrnsban (BTV), vlrusszerő sapkaszerkezeteket képes addídonáln) (+) RNS-hez t« v:W íRstnadsvi NI, és ártsák, Proe, Natl. Acad, Sói. USA 95, 1:353713-542. old. (1998)), Feltételezhető, hegy aoDNS· ?n rivo öastszkripciója és a VP3(cap) fehérje Intmcelluláris expressziója sapkázoít RNS-ek expresszlóját eredményezi mind a 11 rotavlrus genomíális szegmens esetében. Ezen m&NS-ek vitális fehérjékké rranszlálódnak,, vagy ,,preeore-R.l”-be pakelődnak. A yPé{Ti3)-Rl részecskék kialakulása után a pozitív-szsnsz mRNS terápiáiként működik a (-} RNS szintéziséhez. Végső soron a VP4 ésVP? hozzáadása a moríogenezis során fertőző utódvirionok kialakulását eredményezi.
Mivel a replikádé és rnortegenezis hatékony iniciálása függhet az egyes virális fehérjék optimális koncentrációjától, előnyös lehet különálló plazmidok létrehozása RN'S-szintézíshez és fehérjeexpresszióhoz. Azonban mivel a fehérjeexpresszlő szintje vagy a gazdasejtben lévő plazmidok mennyiségének változtatásával, vagy különböző promóíerek alkalmazásával optimalizálható az m.RN-S-szintézisrey nem valószínű, hogy szükséges szegmensenként két ptóhid á gének többsége esetében. Mivel g (+) RNS (-) RNS-röl szintetizálódik, a (-) RNS és fehérje iatracellaláris expressziója replikáeió-kompetens egységek keletkezését eredményezheti, amelyek virálls mRNS-t termelnek. így a két promőtert tartalmazó rendszer lehetővé teszi minimális plszmid rendszer létrehozását, amely szignifikánsan kevesebb plaztnidöt tartalmaz, mint 22, ami ekkor lenne szükséges, ha az RNS-i és fehérjét expresszáló plazmidok különálló plazmídokou lennének, A rotavírus előállítását hasonló módon hajthatjuk végre., mint amit az influenza-A vírus slöálllíásának esetében alkalmaztunk.
11Á-I1D, ábra. 'RNS virusgenomok replikációja és irtRNS-színlézíséí is ismertetjük.
X * ♦* «'·»· (A) az mSNS-ek a vsrális pölimetúzidhérjék által szintsítzúiúdnak a {-} szálú vírusok fertőzése sorún: egy vagy két mRNS szegmentált RNS-vhusok estéében, vagy több ssSNS «nirnoiekuláris gesosnú vírusok esetében. Az. artíiíerrmnáciús mechanizmus teljes hosszúságii (+} szálak szintézisét eredményezi, amelyek (-) gsnomiális RNS-ső másolhatók.
(8) Az atúbíszenss RNS-vímsok szegmentált genomja egy m&NS-sé rnásolódik; egy második RNS szlníeíizálödik a kamplemememői.
(C) Rőtszálú RNS-tdrusokkai fertőzött sejtekben az először szintetízúlódott mRNS-ek fehérjévé transziálhatók, vagy tempóiként szolgálhatnak (-) szálak szintéziséhez, kétszálú genomiálís RNS-t eredményezve.
(D) A (+) szálú vírusok esetében a gesömiáiis RNS mRNS is, amely (-) szálú SNS-sé másoíodik, ami (t-) getionsíális RNS~sé másolható. Bizonyos (-)-} RNS-vkusok aaRNS-e uem tartalmaz pőliÁ-iarkat Egyes családokban egy vagy több szubsesoimálls RNS termelődik.
Míoden RNS-virus életciklusa tartalmaz RNS-szmtézíst és virusrészeoskék összeszerelését fehérjeszintézis mán; ezen funkciók konceptuális keretet adnak a találmány szerinti reverz-genetihsa rendszerekhez és a leírtában ismerteteti ?»ás rendszerekhez, amelyek RNS «vírusok létrehozására alkalmazhatók klónozott eDNSröl. A találmány és a leírásban ismertetett más rendszerek leegyszerűsíti és javítja a jelenleg elérhető reverzgenstíkai rendszereket két pronsótert ísrtalmazé rendszer létrehozásával az alábbi vírusok előállitáshoz; negatív szálú szegmentált vírusok (például iafluenza-Á, inflnenza-B, BmprsvírMre), nem szegmentált negatív szálú RNS-vírusok (péidáal /fea^zvövfeidde, .Mj«ö^gő/«s), kéiszálú RNS-vírusok (például Memr&foe, Bteferídae) és pozitív szálú RNS-vírusok (például Ffavréíríobe, F/eo/amurii/ös?, Coroumdrááre, Tbgzo’fndde), Mivel a találmány szerinti rendszer egyetlen virális cDNS-í alkalmaz mind a fshérjeszrníézísre, mind a genomiálís RNS szintézisére, a rendszer csökkenti a vírus előállításához szükséges plaznűdok számát, és lehetővé feszi vakcinák gyors és olcsó előállítását.
Ha szegmentált RNS-genojtsú vírust kell előállítani, a találmány szerint célgenora egyes génjeinek megfelelő virális úDNS-í inzertáiuuk a találmány szerinti expresszié® plazmidfea, A találmány egy bsdírekcionálís plszmidalapú espresszíós rendszert tartalmaz, amelyekben vitális cDNS-t inzertáinnk RN5polímeráz-í (pol-í) promóter és termisátor szekvenciák közé (belső transzkripciós egység). Sitt a teljes pol-í transzkripciós egységet RNS-pöilmeráz-H (pol-H) promóter és polladenilációs hely szegélyezi (külső transzkripciós egység). Ismertetünk egy unidlrekeionáiís rendszert is, amelyben a poi-l és poi-H promóter leolvasással ellentétes irányban van a eBNS-en, és pozhlv-szensz sapkázatían oRNS-t (a pol-í promóterröl) és pozítívszensz sapkúzott mRNS-t (a pol-U promóterröl) hoz létre, A pnl-I promóter, pol-í terminátor szekvencits, poi-íí promóter és poll&deníiáeios szignált sz unidirekcíonáks rendszerben „leolvasással ellentétes - leolvasással megegyező irányítöttságúnak’' nevezhetjük. A találmány szerinti hidirekelonális rendszerben a pol-í és pol-Ii promóter a eDNS ellenkező végén van, ahol az leolvasással ellentétes irányban: lévő pol-H promófer poztífyszeasz sapkúzott tnRNS-t hoz létre, és a leolvasással megegyező irányban lévő pol-l promótsr öegatlv-szessz sapkázstlan virális RNS-t (vRNS) hoz létre. Ezek a poM-pol-íí reödszerek a két cefiuláris RNS-polimeráz enzim rtanszkripciójának snícíásiájávaí indulnak a saját prométerúkrőí, feltehetőleg a sejtmag különbőzó kompartmestjében. A pol-l promóter és pol-í íemrinstor szekvenciát a bidirekeionáus rendszerben „leolvasással megegyezd - leolvasással ellentétes irányfeotíságúnak’'' nevezhetjük, taíg a poWl promóter és poliadesilációs
- 13„* »!.♦ ··» ” szignált a bidírekeíonálís rendszerben „leolvasással ellentétes - leolvasással megegyező irányítottságúnak” nevezhetjük.
Ha a céív&us pozitív szálú szegmentált RNS-genomot tartalmaz, a poí-1 promóter előnyösen leolvasással ellentétes irányban helyezkedik el a cDNS-eo a belső transzkripciós egységben rtmidireketonális readsser). Ebben az esetben pozitív szálú RNS-í állítunk elő új vírusokba történő közvetlen beépítés végett. Azonban, amikor a eálviros negatív szálat tartalmaz, szegmentált RNS-genomot állítunk elő uasdirekcioaáBs rendszer alkalmazásával.
Ha a eélvírss negatív szálú-szegmentált RNS-genomot tartalmaz, a p©W prométer előnyösen leolvasással ellentétes irányban helyezkedik el a cDNS-en a belső transzkripciós egységben (hidirekcíonúlis rendszer). Ezen megvalósítási mód szerint negatív szálú RNS-t állítunk elő új vírusokba történő közvetlen beépítés végett. Ismertetjük azt is, -hogy, amikor a célvfois pozitív szálat tartalmaz, .szegmentált RNS-genontoí áffitaak elő a bidirekcíoxíális rendszer nikalmazásávaí.
A találmány alkalmazható olyan vírusok előállítására, amely ek fertőző és nem fertőző nem szegmentált negatív szálú RNS-genomot tartalmaznák. Általában fertőző vitális gesoróáfe- RNS -egyszerű bejuttatása gazdasejtbe -elegendő- a víráiis -életciklus iniciálására a sejtben, és teljes vírusok ebből következő előállítására. Például pikemavirus genotniális RNS-ének egyszerű bejuttatása gazdasejtbe. elegendő teljes píkomavirusok létrehozására. Nem fertőző genohriábs RNS-t tartalmazó vlras életciklusának iniciálásához tipikusan szükséges más viráiis fehérjék további bejuttatása, amelyek általában a genöíumal együtt a vltehs részecskében találhatók. Például a parasnfl«enzavúus4fí egy RNS-íüggő-RNS-puhmetert hordoz, amelynek & jelenléte szükséges az űjmesaa megfertőzött sejtben a vitális gesomiális RbiS implikációjához és vitelig raRNS-ek ttasszkripciójáboz; a poíimeráz hiányában a psralhSuesza-IB geaosúáhs RNS-e sem fertőző. Azon megvalósítási módok szerint, amelyekben fertőző nem szegmentált negatív szálú geaomlális RNS-t tartalmazó vírusokat hozunk létre, a találmány szerinti, két proaaőíert tartalmazó, a vitelig genomot tartalmazó míkleissavat hordozó expressziós plazmld bejuttatása megfelelő gazdagépbe elegendő teljes vírusok létrehozásához, Olyan megvalósítási módok szerint, amelyekben sem fertőző nem szegmentált geuomíálls RNS-t tartalmazó vírusokat hozunk létre, további expressziős píazmrdokat is be kell juttatni a gazdasejtbe & vitális genoraoí hordozó, két promótert tartalmazó expressziós plazróá mellett. A további plaamAak kell expresszálsia a víráiis életciklus iniciálásához szükséges fehérjé(ke>t, amelyek nonnálísao a fertőzéssel jutnak be a gazdasejtbe (például RNS-fÜggő-RNSpoltmerázok).
Olyan esetben, amikor fertőző nem szegmentált pozitív szálú RNSi-gesomet tartalmazó pikomavíruat hozunk létté, a teljes víráiis genomot tartalmazó cf>NS-t inzertáljak. a találmány szerinti két pramotert tartalmazó expressziós phzmidba, A külső transzkripciós egység leolvasással ellentétes irányban lévő proraóters, előnyösen pol-Π promóter irányítja a teljes vitells genomot tartalmazó pozitív szálú mRNS-ek előállításái, egy poisproísm, amely traavzlálódtk, és az egyedi felsérséfc lehasítódtíak és felszabadulnak a poBproteisrő! (például a poíiproíehtben lévő proteáz álján). Ha a vitális genom negatív szálú RNS-t tartalmas, egy második, leolvasással megegyező irányban lévő -promóter a belső transzkripciós egységben, (bídírekcionális rendszer), előnyösen pol-í promóter Irányúja a genom negatív szálú másolatának előállítását. Olyan eseteket is ismertetőnk, amelyekben pozitív szálú, nem szegmentált RNS-generaoí tartalmazó vírusokat állítunk elő az bídúekcionálís rendszer alkalmazásával, a találmány tárgykörébe tartoznak,
- 14 ...» ··
... »’·
Nem fertőző, nem szegmentéit negatív száló. RNS-genomot tartalmazó vírusok is előállííhatók a találmány szénát, amelyekben nem termelődik poliprotem. Például a találmány szerinti rendszer alkalmazható /Stódováiíáse vagy PmssrgtovHstee vhusók előállítására, előnyösen porsmflaenzavtros-ΙΠ előállítására, amelyeknek az éfetcSdasa normálisan több polteztrosas mRNS előáll ítását tartalmazza negatív .szálú gencmiálts KNS-ről a vlrálisan kódolt B-NS-Rlggő-RHS-polinteráz útján; a moöocísztronas mRNS-ekrői egyedi fehérjék expresszálődnak, Ezen megvalósítási módok .szerint egy pol-11 promőíert tartalmazó külső transzkripciós egység, irányítja a virális genom pölicisztronas, pozitív száló másolatának előállítását, amelyről általában csak az első gén (NP) trsuszlálódik, Ezeniélői egy poM promőtert tartalmazó belső tmnszkripdős egység irányítja a genom RNS másolatának az expxsssziőjái áj vírusokba történő beépítés «áljából Mivel a parassfiaenza-fíl víráks genómja negatív szálú KNS-t tartalmaz, a belső transzkripciós egység promőtere leolvasással megegyező irányban helyezkedik el. a cDNS-en (bidírskeioníUís rendszer). Ha a vitális genom pozitív szálé RNS-t tartalmaz, a belső tmtszkripci'Ős egység promótsre leolvasással ellentétes irányban helyezkedik el a cDNS-en (nnittírekcionálSs rendszer). Olyas eseteket is ismertetünk, amelyekben pozitív szálú RN:S-geaomot tartalmazó vírusokat állítok elő a bidirekcionáiis rendszer alkalmazásával. További vitális fehérjék (a polícisztrosos mRNS-ről expresszálódö fehérjéktől különbözőek) is szükségesek a transzkripcióhoz és replikáciöhoz (1, és P), és ezen fehérjéket egyedileg biztosítjuk különálló espressziés plazmidokon.
Ismertetünk olyas eseteket is, amelyekben kétszáíú szegmentált -RNS-genomot tartalmazó vkwokté állítunk elő. Ezekben az esetekben a vitális eélgesom egyes génjeit tertatetező plazísidökat inzertáUmfc találmány szerinti két prométert íartaLmszó expresszíós plazmádba, A plazmiá feidirekciosMis plazmid. A küké transzkripciós egység promőtere, előnyösen pol-U promóter irányítja az egyes gének mRNSAmnszkríptemán&k expresstíóját, amelyek a kódolt fehérjékké transzláiódoak. A belső transzkripciós egység promótere, előnyösen pol-J ppomöter irányítja a negatív szál (bídirekcionális rendszer) transztópciőját. Art követően & keletkezett eteti· szál tempiátíséat szolgálhat a komplementer szál előállításához a vitális RNS-polimeráz által. A kapott kétssálá RNS-íerméfc épül be áj vírusokba.
A minimális plazmldalaps rendszerből való két ín&enza-A. vírus,. az A/WSN/3d(i<lbll) és Á^«aVHK/W312Z97(HÓHÍ> előállítása bizonyította a rendszer alkalmazhatóságát. A fenotlpusosan megkülönböztethetetlen AW/8/34(HlNl) törzs - amely a standard snaktiváií lnfiaesza-A vakéba előállítására - előállítása bizonyitotia a rendszer alkalmazhatóságát vakcina fejlesztésére. 72 órával nyolc expressziéi ptenidaak együtt tenyésztett 293T és MDCK sejtekbe történő transziektálása után a transzfektált sejtek felblúszójának vímshozama 2 x Iti* és 2 x 19' fertőző vírus volt mi-enként, Ezt a nyrsfeplazmiáos rendszert alkalmaztuk A/'Teab'HKZW312''9?(HőNl) és A''WSN/33(.H1N1) közötti egyszeres és négyszeres átrendeződött vírusok létrehozására, és A/WSN/3 3 vírusok létrehozására tandem irányítottságé rendszerben (amely cRNS-t és mRNS-t is tennél).
Mivel a p»1-l-p©l~B rendszer elősegíti mind rekombiaáns, mind átrendeződött inímonza-A vírusok tervezését és előállítását, alkalmazható más vírusok teljes egészében klónozott cDHS-bői történő előállítására is. Habár cDNS előnyös a találmány szerinti alkalmazásra, bármilyen más típusú nukleinsav is alkalmazható, .amely az expresszálaadó víráll» gént kódolsa, ha a találmány lényeges elemeit megőrizzük. Példán! alkalmazhatók vitális géneket tartalmazó, PCR-rel amplífikálí: termékek vagy restrikciós fragmensek. Ezenkívül a találmány szerinti pl&zmidalspú rendszerben expresszált gének ftmonáítetva vagy címkézve lehatok más génekkel, mint például tisrtításkdetelrtálás! címkékkel (például gintation-S-íranszferáz, poljhiszíidín, zöld fluoreszcens $ φ *·♦ X * φ φ föhéne, mye-eímke és FLAG-cfcnfce). A találmány tárgykörébe tartóénak olyan megvaiósöásí módok is, amelyekben részleges génszekvenciákat alkalmazunk a találmány szerinti rendszerek piazmlájaifean.
Az alábbi táblázatban a találmány szerint előállítható negatív szálú RNS-virusok nem korlátozó példáit mutatjuk be:
-π-
8φΑ v V J ..................................-..............! ΓφΜ i ?riOT?oteto&Vte |
f ’'' ί íww lis Csfes Vitás 1..................................................................................................
l^im : V jteteeVi»
j. Áw« LtótitetooisgíústVb
j IhwgwA Ár»iA ^.,,,..,..0....^............................................... J)dUw HspatifcDehVta
♦«♦· «»1 «» ♦» ·♦
A ialáhnásy továbbá részben olyan bidsrekcfonátis transzkripciós konstrukció kifejlesztésén alapul, amely P82, PB1, PA, HA, NP, NA, M vagy NS gént kódoló virális cDNS-t tartalmaz, ssegélyezve RNS-poiímeráz~I (pol-l) pjwótenei vSNS szimézisáre, és a RNS-polimeráz-H (ρο!-Π) premóterrei virális mRNS szintézisére. Ezen megközelítési mód alkalmazhatóságát bizonyítja vírus keletkezése a polΙ/ροί-Π/ΡΒΙ koustmkció transzfektáiása «tárt együtt vRNS« és íehérjeexpresszíős konstrakciókkal a fennmaradó 7 szegmenshez, Mivel ezen megközelítési mód csökkend a vtius létrehozásához szükséges plazmidok számát, csökkenti a klónozáshoz szükséges munkát is, fokozza a vlruslétrehozás hatékonyságát, és kiterjeszti a reverz-genetikai rendszer alkalmazását olyat? sejtvonaíakrís, amelyekben 17 plazmád hatékony együttes transzfektálása nem lehetséges. Ismertetőnk továbbá egy tmidirekcíonálís transzkripciós konstrukció is. amely po!-! és pol-II promótert tartalmaz virális eDNS-t kódoló szekvenciától leolvasással ellentétes irányban. Mindkét prontóter közös leolvasással ellentétes - leolvasással megegyező trányöoítsághzn található a génhez viszonyítva. Habár a bidirekcionáils rendszer magasabb mfineuza-A vírusíiíert hoz létre, az onldirekcionális rendszer hasznos más alkalmazásokra (példás! más negatív száló virális törzsek előállítása).
Egy promóter, temsináíor vagy poliadenilációs szignál „leolvasással ellentétes irányban” található egy génhez viszonyítva, ha közel van a gén elejéhez (például az első ködöshöz) és távol van a gén végétől (például a íermináciős kódostól). Egy promóter, termísátor vagy· poliadenilációs szagnál „leolvasással megegyező irányban” található egy génhez viszonyítva, ha közel vsa a gén végéhez és távol van a gén eleiétől. A találmány szerinti plazmídokban lévő promőterek, amelyek működőképesen kapcsoltak a génnel, úgy vannak elhelyezve, hogy elősegítsék a gén szensz: vagy amíszensz szálának a transzkripcióját.
A leírás szerinti értelemben „expressziős píazmid” alatt olyas DNS-vektort ériünk, amely egy „belső transzkripciós egységet” és egy „külső transzkripciós egységet” tartalmaz. Amint fent tárgyaltuk, expressziós plazmidokat alkalmazhatunk bármilyen típusú RNS-virus létrehozására, előnyösen pozitív vagy negatív szálú RNS-vírusok, szegmentált vagy nem szegmentált genomú RNS-vímsok vagy kétszálú RNS-vírosok előállítására. A külső transzkripciós egység, tartalmaz egy promőtert, előnyösen pol-íl promótert, ami vitális cDNS-rÓl irányítja tnRN'S átírását, amely ír&uszlálhafo. A külső transzkripciós egy^g tartalmazhat T7 RNS-polimeráz promótert, T3 RN'S-pohmeráz promótert, SPó RNS-polkner&z promőtert, vagy bármilyen promőtert vagy genetikai elemek kombinációját, amely képes íraosziáibaíő RNS-tenoék expressziójának irányítására. Például a külső transzkripciós egység tartalmazhat pol-I vagy poi-Π promótert, ha a. virális C.Í3NS, amelyet expresszáhasl keli a plazmidról, génsebészeti hton úgy w módosítva, hogy poliadenilációs szignált tartalmazzon az átírt RNS 3’ végén. Ezt A-uakleottdok láncának beépítésével érhetjük el a cDNS kódoló szekvenciájának 3’ végété közvetlenül a sfopködon elé. Ezenkívül a virális· cDNS~t génsebészeti úton módosíthatjuk ágy, hogy „hrterttal Ribosomal Eairy Síié'* helyet (1RES) tariafaaazzzoa a cDNS 55 végén, hogy elősegítse a transzlációs mielációt az átírt RNS-rők Egy „belső transzkripciós egység” a találmány szerinti expressz.íós plszmidhsn a külső transzkripciós egységes belől helyezkedik el, és tartalmaz egy promótert, előnyösen pol-1 promótert, amely képes virális cDNS transiíkripcísiíának irányítására, amely repiíkáiható a virális gépezet által és új vírusokba építhető be. Előnyösen a belső transzkripciós egység promótere olyast RNS-t ír át, amely nem tartalmaz felesleges, nem virális Idegen szekvenciákat az 5' vagy 3’ végen, előnyösen a virális cDNS pontos fúziója révén a pol-I promóter és termisátor szekvenciákkal. Azonban a találmány tárgyát képezik olyan megvalósítási ****
Μ-.*'** * _ Φ '»*'♦ χ *** Jt * -A „19. .»»’·♦····’ módok, amelyek szerbit a belső írtmszkripclós egység olyan promótert tartalmaz, amely további 5’ és 3’ nem vitális szekvenciákat tartalmazó RNS-Uanszkríptamok előállítását irányítja (például peWl promöterek, pol-ílí premóíerek, T7 RNS-polimeráz promőtor, T3 RNS»poláaeráz protsólerek vagy SPS RN'S-polímeráz promóterek). Ezen megvalósítási módok szerint további szekvenciákat építhetünk be az expressziós plazmidba, .amelyek biztosítják, hogy a belső transzkripciós egységről keletkező RNS nem. tartalmaz felesleges nem vírális szekvenciát. Például az expresszlós piazmidoí génsebészeti úton módosíthatjuk úgy, hogy rihozim szekvenciákat tartalmazzon a belső transzkripciós egységről keletkezeti trssszkriptomok végein, és az átírt RNS ribozim részei oly módon hasítják a íranszkriptonot, hogy az RNS 5' és 3’ végei oly módos jönnek léire, amist -az vírus RNS-bea megtalálható. Ezenkívül sz expresszlós ptamdokat úgy «tódosíthatjak génsebészeti úton, hogy termínálor szekvenciákat tartalmazzanak, amelyek transzkripciós tersuinációí okoznak a vlráits cDNS kódoló szekvencia végénél, ezáltal megakadályozzák felesleges nem transziáiható szekvenciák beépülését az átírt RNS 3’ végén. Előnyösen az „expresszlós plazmád poM-poi-S rendszert tartalmazó DNS-veklor, így az ilyen piszmíd RNSpolimeráz-í (pol-1) promőter és pol-J íerntísátor szekvenciát tartalmaz, amelyek RNS-polhnetéz-í? (sxtíΠ) promőter és poliadöailácíős jel közé van inzertélva. A bidirekcíonális rendszerben RNS-polimeráz-1 promóter szabályozza a geaomíáíís negatív szensz sspkázatían RNS expresszióját {amit a leírásban „vRNS”-nek nevezőnk} a cBNS-ról, amely „astíszensz” irányítottságban van inzertélva a promóter és a terminálos· közé. Egy RNS-polimeráx-:ö promőter szabályozza a hírvivő RNS expresszióját; a poMJ promőter és políademlációs szignál közé szensz Irányítottságban inzertéit vírálís cDNS-génszegmens pozítív-szerssz s&pkázotí viráiis otRNS expresszióját eredményezi. Aieírásban szintén ismertetett unidirekcíonáiís rendszerben a vitális cDNS leolvasással megegyező irányban és szensz irányítottságban van mzertálva a pol-í és pol-Ö promóterekhez viszonyítva. A pol-Ö promőter Irányítja a pozidv-szenaz sapkázoíí vitális mRNS expresszióját, és 3 pol-1 promőter irányítja a pozitiv-szensz sapkázatian viráiis cRNS expressziőjái.
Egy pl&zroid tartalmazhatja egy másik alappiazmidnak „lényegében az egészéi”, ha sz atepplazmid összes génje és funkcionális nem kódoló régiója jelen van; Például a pusztán egy poiiiinker egy részletének eltávolításával, és egy idegen gén beillesztésével konstruált plazmíd lényegében az egészét tartalmazza az ttlapptézzsídnok.
„Negatív szálú RNS~virus” alatt olyan vírust értőnk, amelyben a vitális genom negatív szálú RNS-t tartalmaz» A negatív szálú RNS komplementer sz íuRNS-sel, és általában komplementer pozitív szálú mRNS-sé keli stmásolődni, hogy a. fehérjék íranszlálódjanak. Tipikusan ezen vírusok RNS-SlggÖRNS-polimerázt pakolnak az mRNS gazdasejt megfertőzését követően történő előállítására. Negatív szálú RNS-vírusok családjainak nem korlátozó példái közé tartoznak az ör/őeínyzoviririne, rirenov/Hítoe és Rn.py.<o’to?dne. Előnyősén a vitális genom olyan vírusból származik, amely az í?rfoő.eit-n'0VÍ>7dm; családjának a tagja, és optimális esetben szegmentált genomú, As riAtéo.>syx'ovtoto!ö'e család tagjainak nem korlátozó példái közé tartozik m tofíuenza-A, toíleenza-B, infíuenza-C, Tegetovírus, kanyaró és mumpsz vírus (paramőtovirux) vagy veszettség vírus (rabdovirtis), „Pozitív szálú RNS-vírus” alatt olyan vírust értőnk, amely pozitív szálú SNS-geoomot tartalmaz. A pozitív szálú RNS-virusok közé tartozik a poliovínts (pikornavirus). togavírusok és BavivíniSök. Ezért
-20a·** *·*· vírusok gemstóálts RN5~e az mRNS-sel megegyezően sasasz, és mRNS-ként funkcionálhat te vírusok szegmentált vagy nem szegmentált génemet tartalmazhatnak.
