CN101627113B - 支持病毒生长到高效价的mdck细胞系和采用该细胞系的生物反应器方法 - Google Patents

支持病毒生长到高效价的mdck细胞系和采用该细胞系的生物反应器方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及可使病毒，例如流感病毒在细胞培养物内生长到高于之前可能效价的新型MDCK细胞。所述MDCK细胞能适应无血清培养基。本发明还涉及包含所述MDCK细胞的细胞培养组合物以及培养MDCK细胞的培养方法。本发明还涉及利用本发明的MDCK细胞进行细胞培养制备流感病毒的方法。

Description

支持病毒生长到高效价的MDCK细胞系和采用该细胞系的生物反应器方法
1.在联邦资助研究和开发下完成发明的权利声明
本文所述的一项或多项发明是在健康和人类服务部(Health and HumanServices)第HHS0100200600010C号合同下由政府支持完成的。因此，政府可享有这些发明的某些权利。
2.发明领域
本发明涉及可使病毒，例如流感病毒，尤其是冷适应、和/或温敏、和/或减毒的流感病毒，在细胞培养物内生长到高效价的新型MDCK细胞。所述MDCK细胞经适应或遗传修饰能在无血清培养基内生长。本发明还涉及包含所述MDCK细胞的细胞培养组合物，培养MDCK细胞的培养方法以及鉴定此类细胞的方法。本发明还涉及利用本发明的MDCK细胞进行细胞培养制备流感病毒的方法。具体地说，本发明涉及使可用来培养病毒(例如，流感病毒，尤其是冷适应、和/或温敏、和/或减毒流感病毒)的贴壁细胞(例如，MDCK细胞)在细胞培养物内生长到高效价的新型生物反应器方法。所述生物反应器方法可采用无血清培养基。本发明还涉及使用本发明的生物反应器方法产生的疫苗组合物。
3.发明背景
疫苗接种是预防每年流感流行所致疾病的最重要公共卫生手段。疫苗的有效应用取决于能否从稳定而容易地培养细胞而快速制备大量疫苗材料(例如，病毒)。快速开发疫苗及大量获得疫苗材料对抵御许多人和动物疾病至关重要。疫苗生产滞后及其产量不足可能导致无法控制疾病爆发的问题。例如，近年的研究提出其原因关系到生产抗流感疫苗需要的前导时间很长。参见，例如Wood，J.M.，2001，Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.，356：1953。因此，最近用来制造疫苗的努力已着力于疫苗病毒在细胞培养物内的生长。
Madin Darby狗肾(MDCK)细胞通常用于流感病毒滴定(Zambon M.，刊于Textbook of Influenza(《流感教材》)，Nicholson编，Webster and Hay，第22章，第291-313页，Blackwell Science，(1998))。1958年从正常的雄性考克斯班尼犬(cocker spaniel)的肾脏建立了这些细胞。ATCC列出了已经由S.Madin和N.B.Darby保藏的MDCK(CCL 34)细胞系。然而，现有MDCK细胞系有许多缺点，包括可能的致瘤性、细胞培养时需要动物血清、以及适合用于疫苗的流感病毒产量低。因此，对MDCK细胞系，尤其是能使这种流感病毒株生长到高效价(尤其在无血清培养基内)的非致瘤性MDCK细胞系仍未得到满足。本发明提供了这些以及其他未实现的需求。
4.发明概述
本发明提供了能支持流感病毒，例如，冷适应和/或温敏和/或减毒流感病毒生长到高效价的MDCK细胞。MDCK细胞可在含血清或无血清培养基配方包括无动物蛋白(APF)配方中生长，但优选在无血清和/或APF培养基配方中生长。因此，在第一个方面，本发明提供了一种Madin-Darby狗肾(MCDK)细胞，其中所述细胞培养组合物包含多个支持冷适应，和/或温敏，和/或减毒流感病毒复制达到每毫升以10为底的半数组织培养感染剂量的对数(log10 TCID50/mL)为至少约7.0的MDCK细胞。一些实施方式中，本发明的MDCK细胞是贴壁的。在其他实施方式中，本发明的MDCK细胞是非贴壁的(例如，能够在非贴壁条件下生长)。一些实施方式中，本发明的MDCK细胞是非致瘤性的。一些实施方式中，本发明的MDCK细胞具有上皮形态。一些实施方式中，本发明的MDCK细胞是贴壁的并具有上皮形态。一些实施方式中，本发明的MDCK细胞被适应或选择成在非贴壁条件下生长。一些实施方式中，本发明的MDCK细胞是贴壁的和非致瘤性的。
可在本发明的MDCK细胞中生长的病毒包括但不限于：负链RNA病毒，包括但不限于流感病毒，RSV，副流感病毒1、2和3，和人肺炎后病毒，以及其他病毒，包括DNA病毒，逆转录病毒，正链RNA病毒，负链RNA病毒，双链RNA病毒，包括，但不限于，乳多空病毒，水泡性口膜炎病毒，痘苗病毒，柯萨奇病毒，呼肠弧病毒，细小病毒，腺病毒，骨髓灰质炎病毒，麻疹病毒，狂犬病病毒，和疱疹病毒。
本发明还提供了用于衍生、繁殖和维持能支持流感病毒，例如冷适应、和/或温敏、和/或减毒流感病毒，生长到高效价的MDCK细胞的方法和培养基配方。本发明MDCK细胞对生产疫苗材料，例如病毒特别有用。因此，另一方面，本发明提供了包含MDCK细胞和细胞培养基的细胞培养组合物，其中所述细胞培养组合物支持冷适应、和/或温敏、和/或减毒流感病毒复制达到log10TCID50/mL为至少约7.0。
本发明的其它方面包括通过在合适的培养基中，在能产生疫苗材料的条件下培养本发明任何MDCK细胞来产生疫苗材料(如病毒)以及从一种或多种宿主细胞或其所生长的培养基中分离该材料的方法。因此，一些实施方式中，本发明提供了在细胞培养物内制造流感病毒的方法，包括用流感病毒感染本发明的细胞培养组合物，在允许流感病毒复制的条件下培育细胞培养组合物；和分离流感病毒与细胞培养组合物。
另一方面，本发明提供了免疫原性组合物。例如，一些实施方式中，本发明提供了免疫原性组合物，其包含按照上述方法产生的疫苗材料和任选的赋形剂如药学上可接受的赋形剂或一种或多种药学上可接受的给药组分。
本发明也包括通过给予对象有效量的一种或多种上述免疫原性组合物从而在该对象中产生免疫应答的方法。此外，通过给予有效量的一种或多种上述免疫原性组合物产生抵御病毒感染(例如，流感病毒)的免疫应答来预防性或治疗性治疗病毒感染的方法也是本发明的一部分。这种治疗的对象可以包括哺乳动物(例如，人)、禽类(例如，家禽)。此外，这些方法也可包括给予用本发明MDCK细胞生产的一种或多种病毒的组合物和药学上可接受的赋形剂，给予对象的用量能有效地预防性或治疗性治疗病毒感染。
阅读以下详述和附图后可更完全地明白本发明的这些和其它目的及特征。
5.附图简述
图1为包含MDCK克隆1、5、36、39、40和55中产生的野生型流感病毒株A/Panama、A/New Caledonia或B/Jilin的HA和NA基因区段的重配流感病毒株的图示。
图2为MDCK亚克隆1-A、1-B和1-C在MediV 105无血清培养基中细胞生长的图示。
图3为感染后天数(DPI)为3和4时包含野生型流感病毒株A/NewCaledonia/20/99、A/Hiroshima/52/05、B/Malaysia/2506/04或A/Vietnam/1203/2004的HA和NA基因区段和来自冷适应、温敏、减毒病毒的剩余基因区段的重配流感病毒株在MDCK亚克隆1-A、1-B和1-C中的产量的图示。
图4的表格表示在OptiProTM培养基和MediV 105中感染后天数(DPI)为3和4时包含野生型流感病毒株A/New Caledonia/20/99、A/Hiroshima/52/05、B/Malaysia/2506/04或A/Vietnam/1203/2004的HA和NA基因区段和来自冷适应、温敏、减毒病毒的剩余基因区段的重配流感病毒株在MDCK亚克隆1-A、1-B、1-C和1-D中的产量。
图5为制备MDCK亚克隆1-B无血清细胞库的流程图。图A是在含血清培养基内进行的选择步骤。图B是适应无血清培养基的步骤。
图6表示MediV 105和M18M培养基中亚克隆1-A的生长。
图7表示MediV 105和M18M培养基中亚克隆1-A的倍增时间。
图8比较了接种后30和60分钟时包含四种不同微载体的M18M培养基中亚克隆1-A的细胞密度。
图9比较了包含四种不同微载体的M18M培养基中亚克隆1-A的细胞产量。
图10列出了可用于商业规模制造疫苗材料的细胞培养规模放大过程。
图11列出了可用于从细胞培养物商业规模纯化疫苗材料的两种纯化方法。
图12代表Benzonase处理之后或同时进行的Cellufine Sulfate(CS)层析的结果。图A)左图显示了采用Cellufine Sulfate进行的柱层析的OD曲线，箭头表示加样、洗涤和洗脱开始的时间。琼脂糖凝胶电泳(右图)显示，DNA污染物存在于原料(泳道2)和流出液(泳道3)中，但不存在于从柱上洗脱的材料中(泳道4)，泳道1是分子量标记。图B)描绘了采用Benzonase柱上处理(BenzonaseOn-Column Treatment)进行MDCK dsDNA降解的过程。
图13代表在MDCK亚克隆1-B中制造B/Malaysia/2506/04的30L SUB过程的若干曲线。上图是生长阶段细胞的生长曲线。通过Bioprofile测量该过程中葡萄糖(中图，实线)、乳糖(中图，虚线)、谷氨酰胺(下图，实线)和铵离子(下图，虚线)的代谢物曲线。
图14表示未改变培养基的SUB过程的中试研究结果。A)2和3dpi时改变0-100％培养基获得的病毒效价的曲线图(分别见上图和下图)。B)2和3dpi时TrypLE浓度介于0.04和1的病毒效价峰值的曲线图。C)改变(三角形)或不改变(方形)培养基时感染后B/Malaysia/2506/04(上图)和A/Vietnam/1203/2004(下图)的病毒效价随时间变化的曲线图。
图15为采用不同MOI时A/Solomon Islands/3/06病毒效价随时间(感染后时间)变化的曲线图。感染后20-96小时的病毒产率被框出，并在右侧将该曲线图区域放大。圈出了以2000 FFU/mL感染培养物获得的病毒收获峰值。
6.发明详述
本发明一部分基于发现了可获得能支持流感病毒，尤其是冷适应、和/或温敏、和/或减毒流感病毒，复制到高效价的克隆的MDCK细胞系。因此，本发明一方面提供了已经适应各种细胞培养条件，包括无血清培养基配方的能支持流感病毒，例如冷适应、和/或温敏、和/或减毒流感病毒，复制到高效价的MDCK细胞系，文中将其称为“本发明的细胞”。
此外，本发明提供包含本发明细胞和其它组分的细胞培养组合物，所述其它组分包括但不限于：培养基(例如，本文公开的培养基)、培养基组分、缓冲液、化合物、其它类型的细胞、病毒材料(例如，病毒基因组、病毒颗粒)和异源蛋白质。
本发明也提供可用于培养MDCK细胞的方法和培养基配方，所述细胞具有一种或多种具体特征，包括但不限于：非致瘤性(例如，在裸小鼠中不会形成小结)和/或非致癌性和/或作为贴壁细胞生长和/或具有上皮样形态和/或能支持各种病毒(包括但不限于正黏病毒、副黏病毒、弹状病毒和黄病毒(flavoviruses))复制和/或支持流感病毒(包括冷适应和/或温敏和/或减毒的流感病毒)生长到高效价。本发明的培养条件包括含血清和无血清的培养基配方以及无动物蛋白(APF)制剂。
此外，本发明也提供在MDCK细胞中产生疫苗材料(例如，流感病毒)、从MDCK细胞制备疫苗材料的方法和利用MDCK细胞产生的疫苗材料预防流感感染的方法。本发明细胞对在其它哺乳动物细胞系(例如，Vero、PerC6
Figure G2007800423659D00061
HEK-293、MRC-5和WI-38细胞)中不能有效复制的冷适应/温度敏感/减毒(ca/ts/att)流感毒株(例如，
Figure G2007800423659D00062
中的那些)的生产特别有用。
6.1定义
“致瘤性”在文中具有本领域技术人员所了解的该术语的常规含义。在一个实施方式中，利用成年裸小鼠模型测定致瘤性(例如，Stiles等，1976，Cancer Res，36：1353和以下实施例5)。也可采用其它试验，例如通过注射入鸡胚胎和/或局部应用于绒毛膜尿囊来测试致瘤性(Leighton等，1970，Cancer，26：1024)。
术语“重组体”表示通过人工干预经人工或合成(非天然)方法改变的物质(例如，核酸或蛋白质)。可对处于其天然环境或状态中，或对从其天然环境中除去的物质进行改变。具体地说，当提及的病毒，例如流感病毒是重组体时，可通过重组核酸的表达产生。
当术语“重配体”指病毒时，其表示该病毒包含衍生自多个亲代病毒毒株或来源的遗传成分和/或多肽成分。例如，7∶1重配体包含衍生自第一亲代病毒的7个病毒基因组区段(或基因区段)和第二亲代病毒的一个互补病毒基因组区段，例如编码血凝素或神经氨酸酶的基因组区段。6∶2重配体包含第一亲代病毒的6个基因组区段(最常见的6个内部基因)和不同亲代病毒的两个互补区段，例如(编码)血凝素或神经氨酸酶的区段。
除非另有说明，术语“约”在文中表示不超过该术语修饰值的上下10％。例如，术语“约5μg/kg”表示范围介于4.5μg/kg至5.5μg/kg。另一个例子，“约1小时”表示范围介于54分钟到66分钟。
术语“温敏”、“冷适应”和“减毒”也是本领域熟知的。例如，术语“温敏”(“ts”)表示，甲型流感病毒株在较高温度(例如39℃)下显示出的病毒效价比较低温度(例如33℃)下降低100倍或更多，而乙型流感病毒株在较高温度(例如37℃)下显示出的病毒效价比较低温度(例如33℃)下降低100倍或更多。例如，术语“冷适应”(“ca”)表示病毒在较低温度(例如25℃)下显示出的生长速率比它在较高温度(例如33℃)下的生长速率高100倍。例如，术语“减毒”(“att”)表示病毒在雪貂上呼吸道内复制但在肺组织内不可检测，且不会在动物中造成流感样疾病。应理解，具有中间表型的病毒，即在39℃(对于甲型流感病毒)或37℃(对于乙型流感病毒)的效价降低小于100倍，在25℃的生长速率是33℃生长速率的100以上(例如，200倍、500倍、1000倍、10000倍数以内)，和/或相对于在雪貂上呼吸道内的生长在肺内的生长减弱(即部分减毒)和/或动物的流感样疾病减轻，也是包含在本发明之内的有用病毒。生长是指病毒数量，如通过效价、嗜菌斑大小或形态、颗粒密度或者本领域技术人员已知的其他测量值来表示。
6.2细胞特征
在一个实施方式中，本发明的细胞是脊椎动物细胞。在另一实施方式中，本发明细胞是哺乳动物细胞，例如仓鼠、牛、猴或狗，特别是源自这些动物的肾细胞或细胞系。再在另一个实施方式中，本发明细胞是MDCK细胞(例如，源自ATCC CCL-34 MDCK)，在本文专门称为“本发明的MDCK细胞”，术语“本发明的细胞”包括它们。在一具体实施方式中，本发明细胞衍生自ATCC CCL-34MDCK。本发明细胞可以采用本领域熟知的方法衍生自CCL-34 MDCK细胞。例如，CCL-34 MDCK细胞可以首先在含血清的培养基中(如Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)+10％胎牛血清(FBS)+4mM谷氨酰胺+4.5g/L葡萄糖，或本文所述的其它培养基)传代有限次数，然后克隆各细胞并特征鉴定各克隆。选出具有优良生物学和生理特性(包括但不限于倍增时间、致瘤性情况和病毒产量)的克隆来产生主细胞库(MCB)。
在第一个方面，本发明提供了一种Madin-Darby狗肾(MCDK)细胞，其中的细胞培养组合物包含多个支持流感病毒复制的MDCK细胞。在一个具体方面，所述MDCK细胞支持具有一个或多个以下特征的流感病毒复制：冷适应，减毒，和温敏。在某些实施方式中，MDCK细胞支持病毒复制的能力是通过从感染的细胞培养物获得的病毒的产率来测量的(例如，采用半数组织培养感染剂量(TCID50)试验或荧光聚焦试验(FFA))。在某些实施方式中，MDCK细胞支持流感病毒复制到每毫升以10为底的半数组织培养感染剂量的对数(log10TCID50/mL)为至少约7.0。在某些实施方式中，MDCK细胞支持流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约7.2。在某些实施方式中，MDCK细胞支持流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约7.4。在某些实施方式中，MDCK细胞支持流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约7.6。在某些实施方式中，MDCK细胞支持流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约7.8。在某些实施方式中，MDCK细胞支持流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约8.0。在某些实施方式中，MDCK细胞支持流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约8.2。在某些实施方式中，MDCK细胞支持流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约8.4。在某些实施方式中，MDCK细胞支持流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约8.6。在某些实施方式中，MDCK细胞支持流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约8.8。在某些实施方式中，MDCK细胞支持流感病毒复制到log10TCID50/mL为至少约9.0。或者，或者任选地，可按照荧光聚焦试验(描述于实施例6，并且是本领域已知的，参见例如，Stokes等，1988，J Clin Microbiol.26：1263-6和美国专利公开20040265987)测定样品中存在的病毒浓度来量化病毒产量。FFA值通常表示为log10 FFU/mL(荧光焦点单位/mL)。因此，在某些实施方式中，MDCK细胞支持流感病毒复制到每毫升以10为底的荧光焦点单位的对数(log10 FFU/mL)为至少约7.0，或达到log10 FFU/mL为至少约7.2，或达到log10 FFU/mL为至少约7.4，或达到log10 FFU/mL为至少约7.6，或达到log10FFU/mL为至少约7.8，或达到log10 FFU/mL为至少约8.0，或达到log10 FFU/mL为至少约8.2，或达到log10 FFU/mL为至少约8.4，或达到log10 FFU/mL为至少约8.6，或达到log10 FFU/mL为至少约8.8，或达到log10 FFU/mL为至少约9.0。
在某些实施方式中，本发明的细胞在培养物中繁殖到产生细胞培养组合物(文中也称为“本发明的细胞培养组合物”)。一实施方式中，本发明的细胞培养组合物包含作为唯一宿主细胞类型的本发明的MDCK细胞，其中所述细胞培养组合物支持具有冷适应、减毒、和温敏中一个或多个特征的流感病毒复制到log10 TCID50/mL和/或log10 FFU/mL为至少约7.0，至少约7.2，至少约7.4，至少约7.6，至少约7.8，至少约8.0，至少约8.2，至少约8.4，至少约8.6，至少约8.8，至少约9.0，至少约9.2，至少约9.4，至少约9.6，至少约9.8，至少约10.0，至少约10.2，至少约10.4，至少约10.6，至少约10.8或至少约11.0。
一方面，本发明细胞适应在选择培养基中(例如，无血清或APF培养基，如本文所述的)生长。这种适应性可在克隆各细胞之前、同时或之后产生。在某些实施方式中，本发明的细胞经适应能在MediV 101、MediV 102、MediV 103、MediV 104、MediV 105、M-32、MediV 107、M18M或其生长优化衍生物中生长，如上下文中所述。因此，本发明的细胞可在本文所述培养基内增殖产生本发明的细胞培养组合物。一实施方式中，本发明的细胞培养组合物包含作为唯一宿主细胞类型的本发明的MDCK细胞，其中所述生长培养基是无血清培养基。
在本发明一具体实施方式中，这些细胞是以下细胞系，包括但不限于：2005年1月5日由美国典型培养物保藏中心(10801大学大街，马纳萨斯，弗吉尼亚，20110-2209)保藏并指定ATCC保藏号PTA-6500、PTA-6501、PTA-6502和PTA-6503的那些细胞，以及2006年10月5日保藏并分别指定ATCC保藏号PTA-7909和PTA-7910的那些亚克隆1-A和1-B。这些保藏物按照国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的条款维持。在一个实施方式中，可利用本发明MDCK细胞产生用于制备美国食品与药品管理局批准的人用疫苗材料的细胞库。一实施方式中，本发明的细胞培养组合物包含作为唯一宿主细胞类型的以ATCC登录号PTA-6500、PTA-6501、PTA-6502、PTA-6503、PTA-7909或PTA-7910保藏的MDCK细胞。在一具体实施方式中，本发明的细胞培养组合物包含作为唯一宿主细胞类型的以ATCC登录号PTA-7909保藏的MDCK细胞。在另一具体实施方式中，本发明的细胞培养组合物包含作为唯一宿主细胞类型的以ATCC登录号PTA-7910保藏的MDCK细胞。
在一些实施方式中，本发明提供了通过传代和根据一种或多种具体特征选出了由细胞系MDCK(CCL 34)所衍生的MDCK细胞系，所述特征包括但不限于：能在含血清或无血清培养基或无动物蛋白培养基中作为贴壁细胞生长，在含血清或无血清培养基或无动物蛋白培养基中作为非贴壁细胞生长，具有上皮样形态，非致瘤性(例如，在裸小鼠中不会形成小结)，和/或非致癌性，和/或能支持各种病毒(包括但不限于正黏病毒、副黏病毒、弹状病毒和黄病毒)复制。
在一个实施方式中，本发明MDCK细胞无致瘤性。在另一实施方式中，本发明的细胞培养组合物包含作为唯一宿主细胞类型的本发明的MDCK细胞，其中所述本发明的MDCK细胞是非致瘤性的。本领域熟知测定细胞是否有致瘤性的方法(参见，例如Leighton等，1970，Cancer，26：1024和Stiles等，1976，Cancer Res，36：1353)，以下章节8.7详述的美国食品与药品管理局目前首选的方法是利用裸小鼠模型。在一具体实施方式中，本发明MDCK细胞在成年裸小鼠模型中无致瘤性(参见Stiles等，同上和以下章节8.7)。在另一具体实施方式中，本发明MDCK细胞在注入鸡胚和/或局部应用于绒毛膜尿囊时无致瘤性(参见Leighton等，同上)。再在其他实施方式中，本发明MDCK细胞在成年裸小鼠模型中无致瘤性，但在注入鸡胚和/或局部应用于绒毛膜尿囊时有致瘤性。再在其他实施方式中，本发明MDCK细胞在成年裸小鼠模型中和在注入鸡胚和/或局部应用于绒毛膜尿囊时均无致瘤性。再在其他实施方式中，本发明MDCK细胞在培养基中传代至少20代、或至少30代、或至少40代、或至少50代、或至少60代、或至少70代、或至少80代、或至少90代、或至少100代后无致瘤性。在还有另一具体实施方式中，培养基是本文所述的培养基(例如，Medi 105)。
可采用本领域技术人员已知的许多方法定量测定致瘤性。常规使用的一种方法是测定“TD50”值，其定义为诱导50％测试动物产生肿瘤所需的细胞数目(参见例如Hill R.The TD50 assay for tumor cells(肿瘤细胞的TD50试验).刊于：Potten C，Hendry J编，Cell clones(《细胞克隆》).，伦敦：Churchill Livingstone；1985.第223页)。在一个实施方式中，本发明MDCK细胞的TD50值介于约1010-约101、或介于约108-约103、或介于约107-约104。在一具体实施方式中，本发明MDCK细胞的TD50值高于1010、或高于约109、或高于约107、或高于约106、或高于约105、或高于约104、或高于约103、或高于约102、或高于约101。