„Kéíszálű RNS-vírus” alatt olyan vírust értünk, amely kétszálú RNS-geaomot tartalmaz, A reovlrusok teétszálú RNS-virusok.
A virális genots tehet szegmentált vagy nem szegmentált (unítnoíektsláris), Egy szegmentált genom két vagy több nsktemsavat tartalmaz, amelyek mindegyike ©gy vagy több virális gént kódol. Előnyösen egy szegmentált genom külön nnkteinsavaí tartatom mindegyik génre. Az ortomixovírusok (tnfluenza-A, -B vagy -C vírus), feunvsvhtísak és arenavírnsok szegmentált KNS-genornot tartatomnak. Á nem szegmentált genom egyetlen saktemsavat tartalmas, amely tartalmazza az összes virális gént. A AffWWgafes vírusok, rabdovfrasok, Savjv&ösok, pikonmvírusok, ksmnavifttsok, togsvírasok és psmmisovtmsok nem szegmentált RNS-genomot tartalmaznak,
A kétszálu ÜHS»t „ásRNS”-nek rövidíthetjük. Az egyszálú RNS-í „ssRNS',*-aek rövidíthetjök. Az egyetlen, negatív -szálú RNS-t ,,-ssRNS”-aek rövidíthetjük. Az egyetlen, pozitív szálú RNS-t ssRNS”-nek rövidítheti ük.
„Virális génszegmens” alatt előnyösen klónozott cWS-t értőnk, amely megfelel RNSvírnsgenomből szánnazó genontíálls RNS-motekíilának, Ezen kifejezés alatt értünk bármilyen olyan gént vagy génszegmensí (például PCR-íenséket vagy restrikciós íragmenst), amely RNS-vírusből. származó gént tartalmaz, ,^<inimáiis plazmidalapú resdszer” alatt olyan rendszert értőnk, amelyben fent definiált expresszíős plszmid van, amely RNS-vírusból -származó autonóm virális genomíális szegrnenst tartalmaz. Így a virális genömiálís szekvenciái tartalmazó plazmidok Összes száma nem haladja meg a forrás RNSvírusban található génszegmensek összes számát A találmány tárgyát képezik, olyan megvalósítási módok is, amelyek szerint más plazmidokat, amelyek nem tartalmaznak virális szekvenciákat, együtt transzíékíáihatnnk a gazdasejíekbe. Ez szignifikáns előnyöket biztosít, a rendszernek a gazdasejtben történő létrehozásához szükséges plazmidok összes számának a limitálásával, elimináiva a segítő-vírus- szükségességét, elíminálva a szelekciós eljárás szükségességét, és tehetővé téve átrendezett vírusok hatékony létrehozását.
A találmány szerinti minimális plazmidalapú rendszerben bizonyos virális gének származhatnak olyan vírustörzsekből, amelyek jól adaptálódtak a sejttenyészethen történő nö vekedéshez, mint például & PR/8/34(HlNí) vagy W'SN/33(HINI) törzs, vagy származhatnak legyengített törzsből, mint például az A/Ann Árborió/úO(id2N2), vagy iafluenza-B esetés R/Ánn Arbor/lZőb. Előnyösen egy le^engitett törzs jól adaptálódott a sejttenyészetben történő növekedéshez Is. Közelebbről, az influenza-A esetében a plazmidalapú rendszerben előnyös virális géoszegmensek olyan törzsekből származó virális polímerázteomplex fehérjéket, M~fehérjéket és/vagy NS-fehrijéket kódolnak, amelyek jól adaptálódtak a sejtíenyászetben történő növekedéshez vagy legyengítettek, vagy mindkettő,. Ezen fehérjéket a. leírás szerinti értelemben „vitális belső fehérjéknek” vagy vitális „nem glíkoproteineknek” nevezzük.
Az lnflnenza-A vírus genomja tipikusan 10 különböző fehérjét kóáel: Fö2~t, amelyről azt gondolják, hogy' írtmszkripíáz, FBÍ-et, amelyről azt .gondolják, hegy íranszRrlptáz, FA-t, amelyről ezt gondolják, hogy íranszkriptás, HA-t, amelyről azt gondolják, hogy hemaggintísín, NP-t, amelyről azt gondolják, hogy RNS-köíS nnkleoprosetn, NA-t, amelyről azt gondolják, hogy neuraminidáz, Ml/M2~t, ame-21 * *·*» ***
Ivekről azt gondolják, hogy sorrendben mátrixfehéíje és integrálódott monsbránfehér^s, és NSI/NS2-Í, amelyekről azt gondolják, hogy nem szerkezeti fehérjék, amelyek az RNS-feidoígozást és transzportot befolyásolhatják. A Pöl-ről, PS2-röl, MP-rŐl és PA-ról azt gondolják, hogy részel az iaSum&vfros transzkripciós poiimeráz-komplexének.
A „sejdenyészeí” kifejezés alatt a leírás szerinti értelemben kereskedelmileg elfogadott eljárást: értünk vírus szaporítására vakeinagvártás céljából, példán! embriót tartalmazó tyúktojásokat, valamint ó? vkro gazdasejtben történő sejiíenyészetet (lásd Furmfogcr, „Textbook of Influenza”, szerk.: Nicholson, Webster és May, 24, fejezet, 324-332. -old,, különösen a 328-229. old,).
Hasonlóképpen a plazmidaiapó rendszer tartalmazhatja olyan antigének génszegmenseit, amelyek szükségesek védő immsttválasz létrehozásához. „Védő immunválasz* alatt Immorális (ellenanyag) vagy sejtes komponenst értünk, vagy mindkettőt, amely hatásos a virionok és fertőzött sejtek eliminálására immunizált (vakcináit) személyben, Így a védő immunválasz megakadályozhat vagy ehávolítbat egy RNS-vírus, például influenzavírus fertőzést. Előnyösen sz antigének „felszíni antigének·*; azaz a vírson felszínén vagy a fertőződ sejtek felszínén expresxzálódnak, Előnyösebben a felszíni antigének giikoprotsínek. Az influenza esetében az elsődleges glikopretein antigének a hemagglutínín (HA vagy H) és a senraminidáz (NA vagy N).
A leírás szerinti értelemben az „immanogén” kifejezés alatt azt értjük, hogy a polipepíid képes Immorális vagy ceiiuláris immunválasz, és előnyösen mindkettő kiváltására, Egv ímmtmogés entitás antigénfeatásó is, Immnnogén készítmény alatt olyan készítményt értőnk, amely immorális vagy ceiiuláris immunválaszt vált ki, vagy mindkettőt, amikor beadjuk állatnak. Egy molekula „antigénhatásáT. ha képes specifikusan kölcsönhatni az immunrendszer antigénfelismerő molekulájával, mint példán! immunglobulinnal (ellenanyag) vagy T-sejt antlgénreceptorral. Egy antigénhatásü polipepíid legalább körülbelül 5, előnyösen legalább körülbelül lö amiaosavból álló epitépot tartalmaz. Egy pohpeptid aníigénhaíásö részlete, amelyet a leírás szerinti értelemben epitőpnak is nevezünk, az a részlet lehet, amely ínmrundOmínáns ellenanyag vagy T-sejt-receptor általi felismerésben, vagy olyan részlet lehet, amelyet a molekula elleni ellenanyag, előállítására alkalmazunk az tmíigénhalásít részletnek hordozó poltpepÍK&ez ímtmmizálás céljára történő konjugálásával. Egy astigénhatásö molekulának nem kell önmagában ítnmtmogénnek fennie, azaz képesnek lennie immunválasz kiváltására hordozó nélkül.
A „patogén vírustörzs’* kifejezés alap a leírás szerinti értelemben olyan vírustőrzset értünk, amely képes betegséget okozni; előnyösen a vírus rajta van az Egészségügyi Világszervezet (WHO)> „Centers fór Disease C&atot and Prevemiofe' (CfeC) vagy egyéb közegészségügyi hatóság kurrens listáján a valószfeö keringő vírusokról. ilyen vírusok lehetnek a hepstitiszvírusok család, reovíms család, ortonüxovirna család,, pamaixövHs család, fílovíntsok család, homavímsok család, bunyavímsok család, arersavirusok család, koronavirusok család, polfovlrus család vagy rabdovlrus család tagjai. A találmány tárgyát képezi előnyösen Ilyen törzsekből származó elsődleges antigének inzertáiása plazmidslapü rendszerbe, amelyben a fennmaradó viráhs géneknek kívánt tenyésztési és/vagy iegyengitésí tulajdonságai varrnak, Így lehetővé teszik a megfelelő antigénhátierő vírus nagy mennyiségének előállítását vakcinagyáríás céljára. Például a humán parmSöeazav&u$«3 génjeit (nukleokapszíd gén, feszfoproteín gén, mátrix gén, fúziós gén, feemaggmhnta-neuratninidáz fehérjegét! és nagy gén) kényelmesen a találmány szerinti plazmidokba helyezhetjük parainílaeszavíms-3 virtonok előállítására.
így találmány szerinti uíőayös „átrendezett vírus” olyan vírus, amelyben a patogén vimstörzsböl származó aníigénhatásö fehérjéket kódoló génszegmetísekeí kombinálunk vitális polímeráz-komplexet vagy más hasonló géneket kódoló- génszegmeosekkel (példán! sem gfíkoprötein gének, beleértve Mgének és NS-gének), amelyek teoyészetheá való növekedéshez adaptált vírusokból származnak (vagy legyengített vírusokból). Az átrendezett vírus így hordozza a kívánt antigénhaíásü jellegzetességeket olyan háttérben, amely lehetővé tesz! a hatékony termelést gazdasejtben, amint fent leírtuk. Az ilyen átrendezett vírus kívánt víruscsira” virioöök előállításához vakemagyártásban (lásd Furmisger, mint fent).
A „gazdasejt” kifejezés alatt hsmtílyes organizmus bármilyen sejtjét értjük, amely szelektálva, sródoslíva, transzformálva, tenyésztve v&gy alkalmazva van bármilyen módon rekombsnáns RNS vtrionok, előnyösen negatív szálú szegmentált RNS virionok sejt általi előállítására. Gazdassjtek szemléltető, nem korlátozó példái közé tartoznak a „Madto-Darby Canin« Kidney” (MDCK) sejtek, VERŐ sejlek, CV'l sejtek, COS-i és COS-7 sejtek és SriK-i sejtek, példaként és nem korlátozásként. Egy specifikus- megvalósítási mód szerint tranziens együtt tenyésztés előnyős virionok előállítására. Az együtt tenyésztés lehetővé teszi fogékony sejtek, mint például 293T sejtek transzfektálását, majd vrralís növekedésre permisszív sejt, mini példán! MDCK sejt azt kővető fertőzését
Az „RNS-vírus virionok” kifejezés alatt olyan vírusrészecskéket értőnk, amelyek elsőre fertözőek a találmány szerinti plazmidalaptí rendszerrel transzfektált vagy együtt transzfektáh gazáasejtekből előállítva, ilyen rendszer vRNS-t és vitális fehérjéket termel (amelyek vitális mRNS transzlációjából származnak) fertőző vírusrészecskék (virionok) összeszerelését eredményezve,
A leírás szerinti értelemben „OS-vfrasra specifikus vakolna” alatt -olyan készítményt értünk, amely védő immunitást válthat ki RNS-vírus ellen, ha egy személynek beadjuk. A „vakcina” kifejezés alatt olyan készítményt értünk, amely vírust, inaktiválí vírust, iegyengííett vírust, hasított vírust vagy vitális fehérjét, azaz felszím antigént tartalmaz, amely alkalmazható védő immuaítás kiváltására befogadó személyben (lásd Furmioger, mint fent). Megjegyzendő, hogy ahhoz, hogy a találmány szerinti vakéba hatékony legyen, immunválaszt válthat ki a populáció egy részében, mivel bizonyos egyénekben nem alakul ki erős vagy védő immunválasz, vagy bizonyos esetekben semmilyen Immunválasz, Ez a képtelenség »2 egyén genetikai hátteréből eredhet, vagy ímmundeffeiens állapotból (akár szerzett, akar veleszületett) vagy immsaszuppresszióbáí (például ímsnnuszöppressziv droggal történő kezelés miatt szervkíiökődés megakadályozására, vagy aumimrmm állapot szuppresszálása). A hatásosságot állati modellekben állapíthatjuk meg.
Vakcina „védő dózisa’'' olyan mennyiség, amely egymagában vagy adjuvátsssal együtt hatékony védő imnomválasz kiváltására befogadó személyben, A védelem függhet a beadás htjától is, például intramuszkeiáris (amely előnyös ínaktíváit vakcina esetén) vagy íntranazális (amely előnyős legyengített vakcina eseten),
A „személy” kifejezés alatt a leírás szerinti értelemben olyan állatot értünk, amely RNS-vírussal fertőzhető, nem korlátozó példaként vízimadár, csirke, sertés és ember, Különösen a kifejezés alatt embert: értünk.
»«:« „Adjwáias” alatt olyan molekulát vagy készítményt értitek, amely potenciálja az ímmuuogénre adott immunválasz, Egy aájuváns „humán alkalmazásra elfogadfeatö”, ha gyógyászatilag elfogadható, Amint azt alább meghatározzuk. Adjuvánsok példáit bemutatjuk alább.
A leírás szerinti értelembe® az izolált kifejezés alatt azt értjük, hogy az adott anyagot eltávolítótok a natív környezetéből, például sejtből, így izolált biológia anyag lehet mentes bizonyos vagy az összes celhdáris komponenstől, azaz a sejt azon komponenseitől, amelyben a natív anyag a természetben előtörőül (például citoplazmatiktts vagy membrán komponens). Egy anyagot izoláltnak tekintitek, ha sejtextraktumban vagy feíülúszőban van jeles. Htíkietesav-molekslák esetében izolált nnklelssavak közé tartozik PCR-termék, izolált mRNS, eDNS vagy restrikciós fragmens. Egy másik megvalósítási mód szerint sz, izolált nukletesav előnyösen ki van vágva a kromoszómából, amelyben megtalálható, és előnyösebben nem kapcsolódik vagy nincs közei olyan nem kódoló régióhoz (de kapcsolódhat a natív szabályozó régióihoz vagy azok részleteihez), vagy más génekhez, amelyek leolvasással ellentétes vagy leolvasással megegyező irányban találhatók adói a géntől, amelyet az izolált nukleinsav-möfekula tartalmas, amikor a kromoszómában található. Egy még másik megvalósítási mód szerint az izolált nukleinsavhől hiányzik egy vagy több iníron. izolált nakleinsav-molekulák közé tartoznak plazmidokba, kozmidokba, mesterséges kromoszómákba és hasonlókba ínzertált szekvenciák,, azaz amikor az egy kunéra rekombináns nukfeínsav-kcmstrukcsó részét képezi. így egy speciíikus megvalósítási mód szerint rekombináns nuklemsav izolált nukisbsav. Egy izolált feltörje kapcsolódhat más fehérjékhez vagy nukleinsavakhoz, vagy mindkettőhöz, amellyel kapcsolatba® áll a sejtben, vagy sejtmembránokban, ha az membránkötött fehérle. Egy izolált organellura, sejt vagy.szövet el van távolítva arról az anatómia helyről, ahol megtalálható egy organizmusban, Egy' izolált anyag lehet tisztított, de nem fehétlenal az.
A „tisztított'’ kifejezés alatt a leírás szerinti értelemben olyan anyagot értitek, amelyet olyan körülmények között izoláltitek, amely csökkenti vagy eihnmálja nem rokon anyagok, azaz szsnnyezősnyagok jelenlétéi, beleértve azokat a natív anyagokat, amelyből az- anyagot, előállítjuk. Például egy tisztított víríon előnyösen lényegében mentes gazdasejtbeli vagy tenyészetheti komponensektől, beleértve szövettenyésztési vagy tojásfehérjéktől, nem specifikus patogénektől és hasonlóktól, A leírás szerinti értelemben a „lényegében mentes” kifejezést eljárásíiag alkalmazzuk, az anyag snalitlkaí tesztelésével összefüggésben, Előnyösen tisztított anyag lényegében mentes szennyezőanyagoktől, ha legalább 50% tiszta; előnyösebben legalább 90% tiszta, és még előnyösebben legalább 99% tiszta. A tisztaságot kromatognítiával, gélelektroforézíssel, immunológiai vizsgálati eljárással, összetétel elemzésével, biológiai vizsgálati eljárással és más, a szakterületen ismert eljárással értékelhetjük,
A tisztításra szolgáló eljárások jól ismertek a szakterületem Vírosrészecskéket ulirasztiréssei vagy ultraeentrifugálásssl tisztíthatunk, előnyösen folyamatos eentriftigálássai (lásd Furmmger, mint fent). Adás tisztítási eljárások Is lehetségesek, ős a találmány tárgykörébe tartoznak. Egy tisztított anyag kevesebb, mist .58%, előnyösen kevesebb, mint 75%, és legelőnyösebben kevesebb, mint 90% celteláris komponenst, tápkőzeget, fehérjét vagy más nemkívánatos kerapoHepst vagy szeonyezöanvagot (érteletnszernen) tartalmazhat, amellyel eredetileg kapcsolatban állt, A „lényegében tiszta” kifejezés azt a legmagasabb mértékű tisztaságot jelzi, amelyet el lehet érni a szakterületen ismert hagyományos tisztítási módszerek alkalmazásával.
V »** ί
X»*
-24’/ , ζ.
,»»» «»» ··
Egy specifikus megvalósítás! mód szerint & ..körülbelül” vagy „megközelítőleg kifejezés egy adott értékhez vagy tartományhoz 20%-ra, előnyösen 10%-ra és előnyösebben 5?ó-ra lévőt: jelent. Más megoldásképpen a biológíábsKi alkalmazóit logariímiküs kifejezéseket esetebes a ,,körtdbeiüí” kifejezés egy adott értéktől egy nagyságrenden belől levő jelent és előnyösen az értéktől fel nagyságrenden belül levőt.
Fbzmidalngó rendszerek génsebészete
A találmány szerinti értelemben a szakember számára kézenfekvő hagyományos molekuláris biológiai, mikrobiológiai és rekombisáns DNS módszereket alkalmazhatunk. ilyen módszereket részletesen ismertetnek a szakirodalomban. Lásd példád Sambrook, Friföcb és Mániát!», „Melecnlar Ctening; A Laboratory Manual”, második, kiadás, kiad.: Göld Spring Harbor Laboraíory Press, Goid Spriug Harbor, New York (1989) ( amit a leírásban Sambrook és mtsaí., 1989 néven nevezőnk); “DNA Cloning; A Praeücal Appmeh” 1, és Π. kötet (szerk.: D, Glover, (1985); “Olig&nudeotide Synibesis” (szerk.: M.3. Gall, 1984); Nudeie Add Hybridizatios [szerk.: B.D. Hamsa és S.J. Higgtas (1985»; „Traascriptlon And 'Traosiartoh” [szerk.: B.D. Hames és S.J. Higgins (1984)); „Animál Ceil Culture” [szerte,; R.L Freslmey (198ő)j; „Immobilized Ceils And Enzymes” [kiad.: l'PL Press (1986)}; “A Praetical Gnide te Moíecalar Cloníng” [szerk.*. B, Perbál (1984)): és Cement Froiocols in Moleeuía? Biology”, [szerk,; Ausabel, F.M. és mtsaí., kiad.: Joha Wüey & Sons, New York. N.Y, (1994)).
Ezen rutin módszerek alkaknazhstók a pöl-i-pol-Π rendszer előállítására, virális génszegmens eDNS-klónok izolálásra, ilyen DNS-ek plazmídökba történő ínzertálására, és sejtek ö-anszfektálására találmány szerinti plazmiddal vagy plazmidakpú rendszerrel, A heíyspecifikus motagenezis vagy gésmódosítás rutin módszerei lehetővé teszik az virális RNS gének, előnyösen negatív szálú szegmentált virális RNS gének módosítását legyengíted vírus kifejlesztése végett, amint alább bemutatjuk; vagy virális fehérjék előállítását, amelyek új epifópokat, például a nsumminidáz szárán lévőt tartalmaznak; vagy defektiv vírusok létrehozását.
DNS „amplifíkálásís a leírás szerinti értelemben poiimeráz-láncreakeíő (PCR) alkalmazását jelenti egy adott DNS-szekvescia menayiségénsfc növelésére DNS-szekveneíák keverékében, A POR leírásáért lásd Saiki és mtsai. közleményét [Science 239, 487. old. (1988)].
„Nukíeínsav-möíekuía” alatt ribonukieozádok (adenozíu, guannzin, anáia vagy cltsdín); ,,RNSmoiekolák”) vagy dezoxíríbonukleozídstk (dezoxíadenozín, dezoxiguanozm, dezoxitímidin vagy' dezoxfeltídm; „DNS-molekuiák”), vagy azok bármely toszfoészter analógjai, mint például foszforotíoáíok •és tíoészterek foszfát-észter polimer formáját értjük, akár egyszslú formában, akár kátszáíá hólíxhen. „Rekomhínáns DNS-molekula” olyan DNS-molekula. amely molekuláris biológiai manipuláción ment át.
„Pöiínukieodd” vagy „nukleolid szekvencia” aukfeoiiábázssok (amelyeket „sukleoddokuak” is nevezőnk) sorozata DNS-ben vagy RNS-ben, ás két vagy több nekfeofid bármilyen láncát jelenti, Egy* nuldeofidszekvetteb tipikusan genetikai införmsciót hordoz, beleértve a ceíhlárís gépezet által fehérjék készítésére szolgáló információt.
A leírás szerinti polinukieoadok&í heterológ szekvenciák szegélyezhetik, például promóterek, „internál rtbosome entry síte” helyek j'lRSS; Ghattas és mtsai, Mól. Ceil. Siói. 11, 5848-5859. old. (1991)), és más riboszómaköíö szekvenciák, enhancerek, válaszelemek, szuppresszsrok, szignálszekvenciák, poliartemiácíós szekvenciák, íntronok, 5' és 3 nem kódoló régiók, ás hasonlók. A snklein»25- »»» ....·· savakat mőáosítha^uk a szakterületen ismert sokféle módszerrel. Ilyen módosítások sem korlátozó példái közé tartozik a metíláciő, sapkák11, mint példáét 5'-7-m£tlI-G(5’)ppp(5‘)N sapkák, egy vagy több természetben előforduló oukleotíd szubsztitúciója analóggal, és íntemukleotid módosítások. Folmnkleotidok tartalmazhatnak egy vagy több további kovalensen kötött molckularészt, mint például fehérjéket (például nukleázok, toxinok, ellenanyagok, szignáípeptiáek, polí-I-iizin, stb.), ioterkalálődó szereket (például akndm, pszoralén, stb.), kciátorokat (például fémek, radioaktív fémek, vas, oxiáatív fémek, stb,), és alkilálószereket A poíintíkleotidokst szármsztafeatjok tnetíl- vagy edl-foozfotríészterek kialakításával, vagy aikil-feszforamídítok kapcsolásával Ezenkívül a leírás szerinti pohnukleotidokat módosíthatjuk olyan jelölöany&ggal, amely képes detektálható jel biztosítására, akár közvetlenül, akár közvetve. Szemléltető jelölöany&gok kézé tartozóak rsdíolzoíópök, fluoreszcens molekulák, bioim, és hasonlók.
„Kódoló szekvencia” vagy expressziós terméket, mint például polipeptidet ..kódoló” szekvescia olyas nukleotidszekveucia, amely ·- amikor expresszálödík - a pohpeptíd termelését eredményezi, azaz a nukleotídszekvencia a poiipeptid aminosav-szekvencíáját kódolja. Feltétje kódoló szekvenciája stankodont (általában ATG) és stopkodont tartalmazhat.
A „gés”, atás néven „srukturálís gén** kifejezés alatt olyan DNS-szekvenciát értünk, amely egy vagy tObb poiipeptid egészét vagy egy részét alkotó amsnosavak adott szekvenciáját kódolja vagy annak felel meg, és vagy tartalmaz, vagy sem szabályozó DNS-szekvenciákat, mist például promőter szekvenciákat, amelyek meghatározzák például szókat a körülményekek amikor a gén expresszáiődík.
Ezenfelül a találmány lehetővé teszí RNS-vírus génszegmensek, előnyösen negatív szálú RNSvírus génszegmensek különféle mutánsainak, konzervatív szekvermlavariássatnak és fűnké ionáiísatí konzervatív variánsainak alkalmazását, feltéve, hogy az összes ilyen variáns megtartja a szükséges nnmasológtál védöhatását. Sőt a találmány előnyösen lehetővé teszi mutagenszss alkalmazását legyengíteti virastörzsek szisztematikus módon történő kifejlesztésére.
A „mutáns” és „mutáció” kifejezések alatt bármilyen detektálható változást értünk a genetikai anyagban, például DNS-bsm vagy bármilyen folyamatot, mechanizmust vagy ilyen változás eredményét, Ezek közé tartoznak génmatációk, amelyekbe» a gén szerkezete (például DNS-szekvenciája) megváltozik, bármely gén vagy DNS-szekvenda, amely bármilyen mutációs .folyamatból keletkezik, és bármilyen cxpressziős termék (például fehérje), amelyet módosított gén vagy DNS-szekvencla. expresszál. A „variáns” kifejezést is alkalmazhatjuk módosított gén, DNS-ssekvsncia, enzim, sejt, stb. jelzésére, azaz bármilyen fajta mutáns jelzésére, Mutációkat random muiagenezls módszerekkel építhetünk be, vagy hslyspeeíflkus mutagenedssel, beleértve a PCR-alapú szekvsndamódosítáat. Amint fest megjegyeztük, és részletesen tárgyaljuk alább, RNS-vfess (például negatív szálú szegmentált RNS-vírus) egy vagy több egyedi génszegmensének mutagenezlse lehetővé teszi legyengített vírusok előállítását, valamint a legysngiíési mechanizmus snegvílágítását. Ezenkívül a találmány szerinti píszmitíáktpú rendszer elhárítja a korábbi kísérletek hátrányait legyengített vírusok muiagenezissel történő előállítására, mist például egy hatékony szelekciós rendszer szükségességét (lásd öilsel és Kawaoka, „Textbook of Influenza, szerit; Nicholsoo, Webster és May, 32. fejezet, 422-434. old., különösen a 423-425. old.).
Polinakieoíld-szekvescis „szekvencis-konzervatív variánsai” olyanok, amelyekben egy vagy több nukleotid cseréje egy adott kodonpozícióban nem eredményez változást sz adott pozíció állal kódolt aminosavban. Az aífelíkus variánsok lehetnek szekvestcia-konzervatív variánsok.
*»*♦ * * * *
«·♦♦
-26„Fuítkclé-konzeta'atív variánsok” azok, amelyekben egy fehérje vagy enzim adott aminosíívát snsgválíozíataík anélkül, hogy megváltozatnánk a polipeptid általános ksníbrmáciöját és funkcióját, nem korlátozó példaként beleértve egy atninesav helyettesítéséi egy hasonló tulajdonságúval (mint például polaritásával, hidísgénkőtési potenciálúval, savasságával, bázikusaáguvtd, hidroféhltásúvai, sromússágúvai és hasonlóval). Bizonyos ailelikns variánsok iunkckfekonzervaísv variánsokat eredményeznek, például egy aorinosav-szubsztitúció sem változtatja meg drámaian a fehérje funkcióját Hasonlóképpen, homológ fehésjék lehetnek fenkció-kenzervatlv variánsok. Hasonló tulajdonságú arnrnosavák jól ismertek a szakterületen. Például sz arginin, bisztidm és ilrin hidrofíi-báztkes amteosavak, és felcserélhetök. Hasonlóképpen, az izoieucln, amely egy hidrofób aróaosav, helyettesíthető leueűmak meiiorannal vagy váltónál. Ilyen cseréknek várhatóan kicsi vagy semmilyen a hatása a fehérje yagy polipeptid látszólagos molekulatömegére vagy izoelektromos psagára. A koazerváltaak feltüntetettektől eltérő asmes&vák. különbözhetnek egy fehérjében vagy msimben úgy, hogy a százalékos fehérje vagy aíuiHosav-szekvencbt hasonlóság bármely két, hasonló funkciójú fehérje között változhat, és lehet például 70-99%, amint azt egymás alá rendezési sémával meghatározhatjuk, mist például a „Cluster Melhod” éljárassal, ahol a hasonlóság a „MEöÁLl'GN” algoritmuson: alapul. Egy „ftmkeió-konzervatív variáns’' lehet olyan polipeptid vagy enzim, amelynek legalább őö% az atninosav azonossága, a BLAST vagy FASTÁ algoritmussal meghatározva, ahol a paraméterek úgy választjuk meg, hogy a legnagyobb Illeszkedést adják a teszteli szekvenciák között a referencia teljes hosszúságára vottatkoriatva» előnyősért legalább 75%, legelőnyösebben legalább 85%, és még. előnyösebben legalább 90%, és amelynek ugyanolyan vagy lényegében hasonló tulajdonságai vagy funkciói vaunak, mint a natív vagy szólói fehérjének vagy enzimnek, amelyhez hasonlítjuk.
A leírás szerinti értelemben a „homológ” kifejezés az összes nyelvtani formájában és változatában a „közős evolúciós eredetti” fehérjék közötti rokonságát jelenti, beleértve szupercsaládokbél (például immunglobulin szupercsalád) származó fehérjéket és különböző fajokból származó homológ fehérjéket (például míozin könuyá lánc, stb.) (Reeck és mtsai., Ceil 50, óó7. old, 09$?)}, Ilyen fehérjék (és sz azokat kódoló gének) szekvenciája, homológ, amint azt szekveuciahasonlőságtík tükrözi, akár a százalékos hasonlóság, akár a specifikus oidalláneok vagy motívumok jelenlété vonatkozásában.
Ennek megfelelően a „szekvencsahasonlóság” kifejezés az összes nyelvtani formájában az azonosság mértékét vagy megfelelőségét jelenti olyan fehérjék nuklemsav- vagy aminosav-szekvenciája között, amelyek közös evolúciós eredetűek, vagy sem (lásd Reeck és ntísai., mint fent). Azonban & köznapi használatban és a leírásban a „homológ” kifejezés, kiegészítve jelzővel, mint például „nagyon”, szskvenclnh&sonlóságra atal, és vagy utál közös evolúciós eredetre, vagy sem.
Egy specifikus megvalósítási mód szerint két DNS-szekveneia „lényegében homológ” vagy „lényegében hasonló”, ha elegendő számú nuklcotíd illeszkedik a DH'S-szckvenciák teljes hosszúságára vonatkoztatva althoz, hogy tnsgkülönböztethesstik a szekvenciákat más szekvenciáktól, aatíat az szekveseia-összehasosiíió algoritmusokkal, mint például BLAST, FÁSTA» PÁTI SHsfer, és más algoritmusokkal meghatározható, amikor a paramétereket úgy választjuk meg, hogy a legnagyobb illeszkedést adják a tesztelt szekvenciák között a referescsaszekvencía teljes bosszúságára vonatkoztatva. Lényegében homológ szekvenciákat a szekvenciák összeírásos (kásával azonosísbaísnk szekvencia-adatbankokból hozzáferheíö szokásos szoftver alkalmazásával, vagy Soníbern-híbrídízáctös kísérletben például • 27sztringess körülmények között, amint az egy adott rendszerben definiálva van, Ilyen sztringens körülmények ismertek a szakember számára, és megtalálhatók a „Current Proíecois is Mofecul&r Sielogy” etrnü könyvben [kiad.: John Wfiey & Sess, N. Y. (19§9), 6.3,1-6.3.6. old,} Sztringess hibridizációs körülmények nem korlátozó példája hibridizáció 6X n^iö5a-klorídZná.fes«m-ciaát (SSC) puíferbeo körülbelül 45eC~on, majd egy vagy több mosás 0,2 X SSC, 0,1% SDS pufferben 50*C-om előnyösen 55cC-on, és előnyösebben 60 vagy 65°C-oo.
Hasonlóképpen egy előnyös megvalósítási mód szerint két aminosav-szekveatcia „lényegében homológ” vagy „lényegében hasonló”, ha elegendő számú amínosav azonos vagy hasonló (fhnfceiönáhsan azonos) egy meghatározott hosszúságra vonatkoztatva ahhoz, hogy a szekvenciákat megkülönböztethessük más szekvenciáktól. Előnyösen a hasonló vagy homológ szekvenciákat egymás alá rendezései azonosítjuk, példán! a öCG programcsomaggal (Genetles Computer Group, Program Manual fór the GCG Pnckage, Version 7, Madssos, Wlseossm), vagy bármilyen főnt leírt programmal (BLAST, FASTA, stb,), A BLAST algoritmus vonatkozásában az alábbi közlemények hivatkozás útján a kitanltás részét képezik: BLAST ALGORITMUS: Altscfeul, S.E., Gísh, W„ Miller, W., Mvers, E.W, és Lipman, DJ., L Mól, Bioi. 215, 403-4 Ifi. old. (1990); Gish, W, és States, DJ,, Natúré Génét. 3,266-272. old, (1993): Maddeo, T.L., Tatusov, S..L. és Zfeaog, L, Meih. Enzystol. 2őő, 131-141. old. (1996); Aliséból, S.F.., Madden. T.L., ScfeaíTer, A.A., Zbang, L, Zfeaog, 2.» Miller, W. és Lipsnan, DJ., Noeleie Acids Rés, 25, 3389-3402, old. (1997); ..Zhang, J. és Madden, T.L., Genoros Rés. 7, 649-656. old. (1997); Wöotton, LC. és Féderben, S,,. Comput. Chem, 17, 149-163. old. (1993); Hancock, J.M. és Artusfe-ong, J.S., Comput Appl, BfoseL 10, 67-7Q. old, (1994)', EGYMÁS ALÁ RENDEZÉSI PONTOZÁSI RENDSZEREK:: Dayhoff, M.O., Sehwartz, R.M. és Orcutt, B.C. ”A model of evolutronsry cfeange in proteüss., Átlss of Proton Seqnenee and Strueture”, 5. kötet, 3, kiegészítés, 345-352, old., stó.: M.O. BayhoíT kiad.: Natl. Btomed. Rés. Fonod., Washington, BC (1978); Sehwartz, R.M. és Dayhofí, M,O,, Matríees fór áetectlng disíant relaíionshipsT, Aüss of Protein Seqnenee and Struetere”, 5. kötet, 3, kiegészítés, 353-358. old,, szerk.: M,O. DaybofL kiad.; Natl Bíomed. Rés, Fossd., Washington, DG (1978); Altscfeul, S.F., J. Mól, Bioi 219, 555-565. old. (1991); States, DJ., Gish, W., AlBehui, S.F., Methods 3,66-70, old. (1991); Hsm&oíÉ S, és HenikoíT, LG., Proc. Natl. Acad. Set, VSA 89, 16915-16959. öld. (1992): Alisokul, S.F., 3. Mól. Evői. 36, 290-300, old. (1093); EGYMÁS ALÁ RENDEZÉSI STATISZTIKA: Karib» S. és Altsehöl, S.F., Proc. Natl Acad. Sói, USA 87, 2264-2268, old, (1990); Karira, S. és Altschnl, S.F., Proc. Natl. Aead. ScL USA 90» 5873-5877. old, (1993); Demba, A., Ksrlm, S. és Zeiíoum, O„, Aun. Prob.. 22, 20222039. öld. (1994) és Aitsehük S.F., Evaluating ífee statístleal significaacé of multíple distinet local alígnments.”, Theoretical and Cömpatational Methods írt Geaotne .Researeh.”, 1-14. old., szerk.: S. Syhai, kiad,: Plenum, New York (1997).
„Promóter szekvencia” olyas DNS szabályozó régió, amely képes RNS-polímeráz kötésére egy sejtben, és képes szekvencia transzkripciójának iniciálására. A találmány vonatkozásában egy eDNS-ea leolvasással ellentétes irányban lévő promőter szekvencia a 3’ végével kötődik a transzkripciós iniciációs helyhez, és leolvasással ellentétes irányban <SS irányban) elnyúlik, hogy tartalmazza a hártér felett detektálható mértékű transzkripció iniciálásához szükséges mbsmálís számú bázist vagy elemet. Egy' cDNS-est leolvasással megegyező irányba» lévő promőter szekvencia [(-) RNS expresszálásáral az 5’ végével kötődik a transzkripciós iniciációs helyhez, és leolvasással megegyező íránybau (3’ irányban) elnyúlik, hogy
X *
- 28 *♦♦♦ χ· *
Μ* tartalmazza a háttér felett detektálható mértékű transzkripció iniciálásához szükséges mmímáíis: számú bázist vagy elemet, A találmány szerinti bidirekcionálls rendszer turtsimaz míad leolvasással ellentétes irányban, mind leolvasással megegyező irányban lévő promótereket; az ismertetett uniáirekeionáli» rendszer csak leolvasással ellentétes irányban lévő promótereket tartalmaz. A promóter szekvencián belül találhatók a transzkripciós iniciációs hely (amelyet kényelmesen például S1-nukieázzai térképezhetünk), valamint fehérjekötő bőmének (konszenzus szekvenciák), amelyek az RNS-poimteráz kötéséért felelősek.
Bármilyen ismeri promóter alkalmazható a találmány szerint, mindaddig, amíg a találmány eszszeaciális elemest megőrizzük. Például az alkalmazható, génexpresszióí szabályozó pol-Π promóterek ssem korlátozó példái közé tartozik a eiíomegafovirus (CMV) promóter (5 385 839, és 5 168 Ü62. számú amerikai egyesüli államokbeli szabadalmi irat), az SV4Ö kém promóterrégió [Benoíst és Chmnbon, Natúré 290» 304-319, old. (1981)], a Rous-szarkórnavírus 3' bosszú terminális ismétlődésében található promóter fYamamoío és Húsai., CeH 22,787-707. old, (1980)], a herpesz timsdm-kináz promóter (Wagner és natsax., Proc. Na.il, Acad. Ser, USA 78,1441-1445. old, (1981)), a metallotionein gén szabályozó szekvenciái (Brinsier és mtsah, Natúré 296, 39-42, old, (1982)]; T7 RNS-polímeráz promóterek; T3 RNSpollmeráz prsmóíetek; SP6 RNS-polimeráz pröurőterek és más, a jelentőséggel biró gasdasejtben működőképes promóterek. Sapkázatlan RNS expressziőjára szolgáló pol-i promóterek általánosan elterjedtek az összes euksriótáhan, és közéjük tartozik a humán poí-i [lásd „Molecular Ceíl Biology”, szerk.: Daraeli és misak, 31 U> 365-3ŐÖ. old, (1986)]. RbiS-polútteráz-ÍB. promóterek szintén alkalmazhatók a találmány szerint
Egy kódoló szekvencia transzkripciós és transzlációs szabályozó szekvenciák (például pol-í vagy pol-il promóter) „szabályozása alatt áll” „funkcionálisan kapcsolt” vagy „működőképes kapcsolt” azokkal egy sejtben, ha RNS-polúneráz átírja a kódoló szekvenciát RNS-sé, például rnRNS-sé vagy vRNS-sé.
Az „expresszál és „expresszié” kifejezések a génben vagy DNS-szekveueíábatt lévő információ ki fejeződésének lehetővé tevését vagy okozását j e lentik, például RNS termelését (beleértve cRNS, vRNS és virális mRNS termeléséi}, vagy feltörje termelését a megfelelő gén vagy DNS-szekvencía transzkripciójában vagy transzlációjában részt vevő cellulárís funkciók aktiválása révén. Egy DNS-szekvencia úgy expresszálódík egy sejtben vagy sejt által, hagy „expressziős termék, mint például fehérje keletkezik. Azt is mondhatjuk, hogy magát az expressziős terméket, például a kapott fehérjét a sejt „expresszálja”.
A „tenszfekeiö” kifejezés idegen nnklemsav sejtbe történő bejuttatását jelenti, oly módon, hogy a gazdasejt expresszálja a bejuttatott gént vagy szekvenciái, a bejuttatott gén vagy szekvencia által kódolt kívánt polipeptidet előállítva. A bejuttatott gént vagy szekvenciát nevezhetjük „klónozott vagy „idegen” génnek vagy szekvenciának, és lehet szabályozó vagy kontroll szekvencia, mint például start, stop, promóter, szignál, szekréciós vágy a sejt genetikai gépezete által alkalmazott más szekvenciák, A gén vagy szekvencia tartalmazhat nem funkcionális szekvenciákat, vagy ismeretien fenkciojú szekvenciákat. A bejuttatott DNS-t vagy RNS-t befogadó és expresszáló gazdasejt „íransztbrtnálva” lett, és „transzformáns” vagy klón”, A gazdasejtbe bejuttatott DNS vagy RNS bármilyen forrásból származhat, beleértve a gazdasejttel azonos nemzetség vagy fej sejtjeit, vagy különböző nemzetség vagy faj sejtjeit.
Á „vektor”, „klónozó vektor” és „expressziős vektor” kifejezések alatt olyan hordozóeszközt értünk, amely által DNS-f vagy RNS-t (például idegen gént) hejuttsthatttnk gazdasejtbe, oly módon, hogy ·»♦ ϊ ízanszfőrnriljuk a gazdát, és elősegítjük a bejuttatott szekvencia expresszióját (például transzkripcióját és írasrszláeióját), A találmány szerinti előnyős vektorok plszsnldok,
A vektorok tipikusan egy átvihető égess DNS-ét tartalmazzák, amelybe idegen DNS-t rnzerlálunk. Gyakori mód DNS egy szegpsensének inzertáiására egy másik DNS-szegsnerssbe az, hogy restrikciós enzsaeköék nevezett enzimeket alkalmazunk, amelyek a DNS-t specifikus helyeken («ukieetidofc specifikus csoportjainál) hasítják, amelyeket restrikciós helyeknek nevezünk. „Kazetta alatt olyan DNS kódoló szekvenciát vagy DNS-szegmcnst értőnk, amely sxpressziós termeket kódol, és amely beilleszthető egy vektorba meghaferozött restrikciós helyeken. A kazetta restrikciós helyeit úgy tervezzük meg, hogy biztosítsák a kazetta megfelelő leolvasási fázisban történő 'mzetciőját. Általában idegen DNS-t a vektor DNS egy vagy. több restrikciós helyén inzertáhmk be, és azután a vektort gazdasejíbe juttatjuk be az átvihető vektor DNS-ével együtt, Hozzáadott vagy· hemzertált DNS-szegmenst vagy szekvenciát tartalmazó DNS-t, mist például egy expresszíós vektort „DNS-kosstrukciónak is nevezhetünk. Vektor gyakori típusa a „plazmlá”, amely általában egy· önálló, rendszerint bakteriális eredetű, kétszálű DNSmole&ula, amely ktkmyen befogad további (idegen) ONS-t, és asssely könnyen bejuttatható alkalmas gazdasejtbé, Plaztnidvektor gyakran tartalmaz kódoló DNS-t és preméter DNS-t, ás egy vagy több, idegen DNS bejuttatására alkalmas restrikciós helyet A. kódoló DNS olyan DNS-szskvencsa. amely egy adott fehéíje vsgy esrzíxu adott aminosav-szekvenciát kódolja. A promótsr DNS olyan DNS-szekvencis, amely inidélja, szabályozza vágj’ másképpen befolyásolja vagy kontrollálja a kódoló DNS expressziójáí. A promóter DNS és kódoló DNS lehet ugyanabból a génből vagy különböző génekből, és lehet ugyanabból vagy különböző organizmusból. feekonrbíháxss klónozó vektorok gyakran tartalmaznak egy vagy több replikációs rendszert klónozáshoz vagy expresszióhoz, egy vagy több, gazdában való szelekcióra szolgáló markert, például antibiotikum-rezisztenciát, és egy -vagy több expressziós kazettát.
Az „expressziós rendszer” kifejezés alatt gazdasejtet és kompatibilis vektort értőnk megfelelő körülmények között, például a vektor által hordozott idegen DNS által kódolt fehérje expressziőjára, és bejuttatva a gazdasejíbe.
A „heterológ” kifejezés riad természetben nem együtt előforduló elesnek kombinációját értjük. Például heterológ DNS aktit olyas DNS-t értünk, amely nem a sejtben, vagy nem a. sejt kromoszómáKs helyén helyezkedik el a természetben, Előnyösen a heterológ DNS a sejt számára idegen gént tartalmaz. Heterológ expressziét szabályozó elem más génnel működőképesen kapcsolt elem, mint asxsivel az működőképesen kapcsolt a természetben, A leírás szerinti értelemben szekvenciák klóniárából származó szekvenciát tartalmazó poiipeptídet kódoló gén heterológ ahhoz a vektor DNS-hez viszonyítva, amelybe klónozáshoz és exprcsszáítntáshoz ínzertáltak, és betérőkig az ilyen vektort tartalmaz gazdasejtbez viszonyítva, asnelyben cxpresszálódlk.
Amint fesd snegjegyestők, a taláhsrány lehetővé teszt átrendezett vírusok létrehozását beíerológ vitális gének alkalmazásával. Amellett, hogy vitális antigének génjeit építjük be tenyészethet* való jó növekedéshez adaptálódott virustörzs gestelíkai bsátíerébe, a találmány lehetővé teszi fejők közötti átrendeződések létrehozását, például influenza-E antigént inflnertza-A háttérben.
Ülfeiuák
Amint fent megjegyeztük, a találmány tárgya hatékony és gazdaságos stratégia RNS vitális fertőzések, előnyösen negatív szálú RNS-víms fertőzések kezelésére és megelőzésére alkalmas vakcinák
-30előállítására. A raláímány szerbú mmitaö-& plazmidaiapü rendszer eímúnáíja a szelekció szükségességét, és biztosítja az átrendezett vírusok száras szabályozását.. Inaktívált influenza vakéba elöállifásóhuz magas hozamú törzs [péktel KV8/34(Hmi)J sem glskoproíein szegmenseit (PB1, PB2, PA, NP, M és NS> tartalmazó hat plazmiáot együtt transzfekíálhafunk. két expressziéi plazruiddal, amelyek a javasolt vakcina altípus HA és NA eDNSfeí tartalmazzák. Mivel nincs szükség segítövirusra, a keletkezett vlrns a kívánt genetikai összetételű xsftejzavfeas. Analóg megközelítési módot alkalmazhatunk bármilyen fajta inaktivsi.it, átrendezett BNS-vírus előállításra, vakcinában történd alkalmazás végett Célvirus génszeg» mécsét (például nem gUkoprotein szegxaesseket) tartalmazó expresszsős plazmídokafc együtt transzfekíálhtstunk más, adott fertőző virális altípusnak (például a jelenleg a populációban cirkuláló virális altípusnak) megfelelő fehérjéket kódoló expressziós plazmidokfcal. A találmány szerint előállított vírust vukcináiásra alkalmazhatjuk hagyományos vagy új megközelítési módokban (lásd Bllsei és Kawaoka, „Textbook of isfíuenza”, szerk.: Nicbolson, Webster és May, 32. fejezet, 422-434. old.), különöse® élő, legyengített vakcinák' kifejlesztésére (amelyeket részletesebben tárgyalunk alább). Közelebbről, a találmány kiküszöböli a jelenlegi technológia hiányosságait, az átrendezett vírusok kifejlesztésénél előforduló korlátozott gazdatartomány és megjósolhatatlan iegyengítés vonatkozásában (ugyanott).
Sok kísérlet történt ioftenxavakcmák kifejlesztésére (lásd Wood és Williams, „Tcxífeook of Influenza”, szerk,: Mfeholson, Webster és May, 23, fejezet, 317-323. old.). Míg ezen fejezet nagy része az mSuenzavakctnákkaí kapcsolatos, a találmány oltalms kőre kiterjed az összes negatív szálú szegmentált RNS-vírus vakcinákra, és különösen az onomixovírus vakcinákra.
Háromfelé isakííválí isílaenzavakcms kapható jelenleg: teljes vírus, hasított termék és felszíni antigén vakcina (lásd Wood, „Textbook of Influenza”, szerk.: Nicholso®, Webster és May, 25, fejezet, 333-345, old,), Mivel a találmány lehetővé teszi kívánt, tenyészetben elfogadható növekedési jellemzőkkel bíró átrendezett vírus gyors kifejlesztését, előnyőse® pozícionálja a vakclnagyártöt elegendő mennyiségű vakcina előállítására, hogy eleget tegye® a közegészségügyi szükségleteknek, és biztosítsa a síarsdardizálási, ami fontos előírás, amelyet jelenleg egy vakcina klinikai mennyiségeinek előállításának szükséglete mérsékel, gyakran S-P hónapos' időszak alatt (Wood, mini fent, 333. old,),
A vakcina biztonságossága szintén fontos (lásd Wtselka, „Textbook of Iníhrenza”, szerk.: Niehoíson, Webster és May, 26, fejezet, 346-357. old.). Mivel a találmány szerinti vakcinák lehetővé teszik a termelést meghatározott sejíteayészíési rendszerben, azokban nincsenek nem specifikus paíogének, baktériumok és aiíergén fehérjék, amelyek jelen lehetnek a kereskedelmi forgalomban kapható, embriót.tartalmassá- tojásokban előállított vakcinákban.
Adjuvássokat alkalmaztak vakcinákba® (például innuenzavakcinákban) (Wood és Williams, mini fent). Az „adjuváns” kifejezés alatt olya:® vegyületet vagy keveréket értünk, amely fokozza az antigénre adott immunválaszt. Egy adiuváus szöveti depóként szolgálhat, amely ta szabadítja fel. az antigént, és szolgálhat nyírökrendszeri skúváterkéni is, -amely nem specifikusa® fokozza az immunválaszt [Hood és tnísai., „ímmunofegy”, 2. kiadás, 384. old., kiad,: BenjamífeCutntmugs, Menlo Park, Catttorala (1 P84)j. Oyalera® az antigénnel való, adjuváns nélküli első kihívás nem elegendő immorális vagy ceiiuiáris immunválasz kiváltására. Adjuvánsok nem korlátozó példái közé tartozik a komplett Frenud-adjuváns. Inkomplctt Frenad-adjuváss, szapoain, ásványi gélek, mint például alumínium-iúdroxíd, felületaktív anyagok, mint példán! lizoiecttin, pluronikus pölioiok, polianíonok, peptidek, olaj vagy szénhidrogén
-31 «tnulzíók, és potenciálisan hasznos humán adjuvánsok, mint például s BCG (Cslnterte-Guerin hacillus) és jmw, Szintetikus adjuváns előnyős példája a QS-21. Más megoldásképpen vagy ezenfelül alább ismertetett knmrinstímtdáns fehérjék alkalmazhatók sdjuvánskétít vagy a vakcinára adott immunválasz növelésére. Előnyősén az udjuvám győgyászatilag elfogadható.
A „gyógyászatiéig elfogadható kifejezés alatt olyan molekuláris entitásokat és készítményeket értőnk, amelyek dziölőgíásan elfogadhatóak, és tipikusan nem okoznak allergiás vagy hasonló nemkívánatos reakciókat, mint például gyűtnorbáníaltnaí, szédülést ős hasonlót, amikor embernek beadjuk. Előnyősén a leírás szerinti értelemben a „győgyászatilag elfogadható kifejezés alatt azt értjük, hogy elfogadott a szövetségi vagy állami kormány szabályozd hatósága állni, vagy listázva van az „kJ. S. Pharmacopeisf-ban vagy más általánosan elismert gyógyszerkönyvben., állatokban, előnyösen emberekben történő alkalmazásra. A „hordozó’' kifejezés alatt oldószert, sájevánst. kőtöszert vagy hordozóeszközt értünk, amellyel a vegyöletet. beadjak. Steril víz vagy vizes sóoldat és vizes dextróz és glicerin oldat az előnyösen alkalmazott hordozó, különösen injektálható oldatok eseteben. Megfelelő gyógyászati hordozókat ír le a Remington’s Pharmaeeutseaí Sciences” című kézikönyv (szerk.: E. W. Martin).