在一个实施方式中，本发明MDCK细胞是非致癌性的。在另一实施方式中，本发明的细胞培养组合物包含作为唯一宿主细胞类型的本发明的MDCK细胞，其中所述MDCK细胞是非致癌性的。测定细胞是否为致癌性的方法是本领域熟知的并通常包括将细胞裂解物和/或DNA接种到新生啮齿动物种类中并评价随时间变化是否有任何肿瘤形成(参见，例如，Nowinski和Hays，1978，J.Virol.，27：13-8；Peeper等，2002，Nat Cell Biol.，4：148-53；联邦规则代码(Code ofFederal Regulation)(CFR)，“致癌性”，标题40，第8卷，第1章，第798.330段，第160-164页)。例如，将至少等价于107细胞的细胞裂解物和/或DNA注射到通常不超过4日龄的新生啮齿动物(例如，仓鼠、裸鼠、大鼠)，然后监测啮齿动物达5个月或更长时间。致癌性试验通常由商业检测公司(例如，BR公司(BioReliance)，见程序#001031和#001030)进行。一实施方式中，相当于至少105、至少106、或至少107本发明的MDCK细胞的细胞裂解物和/或DNA当被注射到新生啮齿动物时在2个月内、或在3个月内、或在4个月内、或在5个月内、或在6个月内、或更长时间不诱导肿瘤形成。在另一实施方式中，0.01mg、或0.02mg、或0.03mg、或0.04mg、或0.05mg、或0.06mg、或0.07mg、或0.08mg、或0.09mg、或0.10mg、或更多的本发明MDCK细胞的DNA当被注射到新生啮齿动物种类时在2个月内、或在3个月内、或在4个月内、或在5个月内、或在6个月内、或更长时间不诱导肿瘤形成。
在另一实施方式中，本发明细胞能在含血清或无血清培养基或无动物蛋白培养基中作为贴壁细胞生长。再在另一实施方式中，本发明细胞能在含血清或无血清培养基或无动物蛋白培养基中作为非贴壁细胞生长(例如，能够在非贴壁条件下生长)。再在其他实施方式中，本发明细胞具有上皮样形态。再在其他实施方式中，本发明MDCK细胞能支持各种病毒(包括但不限于正黏病毒、副黏病毒、弹状病毒和黄病毒)复制。预计本发明的MDCK细胞可具有一种或多种具体特征的任意组合，所述特征包括但不限于：非致瘤性，非致癌性，作为贴壁细胞生长，作为非贴壁细胞生长，具有上皮样形态，支持各种病毒复制，以及支持流感病毒复制到高效价，例如，log10 TCID50/mL为至少约7.0，至少约7.2，至少约7.4，至少约7.6，至少约7.8，至少约8.0，至少约8.2，至少约8.4，至少约8.6，至少约8.8，至少约9.0，至少约9.2，至少约9.4，至少约9.6，至少约9.8，至少约10.0，至少约10.2，至少约10.4，至少约10.6，至少约10.8或至少约11.0；和/或log10 FFU/mL为至少约7.0，至少约7.2，至少约7.4，至少约7.6，至少约7.8，至少约8.0，至少约8.2，至少约8.4，至少约8.6，至少约8.8，至少约9.0，至少约9.2，至少约9.4，至少约9.6，至少约9.8，至少约10.0，至少约10.2，至少约10.4，至少约10.6，至少约10.8或至少约11.0。在某些实施方式中，本发明的细胞培养组合物包含作为唯一宿主细胞类型的本发明的MDCK细胞，其中所述本发明的MDCK细胞具有一种或多种具体特征的任意组合，所述特征包括但不限于：非致瘤性，非致癌性，作为贴壁细胞生长，作为非贴壁细胞生长，具有上皮样形态，支持各种病毒复制，以及支持流感病毒复制到高效价(例如，log10 TCID50/mL和/或log10 FFU/mL为至少约7.8)。
认为本发明MDCK细胞的每一代和每次传代记录应足够详细，从而使得各细胞系都有完整谱系可用。每一代和每次传代的文件可能有助于美国食品与药品管理局和世界上其它管理机构批准使用本发明MDCK细胞来制备疫苗材料。
在另一实施方式中，本发明MDCK细胞无微生物污染(例如，细菌、病毒和真菌污染)。商业承包者(例如，BioReliance
Figure G2007800423659D00121
，Rockville，MD)可常规进行本领域熟知方法来检测细菌和真菌污染的存在。下面的8.7节详述了公认的微生物除菌和支原体检验。要检验的微生物的具体例子见表4。
再在其他实施方式中，本发明MDCK细胞能支持各种病毒复制，包括但不限于正黏病毒(包括甲型和/或乙型流感毒株)、副黏病毒(包括RSV A和/或B，人肺炎后病毒和副流感病毒1、2和/或3)、弹状病毒和黄病毒。
在一具体实施方式中，本发明MDCK细胞能支持冷适应/温度敏感(ca/ts/att)流感病毒(例如，见于中的那些)(Belshe等，1998，N EnglJMed338：1405；Nichol等，1999，JAMA 282：137；Jackson等，1999，Vaccine，17：1905)和/或包含这些病毒为骨架或包含具有以下一个或多个特征的流感病毒为骨架(或一个或多个vRNA区段)的重配病毒复制：冷适应的、减毒的和温度敏感的。细胞能支持病毒复制的一种指标是从受感染的细胞培养物中获得的病毒产量。可采用本领域技术人员已知的许多方法测定病毒产量。例如，可按照检测感染性病毒体的中值组织培养感染剂量(TCID50)试验或荧光聚焦试验(FFA)测定样品中存在的病毒浓度来定量测定病毒产量。TCID50值通常表示为log10TCID50/mL，FFA值通常表示为log10 FFU/mL(荧光焦点单位/mL)。
在一个实施方式中，本发明MDCK细胞支持流感病毒(例如，ca/ts毒株)复制可达到的log10 TCID50/mL至少为6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。在另一实施方式中，本发明MDCK细胞支持流感病毒(例如，ca/ts毒株)复制可达到的log10 TCID50/mL至少为约6.0、或至少约6.2、或至少约6.4、或至少约6.6、或至少约6.8、或至少约7.0、或至少约7.2、或至少约7.4、或至少约7.6、或至少约7.8、或至少约8.0、或至少约8.2、或至少约8.4、或至少约8.6、或至少约8.8、或至少约9.0、或至少约9.2、或至少约9.4、或至少约9.6、或至少约9.8。再在另一个实施方式中，本发明MDCK细胞支持流感病毒(例如，ca/ts毒株)复制可达到的log10 FFU/mL至少为6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。在另一实施方式中，本发明MDCK细胞支持流感病毒(例如，ca/ts毒株)复制可达到的log10 FFU0/mL至少为约6.0、或至少约6.2、或至少约6.4、或至少约6.6、或至少约6.8、或至少约7.0、或至少约7.2、或至少约7.4、或至少约7.6、或至少约7.8、或至少约8.0、或至少约8.2、或至少约8.4、或至少约8.6、或至少约8.8、或至少约9.0、或至少约9.2、或至少约9.4、或至少约9.6、或至少约9.8。
本领域熟知，生物评价和研究中心(CBER)的疫苗和相关生物产品顾问委员会或者世界卫生组织(WHO)以及欧洲药物评价机构(EMEA)每年都推荐野生型病毒，这些病毒用于制备年度接种用抵抗流行性感冒的疫苗株，并由FDA或疾病控制和预防中心(CDC)推荐给制造商。这些毒株然后被用于制造重配疫苗毒株，所述毒株通常将野生型病毒的NA和/或HA基因和将具有某些所需特性的衍生自供体病毒(通常称为主供体病毒或MDV)的保留基因区段组合。例如，MDV毒株可以是冷适应、和/或温敏、和/或减毒，和/或具有高生长速率。下面的实施方式涉及不同流感病毒株(例如，一个或多个健康机构推荐的野生型毒株)的冷适应、和/或温敏、和/或减毒形式。本领域技术人员将了解，这种冷适应、和/或温敏、和/或减毒流感病毒可通过获得包含感兴趣毒株的HA和NA基因区段以及合适的冷适应、和/或温敏、和/或减毒流感毒株(文中也称为“冷适应、温敏、减毒骨架”，例子有
Figure G2007800423659D00131
中的冷适应、温敏、减毒流感病毒以及A/Ann Arbor/6/60或B/Ann Arbor/1/66毒株)的保留基因区段的重组和/或重配流感病毒而方便地制造。文中，包含野生型流感病毒株HA和NA基因区段以及冷适应、温敏、减毒流感病毒保留基因区段的重组和/或重配病毒也可在野生型毒株名称之前加上“ca”来表示，例如包含A/New Caledonia/20/99的HA和NA基因区段和冷适应、温敏、减毒流感病毒保留基因区段的重组和/或重配病毒可称为“ca A/New Caledonia/20/99”。一些实施方式中，所述重配流感病毒包含A/Ann Arbor/6/60、B/Ann Arbor/1/66、A/Leningrad/134/47/57、B/Leningrad/14/17/55或A/Puerto Rico/8/34的至少一个基因区段。
在某些实施方式中，本发明的MDCK细胞支持每年由包括但不限于CBER、WHO、EMEA、FDA和CDC的一个或多个健康机构推荐和/或提供的至少一种流感毒株(例如，甲型流感毒株，乙型流感毒株)的冷适应、和/或温敏、和/或减毒形式(例如，重配体)复制到log10 TCID50/mL和/或log10 FFU/mL为至少6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。一实施方式中，本发明的细胞培养组合物包含作为唯一宿主细胞类型的本发明的MDCK细胞，其中所述细胞培养组合物支持每年由包括但不限于CBER、WHO、EMEA、FDA和CDC的一个或多个健康机构推荐和/或提供的至少一种流感毒株(例如，甲型流感毒株，乙型流感毒株)的冷适应、和/或温敏、和/或减毒形式(例如，重配体)复制到log10 TCID50/mL和/或log10 FFU/mL为至少6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。
在某些其他实施方式中，本发明的MDCK细胞支持至少一种甲型流感毒株的冷适应、和/或温敏、和/或减毒形式复制到log10 TCID50/mL和/或log10 FFU/mL为至少6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。一实施方式中，本发明的细胞培养组合物包含作为唯一宿主细胞类型的本发明的MDCK细胞，其中所述细胞培养组合物支持至少一种甲型流感毒株的冷适应、和/或温敏、和/或减毒形式复制到log10 TCID50/mL和/或log10FFU/mL为至少6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。认为甲型流感毒株可以是任何亚型(例如，H1N1、H3N2、H7N7、H5N1、H9N2、H1N2、H2N2)。目前已经鉴定出甲型流感病毒的至少16种不同HA和9种不同NA亚型。因此，甲型流感毒株可包含目前已知的或者将来可鉴定出的HA和NA亚型的任意组合。
在某些其他实施方式中，本发明的MDCK细胞支持至少一种乙型流感毒株的冷适应、和/或温敏、和/或减毒形式复制到log10 TCID50/mL和/或log10FFU/mL为至少6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。一实施方式中，本发明的细胞培养组合物包含作为唯一宿主细胞类型的本发明的MDCK细胞，其中所述细胞培养组合物支持至少一种乙型流感毒株的冷适应、和/或温敏、和/或减毒形式复制到log10 TCID50/mL和/或log10FFU/mL为至少6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。乙型流感病毒目前不是根据它们的血凝素和神经氨酸酶蛋白分成不同亚型，而是按照谱系归类。目前，乙型流感病毒株可分成两个谱系，B/Yamagata和B/Victoria谱系，各谱系中还有许多亚谱系。因此，乙型流感毒株可衍生自任何目前已知的或者将来可鉴定出的谱系和/或亚谱系。
在某些其他实施方式中，本发明的MDCK细胞支持A/New Caledonia流感毒株的冷适应、和/或温敏、和/或减毒形式((即ca A/New Caledonia))复制到log10TCID50/mL和/或log10FFU/mL为至少6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。在某些其他实施方式中，本发明的MDCK细胞支持A/Hiroshima流感毒株的冷适应、和/或温敏、和/或减毒形式((即ca A/Hiroshima))复制到log10 TCID50/mL和/或log10 FFU/mL为至少6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。在某些其他实施方式中，本发明的MDCK细胞支持A/Hiroshima流感毒株的冷适应、和/或温敏、和/或减毒形式((即ca A/Hiroshima))复制到log10TCID50/mL和/或log10FFU/mL为至少6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。在某些其他实施方式中，本发明的MDCK细胞支持A/Vietnam流感毒株的冷适应、和/或温敏、和/或减毒形式((即caA/Vietnam))复制到log10 TCID50/mL和/或log10FFU/mL为至少6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。在某些其他实施方式中，本发明的MDCK细胞支持A/Wisconsin流感毒株的冷适应、和/或温敏、和/或减毒形式((即caA/Wisconsin))复制到log10 TCID50/mL和/或log10FFU/mL为至少6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。
在某些其他实施方式中，本发明的MDCK细胞支持A/New Caledonia和A/Hiroshima流感毒株中每一种的冷适应、和/或温敏、和/或减毒形式复制到log10 TCID50/mL和/或log10FFU/mL为至少6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。在某些其他实施方式中，本发明的MDCK细胞支持A/New Caledonia和B/Malaysia流感毒株中每一种的冷适应、和/或温敏、和/或减毒形式复制到log10 TCID50/mL和/或log10 FFU/mL为至少6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。在某些其他实施方式中，本发明的MDCK细胞支持A/NewCaledonia和A/Vietnam流感毒株中每一种的冷适应、和/或温敏、和/或减毒形式复制到log10 TCID50/mL和/或log10 FFU/mL为至少6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。
在某些其他实施方式中，本发明的MDCK细胞支持A/Hiroshima和B/Malaysia流感毒株中每一种的冷适应、和/或温敏、和/或减毒形式复制到log10TCID50/mL和/或log10FFU/mL为至少6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。在某些其他实施方式中，本发明的MDCK细胞支持A/Hiroshima和A/Vietnam流感毒株中每一种的冷适应、和/或温敏、和/或减毒形式复制到log10 TCID50/mL和/或log10 FFU/mL为至少6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。在某些其他实施方式中，本发明的MDCK细胞支持B/Malaysia和A/Vietnam流感毒株中每一种的冷适应、和/或温敏、和/或减毒形式复制到log10TCID50/mL和/或log10FFU/mL为至少6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。
在某些其他实施方式中，本发明的MDCK细胞支持A/New Caledonia、A/Hiroshima和B/Malaysia流感毒株中每一种的冷适应、和/或温敏、和/或减毒形式复制到log10 TCID50/mL和/或log10FFU/mL为至少6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。在某些其他实施方式中，本发明的MDCK细胞支持A/New Caledonia、A/Hiroshima和A/Vietnam流感毒株中每一种的冷适应、和/或温敏、和/或减毒形式复制到log10TCID50/mL和/或log10FFU/mL为至少6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。在某些其他实施方式中，本发明的MDCK细胞支持A/New Caledonia、B/Malaysia和A/Vietnam流感毒株中每一种的冷适应、和/或温敏、和/或减毒形式复制到log10 TCID50/mL和/或log10FFU/mL为至少6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。在某些其他实施方式中，本发明的MDCK细胞支持B/Malaysia、A/Hiroshima和A/Vietnam流感毒株中每一种的冷适应、和/或温敏、和/或减毒形式复制到log10 TCID50/mL和/或log10FFU/mL为至少6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。在某些其他实施方式中，本发明的MDCK细胞支持A/New Caledonia、A/Hiroshima、B/Malaysia和A/Vietnam流感毒株中每一种的冷适应、和/或温敏、和/或减毒形式复制到log10 TCID50/mL和/或log10 FFU/mL为至少6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。
再在其他方面，本发明提供了一种使冷适应、和/或温敏、和/或减毒流感病毒生长到log10 TCID50/mL和/或log10FFU/mL为至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8或至少10.0的方法，该方法包括使所述细胞在MediV105、M-32、MediV 107或M18M或者其生长优化衍生物中生长，然后用流感病毒感染细胞，并在感染期间或之后加入新鲜培养基或培养基组分(例如，葡萄糖，氨基酸，脂质)。再在其他方面，本发明提供了一种使冷适应、和/或温敏、和/或减毒流感病毒生长到log10 TCID50/mL和/或log10FFU/mL为至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8或至少10.0的方法，该方法包括使所述细胞在无血清培养基，优选无动物蛋白培养基中生长，并在用流感病毒感染细胞之前、期间或之后加入蛋白酶，如TrypLE(1∶10-1∶100)。在某些其他实施方式中，所述冷适应、和/或温敏、和/或减毒流感病毒生长到log10 TCID50/mL和/或log10FFU/mL为至少6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8或至少10.0。在某些实施方式中，所述新鲜培养基是补加有蛋白酶如TrypLE(1∶10-1∶100)的MediV 105。在某些实施方式中，所述新鲜培养基是补加有蛋白酶如TrypLE(1∶10-1∶100)的M-32。在某些实施方式中，所述新鲜培养基是补加有蛋白酶如TrypLE(1∶10-1∶100)的MediV 107。本领域技术人员已知的任何用于切割流感病毒蛋白的蛋白酶都可用于这些方法。在某些实施方式中，所述新鲜培养基是补加有蛋白酶如TrypLE(1∶10-1∶100)的M18M。在某些实施方式中，所述新鲜培养基是补加有4.5g/L葡萄糖、4mM谷氨酰胺和蛋白酶如TrypLE(1∶10-1∶100)的DMEM/F12。
本领域技术人员应该知道，本发明细胞通常可被用作细胞培养组合物的一部分。细胞培养组合物的组成将根据细胞和所需用途而不同。例如，对于培养目的，细胞培养组合物可包含本发明细胞与细胞生长的合适培养基。因此，本发明提供包含本发明细胞和其它组分的细胞培养组合物，所述其它组分包括但不限于：培养基(例如，本文公开的培养基)、培养基组分、缓冲液、化合物、其它类型的细胞、病毒材料(例如，病毒基因组、病毒颗粒)和异源蛋白质。在一个实施方式中，细胞培养组合物包含本发明细胞和培养基或其组分。细胞培养组合物中可能存在的培养基包括无血清培养基、含血清培养基和无动物蛋白培养基。在一个实施方式中，细胞组合物包含无血清培养基，如MediV 101、MediV 102、MediV 103、MediV 104、MediV 105、M-32、MediV 107或M18M，或者其组分或生长优化衍生物。
6.3方法和培养基配方
本发明还提供了能支持流感病毒在含血清培养基中复制到高效价的培养MDCK细胞的方法和培养基配方。本发明还提供使MDCK细胞适应无血清培养基(包括无动物蛋白培养基)制剂和随后在其中培养的方法。在本发明的某些方面，将培养基配制成能使培养的MDCK细胞保留一种或多种下述特征，所述特征包括但不限于：如本文所述的非致瘤性、非致癌性、作为贴壁细胞生长、作为非贴壁细胞生长、具有上皮样形态、培养时支持各种病毒复制、以及支持流感病毒复制到高效价。认为细胞培养组合物中可存在本文公开的培养基配方或其组分。
本领域熟知含血清的培养基配方。含血清培养基配方包括但不限于：Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)+胎牛血清(FBS)+谷氨酰胺+葡萄糖。在一个实施方式中，含血清培养基中存在的FBS浓度介于约1％-约20％之间，或介于约5％-约15％之间，或介于约5％-约10％之间。在一具体实施方式中，含血清培养基中存在的FBS浓度为10％。在另一实施方式中，含血清培养基中存在的谷氨酰胺浓度介于约0.5mM-约10mM之间，或介于约1mM-约10mM之间，或介于约2mM-约5mM之间。在一具体实施方式中，含血清培养基中存在的谷氨酰胺浓度是4mM。再在其他实施方式中，含血清培养基中存在的葡萄糖浓度介于约1g/L-约10g/L之间，或介于约2g/L-约5g/L之间。在一具体实施方式中，含血清培养基中存在的葡萄糖浓度是4.5g/L。再在其他实施方式中，含血清培养基配方包含浓度介于约1％-约20％之间的FBS，浓度介于约0.5mM-约10mM之间的谷氨酰胺和浓度介于约1g/L-约10g/L之间的葡萄糖。在一具体实施方式中，含血清培养基配方包括Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)+10％胎牛血清(FBS)+4mM谷氨酰胺+4.5g/L葡萄糖。DMEM不难从许多商业来源购得，包括例如Gibco/BRL(目录号11965-084)。FBS不难从许多商业来源购得，包括例如JRH Biosciences(目录号12107-500M)。虽然FBS是动物细胞培养基中最常用的添加剂，但本发明也包括常规使用的其它来源血清，包括新生小牛、马和人血清。
在一个实施方式中，通过在补加血清的化学成分明确的培养基中培养得自美国典型培养物保藏中心(ATCC CCL34)的Madin Darby狗肾(MDCK)细胞衍生得到的本发明血清适应型MDCK细胞。在一具体实施方式中，如下所示，在补加血清的化学成分明确的培养基中扩增MDCK细胞(ATCC CCL34)来产生血清适应型MDCK细胞系：视需要使MDCK(ATCC CCL34)细胞在补加了胎牛血清(10％v/v)、4mM谷氨酰胺和4.5g/L葡萄糖的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)中传代，从而获得足够的细胞来制备冷冻的前主细胞库(preMaster Cell Bank)(PreMCB)。在另一具体实施方式中，用下面实施例1和2中详细描述的方法培养细胞。特别考虑从PreMCB小瓶再传代MDCK血清适应型细胞20次或更多次，并在成年裸小鼠体内模型中检验其致瘤性以及在核型试验中检验其核型。在某些实施方式中，将扩增的MDCK-S细胞皮下注射入成年裸小鼠不产生肿瘤，其染色体众数为78，染色体数目的范围不超过约60-88，或不超过约65-85，或不超过约65-80或不超过约70-85。在一个实施方式中，MDCK-S细胞在培养基(例如，本文所述培养基)中传代至少20代、或至少30代、或至少40代、或至少50代、或至少60代、或至少70代、或至少80代、或至少90代、或至少100代后无致瘤性。
本领域技术人员应知道在组织培养应用中使用血清或动物提取物可能有缺陷(Lambert，K.J.等，刊于：Animal Cell Biotechnology(《动物细胞生物技术》)，第1卷，Spier，R.E.等编，Academic Pres，纽约，第85-122页(1985))。例如，即使来自同一生产商，这些添加剂的化学组成在批次之间可能不同。此外，动物或人源的添加剂也可能污染了外来物质(例如，支原体、病毒和朊病毒)。当细胞培养基配方利用这些受污染的添加剂时，这些物质可严重破坏所培养细胞的健康状况。此外，当将受外来物质污染的培养物所产生的物质用于细胞治疗和其它临床应用时，这些物质可能造成健康风险。主要的担心是存在的朊病毒会在动物中导致海绵状脑病和在人中导致克-雅病(Creutzfeld-Jakob disease)。因此，本发明还提供包含本发明的MDCK细胞的无血清培养基配方。
本发明的无血清培养基配方包括但不限于：MediV 101(Taub+植物水解物)、MediV 102(Taub+脂质)、MediV 103(Taub+脂质+植物水解物)、MediV 104(Taub+脂质+植物水解物+生长因子)和Medi 105(除了用柠檬酸铁铵/托酚酮或硫酸铁铵/托酚酮替代转铁蛋白外与MediV 104相同)(参见，例如，美国专利申请号2006/0188977)、M-32(与MediV 105相同，添加微量元素A、B和C(见表9)、MediV 107(见表10)和M18M(见表11))。特别考虑的Taub的SF培养基(Taub和Livingston，1981，Ann NY Acad Sci.，372：406)是补加以下物质的DMEM和Ham的F12 50∶50混合物：激素、5μg/mL胰岛素、5μg/mL转铁蛋白、25ng/mL前列腺素E1、50nM氢化可的松、5pM碘塞罗宁、10nMNa2SeO3、4.5g/L葡萄糖、2.2g/L NaHCO3和4mM L-谷氨酰胺。本文也将Taub的SF培养基称为Taub培养基或简称为“Taub”。具体的培养基配方以及它们的制备方法在下文中提供(参见，例如，章节8.10)。
植物水解物包括但不限于一种或多种以下植物的水解物：玉米、棉籽、豌豆、大豆、麦芽、马铃薯和小麦。可采用酶水解制备的植物水解物，通常含有肽、游离氨基酸和生长因子的混合物。植物水解物不难购自许多商业来源，包括例如马克发展公司(Marcor Development)、HC公司(HyClone)和OT公司(Organo Technie)。也考虑可利用酵母水解物替代植物水解物或与之联用。酵母水解物不难购自许多商业来源，包括例如西格玛公司(Sigma-Aldrich)、USB公司(USB Corp)、基博科公司(Gibco/BRL)和其它公司。在某些实施方式中，可加入合成的水解产物或用来代替植物或酵母水解产物。
可用于补加培养基的脂质包括但不限于：化学成分明确的动物和植物衍生的脂质添加剂以及合成衍生的脂质。脂质添加剂中可能存在的脂质包括但不限于：胆固醇、饱和和/或不饱和脂肪酸(例如，花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸和硬脂酸)。脂质添加剂的100×储液中胆固醇的浓度可以介于0.10mg/ml-0.40mg/ml之间。脂质添加剂的100×储液中脂肪酸的浓度可以介于1-20μg/ml之间。适合于培养基配方的脂质不难购自许多商业来源，包括例如HC公司(HyClone)、基博科公司(Gibco/BRL)和西格玛公司(Sigma-Aldrich)。
在一个实施方式中，Taub培养基补加了植物水解物，其终浓度为至少0.5g/L、或至少1.0g/L、或至少1.5g/L、或至少2.0g/L、或至少2.5g/L、或至少3.0g/L、或至少5.0g/L、或至少10g/L、或至少20g/L。在一具体实施方式中，Taub培养基补加了小麦水解物。在另一具体实施方式中，Taub培养基补加了终浓度为2.5 g/L的小麦水解物。本发明提供在本文中称为MediV 101的无血清培养基，其包含补加了终浓度为2.5g/L小麦水解物的Taub培养基(参见，例如，章节8.10)。
在另一实施方式中，Taub培养基补加的脂质混合物终浓度为生产商推荐终浓度的至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少125％、或至少150％、或至少200％、或至少300％。在一具体实施方式中，Taub培养基补加了化学成分明确的脂质混合物。在另一具体实施方式中，Taub培养基补加的化学成分明确的脂质混合物终浓度为生产商推荐终浓度的100％(例如，购自生产商的100×储液可加入培养基中至终浓度为1×)。本发明提供在本文中称为MediV SFM 102的无血清培养基，其包含的Taub培养基补加的化学成分明确的脂质混合物终浓度为生产商推荐终浓度的100％(参见，例如，章节8.10)。
再在其他实施方式中，Taub培养基补加了植物水解物和脂质混合物，其中所述植物水解物的终浓度为至少0.5g/L、或至少1.0g/L、或至少1.5g/L、或至少2.0g/L、或至少2.5g/L、或至少3.0g/L、或至少5.0g/L、或至少10g/L、或至少20g/L，脂质混合物的终浓度为生产商推荐浓度的至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少125％、或至少150％、或至少175％、或至少200％。在一具体实施方式中，Taub培养基补加了小麦水解物和化学成分明确的脂质混合物。在另一具体实施方式中，Taub培养基补加了终浓度为2.5g/L的小麦水解物和终浓度为生产商推荐终浓度的100％的化学成分明确的脂质混合物。本发明提供在本文中称为MediVSFM 103的无血清培养基，其包含的Taub培养基补加了终浓度为2.5g/L的小麦水解物和终浓度为生产商推荐终浓度的100％的化学成分明确的脂质混合物(参见，例如，章节8.10)。
再在其他实施方式中，Taub培养基补加了生长激素。可用的生长激素包括但不限于：表皮生长因子(EGF)、胰岛素生长因子(IGF)、转化生长因子(TGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)。在一具体实施方式中，所述生长因子是表皮生长因子(EGF)。在一个实施方式中，Taub培养基补加的生长因子终浓度介于约0.1-约50.0ng/ml之间、或介于约0.5-约25.0ng/ml之间、或介于约1.0-约20ng/ml之间、或介于约5.0-约15.0ng/ml之间、或介于约8ng/ml-约12ng/ml之间。在一具体实施方式中，Taub培养基补加的EGF的终浓度是约10ng/ml。在还有其它实施方式中，Taub培养基补加了生长因子、植物水解物和脂质混合物，其中所述生长因子的终浓度介于约0.1-约50.0ng/ml之间、或介于约0.5-约25.0ng/ml之间、或介于约1.0-约20ng/ml之间、或介于约5.0-约15.0ng/ml之间、或介于约8ng/ml-约12ng/ml之间，所述植物水解物的终浓度为至少0.5g/L、或至少1.0g/L、或至少1.5g/L、或至少2.0g/L、或至少2.5g/L、或至少3.0g/L、或至少5.0g/L、或至少10g/L、或至少20g/L，所述脂质混合物的终浓度为生产商推荐浓度的至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少125％、或至少150％、或至少175％、或至少200％。在另一具体实施方式中，Taub培养基补加了终浓度为2.5g/L的小麦水解物和终浓度为生产商推荐终浓度的100％的化学成分明确的脂质混合物及终浓度约10ng/ml的EGF。本发明提供在本文中称为MediV SFM 104的无血清培养基，其包含的Taub培养基补加了终浓度为2.5g/L的小麦水解物和终浓度为生产商推荐终浓度的100％的化学成分明确的脂质混合物及终浓度约10ng/ml的EGF(参见，例如，章节8.10)。
本领域技术人员也应知道制备用于生产疫苗的病毒可能需要无动物蛋白的培养基配方。因此，在某些实施方式中，可用无动物的衍生物替代本文公开的无血清培养基(例如，MediV 101，MediV 102，MediV 103，MediV 104，MediV105，M-32，MediV 107，M18M)中一种或多种或所有的动物来源的成分。例如，利用可商品化购得的非动物来源重组胰岛素(例如，Biological Industries目录号01-818-1)替代动物来源的胰岛素。类似地，可利用铁结合试剂(参见例如美国专利5,045,454；5,118,513；6,593,140和PCT公布号WO 01/16294)替代动物来源的转铁蛋白。在一个实施方式中，本发明无血清培养基配方含有托酚酮(2-羟基-2，4，6-环庚三烯-1)和铁来源(例如，柠檬酸铁铵、硫酸铁铵)替代转铁蛋白。例如，该培养基中托酚酮或托酚酮衍生物与铁的摩尔浓度相比可过量，摩尔比约为2比1到约70比1，或约10比1到约70比1。在一具体实施方式中，本发明的无血清培养基包含终浓度为200μg/L的枸橼酸铁铵和终浓度为250μg/L的托酚酮(参见，例如，章节8.10)。因此，当该培养基中铁浓度约为0.3μM时，所用托酚酮或其衍生物的浓度约为1.5μM-约20μM，例如约3μM-约20μM。铁可以亚铁或铁离子存在，例如在该培养基中使用简单或络合的铁盐，如硫酸亚铁、氯化铁、硝酸铁或者特别是柠檬酸铁铵。本发明提供在本文中称为MediV SFM 105的无血清培养基，其包含的Taub培养基补加了终浓度为2.5g/L的小麦水解物、终浓度为生产商推荐终浓度的100％的化学成分明确的脂质混合物和终浓度约10ng/ml的EGF及比例介于2比1到70比1之间的柠檬酸铁铵∶托酚酮或硫酸铁铵∶托酚酮。在一具体实施方式中，本发明的无血清培养基包含终浓度为200μg/L的枸橼酸铁铵和终浓度为250μg/L的托酚酮(参见，例如，章节8.10)。
在某些实施方式中，这里所述的一种或多种培养基添加有微量元素(例如，微量元素溶液A、B和C，表9)。可使用的微量元素包括但不限于：CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O、亚硒酸二钠、枸橼酸铁、MnSO4·H2O、Na2SiO3·9H2O、钼酸铵盐、NH4VO3、NiSO4·6H2O、SnCl2(无水)、AlCl3·6H2O、AgNO3、Ba(C2H3O2)2、KBr、CdCl2、CoCl2·6H2O、CrCl3(无水)、NaF、GeO2、KI、RbCl、ZrOCl2·8H2O。微量元素的浓缩储液可方便地从许多商业来源获得，其中包括例如细胞生长公司(Cell Grow)(见目录号99-182、99-175和99-176)。本发明提供在本文中称为M-32的无血清培养基，其包含的Taub培养基补加了终浓度为2.5g/L的小麦水解物、终浓度为生产商推荐终浓度的100％的化学成分明确的脂质混合物和终浓度约10ng/ml的EGF和微量元素溶液A、B和C(表9)以及比例介于2比1到70比1之间的柠檬酸铁铵∶托酚酮或硫酸铁铵∶托酚酮。在一具体实施方式中，本发明的无血清培养基包含终浓度为200μg/L的枸橼酸铁铵和终浓度为250μg/L的托酚酮(参见，例如，章节8.10)。还考虑本文所述的一种或多种培养基被添加有额外的葡萄糖。一实施方式中，本发明的无血清培养基额外包含1-5g/L葡萄糖，使得葡萄糖的终浓度在约4.5至约10g/L之间。
在一个实施方式中，通过在补加血清的化学成分明确的培养基中传代得自美国典型培养物保藏中心(ATCC CCL34)的Madin Darby狗肾(MDCK)细胞至少一次，然后在无血清培养基，例如下述的无血清培养基中传代而衍生得到适应在MediV 101、MediV 102、MediV 103、MediV 104、MediV 105、M-32、MediV 107或M18M无血清培养基中生长的MDCK细胞。在一具体实施方式中，如下所示，使MDCK细胞(ATCC CCL34)适应无血清培养基：MDCK(ATCC CCL34)细胞在补加了胎牛血清(10％v/v)、4mM谷氨酰胺和4.5g/L葡萄糖的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)中传代至少一次，然后在无血清培养基中传代。然后视需要使MDCK细胞在无血清培养基中传代以获得足够的适应无血清培养基的细胞来制备冷冻的前主细胞库(PreMCB)。在某些实施方式中，这些细胞在含血清培养基(例如，补加了胎牛血清(10％v/v)、4mM谷氨酰胺和4.5g/L葡萄糖的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM))中传代1-5次、或4-10次、或9-20次、或20次以上，然后在无血清培养基(例如，MediV101、MediV 102、MediV 103、MediV 104、MediV 105、M-32、MediV 107和M18M，参见例如章节8.10)中传代。
特别考虑从PreMCB小瓶再传代适应无血清培养基的MDCK的细胞20次或更多次，并在成年裸小鼠体内模型中检验其致瘤性以及在核型试验中检验其核型。在某些实施方式中，将扩增的适应无血清培养基的MDCK细胞皮下注射入成年裸小鼠时不产生小结和/或其染色体众数为78。在另一实施方式中，扩增的适应无血清培养基的MDCK细胞的染色体众数为78，染色体数目的范围不超过约60-约88，或不超过约65-约85，或不超过约65-80或不超过约70-约85。在一个实施方式中，MDCK-SF细胞在培养基(例如，本文所述培养基)中传代至少20代、或至少30代、或至少40代、或至少50代、或至少60代、或至少70代、或至少80代、或至少90代、或至少100代后无致瘤性。
在一个实施方式中，用于衍生得到适应无血清培养基的MDCK细胞的无血清培养基是MediV 101。在另一个实施方式中，用于衍生得到适应无血清培养基的MDCK细胞的无血清培养基是MediV 102。再在另一个实施方式中，用于衍生得到适应无血清培养基的MDCK细胞的无血清培养基是MediV 103。再在另一个实施方式中，用于衍生得到适应无血清培养基的MDCK细胞的无血清培养基是MediV-104。在另一个实施方式中，用于衍生得到适应无血清培养基的MDCK细胞的无血清培养基是MediV 105。在其他实施方式中，用于衍生得到适应无血清培养基的MDCK细胞的无血清培养基是M-32。在其他实施方式中，用于衍生得到适应无血清培养基的MDCK细胞的无血清培养基是MediV 107。在另一个实施方式中，用于衍生得到适应无血清培养基的MDCK细胞的无血清培养基是M18M。再在另一个实施方式中，用于衍生得到适应无血清培养基的MDCK细胞的无血清培养基是APF培养基。考虑本文所述培养基的配制除去动物蛋白。例如，可用非动物来源的重组转铁蛋白替代牛转铁蛋白。具体的培养基配方以及它们的制备方法在下文中提供(参见，例如，章节8.10)。
在其他实施方式中，本发明的细胞不是经适应而能在无血清培养基内生长，而是未经适应就能在无血清培养基中生长。因此，一实施方式中，所述细胞在MediV 101中生长。在另一实施方式中，所述细胞在MediV 102中生长。再在另一实施方式中，所述细胞在MediV 103中生长。再在另一实施方式中，所述细胞在MediV-104中生长。在另一实施方式中，所述细胞在MediV 105中生长。在另一实施方式中，所述细胞在M-32中生长。在另一实施方式中，所述细胞在MediV 107中生长。在另一实施方式中，所述细胞在M18M中生长。再在另一实施方式中，所述细胞在APF培养基中生长。考虑本文所述培养基的配制除去动物蛋白。  例如，可用非动物来源的重组转铁蛋白替代牛转铁蛋白。
6.4培养条件
本发明提供在上述含血清和无血清培养基配方中培养本发明的MDCK细胞和其它动物细胞的方法。尤其考虑，额外的培养条件对于维持本发明MDCK细胞的特性以及支持流感病毒(例如，冷适应、和/或温敏、和/或减毒)生长到高效价可能有用，所述特性包括非致瘤性、非致癌性、作为贴壁细胞生长、作为非贴壁细胞生长、具有上皮样形态、支持各种病毒复制，所述高效价例如log10TCID50/mL和/或log10 FFU/mL为至少约7.4、或至少约7.6、或至少约7.8、或至少约8.0、或至少约9.0。这些培养条件包括但不限于：选择黏着表面、细胞密度、温度、CO2浓度、培养方法、溶氧含量和pH。
特别考虑了本领域技术人员可采用许多方式改进培养条件来优化本发明MDCK细胞的生长。这种适应可导致病毒材料(例如病毒)产量提高，例如美国专利申请公开号2005/0118698中所述。或者，本领域技术人员可改进培养条件来优化本发明MDCK细胞的疫苗材料产量，而不考虑细胞生长。这些培养条件包括但不限于：贴壁表面、细胞密度、温度、CO2浓度、培养方法、溶氧含量和pH。
在一个实施方式中，本发明MDCK细胞作为贴壁细胞在所附着表面培养。本领域熟知组织培养细胞能生长的黏着表面。黏着表面包括但不限于：表面改性的聚苯乙烯塑料、蛋白质包被表面(例如，纤连蛋白和/或胶原包被玻璃/塑料)以及各种商品化购得的微载体(例如，DEAE-葡聚糖微载体珠，如PL公司(Pfeifer & Langen)的Dormacell；FL公司(Flow Laboratories)的Superbead；苯乙烯共聚物-三-甲胺珠，如Hillex、SoloHill、Ann Arbor；GE健康护理生命科学公司(GE Healthcare Life Science)的Cytodex 1和Cytodex 3)。微载体珠是能为每份体积的贴壁细胞生长提供大表面积的小球(直径100-200微米)。例如，1升培养基可容纳超过2千万个微载体珠，从而能提供超过8000cm2的生长表面。本领域技术人员可根据培养本发明MDCK细胞所用的方法决定贴壁表面的选择。本领域技术人员将理解，在亚培养的贴壁细胞的处理过程中(即增殖所述细胞、扩增细胞培养物)，细胞必须从汇合支持表面(例如，烧瓶表面、微载体等)转移到新的支持表面。许多方法都可用来进行这种细胞转移。例如，可用蛋白酶(包括胰蛋白酶、TrypLE和胶原酶)从烧瓶或微载体上除去细胞，然后洗涤细胞并稀释到含有扩增培养基的较大烧瓶或较大体积的微载体中。该过程优选使用非动物来源的蛋白酶，如TrypLE(加州卡尔斯拜德因维曲根公司(Invitrogen，Carlsbad，CA))。或者，可采用微载体培养直接珠-珠转移法，其中将新鲜珠和培养基与汇合珠混合并在有助于细胞转移到新珠的条件下培育培养物。在某些实施方式中，组合采用了蛋白酶处理和珠-珠转移。在一具体实施方式中，用蛋白酶(例如，TrypLE)处理在微载体表面作为贴壁细胞生长的本发明的MDCK细胞的细胞培养物，然后灭活蛋白酶(例如，加入利马豆胰蛋白酶抑制剂等蛋白酶抑制剂)，然后可在培养物中加入新鲜培养基和微载体珠。一实施方式中，先除去部分或所有的生长培养基再进行蛋白酶处理。其他实施方式中，先用缓冲液代替部分或所有的生长培养基再进行蛋白酶处理。再在其他实施方式中，在蛋白酶处理之前或期间加入螯合剂。一些实施方式中，加入新鲜培养基和微载体之前、期间或之后将蛋白酶处理的培养物转移到较大培养容器内。
一实施方式中，本发明的MDCK细胞被作为非贴壁细胞(例如，能够在非贴壁条件下生长)在悬浮液中培养。本发明方法中可用的合适培养容器均是本领域技术人员已知的那些容器，例如，转瓶、滚瓶(roller bottle)、发酵罐或生物反应器。对于病毒的商品化生产，例如疫苗生产，往往需要在生物反应器或发酵罐中培养细胞。生物反应器可用容积从1升以下到10,000升以上，例如Cyto3生物反应器(Osmonics，Minnetonka，MN)；NBS生物反应器(NewBrunswick Scientific，Edison，新泽西)；B.Braun Biotech International的实验室和商业规模生物反应器(B.Braun Biotech，Melsungen，德国)。
在一个实施方式中，可用分批培养系统培养作为贴壁细胞的本发明MDCK细胞。在一具体实施方式中，本发明的MDCK细胞被作为贴壁细胞在补料分批培养系统内培养，其中当起始培养基中的营养物(例如，碳源、氨基酸等)被耗尽时加入额外的营养物以便于生长到高细胞密度。再在其他实施方式中，可用灌注培养系统培养作为贴壁细胞的本发明MDCK细胞。对于生产疫苗材料(例如，病毒)，特别考虑用灌注培养系统培养本发明MDCK细胞(例如，在搅拌式容器发酵罐中利用本领域技术人员已知的细胞保持系统，例如离心、过滤、旋转过滤器等)。有关将MDCK细胞作为贴壁细胞培养的其他指南可在例如美国专利申请号2003/0108860和2005/0118140中找到。在其他实施方式中，可用分批或补料分批培养系统培养作为非贴壁细胞的本发明MDCK细胞。再在其他实施方式中，可用灌注培养系统培养作为非贴壁细胞的本发明MDCK细胞。
在某些实施方式中，采用了包含一次性元件如培养细胞的柔性塑料袋的反应器系统。这种反应器系统是本领域已知的并可购得。参见，例如，国际专利公开WO 05/108546、WO 05/104706和WO 05/10849以及下面的章节8.12。包含一次性元件的反应器系统(文中也称为“单次使用生物反应物”或用缩写“SUB”表示)可以预先灭菌，且在各批次之间或各产物之间对培养或制造系统的原位蒸汽(SIP，steam-in-place)或原位清洁(CIP，clean-in-place)环境不作要求。如此，由于能确保各批次之间为0污染因此SUB不大需要调节控制，故而有显著的经济优势且在使用之前只需简单准备或无需准备。此外，由于SUB不需要清洁或灭菌，它们可快速使用从而有助于从细胞培养物制造大量疫苗材料(例如，病毒)。在具体实施方式中，一次性反应器系统是搅拌釜式反应器系统，它为混合细胞培养物提供了流体环境从而能更有效地控制营养物、O2和pH。
在一个实施方式中，在CO2浓度至少为1％、或至少为2％、或至少为3％、或至少为4％、或至少为5％、或至少为6％、或至少为7％、或至少为8％、或至少为9％、或至少为10％、或至少为20％下培养本发明MDCK细胞。
在一个实施方式中，在培养本发明MDCK细胞期间优选将溶氧(DO)浓度(pO2值)范围调节为介于5％-95％(根据空气饱和)之间，或介于10％-60％之间。在一具体实施方式中，溶氧(DO)浓度(pO2值)为至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少50％、或至少60％。
在另一实施方式中，在培养期间将用于培养本发明MDCK细胞的培养基pH范围调节为pH 6.4-pH 8.0，或pH 6.8-pH 7.4。在一具体实施方式中，培养基pH为约6.4、或约6.6、或约6.8、或约7.0、或约7.2、或约7.4、或约7.6、或约7.8、或约8.0。
在还有一实施方式中，在温度25℃-39℃培养本发明MDCK细胞。特别考虑了培养温度可按照所需方法而不同。例如，对于细胞增殖，可以在37℃培养本发明MDCK细胞，对于生产疫苗材料(例如，病毒)，可以在较低温度(例如，25℃-35℃)培养。在另一实施方式中，为生产疫苗材料，在低于30℃、或低于31℃、或低于32℃、或低于33℃、或低于34℃温度培养细胞。在另一实施方式中，为生产疫苗材料，在30℃、或31℃、或32℃、或33℃、或34℃温度培养细胞。
为生产疫苗材料(例如，病毒)，特别考虑了在易于更换培养基(的条件下)培养本发明MDCK细胞(例如，灌注系统)。可将细胞培养至极高细胞密度，例如介于1×106和25×106个细胞/mL之间。在培养本发明MDCK细胞期间，应能方便地操控培养基中葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸的含量以及pH和pO2值与本领域技术人员已知的其它参数，例如搅拌速率，从而能优化细胞密度和/或病毒生产。
本发明提供了通过在SUB中培养细胞(例如，本发明的MDCK细胞)使培养物中的所述细胞增殖到高细胞密度的方法。某些实施方式中，MDCK细胞在SUB系统内培养到细胞密度为至少5x105细胞/mL，至少7.5x105细胞/mL，至少1x106细胞/mL，至少2.5x106细胞/mL，至少5x106细胞/mL，至少7.5x106细胞/mL，至少10x106，至少15x106细胞/mL，至少20x106细胞/mL、或至少25x106细胞/mL。在具体实施方式中，MDCK细胞在SUB的已经补加了额外葡萄糖的无血清培养基内培养，所述培养基如下文所述(参见，例如，章节8.10)。例如，可采用补加了额外4.5g/L葡萄糖(总葡萄糖浓度为9.0g/L)的MediV-105。再在其他具体实施方式中，MDCK细胞在SUB中作为贴壁细胞在微载体上培养。一个实施方式中，使用的微载体的浓度介于约1至约4g/L。在其他实施方式中，使用的微载体的浓度介于约2至约3g/L。在某些实施方式中，用要培养的MDCK细胞接种SUB，接种密度为约5至约15×104细胞/mL。在一具体实施方式中，接种密度介于约6至约14×104细胞/mL，或介于约7至约13×104细胞/mL，或介于约8至约12×104细胞/mL，或介于约9至约11×104细胞/mL。对于本领域技术人员显而易见的是，也可按照每个微载体为基准计算接种密度。因此，在某些实施方式中，用要培养的MDCK细胞接种SUB，接种密度为约2至约30细胞/微载体、或为约2至约25细胞/微载体，细胞/微载体、或为约2至约20细胞/微载体、或为约2至约15细胞/微载体、或为约2至约10细胞/微载体、或为约5至约30细胞/微载体、或为约10至约30细胞/微载体、或为约15至约30细胞/微载体、或为约20至约30细胞/微载体、细胞/微载体、或为约5至约30细胞/微载体、或为约10至约25细胞/微载体、或为约15至约20细胞/微载体。