A vakcírtálás hatásosságát fokozhatjuk ímmunstimuláns molekula együttes beadásával [Salgaller és Ledge, 3. Sarg, öucoi. ód, 122, old. (1998)], mini példáéi immunstimuláló, ímmtmpelencíáló vagy' proimflammtPorífors citokin, iimfokm vagy kemokin. beadásával a vakcinában, különösen vektor vakcinában, Például cítokiuek vagy citokín-génsk; mini például IL-t, It-2, IL-3, ÍL-4, ÍL-12, 1L-53 feterleakin, grantiiociía-mafcroíág (GM)-fa>lőniasrtmaláló faktor (CSF> és más kelóníasiimulálé faktorok, makrofág ínEammatortkös laktor, FltS-ligandum (Lyman, Curr, Gpto. Kómától. 5, 192. old. <199% valamint bizonyos kulcsfontosságú knstmdáns molekulák vagy génjeik (például B7.1, B7.2) alkalmazhatók. Ezen immunstímuláns molekulákat szisztémásán vagy lokálisan juttathatjuk be fehérjeként vagy a molekulát expresszíőjái kódoló vektor expressziója útján.
Aetéfe xe/íéá A vaketnálást dendrikus sejtek célzásával is elvégezhetjük [Stoistnan,
J. Láb. Cliu. Med. 1.28, 531, old. (1996);; Steinmím, Exp. Kcmaíol, 24, 859. old. (1996); Tatto és mtsal, Leukémia 13, 653, old, (1999); Avigas. Blood Rév. 13, 51. old. (1999); DiNieob és mtsai., Cytokines Cell. Mól. Ther. 4,265. old. (1998)]. A dendrikus sejtek kulcsszerepet játszanak a T-sejt-fÜggö immunitás aktiválásában. Froliforálö dendrikus sejteket alkalmazhatunk fehéjjeantigének hnmunogéo formában rn skn történő befogására, és azután ezeket az antigéneket prezentálhatjuk olyan formában, amely felismerhető & T-sejtek által és stimulálja azokat (lásd például Steámaa, Exper. Hematól 24, 859-862, old. (i99ő); Inaba és mtsai., J. Exp. Med. 188,2163-2173. old, (Í998);és az 5 851 756. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat]. Ex vivő stimulálás végett dendrikus sejteket tenyésztő csészékre szélessíöuk, és viríonok hatásának teszünk ki (puízalunk) elegendő mennyiségben és elegendő ideig, and lehetővé teszi a virális antigének kötődését a dendrikus sejtekhez, A pulzáit sejteket azután visszaültetjük a kezelés alatt álló személybe,, például intravénás injekcióval Előnyösen autolég dendrikus sejteket, azaz a kezelés alatt álló személytől származó dendrikus sejteket alkalmazunk, habár lehetséges MKC H-es osztály szerint illeszkedő dendrikus sejtek alkalmazása, amelyeket n'pusazonos donortól szerezhetünk be vagy dendrikus sejtok génsebészeti hton a kívánt M'KC-molekulák expresszálására történő módosításával állíthatunk elő (és amelyek előnyösen szuppresszálják a nemkívánatos MHC-mofoktdskat).
* «'*·♦
Előnyősén a dendrikus sejtek specifikus célzottak is viva vírus vagy virális alegységek felvételére. Különféle stratégiák állnak rendelkezésre dendrikas sejtek r« vivő célzására olyan receptorok kihasználásával, amelyek közvetítik az antigénprezentálást, mint például DEC-2Ö5 [Swíggard és mlsaL, Célt immunoi. 165,392-311. old. (1995); Steinman, Exp. .Kerntől. 24, §59. old, {199ő)j és Fc-receptorok.
Inaktívált vlrusvakeínák jól ismertek RNS-virus fertőzés (például Influenza) elleni vakcináiásra flásd Niehoi, „Jexíbook of Influenza”, szsrk.: Niebolsos, Webster és May, 27. fejezek '358-372, old.). Az inakiivúlt vírus előállításához a transzfektáit vírust sejiíenyészetbep vagy embriót tartalmazó- tojásokban növesztjük, A. vírust ínaktíváihatiuk az alábbi anyagokkal történd kezeléssel: formaldehid, hétapropiolakton, éter, éter és detergerss (mint például Tweea-89), cetilrtfiníetil-ammónium-bromid (CTAB) és Triton-NlOl, iKttóam-áeoxíkoIáí és trí(a-butil)~fbszfát (Funninger, mint fent; Wood és Williams, mint fest),. Az inaktiválás történhet az ailanteis-íblyadék feltisztltása után vagy előd (tojásokban. előállított vírus esetén); a virionofcaí centti&gáiássai izoláljak és tisztítjuk (Funnisger, mint fent, 32.6. old.). Á vakcina hatásosságának megállapítására egyedi radiális immundífíözíős (SRD) tesztet alkalmazhatok (Sebild és mísai,, Bull. World HeaiÖt Orgaa. 52, 43-50, és 223-23 L old, (1975): Mosfow és mtsai,, J. Clia. Microbioi. 2, 531. old. (1975)), A kielégítő immunválaszhoz szükséges dózist standardizálták, és ez 15 pg HA/íőrzs/dózis. Az ínaktívált vakcinát intramuszkuláris injekcióval történő beadásra szerelhetjük kiadhatjuk be.
Élő teaygggltgtt iaílacsizavakclaáfe
Legyengíted, hideghez adaptált élő RNS-víms vakcinákat (iniluensavakeiriákat) már kifejlesztettek (lásd Keltél és Pisára, „Texlbook of Influenza”, sxerfc,: Nicirolsoa, Webster és May, 2S. fejezet, 373390. old.]; Ghendon, „Texlbook of influenza”, szerit,.: Nieholson, Webster és May, 29. fejezet, 391-399, old.). Annak a képessége, hogy inSaeazavírust teljes egészében létrehozzunk nyolc plazmádból, lehetővé teszi a vakcjuatörzsek legyengitését, és bármely célpopulációnak optimálisan megfelelő vakcinatörzsek, kifejlesztését (lásd Bílsel és Kawaoka, mint fent). Mivel az A/Asm Arbor/6/6Ö(H2N2) influenzatSrzs vagy a B/Ann Arhor/llöó infíueszatőrzset alkalmazzák jelenleg legyengített vakcinák előállítására, az influenza belső génjeit (PB2, PB1, PA, NP, M, NS) kódoló hat cDNS-f inzetéálhatjuk plazmádba, runtt például pHW'2ööö piazmidba. A releváns influenzatörzs HA és NA glikoproíeinjeh tartalmazó két plazmidof konstruálhatunk, és együtt transzfektálhatjuk azokat a. sem glíkozíiáít infiuenzafefaérjekeí kódoló hat plazmiddal.
Az várható, hogy a belső gének kódoló vagy nem kódoló régiójának & genetikai módosítása javítja a vakcina biztonságosságát, feriSsőképességét, immunogeniiását és védő hálását, a legyengített vírus kifejlesztésének lehetővé tétele mellett.
A HA gén manipulálása is növelheti a vakcinatörzs biztonságosságát. Például az erősen pategén madár isílusnza-A H5 és H? glikoproteínjeinek összekötő peptidjében lévő bázikus amínosavak eltávolítása növelheti a vakcina biztonságosságát.
Ajvf/ku&íirifysf vafóatd/ák Nyálkahártya! vakcmálási stratégiák köiönössn hatékonyak sok pálosén vírus esetében, mivel a. fertőzés gyakran a nyálkahártyán keresztül történik. A nyálkahártya dendríkus sejteket tartalmaz, amelyek fontos célpontjai az EBNA-l vakcináknak és· az immunterápiának. Ezáltal a nyálkahártyái vakcmálási stratégiák inaktíváh és legyengített vírus vakcinák esetében a találmány tárgy- 33 • ,ϊ». ·»» ” kóréhe tartoznak. Mivel a nyálkahártya célozható vakcina lokális bejuttatásával különböző stratégiákat alkalmaztak Immunogén fehérjék nyálkahártyára történő eljuttatására.
Egy specifikus megvalósítási mód szettet ts vakcina keverékben történő beadásra szerelhető ki, vagy kottjugátumkést kiméra ;hiziős fehéreként koleratoxinttal, mint például S koieratoxínnal vagy A/8 kolerafoxin khnérávsi [Hajisheng&llfe, J lanttu;nol, 154,4322-4332. old. (1995); Jobiing és Hohles, isfect. Immun. 60, 4915-4924. old. (1992)], Leírtak 8 koleratoxteoa alapuló nyálkahártyái vakcinákat [Lebens és Hebagreá, Dev, Bioi, Stand. 32,215-227, old, (1994)], Egy másik megvalósítási mód szettet bőlabilis emerotoxtesaf (LT) alkotott keveréket állíthatunk elő nyálkahártyái vakcteálásra.
Egyéb nyálkahártyái instKsnizaiási stratégiák közé tartozik a vírus mlkrokapszulába történő bezásárása (5 075 109.,. 5 320 883, és 5 853 763, számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi lm) és ámunpoteacUíö membrános hordozó alkalmazása (WO 98/0558. szántó nemzetköz.! közzétételi irat), Orálisan beadott teununogének immunögfinításáí fokozhattuk vörősvőrtesíek (rbc) és rbc-szeiiemek (5 643 577. szórná amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat), vagy' „blue tongue” antigén alkalmazásával (5 690 §38. számú amerikai egyesült állansokbeli szabadalmi irat).
A találmány jobban megérthető az alábbi példákra hivatkozva, amelyek szemléltetik a találmányt, anélkül, hogy korlátoznák azt.
„Ámbiszcnsz” megközelítési mód isOnenzs-A vírus létrehozására: vJlNS és mRNS szintézise egy tempiátról
A plazmátok száma csökkentésének első lépéseként ebben a példában beszámolunk ugyanazon a plaztnldon mind ροϊ-1-et, mind ροΙ-Π-t tartalmazó plazmidok előállításáról és transzfektálásáról, ós bemutatjuk, hogy ez a rendszer lehetővé teszi yRíQS és fehétje expresszióját egy teraplátról. Ezt a példát már leközöltük (HoSmantÍ és mísal, Vlrelogy 267, 318. old. (20ÖÖ)].
Anyagok és eljárások
Htem/dok k/tteosása, Az összes klónozás! és PCR reakciót szokásos protokollok szerűd hajtottak végre. Röviden, az A/WSN/33 törzs peiimeráz-komplex génjeinek expressziós plazmidjai apeDNA3hói (Inviírogea) származtak, és tartalmazták a humán citonregalovlrus (CMV) azonnali korai promóterét és a szarvasmarha növekedési hormont (BGH) kódoló gén poli-A helyét. A vitális eDNS~ek a pWNF!43, pWSNPA3, pWSN8B2'14, pGW-FBl plazmidokbél származtak, a pHW25-NP, pHW23-FA, pHW2ÍFB2, pHW22-PB! expressziös konstrukciókat eredményezve. A pH W 12-t a humán poi-í promótsr és fermtnáíor szekvenciák poi-U promóter és a poli-A hely közé történő tezertáiásával hoztuk létre. A pHW52 ptankfot a pHW12~ből származtattuk, először a EBI nem kódoló régióját Hindii! és Xitel helyekkel meghosszabbítva tartalmazó oligonukleotid mzertálásávai, majd a EBI kódoló régiójának beinzerlálásával a pllW22-FBl píazmidből ezekre a helyekre. A pHW82-F;81 palzmideí a pHW52-P81bői szártnaztatíuk a CMV-promóíer szekvenciák deletáiásával. A fokozottan zöld fluoreszcens fehérje (EGFP) kódoló régióját a pHW72-EGFP riporterkonsirukcioban FCR-ampllfikációvai állítottuk elő a pEGEE-Hl (Clontech) terápiáiként történő alkalmazásával, és a cDNS-nek a hantán pol-í promóteri ős egér termioátort és az M-szegmess w kódoló régióját SaelL'Xhol helyekkel elválasztva tartalmazó pHW72 plazmíd SacH/XhoI emésztése után, A pW127-M és pHWI28~NS plazmidokat virális RNS RT-PCR ampllrikálásával .állítottuk elő szegmens-specifikus szekvenciákat és a BsmBi enzimmel «mész-34¢. Ο tett pHH21 vektorba történő lígálás végett BsmBI helyeket tartalmazó iáncisdltók alkalmazásával (E, Hofteaon,. Fh.D. értekezés, testes Lsekig Druversíty, Giessen, Gensany (1997); Neumann és mísai,, Proc. Nad. Aead, Sd. USA 96, 9345, öld. (1999)], A pPoH-WSN-PBÍ, pPotí-WSN-FSa, pPolí-WSN-PA, pPoH-WSN-NP, pPoii-WSN-HA, pPolIAVSN-NA, pEWSN-HA és pCAGGS-WNA15 plazmidok előállítását máshol leírták (Nenmana és mtsaL nutk fent).
ÓTyátenyászeí ék rrss.s%4ekíű&ís„ ,,Madm--Oarby canine kiduey’' (MDCK) sejteket tartottunk fetm módosított Ettgle-íéls tápközegbcs (MÉM), amely 10% magzati márbaszérumoí (FBS) tartalmazott, és 293T hmnán embrionális vesesejteket tenyésztettek Dülbeceo-féle módosított Eagle-tápközeghen (DM.EM), amely 16% FBS-t tartalmazott, 7>a«»'.fF LF-í-et (Panvera. Madíson, Wlsconsin) alkalmaztunk a gyártó «táskásai szerint 1 χ ΙΟ’ 2931’ sejt transzfekiálására, Plazrtűdok különböző mennyiségéi (1. táblázat) kevertük összes Tra/w/T íí-J-gyei (2 μΐ ?hr.ez/T 17-/ per 1 pg DNS), 45 percen keresztül ínkufeálmk szobabőmérsékleíes, és a sítekhez adtuk. Hat órával később a DNS-transz.íekeíós elegyet belyetíestetük Opfi-ó/AM-md (Gíbeo/BRL, Gahhersburg, Maryland}, amely 0,334 szarvssmarhaszérumalbumint (SS.A) és 0,öí% FBS-t tartalmazott, 48 órával a transzíektálás után a vírust tartalmazó felülúszókat bíráltuk MDCK sejtekben.
és RT-FCR. Virális RN5-i ízoiáltek vírasrészeeskékhöl az J&feasy-Kit (Qiagen, Valencia, Califorrba) alkalmazásával, a gyártó utasításait: követve. A rekomhináns ínfsuenzavkusok jellemzésére az Access RF-.RCR k/í-eí (Ffőmega, Madíson, Wlsconsin) alkalmaztuk a mellékelt protokoll szerint. Az alábbi lándnóíiók&t alkalmaztuk az RT-PCR kísérletben; Se<pF8iAl: 5'-AGG ATG GGA TTC CTC AAG G-3' (I, azonosítószámú szekvencia); Seq-P8ió2: S-GCT ATG GTT TCC AGA GCC CG-3' (2, azonosítószámú szekvencia); Bta-PBbl; S’-TAT TCö TCT CAG GGA.GGG AÁÁ GCÁ GÓC A-T (3. azonosítószámú szekvencia); Bm-PBl-2341.R: S'-ATA TOG TCT CGT ATI' AGT AGA AAC AAG
GCA TTT-3' (4, azonosítószámú szekvencia). Az RT-PCR. kísérleteket a PTC-200 D.N.4 készülék (MI .Research, Watertown, Massactosetts) alkalmazásával hajtottuk végre. Az amplíirkációs program 1 ciklussal 48°C-oa 45 percen keresztül (első eDNS-szál szintézise), és I ciklussal 94°C-on 2 percen keresztül (az AMV reverz-transzkríptáz inaktiválása és a cDNS ásnateálása) kezdődött. Ezeket a ciklusokat követte 40 ciklus ·94°Οο» 20 másodpercen keresztül, 52φ€-οη 3Ö .másodpercen keresztül és ?2a€-on 30 másodperces keresztül (PCR-amplííikáció); és a program egy ciklussal fejeződött be íT'C-on 5 percen keresztül A PCR-tcrmékeket agaróz-géieiefctoprforézísset elemeztük, és megszekvenáltuk a Seq-PBÖt vagy Seq-PBi#2 lánemdító alkalmazásával.
Jrsmfdsr' ctTomúr/s, 48 órával a trsoszfektáíás után a 293T sejteket mostuk íoszfát-puílbrelt sóoldattal (FBS). leeentrlíúgáííuk és újrafelszuszpendáltuk FBS + S% FSS puRcrfeen. Az áramlási citometriás eienrzést E4CS Cu/bm?' áramlási eítométer (Beclon Dicklhson) alkalmazásával hajtottuk végre, és az adatokat a Ce//g«&«f szollvercsömag afkahnSzásával elemeztük. Az EGFP expressziójának elemzésére az 536 nm-es emissziós hullámhosszat (Ftl) alkalmazóik az EGFF-kSsvetíteti Boureszeencía-dctckclö magas érzékenysége elérése érdekében.
Erednrények. és diszkusszió ,4 áéé etikazte? jMWtdte# ámn/í»nzó pHTF/2 k&Bíözd vekíor remedre ás íteydóíísdgoá Az iafiuenza-A vírusok szegmentált vírusok, amelyek uegabv-szensz polsritású RNS-molekuíákat tartalmaznak. A rcpiikáclós ciklus során a S vRNS szegmens 5' és 3’ szerkezetemek a ríbonukleoprotem-kotsplex »*« '*·* » β *
- 35 fehérjéi (PS2, PB 1, FA, N'F) általi felismerése eredményezi as influenzavírus gének repllkácíóját és transzkripeisípját. Az a tény, hogy a terminális szekveuciaelemek erősen konzerváltak, azt jelzi, hegy az átírt mesterséges RNS-sek az 5’ és 3' véggel azonos szekvenciákat kell tartalmaznia (Lao és mtsai·., J. Virol. «5,286L old. (1.991); Flíck és mtsai., RNA 2, 1046. old, (1996». Előállítottuk a pHWll klónozó vektort, amely lehetővé teszi jelentőséggel hirő szekvenciák befezertáláaát a pol-I promóter és ienranátor közé BstuBI restrikciós endosakleáz alkalmazásával. A pol-i transzkripciós egységet a cítoínegalövirus pol-fi promófere (CMV) és a szarvasmarha növekedési honaoat kódoló gén poliadenliációs szignálja szegélyezi. A CMV-promóter, a poii-Á hely és a plazntid gerince a pcDNA3 klónozó vektorból származik,.
ÍJ egyplazmídos transzkripciós rendszer tesztelésére az A/WSN/33 vírus FBI génjét beinzertálísk a pHWI2 klónozó vektorba g pHW52-FBl vektort létrehozva, HtndHÍ és Xhoí restrikciós helyeket inzertáltnnk a gén 5 és 3’ nem kódoló régióiba, Ezen genetikai címkéket azért építettek be, hogy biztosítsuk, hogy a keletkezett rokombináns vírus azonosítható legyen RT-PCR-rel, Azt vártok, hogy az ezzel a plaztuiddsi transzfektált huínán sejtek kétféle RNS-t termelnek: PSI-vRNS szmteíízálóílík a celluláris pobí, és 5’ sapkázotí mRNS szlntetízáíédlk a pol-1 állal. A2 mRNS transzlációjának a FBI-fehérjét kell eredményeznie.
Annak vizsgálatára, hogy a PSI-febétje termelődik-e erről & konstrukcióról, teszteltük egy mesterséges vRNS replikácíőját és transzkripcióját a pHW2l-PS2, pHW23-PA és pBW25-NF expressrióe plazmidok előállításával, amelyek az A/WSW33- Ρ82, FA és NF fehérjéit kódoló cDNS-eket tartalmaznak a CMV-promóicr szabályozás alatt. Mesterséges vRNS ?« w szintézise véged előállítóitok a pHW72-BGPP riporterkonsírukeiót, amely tartahntszza az EGFP oDNS-t, az M-szegmess nem kódoló régiójával, a humán pol-l proroótenel és egér termmátor szekvenciával szegélyezve. Öt plszmidot [2 ug pHW21-FB2, 2 pg pW52-PBi (ροΜ.φοΙ-Ιϊ promóter konstrukció), 2 pg pHW23-PA, 2 pg pHW25-NP és 1 ug p.WW?2-EGFPj manszfektáltonk 293T sejtekbe. 24- és 48 órával a transzfekiálás mán a sejteket fluoreszcens mikroszkópiával elemeztek. 24 óra elteltével fluoreszcens sejteket Sgvelídnk meg. Ez az eredmény azt mutatják, hogy·· 24 órás beiül a polimeráz fehérjók olyan koncentrációban szlníedzslódnak, amely elegendő sz EGFP-vRNS influenzavírusra specifikus véget felismerésének lehetővé tételéhez. Ezen fehérjék mRNS~t szintetizálnak, amely SGPP-vé írartszlálődlk,
A rendszer hatékonyságának érékelésére áramlást cítomctriás elemzést végeztünk a fluoreszcens sejtek számának ieszámlálására. 48 órával az őt piazitud transzíekiálása «tán a sejtpopuláció 1.8,72%-a mutatott fluoreszcenciát, Csak fmoreszoens sejtek háttérszímjét (Ö,Ö6%) detektáltuk, amikor a pHW52FBI plazmidot nem alkalmaztuk; ez az eredmény konzisztens azokkal a korábbi vizsgálatokkal, amelyek azt mutatták, hogy' mind a négy RNP-kompiex fehérje szükséges a vRNS amplifikálásához (Huang és mtsak, 5. Virul. 64,. 5őő9, old. {1990)1. Az eredmények azt jelzik, hogy a PB 1-cDNS transzkripciója és -aFBl-fehérje keletkezett koncentrációja az egyéb RNP-komplex fehérjékkel együtt elegendő a vitális íranszkrincíős/repükáclós folyamat írbe látására, m/hre?rja-,4 w5r»a IdrreÁoídra. Fertőző Mueaza-A vírus létrehozása érdekében szükséges, hogy a pH4V52-FBl plazmld ne csak FBI mRNS-t és fehérjét,, hanem elegendő mennyiségű FBl-vRNS-f is biztosítson, amely otódvímsokba pakoíódkat. A fennmaradó ? vRNS esetében olyan ♦ * φφ
-36píazmidofeat alkalmaztunk, amelyek tartalmazták az A<WSN/33 vírus teljes hosszúságú RNS-einek cDNS-ét, a humán pol-I promóterrel és az egér tetmináiorrai szegélyezve, Ezea plaztnidok öwszfdrtálása miad a nyolc vitális RNS szintézisét kell, hogy eredményezze, amelyek replikáiőshtak és áíírődttak a polimeráz fehérjék révén, új vRNP-ket alkotva. A szerkezeti fehérjék szintézise után az RNP-k áj vfnísrésaccskékbe pskolődnnk,
293T sejtekét transzMtátaak különböző mennyiségű (ö, 2, 4 ug) pHW52-PBÍ piazmíddal, együtt a pPoli-WSN-PS2, pPoil-WSN-FA, ρΡοϊϊ-WSN-HA, pPoli-WSN-NP, pPoB-WSN-NA, pHW127M, ,pHWJ28-NS plazmidskkai (mindegyik 1 gg). A fehértől expresszálő pHW21-PB2 (1 gg), pHW23-PA (0,1 pg), pHW25-NF (1 pg), pEWSN-HA (1 pg) és pCAGGS-WNAlS (1 pg) píazmidekaí együtt transzfektáituk. A hemagglutinin (HA) és neuramínáláz (NA) expressziós plazmldját is alkalmaztak a fraaszfektáns vírus hozatnának növelésére.
órával a iranszfekíáJás után a?, elsődleges transzfektált 293? sejtek feialúszóját MDCK sejtekbe vittük át Az összes trsnszfekclós klsórfetben, amelyben.pHW52-PBl piazmidot is alkalmaztunk, 24 órával a passzáiás után vtrus-indökált eltopáílás hatást figyeltünk. meg. Nem volt citnpátiás hatás megfigyelhető, ha nem alkalmaztunk PBl-et expresszáló plazmldot a transzfekiálási reakcióban, A virustitert g úanszfektált sejtek feiülúszójárak MDCK sejteken történő títrálásávaí határoztuk meg; azt találtuk» hogy a felülúszó 2x10''- 2' χ I ö$ pfu/ml vírust tartalmaz. Ez az eredmény azt matatja, hogy a PB 1 -ροΙ-ί/ροί-Πprométer-phtzmid transzfektálása. után (együtt az expressziós plazmánkkal) PB1 vSNS és PBl-fehéfie szintetízálódík -a barnás 293? sejtvona&aa, olyan szinten, amely elegendő fertőző ínfiueaza-A vírusok létrehözásához. A PBI-eDNS-t két plazmádon külön-külön található együttes transzfekdós kísérletekben (pHW82-PBl és pHW22-PBl) 2 x 18* pfiml virustitert találtunk; a vad típusú PB 1:-szekvenciákat t&rtaitnazó piazmídok alkalmazásával végzett analóg kísérletben (pBoll-WSN-PBl és pHW22-PBl) 3 x W* pih/ml virustitert kaptunk.
Ellentétben az előző kísérletben alkalmazott pol-11 promótert tartalmazó expressziós konstrukcióval (Neumann és rotsaí, Proc. Natl, Acad. Sci. USA 96, 9345. -old. (1999)], a pHW'52-PBi plaztnidot alkalmaztuk, amely a pol-í transzkripciós egységből származó szekvenciákat tartalmaz, atneiyek a CMVprotnóter és poliadenilációs szignál közé vannak mzeriáiva. Az PUFF ríportergérs expresszíója azt jelzi, hogy a PB 1-fehérje expressziójít ebbe® a rendszerben elegendő EGFP-RNP komplexek kialakulásához. Habár a pöl-I-promóíerrterrainátor régió tartalmaz felismerési szekvenciákat a pol-l-specifíkus transzkripciós és terntínácíős laktorok számára [Secktnnnn és mtssk, Science 276, 1506. old. (1995); Bell és mtsaL, Science 241, 1192. old. (19SS); Kaim és mtsal, EMBOJ, 13,416, old, (1994)], nem tűnik ügy, hogy ezen DNS-kötő fehérjék gátolják a ροΙ-Π-fcözvetitett transzkripcióé Ezen eredmények konzisztensek, azzal a felismeréssel, hogy a pol-í-speeífíkns DNS-kötő fehérjék gyakoribbak a ííukleoluszhan, abban a kompartmetttben, almi az rDNS transzkripciója történik (Evem és tntsai., EMBO £ 14» 1248, old. (1995)j. Ezen eredmények azt jelzik, hogy a poi-i/poi-ll-premőter konstrukció sejtbe történő transzfektálása után a plazmídok egy része bekerül a nuklsolaszha, ahol pol-I-kőzvelitett transzkripció megy végbe, és egy része a sejtmagban marad, ahol átirődik az RNS-polímcráz-II révén.
Mivel« pHW52-PB 1 riporterkonsímkcld további nem influenzavírus szekvenciákat is tartalmazott (restrikciós helyek) a nem kódoló régióban a siat kodon előtt és a stop kodon után, az is érdekelt bennünket, hogy ezen szekvenciák stabilan fennmaradnak-e a virális PB! RNS-szegmensben. Ezért *»φ*
-37vRNS-t izoláltunk a traoszfektáns vírusok MDCK sejteken történő második pssszálása után, és reverztranszkripciós PCR-elemzést hajtottunk végre. A vRNS amplsfikálása FBI-specifikus lánctndítökkaí s várt mérető cDNS-frugmensek keletkezését eredményezte. Ugyanezzel a virális SNS-seí és isnemöííőkkai, de reverz-franszkrintáz hozzáadása nélkül nem kaptunk amplilikációs terméket, mutatva, hogy a cDMS vitális RHS-ből származott, és nem a transzfektált sejtek felél úszójával átvitt plazróá DNS-böl.
A PCR-termékek szekvenálása feltárta, hogy mindkét restrikciós hely szekvenciája jelen van az RNS-molekul-ában. Az eredmények azt mutatják, pol-lzpol-H transzkripciós rendszer tehetővé teszi fertőző rekombináos vírus előállítását, és hogy a FB I gén nem kódoló régiójában idegen szekvenciákat tartalmazó vírus életképes. Ez a módosított FBI-szegmens replikálódik, áfíródlk és vírusrészecskékbe pakolódik. Korábban az RNIMr&ns&kclós rendszer alkalmazásával az InBuenza-A vírus szegmensek sem kódoló régiói megváltoztak. Az NA gén nem kódoló régiójának az isBaenza-B NS-szegrsesséaek megfelelő szekvenciájával történő szöbsztitaálásáváí írauszfektáns influenzavírusokat állítottak elő (Mester és mtsai,, Pfoe, Natl. Arad, Sci. Amerikai Egyesült Államok 88, 5177. old. (1991); Bergmaas és Mester, J, öen. Virol. 76, 3211. old. (1995)]. Ez kunéra NA-szegmesst tartalmazó vírus legyengített fenotipust mutatott egerekben, és megvédte a nem totális dózissal injektált egereket a vad típusú influenzavírus fertőzéssel szemben. Ezen eredmények azt matatták, hogy -egy ENS-szegmens sem kódoló régiójának genetikai megváltoztatása sregváltoztathatja a írenszfektóss vírus biológiai tulajdonságát, fit azt közöljük első tdkalonunsi, hogy még akár nem ásflaenzavfrus szekvenciák is iszertálhatók a FBI-szegmens sem kódoló régiójába.
A pol-Upol-Π transzkripciós rendszerrel lehetséges szisztematikusan módosítani ezeket a szekvencíaelemekeí a PB 1 -szegmens nem kódoló régiójában, és értékeiül azt, hogy ezen genetikai manipulációk eredtnényeznek-e változásokat a rekombínáss vírusok biológiai tulaídonságatban. Sőt a mutáns PBl-szegmenst tartalmazó vírusok alacsonyabb hozama a vad típusú vírussal összehasonlítva azt jelzi, hogy az ínzertált szekvenciák negatívan befolyásolják a vírus növekedését.
Habár a nemrégiben kifejlesztett pi&zmídslapú rendszer (Neumann és mtsai,, mist feni) nagyon hatékony inRueszavírus létrehozására, 14-17 plazmid klónozását foglalja magába®, Ebben a vizsgálatban 13-ra csökkentettek az AZWSN/33 ínSuenzavirus törzs hatékony előállításához szükséges plszmldok számát. A plazmídok számának ezen megközelítési mód útján elért csökkentése a transzfefeció hatékonyságának növekedését ígéri a 293T sejtektől eltérő sejtvoualakban, ezáltal lehetővé teszi géneknek olyan sejtvoríniakba történő bejuttatását, amelyekbe 14 plazroiá hatékony bejuttatását nehéz elérni. Fodor és mtsai, (I Virol. 73, 9679.. old. (1999)] képesek voltak influenzavírus kimentésére 12 plaztnid transzfektálása után, de a viroshoznm abban s vizsgálatban csak 1-2 fertőző virusrészeoske volt 10” transzfektált Verő-sejtre,
2. példa.
Rekontbísáas influenza-A vírusok előállítású minimális ptatniö&i&pú restdszerbőf
Ebben a példában plazmídafepú íranszfekeiós rendszer alkalmazását mutatjuk be lnfluonza-A vírus kimentésére teljes -egészébe® klónozott eUNS-böl. Ellentétben a létező plazmidalapú rendszerekkel, ez az influenza-A vírus létrehozására alkahnas rendszer csak nyolc expressztós plaznhd konstrukcióját és transzféktálását alkalmazza, amelyek mindegyike egy viráiis génszegtnonsnek megfelelő különböző virális cKNS csak egy kópiáját tartalma» Ez s reverz-genetikai rendszer csökkenti az m£hamza~A vírus
-38visszanycrésáhez szükséges plazmktok számát, és lehetővé teszi átrendezett vírusok megjósolható és hatékony létrehozását.
Anyagok és ellátások
Pfezm/ífei k&bwzdss, A pHW2O00 plazmsdot (3 A, ábra) a pHW12~bŐl származtattuk (1, példa). A pHW2O80 klónozó vektor a humán poM promöler 225 bp-ját ás a® egér termmátor szekvencia 33 bpját tartalmam két BsmBI hellyel elválasztva. A pol-i promóter és termiaátor elemet a humán cÍtomegaiovtrus azonnali korai promóteréoék csonkolt verziója (megközelítőleg 350 hp-ral leolvasással ellentétes irányban kezdődően a pcDNA3-ban található transzkripciós starthelytől számítva, fcvitrogen, Carksbad, Califortsía) és a szarvasmarha növekedési hormon políadeniláciős szignálja szegélyezi. Az A/TOiZnCHtm) vírus eDNS-ét tartalmazó nyolc ptamáot (pW18M»B2, pHWIS2-PBi, pHW183PA, pHW184-HA, pHW135-NPs pHWW-NA, pHWW-M és pHW188-NS) a pPolI-WSN-PB2, pPolIWSN-PB1, pFoll-WSN-PA, pFoll-WSN-NP, pPoil-WSN-HA, pFoO-WSN-bíA plazmídok [Neumann és mlsai,, Proc. Nett Aead, Seb USA 96,9345. old. (1999)], pHWl27-M és pHWÍ2S-NS 0. példa) vitális cDNS-ét és pol-l promőtert és terminátor szekvenciát tartalmazó Apal-Sall fragmensének a pHW2ö00. vektor Apai-Sáli fragmensébe történő hehizertálásával állítottuk elő. A/FesWK/W312/9?(HőNl) cDNSét tartalmazó nyolc ptamidot (pW241-PB2, pHW242PBl, pHW243-FA, pHW244-HA, p.HW245NP, pHW24ó-NA, pí-lW247-M és pBW24S~NS) a vitális RNS reverz-traoszkríptáz polimerázláttcreakciójával (RT-PCR) .állítottuk elő. A PCB-reskcióhs® alkalmazott láncindltók szegmensspecifikust szekvenciát tartalmaztak a 3’ végükön, és BsnaBÍ vagy Ssal restrikciós hely szekvenciát tartalmaztak az 5’ végükön. A PCR-termékek SsmBl vagy Bsal enzimmel történő emésztése után a fragmenseket pHWIOÖO vektorba klónoztak (3A. ábra). Az Artealőd&A¥312/97 (HöNl) genomjáosk az amplitlkálására alkalmazott láncindltók szekvenciája az alábbi, A láscindhókat halról jobbra ábrázoljuk az 5’-3’ végeknek megfelelően, Az mflnenza-A-ra specifikus nukieotidokat aláhúzással jelöljük.
NS:
Bm-NSvl: TATPCGTCTCAGGGAGCAÁAAGCAGGGTG (5. azonosítószámú szekvencia)
Bm-NS#2:. ATATCGTGTCGTATTAGtAGAAACAAGGGTGTrr (6. azonosítószámú szekvencia)
M:
Bm-Mhí: TATrCÜTCTCAGGGAGCAAAAOCAGGTAG (7. azonosító,számú szekvencia)
Bm-M#2: ÁTATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAÁGGTAGTTTTTT (8. azonosítószámú szekvencia)
NA:
Bm-NÁl-1; TATTCGTCTCAGGGÁGCAAAÁGCAGGÁGTTTAACATG (9. azonosítószámú szekvencia)
Bm-NA-Í 413.R: ATATCGTCTCGTATTzkGTAGAAACAAGGAGTTTTT (IÖ. azonosítószámú szekvencia)
HA:
Bm-HŐ-1: TATTÜGTüPCAGGGáGCAAAáGCAGGGGAAAATG (11, azonosítószámú szekvencia) Bm-N&#2: ATATCGTCTCOTATTAGTAQAAACAAGGGTGTTT (12. azonosítószámú szekvencia) (megjegyzést a HA és NS szegmenseknek azonos a szekvenciája a nem kódoló régió ezen részében)
NP:
Ba-NF-1: TATTGGTGTCAGGGAGCGAAAGCÁGGGTA (13. azonos hószámú szekvencia)
-39«·> w *
B&-NP1565R: ATATGGTCTCGTATTAGTAGÁAACAAGGGTATT /14. azonosítószámú szekvencia) PA;
Bm-PAM: TATTCGTCTCAGGG A.GCGAÁAGCAGGTACTGATCC <15. azonosítószámú szekvencia) Bm-PA1-2231R; ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTACTTTTT (lő. azonosítószámú szekvencia)
Ρδί:
Bxn-PBÍa-l; TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGCAAACC{17, azonosítószámú szekvencia) Bm-PBl-2341 R: ATATGGTCTCGlÁTTAGTÁGAAACAAGGCATTT (18. azonosítószámú szekvencia)
PB2:
Ba-PB2-1: TATTGGTCTCÁGGGAGCGAAAGCAGGTCAAITATATTC i' 19. azonosítószámú szekvencia)
Ba-PB2~2341R: ÁTATCGTC'TCGTATTAGTÁGAAACAAGGTCGTTTPT (2ö. azonosítószámú szekvencia)
Az RT-reatóót az S'-ÁGCAAAAGCAGG-l’ láaeindítóval (21, azonosítószámú szekvencia) hajtottak végre. Annak biztosítására, hogy az RT-PCR amphfikáeíőból .származó virális eDNS az expressziős pl&zmsdhan nem tartalmaz nemklvánt mutációkat, az inzertéit cDNS-ekeí megszekvenáitsk.
R&uwá és sejMmyés&í Az A/WSNG3(H1NI) és Á/TeM/HK/W312/97(HőNl) vírusokat ΙΘ napos tojásokban szaporítottuk, „Maáin-Darby canine kldney” (MDCK.) sejteket tartottunk fenn módcsl· tett Eagie-iéle tápközegben (MÉM), amely 10% FBS-t tartalmazott 293T tormán embrionális vesesejíekeí Opíi~M£M f tápközegbsm tenyésztettünk (Life Technologies, Gaithersbarg, Msryíasd), amely 5% FBS-t tartalmazott, A. transzfekciós kísérlethez hat-mérőhelyes szövetíenyésztő mikroliterleísezekeí alkalmaztunk. Á trasszfektálást megelőzd napos 75 cm2-es fiaskákban lévő konftoens 293T és MDCK sejteket tripszhúsáitnnk, és az egyes sejtvssalak 10%-át összekevertük 58 mi Qpti&ÍEM 1 tápközeggel; ezen sejtszuszpenzíő 3 rnl-ét oltottuk a hat-mérőhelyes mikrotiterlemez egy mérőhelyére. Az együtt tenyésztett MDCK és 293T sejteket (0,2-1 x IQ6 sejt mérőhelyenként mindegyikből) alkalmaztuk a trauszíektálási kísérletben. Tkans/F iT-Z-et (Panvera, Maásson, Wisconsia) alkalmaztunk a gyártó utasításai szerint a sejtek írahszfektálására, Röviden, l gl DNS-re számítva 2 pl Tratis'fT LT-i-zt összekevertünk, és szobahőmérsékleten inkuháltuk 4-5 percen keresztül, majd a sejtekhez -adtuk. Hat órával később a DNS-trasszfekciés elegyet 'helyettesítetek Opti-MEAl /-gyei. Harminc órával a transz&ktálás után 1 ml, TPCK-tripszint tartalmazó Opli-MEM/ tápközeget adtunk a sejtekhez; ez a hozzáadás a TFCK-trlpszm 0,5 pgÁnl végkoneentrációját eredményezte a sejtek íelülúszojában. A sejtek fehilúszójának a vírastlterét a felklúszó MDCK sejteken történő titrálásával határoztuk meg.
ds JWkPCR. Virális RNS-í izoláltunk virusrészecskékhői az (Qíagen,
Valencia, Calífomia) alkalmazásával, amelyet a gyártó utasításai szerint alkalmaztunk, A rekombináns toffeenzavfeusok jellemzésére az 4cem RT-PCR áh-eí (Fromega, Madlson, Wisconsia) alkalmaztuk a mellékeh protokoll szerint. Az alábbi láscindltők&í alkalmaztuk az RT-PCR kísérletben: Bm-NSÜl (5'TAT TCG TCT CAG GGA GCG AAA GCA GGC A-3’; 5. azonosítószámú szekvencia) és Bm-NS#2 (5'ATÁ TCG TCT GGT ATT AGT AGA AAC AAG GGT GTT ΤΊ-3; 12. azonosítószámú szekvencia). Az RT-PCR kísérleteket a PTC-28Ö DNA készülék (Mi Research, Watertown, Massschuseiís) alkalmazású~ 40 vaí hajtottuk végre. Ás ampiiőkáeíós program .1 ciklussal' 48°.C-on 45 percen kérésziül és 1 elkfessal íNKC-on 2 perce® keresztül kezdődött. Ezeket a ciklusokat követte 40 ciklus 94cC-on 20 raásodpotosa keresztül, S2öC-on 3Ö másodpercen keresztül és 72eC-ön 4Ő másodperces keresztül; és a program egy ciklussal fejeződött be ?2~C-os 5 percen keresztül, A ECK-íertnékekeí agarőz-géielektrofórézissei elemeztük és megszekvenálíuk a Rra-NSl»? feciitdító a&aíxnazásával. A „Center fór Biotechnólogy at St Jade Children's Research Hospiíal” határozta meg terápiái DNS szekvenciáját a rodarnin vagy d-rodstnln .^e-temróefar epe/s? se^ueneteg nevnA zcwriou áh, Αί?ϊρ/ί7bsy £>AK pöMuerose FS' (Ferkín-Elmer, Ápphsd Biosystems, lse, fPEZABJ}, Foster City; CA) és szintetikus oügontskfeotídok alkalmazásával,
A mintákat edeksrolbreiizáltált, detektálták, és F&ASí morfeí 373, módéi 373 SíretcA vagy motteí 37? DNS-szekvenátoroko® elemezték, l^dmények ,4 poM-poW/.re»^^/áííeí!iíísáwJ^3^^Ífjy/A///í^weWfWsáf». Mivel az IsSaesja-A vírus genomja nyolc szegmens!: tartalmaz, azt gondoltuk, hogy mlsd a nyolc Infiaenza-A cDNS poí-I protnóter és pol-íl promóíer közé történő inzertáíásának a nyolc virális vRNS, .az összes virális RNS transzkripcióját és mind a 10 virális fehérje szintézisét kell eredményeznie (1. ábra). Azután az összes virális ribonukleoproteín és szerkezeti fehérjék összeszerelésének fertőzd infiuenza-A vírust kell eredményeznie (2. ábra).
Annak tesztelésére, hogy khnenfeeíö-e fertőző mflíiénza-A vírus ezzel a btdírekesonáhs transzkripciós rendszerrel, nyolc expresszsós plazmidot (pílWISÍ-PBl, pHWIS2-PSÍ, pHW183-PÁ, pHWÍMHA, pHWS85-NP, pWUő-NÁ, pHWI87-M és pHWI88-NS) áliitoítank elő, amelyek tartalmazták az ΑΛν$Ν733(Η1ΝΙ) nyolc eONS-éi, Nyolc piszmrdot (1 ng mindegyikből) (1. táblázat) együtt transzferáltunk tratszíettse® együtt tenyésztett 293T-MDCK sejtekbe, Mfedkét sejtvonalat együtt tenyésztettük egy sejttenyésztő mérőhelyen a iranszfektálásí megelőző napo®, hogy híztosltsttk a trasszfekeiá hatékonyságát (293T sejtek) és az mOuenza-A vírusok replikácíójánsk hatékonyságát (MDCK sejtek), 48 és 72 óra ekekével az MDCK sejtek virastttdakáh citopátiás hatást mutattak, de nem Sgyeíttok. meg eítopáliás hatást hét plazmái tramzfsktáláss útás a FBI exprsssztős konstrukció nélkül (1, táblázat), Meghatároztuk a feWószök vfrnstíterét különböző időpontokban a íranszfektálás után, MDCK sejtekben történő titráiással. 24 órával a. tnmszfektáíás után a sejtíelülűszók 1 x 1Ö$ vírust tartahnaztak ml-enként; 2 x lö7 fertőző vírus keletkezett 72 órával a trsnszfekíáiás teás mi-enként (1, táblázat). A kapott vírusokat kétszer passzoltuk M55CK sejteken, Annak igazolására, hogy a keletkezeit vírus a tervezett AAVSN-vlrus, előállítottuk az, NS-gén eDNS-ét RT-PCR-rel (4A, ábra, S, sáv). Két íragmens keletkezése Néni restrikciós endenskleázzal történő emésztés után (48, ábra, 8. sáv) és az amphílkák ftagmeas szekvencia-elemzése igazolta azt, .hogy a kapott vírus valóba® & tervezett ÁAVSN-virus. Ezen eredmények azt mutatják, hogy vRNS és mRNS nyolc plszmídról történő pol-í- és pol-IÍ-hányiíott szintézise fertőző möaenasa-A vírus keletkezését eredményezi, t Táblázati Az A/WSNmCHlNl) és A/TeaVHKW3J2/97(HÓNl) vírus visszanyerésére aiUteazöft piszmldkészletek ’sSgmens ' A7^VHKm3ÜW(Sé1^ .
— pHWm-PBl — pHW242-PBl «φ» * ***
3 4 5 6 8 PÍÍW183-PA PHWI84-HA pHWHS-N? pHWlSó-NA pHW187-M pHW5S8-NS pHWlS3-?A pHW184-HA pHW?8S-NP pHWlSő-NA pHW 187-M P-HW188-NS pHW243-PA pHW244-HA PHW245-NP pHW246-NA pHW247-M pffW248-NS pHW243-P.A pKW244-HA pKW245-NP pBW24ö-NA pHW247-M pHW24«-NS
Vímstiter§
: 24 óra Ö i x kV 0 Ö
' 48 óra 0 2.x 1ÖS* 0 2x lö5
f-72 óra Ο 2 χ Κ)’* Ο 2χΚτ« § A szántok fertőző vlmrészecskét jelentenek mi-enként a manszfektált sejtek fedühiszójában a íransafektálás után 24,48 és 72 órával meghatározva, * citopátlás hatást Egyeltünk meg az együtt tettyészted MDCK sejtekben, vssszsrtyerdse apaic jifa&xtö egyőrtes ímmss^ékíátássivsi. Ás eredetileg az 1918-as járványos humán influenza törzsből származó A'4YSN/33(K1N1) ínfiveazavtet (Goto és Kawaoka, Proc. Natl. Ácad. Sei. USA 95, 10224. old. (1998); Hoki és mtsai, Proc. Natl, Áeaá. Ser. USA 96, 1&51. old. <1999)1 egér&gyhsn passzálták, és jól adaptálódott a sejttenyészetben történő növekedéshez, A sejttenyészetben való növekedéshez sem jól adaptálódott vírus klónozott cDNS—hői nyolcplazmidos rendszer által történő létrehozására való hatékonyságának értékelésére megkíséreltük az AZTealTíK/W3 i2-'97(HóNl} vírus létrehozását pasztán klónozott cDNS-böl. Ezt a B6NI vírust egy elpusztult récéből Izolálták a H5N1 járvány során Hongkongban 1997-bes. A vírus genetikai elemzése feltárta, hogy hét szegmense van, amely több mint 97%-ban homológ a patogén H5N1 vírustőrzsekkel. RNS-t extraháltunk fertőzött aliantois-folyadékbóí, és az ST-FCR-rel sntpiiílkálí cDNS-eket a pHW2ÖÖÖ plazmidba ínzertáltnk; ez, az inzer táíás nyolc expressziós plamídat eredményezett (3. ábra), 72 órával a pHW243-FB2, pHW242-FSl, pHW243-RA, pHW244-HA, pHW245-NP, pW246~NÁ, p.BW247-M és pHW248-NS plazmidok trarsszfektálása ufea (1 gg mindegyikbői) együtt tenyésztett 293T-MDCK sejtekbe, YÍnis-isdukáií citopátíás hatást fígyeltttnk meg az MDCK sejtekben (1. táblázat), A vírushozam 2 x 105 fertőző vírus volt a tmnszlektált sejtek felülöszójának nd-ére számítva, Amint a 4, ábrás bemutatjuk (A és 8, 2. sáv) a visszanyert vírusok azonosságát az NS-szegmens jellemzésével igazoltok, JBzea eredmények azt szemléltetik, hogy ez a piazmídtendszer csak nyolc cDNS klónozását Igényli egy plaztnidvekíorba, és hogy a nyolc expressziéi plazmid transzfektálása lehetővé teszi olyan InSuenza-Á vírus visszanyerését, ataeíyaek az anőgeaítása olyan, mint egy endős sejtekben való növekedéshez még nem adaptálódott vírusé, .-ífecrsdejert r«/íw«sis-,4 v/zm'ok Teszteltük a nyolcplaztnidos rendszer alkalmazhatóságát átrendezett vírusok létrehozására. Mivel a DNS-transzfekciós rendszerhez nem szükséges semmilyen szelekciós rendszer, az átrendezett vírusok visszanyerésének elérhetőnek kell lennie a frwszíekcsós reakcióban lévő expressziós plazmidok megfelelő kombinációsnak alkalmazásával, A/Teal/HK.'W312/97(H6N1) cfeHS-ét tartalmazó hét plazmidoí együtt transzíektáltsk egy expressziós plasmiddal, amely az A/WSW33(H1N l) ÜNS-éí tartalmazta- (2, táblázat), Magas vínsshezasoot értőnk el
Φ »·.♦'♦ φ
«.«* «
β φ *
-42a réce-vírus fedi szegmenséi és a WSN-vte M- vagy NS-szegmensét tartalmazó átrendezett vírusokkal. Alacsonyabb virushozamot értünk el az NA ős HA átrendezett vírusokkal (2. táblázat). Mivel egyedi átrendezett vírusokat mentenünk ki a nyoicpiazmidos rendszerrel, a kővetkező tépés smnak meghatározása volt, hogy kimenthető-e egy vírusból származó több szegmens! tartalmazó vírus. Tehát a HőNí -vírus RHF-komplex génjeinek cDNS-ét tartalmazó négy expresszlós píaztnidoi (pHW241~PS2, pHW242-P8k p.HW243-PÁ és. pMW245-NP)transzfektáltonk együtt a WSN-vírus eDNS-ét.tartalmazó pHWlS4-HÁ, pHWISő-NA, p.HWT8?-M és pHWlS8-NS píaztnidokkal (2. táblázat). 4 x 1Ö® vírust nyertünk ki a sejtfeiüiúszó mi-ére számítva. Amint a 4. ábrán bemutatjuk (tó. sáv), a négyszeres átrendezett vírus ampliükúlt NS-ssegntenséi .nem. hasította az NeoC így az NS-szegntens a WSN-virnxból származik. Ezen eredmények azt mutatják, hogy a nyok^tesiáos transz&kctós rendszer lehetővé teszi egyszeres és négyszeres átrendezett vírusok visszanyerését.
OÉM Átrendezett inflaeoza-A vírusok létrehozása A/T«aVHKAVU2(HéNS> és AAVSN/33<R.íNí) között nyolc plazmíd iranszfekíálásávíri,
| szegmens1* HA MA M | NS I BÁ-MA-M-NS :
! pHW241-FB2 pHW241-FB2 pHW24l-PB2 j pHW241-FB2 | pHW24s-P32
1 2 pHW242-FBl pW242-FSI pHW242-PBi j pHW242-FBÍ ) PHW242-P81
1 3 pHW243-FA pHW243-PA pKW243-PÁ ) pHW243-PA 1 pHW243-PA
i 5 pBW245-W pHW24S-NP pW24S-NF | píiW245-NF | pÉW245-MP
1 4 pHWJ84-HA pHW244-.HA pHW244-HA [ pHW244-HA j pHWl&MU
í 6 pHW246-NA pHW186-NA pBW24ő-NÁ i pHW24ő-MA I PHWISŐ-NA
i 7 pHW247-M pHW247-M pHWm-M j pW24?-M i pHWt87-M
1 8 PÍ-IW248-NS pHW24S-NS pHW248~NS | pHWISS-NS 1 pRlWNS
j vírtístiter§ 2x íF~ ' 2x 18'' 2 x Gr | 2 x 10' '1 4x10
* az A/WSN/3XH1N1) eDN S-éi tartalmazó piazmldokaí vastag betűvel jelezzük.