在某些实施方式中，MDCK细胞在搅拌釜SUB中培养，监测和/或控制选自下组的一个或多个参数：温度、搅拌速率、pH、溶解氧(DO)、O2和CO2流速。一实施方式中，温度维持在介于约30℃至约42℃，或介于约33℃至约39℃，或介于约35℃至约38℃。在一具体实施方式中，温度维持在介于约36℃至约37℃。一实施方式中，搅拌速率维持在介于约50至150rpm。在一具体实施方式中，搅拌速率维持在介于约80至约120rpm，或介于约90至约100rpm。搅拌速率是通过本领域熟知方法控制的。在另一实施方式中，培养物的pH维持在介于约6.0至约7.5。在一具体实施方式中，培养物的pH维持在介于约6.0至约7.5，并在培养过程中将培养物的pH维持在约7.0至约7.5。本领域技术人员将理解，最初的pH可以低于或高于所需范围，然后可使pH升高或降低到所需水平(例如，7.4)并维持该水平。可通过本领域已知的任何方法维持pH。例如，可根据需要通过鼓入CO2和/或通过加入酸(例如，HCL)或碱(例如，NaOH)来控制pH。再在其他实施方式中，可接受的DO介于约100至约35％。在一具体实施方式中，DO维持在介于约35％至约50％、或约50％。在另一具体实施方式中，DO不应降至低于约35％。本领域技术人员将理解，最初的DO可以是100％，然后可使DO降至预定水平(例如，50％)并维持该水平。可采用本领域已知的任何方法维持DO，例如通过鼓入O2。在某些实施方式中，O2流速维持在小于约2.0L/分。在某些实施方式中，CO2流速维持在小于约0.4L/分。
6.5生产疫苗材料(例如，病毒)
本发明提供了在细胞培养物内制造病毒的方法，该方法用MDCK细胞制造病毒。在该方法的某些实施方式中，本发明的MDCK细胞被用来制造病毒。在一个实施方式中，所述方法包括以下步骤：
a.用病毒感染包含本发明MDCK细胞的细胞培养组合物，
b.在允许病毒复制的条件下培育所述细胞培养组合物；和
c.将病毒与细胞培养组合物分离。
在一个实施方式中，本发明MDCK细胞在步骤(a)之前作为贴壁细胞增殖。在另一实施方式中，本发明MDCK细胞在步骤(a)之前作为非贴壁细胞增殖。在该方法(实施)期间，本发明MDCK细胞可以在任何培养基中培养，包括但不限于上述那些。在某些实施方式中，在该方法(实施)期间，本发明MDCK细胞可以在无血清的培养基中培养，例如MediV-101、MediV-102、MediV-103、MediV-104、MediV-105、MediV-107、M18M和其APF配方。在一具体实施方式中，本发明的MDCK细胞在补加有葡萄糖的无血清培养基中培养。在该方法(实施)期间，本发明MDCK细胞任选在含血清的培养基中培养(例如，DMEM+10％FBS+4mM谷氨酰胺+4.5g/L葡萄糖)。上文详述了其它培养条件，例如温度、pH、pO2、CO2浓度和细胞密度。为增殖用于生产病毒的本发明MDCK细胞，本领域技术人员可组合各培养条件。
在一个实施方式中，用病毒感染前，细胞增殖的温度介于22℃-40℃之间。在某些实施方式中，用病毒感染前，细胞增殖的温度低于39℃、或低于38℃、或低于37℃、或低于36℃、或低于35℃、或低于34℃、或低于33℃、或低于32℃、或低于30℃、或低于28℃、或低于26℃、或低于24℃。在一具体实施方式中，用病毒感染前，细胞增殖的温度介于33℃至约39℃。在该方法的一个实施方式中，利用本领域技术人员已知的细胞保持系统，例如离心、过滤、旋转过滤器等、微载体等在灌注系统，例如搅拌式容器发酵罐中进行细胞增殖培养。在一具体实施方式中，在SUB系统内进行培养以增殖细胞。
在该实施方式中，例如，该情况下细胞可增殖1-20天、或3-11天。在此期间进行培养基替换，每天从0增加至约1-5个发酵罐体积。或者，生长培养基中可补加和/或包含额外组分(例如，葡萄糖、痕量矿物质、氨基酸，等等)从而无需更换培养基。细胞以此方式增殖至高细胞密度，例如高达至少1×106-25×106个细胞/mL。培养期间，可通过细胞计数、培养基中葡萄糖、谷氨酰胺或乳酸含量和通过本领域技术人员已知的其它参数调节灌注系统中的灌注速率。或者，可采用分批方法或补料分批方法培养细胞。
在本发明方法的一个实施方式中，在培养期间，可如上所述采用本领域技术人员已知的方法调节用来培养细胞的培养基的pH、pO2值、葡萄糖浓度和其它参数。
在某些实施方式中，在步骤(a)之前更换部分培养基。一实施方式中，要更换的培养基部分介于约20％至约100％，或介于约30％至约80％，或介于约30％至约60％，或介于约66％至约80％。一实施方式中，将培养基更换为等体积的培养基。在另一实施方式中，将培养基更换为较小体积的培养基，从而有效浓缩细胞。培养基可更换成具有相同或不同组成的培养基。一实施方式中，用来增殖MDCK细胞的生长培养基被更换成感染培养基(即感染和病毒复制期间使用的培养基)。在一具体实施方式中，MDCK细胞在MediV-105、MediV-107或M18M中增殖并在感染之前将部分培养基更换成感染培养基。或者，生长培养基中可补加和/或包含额外组分(例如，葡萄糖、痕量矿物质、氨基酸，等等)从而无需更换培养基。在另一具体实施方式中，感染培养基包含丝氨酸蛋白酶(例如，胰蛋白酶，TrypLE，等等)。在其他实施方式中，未更换培养基，并在感染前不久、感染期间或感染后不久加入丝氨酸蛋白酶(例如，胰蛋白酶，TrypLE，等等)。
在某些实施方式中，在用病毒感染细胞之前或在感染时加入蛋白酶。
一些实施方式中，用病毒感染细胞的m.o.i.(感染复数，文中也缩写为“MOI”)为约0.00001至约10、或约0.00001至约1、或约0.00001至约0.0003、或约0.00001至约0.0001、或约0.0001至约10、或约0.0005至约5、或约0.002至约0.5、或约0.001至约0.003。再在其他实施方式中，用病毒感染细胞的m.o.i.(感染复数)为0.0001-10、或0.0005-5、或0.002-0.5、或0.001-0.003。或者，由培养物中病毒的最终浓度决定病毒对细胞的感染。例如，可加入病毒使最终浓度为约0.001x103/mL至约0.2x103/mL、或约0.01x103/mL至约2x103/mL、或约0.1x103/mL至约20x103/mL、或约1x103/mL至约4x103/mL。感染后，进一步培养感染的细胞培养物以复制细胞，特别是直至能检测到最大致细胞病变效应或最大病毒抗原含量。在一个实施方式中，感染后在介于22℃-40℃之间的温度培养细胞。在某些实施方式中，用病毒感染后，在低于39℃、或低于38℃、或低于37℃、或低于36℃、或低于35℃、或低于34℃、或低于33℃、或低于32℃、或低于30℃、或低于28℃、或低于26℃、或低于24℃的温度培养细胞。在某些实施方式中，用病毒感染后，在33℃的温度下培养细胞。在另一实施方式中，用病毒感染后，在低于33℃的温度下培养细胞。在另一实施方式中，用病毒感染后，在31℃的温度培养细胞。在某些实施方式中，培养细胞2-10天。可以在灌注系统中或任选以分批方法或补料分批方法进行培养。
在该实施方式中，例如，可在用病毒感染(步骤(b))后培养细胞，从而可如上所述维持pH和pO2值。在该方法的步骤(a)之前的培养细胞和/或步骤(b)的病毒复制过程中，也可以用新鲜制备的培养基、培养基浓缩液或诸如氨基酸、维生素、脂质组分、磷酸等明确成分替换细胞培养基来优化抗原产量。可在几天中进一步加入培养基或培养基浓缩液来缓慢稀释细胞，或者可在用培养基或培养基浓缩液进一步灌注期间培育细胞。在此情况中，进而可通过细胞计数、培养基中葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸或乳酸脱氢酶含量或本领域技术人员已知的其它参数来调节灌注速率。也可以联用灌注系统与分批方法。
在所述方法的一个实施方式中，感染后经过充分时间，例如2-10天、或任选3-7天获得合适病毒产量后，进行所生产病毒的收集和分离(步骤(c))。在所述方法的一个实施方式中，在感染2天、或3天、或4天、或5天、或6天、或7天、或8天、或9天、或10天后收集和分离所生产的病毒(步骤(c))。
可在本发明MDCK细胞中生产的病毒包括但不限于动物病毒，包括正粘病毒科、副粘病毒科、披膜病毒科、疱疹病毒科、弹状病毒科、逆转录病毒科、呼肠孤病毒科、黄病毒科、腺病毒科、小RNA病毒科、沙粒病毒科和痘病毒科。
近年来也开发了用于在细胞培养物中生产流感病毒的系统(参见，例如Furminger.刊于Textbook of Influenza(《流感教材》)，Nicholson，Webster和Hay编，第324-332页，布莱克威尔科技出版社(Blackwell Science)(1998)；Merten等，刊于Novel Strategies in The Design and Production of Vaccines(《疫苗设计和生产的新策略》)，Cohen和Shafferman编，第141-151页，克鲁维学术出版社(Kluwer Academic)(1996))。这些方法通常包括用选择的病毒株感染合适的宿主细胞。虽然消除了在鸡蛋中生产疫苗有关的许多困难，但不是所有致病流感毒株均能按照已建立的组织培养方法良好培养并生产。此外，在采用已建立方法的组织培养中，具有所需特征(例如减毒、温度敏感性和冷适应)的适合于生产减毒活疫苗的许多毒株培养并不成功，特别是在商品化规模下。
本发明提供了MDCK细胞系，这些细胞系已适应在含血清或无血清培养基中生长，在培养时能支持病毒(包括但不限于流感病毒)复制。这些细胞系适用于在细胞培养物中经济地复制用作疫苗材料的病毒。本发明MDCK细胞特别可用于生产用其它已建立细胞系培养不佳的冷适应、温度敏感的(ca/ts)流感病毒株(例如，
Figure G2007800423659D00351
中发现的流感病毒株)。此外，可用本发明MDCK细胞生产在含胚鸡蛋中培养的流感病毒株，例如可在人中致病的禽流感病毒(例如，“流行”毒株)。
可采用本发明方法在本发明MDCK细胞中生产的流感病毒包括但不限于：将选择的血凝素和/或神经氨酸酶抗原掺入减毒、温度敏感、冷适应的(ca/ts)原始毒株的重配病毒。例如，这些病毒可包含如温度敏感(ts)、冷适应(ca)或减毒(att的原始毒株(例如，甲型/Ann Arbor/6/60、乙型/Ann Arbor/1/66、PR8、乙型/列宁格勒/14/17/55、乙型/14/5/1、乙型/USSR/60/69、乙型/列宁格勒/179/86、乙型/列宁格勒/14/55、乙型/英格兰/2608/76等)中一种或多种的骨架(或一个或多个vRNA区段)。本领域已知在鸡蛋或细胞系中生产重配流感疫苗毒株的方法，包括Kilbourne，E.D.刊于Vaccines(《疫苗》)(第2版)，Plotkin和Mortimer编，WBS公司(WB Saunders Co.)(1988)以及PCT申请PCT专利公布号WO05/062820和WO 03/091401和美国专利号6,951,754、6,887,699、6,649,372、6,544,785、6,001,634、5,854,037、5,824,536、5,840,520、5,820,871、5,786,199和5,166,057和美国专利申请公开号20060019350、20050158342、20050037487、20050266026、20050186563、20050221489、20050032043、20040142003、20030035814和20020164770中所公开的那些方法。可采用本发明方法在本发明MDCK细胞中生产的其它流感病毒包括能表达异源基因产物的重组流感病毒，参见例如美国专利公布号2004/0241139和2004/0253273。
在一个实施方式中，使这些细胞增殖然后用流感病毒感染这些细胞。在某些实施方式中，以0.0001-10、或0.0005-5、或0.002-0.5、或0.0001-约0.002、或0.00001-约0.002的m.o.i.(感染复数)进行感染。在其它实施方式中，以约0.0001-约10、或约0.0005-约5、或约0.002-约0.5、或约0.0001-约0.002、或约0.00001-约0.002的m.o.i.(感染复数)进行感染。任选加入蛋白酶来切割血凝素[HA0]的前体蛋白，从而使病毒吸附到细胞上。按照本发明，可在用流感病毒感染细胞之前、同时或之后不久加入蛋白酶。如果在感染同时加入蛋白酶，可将其直接加入待感染的细胞培养物中，或者作为浓缩液与病毒接种物一起加入。在本发明的某些方面，所述蛋白酶是丝氨酸蛋白酶、或半胱氨酸蛋白酶或天冬酰胺蛋白酶。一个实施方式利用胰蛋白酶。一具体实施方式利用TPCK-处理的胰蛋白酶。在其他实施方式中，使用了美国申请号11/455,818中描述的来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的蛋白酶。胰蛋白酶可来自动物来源，或者更优选来自重组体来源。
在一个实施方式中，向细胞培养物中加入胰蛋白酶最高至终浓度为1-5000mU/ml，或5-1000mU/ml，或100-500mU/ml。在另一实施方式中，向细胞培养物中加入胰蛋白酶最高至培养基中终浓度为1-200μg/ml，或5-50μg/ml，或5-30μg/ml。在本发明方法步骤(iii)的感染细胞的进一步培养期间，以分批方法或补料分批方法为例可通过加入新鲜的胰蛋白酶以再活化胰蛋白酶，或者以灌注系统为例可通过连续加入或间歇加入胰蛋白酶溶液以再活化胰蛋白酶。
感染后，进一步培养感染的细胞培养物以复制病毒，特别是直至能检测到最大致细胞病变效应或最大病毒和/或病毒抗原含量。在某些实施方式中，培养细胞2-10天。进而可在灌注系统中或任选以分批方法或补料分批方法进行培养。在另一实施方式中，用流感病毒感染后，在25℃-36℃、29℃-34℃的温度培养细胞。在低于33℃的温度，特别是在上述温度范围培养受感染的细胞能导致某些流感病毒，例如乙型毒株产量较高(参见，例如，美国专利公布2006/0153872)。此外，考虑在低于35℃培养受感染的细胞能产生温度敏感、冷适应(ts/ca)的流感病毒。考虑ts/ca病毒也可以是减毒的(att)。在另一实施方式中，在低于30℃、或低于31℃、或低于32℃、或低于33℃、或低于34℃的温度培养细胞来产生ts/ca流感病毒株。在一具体实施方式中，在31℃的温度培养细胞来产生乙型流感病毒毒株。
用流感病毒感染后进行上述细胞培养(步骤(iii))。
在所述方法的一个实施方式中，感染后经过充分时间，例如2-10天、或3-7天以产生合适病毒产量后，进行所产生流感病毒的收集和分离(步骤(iii))。通常从受感染细胞生长的培养基中回收病毒。一般先澄清原始培养基，再浓缩流感病毒。常规方法包括过滤、超滤、吸附到硫酸钡上并洗脱以及离心。例如，首先可通过离心(例如1000-2000×g)足够时间(例如，10-30分钟之间)除去细胞碎片和其它大的颗粒物质以澄清受感染培养物的原始培养基。或者，培养基可经0.8μm醋酸纤维素膜过滤器过滤以除去完整的细胞和其它大的颗粒物质。然后可任选离心(例如，15,000×g，约3-5小时)澄清的培养上清液以沉淀流感病毒。将病毒沉淀物重悬于合适的缓冲液，例如STE(0.01 M Tris-HCl；0.15 M NaCl；0.0001 M EDTA)或pH 7.4的磷酸缓冲盐水(PBS)后，可利用蔗糖(60％-12％)或酒石酸钾(50％-10％)密度梯度离心浓缩病毒。无论连续或分梯度离心(例如将介于12％-60％之间的蔗糖梯度分成四个12％步骤)均合适。以某梯度离心的速度和时间应使病毒浓缩成可回收的可见条带。或者，对于最大规模的商品化应用，利用以连续方式操作的区带离心机转头进行密度梯度离心淘选病毒。足以指导技术人员从组织培养物中制备流感病毒的其它细节见，例如Furminger，刊于Textbook of Influenza(《流感教材》)，第324-332页，Nicholson等编；Merten等，刊于Novel Strategies in Design and Production of Vaccines(《疫苗设计和生产的新策略》)，第141-151页，Cohen和Shafferman编；和美国专利号5,690,937。如果需要，可在有稳定剂，例如蔗糖-磷酸盐-谷氨酸(SPG)存在下-80℃保存回收的病毒。
在所述方法的某些实施方式中，用
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或其它非特异性内切酶处理病毒。
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处理任选在收集和分离所产生流感病毒之前进行。在所述方法的其它实施方式中，Benzonase处理后澄清病毒材料。用于澄清的方法包括但不限于：直接流动过滤(direct flow filtration)(DFF)。收集和分离所产生流感病毒(步骤(iii))可用的其它步骤包括但不限于：正切线流过滤(TFF)、亲和层析以及离子交换层析和/或羟基磷灰石层析。在某些实施方式中，方法中采用了亲和层析。本领域技术人员将理解，可获得许多具有类似分离特性的亲和层析介质，例如可获得众多亲和层析介质来浓缩和纯化许多病毒和病毒蛋白。在一具体实施方式中，CellufineTM Sulfate(奇松公司(Chisso Corp.))亲和介质被用于亲和层析。在其他实施方式中，FluSelect(GE健康护理公司(GE Healthcare))被用于亲和层析。一实施方式中，在亲和层析处理的同时用
Figure G2007800423659D00383
处理病毒。在某些实施方式中，方法中采用了膜层析。一实施方式中，方法中采用了离子交换层析。一具体实施方式中，方法中采用了阳离子交换层析。某些实施方式中，阳离子交换层析在高pH下进行。一具体实施方式中，方法中采用了阴离子交换层析。某些实施方式中，阴离子交换层析在低pH下进行。用于离子交换层析的阴离子膜包括但不限于：阴离子膜吸附剂(例如
Figure G2007800423659D00384
Q15、D15)和阳离子膜吸附剂(例如S15和C15)。其它步骤示范于下文实施例章节。
6.6疫苗组合物和用法
本发明还涉及通过本发明方法获得的病毒(例如，流感病毒)。可采用已知方法配制这些病毒从而提供用于给予人或动物的疫苗。这些病毒可以完整的病毒颗粒(例如，减毒的活病毒)或灭活/裂解的病毒(例如，用洗涤剂或甲醛处理的)存在。可任选采用本领域技术人员已知的方法从病毒分离确定病毒组分(例如，蛋白质)用于制备疫苗。本领域熟知制备和配制疫苗组合物的灭活/裂解的病毒颗粒的方法，这些方法已用了超过40年。
配制完整的病毒颗粒(例如，减毒的活病毒)可包括其它步骤，包括但不限于通过过滤将缓冲液替换为最终制剂，然后进行灭菌步骤。用于这种制剂的缓冲液可含有200mM蔗糖和pH 7.0-7.2的磷酸盐或组氨酸缓冲液，还可额外加入其他氨基酸赋形剂，例如精氨酸。在某些实施方式中，加入能稳定蛋白质的水解物，例如胶原或明胶(例如，猪、鱼、鸟的明胶)。在某些实施方式中，本发明最终病毒溶液/疫苗包含活病毒，该活病毒的液体形式可稳定足够时间从而能在整个流感疫苗接种季节(例如，在北半球约从9月到3月)“现场”保存(例如，在2-8℃、4℃、5℃等冷藏销售和商品化)。因此，需要病毒/疫苗组合物能在整个保存期间保留其效力或其效力丧失速度可接受。在其它实施方式中，这种溶液/疫苗的液体形式能在约2℃-约8℃(例如冷藏温度)稳定。例如，配制冷藏稳定的减毒流感疫苗的方法和组合物描述于PCT专利公布号WO/2006/041819，也参见PCT公布WO 05/014862。
因此，在某些实施方式中，本发明提供了一种冷藏稳定的疫苗制剂，其最终配方中包含一种或多种以下成分(一种或多种组分的偏差在10％之内)：1-5％精氨酸；1-4％明胶；5-10％蔗糖(任选用磷酸缓冲液配制)；0.01-0.1％谷氨酸(单钠、一水合物)；10-150mM磷酸钾和80-150mM组氨酸。
在一具体实施方式中，所述疫苗制剂包含一种或多种以下成分(一种或多种组分的偏差在10％之内)：1-2％精氨酸；2％明胶；7-10％蔗糖(任选用磷酸缓冲液配制)和100mM组氨酸。在其他具体实施方式中，所述疫苗制剂包含一种或多种以下成分(一种或多种组分的偏差在10％之内)：1-2％精氨酸；1％明胶和7-10％蔗糖(任选用磷酸缓冲液配制)。
在某些其他实施方案中，本发明提供了本发明提供了一种冷藏稳定的疫苗制剂，其最终配方中包含一种或多种以下成分：6-8％重量/体积(w/v)的蔗糖；单盐酸精氨酸1-2％w/v；谷氨酸单钠一水合物0.05-0.1％w/v；明胶水解物，猪A型(或其它来源，如鱼类或鸟类)0.5-2％w/v；磷酸氢二钾1-2％；和磷酸二氢钾：0.25-1％w/v。
在一具体实施方案中，所述疫苗制剂包含以下一种或多种成分：蔗糖6.84％重量/体积(w/v)；单盐酸精氨酸1.21％w/v；谷氨酸单钠一水合物0.094w/v；明胶水解物，猪A型(或其它来源)1％w/v；磷酸氢二钾：1.13％；和磷酸二氢钾0.48％w/v。在另一具体实施方案中，所述疫苗制剂包含以下所有成分：蔗糖6.84％重量/体积(w/v)；单盐酸精氨酸1.21％w/v；谷氨酸钠一水合物0.094w/v；明胶水解物，猪A型(或其它来源)1％w/v；磷酸氢二钾1.13％；和磷酸二氢钾0.48％w/v。
在另一具体实施方案中，所述疫苗制剂包含以下所有成分(一种或多种成分的偏差在10％以内)：蔗糖6.84％重量/体积(w/v)；单盐酸精氨酸1.21％w/v；谷氨酸单钠一水合物0.094w/v；明胶水解物，猪A型(或其它来源)1％w/v；磷酸氢二钾1.13％；和磷酸二氢钾0.48％w/v。在另一具体实施方案中，所述疫苗制剂包含以下所有成分(一种或多种成分的偏差在10％以内)：蔗糖6.84％重量/体积(w/v)；单盐酸精氨酸1.21％w/v；明胶水解物，猪A型(或其它来源)1％w/v。在这类实施方案中，制剂用缓冲液{例如，磷酸钾缓冲液(pH7.0-7.2))配制。在另一具体实施方案中，疫苗制剂包含以下所有成分(一种或多种成分的偏差在20％以内)：蔗糖6.84％重量/体积(w/v)；单盐酸精氨酸1.21％w/v；谷氨酸单钠一水合物0.094w/v；明胶水解物，猪A型(或其它来源)1％w/v；磷酸氢二钾1.13％；和磷酸二氢钾0.48％w/v。
在另一具体实施方案中，所述疫苗制剂包含以下所有成分(一种或多种成分的偏差在30％以内)：蔗糖6.84％重量/体积(w/v)；单盐酸精氨酸1.21％w/v；谷氨酸单钠一水合物0.094w/v；明胶水解物，猪A型(或其它来源)1％w/v；磷酸氢二钾1.13％；和磷酸二氢钾0.48％w/v。再在另一具体实施方案中，所述疫苗制剂包含以下所有成分(一种或多种成分的偏差在40％以内)：蔗糖6.84％重量/体积(w/v)；单盐酸精氨酸1.21％w/v；谷氨酸单钠一水合物0.094w/v；明胶水解物，猪A型(或其它来源)1％w/v；磷酸氢二钾1.13％；和磷酸二氢钾0.48％w/v。
在另一具体实施方案中，所述疫苗制剂包含以下所有成分(一种或多种成分的偏差在1％以内)：蔗糖6.84％重量/体积(w/v)；单盐酸精氨酸1.21％w/v；谷氨酸单钠一水合物0.094w/v；明胶水解物，猪A型(或其它来源)1％w/v；磷酸氢二钾1.13％；和磷酸二氢钾0.48％w/v。在另一具体实施方案中，所述疫苗制剂包含以下所有成分(一种或多种成分的偏差在3％以内)：蔗糖6.84％重量/体积(w/v)；单盐酸精氨酸1.21％w/v；谷氨酸单钠一水合物0.094w/v；明胶水解物，猪A型(或其它来源)1％w/v；磷酸氢二钾1.13％；和磷酸二氢钾0.48％w/v。在一具体实施方案中，所述疫苗制剂可含有，例如，用作缓冲液的磷酸钾(如，至少50mM，或至少100mM，或至少200mM，或至少250mM)或组氨酸(如，至少50mM，或至少100mM，或至少200mM，或至少250mM)。
可任选采用喷雾干燥(一种在干热空气流下将制剂料液喷雾雾化成细小液滴的快速干燥方法)来延长疫苗制剂的保存时间。细小液滴蒸发得到溶质构成的干粉(参见，例如美国专利公布号2004/0042972)。
通常可预防性给予合适载体或赋形剂制备的病毒或病毒组分来刺激对一种或多种病毒毒株特异的免疫应答。载体或赋形剂一般是药学上可接受的载体或赋形剂，例如无菌水、盐水溶液、缓冲盐水溶液、葡萄糖水溶液、甘油水溶液、乙醇或它们的组合。可按照本领域已建立的方法制备这种确保无菌、pH、等渗性和稳定性的溶液。通常要选择载体或赋形剂以尽可能降低过敏和其它不良作用，以及配合具体给药途径，例如皮下、肌肉内、鼻内等。