§ a számok fertőző vírusrészeeskét jelentenek mi-eukéní a trasszfsktálí sejtek felíllíÍSZÓjában a transzfektálás után 72 órával meghatározva.
Az A/T«aVHK/W312/97(H6Nl) vagy AAVSN7330Í1N1) eDNS-ét tartalmazó nyolc expresszlós plazmíd trtmszfektálása istán inílyenza-A vírus kimentésének képessége azt bizonyítja, hogy a poM-pol-ií transzkripciós rendszer elegendő mennyiségű vFNS-t és viráiis fehérjét biztosit fertőző ínHoenza-A vírus létrehozásához, Kétfelé, a m kódoló régiójában eltérő mRNS-t szintetizálank (1. ábra). Az összes vitális fehérjét kódoló mRNS-tlpes közvetlenül a poMl-rői íródik át, A nem kódoló régiók (NCR) iailuenzavírns szekvenciák mellett ezen mRNS-ek tartalmaznak szekvenciákat a poi-1 promőter és egér tenninátor régiókból ss. Fontos módén a kifeiissztett pol-I-pol-íl expresszlós rendszer csak 33 bp-t tartalmaz az egér termináíör szskveneíáfeöi. Korábbi vizsgálatok a kíöramfenikol-aeedkrenszferáz (GAT) és zöld íihoresBö» fehérje (GFF) alkalmazáséval art mutatták, hogy szekvenciák a 174 bp hosszúságú remimkor régióban csökkentették a fehérjék ptd-il-közvetííetí expmssziájlt [E, Hoíftoam, Fh.D. értekezés, Justns Cicisig thüversity, Gtessest, öcrtsany (1997)). Bgy második típusú mRNS keletkezik a viráiis replíkációs és transzkripciós folyamat iniciálása után (2, ábra). Ez, az mRNS a vjráíis poílmerázfefeérjék útján szlntetlzálódík, és S’ sapkoszerkezetet tartalmaz, amely eellnláris RNS-ekből származik „eap snstching” «Íján, *«** * ♦ * Λ » »·♦,,*.
χ**# *** *Μ
-43 az influenzavírus nem kódoló szekvenciáit megelőzően. A kétfajta nrRNS-ről transziálódó szerkezed fehérjék hozzákapcsolódnak az RNP-komplexekhez, új vírusrézecskéket alkotva, A transzíektáns vírusok bimbózása olás a keletkezeit vímsrészecskék rcplikálódhatnak a 293T sejtében, és az együtt tenyésztett MDCK sejtekben.
Ellentétbe» a fenti technika állása részben megtárgyalt megközelítési módokkal a találmány szerinti eljárás nyolc cDNS-t sorakoztat fel nyolc pfozmíddál, amelyek 225 bp-t tartalmaznak a poí-1 promőter szekvenciájából és 33 bp-t tartalmaznak a temisátor szekvenciákból A pól-I-pol-O resdszerben mind a 19 vitális fehérje a formást citomegalovírus azonnali korai pronfoterének csonkolt változatáról expresszáiódik. Az a tény, hogy az összes szerkezeti fehérje expressziója & 17-piazmidox rendszerben (Neurnsm ős mtsai, Froc, Naíi. Acad, Sel USA 96, 9345, old. (1999)] és a nyoicplazmídos rendszerben (jelen találmány) a vírus-visszanyerés nagyobb hatékonyságát eredményezte, mint az RNP-kompfex fehérjéit expresszáiő piazmídok együttes traaszfektáíása (Neumann és rutsal, mint fent; Fodor és mtsai. 1 Várói 73, 9679. old. (1999)], alátámasztja azt a feltételesést, hogy a fertőző inflnesza-A vírus keletkezését fokozza a HA, NA, Ml, M2 és KS2 fehérjék korai biztosítása a transzfektálás után.
A vitális repiifcáeiós ciklus komplex kölcsönhatást jelent a virális fehérjék között, és a eelluláris faktorokkal (Ludrvlg és mtsai, Vírol. immunoi. 12, 175.old. (1999)]. Ezáltal a fertőző vírus létrehozásában a virálís molekulák plazjníd-irányitott szintézise a vitális fehérjék optimális koncentrációját kell, hogy biztosítsa a rephkációs ciklus iniciálásához és a virusszeríl részecskék kialakulásához. Habár a syolcplazmídos rendszer hatékonynak bizonyult, tehetséges tovább növelni a vírus termelését. Kimutatták, hogy az RMF-kompIex fehérjéit expresszáló transzíéktált plazmidök aránya és az M i-fehér je expressziója befolyásolja a trattszkripiáz-aktivitást [Pleschka és mtsul, J. Virol 70, 4183. old. (1996); Ferez és Gonis, Virology 249, 52. old, (1993)]. A vírusszerd részecskék kialakulásának hatékonysága, fegg a szerkezeit vitális fehérjék kottcemrációjátö; Is {Mm és mtsai» 1 Vírol 7(5, 5016. old. (1996); Gomez-Puertas és mtsai, .1. Gén, Vírol S0, 1635, old. (1999); Neumann és mtsai., 3. Virol 74, 547, old. (2őÖÖ)]. A fertőző vírusok keletkezésének hatékonysága a pol-í-pol-H rendszerrel tehát tovább növelhető a traastfekdős reakcióban alkalmazott plazmsdkoncentráelö változtatásával, vagy különböző pol-Il promóterö expresszios piazmiáok alkalmazásával. Mivel a eelluláris faktorok által közvetített „spl teing”hatékonyság befolyásolja az inflaeaza~Á vírusok repiikáloképességét (Lau és Scholtíssek, Virology 212, 225. old, (1995)], 293T-től eltérő sejtvonalak alkalmazása növelheti a vírushozamot bizonyos ísfluenza-Á törzsek esetében. .A négyszeres átrendezés magas yírushozama (2. táblázat) konzisztens azzal az eredménnyel hogy az. A/WSNZ33(K1N 1) tenyésztett sejtekben való gyors repitkációjáí a HA, HA és M szegmensek közvetítik {Goto és Kawsoka, Froc, Háti. Acad. Scl USA 95, 10224., old. (1993); Sehuhnao és Paiese, J. Vírol. 24,170, old. (1977); Yesuda és mtsai., 3. Virol. 68, 3141. old. (1994)],
Az életképes átrendezett vírusok keletkezése (2. táblázat) a madár H6N1 vírus és a humán HíN 1 vírus között azt jelzi, hogy ez a H6N1 vinss képes génszegmenseket befogadni távoli rokon vírusokból Genetikai elemzés azt sugallta, hagy a paíogén H5NI vírusok átrendeződéssel keletkeztek (Xu és mtsai.» Virology 261, 15. old. (1999)]. HSNl-szerő génszegmenseket találtak a HŐH1 és H9N2 altípusokban [Gnőn és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 9ő, 9363. old. (1999)], ami egy olyan eredmény, amely azt jelzi, hogy ezen vírusok tehettek a patogén H5N{ vírusok prekurzoras, Új patogén influengavi'rusokat létrehozó átrendeződések valószínűleg elő fognak fordulni a jövőben. Azonban ezen vírusok létrehozásé♦ Φ**
Φ«χ* «**« ír « ♦ ír « Φ* *·*♦
-74nak és manipuláltad: a képessége a taltaány szerint kifejlesztett egyszerűsített eljárással segítheti a kutatókat ezen új vírusok biológiai tulajdonságainak jobb megértésében, és a populációt ellenük hatékonyan védő vakcinák kifejlesztésében. Egy új pategén törzs feltűnése és vakcina előállítása közötti íddtaríam kulcsfontosságú változó egy vakclnsidsi program hatékonyságában. Vírusok csak nyolc plazmid klónozásával történő létrehozásnak képessége csökkenti a potenciális vakcinák előállításához szükséges időt, ésjavítja asneglévő reverz-genetíksi rendszereket, a vírus-létrehozás egyszerűsítésével, és csökkenti egy vakcina előállításának teljes költségét.
Vitális cDNS pol-I promőter és pol-Π prontőter között eukarióta sejtekbe történő behzertáiásnak elve vírus visszanyerése érdekében alkalmazható az ortomisovírusok családjának más tagjai létrehozására is. Inílusnza-B vírus esetén ehhez a stratégiához nyolc plazmád előállítására és együttes iraaszfekbilására van szükség; az ínflueuza-C esetén hétre; és togotovirus esetén hatra. Az 5’ sapkázotí mRNS és vRNS in vivő transzkripciója ugyanarról a cDNS lempiátról egyszerűsítheti a piazmidalapú rendszereket más RNSvírusok esetében is, vagy akár elősegítheti pol-I-pol-il rendszerek megalkotását más családokból való vírusok esetén (például Árenavhusok, Buayavmusok),
3. példa
RNS pof-I/pnl-U rendszer inflsesza-B vírus teljes egészében klónozott cDNS-böí történő létrehozására
Ás Infincnza-A és íoöuenza-S vírusok mindegyike nyolc egyszahi, negatív polaritásé RNSszegmens! tartalmaz (összefoglalásért lásd: Lamb és Krug, ''Ortbomyxövirldae: The vlruses and tbeír replícarion”; „Virology”, 1353-1395. öld., szerb.: Fields). .Ellentétben az iniluenza-Á vírussal, az ínSuenza-B nyolc szegmense II fehérjéi kódol. A három legnagyobb gén kódolja az RNS-pohmeráz komponenseit (FBI, BB2 és FA) és a 9. szegmens kódolja a bemaggluílniuí. Az 5. szegmens kódolja a nuklcoproteínt, amely a vírális RNS-hez Itapcsolódő ló szerkezed komponens, és a 6. szegmens kódolja a ncur:unidinázl (NA) és az NB fehérjét A két fehérje, az NA és N8, bíeisztrosos m&NS átfedő olvasási fázisáról transziálódlk, Az iníluer.za-S 7. szegmense szintén két fehérjét kódok a BMl-et és 8M2-1. A legkisebb szegmens két terméket kódol: az NS1 a teljes hosszúságú KNS-rŐl aaaszlátódik,. míg az NS2 egy „spriccel” mRNS-ről transzlálédik.
Az influenza-B cDNS-ét tartalmazó expresszsós plazmidok előállítása ugyanazzal a stratégiával történik, mint amit A:tteal''HK/W312V7(HőNl) ínfiuenza-A vírus lériebo2ásánái leírtunk. Először fertőzött aliantofe-iblyadékbői (például B/tee/48) nyert vímsrészeeskékhól RNS-t izolálunk. A nem kódoló régió konzervált szekvenciái alapján RT-PCR iáneisdítókat szintetizálunk, és cDNS szintézisére alkalmazzuk szokat. Á láscmáitók 5' vége BsmBi vagy Bsal restrikciós endonukleáz helyet tartalmaznak. A PCR-tcmfekek emésztése BsmBl vagy Bsal enzimmel lehetővé teszi a BsmBí enzimmel linearízált pHWzöOÖ (vagy pHWÜ) klónozó vektorba történő beínzertálást, Annak biztosítására, hogy s plazmában lévő cDNS-ok nem tartómnak s porimeráz által a PCR alatt vétett nem kívánt mutációkat, s konstrukciókat meg kelI szekvenáini.
Együtt tenyésztett 293T-MDCK sejtek (vagy COS-Í-MDCK sejtek) együttes transzfektálása és tripszin hozzáadása fertőző influenza-B vírusok keletkezését eredményezi. A traaszfekíált sejtek íéiüiúszőját azután új MDCK sejtekre passzáljuk. A kapcsa vírustitert szokásos eljárásokkal, például HA vizsgálati eljárással és tarlóik vizsgálati eljárással határozhatjuk meg. Az egyes gésszegmensekre specifikus
- 45 R.T-PCR végrehajtása lehetővé tesz? az 'RNS ampliSkáhísáí a rek-ombináns jnfiwaa-ö vírusból. A termékek szekvenálása igazolja azt, hogy a keletkezett vírus valóban a kiváut mfíuesza-B vírus, ' í
Nyofeptessdös rendszer möueno~A vírus síapttesre
A plazmldalapü rendszer vakcinák előállítására szolgáló kereskedelmi haszáosságfeak meghatározására létrehoztuk a A/?R/8/34(RlNÍ) aiaptörzset („mester sírafe”), amelyet jelenleg ínaktívált vakcina előállításúm alkalmaznak, teljes egészében klónozott cDNS-böl, atomi azt a 2. példában leírtuk. A rekombináns vírus tcsiásokbau történő passzálása után HA vizsgálati eljárással meghatározott vínisfcozam ugyanolyan magas volt, mint a szőlői vad típusd vírus esetés. Ezen eredmények bizonyították, hogy a keletkezett rekombíttáus vírusai ugyanolyanok. a növekedési taiajdíísság&i, mint a szülői, tojásban tenyésztett. vírusnak, és jelzik, hogy a nyoíepbzmidos hanszíékeíds eljárásnak van esélye a vaksmmdrusok előállítására jelenleg alkalmazott élj árásek javítására.
Anyaguk és eljárások
Hírttsok és mms^eáídd. Az AFR/S/SéCHíNl) mnuenzavírusí a Sí. Judo Cbildrens's Research Hospital gyűjteményéből szereztük be, és ÍÖ napos, embriót tartalmazó tyúktojásokban szaporítottuk. „Madm-Barby eanine kidney* (M.DCK) tartottunk fenn 10% FBS-t tartalmazó MÉM tápfeőzegben. 293T humán embrionális vesesejteket és Veres sejteket öptt-MBáé / tápközegben tenyésztettünk (Lile Technologies, Gakhersburg, MD), amely 5% magzati marhaszérumot (FBS) tartalmazott. A transzfekciós kísérlethez bat-méröhelyes szóvfittesyészlő míkrotiteríemezeket alkalmaztunk. Az együtt tenyésztett MDCK és 293T sejteket (Ő,2l x ÍÖ* sejt snl-eskéaí mindegyik sejtből) alkalmaztok a transzfektálásl kísérletben. 7hm/r ŐT-Z-st (Paavera, Madison, Wl) alkalmaztunk a gyártó uíasííásai szerint a sejtek transzfektáiására, Röviden, 1 pl DNS-re számítva 2 pl TranslT ΙΓ-Ζ-et összekevertük, és szobahőmérséklete» Iskübáltuk 45 percen keresztül, majd a sejtekbe?, adtuk. Hat órával később a DNS-íranszíekeiós elegyet helyettesítettük öpttriVRáé /-gyei. 24 Órával a transzfekíálás után 1 ml. TFCK-tripszint tartalmazó Q?wAffiM / tápkőzegöt adtunk a sejtekhez; ez a hozzáadás a TPCK-íripszio 0,5 pg/ml végkoncentrációját eredményezte a sejtek fakúszójában. A vírastiíert a seitfeíűlűszó MDCK sejtekben történő pssszálásűv&l és tarfolt vizsgálati eljárással határoztuk meg.
/TZ-PCT? ds a ptemids& etöféS&fáta, Virális RNS-t extoahálttínk embriót tartalmazó tojások 2δδ pl, vírust tartalmazó alfeníois-foiyadékábót a Qiagen RVeasy A'h-fének alkalmazásával, Rétlépéses RTFCR-t alkalmaztunk az egyes virális génszegmensek amplifskálás'ára. Röviden, az RNS-t cDNS~sé Irtuk át AMV reverz-trsnszkriptáz (Roche Oiagnesties, Germany) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint, és azután a eDNS-í ampliSkáítak az áhpínvd fffgb /ode/lrt PC/? (Rocfee Diagsostíes, Germasy) ab kalmazásával. Az ampliflkáclös program l ciklussal kezdődött 2 percig 94°C-os; majd 3Ö ciki»» 94s'C-on 20 másodpercen kérésziül, S4*C-o» 30 máscdperceo keresztel és 72°€-öu 3 perces kérésziül; és a program egy ciklussal fejeződött be 72°C-on 5 percen keresztül. Az alkalmazott íártónáltók vagy Bsal vagy BsmBl restrikciós euzlmheiyet tartalmazlak, hogy lehetővé tegyük az emésztett PCR-fragsnens pontos beillesztését a pHW20ÖŐ klónozó vektorba (lásd a 2. példát).
A HA, NP, NA, M, NS gének klónozására a PCR-fragmeaseket emésztettük BsmBÍ vagy' Bsal eaaámmek és a pHWSOOö klónozó vektorba ligáitok azokat. A F-génék klónozására két (P32, PA) vagy három (PS1) feagmenst izoláltunk, emésztettünk és pHW'2000-BsmBl vektorba ligáitok. Annak biztosítóf *
-46sára, hogy a gének sem tartalmaztak nemkívánt mutációkat, a PCR-eredető fragmenxsket megszskvenáltak. Az Á/WSN/Ü(HTNI) vírus cDNS-éí tartísltuszó nyolc plazxmdot pHW191-FB2, pHW192-BBl, pHW193~PÁ, pHW194-HA, pHW19ő-NP, pHW19ő-NÁ, pW19?-M és pHW198-NS plazinidnak neveztük el. A „Center fór Biotechnology at St Jade Cbiídreris Research HospitaN határozta meg templát DNS szekvenciáját A rodarsin vagy d-rodamb ^e-re/w/aste?· cyek seqweHeteg reuíV/o.n h'í, AmpPTsg .ÖAH js^hkm» FIS (Ferkin-Fdsner, Applied Biosystems, Inc. |PE/ABQ, Fos tér City, CA) és szánt etikus olígosukleotidok alkalmazásával A mintákat elektrofbretízáltnk, detektáltuk, és FENE/ ffii-jAe/ 373, ísötíei 373 Sfrercó vagy wdb/ 377 DNS-szskvesátorokon elemeztük.
Eredmények
VöwszerS vRNS-ek és mRNS~ek szintézisének tehetővé tételéhez megalkottuk az RNS-poi»l« pol-Π rendszert (lásd a 2. példát). Ebben a rendszerben vlrális cDNS-t inzertéinek a humán BNSpoliEueráz-l (pol-I) promóter és terminátor szekvenciák közé. Ezt a teljes pol-I transzkripciós egységet RNS-polimeráz-0 (polúl) promóter és poü(A)-hely szegélyezi, A két trasszLripcíós egység irányítottsága lehetővé teszi ncgatív-szessz vlrális RNS és pozitlv-szensz tnRNS szintézisét egyetlen virálís cDNStempláiréi. Ez a pol-I-pol-II rendszer a két celltsláris RNS-polisneráz enzim íranszkripdöjdnak inícíációjával indul a saját prométeréröl, feltehetőleg a sejtmag különböző kömp&rtmentjébes (lásd az I, ábrát). Nyolc plazroíd transsfektálása 293T sejtekbe a eelhdáris és vlrális transzkripciós és transzlációs gépezetből .származó molekulák kölosöühaíüsát eredméstyezi, és végső soron íértösó influesza-Á vírus keletkezik. Ez a rendszer nagyon hatékonynak bízosytdt az A/WSN/33(Hlbil) és A/TcaVHK/W312/97(BŐN 1) vírusok kialakítására (2. példa).
Mivel az ínaktivált mtlüenzavakcína előállítására szolgáló jelenlegi alaptőrzs az AdriVS/BdfHlNl), megkíséreltük ezt a vírust teljes egészében előállítani klónezotí cDNS-böl. A nyolc RNS-szegmeast reprezentáló cDNStekeb a.,pHW2t)08 vektorba inzeriáltnk. A kapott plazmídokat <pHW1.9l-PB2, pHW192-FB 1, pHWí 93-?Á,: pHW194-HA, pHWl95-NE, pHW196-NA, pHW197-M és pHW198-NS) transzfekíáltuk együk tenyésztett 293T-MDCK sejtekbe vagy Vero-MDCK sejtekbe. 72 órával a bansztéktálás utáa megha&lrozíuk a vífustltort MD€K sejtekben történő títrálással, Az együtt tenyésztett Vero-MDCK sejtek felüidszója 1 x lö4 pfb-t tartalmazott nd-enként, és az együtt tenyésztett 293T-MDCK sejtek felüíúszója 2 x lő” pfe-r tartalmazott mi-enként. A 293T-MDCK sejtek magasabb vírusbozamáí legvalószínűbb módon a 293T sejtek Verő sejtekhez viszonyított magasabb transzfekciós hatékonysága okozza. Ezek az eredoíények azt mutatják, hogy a nyolepiaznüdos rendszer lehetővé teszi A/PR/8Z?4(H INI) létrehozását klónozöd cDNS-ből.
A vad típusú vírus és a keletkezett rekombináns vírus növekedésének Ssszehaserdííására embriót tartalmazó tyúktojásokat oltottunk be a vad típusú vírusai vagy a rekotnbináns vírussal. .Az tdlantoísfoiyadákot 4S órával a fertőzés után gyűjtöttük be. A vlrushozamot HA vizsgálati eljárással határoztuk meg. Habár a HA~titerek eltértek az egyes tojások között, azt találtuk, hogy mindkét vírus UA-títere $ 120 és 10240 hetuagglutlnáciös egység között volt, jelezve, hogy mindkét vírus nagyhozamú izolátum. így a DNS-trauszlekeióv&l létrehozóit rekornblsáus vírusnak ugyauolyaa erőteljes a tenyésztési fenortpusEs, mint a szülői ízoláíomnak.
Diszkusszió »« φ**»
X ♦ * ♦. ♦ φφ» « *** «
A”? * * * * * ~ *y, v »*# «*«« »** *φ
A találmány szerinti nyolcpiazmldos rendszer elkerüli különálló plazmídok alkalmazását fehérjék expresszáltatására (lásd a technika állásának ismertetését), igy leegyszerűsíti az infloensa-A vírus teljes egészében klónozott cBNS-höl történd létrehozását. Vakcinák előállííásá. olyan vírus előállítását foglalja magában, amelyet virusoltványként alkalmaznak vakeinavírus előáll kásához akár tojásokban, akár sejítenyészetben. Egy vakcinákká program hatékonysága fdgg az olyan altípus kiválasztásától, amely nagyon illeszkedik a keringő patogén törzsekhez, hogy magas specifikus ellenanyag-titert stimuláljon a vakcináit populációban, hatásos védelmet eredményezve. A hat, az A/ÍWd/34 inflaenza-A belső génjeit kódoló aiapplazmídoí {pHW191-PB2,. pHWI92-PSl, pHW193-PA, pHWÍ95-NT, pHW197-M és pHW19S-NS) most már a&ahnazhatjuk a jelenleg keringő törzs HA és NA glikoproteinjeít kódoló piazmldokkal történő együttes toansziekiálásrs. Az egyes génszegmensek manipulálásnak képessége lehetővé teszi számunkra, hogy értékeljük, hogy melyik génszegmeosCek) tbmos(ak) az átrendezett vírusok tojásokban, valamint sejttenyészetbea való magas hozamú növekedéséhez.
Az a tény, hogy képesek voltunk két la&öratóriami mfiuenzavirss törzset (A/WSNZ33{HIHl) és A/PR/S/34{H1N1}] és egy szabadtéri izolútumot (A/Teal.'HKAkGU^^TfHdNíjl létrehoz!» csak nyolc plszmiö együtt transzfektálásával ezt sugallja, hogy a rendszer alkalmazható élő legyengített influenzavakcinák kifejlesztésére. Az iníranazálisan beadott legyengített élő vfrasvakcínák lokális, nyálkahártya!, sejt-kőzvetltetí és humoraiig immunitást váltattak ki. Azok a hidegre adaptált (ca) átrendeződött (CR) vírusok látszanak megbízható módon legyengitbst&sk, amelyek tartalmazzák az élő, legyengített bifluenza-A/Ann ,Arbor/ő/6Ö{H2N2) hat belső génjét, és a jelenkori vad típusú influenzavírusok bamaggluíínínjáf (HA) és neurssuntdázát (NA). Erről a vakcináról kimutatták, hogy hatékony .gyenaekekben és fiatal felnőttekben {Keltei és Piedra, „Textbook of ínfiueuza* szerk.; Nícholson és mtsai., 373390. old. {1998}}. Azonban túlzottan legyengített lehet ideális immunválasz stlmulálására idős emberekbe*!, akik az Amerikai Egyesült Államokban minden évben az infíuenzafertőzés eredményeképpen elhalálozó 28000-40080 személy fő csoportját képezik. Az egyes szegmensek hozzájárulása a legyengített fenotípushoz még nincs jói defiuiálva (Ksítei és Piádra, mint fent). Ezt az információt csak specifikus, meghatározod legyengítő mutációknak a vírusba történő sorozatos beépítésével lehet megszerezni. Mivel a részletes eletnxéshez szükséges nagyszámú Esardpuldlt vírus tesztelése, csak nyolc plazmid előállítása és trsnszfektálása egyszerűsíti a feladatot és csökkenti a céí eléréséhez szükséges időt és költséget.
5, összehasonlító példa línidirekckmábs RNS-poíimcráz~Kp«íh»eráz-íi transzkripciós rendszer iofíuenza-A vírus létrehozására nyolc plswidbőí
Az előző példák egy rendszert Írnek le az íntluesza-A vírus létrehozására csak nyolc plazmid együttes Iranszfektálásával, amelyekről segatív-szensz v.RNS és poziliv-szensz m.RNS expresszálódík (ezt a munkát azt követően publikáltuk; lásd Hofímsnn és mtsak, Proc. Natl. Aead. Sói. USA 97, ólöS6113. old, (2DÖÖ)j, Ez a példa egy eltérő transzkripciós rendszer megalkotását írja le vfeusszerő RNS-ek expresszáiíatásárs, lehetővé téve sspkázatlan pozitív-szensz cRNS és S’-sapkásoíí mRNS ísíracelluláris szintézisét egyeben tempiátről. Nyolc, tandem helyzetű RNS-poM-pd-ll promótert és a A/WSW33 (HINI) cDNS-óí tartalmazó plazmíá együttes transzfebálása fertőző mfiueaza-Á vírus létrehozását eredményezte, noha alacsonyabb vírashozammal, mint a bidirekdonálb rendszer. A megközelítési mó*«*
-48φ φφ ΐ * * *
Λ »«« *
Φ ♦ * * » ίΜ ♦** ** áusk vagy vRNS és raKNS, vagy cRNS és mRNS mtraeeiluláris létrefeossásáre minimális plszmídkászlettel alkalmazható más KNS-vírusök reverz-genetíkai rendszerének megalkotására vagy optimalizálására.
Az ebben a példában leírt eredményeket publikáltok [lásd Hotfmann és Webster, J, Gén. Vtrol. Sí, 2843. old, <2000)}.
Ncgatlv-szensz RNS-yfrus létrehozásához akár negatív-szensz vRNS, akár pozitív-szensz c&NS szolgálhat terápiáiként A vírus visszanyeréséhez szükséges pisztnidok számának csőkkeatéséhez úgy gondoltuk, hogy esetleg lehetséges, hogy celluláris RNS-pol-1 és pol-H cRNS-t és mRNS-t szintetizáljon egy templáíről, Tehát megkíséreltük egy tiuidirekcíísnálls pol-l-pol-il transzkripciós rendszer kifejlesztését (5. ábra). Virális cÖNS-t huertáltunk pozhív-szeusz irányítottságban RNS-pol-l promóter és ternűnátor szekvencia közé. Est a teljes pol-1 transzkripciós egységet beiszertálíuk pozkív-szensz irányítottságban egy RNS-poi-H promóter és poHadeniláeiós szignál közé (S. ábra), Ellentétben a bidirekciönáiís transzkripciós rendszerrel előállított negatlv-szensz vRNS-sel és a pozirtv-szensz mRNS-sel (i. ábra), kétfajta pozirtv-szensz RNS szintézisét vártuk. A poi-S prosnóserról 5’ sapkaszerksKetsl tartalmazó mRNS-nek keli átlrődnía a nokleoplazmában. Esnek a transzkríptomnak fehérjévé keli transzlálödnia, A nukleóluszban a ceJMáris poí-I-fói szt várjuk, hogy teljes hosszúságú, pozittv-szensz Mueazavhas cRNS-t szintetizál trifoszfát-csoporttai az. 5' végén (5. ábra). Tetszőleges cDNS-lfagnsensek beinzertálására alkalmazható pHWll klónozó vektort konstruáltunk (6. ábra). .Ez a plazmád tartalmazza a pol-ö promótert (a humán ciíomegafevitos awrnli korai prömóiere) és a humán pol-1 promátert, amelyek leolvasással ellentétes irányban találhatók a pol-1 íerminátor szekvenciától és egy poli(A)-belytói.
Ásnak tesztelésére, hogy a fertőző kjŐscsza-A vírus létrehozható eRNS és mRNS egyetlen terápiáiról történő szintézisével, nyolc plazmídot állítottunk elő. A pHW'i?bPB2, p.HW172-PSl, pHW'173-ΡΑ, pHW174-HA, p.HW!75-NP, pHW!76~NA, pW177-M és pHW17S~NS plazmátok az AAVSN/33(HIN1) bfluenza-A tőm nyolc gésszegraenséi reprezentáló cDNS-t tartalmazzák. Ezen cDNS-ek mindegyike pozitív-szensz irányítottságban található a pol-1 és pol-ll promőterhez viszonyítva. A nyolc plazmádét (1 pg mindegyik piasmidból) 293'f vagy COS-1 sejtekbe íranszfektáltuk MDCK sejtek együtt tenyésztésével vagy anélkül, amint azt a 2. példában leírjak,
A transzfektáit sejtek felüiúszójának virushözamát meghatároztok kslöabőzó időpontokban tarfolt vizsgálati eljárással MDCK sejtekre történő passzáiás után. 48 órával a transzfektálás után 2-5 x áö3 fertőző virion keletkezeit (3. táblázat), 72 órával a teansziektálás után a felülüszó 4 x lő4 pftoml-t tartalmazott 2937 sejtek írauszfekíáiósa után, vagy 2 x IS4 plu'ml-t tartalmazóit COS-1 sejtek íranszfektáiása után. A vírushözam 72 óra elteltével aövelhető 293T sejtek vagy CÖS-1 sejtek MDCK sejtekkel történő együtt tenyésztésével (3. táblázat).
A vírus keletkezése bizonyítja, hogy a nyolc plazmid transxfektáiása után az KNS-poH messzinteíizáiia a nyolc, s&pkázatian, posídv-szcnsz cRNS-t, A négy, celltrláris poi-íl által színtesizák celluláris RNS-rŐl transziálődoti virális pohmcráz fehérje kötődött a csupasz vírusszerü eRNS-hes, eTNT-ket formálva, A FBI poltmeráz-alegység fontos a vimsszerü eRNS-ek terminális szerkezetének felismeréséhez és kötéséhez [Oouzález és Ortin, EMBÖ 1. 18, 3767. old, (1999); Gonzálcz ás Öríin. J, Virok 73, 631. old. (1999); és Li és misül,, EMBÖ J, 17, 5844. old. (1998)), A kölcsönhatás más poHmeráz fehérjékkel elindította a repilkációs-feanszkripciős ciklust, ami vRNP-k és virális mRNS-ek szintézisét eredményezte (Toyoda és missí., J. Gén, Vírol. 77, 2149. old. (1996); González és reísaL, Muci. Acids Rés. 29, 4456.
19(1990)}. A pöM-pol-Tl rendszerben bét különböző fajta mRNS szfetetizálödik. Az egyik közvetlenül a plazmió DNS-röl szístetlzálődák az. RNS-poMl által, és tartalmazza a pel-i promáter szekvencia 225 bpiát az 5' végen, és a poi-í termináterl a 3’ véges. Egy másik m&NS szí«tet52álőá& a virális polimeráz·' komplex fehérjéi által, amelyek a v&NB-í alkalmazzák terápiáiként Ezen mRNS 5’ sapkaszerkezete a „cap saatc&Hig” mechanizmus öljön keletkezik, amelyben a FB2 pollmeráz-alegység leszedi a sapkái a cellniárts RNS-ekrSl (Ütemen és nrtsaL Proe, NatL Acad. Sci. USA 21, 3607. oki. (1981)], Habar mindkét mRNS-£ajt& különbözik az 5’ és 3’ nem kódoló régióban, ugyanazokat az nyílt leolvasási fázisokat tartalmazzák aa: összes virális fehérje esetében. A transziáit szerkezeti fehérjék a vRNP-kkel együtt összeállnak fertőző mőuenza-A vírust létrehozva.
>
ι ' i T...... ........m1 --------------------,
V«j>8»gBffiS íÉítóátfis : ϊ ' V v ' fi ftiytíT^fcfiftíVVÍ —......«......—η
1 pwm«' í«7« pWffiffi p8¥Rl« ' pHfrttffi 1 pffliM i
'í w pWMi pRWBi .......... p»S pWBi Ί 1
3 pHwnm pinsS pia piró-FÁ J ρΒ» ί pw pBiS# ! .......... .1,
4 pHWMÁ p®i?4« pÉ!?4< pite i pMMÁ ρ»!»
3 5«?« pffli'M pWlW pl» pffl«
pWtM pÖiW ί í»» ........J ”l 'L '- J --. !i 11 11 pMMÁ ', „ ., ........ X
( , . ........... jSlW ' PM pBM P»>M pWÖ pra J ! ρβ·Μ ' Ϊ
í...................... i Ϊ pS« :- |ÜÍ p8W« ꨅ ! í
s 2< 2® w CÖS-l j M i w cos-r J cös-i
1 ξ j - j +ΜΚΧ tWI ί J................. ......... 1 +WK
Iswptet j.............. í' w lilKíiO ...t .............. «83«
iVirtMWW
24 Pa 8 8 6 ! « | Sxíií2 4stf i hf iriíi3
; 4SÓB & 1 í Μ 1 ί 1 ~w H híF ixtf íxftf i
?2és ííi? ............... p~ ilrf Hitt5 y i2x»s I......... irf 3xB!
* m » * » » x 4
4 ♦ 4 <♦ « « » í .» » »x4 4 ♦ 4 V X * »
» 4 ♦ 4 4 4 »4
Λ»»*
Habár a WSN—vírus létrehozása a nyolc tandem-promóterS pfezaaddál transztektáit sejtből nagyon megbízhatónak bizonyuk, ezen eRNS-mRNS megközelítési mód vírushuzama afecseeyahb volt. mint a bidárekcionális rendszeré, mely vRNS és jsKNS iranszkKptumokgt hoz léire (3, táblázat). 72 órával a 393T vagy -COS-l sejteknek a bidirekcionálís poM-pol-Π transzkripciós rendszert tartalmazó nyolc plazmáddal íörtéftó transzfoktáláss után [1, ábra; 2. példa; lásd Neumann és mim., Proc. Naíl. Acad. Seb USA 97, 6108. old. (2000); pHWÍSl-F82, pHWlB2-PBk pHW183-PA, pHWI84~HÁ, pHWl SS-NP, pHWW-NA, pHW187-M és pHWl§§-NS], a vlmsiiier 1 χ 107 pfedmi volt (3. táblázat). 24 órával COS-l vagy 293T sejtek transzfektálása után 0,4-1 x lö4 pfe'ml volt a leiüiúszóbsn. Ezen adatok azt mutatják, hogy a nyolcplazmidos hidirekoionális rendszernek hasonló kinetikával azonos a vím létrehozási hatékonysága, mint a kmplWiabfe és nehézkes íöbbplaztnidos rendszereknek, amelyekhez 12 vagy 17 phszmid együttes trauszfeketója szükséges [Neumann és mtsaí, Proc. Nath Acad. Sci. HSA 96,9345. old, (1999)1.
Nem találtunk fertőző vírust 24 órával a nyolc ísadexa elhelyezkedésű promótert tartalmazó plazma! transzfektálása után (3. táblázat). Ezen eredmények azt sugallják, hogy a vRNS-mRNS és eRNSraRNS megközelítési módok virushozama közötti különbségek az elsődleges pol-I-írasszkriptumok különböző polaritásából következnek. A bídirekcíonális rendszer v.RNS ímracellnlárís szintézisével kezdődik, egy olyan helyzettel, amely hasonlít a természetes intluenza-A fertőzésre, amelyben vRNP-k jutnák be a sejtmagba, és a vKNP-k kezdetben mRNS és cRNS szintézisének templáíjaként szolgálnak. Az uuidirekcionáliá rendszerben cRNF-k az első előállított repiíkácíá-kompetens egységek. Az mRNS-ek előállításához & cRNS-eknek vRNS-ekké kell rephkálódninfc, és a vRNF-knek végül utód vírusrészeeskékbe kell pakoíódniuk (Hsu és mtssí, J, Gén. Virol. 77,2575, old. (I9S7)], A vRNF-k és cRNP-k létrehozásához szükséges további reakciók miatt a vírus kialakulása, az unidirekcionális rendszerben később következik be, mint bidirekcionáits rendszerben,
A két rendszer virushozama közötti különbségek másik lehetséges oka sz, hogy a eDNS-ben lévő szekvencfeslemek csökkentik a transzkripció hatékonyságát a transzkripció tsonmálásával, vagy az RNS'íranszkriptumokban lévő szekvenciák csökkentik a pol-1 vagy pol-Π transzkriplnmok egyensúlyi szintjét. A nyolc vírusszerö cRNS vagy mRNS közül csak egynek az alacsonyabb koncentrációja csökkenti a rendszer összhaíékenyságát, mivel az összes vRNP-nek és szerkezeti fehérjének meg kell szintéi!zálódnia olyan koncentrációban, amely optimális a vírus replikáélójához és a vírus összeszereléséhez,
A nyoleplazmldos rendszer magas hatékonysága intluenza-A vírus létrehozására azt jelzi, hogy ez a. rendszer alkalmazható más· ortomisovirusök, például iníluenza-B vírus, mfhmza-C vírus és togetovfrus esetén is, Ezen vizsgálat eredményei azt sugallják, hogy a vRNS-mRNS rendszer lehet a leghatékonyabb mód ezen vírusok teljes egészében plazmidokról történő létrehozására. A találmány lehetővé teszi pol-l-alapú rendszer megalkotását az. ortomkovlrusoktól eltérő RNS-vtesok létrehozására, például paramixovirusok, arenavlrusek vagy banysvirusok létrehozására [Eoberts, A, és Rose, 3. K., Viroiogy 247, l-ő. old. (199S); Bridgen és Elírni, Proc. Naíi. Aead. Sci. USA 93, 15400. old. (1 W>; Lee és mtsal., 3. Virol. 74, 3470·. old. (2908)). Ellentétben sz ort-omixovírusokkal, a legtöbb RNS-vírus a fertőzött sejtek eltoplazmájában replikálódik, Az evolúciójuk során ezen vírusok RNS-e nem volt kitéve a sejtmagban található szelekciós nyomásnak, például „splic.ing”-nek. Általában a nem szegmentált negatív-szálú RNS-virusok reverz-genetíka! rendszerei T? prörnőterrői történő imr&eellulárís transzkripción
977Ó5-194Ö-U
-52a * * alapulnak, amit Cönsrimann· és mtsaí, alkalmaztak eMkéat veszettség vírusának kimentésére (Sehrssll és mtsat, £MBO J. 13,4195. old. (1994)]. A vfcusszerü RN5-ek sxpresszíójáí T? RNS-polimeráz irányítja, akár rekombmáns Vaceiaia-viressal történő fertőzéssel, akár 17 KNS-pofeerázt koustitutívan espresszáló sejívonalak alkalmazásával. Ellentétben a pold transzkripcióval. amely a sejtmagban történik, & T? promőíer általi transzkripció 3 ehopíassában megy végbe. A poM transzkripciós rendszer alkalmazása eítoplazmaíikus SNS-Vfrusokra azt tenné szükségessé, hogy az RNS-trasszkriptumok ki&záiiítódjanak a sejtmagból. Azt, hogy poi-l íranszkríptaraok valóban kiszállítódnak a sejtmagból, alátámasztja a fefeérjetermelés detektálása az 5’ nem kódoló régiójukban „miemal ríbosomal eatry síié” helyet hordozó pol-1 transzkripíumokat tartalmazó sejtekben [Palmer és ártsál, Nucl Ácids. Rés. 21, 3451, oM, (1993)}, Mivel limitált információ áll rendelkezésre a poi-1 'íransakripttnsok kiszállításáért vagy visszatartásáért alapvető fontosságú szekvenciákkal kapcsolatban, segaílv-szensz. vagy pozüív-szansz RHS-ek szintézise különböző hatékonyságú sejtmag! kiszállítást eredeméayezhet. Ezenfelül a nagy pol-11 által létrehozott koronaviras-szeríi teszkriplumok (több mint 3Ö0ÖÖ wfcleotíd) kiszélfitása a sejtmagból [Almásán és mtsai., Proc. Mail. Acad Ser. USA 97, 55lő, old, (2900)] azt jelzi, hogy inkább specifikus RNSszekveneiák. mini a hasszkriplüm hossza lehet kulcsfontosságú a kiszállítás szempontjából, Az általunk kifejlesztett pol-í-pol-ll klónozó vektorok és a restrikciós ettdorsakleázok alkalmazásán alapuló hatékony klónozás! eljárás lehetővé teszi sejtmagban szintetizált pozitív- és negatív-szensz RNS-ek alkalmazását eitoplazmatikas RNS-vírusok létrehozására ésszerű költséggel és ésszerű időn belül.
SXEKVENC5ÁLXSTA <110> St. Judo Children's Hospftai <120 DNS Tanézfekeié® rendszer fertőző influenzavírus előállítására <14 0 PCT/ÖSG1 /13650 <•40 20000-2?
<16ő> 2.1 <21Q> 1 <21i> IS <212> DMS <213> mesterséges szekvencia <220>
<223> PCR primer {Seb-PBIHI) <400 I apgatogpst tcctcaagg 19 <210 2 <2O> 20 <2.12 > DNS <213> mesterséges szekvencia· <22Ό <223> PCR primer ·Seq-P31&2) <400 2 get a tggttt -ceagagcecg <210> 3 <2U> 28 <212> WS <213> mesterséges szekvencia <22ö>
<223> ?CR primer (2κΌδ1-~1) <400> 3 tattcgtctc aggaagcgaa agcaggca <21!» 4 <210 33 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220 <223> PCA primer lBm-P31~2341R;
<400 4 atatcgtctc gtattagtag aaacaaggca fctc « » > » « *♦·* <
« X Φ ♦ ♦·.*· ·♦·♦
<210 5
<211> 29
<212> DNS
<213> .mesterséges szekvencia
<22 ö>
<223> POR primer
<4 00 5
tattcgtctc agggagsaaa agcagggtg
<210 6
<210 34
<212> OS
<213> mesterséges szekvencia
<220
<22 3> PCP. primer {3m~NS'#2}
<400> 6
atatcgtctc gtattagtag aaacaagggt gttt ♦ Φ φφ φφ* * Λ Φ ♦
- 54<210 ?
<21.1> 2S <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <22δ>
<223> POR primer ISm-MU <40ö> 7 tatfccgfc-ctc agggagcaaa ag-caggtag <210> 8 <2 .U > 37 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220 <223> FCR primer ;Bm~m25 <400 3 afcafccgtctc gfcattagtag aaacaaggta gtttttt <2X$> 3 <21I> 3 <212 > DNS <2.13> mesterséges szekvencia <220 <220 FÜR priiaer (Bm-NAi-lJ <4Öö> S tattcgtctc agggagcaaa ageaggagfct taacatg <210> 10 <21I> 35 <212> DOS <213> mesterséges szekvencia <220 <223> PCR primer {Sm~NA~1413S;
<400 10 atatcgtctc gtattagtag aaacaaggag rfcfc·:;:
<210> 11 <211> 34 < 2 2 2 > DNS <213> mesterséges szekvencia * *»* * « a * * ♦
«.Ji Jfr ΦΦΦΦ ♦ * *
- S5 ♦* β * ♦ M- * * * ·*'*·* * ♦ »··»♦ <223> PCR primer · Bm-RS-l) <4ÖO> 1.1 tattcgtetc agggagcaaa agcaggggaa aatg <210 12:
<210 34 <212> DBS <213> mesterséges szekvencia <220 <223> PCR primer ÍB®-«2} <400- 12 atatcgtctc gtattagtag aaacaagggt gtfcfc <210 13 <21.1> 29 <212> OS <213.> mesterséges szekvencia <220>
<223> PCS. primer (Ba-'NP-lJ <4ÖQ> 13 fcattggtctc agggagcgaa agcagggta <21'Q> 14 <2U> 33 <212> W <213> mesterséges: szekvencia <220 <223> FCR primer íSa~RP1555R} <400> 14 atafcggt.ctc gtat tagtag aaacaag-ggt att <2:10 IS <210 35 <212> DNS <2.13> mesterséges szekvencia <220 <223> PCR ©rim-er (Bm-PAl-U <400 15
9« »««♦ «***
-56tatccgtctc agggsgcgaa agcaggtact gatcc <210> 16 <212> 36 <212 > ÖRS <213> mesterséges szekvencia <22 ö>
<223> 2CR primer f&t-R&l-2231R) <40Ö> 16 atatcgt-ct-o gtattagtag aaacaagqta cttttt <210> 17 <21X> 32 <212> ÖRS <213> mesterséges szekvencia <220>
<223> PCR primer IBm-PBla-l) <4ÖÖ> 17 tattcgtctc agggagcgaa agcaggcaaa cc » ♦ * « φ«Χ * «** * * #»«* X·** <210> IS <211> 33 <21z> ÖRS <213> mesterséges szekvencia <22Q>
<22 3> FÜR primer (.3m-FBl-2341R} <4GÖ> 18 atatcgtctc gtattagtag aaac.aaggca ttt <210> 19 <211> 38 <212> ÖRS <22.3> mesterséges szekvencia <220>
<223> PCF. primer í3a~PS2~l! <400> 19 tattggtctc agggagcgaa agcaggteaa ttatatte <210> 23 <2il> 36
XX X 9 a * « »x« e « ♦
Φ9Φ ♦«»* »** <212> DNS <213> -mesterséges szekvencia <22ö>
<223> »CR primer ?Ba~DB2-234ÍR? <4 00> 20 afcatggtctc gtafctagtag asacaaggtí <210> 21 <211> 12 <,212> DNS <213> mesterséges szekvencia <22 0>
<223> PCR primer <400> 21 agc-aaaagca gg

Claims (23)

1, Minimális plazmidalapú rendszer fertőző negatív-szálú RNS-vírások klónozott vitális c!>NS~ bői történő előállítására, amely olyan plazmídok készletét tartalmazza, amelyek mindegyike egy autonóm virális génszegmensnek- megfelelő virális eDNS-t tartalmaz, amely RNS-polimeráz-i (pol-1) promóter és termmáíor szekvenciák köze van inzertálva, ezáltal a eDNS képes vR.NS expresszióián&k irányítására, és amely cDNS inzertálva vauRNS-polimeráz-li (pol-11) promóter és egy poliadem'iációs szignál közé is, ezáltal a «DNS képes mRNS expressziójának irányítására is, és almi a plazmid rendszer cDNS bidirekcionáiis plazmid rendszer,
2, Az 1. igénypont szerinti plazmidriapá rendszer, amelyben a terminátor szekvencia RNSpotiineráz-í (pol-Ij temtinátör szekvencia.
3, Az 1. igénypont szerinti plaznttdalapú rendszer, amelyben a tertninátor szekvencia ribozim szekvencia.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti plazmidalapú rendszer, amelyben a a vRNS pontosan 3’ véget tartalmaz.
5, Az M. igénypontok bármelyike szerinti plazmidalapá rendszer, amelyben az RNS-virus az öfíbornyvovfetáív víruscsalád tagja,
ó. Az 5. igénypont szerinti plaztnidaiapú rendszer, amelyben az ONhíWxovhfeöt·? vírus. iníluenza-A vírus,
7. Az 5. igénypont szerinti piazmidalapú rendszer, amelyben az vírus in.flnenza-B vírus.
S. Az 5-7. igénypontok bármelyike szerinti plazmidslapú rendszer, amelyben a virális génszegmens virális polimeráz-komplex feltétje, M-fehérie vagy NS-fehérje génjének bármelyikét kódolja; és a gének, olyan törzsből származnak, amely jól adaptálódott sejítenyészetben történő növekedéshez, vagy legyengíteti törzs, vagy mindkettő.
9. Az 5-7. Igénypontok bármelyike szerinti plazmidslapú rendszer, amelyben a virális génszegmens hemagglolinmí: (HA) vagy neufatninidázt (NA) kódoló gént tartalmaz, vagy mindkettői; és a gének patogéf: ia8««nasavfrusból százmszttak,
18. A 7. Igénypont szerinti plazmidalapú rendszer, amely a következők által alkotott csoportból kiválasztott piazmidot tartalmaz: Í*B2 gént tartalmazó plazmid, FBI gént tartalmazó: plazmid, PA gént tartalmazd plaznrid, HA géni tartalmazó plazmid, NP gént tartalmazó plazmid. NA gént tartalmazó plazmid, M gént tartalmazó plazmid és NS gént tartalmazó plazmád.
11, Gazdasejt, amely az 1-18. igénypontok bármelyike szerinti plazmidalapú rendszert tartalmazza,
12, Eljárás negatív-szálú RNS-vórus előállítására, srzn/yelfemezve, hogy a 11. igénypont szerinti gazdasejtet olyan körülmények között tenyésztjük, amelyek lehetővé teszik virális fehérjék és vRNS előállítását.
13. A 12, Igénypont szerinti eljárás, ahol az RNS vlrss patogén.
14. Á 12. vagy 13. igénypont szerinti: eljárás, ahol az RNS-virus az <Wwí>aöVír«&e vírtBcsalád tagja.
15«. A 14«. igénypont szerinti eljárás, ahol az <7rráö»nn.'övfrú/sse vírus influenza-A vírus,
16« A. 14. igénypont szerinti eljárás, ahol vírus isíksenza-B vírus,
17«. Eljárás legyengített negatív-szálú RNS-vírus létrehozására, szru/yelfemezve, hogy:
(a) egy vagy több virális génszegmensí mutáltattmk az 1-10, igénypontok bármelyike szerinti plazntídalapö rendszerijén; és (b) meghatározzuk, hogy a píazmhlalapú rendszerben keletkezett negatív szálú RNS-vöwok alkalmas gazdassjtbe bejuttatva legyengítettek-e,
IS, Eljárás legyengíteti negatív-szálú RNS-vírus létrehozására vakcinákban történő alkalmazásra sezaí je/femejve, hogy:
iá) az 1-10, igénypontok bármelyike szerinti piaztuidalspá rendszert tartalmazó gszdssejíet tenyésztünk a vírus létrehozására; és (b) megtisztítjuk a gazdasejt által termelt vírust.
19. A 17. vagy IS. igénypont szerinti eljárás, ahol az RNS-vírus az' öríAo^>«f?vlriíá3e víntscsalád tagja.
20. A 19. igénypont szerinti eljárás, ahol az Orriowyxw/rfdae v-íras iafiuenza-A vírus,
21. A 19. igénypont szerinti eljárás, ahol az dbráota>xcfvfeúzöe vírus infiuenza-B vírus,
22. A 12-21. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal felemezve, hogy a gazdasejt a kővetkezők által alkotott csoportból van kiválasztva: „Madsn-Darby Canrne Kidney” (MDCK) sejtek, VERŐ sejtek, CV1 sejtek, CÖS-1 sejtek, COS-7 sejtek és BfíK-1 sejtek.
23. A 22. igénypont szerinti eljárás, ahol a gazáasejt VERŐ sejt.
24. A 12-15., 17-20. vagy a 22-23 . igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a plazmidalapú rendszer legalább egy plazatidja az Á/TR/S/34 mflusnzatörss virális gfezegtsensét tartalmazza.
25. A 12-1S., 17-20, vagy a 22-23 . igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a plazmidalapú -rendszer legalább egy plaznridja az Á/'Ann Arbor/b.-'fsö iníiuenzatőrzs virális génszegmenséí tartalmazza.
26. A 1.2-15., 17-20. vagy a 22-23, igénypontok bánnelytke szerinti eljárás, ahol a plazmídaiapú rendszer legalább egy plazmidja a BZAna Aífcorii/66 iníluenzatörzs: virális génszegmensét tartalmazza.
27. Az 1 -10. igénypontok bármelyike szerinti plazmidalapú rendszer virális fertőzés kezelésére vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer gyártására, ahol a fertőzés m&enzafertozés.