用于病毒的预防性给药的制剂也任选含有一种或多种佐剂以提高针对流感抗原的免疫应答。合适的佐剂包括：皂苷，矿物凝胶，例如氢氧化铝，表面活性物质，例如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子、肽、油或烃乳液，卡介菌(BCG)，短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)和合成佐剂QS-21及MF59。
疫苗制剂的给予量通常应足以刺激对流感病毒的一种或多种毒株的特异性免疫应答。给予病毒最好能引发保护性免疫应答。本领域技术人员已知引发抗一种或多种病毒株的保护性免疫应答的剂量和方法。例如，灭活流感病毒的范围是约1-1000 HID50(人感染剂量)，即每份给予的剂量约105-108pfu(噬斑形成单位)。或者，不用佐剂时给予约10-50μg，例如约15μg HA，使用佐剂时给予的剂量较低。一般可在该范围内根据，例如年龄、身体状况、体重、性别、饮食、给药时间和其它临床因素调节该剂量。可全身性给予预防性疫苗制剂，例如通过针头和注射器或无针注射装置的皮下或肌肉内注射。或者，鼻内给予疫苗制剂，可利用滴剂、大颗粒气溶胶(大于约10微米)或喷入上呼吸道。虽然任何上述递送途径能导致保护性全身免疫应答，但鼻内给药能赋予在流感病毒进入部位引发粘膜免疫力的额外优点。对于鼻内给药，优选减毒的活病毒疫苗，例如减毒的冷适应和/或温度敏感的重组或重配流感病毒。虽然优选用一次剂量刺激保护性免疫应答，但也可通过同一或不同途径给予再次剂量来实现所需保护作用。这些方法可适合于任何病毒，包括但不限于正黏病毒(包括甲型和乙型流感病毒)、副黏病毒(包括RSV、人肺炎后病毒和副流感病毒)、弹状病毒和黄病毒。
6.6.1流感病毒
本文的方法、工艺和组合物主要涉及制备流感病毒疫苗。流感病毒由含分区段单链RNA基因组的内部核蛋白核心和由基质蛋白相连的脂蛋白外膜构成。甲型流感病毒和乙型流感病毒各含有单链负RNA的8个区段。甲型流感病毒基因组编码11种多肽。区段1-3编码构成RNA依赖性RNA聚合酶的3种多肽。区段1编码聚合酶复合体蛋白PB2。区段2和3分别编码其余的聚合酶蛋白PB1和PA。此外，一些流感病毒毒株的区段1编码在PB1编码区内由交替读框产生的小蛋白PB1-F2。区段4编码参与感染期间细胞附着和进入的血凝素(HA)表面糖蛋白。区段5编码核衣壳核蛋白(NP)多肽，病毒RNA有关的主要结构组分。区段6编码神经氨酸酶(NA)被膜糖蛋白。区段7编码从另路剪接的mRNA翻译的两种基质蛋白，称为M1和M2。区段8编码从另路剪接的mRNA变体翻译的两种非结构蛋白，NS1和NS2。
乙型流感病毒的8个基因组区段编码11种蛋白质。3个最大的基因编码RNA聚合酶的组分，PB1、PB2和PA。区段4编码HA蛋白。区段5编码NP。区段6编码NA蛋白和NB蛋白。NB和NA两种蛋白均从双顺反子(biscistronic)mRNA的重叠读框翻译。乙型流感病毒的区段7也编码两种蛋白：M1和M2。最小的区段编码两种产物，其中NS1从全长RNA翻译，NS2从剪接的mRNA变体翻译。
制备重配病毒以在批准的原始毒株(也称为原始供体病毒(MDV))中掺入选择的血凝素和神经氨酸酶抗原。FluMist
Figure G2007800423659D00431
利用批准的冷适应、减毒、温度敏感的MDV毒株(例如，甲型/AnnArbor/6/60和乙型/Ann Arbor/1/66)。
可采用许多方法来制备重配病毒，包括鸡蛋方法和更新的细胞培养方法(参见，例如PCT公布WO 03/091401；WO 05/062820和美国专利号6,544,785；6,649,372；6,951,75，以及美国专利申请号11/455,818,11/455,734和11/501,067。考虑可利用本发明MDCK细胞、培养基和方法来生产流感病毒，包括但不限于：本文公开的流感病毒株(例如，甲型/AnnArbor/6/60和乙型/AnnArbor/1/66)和包含甲型/AnnArbor/6/60、乙型/AnnArbor/1/66的基因，PR8的重配病毒。还考虑可利用本发明MDCK细胞、培养基和方法来生产具有温度敏感、冷适应、减毒的一种或多种表型的流感病毒(包括重配病毒)。可采用经典重配技术，例如共感染方法或任选通过质粒拯救技术制备重配体(参见，例如PCT公布WO03/091401和WO 05/062820；美国专利号6,544,785、6,649,372、6,951,754、6,887,699、6,001,634、5,854,037、5,824,536、5,840,520、5,820,871、5,786,199和5,166,057；美国专利申请公布号20060019350、20050158342、20050037487、20050266026、20050186563、20050221489、20050032043、20040142003、20030035814和20020164770；以及Neumann等(1999)Generation of influenzaAvirus entirely from cloned cDNAs(完全从克隆的cDNA制造甲型流感病毒).Proc Natl Acad Sci USA 96：9345-9350；Fodor等(1999) Rescue of influenza Avirus from recombinant DNA(从重组DNA拯救甲型流感病毒).J.Virol73：9679-9682；Hoffmann等(2000)A DNA transfection system for generation ofinfluenza A virus from eight plasmids(从八种质粒产生甲型流感病毒的DNA转染系统)Proc Natl Acad Sci USA 97：6108-6113；WO 01/83794；Hoffmann和Webster(2000)，Unidirectional RNA polymerase I-polymerase II transcription system for thegeneration of influenza A virus from eightplasmids(从八种质粒产生甲型流感病毒的单向RNA聚合酶I-聚合酶II转录系统)，81：2843-2847；以及Hoffmann等(2002)，Rescue of inuenza B viruses from 8 plasmids(从八种质粒拯救乙型流感病毒)，99(17)：11411-11416。
因此，本发明的另一个方面提供了一种包含一个或多个流感病毒基因组区段的本发明的MDCK细胞。在某些实施方式中，所述细胞包含流感病毒所有8个基因组区段。在某些实施方式中，所述8个基因组区段分别来自相同的流感病毒。在某些实施方式中，所述8个基因组区段分别来自一种、两种或多种不同的流感病毒。在某些实施方式中，所述8种基因组区段包含来自本领域技术人员已知且没有限制的任何流感毒株的分别编码HA和NA的两个区段，而剩余基因组区段来自冷适应、和/或温敏、和/或减毒流感病毒。在某些实施方式中，所述细胞包含上述任何公开文献中描述的任何流感基因组区段。
7.具体实施方式
1.一种Madin-Darby狗肾(MCDK)细胞，其中所述细胞培养组合物包含大量支持减毒、冷适应、温敏流感病毒复制达到每毫升以10为底的组织培养物感染剂量中值的对数(log10 TCID50/mL)为至少约7.0或者达到每毫升以10为底的荧光焦点单位的对数(log10 FFU/mL)为至少约7.0的MDCK细胞。
2.如实施方式1所述的MDCK细胞，其中所述MDCK细胞支持流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约7.2和/或log10 FFU/mL为至少约7.2。
3.如实施方式1所述的MDCK细胞，其中所述MDCK细胞支持流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约7.4和/或log10 FFU/mL为至少约7.4。
4.如实施方式1所述的MDCK细胞，其中所述MDCK细胞支持流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约7.6和/或log10 FFU/mL为至少约7.6。
5.如实施方式1所述的MDCK细胞，其中所述MDCK细胞支持流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约7.8和/或log10 FFU/mL为至少约7.8。
6.如实施方式1所述的MDCK细胞，其中所述MDCK细胞支持流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约8.0和/或log10 FFU/mL为至少约8.0。
7.如实施方式1所述的MDCK细胞，其中所述MDCK细胞支持流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约8.2和/或log10 FFU/mL为至少约8.2。
8.如实施方式1所述的MDCK细胞，其中所述MDCK细胞支持流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约8.4和/或log10 FFU/mL为至少约8.4。
9.如实施方式1所述的MDCK细胞，其中所述MDCK细胞支持流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约8.6和/或log10 FFU/mL为至少约8.6。
10.如实施方式1所述的MDCK细胞，其中所述MDCK细胞支持流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约8.8和/或log10 FFU/mL为至少约8.8。
11.如实施方式1所述的MDCK细胞，其中所述MDCK细胞支持流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约9.0和/或log10 FFU/mL为至少约9.0。
12.如实施方式1所述的MDCK细胞，其中所述MDCK细胞在无血清培养基内生长。
13.如实施方式1所述的MDCK细胞，其中所述无血清培养基是无动物蛋白培养基。
14.如实施方式1所述的MDCK细胞，其中所述MDCK细胞是贴壁的。
15.如实施方式1所述的MDCK细胞，其中所述MDCK细胞是非贴壁的。
16.如实施方式1所述的MDCK细胞，其中所述MDCK细胞是非致瘤性的。
17.如实施方式1所述的MDCK细胞，其中所述MDCK细胞是非致癌性的。
18.如实施方式1所述的MDCK细胞，其中所述MDCK细胞衍生自被鉴定为美国典型培养物保藏中心(ATCC)登录号CCL34的MDCK细胞系。
19.如实施方式1所述的MDCK细胞，其中所述MDCK细胞衍生自被鉴定为ATCC登录号PTA-6500、PTA-6501、PTA-6502或PTA-6503的MDCK细胞系。
20.如实施方式1所述的MDCK细胞，其中所述MDCK细胞被鉴定为ATCC登录号PTA-7909或PTA-7910。
21.如实施方式1所述的MDCK细胞，其中所述流感病毒是甲型流感病毒。
22.如实施方式1所述的MDCK细胞，其中所述流感病毒是乙型流感病毒。
23.如实施方式1所述的MDCK细胞，其中所述流感病毒是冷适应病毒。
24.如实施方式1所述的MDCK细胞，其中所述流感病毒是温敏病毒。
25.如实施方式1所述的MDCK细胞，其中所述流感病毒是减毒病毒。
26.如实施方式1所述的MDCK细胞，其中所述流感病毒是减毒、冷适应和温敏病毒。
27.如实施方式1所述的MDCK细胞，其中所述流感病毒包含温敏、减毒和冷适应流感病毒的一个或多个基因区段。
28.如实施方式1所述的MDCK细胞，其中所述流感病毒包含流感毒株A/Ann Arbor/6/60的一个或多个基因区段。
29.如实施方式1所述的MDCK细胞，其中所述流感病毒包含流感毒株B/Ann Arbor/1/66的一个或多个基因区段。
30.一种在SUB系统内使上述任一实施方式所述MDCK细胞增殖到细胞密度为至少约1x106细胞/ml的方法，所述方法包括以介于约8×104至约12×104细胞/mL的接种密度将权利要求1所述的MDCK细胞接种于无血清细胞培养基同时维持选自下组的一个或多个培养条件：
a.搅拌速率介于约50至150rpm；
b.pH介于约6.0至约7.5；
c.溶解氧(DO)介于约35％至约100％；和
d.温度介于约33℃至约42℃。
31.如实施方式30所述的方法，其中所述细胞培养基是无血清培养基。
32.如实施方式30所述的方法，其中所述细胞培养基是无动物细胞培养基。
33.如实施方式30所述的方法，其中所述细胞培养基是补加有葡萄糖的MediV-105、或者M-32或MediV-107。
34.如实施方式30所述的方法，其中所述搅拌速率介于约90至约100rpm。
35.如实施方式30所述的方法，其中所述DO介于约35％至约100％。
36.如实施方式30所述的方法，其中所述温度介于约36℃至约38℃。
37.如实施方式30所述的方法，其中用微载体来培养贴壁MDCK细胞。
38.如实施方式37所述的方法，其中所述微载体浓度介于约1至约4g/L。
39.一种通过实施方式30至实施方式38中任一项所述方法产生的细胞培养组合物。
40.一种包含MDCK细胞和细胞培养基的细胞培养组合物，其中所述细胞培养组合物支持流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约7.0和/或log10FFU/mL为至少约7.0。
41.如实施方式40所述的细胞培养组合物，其中所述MDCK细胞培养组合物支持流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约7.2和/或log10 FFU/mL为至少约7.2。
42.如实施方式40所述的细胞培养组合物，其中所述MDCK细胞培养组合物支持流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约7.4和/或log10 FFU/mL为至少约7.4。
43.如实施方式40所述的细胞培养组合物，其中所述MDCK细胞培养组合物支持流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约7.6和/或log10 FFU/mL为至少约7.6。
44.如实施方式40所述的细胞培养组合物，其中所述MDCK细胞培养组合物支持流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约7.8和/或log10 FFU/mL为至少约7.8。
45.如实施方式40所述的细胞培养组合物，其中所述MDCK细胞培养组合物支持流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约8.0和/或log10 FFU/mL为至少约8.0。
46.如实施方式40所述的细胞培养组合物，其中所述MDCK细胞培养组合物支持流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约8.2和/或log10 FFU/mL为至少约8.2。
47.如实施方式40所述的细胞培养组合物，其中所述MDCK细胞培养组合物支持流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约8.4和/或log10 FFU/mL为至少约8.4。
48.如实施方式40所述的细胞培养组合物，其中所述MDCK细胞培养组合物支持流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约8.6和/或log10 FFU/mL为至少约8.6。
49.如实施方式40所述的细胞培养组合物，其中所述MDCK细胞培养组合物支持流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约8.8和/或log10 FFU/mL为至少约8.8。
50.如实施方式40所述的细胞培养组合物，其中所述MDCK细胞培养组合物支持流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约9.0和/或log10 FFU/mL为至少约9.0。
51.如实施方式40所述的细胞培养组合物，其中所述细胞培养组合物不含动物血清。
52.如实施方式40所述的细胞培养组合物，其中所述细胞培养组合物不含从动物纯化的蛋白质。
53.如实施方式40所述的细胞培养组合物，其中所述细胞培养组合物包含重组表达蛋白。
54.如实施方式53所述的细胞培养组合物，其中所述蛋白质由至少一种MDCK细胞表达。
55.如实施方式53所述的细胞培养组合物，其中所述蛋白质由重组表达系统表达然后再加入细胞培养组合物。
56.如实施方式53所述的细胞培养组合物，其中所述重组表达的蛋白质是胰岛素或胰蛋白酶。
57.如实施方式40所述的细胞培养物组合物，其中所述至少一些MDCK细胞是贴壁的。
58.如实施方式40所述的细胞培养物组合物，其中所述MDCK细胞是贴壁的。
59.如实施方式40所述的细胞培养物组合物，其中所述至少一些MDCK细胞是非贴壁的。
60.如实施方式40所述的细胞培养物组合物，其中所述MDCK细胞是非贴壁的。
61.如实施方式40所述的细胞培养物组合物，其中所述MDCK细胞是非致瘤性的。
62.如实施方式40所述的细胞培养组合物，其中所述MDCK细胞衍生自被鉴定为美国典型培养物保藏中心(ATCC)登录号CCL34的MDCK细胞系。
63.如实施方式40所述的细胞培养组合物，其中所述MDCK细胞衍生自被鉴定为ATCC登录号PTA-6500、PTA-6501、PTA-6502或PTA-6503的MDCK细胞系。
64.如实施方式40所述的细胞培养组合物，其中所述MDCK细胞被鉴定为ATCC登录号PTA-7909或PTA-7910。
65.如实施方式40所述的细胞培养组合物，其中所述流感病毒是甲型流感病毒。
66.如实施方式40所述的细胞培养组合物，其中所述流感病毒是乙型流感病毒。
67.如实施方式40所述的细胞培养组合物，其中所述流感病毒是冷适应病毒。
68.如实施方式40所述的细胞培养组合物，其中所述流感病毒是减毒病毒。
69.如实施方式40所述的细胞培养组合物，其中所述流感病毒包含温敏、减毒和冷适应流感病毒的一个或多个基因区段。
70.如实施方式40所述的细胞培养组合物，其中所述流感病毒包含流感毒株A/Ann Arbor/6/60的一个或多个基因区段。
71.如实施方式40所述的细胞培养组合物，其中所述流感病毒包含流感毒株B/Ann Arbor/1/66的一个或多个基因区段。
72.如实施方式40所述的细胞培养组合物，其中，在流感病毒复制期间在约25℃至约33℃培养所述MDCK细胞。
73.如实施方式40所述的细胞培养物组合物，其中所述MDCK细胞不包含可检测的致癌DNA。
74.如实施方式40所述的细胞培养组合物，其中所述细胞培养组合物不含可检测的支原体。
75.如实施方式40所述的细胞培养组合物，其中所述细胞培养组合物不含可检测的细菌。
76.如实施方式40所述的细胞培养组合物，其中所述细胞培养组合物不含可检测的除流感病毒之外的病毒。
77.如实施方式40所述的细胞培养组合物，其中所述可检测的病毒是感染犬或人细胞的病毒。
78.如实施方式40所述的细胞培养物组合物，其中所述MDCK细胞不包含潜伏病毒。
79.如实施方式40所述的细胞培养物组合物，其中所述MDCK细胞不包含逆转录病毒。
80.如实施方式40所述的细胞培养物组合物，其中所述MDCK细胞生长至细胞密度至少约1x105细胞/ml。
81.如实施方式40所述的细胞培养物组合物，其中所述MDCK细胞生长至细胞密度至少约5x105细胞/ml。
82.如实施方式40所述的细胞培养物组合物，其中所述MDCK细胞生长至细胞密度至少约1x106细胞/ml。
83.如实施方式40所述的细胞培养物组合物，其中所述MDCK细胞生长至细胞密度至少约2.5x106细胞/ml。
84.如实施方式40所述的细胞培养物组合物，其中所述MDCK细胞生长至细胞密度至少约5x106细胞/ml。
85.一种在细胞培养物内制造流感病毒的方法，所述方法包括：
a.用流感病毒感染如实施方式40-84中任一项所述的细胞培养组合物，
b.在允许流感病毒复制的条件下培育所述细胞培养组合物；和
c.将流感病毒与细胞培养组合物分离。
86.如实施方式85所述的方法，其中，在步骤(a)之前或期间在细胞培养物中加入新鲜培养基或补充的培养基组分。
87.如实施方式85所述的方法，其中，在步骤(a)之前或期间不除去细胞培养基或除去一些细胞培养基并替换成新鲜培养基。
88.如实施方式85所述的方法，其中，在感染复数(MOI)介于约0.00001至约0.00003 FFU/细胞时进行步骤(a)。
89.如实施方式85所述的方法，其中，在MOI介于约0.0001至约0.0003 FFU/细胞时进行步骤(a)。
90.如实施方式85所述的方法，其中，在MOI介于约0.001至约0.003 FFU/细胞时进行步骤(a)。
91.如实施方式85所述的方法，其中，步骤(c)的条件选自下组：
a.搅拌速率介于约50至150rpm；
b.pH介于约6.0至约7.5；
c.溶解氧(DO)介于约35％至约100％；和
d.温度介于约30℃至约35℃。
92.如实施方式85所述的方法，其中所述流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约7.0和/或log10 FFU/mL为至少约7.0。
93.如实施方式85所述的方法，其中所述流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约7.2和/或log10 FFU/mL为至少约7.2。
94.如实施方式85所述的方法，其中所述流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约7.4和/或log10 FFU/mL为至少约7.4。
95.如实施方式85所述的方法，其中所述流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约7.6和/或log10 FFU/mL为至少约7.6。
96.如实施方式85所述的方法，其中所述流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约7.8和/或log10 FFU/mL为至少约7.8。
97.如实施方式85所述的方法，其中所述流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约8.0和/或log10 FFU/mL为至少约8.0。
98.如实施方式85所述的方法，其中所述流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约8.2和/或log10 FFU/mL为至少约8.2。
99.如实施方式85所述的方法，其中所述流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约8.4和/或log10 FFU/mL为至少约8.4。
100.如实施方式85所述的方法，其中所述流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约8.6和/或log10 FFU/mL为至少约8.6。
101.如实施方式85所述的方法，其中所述流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约8.8和/或log10 FFU/mL为至少约8.8。
102.如实施方式85所述的方法，其中所述流感病毒复制到log10 TCID50/mL为至少约9.0和/或log10 FFU/mL为至少约9.0。
103.一种用实施方式85所述方法生产的流感病毒。
104.一种免疫原性组合物，其包含实施方式103所述流感病毒的多肽和药学上可接受的载体或稀释剂。
105.一种免疫原性组合物，其包含实施方式103所述流感病毒和药学上可接受的载体或稀释剂。
106.如实施方式105所述的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物是冷藏稳定的。