HU0303036A 2000-04-28 2001-04-27 Dna transfection system for the generation of infectious influenza virus HU229101B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US20067900P 2000-04-28 2000-04-28
PCT/US2001/013656 WO2001083794A2 (en) 2000-04-28 2001-04-27 Dna transfection system for the generation of infectious influenza virus

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0303036A2 HUP0303036A2 (hu) 2003-12-29
HUP0303036A3 HUP0303036A3 (en) 2004-10-28
HU229101B1 true HU229101B1 (en) 2013-07-29

Family

ID=22742710

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0303036A HU229101B1 (en) 2000-04-28 2001-04-27 Dna transfection system for the generation of infectious influenza virus

Country Status (26)

Country Link
US (6) US6951754B2 (hu)
EP (2) EP1317559B1 (hu)
JP (3) JP2004500842A (hu)
KR (2) KR100848719B1 (hu)
CN (2) CN100489107C (hu)
AT (1) ATE420189T1 (hu)
AU (3) AU5921101A (hu)
BR (1) BRPI0110607B8 (hu)
CA (1) CA2406100C (hu)
CY (1) CY1108735T1 (hu)
DE (2) DE122011100039I1 (hu)
DK (1) DK1317559T3 (hu)
EA (1) EA006311B1 (hu)
ES (1) ES2319864T3 (hu)
HK (1) HK1055992A1 (hu)
HU (1) HU229101B1 (hu)
IL (1) IL152426A (hu)
MX (1) MXPA02010642A (hu)
NO (1) NO332080B1 (hu)
NZ (1) NZ521840A (hu)
PL (1) PL205955B1 (hu)
PT (1) PT1317559E (hu)
SI (1) SI1317559T1 (hu)
UA (1) UA84254C2 (hu)
WO (1) WO2001083794A2 (hu)
ZA (1) ZA200208065B (hu)

Families Citing this family (132)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8715940B2 (en) 1999-04-06 2014-05-06 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of making recombinant influenza virus
WO2001083794A2 (en) * 2000-04-28 2001-11-08 St. Jude Children's Research Hospital Dna transfection system for the generation of infectious influenza virus
AU2003231083A1 (en) * 2002-04-26 2003-11-10 Medimmune, Llc Multi plasmid system for the production of influenza virus
US7465456B2 (en) 2002-04-26 2008-12-16 Medimmune, Llc Multi plasmid system for the production of influenza virus
ES2427139T3 (es) 2002-06-20 2013-10-29 Institut Pasteur Virus recombinantes del sarampión que expresan epítopos de antígenos de virus de ARN y uso de los virus recombinantes para la preparación de composiciones de vacuna
EP2110382A1 (en) 2002-06-20 2009-10-21 Institut Pasteur Infectious cDNA of an improved vaccine strain of measles virus, use for immunogenic compositions
DE10248301A1 (de) * 2002-10-16 2004-04-29 Philipps-Universität Marburg Herstellung eines Lebend-Impfstoffes gegen Influenza-Viren
EP1597400B8 (en) 2003-02-25 2013-10-09 MedImmune, LLC Methods of producing influenza vaccine compositions
US20060110406A1 (en) * 2003-02-25 2006-05-25 Medimmune Vaccines, Inc. Refrigerator-temperature stable influenza vaccine compositions
CA2432738A1 (en) 2003-02-26 2004-08-26 Philippe Despres New dengue and west nile viruses proteins and genes coding the foregoing, and their use in vaccinal, therapeutic and diagnostic applications
AU2004274860A1 (en) * 2003-05-28 2005-03-31 Wisconsin Alumni Research Foundation Recombinant influenza vectors with a polII promoter and ribozymes
EP1631663B1 (en) * 2003-05-28 2016-08-24 Wisconsin Alumni Research Foundation High titer recombinant influenza viruses for vaccines and gene therapy
WO2005018539A2 (en) 2003-06-16 2005-03-03 Medimmune Vaccines, Inc. Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
US7037707B2 (en) * 2003-09-04 2006-05-02 St. Jude Children's Research Hospital Method for generating influenza viruses and vaccines
DE602004027537D1 (hu) * 2003-12-23 2010-07-15 Medimmune Inc
DE202005022108U1 (de) 2004-03-09 2013-11-12 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Influenza-Virus-Impfstoffe
DE102004013335A1 (de) * 2004-03-17 2005-10-13 TransMIT Gesellschaft für Technologietransfer mbH Impfstoff gegen Influenza basierend auf Geflügelpestviren
EP1766034B1 (en) * 2004-05-21 2014-03-19 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Alphavirus vectors for influenza virus vaccines
DK1748790T3 (en) 2004-05-24 2015-10-19 Medimmune Llc Multiplasmidsystem for the production of influenza
CA2822895A1 (en) 2004-05-25 2005-12-08 Medimmune, Llc Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
KR101346989B1 (ko) 2004-10-06 2014-02-06 메디뮨 엘엘씨 냉장 온도 안정성 인플루엔자 백신 조성물
MX2007005818A (es) 2004-11-19 2007-07-20 Wisconsin Alumni Res Found Vectores recombinantes de la influenza con unidades de transcripcion en tandem.
US7510719B2 (en) * 2004-12-08 2009-03-31 Medimmune, Llc Methods of producing influenza vaccine compositions
JP5414178B2 (ja) 2004-12-23 2014-02-12 メディミューン，エルエルシー ウイルス増殖用の非腫瘍形成性ｍｄｃｋ細胞株
US7959930B2 (en) 2004-12-24 2011-06-14 Abbott Biologicals B.V. Rescue of influenza virus
ES2527503T3 (es) 2005-03-08 2015-01-26 Medimmune, Llc Virus influenza reordenantes
BRPI0612268A2 (pt) * 2005-06-21 2009-01-27 Medimmune Vaccines Inc Ácido nucleico isolado, vetor de expressço, mÉtodos para produzir um rna genâmico da influenza, para produzir um vÍrus da influenza recombinante, para gerar um vÍrus de rna segmentado de filamento negativo recombinante nas cÉlulas caninas cultivadas e para gerar partÍculas virais da influenza infecciosa em cÉlulas caninas cultivadas, cÉlula, e, vÍrus
US7790434B2 (en) * 2005-06-21 2010-09-07 Medimmune, Llc Methods and compositions for expressing negative-sense viral RNA in canine cells
EP2614836A3 (en) 2005-10-17 2013-10-23 MedImmune, LLC High growth reassortant influenza A virus
US11707520B2 (en) 2005-11-03 2023-07-25 Seqirus UK Limited Adjuvanted vaccines with non-virion antigens prepared from influenza viruses grown in cell culture
US20090304742A1 (en) 2005-11-04 2009-12-10 Novartis Vaccines And Diagnostics Srl Influenza vaccines with reduced amount of emulsion adjuvant
CA2628424A1 (en) 2005-11-04 2007-05-10 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Adjuvanted influenza vaccines including cytokine-inducing agents
WO2007052061A2 (en) 2005-11-04 2007-05-10 Novartis Vaccines And Diagnostics Srl Emulsions with free aqueous-phase surfactant as adjuvants for split influenza vaccines
NZ568211A (en) 2005-11-04 2011-11-25 Novartis Vaccines & Diagnostic Influenza vaccines including combinations of particulate adjuvants and immunopotentiators
PT2368572T (pt) 2005-11-04 2020-06-16 Seqirus Uk Ltd Vacinas com adjuvante dotadas de antigénios não-virião preparados a partir de vírus da gripe cultivado em cultura celular
NZ568212A (en) * 2005-11-04 2012-03-30 Novartis Vaccines & Diagnostic Changing Th1/Th2 balance in split influenza vaccines with adjuvants
KR20080089663A (ko) 2006-01-27 2008-10-07 노바티스 백신즈 앤드 다이아그노스틱스 게엠베하 운트 콤파니 카게 적혈구응집소 및 기질 단백질을 함유한 인플루엔자 백신
AU2007231027B2 (en) 2006-03-24 2013-10-03 Novartis Influenza Vaccines Marburg Gmbh Storage of influenza vaccines without refrigeration
AU2007245192B2 (en) 2006-03-31 2012-04-12 Wisconsin Alumni Research Foundation High titer recombinant influenza viruses for vaccines
AU2014202470B2 (en) * 2006-03-31 2016-08-04 Wisconsin Alumni Research Foundation High titer recombinant influenza viruses for vaccines
AU2012204138B2 (en) * 2006-03-31 2014-02-06 Wisconsin Alumni Research Foundation High titer recombinant influenza viruses for vaccines
WO2007124327A2 (en) 2006-04-19 2007-11-01 Medimmune Llc. Methods and compositions for expressing negative-sense viral rna in canine cells
US9072701B2 (en) 2006-04-21 2015-07-07 St. Jude Children's Research Hospital Avian influenza viruses, vaccines, compositions, formulations, and methods
US7507411B2 (en) * 2006-06-23 2009-03-24 University Of Saskatchewan Attenuated influenza NS1 variants
GB0614460D0 (en) 2006-07-20 2006-08-30 Novartis Ag Vaccines
WO2008133701A1 (en) * 2006-07-21 2008-11-06 Medimmune, Llc. Methods and compositions for increasing replication capacity of an influenza virus
CN104278014A (zh) * 2006-08-09 2015-01-14 米迪缪尼有限公司 流感血凝素和神经氨酸酶变体
AU2007297178B2 (en) 2006-09-11 2014-07-24 Novartis Ag Making influenza virus vaccines without using eggs
CN101627113B (zh) 2006-09-15 2013-04-24 米迪缪尼有限公司 支持病毒生长到高效价的mdck细胞系和采用该细胞系的生物反应器方法
US8202967B2 (en) 2006-10-27 2012-06-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. H5 proteins, nucleic acid molecules and vectors encoding for those, and their medicinal use
WO2008068631A2 (en) 2006-12-06 2008-06-12 Novartis Ag Vaccines including antigen from four strains of influenza virus
WO2008080091A2 (en) * 2006-12-21 2008-07-03 Vical Incorporated Activation of rig-i pathway
WO2008153236A1 (en) * 2007-06-15 2008-12-18 Protheon Co., Ltd An attenuated influenza virus and a live vaccine comprising the same
EP2674486A1 (en) 2007-06-18 2013-12-18 MedImmune, LLC Influenza B viruses having alterations in the hemaglutinin polypeptide
WO2008156778A2 (en) 2007-06-18 2008-12-24 Tokiko Watanabe Influenza m2 protein mutant viruses as live influenza attenuated vaccines
NZ582595A (en) 2007-06-27 2012-07-27 Novartis Ag Low-additive influenza vaccines
EP2045323A1 (en) * 2007-10-05 2009-04-08 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Linear expression constructs for production of influenza virus particles
SG10201606120XA (en) 2007-10-02 2016-09-29 Theranos Inc Modular Point-Of-Care Devices And Uses Thereof
GB0810305D0 (en) 2008-06-05 2008-07-09 Novartis Ag Influenza vaccination
MX2010005701A (es) * 2007-11-26 2010-08-31 London School Of Hygiene & Tro Metodo para producir cepa viral vacunal de un virus de la familia reoviridae.
NZ587798A (en) 2008-03-18 2013-06-28 Novartis Ag Improvements in the preparation of influenza virus vaccine antigens utilising a phosphate buffer
CA2730408A1 (en) 2008-07-11 2010-01-14 Chin-Fen Yang Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
KR20110074563A (ko) 2008-09-24 2011-06-30 메디뮨 엘엘씨 바이러스의 정제 방법
EP2233568A1 (en) * 2009-03-19 2010-09-29 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade AG Novel method for generation of RNA virus
CN102307590A (zh) 2009-02-10 2012-01-04 诺华有限公司 具有减少量的角鲨烯的流感疫苗
CA2752039A1 (en) 2009-02-10 2010-08-19 Novartis Ag Influenza vaccine regimens for pandemic-associated strains
WO2010092477A1 (en) 2009-02-10 2010-08-19 Novartis Ag Influenza vaccines with increased amounts of h3 antigen
EP2396033B1 (en) 2009-02-12 2016-09-28 MedImmune, LLC Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
CA2787099A1 (en) 2009-03-30 2010-10-14 Anice C. Lowen Influenza virus hemagglutinin polypeptides containing stem domains, vaccines and uses thereof
DE102010018462A1 (de) 2009-04-27 2011-04-07 Novartis Ag Impfstoffe zum Schutz gegen Influenza
WO2010144797A2 (en) 2009-06-12 2010-12-16 Vaccine Technologies, Incorporated Influenza vaccines with enhanced immunogenicity and uses thereof
WO2011014504A1 (en) 2009-07-27 2011-02-03 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Recombinant influenza virus vectors and uses thereof
CA2805505C (en) 2009-07-30 2021-08-03 Mount Sinai School Of Medecine Chimeric influenza viruses having reduced ability to reassort with other influenza viruses and uses thereof
CN102666860B (zh) 2009-07-31 2015-06-17 诺华股份有限公司 反向遗传系统
US20120237536A1 (en) 2009-09-10 2012-09-20 Novartis Combination vaccines against respiratory tract diseases
PL2491117T3 (pl) * 2009-10-20 2014-05-30 Novartis Ag Udoskonalone sposoby odzyskiwania wirusa wykorzystujące odwrotną genetykę
WO2011056591A1 (en) 2009-10-26 2011-05-12 Warf - Wisconsin Alumni Research Foundation High titer recombinant influenza viruses with enhanced replication in vero cells
CN102051345B (zh) * 2009-11-09 2013-04-17 中国医学科学院医药生物技术研究所 一种抗流行性感冒病毒药物的筛选方法
MX342716B (es) * 2010-02-18 2016-10-11 Sinai School Medicine Vacunas para su uso en la profilaxis y tratamiento de la enfermedad del virus de influenza.
US10130697B2 (en) 2010-03-23 2018-11-20 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Vaccines comprising mutant attenuated influenza viruses
CA2792537A1 (en) 2010-03-30 2011-10-06 Mount Sinai School Of Medicine Influenza virus vaccines and uses thereof
EA201201620A1 (ru) 2010-06-02 2013-07-30 Авир Грин Хилз Байотекнолоджи Рисерч Дивелопмент Трейд Аг Способ получения рнк-вируса
AR083533A1 (es) 2010-10-22 2013-03-06 Boehringer Ingelheim Vetmed Proteinas de hemaglutinina 5 (h5) para el tratamiento y prevencion de las infecciones de gripe
SG192069A1 (en) 2011-01-21 2013-08-30 Theranos Inc Systems and methods for sample use maximization
US8911975B2 (en) 2011-02-08 2014-12-16 Mie University Method for producing virus vector for gene transfer
US20130189303A1 (en) 2011-08-02 2013-07-25 Yan Zhou Recombinant swine influenza virus and uses thereof
AR088028A1 (es) 2011-08-15 2014-05-07 Boehringer Ingelheim Vetmed Proteinas h5, de h5n1 para un uso medicinal
EP2747778B1 (en) 2011-08-26 2017-12-06 Wisconsin Alumni Research Foundation Influenza viruses with mutant pb2 gene segment as live attenuated vaccines
US8475739B2 (en) 2011-09-25 2013-07-02 Theranos, Inc. Systems and methods for fluid handling
US20140170735A1 (en) 2011-09-25 2014-06-19 Elizabeth A. Holmes Systems and methods for multi-analysis
US9632102B2 (en) 2011-09-25 2017-04-25 Theranos, Inc. Systems and methods for multi-purpose analysis
US9664702B2 (en) 2011-09-25 2017-05-30 Theranos, Inc. Fluid handling apparatus and configurations
EP2758075B1 (en) 2011-09-20 2023-05-03 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
US10012664B2 (en) 2011-09-25 2018-07-03 Theranos Ip Company, Llc Systems and methods for fluid and component handling
US9810704B2 (en) 2013-02-18 2017-11-07 Theranos, Inc. Systems and methods for multi-analysis
WO2013130132A1 (en) 2011-10-07 2013-09-06 Medimmune, Llc Influenza hemagglutinin variants
US20140248320A1 (en) 2011-10-20 2014-09-04 Novartis Ag Adjuvanted influenza b virus vaccines for pediatric priming
WO2014019990A1 (en) 2012-08-03 2014-02-06 Sanofi Pasteur Production of infectious influenza viruses
GB201218195D0 (en) 2012-10-10 2012-11-21 Istituto Zooprofilattico Sperimentale Delle Venezie Composition
NZ627796A (en) 2012-12-18 2017-07-28 Icahn School Med Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
US11008628B1 (en) 2013-02-18 2021-05-18 Labrador Diagnostics Llc Systems and methods for analyte testing and laboratory oversight
US10401373B1 (en) 2013-02-18 2019-09-03 Theranos Ip Company, Llc Systems and methods for analyte testing and laboratory oversight
ES2689878T3 (es) 2013-02-21 2018-11-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Proteínas H5 del virus de la gripe H5N1 para su uso como un medicamento
WO2014159960A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Antibodies against influenza virus hemagglutinin and uses thereof
EP3022296B1 (en) 2013-07-15 2022-12-28 Wisconsin Alumni Research Foundation High titer recombinant influenza viruses with enhanced replication in mdck or vero cells or eggs
US10422806B1 (en) 2013-07-25 2019-09-24 Theranos Ip Company, Llc Methods for improving assays of biological samples
CA2931637C (en) 2013-12-09 2023-10-10 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treating hemophilia
CN103757032B (zh) * 2014-01-28 2017-06-06 中国人民解放军第三0二医院 一种以流感病毒为载体的hcv嵌合疫苗及其制备方法
US10370680B2 (en) 2014-02-24 2019-08-06 Sangamo Therapeutics, Inc. Method of treating factor IX deficiency using nuclease-mediated targeted integration
US11360107B1 (en) 2014-02-25 2022-06-14 Labrador Diagnostics Llc Systems and methods for sample handling
CN106459894B (zh) 2014-03-18 2020-02-18 桑格摩生物科学股份有限公司 用于调控锌指蛋白表达的方法和组合物
WO2015196150A2 (en) 2014-06-20 2015-12-23 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Mutations that confer genetic stability to additional genes in influenza viruses
MA40772A (fr) * 2014-10-02 2017-08-08 Vertex Pharma Variants du virus de la grippe a
MA40773A (fr) * 2014-10-02 2017-08-08 Vertex Pharma Variants du virus influenza a
CN104450695B (zh) * 2014-11-26 2017-08-25 扬州大学 A型流感病毒基因pcr扩增引物及其快速克隆方法
US10889834B2 (en) 2014-12-15 2021-01-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for enhancing targeted transgene integration
JP2018504412A (ja) 2015-01-23 2018-02-15 アイカーン スクール オブ メディシン アット マウント サイナイ インフルエンザウイルスワクチン接種レジメン
US10633422B2 (en) 2015-06-01 2020-04-28 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Influenza virus replication by inhibiting microRNA lec7C binding to influenza viral cRNA and mRNA
WO2016207853A2 (en) 2015-06-26 2016-12-29 Seqirus UK Limited Antigenically matched influenza vaccines
US9890363B2 (en) 2015-07-06 2018-02-13 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Influenza virus replication for vaccine development
WO2017005880A1 (en) 2015-07-07 2017-01-12 Seqirus UK Limited Influenza potency assays
JP6624736B2 (ja) * 2015-11-18 2019-12-25 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 インフルエンザウイルス解析装置、インフルエンザウイルス解析方法及びインフルエンザウイルス解析プログラム
JP2019510481A (ja) 2016-02-19 2019-04-18 ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイション ワクチン開発のための改善されたｂ型インフルエンザウイルス複製
US10844097B2 (en) 2016-06-02 2020-11-24 Sanofi Pasteur Inc. Engineered influenza antigenic polypeptides and immunogenic compositions thereof
US11266734B2 (en) 2016-06-15 2022-03-08 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus hemagglutinin proteins and uses thereof
BR112019010830A2 (pt) 2016-11-30 2019-10-01 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc vacinas atenuadas de influenza suína e métodos de produção e uso das mesmas
WO2018187706A2 (en) 2017-04-07 2018-10-11 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Anti-influenza b virus neuraminidase antibodies and uses thereof
US11241492B2 (en) 2019-01-23 2022-02-08 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Mutations that confer genetic stability to genes in influenza viruses
US11851648B2 (en) 2019-02-08 2023-12-26 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Humanized cell line
US11390649B2 (en) 2019-05-01 2022-07-19 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Influenza virus replication for vaccine development
EP4022046A2 (en) 2019-08-27 2022-07-06 Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF) Recombinant influenza viruses with stabilized ha for replication in eggs
KR102614346B1 (ko) * 2020-12-14 2023-12-14 서울대학교산학협력단 Ｈ5ｎ6 재조합 인플루엔자 바이러스, 이의 제조용 조성물, 및 이를 포함하는 백신 조성물

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3992522A (en) * 1973-01-24 1976-11-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health, Education And Welfare Temperature-sensitive recombinant mutant viruses and a process for producing same
US5854037A (en) 1989-08-28 1998-12-29 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines
US5840520A (en) 1989-08-28 1998-11-24 Aviron Recombinant negative strand RNA virus expression systems
US5786199A (en) 1989-08-28 1998-07-28 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines
US5166057A (en) 1989-08-28 1992-11-24 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand rna virus expression-systems
JPH11509081A (ja) 1994-11-16 1999-08-17 セント ジュード チルドレンズ リサーチ ホスピタル 新規の複製プロセス
DK1185615T3 (da) 1999-04-06 2007-11-05 Wisconsin Alumni Res Found Rekombinante influenzavirus til vacciner og genterapi
WO2001083794A2 (en) * 2000-04-28 2001-11-08 St. Jude Children's Research Hospital Dna transfection system for the generation of infectious influenza virus
US7465456B2 (en) * 2002-04-26 2008-12-16 Medimmune, Llc Multi plasmid system for the production of influenza virus
AU2003231083A1 (en) 2002-04-26 2003-11-10 Medimmune, Llc Multi plasmid system for the production of influenza virus
DE602004027537D1 (hu) 2003-12-23 2010-07-15 Medimmune Inc

Also Published As

Publication number Publication date
EA006311B1 (ru) 2005-10-27
WO2001083794A2 (en) 2001-11-08
DK1317559T3 (da) 2009-03-23
US20050186563A1 (en) 2005-08-25
US20080233560A1 (en) 2008-09-25
JP5837891B2 (ja) 2015-12-24
PT1317559E (pt) 2009-02-12
US20020164770A1 (en) 2002-11-07
CN101580849B (zh) 2012-11-21
AU2001259211B2 (en) 2006-07-13
DE122011100039I1 (de) 2011-12-08
PL366064A1 (en) 2005-01-24
CA2406100A1 (en) 2001-11-08
SI1317559T1 (sl) 2009-04-30
EP1317559B1 (en) 2009-01-07
WO2001083794A3 (en) 2003-03-27
EA200201164A1 (ru) 2003-10-30
NO332080B1 (no) 2012-06-18
UA84254C2 (ru) 2008-10-10
US8309099B2 (en) 2012-11-13
BR0110607A (pt) 2004-06-22
KR100862758B1 (ko) 2008-10-13
MXPA02010642A (es) 2004-05-17
CN101580849A (zh) 2009-11-18
BRPI0110607B1 (pt) 2020-08-11
IL152426A0 (en) 2003-05-29
PL205955B1 (pl) 2010-06-30
HK1055992A1 (en) 2004-01-30
HUP0303036A2 (hu) 2003-12-29
HUP0303036A3 (en) 2004-10-28
CN1856575A (zh) 2006-11-01
IL152426A (en) 2011-07-31
CN100489107C (zh) 2009-05-20
JP2010042030A (ja) 2010-02-25
DE60137345D1 (de) 2009-02-26
AU2006228054B2 (en) 2010-04-29
US20080311149A1 (en) 2008-12-18
ZA200208065B (en) 2003-11-12
US7312064B2 (en) 2007-12-25
AU5921101A (en) 2001-11-12
BRPI0110607B8 (pt) 2021-05-25
US6951754B2 (en) 2005-10-04
US20110250232A1 (en) 2011-10-13
JP2004500842A (ja) 2004-01-15
KR100848719B1 (ko) 2008-07-25
AU2006228054A1 (en) 2006-11-02
ATE420189T1 (de) 2009-01-15
CA2406100C (en) 2010-11-02
JP5745758B2 (ja) 2015-07-08
EP1317559A2 (en) 2003-06-11
EP2085468A1 (en) 2009-08-05
KR20030072209A (ko) 2003-09-13
US7972843B2 (en) 2011-07-05
CY1108735T1 (el) 2014-04-09
NO20025171D0 (no) 2002-10-28
ES2319864T3 (es) 2009-05-14
NZ521840A (en) 2004-11-26
US20080311148A1 (en) 2008-12-18
JP2013116112A (ja) 2013-06-13
KR20070086094A (ko) 2007-08-27
NO20025171L (no) 2002-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU229101B1 (en) Dna transfection system for the generation of infectious influenza virus
US11497807B2 (en) Zoonotic disease RNA vaccines
Chen et al. Advances in development and application of influenza vaccines
Ikegami et al. Rift valley fever vaccines
CN103540614B (zh) 包装流感病毒载体的信号
JP4704232B2 (ja) 組換え伝染性非セグメント化陰性鎖ｒｎａウイルス
JP3545418B2 (ja) インフルエンザの新規組換え温度感受性変異体
MX2007005818A (es) Vectores recombinantes de la influenza con unidades de transcripcion en tandem.
EP1736539A1 (en) Attenuated SARS-CoV vaccines
JP7297832B2 (ja) ウイルス様粒子からの感染性インフルエンザウイルスの生成
JP7198759B2 (ja) 弱毒化表現型を有するヒト呼吸器多核体ウイルス（ｒｓｖ）のためのワクチン候補
US20210401983A1 (en) Arthrogenic alphavirus vaccine
RU2770860C2 (ru) Холодоадаптированная живая аттенуированная вакцина с удаленным фактором вирулентности, подходящая для доставки через слизистые оболочки
Chen et al. Advances and perspectives in the development of vaccines against highly pathogenic bunyaviruses
TW201910510A (zh) 適用於黏膜傳遞之冷適應且去除毒力因子之減毒活疫苗
EP3149158B1 (en) Live attenuated african horsesickness virus
JP7063808B2 (ja) Ｎｓ１およびｎｓ２遺伝子シフトを含む組換えｒｓウイルス株
Shaw Live Vaccines
LT et al. INVESTIGACIONES CIENTIFICAS