107.一种消除病毒制品中的DNA污染物的方法，该方法包括：
(a)在DNA污染物无法保留于亲和层析介质而病毒制品中的病毒得以保留的条件下使所述病毒制品通过亲和层析介质；
(b)洗涤亲和层析介质以除去DNA污染物；和
(c)从亲和层析介质上洗脱病毒制品中存在的病毒。
108.如107所述方法，其中所述亲和层析介质是Cellufine Sulfate树脂。
109.如实施方式107所述的方法，其中，在步骤(a)和(b)之间使非特异性内切核酸酶制品通过亲和层析介质。
110.如实施方式108所述的方法，其中所述非特异性内切核酸酶是pH约7.2的用1X SP缓冲液配制的包含Benzonase的Benzonase制品。
111.如实施方式107所述的方法，其中所述病毒制品是流感病毒制品。
112.如实施方式108所述的方法，其中所述流感病毒制品从哺乳动物细胞制备。
113.如实施方式112所述方法，其中所述哺乳动物细胞是MDCK细胞或Vero细胞或PerC6细胞。
114.如实施方式107所述的方法，其中，用于步骤(a)的条件是用1X SP缓冲至pH约7.2。
115.如实施方式107所述的方法，其中，病毒制品中的病毒用pH约7.2的含有约1 M NaCl的1X SP缓冲液洗脱。
8.实施例
现通过参见以下实施例对本发明进行描述。提供这些实施例的目的只是说明本发明，不以任何方式将本发明的范围限制于这些实施例，而本发明的范围应认为包括根据本文提供的说明而对本发明作出的任何和所有的变化修改。
8.1实施例1：支持病毒在含血清培养液中高滴度复制MDCK细胞系的鉴定
本实施例描述当用含10％胎牛血清(FBS)的杜布(Dulbecco)改良伊格尔(Eagle)培养液(DMEM)培养MDCK细胞时能支持流感病毒高滴度复制的MDCK细胞系的鉴定和选择。
将一小管获自ATCC(ATCC登录号CCL-34；批号1805449；第54代)的MDCK细胞融化后接种T-25培养瓶(Corning)，瓶中装有含L-谷氨酰胺和10％胎牛血清(FBS)的10ml杜布改良伊格尔培养液(DMEM)。在37±1℃和5±1％CO2下培养细胞3天(第55代)。第3天将细胞传代接种一个T-225培养瓶(第56代)。接种后3天，再传代接种4个T-225瓶(第57代)。每次传代用的T-25或T-225培养瓶装有含L-谷氨酰胺和10％FBS的DMEM培养液，程序如下。
用无Ca++和Mg++的杜布磷酸缓冲盐水(DPBS)洗涤细胞二次，将含0.25％胰蛋白酶的1.5ml(T-25瓶)或7.5ml(T-225瓶)加入细胞培养(瓶)中。使培养的单层细胞释放15-20分钟后，加入1.5ml(T-25瓶)或7.5ml(T-225瓶)含L-谷氨酰胺和10％FBS的DMEM培养液以中和胰蛋白酶。用红血球计数器计数细胞，取接种所需量按每毫升5x104个细胞转移到100ml含L-谷氨酰胺和10％FBS的DMEM培养液中培养大约3天。胰蛋白酶消化后合并4个T-225瓶中的细胞，加入如上所述的含血清培养液。然后混合细胞并计数。离心细胞悬液，用含L-谷氨酰胺和10％FBS的10ml DMEM重悬沉淀细胞。再计数此细胞悬液。加入10ml 2x冻存液(含L-谷氨酰胺和10％FBS的DMEM及15％v/v二甲基亚砜)，充分混合细胞，按每等份1ml分装20个各冻存小管。在-80℃的Nalgene冻结容器中冻结细胞，然后转移到液氮气体区冻存。此冻存细胞为第57代，本文称为MDCK Pre-MCB批号1。
接着，将一小管MDCK Pre-MCB批号1细胞融化后接种一个T75瓶，瓶中装有35ml DMEM和10％FBS。在37℃和5％CO2下培养细胞3天(第58代)。第3天将细胞传代接种2个T-225培养瓶(第59代)。接种后3天，再传代接种4个T-225瓶(第60代)。接种后第3天改换为完全培养液。接种后第4天，将细胞传代接种25个T225瓶(第61代)。每次传代用的T-75或T-225培养瓶装有含L-谷氨酰胺和10％FBS的DMEM培养液，程序如下。
用无Ca++和Mg++的杜布磷酸缓冲盐水洗涤细胞二次，将含0.25％胰蛋白酶的3ml(T-75瓶)或7.5ml(T-225瓶)加入细胞(瓶)中。使培养的单层细胞释放15-20分钟后，加入3ml(T-75瓶)或7.5ml(T-225瓶)含L-谷氨酰胺和10％FBS的DMEM培养液以中和胰蛋白酶。用红血球计数器计数细胞，取接种所需量按每毫升5x104个细胞转移到100ml含L-谷氨酰胺和10％FBS的DMEM中培养大约3天。合并用胰蛋白酶消化25个T-225瓶的24个瓶中的细胞，加入含血清培养液。离心细胞悬液，用含L-谷氨酰胺和10％FBS的50ml DMEM重悬沉淀细胞。
该悬液作细胞计数。为了制备60ml每毫升1x107个细胞的悬液，取39.5ml细胞悬液与20.5ml10％FBS DMEM一起培育。然后在该60ml每毫升1x107个细胞的悬液中加入60ml 2x冻存液(含L-谷氨酰胺和10％FBS的DMEM及15％v/v二甲基亚砜)，充分混合细胞，按每等份1ml分装100个各冻存小管。在-60℃ 的Nalgene冻结容器中冻结细胞，然后转移到液氮中冻存。此冻存细胞为第57代MDCK，这些小管命名为MDCK Pre-MCB批号2。此细胞库保存在ATCC，其验明身份为ATCC登录号PTA-6500。
接着，将一小管MDCK Pre-MCB批号2细胞(第61代)融化后接种一个T75瓶，瓶中装有35ml DMEM和10％FBS。在37℃和5％CO2下培养该细胞3天(第62代)。第3天将细胞传代接种2个T-75培养瓶(第63代)。再在新的T75瓶中传3代然后在T225瓶中传一代(第67代)。
然后用胰蛋白酶消化细胞，以稀释法克隆。具体说，按每孔100μl(新鲜与条件培养液比例为1∶1)培养液0.5个细胞将细胞接种在96孔板中。次日显微镜观察细胞，鉴定含一个细胞的孔，然后将平板返回培养箱。培养7天后，核查平板评估细胞生长状况，各孔再加入100μl新鲜培养液。3天后改换为完全培养液(每孔200μL)。初次克隆接种后2周，用胰蛋白酶消化细胞，传代接种2组24孔板生长达到100％细胞铺满。如果未能达到100％铺满，再以新鲜培养液培养。
依次(24孔板→T25瓶或6孔板→T75或T225瓶)扩增克隆细胞，选出总共54个克隆，见以下表1，用含10％FBS DMEM和7.5％DMSO的液体冻结克隆后的第4或第5代细胞，液氮中贮存。此外，基本上按以下所述分离得到第二轮筛选的克隆56、57和58细胞。
表1.54个血清MDCK克隆细胞名单(按冻存顺序)
克隆ID 克隆ID 克隆ID 克隆ID 克隆ID 克隆ID
    1     10     19     28     37     46
    2     11     20     29     38     47
    3     12     21     30     39     48
    4     13     22     31     40     49
    5     14     23     55     41     50
    6     15     24     33     42     51
    7     16     25     34     43     52
    8     17     26     35     44     53
    9     18     27     36     45     54
按以上方法用数组24孔板之一进行病毒产量的初步筛选。为此将含4mM谷氨酰胺的DMEM培养3天的细胞用0.001 MOI的流感病毒株A/NewCaledomia适配株感染。感染时一次加入500mU/ml的TPCK胰蛋白酶。按以下实施例5所述，用半自动TCID50试验测定病毒滴度(每份样品n＝12)。所得各克隆的病毒滴度变化在7.0--8.5之间，分布见表2所示。
表2.用含10％FBS的DMEM培养的54个克隆细胞的病毒滴度分布
    滴度范围(Log10 TCID50/mL)     克隆编号(共54个)
    7.0-7.5     6
    7.6-8.0     35
    8.1-8.5     12
    ＞8.5     1
根据该病毒产量数据，选出6个细胞克隆，即克隆1、5、36、39、40和55细胞作进一步分析。在T瓶中扩增克隆细胞，一组T25瓶(每克隆8个瓶子)细胞用0.001 MOI的A/New Caledomia、
Figure G2007800423659D00551
和B/Jilin适配株感染，用DMEM+4mM谷氨酰胺作为感染后培养液(每个病毒株2瓶)。感染后第4天收获这些培养瓶，用实施例5的半自动TCID50试验(每瓶n＝12，每个病毒株n＝24))分析各瓶样品的病毒滴度。这些实验的结果提供在图1中，显示1和55克隆细胞的适配株A/New Caledonia病毒产量最高，A/Panama和B/Jilin适配株病毒的产量也最高。因此选择克隆1细胞作进一步亚克隆和适应无血清培养液。
再进行上述几轮筛选，筛选1000多个克隆细胞产生高滴度A/New Caledonia病毒的能力。这些克隆所筛选的63个能产生高滴度的A/Panama和B/Jilin适配株病毒，但产量没有一个高于克隆1细胞。因此不对这些克隆细胞作进一步研究，本文也不提供关于这些克隆的数据。
接着，将克隆1细胞(P4/P71，自从单一克隆分离后的第4代，总共71代)融化后接种一个T75瓶，瓶中装有含L-谷氨酰胺和10％FBS的35ml杜布改良伊格尔/汉母(Ham)F12培养液(DMEM/F12)。在37℃和5％CO2下培养细胞3天。第3天将细胞传代接种T-225培养瓶。接种后每隔3或4天在T75或T225瓶中传代细胞一次共8次。经这些传代后，经胰蛋白酶消化细胞(P13/P80)，用以下所述稀释法亚克隆。
按每孔100μl(新鲜与条件培养液比例为1∶1)培养液0.5个细胞将细胞接种在10块96孔板中。次日显微镜观察细胞(P1/P81，自从P1亚克隆以来共传代至P81代)，标记出每孔只含一个细胞的孔。让细胞生长7天，核查平板观察标记孔是否含有生长的细胞。此时间点用100微升新鲜生长培养液饲养细胞，然后3天后进行完全培养液交换(每孔200微升)。初次细胞接种后2周，用胰蛋白酶消化各克隆细胞，传代接种96孔板生长达到50％细胞铺满。不到50％铺满的细胞再用新鲜生长培养液饲养让其继续生长。依次(24孔板→T25瓶或6孔板→T755瓶)扩增达到50％铺满的克隆细胞，用10％FBS DMEM/F12和7.5％DMSO冻结总共63个亚克隆细胞(从此轮亚克隆开始算为第5或第6代)置液氮中贮存。
克隆扩增期间，也在3块96孔板中用0.001 MOI的A/Panama和B/Jilin适配株病毒感染细胞。用DMEM/F12+4mM谷氨酰胺培养细胞，接种后第3天感染细胞采用DMEM/F12+4mM谷氨酰胺作为感染后培养液，感染后第4天收获病毒加磷酸蔗糖使之稳定。用以下实施例4所述的FFA试验检测A/Panama病毒滴度。各亚克隆细胞产生的A/Panama病毒滴度变化在7.0--8.5之间，分布见以下表3所示。
表3.用含10％FBS的DMEM培养的克隆1细胞的63个亚克隆细胞的病毒滴度分布
    滴度范围(Log10 FFU/ml)     亚克隆编号(共63个)
    ＜6.1     28
    6.2-6.9     18
    7.0-7.5     13
    ≥7.6(低于8.0)     4
63个克隆细胞中，MDCK亚克隆1-A(P6/P86)、亚克隆1-B(P5/P85)和亚克隆1-C(P6/P86)细胞产生7.6log10 FFU/ml的病毒滴度，而亚克隆1-D细胞产生7.8log10 FFU/ml的病毒滴度。
8.2实施例2：使MDCK细胞克隆适应在无血清培养液中生长
此实施例描述了MDCK克隆1、55、56、57和58，及亚克隆1-A、1-B(P5/P85)、1-C和1-D细胞在MediV 105无血清培养液中的适应。衍生自MDCK细胞(ATCC登录号CCL-34)的克隆56、57和58细胞以类似于实施例1中所述的方式适应了在含血清的培养液中生长。此过程概况见图5B所示。
首先，将一小管MDCK细胞克隆的亚克隆1-D细胞(冻存的从亚克隆计第5代，总计为P85代)融化后接种一个T75瓶，瓶中装有35ml含L-谷氨酰胺和10％胎牛血清(FBS)的杜布改良伊格尔/汉母(Ham)F12培养液(DMEM/F12)，在37℃和5％CO2下培养3天。第3天将细胞传代接种T-225培养瓶(代次7/P87)。然后经过5次传代MDCK亚克隆D细胞适应了无血清培养液MediV105。
冻存经MediV 105传代的第5代细胞作为额外的存储库(accession bank)。此外，设置一瓶细胞(克隆1-D)以核查在MediV 105无血清培养液中的稳定性。在MediV 105无血清培养液中传代8次后，SF MDCK亚克隆D细胞开始死亡。
此外，使血清MDCK克隆1、55、56、57和58及亚克隆1-A、1-B(P5/P85)和C适应MediV 105无血清培养液。首先，将各血清MDCK克隆1、55、56、57和58及亚克隆1-A、1-B(P5/P85)和C细胞融化后接种装有35ml 10％FBSDMEM/F12培养液的T75瓶，在37℃和5％CO2下培养3天。胰蛋白酶消化细胞后接种一个新的T225瓶，接种密度为5x104个细胞/ml。接种后第3天，将细胞传代接种含血清培养液的T75瓶。
每次在装有DMEM/F12+L-谷氨酰胺和10％FBS的T75或T225瓶中传代的程序如下。用无Ca++和Mg++的杜布磷酸缓冲盐水(DPBS)洗涤细胞二次，将3ml(T-75瓶)或7.5ml(T-225瓶)胰蛋白酶(TrypLE)加入细胞(瓶)中。使培养的单层细胞释放15-20分钟后，加入3ml(T-75瓶)或7.5ml(T-225瓶)含L-谷氨酰胺和10％FBS的DMEM/F12以中和胰蛋白酶活性。用Cedex细胞计数器计数细胞，取接种所需量按每毫升5x104个细胞转移接种到T75瓶或T225瓶中，瓶中装有含L-谷氨酰胺的35ml(T75)或100ml(T225)的10％FBS DMEM足够培养液，培养约3或4天。
然后，使T75瓶中的各克隆细胞(融化后血清培养3代)适应在MediV 105无血清培养液中生长。T75瓶中的细胞在装有35ml MediV 105的T75瓶中传3代。第4代细胞在含100ml MediV 105培养液的T225瓶中传代。根据第5代细胞计数，将T225瓶中的细胞接种2个或3个T225瓶。接种后3天或4天，冻存克隆1、55、56、57和58及亚克隆1-A、1-B、1-C和1-D细胞作为额外的存储库。存库前克隆55和58细胞各用无血清培养液传代一次。
每次在装有MediV105无血清培养液的T75或T225瓶中传代的程序如下：第一次MediV 105传代细胞为取自小管融化后T75瓶用过培养液中的第3代细胞，用DPBS洗涤细胞，加入3ml TrypLE培育细胞使之释放。然后加入3ml白扁豆胰蛋白酶抑制剂溶液(Worthington)中和TrypLE，用Cedex细胞计数器作细胞计数。取接种所需量按每毫升5x104个细胞转移接种到装有35ml MediV105的T75瓶中。除采用2.5ml(T75)或5ml(T225)TrypLE的瓶外，如以上所述在37℃和5％CO2下培养3-4天，然后加入2.5ml(T75)或5ml(T225)白扁豆胰蛋白酶抑制剂溶液终止TrypLE活性，将细胞悬液转移到新无血清培养液的瓶中。所有接种按每毫升培养液5x104个细胞计算接种。
各克隆/亚克隆细胞存库步骤如下：胰蛋白酶消化多瓶细胞，合并后加入胰蛋白酶中和液，然后混合细胞并计数。离心细胞，用保存的用过培养液重悬制成1x107细胞/ml的悬液。然后加入2x冻存液(MediV105+15％v/v二甲基亚砜和等体积用过的培养液)，充分混合细胞，将1ml等份分装于2ml冻存小管。命名这些小管为SF MDCK存储库。在-60℃的Nalgene冻结容器中冻结细胞，然后转移到液氮中冻存。图5是克隆1和亚克隆1-B细胞整个选择和适应的流程图。
与存库一起，设立各个适应无血清培养克隆细胞的T75瓶以研究细胞在无血清培养液中生长的稳定性和病毒感染力。此项研究中，每ml培养液接种5x104细胞，接种后每隔3或4天传代一次。用MediV105培养的第6代克隆56和57细胞开始死亡。
用MediV105连续培养各个其它克隆和亚克隆细胞。第9或10代，各克隆细胞设置5个T75瓶进行病毒感染。用0.001 MOI的重配A/New Caledomia、
Figure G2007800423659D00591
和
Figure G2007800423659D00592
病毒株感染这些克隆细胞，采用DMEM/F12+4mM谷氨酰胺+500mU/ml TPCK胰蛋白酶液作为感染后培养液。感染后3和4天收获病毒，加入10x磷酸蔗糖缓冲液使之稳定。如以下实施例4中所述用FFA试验测定病毒滴度。这些实验的结果表明克隆1的亚克隆细胞产生的病毒高于其它测试的MDCK细胞克隆。因此，选择亚克隆1-A、1-B和1-C细胞作进一步实验以评估其在MediV105中的细胞生长。这些实验的结果见图2。如图2所示，亚克隆1-A、1-B和1-C细胞各显示了基本相似的生长特征。
此外，重测了第12代亚克隆1-A、1-B和1-C细胞的病毒感染力。如以上所述以一式二份(每种病毒株每个克隆细胞2个T75瓶)在与第9代相同的条件下用流感病毒感染每个亚克隆的9个T75瓶细胞。此实验的结果提供在表3中。如表3所示，各亚克隆细胞均支持测试病毒生长至较高滴度，但不同亚克隆细胞均不支持各测试病毒株生长至最高滴度。
最后，为评估MediV105培养液对病毒生长的影响，如以上所述，评估了用MediV105和OptiProTM培养液(GIBCO)二者培养的亚克隆1-A、1-B和1-C细胞的病毒感染力，同时测定了只用OptiProTM培养液培养的亚克隆1-D细胞。这些病毒感染力实验各自的结果表提供在图4中。如图4所示，二种培养液之间没有观察到病毒产生率有明显差异。
8.3实施例3：MDCK细胞在MediV105和M18M中生长的比较
此实施例描述了一个评估MDCK细胞在MediV105和M18M培养液中相对生长的实验结果。以下实施例10中描述了MediV105和M18M的配方。
在这些实验中，分别将一小管适应无血清培养的亚克隆1-A细胞融化后接种含MediV105或M18M的T75瓶。将T75瓶放在提供5％CO2的37℃培养箱中使细胞在这种条件下生长3-4天。培养结束时通过胰蛋白酶消化T75瓶中的细胞，然后用Cedex细胞计数器或再过88小时用Cedex和/或Nucleo计数器，计算总细胞数和活细胞数监测细胞生长速率和活力。
这些实验的结果提供在图6中。如图6所示，亚克隆1-A细胞能在MediV105和M18M二者中复制。然而在M18M中细胞活力随时间推移而下降，但在MediV105中细胞活力维持相对恒定。此外，计算了MDCK细胞的倍增时间提供在图7中。图7表明MDCK亚克隆1-A细胞的倍增时间在MediV105中为39小时，在M18M中为36小时。
8.4实施例4：MDCK细胞在不同微载体上生长的比较
此实施例描述了设计用于评估MDCK细胞在采用不同微载体的M18培养液中生长状况的实验结果。具体说，比较了MDCK细胞在微载体cytodex 1、cytodex 3、cytopore 1和cytopore 2(GE Healthcare)中的生长状况。
此实验中，将MDCK亚克隆1-A细胞接种在含M18培养液的125ml瓶中。然后各瓶分别加入2g/L的cytodex 1、cytodex 3、cytopore 1或cytopore 2。测定接种后30和60分钟不附着(微载体)的MDCK细胞密度见图8。如图8所示，MDCK细胞迅速附着于各种不同的微载体，最终附着于Cytopore微载体优于Cytodex微载体。
此外，在存在不同微载体的M18中(125ml培养液含30ml微载体w/v，120rpm摇动)培养细胞约5天，每日胰蛋白酶消化后作Cedex计数测定细胞总密度。这些实验的结果提供在图9中。如图9所示，Cytodex微载体产生的细胞密度比Cytopore微载体更高。而Cytodex 3产生的细胞密度高于Cytodex 1。
8.5实施例5：流感病毒在MDCK细胞中的复制
以每毫升5x104个细胞密度接种T-75瓶(35mL DMEM+10％FBS+4mM谷氨酰胺)，在37℃ 和5％CO2的培养箱中维持生长3天。用胰蛋白酶EDTA处理这些T瓶一个中的细胞，以台盼兰排除法计数细胞。如下感染其余T瓶中的细胞：吸弃生长培养液每瓶用10ml DPBS(无Ca2+/Mg2+)洗涤细胞二次，用以下公式测定的所需感染复数MOI(如0.01-0.001)病毒用量感染各T瓶中的细胞：
病毒用量(ml)＝各瓶总细胞数*MOI÷10^(logTCID50/mL)
MOI定义为每个细胞加入的病毒颗粒。
然后将所需用量的病毒加入各T瓶的35ml感染后培养液(DMEM+4mM谷氨酰胺+500mU/mL TPCK胰蛋白酶)中。T瓶置33℃，5％CO2下培育，每日取样共6天。在各样品中加入该样品体积1/10的10xSP液作为稳定剂，测定感染力前样品置＜-70℃保存。
按照测定感染性病毒颗粒的组织培养物感染剂量中位数(TCID50)试验，测定各样品中的病毒浓度。简言之，在96孔微量滴定板中将MDCK细胞培养成融合单层，加入ca/ts流感病毒样品的系列稀释液。通常在MDCK细胞试验中将样品稀释到最终稀释度10-4至10-10。1-5行和8-12行诸孔放置稀释病毒和样品，6-7行诸孔只接受病毒稀释液和作为细胞对照孔。此种格式在每块板上各样品稀释液可产生二个数据点(n＝2)。病毒在MDCK细胞中的复制可导致细胞死亡和细胞病变作用(CPE)，也释放子代病毒到培养上清液中。子代病毒感染其它细胞，重复感染导致最终破坏细胞单层。在33±1℃和CO2环境中持续感染细胞单层6天。然后从培养箱中取出平板，吸弃诸孔中的培养液，各孔加入100μl MEM/EBSS+1X非必须氨基酸+2mM谷氨酰胺+青霉素/链霉素+MTT。各板置37℃ 5％CO2培育3-4小时，肉眼观察形成颜色的孔(黄/橙色孔为CPE孔，深紫色孔无CPE)确定显示CPE的孔数。根据Karber改良的Reed-Muench方法，用各半块板中显示CPE的孔数计算出病毒滴度(log10TCID50/mL)。
8.6实施例6：病毒生长的荧光聚焦试验
在加有MEM/EBSS+1X非必须氨基酸+2mM谷氨酰胺+青霉素/链霉素的黑色96孔板中培养MDCK细胞。用病毒样品的系列稀释液(如ca/ts流感B-株(B/Hong Kong/330/01和B/Yamanashi/166/98))感染各孔，在33±1℃和CO2环境中培育约20小时。固定感染了病毒的板作免疫染色然后测定样品的病毒滴度。除去各板中的含病毒培养液，每孔用200μl(无Ca2+/Mg2+)的DPBS洗涤一次，加入200μl冷的4％(v/v)福尔马林PBS液固定15分钟。每孔用200μl(无Ca2+/Mg2+)DPBS洗涤二次，然后将细胞与A或B病毒株特异性第一抗体一起培育。此第一抗体用含0.1％皂甙、1％BSA的PBS稀释到所需稀释度。培育1小时后除去第一抗体，用含0.1％Tween 20的PBS液洗涤细胞3次，各孔加入用含0.1％皂甙、1％BSA的PBS配制成所需稀释度的偶联荧光染料的第二抗体(如标记FITC的兔抗绵羊抗体)进行培育。如上所述洗涤2次后，用纸巾吸干，每日用荧光显微镜观察着染荧光的孔，每日用SPOT程序摄取图象。
8.7实施例7：检测MDCK细胞的细胞核学、致瘤性和外来因子的试验
此实施例描述了适合检测MDCK细胞的细胞核学、致瘤性和是否存在外来因子的代表性试验。
8.7.1.细胞核学试验：
简言之，如上文所述在T225瓶中培养要检测的MDCK细胞，维持并传代培养。当认为细胞群已有足够的有丝分裂细胞时，收获细胞作有丝分裂分析。37℃用秋水仙胺(0.02μg/mL)处理细胞150分钟，然后胰蛋白酶消化，200 Xg离心5分钟收获细胞。吸弃上清液将细胞重悬于预先温热的低渗溶液37℃培育10分钟。离心沉淀膨胀的细胞，与Camoy液(甲醇∶冰乙酸＝3∶1)室温共培育40分钟固定细胞。末次离心后，将细胞重悬于1-3ml新鲜的固定液产生乳白色细胞悬液。将最终细胞悬液滴加在清洁载玻片上风干。
载玻片上加入Wright染料磷酸缓冲液培育7-10分钟染色细胞。7-10分钟后用自来水洗涤载玻片后风干。用低倍物镜(10X)扫描细胞寻找分裂中期细胞。通过高倍油镜(100X)分析中期细胞的染色体。分析100个中期细胞是否形态异常和染色体数目。扫描约1000个细胞测定其多倍体频率和有丝分裂指数(经历有丝分裂的细胞百分比)。
8.7.2.无菌试验：抑菌、抑真菌和4种培养液的无菌试验
抑菌、抑真菌试验可检测待测样品是否对用作对照的微生物(如枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、梭状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、黑曲霉菌)的生长有抑制作用。简而言之，取测试物接种3管TSB(大豆酪蛋白消化培养液)，4管THIO(巯基乙酸钠液体培养液)、2管SAB(Sabourand右旋糖琼脂)和1管PYG(蛋白胨酵母提取物)。取含有100cfu以下对照微生物的各对照接种物，接种相应类型的培养液。阳性对照包括：枯草芽孢杆菌接种TSB和THIO；白色念珠菌接种TSB和SAB(20-25℃和30-35℃)；梭状芽孢杆菌接种THIO和PYG；绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉菌接种THIO和TSB。阴性对照为灭菌的PBS。培养各培养物3-5天后核查微生物生长情况。
为检测所测培养液是否符合USP 26、EP和21CFR610.12制定的灭菌要求，取所测培养液接种2管TSB(大豆酪蛋白消化培养液)，2管THIO(巯基乙酸钠液体培养液)、3管SAB((Sabourand右旋糖琼脂)和2管PYG(蛋白胨酵母提取物)。在相应的适当温度(SAB斜面用二种温度)下接种培养液，观察所有试管14天，期间第3/4或5天，第7或8天，和第14天时检查各试管。取出呈现混浊的接种试管进行革兰染色以确定该测试样品中所含微生物的革兰染色类型。
8.7.3.支原体和支原体抑制试验
如上文所述在T瓶中扩增和培养细胞。制备浓度每毫升5x105个细胞的裂解液-70℃冻存。然后检测测试物能否抑制肺炎支原体、口腔支原体和猪鼻支原体在琼脂肉汤/平板和/或在VERO细胞中的生长。
对于琼脂分离试验，检测测试物在琼脂平板或肉汤瓶中能否形成花序状园点或不形成花序状园点。形成花序状园点的测试样品中肺炎支原体和口腔支原体达到了0-100 cfu/0.2mL(琼脂试验)和10-100 cfu/10mL(半肉汤试验)的稀释度。一部分测试样品不形成花序状园点。用花序状园点形成测试样品(2瓶)或花序状园点不形成测试样品(2瓶)各10ml接种4个半固体肉汤瓶，在适当温度下需氧或厌氧培养形成/不形成花序状园点的测试样品各一瓶。各花序状园点形成或不形成样品接种10块A琼脂平板和10块B琼脂平板。在适当温度下需氧或厌氧培养A型和B型琼脂平板各一半。未接种支原体的半固体肉汤作为未接种的阴性对照。观察所有肉汤瓶21天。第3、7和14天在A型和B型琼脂平板(各10块板，0.2ml/每板)上传代培养各肉汤瓶，培养条件与相应瓶培养相同。每天检查一次共21天。
对于提高VERO细胞培养(效率)的试验，检测了测试物能否形成花序状园点或无花序状园点。浓度为10-100 cfu/0.2mL的口腔支原体和猪鼻支原体测试样品形成了花序状园点。在T-75瓶VERO细胞培养物上接种形成花序状园点测试样品、不形成花序状园点测试样品、阳性对照和阴性对照。接种后3-5天刮下各瓶中的细胞速冻。取各瓶1ml细胞裂解液的2/10接种含VERO细胞的6孔板各孔。此外，取阳性和阴对照接种含VERO细胞的6孔板相应孔。3-5天后，固定细胞用结合DNA的HOECHT染料染色评价是否存在支原体。
8.7.4.在裸小鼠中的致肿瘤试验
在无胸腺裸鼠(nu/nu)中如下评估肿瘤形成。简而言之，给230只无胸腺小鼠(4周龄)皮下各注射0.2ml(1x107个细胞/每只鼠)阳性对照(Hela细胞)或阴性对照(PBS)或测试细胞(MDCK细胞)。注射前随机分组动物，同一天所有小鼠用22号针头注射。每隔一个工作日观察所有小鼠一次，84天内每周触摸注射部位2次有无发生病损。测量各病损区，只要病损范围看不见扩大就保留动物最多达6个月。安乐死呈现垂死的动物。处死存活6个月至观察期结束时的这些动物和所有小鼠作尸体剖解。用组织病理学方法分析注射部位、肺、肩胛淋巴结和肉眼病损。
8.7.5.其他试验
如下文表4中所示，进行了采用现有病毒制剂的其他典型PCR和/或抗体特异性试验。
表4，其他检测试验
    通用试验
    无菌
    支原体
    外来因子，体外(多种细胞系)
    外来因子，体内
    PERT
    共培养
    细胞核学
    电镜
    致瘤性，采用完整细胞
    致癌性，采用细胞DNA
    致癌性，采用细胞裂解液
    牛病毒，每种9CFR
    猪病毒，每种9CFR
  PCR＊/抗体特异性
  AAV1和2型
  HCMV
  EBV
  HSV
  甲肝、乙肝和丙肝
  HHV 6，7和8
  HIV1和2
  HPV
  HTLVI和II
  多瘤病毒属(BK和JC病毒)
  环病毒属
  犬细小病毒
  犬瘟热病毒
  腺病毒
  SV40
8.8实施例8：疫苗材料的加工和配制
采用类似于目前得到许可的生产脊灰病毒疫苗的规模可放大的微载体技术，可用于在上文实施例4中所述的MDCK细胞中生产流感病毒(疫苗)。用葡聚糖制备的球形珠支持了MDCK细胞在2-10升生物反应器中的优良生长。发现培养在MediV 105或OptiProTM培养液中的亲代MDCK细胞能在转瓶中Cytodex 3微载体上以批次方式生长至每毫升2x106个细胞密度，用10升规模生物反应器可培养MDCK细胞至每毫升＞2.5x106个细胞。
检测这些MDCK细胞(或类似的非粘附MDCK细胞)在无血清条件下产生高滴度流感病毒株疫苗的能力，与在T-瓶中用血清培养细胞获得的生产力作比较。为了制备临床用疫苗，以20升或150升规模用MDCK细胞生产流感病毒，而商品化规模生产采用高达2500升的生物反应器。图10概述了一种规模可达到商品化生产水平的细胞培养方法。先从T-75瓶→T-225瓶→1升旋转瓶→20升然后300升生物反应器依次扩增工作细胞库，最后扩大至2500升生物反应器。当获得最佳细胞密度时用疫苗病毒株接种培养的MDCK细胞。从培养上清液中大量收获病毒。实施例12详述了单次使用生物反应器(SUB)生产高滴度病毒用于生产疫苗材料的实施方法。
基于流感疫苗的细胞培养纯化方法以纯化鸡蛋流感疫苗为范例(参见PCT出版物WO 05/014862和2005年10月4日提交的PCT专利申请PCT/US05/035614)。纯化细胞生产的病毒疫苗材料方法包括以下任何或所有步骤：均浆、离心澄清、超滤、硫酸钡吸附和洗脱、正切流过滤、密度梯度超离心、层析和除菌过滤。也可包括其它纯化步骤，例如，可先离心，如1000-2000x g离心足够时间(如10和30分钟)去除细胞碎片和其它大颗粒物质，以澄清感染细胞的粗培养液或收获的病毒。或者，通过0.8μm醋酸纤维滤膜过滤此培养液去除完整细胞和其它大颗粒物质。然后任选离心(如15,000xg约3-5小时)澄清培养液以沉淀流感病毒。以适当缓冲液，如STE(0.01 M Tris-HCl；0.15 M NaCl；0.0001 M EDTA)或pH 7.4磷酸缓冲盐水(PBS)重悬沉淀的病毒后，可在蔗糖(60％-12％)或酒石酸钾(50％-10％)上进行密度梯度离心浓缩病毒。连续梯度或分步梯度，如12％至60％的4层(每层梯度相差12％)蔗糖梯度离心是合适的。梯度离心的速度和时间应足以使病毒浓缩成可看见的条带以便回收。或者，对于最大规模的商品化应用，可采用区带离心转头以连续密度梯度离心方式操作淘选病毒。
在纯化细胞产生的病毒疫苗原料早期加工中可包括的特征是采用一种非特异性内切核酸酶虽然根据对细胞DNA致癌性评价的研究，MDCK细胞的DNA不会形成致癌危险，但用
Figure G2007800423659D00662
处理事实上可消除任何潜在的或假想的危险。在一种纯化方法中，用
Figure G2007800423659D00663
处理后，直向流过滤(DFF)澄清半成品材料也能去除这种材料中任何残留的完整哺乳动物细胞。然后用正切流过滤(TFF)浓缩滤过的半成品，再进行后续纯化步骤。纯化方法包括亲和层析、及离子交换层析和/或羟基磷灰石层析，这些对其它病毒系统工作良好的方法可用于基于细胞的流感疫苗生产。然后将此开发工艺获得的高纯化病毒材料用于生产疫苗材料。例如，用于减毒活疫苗(如FluMist)的生产，这种病毒材料可通过过滤更换缓冲液，再经除菌步骤后成为最终制品。用于这种制品的缓冲液可含200mM蔗糖和磷酸钠，或是加有其它氨基酸赋形剂如精氨酸的pH 7.0-7.2组氨酸缓冲液。如果需要稳定剂也可加入蛋白水解物如明胶(如猪、禽、鱼明胶)。理想地可使配制的疫苗材料在长期贮存中稳定。长期贮存可采用的一种方法是喷雾干燥法，是一种在干热气流下将液体制品喷雾成细小液滴进行快速干燥的方法。细小液滴蒸发干燥后成为干粉形式的可溶性溶质(参见例如US公开专利2004/0042972)。喷雾干燥与常规冷冻干燥相比优点是易于放大规模和制造费用低。或者，采用该领域已知的方法将待稳定的此疫苗原料制成冰箱稳定的液体制品。例如，2005年10月4日提交的PCT专利申请PCT/US2005/035614中描述的配制冰箱稳定的减毒流感疫苗的方法和组合物。
在组成纯化方案的特征性加工步骤中要监测(病毒)生产情况。可采用的特征性步骤包括但不限于荧光聚焦试验(如实施例6所述，本领域已知，参见例如Stokes等，1988，J Clin Microbiol.26：1263-6)，此试验采用简单的抗体结合和荧光染色方法来测定病毒感染能力。本领域技术人员测定总蛋白和DNA的许多方法可用于检测最初残留杂质的百分比。可通过计算每份疫苗的病毒感染力确定此制品的比活性(如每毫克疫苗的感染力)。
图11A概述了可采用的一种纯化方法。简言之，用合适的缓冲液(如蔗糖磷酸缓冲液)稳定收获的单价流感病毒。在稳定的收获病毒中加入一种非特异性核酸内切酶Benzonase以将DNA破碎成300个碱基对以下的片段。经Benzonase处理后，过滤收获的病毒以除去残留的完整MDCK细胞和大多数细胞碎片。具体说，可采用直向流过滤(DFF)。不难确定孔径大小不同的过滤膜，膜的组成和构型(如多层膜或单层膜)和加工参数，包括最大流速和放大系数。然后用超滤膜作切向流过滤(TFF)浓缩澄清的病毒收获液，用合适的缓冲液(如蔗糖磷酸缓冲液)透析此浓缩病毒液。经浓缩和透析的收获液再经柱层析或膜层析。可用亲和层析和离子交换层析进一步去除MDCK细胞蛋白质和DNA。然后浓缩和用制品缓冲液透析经层析纯化的病毒收获液，最后过滤除菌。图11B概述了可采用的另一种联合
Figure G2007800423659D00671
步骤与亲和层析的纯化方法。采用此法可减少下游加工步骤。简言之，用合适的缓冲液(如蔗糖磷酸缓冲液)稳定收获的单价流感病毒。过滤，如用1.2-和0.45-μm滤膜作直向流过滤(DFF)澄清已稳定的病毒。然后作TFF用超滤膜条件化/浓缩澄清的病毒液，然后用合适的缓冲液(如蔗糖磷酸缓冲液)透析浓缩的病毒液，例如可采用500 KD TFF(5X UF/5X DF)。然后使条件化的病毒液经柱处理，再浓缩洗脱的纯化病毒液，以制品缓冲液透析，例如采用500 KD TFF和8X DF加工。然后例如通过0.45-和0.2-μm滤膜过滤除菌病毒液半成品。
8.8.1.硫酸纤维素(Cellufine Sulfate)层析
已确定MDCK DNA含有约12kB的
Figure G2007800423659D00673
抗性片段不能用TFF或蔗糖密度梯度超离心去除(资料未显示)。如上文所述，采用层析可确保去除所有污染物。组成硫酸纤维素树脂的硫酸脂共价结合于纤维二糖的6-位而附着于纤维素珠。此树脂的亲和力与肝素或硫酸葡聚糖相仿。检测了采用硫酸纤维素(CS)的柱层析，证明其能有效去除污染的DNA条带。简而言之，用缓冲液A(1XSP(218 Mmaya蔗糖、11mM磷酸钾)，pH 7.2)平衡2.6x2cm(10mL)柱，加载TFF纯化的病毒(A/New Caledomia适配株)。用5倍柱体积的缓冲液A洗涤此柱，然后用0-100％梯度的缓冲液B(1X SP+1 M NaCl，pH 7.2)洗脱。流速维持在3ml/分钟。图12A的左分图显示了OD概况。表5显示此原材料、CS柱的洗穿液和洗脱组分的DNA含量、总HAU和FFA感染力。
表5.硫酸纤维素(Cellufine Sulfate)层析
样品   总DNA(μg)   总HAU(Log10/mL)   FFA感染力(每mL)
  TFF/UF材料   26.7   5.8   1.5X1010
流穿液   12.7(47％)   4.0(1.6％)   6.5X107(0.4％)
洗脱液   8.5(32％)   5.75(88％)   1.1X1010(70％)
用琼脂糖凝胶电泳分析了原材料、CS柱的洗穿液和洗脱组分(图12A右分图)。原材料(泳道2)和CS柱的洗穿液(泳道3)二者中均存在DNA污染，但洗脱组分(泳道4)中没有。这些数据表明采用这种亲和树脂去除培养液中的污染物和宿主细胞比单次使用超滤更有效。
8.8.2.上
Figure G2007800423659D00681
柱进行处理
为减少处理步骤和提高纯度，可将
Figure G2007800423659D00682
处理与硫酸纤维层析相联合。图12B显示了采用
Figure G2007800423659D00683
柱处理降解MDCK dsDNA的方案。
此工艺详述如下：全过程在22℃室温下实施。将TFF-纯化的病毒液温热至22-24℃，然后如需要进行层析。此柱加载量依据每次FFA试验的病毒总感染力而定。此柱的目标加载量是每毫升柱体积9-9.5log10FFU。平衡、加载、洗涤和洗脱的流速维持相同(155cm/小时)，除了表6所示当用含
Figure G2007800423659D00684
的1X SP缓冲液洗涤时降低流速外。用1X SP(218mM蔗糖-11mM磷酸钾pH7.0±0.2)平衡此柱(1x15cm)直到导电率和pH分别达到2-3mS/cm和7.0±0.2。将病毒液加到柱中并收集流穿液。加载完成后用1倍柱体积(CV)的1XSP洗涤柱，收集洗涤液和流穿液组分。然后用2.5CV的每毫升含2mM MgCl2和50单位
Figure G2007800423659D00685
的1XSP以不同流速(每次实验用0.33、0.46、0.65、0.98和1.3mL/分钟，重复步骤1-3，加载的病毒材料相同)洗涤此柱。洗涤#2后再用2CV的1XSP洗涤此柱(洗涤#3)。用含1M NaCI的1XSP洗脱病毒。一旦A280nm值读到5mAU时就开始收集洗脱液，持续收集直到A280nm吸光值返回到5mAU。用5CV的0.1NNaOH清洁此柱，保持碱性直到再次使用。层析运作的数据保留在此记录的末尾处数据表中。制备每次层析运作数据表的多份拷贝。
表6.运作1-5中
Figure G2007800423659D00691
与病毒液的接触时间和流速
Figure G2007800423659D00692
用PicoGreen定量试验试剂盒按Invitrogen说明书定量测定了层析洗脱组分中的残留MDCK dsDNA。用Molecular Devices Gemini EM平板读数仪检测荧光，用SoftMax Pro第4.8版软件计算出dsDNA降解量。
表7小结了用袋装和层析柱型
Figure G2007800423659D00693
二种处理的几次改进运作纯化的病毒产量。
8.9实施例9：临床前动物模型
雪貂是用于评价减毒流感疫苗和疫苗组成病毒株减毒情况及免疫原性的优良动物模型。将MDCK细胞培养生产的流感病毒株性能与鸡蛋生产的同株病毒性能作比较。在对照研究中这些材料的头对头比较能高水平确保这些病毒产品的可比性。
为了评价这二种疫苗能否感染雪貂或被其摄入，轻度麻醉动物后鼻内接种细胞生产或鸡蛋生产的病毒制品。收集几个时间点的鼻洗液用几种现有方法之一评估病毒量，以评价病毒在动物上呼吸道中的复制动力学和程度。用一定范围的剂量包括多种病毒株和不同的三价混合病毒进行实验，以全面分析细胞培养生产的病毒株与鸡蛋生产的病毒株的相对感染力。也利用这些相同的研究来评价流感病毒株的免疫原性，即与天生相关连的性能和病毒引起感染的能力。接种后不同时间(周)点给动物采血并收集鼻洗液；用这些样品来评估对感染的血清抗体和鼻IgA应答。利用这些数据、感染力、血清抗体和粘膜抗体应答的最高值来比较和评价细胞培养生产疫苗与鸡蛋生产疫苗的相对感染力。预计最可能的结果是细胞和鸡蛋生产的疫苗病毒株具有相似的感染力和免疫原性。如果细胞生产的疫苗显示比鸡蛋生产的产品感染力更高或免疫原性更强，则进一步评价采用较低剂量的可能性。
用雪貂模型进行了多次免疫原性和复制研究以评价人用细胞生产疫苗一个剂量单位的效力。用ca/ts/att病毒株感染通常诱导雪貂产生强而快速的抗体应答。此外，常规检测各ca/ts/att病毒株显示表达减毒表型(att)的病毒株在这些动物的鼻咽部能复制产生相当高的滴度，但其肺部水平不可检测。也评估了细胞培养物的生长状况对这些生物学特性的影响。然而，不可能观察到任何差异，因为att表型是这些病毒株遗传组成的整合部分。评价了给予这些动物一剂人用疫苗后，这些病毒株的生长动力学和交叉反应性。鸡蛋生产减毒活疫苗诱导的血清抗体能与遗传谱系中的多个病毒株发生交叉反应；期望细胞产生的疫苗具有同样的能力。
这些可比性评价应能提供原代病毒产品的潜在生物化学和/或生物物理学的差异，显示这些后生性差异在人细胞或动物研究中对ca/ts/att病毒株性能的影响，这是用第一次传代病毒检测得到的。根据迄今得到的序列信息，预计MDCK细胞生产的疫苗对ca/ts/att病毒株的免疫原性没有影响。
雪貂是已得到良好证明的流感动物模型，常规用于评价ca/ts/att病毒株的减毒表型和免疫原性。通常采用8-10周龄的动物来评估减毒；对于典型的研究设计，需评价试验组或对照组每组n＝3-5只动物。免疫原性研究用8周龄至6月龄动物评价，通常试验或对照组每组需要n＝3-5只动物。这些数目可提供充分的信息以获得有统计学价值的或可观察到的重要组间比较值。在大多数研究中，注意有无流感样征兆但这不可能。雪貂不会显示食欲下降或体重减轻、鼻或眼分泌物的征象；观察到流感样疾病的征兆是此项研究的必须部分，不认为给予干涉如镇痛药是正当的。与主治兽医讨论后，其他不适症状如开放溃疡或体重显著丧失将导致动物产生适当的性情。
8.10.实施例10：配制用于细胞培养的的无血清培养液
此实施例描述了适合本发明细胞培养的几种无血清培养液的配制。虽然肯定上文对这种培养液已作了描述，但为了完全和便于使用，下文将对各个培养液进行全面描述。
Taub无血清培养液的配方：
Taub无血清培养液(Taub和Livingston，1981，Ann NY Acad Sci.，372：406)制剂是一种无血清培养液制品，由含4.5g/L的葡萄糖和4mM谷氨酰胺的DMEM/HAM F12(1∶1)组成，作为基础培养液制品，其中可加入表8所示的激素/生长因子。
表8.加入无血清培养液制品中的激素和生长因子
  组分名称   最终浓度
  胰岛素   5μg/mL
  转铁蛋白   5μg/mL
  碘甲腺氨酸钠(T3)   5x10-12M
  氢化可的松   5x10-8M
  前列腺素E1   25ng/mL
  亚硒酸钠   10-8M
传代时新鲜配制Taub’s SFM，或在SP DMEM/Ham F12培养液+4mM谷氨酰胺+4.5g/L葡萄糖苷+10-8M亚硒酸钠液中加入激素贮存液增强营养。在基础DMEM/Ham F12+4mM谷氨酰胺+4.5g/L葡萄糖苷+10-8M亚硒酸钠液中，加入100μL胰岛素贮存液(5mg/mL)、100μL转铁蛋白贮存液(5mg/mL)、100μL碘甲腺氨酸钠(T3)贮存液(5x10-9M)、5μL氢化可的松贮存液(10-3M)和500μL前列腺素E1贮存液(50μg/mL)制备100ml Taub’s培养液。
胰岛素贮存液-将适量胰岛素溶于0.01N HCl中制备5mg/mL贮存液。通过0.2微米除菌级滤膜过滤此液，分成等份装入Nalgene冻存管4-20℃保存。
转铁蛋白贮存液-将适量转铁蛋白溶于MiliQ水中制备5mg/mL贮存液。通过除菌级滤膜过滤此液，分成等份装入Nalgene冻存管＜-20℃保存。
碘甲腺氨酸钠(T 3 )贮存液-将适量T3溶于0.02N NaOH获得10-4M溶液制备此贮存液。用0.02N NaOH进一步稀释此贮存液至浓度5x10-9M的贮存液，通过除菌级滤膜过滤，分成等份装入Nalgene冻存管＜-20℃保存。
氢化可的松贮存液-将适量氢化可的松溶于100％乙醇制备10-3M贮存液，分成等份装入Nalgene冻存管。小管可4℃保存3-4个月。
前列腺素E1贮存液-将适量PEG1溶于100％灭菌的乙醇制备50μg/mL贮存液，分成等份装入Nalgene冻存管＜-20℃保存。
Na 2 SeO 3 贮存液-将适量亚硒酸钠溶于WF1水或MiliQ水制备10-2 M贮存液。用水进一步稀释至终浓度10-5 M，通过除菌级滤膜过滤4℃保存。
柠檬酸铁铵(FAC)贮存液-将适量柠檬酸铁铵溶于WFI水或MiliQ水通过除菌级滤膜过滤制备200mg/mL贮存液4℃保存。
环庚三烯酚酮贮存液-将适量环庚三烯酚酮溶于WFI水或MiliQ水通过除菌级滤膜过滤制备250mg/mL贮存液4℃保存。
MediV无血清培养液(MediV 101，102，103，104和105)的配制：每种MediV无血清培养液都采用Taub’s培养液作为基础培养液并加入以下添加剂：
MediV101：Taub’s+2.5g/L Organo Technie公司的麦芽胨E1(分类号19559)。麦芽胨E1用水配成灭菌的250g/L贮存液。
MediV102：Taub’s+100X化学成分明确的GIBCO BRL公司的浓缩脂(catno.11905)，加至终浓度1X。
MediV103：Taub’s+GIBCO BRL公司的终浓度1X浓缩脂+2.5g/L OrganoTechnie公司的麦芽胨E1。
MediV104：Taub’s+GIBCO BRL公司的终浓度1X浓缩脂+2.5g/L OrganoTechnie公司的麦芽胨E1+5μg/L EGF(多种来源)。
MediV105：无转铁蛋白的Taub’s+GIBCO BRL公司的终浓度1X浓缩脂+2.5g/L Organo Technie公司的麦芽胨E1+5μg/L EGF+0.2mg/L柠檬酸铁铵+0.25mg/L环庚三烯酚酮。
M-32：含浓度4-4.5g/L葡萄糖的MediV105+微量元素溶液A、B、C(表9)终浓度1X。任选M-32添加额外的4-4.5g/L葡萄糖(M-32+G)。
MediV107：以MediV105为基础的另一种无血清培养液，包含某些微量元素。表10显示了MediV107的最终配方。
M18M培养液的配制：此外，M18M是另一种无血清培养液，可用于本发明细胞的培养。M18M是以DMNSO-7粉末为基础含以下表11所示添加剂的无血清培养液。
表9.1000X微量元素溶液A、B和C
Figure G2007800423659D00741
表10.MediV 107配方
Figure G2007800423659D00742
Figure G2007800423659D00751
Figure G2007800423659D00761
表11.M18M的配方
Figure G2007800423659D00762
Figure G2007800423659D00771
8.11实施例11：培养流感病毒至高滴度
本实施例描述的实验结果，显示能将温度敏感的冷适应性减毒流感病毒培养至高滴度。具体说，这些实验产生的4种流感病毒可达到9xlog10TCID50/ml的病毒滴度。
用MediV 105或M1 8M在接种后培养MDCK亚克隆1-A或1-B细胞3天，然后在感染前立即去除生长培养液，加入新鲜培养液，如MediV 105、M18M或DMEM/F12培养液，添加4.5g/L葡萄糖、4mM谷氨酰胺和TrypLE(1∶100)(Invitrogen)。然后用重配的温度敏感冷适应性减毒流感病毒(包含FluMistTM骨架(如除编码HA和NA蛋白外的所有基因区段)和A/New Caledomia、
Figure G2007800423659D00772
病毒株的HA与NA蛋白)感染细胞。
表12提供了一次实验的结果。表12显示这些方法在感染后2、3、4和5天产生的病毒滴度至少为8.2xlog10TCID50/ml，和高至9.1xlog10TCID50/ml。这些数据表明，感染前或感染期间改变培养液或添加短缺的营养物将导致病毒产量提高。
表12.培养至滴度＞log10 TCID50/ml 8.0
Figure G2007800423659D00773
8.12实施例12：单次使用生物反应器方法
通常采用标准的生物反应器或发酵罐来生产疫苗材料时，每次使用前需要清洁、灭菌和验证。为了减少所需的清洁和验证步骤，已利用一次性生物反应器技术开发了一次性细胞培养方法。此法得以缩短了生产疫苗材料所需的加工时间，显著节约了费用和减少了基础设施要求。此法采用一次性使用的生物反应器(SUB)。许多SUB系统可从市场购得而在加工中使用。简而言之，SUB方法包括用生长培养液在微载体上培养MDCK细胞约4天，用感染培养液更换代替生长培养液后，用流感病毒感染细胞。或者，可不更换培养液直接用流感病毒感染细胞。接种SUB的细胞可以是粘附细胞，可获自转瓶或其它易于扩大规模培养粘附细胞的方法。
前驱研究证明虽然摇速50-100rpm支持细胞生长，但90-100rpm可导致细胞生长提高。此项研究没测试过更高摇速。前驱研究还证明约2-3g/L浓度的载体和接种密度～9.0x104个细胞/mL(相当于～10-15个细胞/MC)可导致细胞生长和病毒产量提高。此外，采用添加葡萄糖的培养液也导致细胞生长和病毒产量提高。根据这些和其它前驱研究，开发了感染前更换或不更换培养液的SUB方法。
8.12.1.材料
此组研究采用Hyclone公司的SUB(Hyclone，Part Nos.SH30715.01、SH30720.01和SH3B 1744.01)。SUB由三种主要部件组成：1.外部支持容器，带搅拌器由控制单元驱动和电加热夹套；2.单次使用的生物反应器BioProcess容器(BPC)，带搅拌器、喷雾器、通风过滤器入口和出口孔+集成的传感器孔；和3.搅拌器的箭杆通过搅拌驱动电动机插入到生物反应器BPC中停靠在一次性搅拌装置内。可按许多客户选择制作SUB装置的一种或多种元件，例如，可扩大出口孔以利于收获和更换培养液，类似地，线内微载体也利于收获和更换培养液。
采用MedIV 105(见8.10章节)或MedIV 105+4.5g/葡萄糖(终浓度9.0g/L称为“MedIV 105+G”)作为生长培养液。当采用MedIV 105培养时，接种后2-3天要添加20mM葡萄糖以防葡萄糖耗竭。MedIV 105+G采用较高的初始葡萄糖浓度可消除添加葡萄糖的需要。
感染培养液包含DMEM/F12、葡萄糖和TrypLE选择。表13显示此感染培养液中的各成分及其浓度。
表13.感染培养液
  成分   最终浓度   每升加入的DMEM/F12量
  DMEM/F12   1L/L   1000mL
  葡萄糖   4.5g/L   10mL
  L-谷氨酰胺   4mM   20mL
  TrypLE选择   1∶33至1∶100   20mL
8.12.2.培养液更换方法
在缓冲液中膨胀微载体然后用缓冲液洗涤和除菌制备微载体贮存液。用前除去缓冲液加入适当的培养液。例如，室温在5升玻璃瓶中用3.0升无Ca2+和Mg2+的PBS pH 7.4浸泡60g Cytodex3微载体(50mL/g Cytodex3)至少3小时。吸弃上清液以1.5升无Ca2+和Mg2+的PBS pH 7.4替代。将该瓶置121℃高压灭菌30分钟。临接种前，吸弃PBS加入4升DMEM/F12培养液，并在无菌条件下加入灭菌的微载体。或者，可用γ-射线原位灭菌Cytodex3微载体。
取出1个冻存小管的克隆1-B细胞用于接种SUB。如下用MedIV 105或MedIV 105+G规模化培养细胞：第1天，融化小管细胞接种T-75瓶；第3天，将细胞分种T-225瓶(接种密度约5x104个细胞/mL)；第7天分种转瓶(接种密度约6.7x104个细胞/mL)；第10天接种添加的转瓶(接种密度约6.7x104个细胞/mL)；第14天用胰蛋白酶消化约30-36个转瓶的细胞用于接种SUB生物反应器。
表14显示接种参数。用蠕动泵通过BPC的接种物添加管道，将从转瓶收集经胰蛋白酶消化的合并细胞转移到装有30升SFMV105培养液含Cytodex3微载体的SUB中。接种后3天培养物中添加20mM葡萄糖以防葡萄糖耗竭。
在表15详述的培养参数条件下培养细胞4天。用Applikon控制仪控制pH，先喷射CO2然后加碱(NaOH，1M)维持培养物pH。用Applikon控制仪喷射氧气控制溶氧(DO)≥50％。细胞培养期间可接受的DO高100％低35％。用Hyclone控制仪控制温度在适当值。用Hyclone控制仪控制搅拌速度为100rpm。
表14.接种参数
  工作体积   30±1L
  微载体(MC)浓度   2to 3±0.2g/L
  微载体用量   60to 90±1g
  细胞/MC(计算值)   15±5
  接种密度(细胞/mL)   9.0±1.5×104个
表15.培养参数
  搅拌速度   100±10rpm
  温度   37(±0.5)℃
  pH   7.4(±0.1)
  溶氧(DO)[空气饱和]   ≥35％[控制在50％]
  O2流速[最大](升/min)   1.0±0.2
  CO2流速[最大](升/min)   0.20±0.04
接种后4±0.5天进行感染。感染前进行核计数。此时细胞应达到0.5-2.0×106个细胞/mL，通常期望细胞密度至少达到约1×106个细胞/mL。如需要作核计数后，所有控制环失效让微载体沉降约45分钟。然后通过SUB的培养液交换孔泵送生长培养液更换培养液，通过培养液添加孔加入感染培养液至最终体积30升。取出约20-24升后加入相同量的新鲜感染液。此相当于更换培养液约66-80％。表16给出了感染参数。
表16.感染参数
  工作体积   30L
  搅拌速度   100±10rpm
  温度   33(±0.5)℃
  pH   7.4(±0.1)
溶氧(DO)[空气饱和]   ≥35％[控制在50％]
  O2流速[最大](L/min)   1.0±0.2
  CO2流速[最大](L/min)   0.20±0.04
感染的MOI(感染复数)约为0.001-0.003FFU/细胞(参见以下公式)：
加入SUB中的病毒量＝SUBxMOI(FFU/细胞)中的细胞总数/10病毒FFA滴度(FFU/mL)×1000
或者，为最大程度减少此工艺的步骤，可加入2x103FFU/mL的病毒。这相当于MOI约～0.001-0.003FFU/细胞。在这些条件下，将所述量病毒以微升计加入SUB。
＝反应罐容积(M1)x2x103FFU/mL/10病毒FFA滴度(FFU/mL)×1000
可利用工艺内取样方法监测几个步骤
接种后0-4天每日收集2x10ml感染前细胞悬液作核计数、拍片和pH及代谢物(葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸、NH4+)分析。感染后抽取2x5ml感染后样品用磷酸蔗糖(磷酸蔗糖与收获的病毒比例＝1∶9)稳定。立即冰冻这些样品-80℃保存可用于测定病毒滴度。
感染后3天(+/-12h)收获获得病毒。关闭SUB和Aplikon上的控制器，让微载体沉降至少45分钟。然后将上清液转移到灭菌的一次性袋中加入1∶9(磷酸蔗糖与收获的病毒比例＝1∶9V/V)比例的磷酸蔗糖使之稳定。磷酸蔗糖应按体积加不能按重量加。
8.12.3.更换培养液的结果
此地小结了测试不同培养液多次运作SUB进行生产的结果，接种和感染参数如章节8.12.2所述。如表18所示，所有测试的变量均导致病毒滴度峰值至少8.0log10FFU/mL，证明更换培养液的SUB方法有强效。
在一次B/Malaysia病毒生产(SUB运作A)中，微载体(MC)浓度为3g/L，工作容积30升，细胞接种密度10个细胞/MC或～9.0x104个细胞/mL。接种后3天培养物中添加20MM葡萄糖以防葡萄糖耗竭。采用MDCK亚克隆1-B细胞，接种后4天细胞密度达到～1.3X106个细胞/mL。整个培养期间维持表15所示的其余培养参数。表17显示此次B/Malaysia病毒株生产运作的细胞生长数据和倍增时间。图13为此次B/Malaysia病毒株生产运作的细胞生长曲线图，以及葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺代谢物分析和用Bioprofile测定的铵离子浓度。
表17细胞生长
  时间(h)   细胞总密度x106个细胞/mL   倍增时间(h)
  0.15   0.09
  21.67   0.10   141.55
  46.00   0.30   15.35
  65.33   0.60   19.57
  70.00   0.69   21.84
  88.83   1.30   20.61
指数生长期倍增时间约20小时。接种后4天约67％的培养液更换为含浓度1；100TrypLE的感染液(见上文)。然后用B/Malaysia病毒株/2506/04，以为0.001FFU/细胞的MOI感染细胞。整个感染期间维持表16所示的感染参数。感染后2和3天取样用荧光聚焦试验(FFA)分析感染情况(dpi)测定病毒感染力。～2dpi时见到的病毒滴度峰值约8.0log10FFU/mL。虽然此次和其它几次运作用终浓度1∶100的TrypLE获得了病毒滴度峰值至少为8.0log10FFU/mL.，但偶尔也见到较低滴度(资料未显示)，因此通常采用较高浓度的TrypLE(1∶33-1∶50)。
用2g/L浓度的微载体和MedIV 105+G作为生长培养液不添加葡萄糖进行了二次SUB运作。采用MDCK亚克隆1-B细胞，接种密度～9.0x104个细胞/mL(相当于～15个细胞/MC)。感染前，更换约80％的培养液，选择加入终浓度1∶100(SUB运作B)或1∶50(SUB运作C)的TrypLE。用2x103FFU/mL浓度病毒感染细胞。这些运作的病毒滴度峰值为8.4log10FFU/mL A/Wisconsin(SUB运作B)和8.7log10FFU/mL A/New Caledomia(SUB运作C)。
用2g/L浓度的微载体和MedIV 105+G作为生长培养液不添加葡萄糖又进行了6次病毒生产运作(SUB运作D-I)。如上文那样采用MDCK亚克隆1-B细胞，接种密度～9.0x104个细胞/mL(相当于～15个细胞/MC)。其余培养参数维持表15所详述的那样。接种后4±0.5天去除约66％的生长培养液(MedIV105+G)，加入相同量的含终浓度1∶33TrypLE的感染液(见表13)。然后用2x103FFU/mL浓度的A/New Caledomia/20/99、A/Wisconsin/67/05或B/Malaysia/2506/04病毒株感染细胞，整个感染期间维持表16所示的感染参数。表18显示SUB运作的病毒滴度峰值范围为8.55-8.75log10FFU/mL。将葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、NH4+概况图与SUB运作A所见作比较(见图13，数据未显示)。
表18.SUB运作的病毒滴度峰值
  SUB运作   病毒滴度峰值(log10FU/mL)   病毒   SUB运作   病毒滴度峰值(log10FFU/mL)   病毒
  A   8.0   B/Malaysia   F   8.7   A/New Caledomia
  B   8.4   A/Wisconsin   G   8.8   A/New Caledomia
  C   8.7   A/New Caledomia   H   8.6   A/Wisconsin
  D   8.6   B/Malaysia   I   8.6   A/Wisconsin
  E   8.7   B/Malaysia
8.12.4.不更换培养液的结果
去除更换培养液(步骤)将减少成本提高工艺的效率。最初测试用1∶100(～0.01x)TrypLE稀释液，提示条件化的生长培养液可能含有一种或多种能抑制TrypLE作用的成分，因而抑制了病毒生长(资料未显示)。进行前驱实验采用不同浓度的TrypLE。简而言之，用2升生物反应器在标准条件下培养DMCK细胞4天(母代培养物)，用此母代培养物接种培养液更换水平不同和TrypLE浓度不相同的摇瓶，然后感染A/New Caledomia病毒株。采用了4种不同稀释度/浓度的TrypLE：1∶100(～0.01x)；1∶50(～0.02x)；1∶33(～0.03x)和1∶25(～0.04x)。在2和3dpi时瓶中取样作病毒滴度测定。图14A是培养液更换比例各为2和3dpi时获得的病毒滴度。这些数据显示，即使不更换任何培养液而添加1∶25-1∶33的TrypLE，产生的滴度接近8log10FFU/mL。根据这些数据，不更换培养液用1∶16的TrypLE稀释液应产生高滴度病毒。故用较高浓度的TrypLE进行了类似实验。简言之，如上文所述制备母代培养物用于接种不更换培养液的摇瓶(其中有稀释度为1∶1-1∶25的TrypLE，相当于0.5x-0.04xTrypLE浓度)，然后感染A/New Caledomia病毒株。图14B是2和3dpi时测得的病毒滴度峰值。这是第一次不更换培养液而获得了大于8log10FFU/mL的病毒滴度。这些数据表明，TrypLE的最适浓度为1∶25-1∶12.5稀释度，而更高浓度的TrypLE不能提高病毒产量。根据这些结果，检验了(分别采用1∶33和1∶12.5的TrypLE稀释液)更换或不更换培养液时其它二种病毒株B/Malaysia/2506/04和A/Vietnam/1203/2004的产量。图14C显示病毒滴度随时间的变化。B/Malaysia/2506/04的病毒滴度峰值(分别更换或不更换培养液)为8.9和8.7log10FFU/mL.类似地，A/Vietnam/1203/2004的病毒滴度峰值(分别更换或不更换培养液)为8.6和8.0log10FFU/mL。因此，将TrypLE的用量提高到1∶12.5稀释度(相当于0.08x)可补偿条件化培养液的作用，不用更换培养液使病毒滴度峰值达到至少8log10FFU/mL。
8.13实施例13：最优的MOI
由于不断出现不同的流感病毒株，根据每个季节传播的流感病毒株需要生产出新的流感疫苗。不幸的是，某些流感疫苗的病毒株(如温度冷适应的重配疫苗病毒株)更难培养至高滴度。生物反应器的滴度高低不仅决定了产量而且影响产品制造成本，因此需要提高病毒滴度(即病毒滴度峰值)。如上文所述，检测了优化疫苗病毒产量的许多参数。此地小结提高几种病毒株产量(即病毒滴度)的研究结果。这些研究确定了MOI(感染每个MDCK细胞所用的病毒颗粒)，MOI作为参数易于检测和调节而优化产量和快速扩大规模生产季节和流行性疫苗病毒株。
进行这些研究，在生物反应器中培养MDCK亚克隆1-B细胞，在摇瓶中用不同量的病毒感染细胞。此项研究的细节如下：在3升生物反应器中用MDCK亚克隆1-B细胞以约15个细胞/mg载体接种含有每升2克Cytodex3微载体珠的M-32+G培养液。37℃，90rpm，pH 7.4和50％DO(喷射O2和CO2控制溶氧)培养细胞。接种后约4天(dps)，66％的生长培养液用感染培养液((DMEM/F12+4.5g/L D-葡萄糖+4mM L-谷氨酰胺+1∶33终浓度的1XTrypLE)替代。将等量培养物(30ml)转移到不同的125ml摇瓶中。用特定的不同量病毒(即2、20、200、2000和20000FFU/ml，分别相当于1x10-6、1x10-5、1x10-4、1x10-3和1x10-2FFU/细胞)感染这些摇瓶中的细胞。感染后33℃100rpm培养摇瓶细胞。一些用于监测的参数包括；感染后不同时间(即感染后1、2、3和4天(dpi))的活细胞密度、代谢物浓度(感染前后)及病毒滴度。这些研究所测4种病毒株的滴度峰值见表19。当MOI从～1x10-3FFU/细胞(上文章节8.12所示SUB工艺所用的MOI)降低到1.3log10FFU/ml时观察到各病毒株的滴度峰值提高。应注意某些情况下获得的病毒滴度峰值是在感染后的不同时间(即2dpi或3dpi)。这可能是由于较低MOI(1x10-4 FFU/细胞)时病毒增殖的动力学不同于MOI为1x10-3FFU/细胞，应注意这种倾向可能见于用生物反应器生产时，病毒收获时间应据此调整。
进行生物反应器研究证实了摇瓶的结果。为了这项研究，在3升生物反应器中如上文所示制备了5种平行的主细胞培养物。比较了所有生物反应器中的活细胞密度、谷氨酰胺、NH4+、葡萄糖和乳酸的细胞代谢概况(资料未显示)。接种后大约4天，66％的生长培养液用感染培养液((DMEM/F12+4.5g/L D-葡萄糖+4mM L-谷氨酰胺+1∶330终浓度的10X TrypLE)替代。用不同量((即2、20、200、2000或20000FFU/ml，分别相当于MOI约1x10-6、1x10-5、1x10-4、1x10-3和1x10-2FFU/细胞)的A/Solomon Islands/3/06感染5种培养物，33℃培养。感染后的所有其它培养参数与感染前培养母代细胞的相同。图15显示采用不同MOI获得的病毒滴度随时间(感染后小时)变化的情况。加框区域(扩大到右侧)显示感染后3天时用2000FFU/mL感染的培养细胞产生了8.3log10FFU/mL的病毒滴度峰值，而用20FFU/mL感染的培养细胞病毒滴度峰值为8.5log10FFU/mL(提高了0.2log10FFU/M1)。类似地，感染后4天，2FFU/mL感染的细胞也达到了8.5log10FFU/mL的峰值滴度。综合这些研究表明，降低MOI可导致提高病毒滴度，因此此法证明可用于提高某些疫苗病毒株的产量。这些研究还表明，必须根据所用的MOI来确定最适的收获时间。
表19.摇瓶培养的最优M0I
Figure G2007800423659D00851
8.14实施例14：微载体珠的转移
大规模培养细胞需要扩大培养的细胞数。当采用贴壁细胞时放大规模通常包括使培养瓶或微载体的细胞依次解脱(例如用蛋白酶处理)，将解脱细胞的稀释液转移到较大培养瓶中或较大数量的微载体中。最大程度减少规模化生产中的洗涤和/或更换培养液步骤可提高效率和降低可能的污染。上述SUB方法要求采用分别从30-36个转瓶收获的细胞，各瓶必须分别用胰蛋白酶处理和收集细胞。以下描述的一种方法可用于减少此种处理步骤将规模从3升扩大至20升容器。实施此策略可采用更大的生物反应器如上述30升SUB。
用3升生物反应器制备：1.在3升生物反应器中加入4g Cytodex3。加入500ml DPBS(PBS w/o Ca，Mg)水合微载体4-6小时。2.用滴管吸去300ml DPBS不要扰乱瓶底的微载体。加入300ml新鲜的DPBS，121℃高压灭菌30分钟。3.反应罐冷却后吸去300ml DPBS，加入300ml培养液(M-32)。200rpm搅拌罐内容物10分钟完全混合罐内容物使罐底所有微载体流动。4.停止搅拌待所有微载体沉降后吸去300ml培养液。5.反应罐中加入1.6升新鲜基础培养液以稳定的参数运作过夜。工作参数是：pH7.2，温度37℃，搅拌速度200rpm，喷气速度50ml/分。
用20升生物反应器制备：1.在5升罐中加入28g Cytodex3。加入3升DPBS(PBS w/o Ca，Mg)水合微载体4-6小时。抽去2升DPBS不要扰乱瓶底的微载体。加入2升新鲜的DPBS，121℃高压灭菌30分钟。2.抽去2升DPBS加入2升培养液到罐中。强烈摇荡罐确保微体悬浮。让微载体沉降然后抽去2升培养液。3.加入新鲜培养液和微载体溶液确保生物反应罐总容积为14升，以稳定的工作参数运作过夜。工作参数是：pH7.2，温度37℃，搅拌速度120rpm，喷气速度400ml/分。
3升生物反应器生长期的操作：1.取样后校正pH和溶氧读数通过NOVABioprofile进行分析。2.加入收获的培养细胞组分以目标制定的9E4细胞/mL(每个微载体珠15个细胞)的细胞密度接种生物反应器。加入培养液到工作总容积2升。3.以设置的50％饱和度开始溶氧控制。4.每日取样用NOVA分析，核计数和显微镜摄象。
规模化珠到珠转移方案：1.在3升罐中培养细胞96小时后，关闭搅拌器、气流、溶氧和温度控制器，让微载体沉降。2.通过滴管吸去(＞80％)的培养液但确保不扰乱罐底的微载体。3.加入DPBS(PBS w/o Ca，Mg)到最初的工作容积。4.提高设置的搅拌速度到180rpm。开动搅拌器10分钟洗涤其余培养液中的微载体。5.关闭搅拌器让微载体沉降到罐底。6.通过滴管取出生物反应器中约50％的液体。保证取液体后温度探头和搅拌器仍完全浸没(剩下的液体体积约1升)。7.开动搅拌器和温度控制器。等待直到反应罐中的温度达到37℃。8.生物反应器中加入5xTrypLE(剩下体积的5-7％)。9.加入1M碳酸钠调节反应罐的pH到7.9+/-0.1。10.间隔50+/-10分钟采样一次，胰蛋白酶处理后在显微镜下观察确保细胞解脱。11.加入与TrypLE体积精确相同的5x利马豆胰蛋白酶抑制剂(LBTI)。12.加入新的培养液至最初的工作体积(2升)。13.将反应罐的所有内容物转移到20升生物反应器(1∶8分装)中。
感染参数：在本文的珠转移条件下，与从滚瓶转移相比，珠转移后细胞生长显示略为减慢，导致感染步骤(第5天感染)比转瓶(第4天感染)延后1天.。当细胞密度基本上如SUB方法所述(见上文章节8.12)的1x106细胞/mL时进行感染。虽然感染延后1天，但珠转移法的病毒滴度峰值相当于类似用以上8.12所述转移条件获得的峰值(见表20)。因此，采用珠转移法可减少操作不会牺牲病毒产量。
表20病毒滴度峰值
  病毒株   珠转移法   转瓶转移法
  B/Malaysia/2506/04   8.8   8.5
  A/Wisconsin/67/05   8.5   8.5
  A/Solomon Islands/3/06   8.1   8.2
虽然已通过参见具体实施方式描述了本发明，但显然本领域其他技术人员可在不背离本发明的真正思路和范围条件下设计出其它实施方式和作出各种变化，而构成本发明附件的权利要求书包括所有这些实施方式和相等的变化。例如，在不同实施方式中可采用上述的所有技术和装置。为了相同的所有目的，将本申请书引用的所有公开专利、专利申请或其他文件他们的内容纳入本文作参考，犹如将各公开专利、专利申请或其他文件为了所有目的单独纳入本文作参考那样。此外，为了所有目的将以下的美国临时专利申请：2006年9月15日提交的60/845,121，2006年12月22日提交的60/871,721，2007年5月9日提交的60/917,008和2007年7月25日提交的60/951,813内容纳入本文作参考。本文参考文献的引用或讨论不构成任何承认他们是本发明之前的技术，引用专利也不构成承认他们合法。

Claims (31)

1.一种含Madin-Darby狗肾细胞的细胞培养组合物，所述Madin-Darby狗肾细胞被鉴定为ATCC登录号PTA-7910。
2.如权利要求1所述细胞培养组合物，所述组合物包含无血清的细胞培养基。
3.如权利要求1所述细胞培养组合物，其特征在于，所述组合物包含选自下组的细胞培养基：MediV-105，补加葡萄糖的MediV-105，M-32，补加葡萄糖的M-32，MediV-107，补加葡萄糖的MediV-107。
4.如权利要求3所述细胞培养组合物，其特征在于，所述细胞培养基是MediV-105或补加葡萄糖的MediV-105。
5.如权利要求1所述细胞培养组合物，所述组合物包含流感病毒。
6.如权利要求5所述细胞培养组合物，其特征在于，所述流感病毒是减毒的。
7.如权利要求5所述细胞培养组合物，其特征在于，所述流感病毒是温敏的。
8.如权利要求5所述细胞培养组合物，其特征在于，所述流感病毒是冷适应的。
9.如权利要求5所述细胞培养组合物，其特征在于，所述流感病毒包含流感毒株A/Ann Arbor/6/60或B/Ann Arbor/1/66的一个或多个基因区段。
10.如权利要求5所述细胞培养组合物，所述流感病毒在Madin-Darby狗肾细胞内复制达到每毫升以10为底的半数组织培养感染剂量的对数为至少7.8或者达到每毫升以10为底的荧光焦点单位的对数为至少7.8。
11.如权利要求1所述细胞培养组合物，还含有蛋白酶。
12.如权利要求11所述细胞培养组合物，所述蛋白酶是胰蛋白酶。
13.一种在单次使用生物反应器中复制病毒的方法，所述方法包括：
a.在单次使用生物反应器系统内，在微载体存在下，培养Madin-Darby狗肾细胞，所述Madin-Darby狗肾细胞被鉴定为ATCC登录号PTA-7910，培养条件中的搅拌速率介于80至120rpm，由此产生培养的细胞；
b.用流感病毒感染培养的细胞，由此产生感染的细胞；
c.在允许流感病毒复制的条件下培育感染的细胞。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述培养条件是无血清的。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所培养条件包括选自下组的细胞培养基：MediV-105，补加葡萄糖的MediV-105，M-32，补加葡萄糖的M-32，MediV-107，补加葡萄糖的MediV-107。
16.如权利要求15所述方法，其特征在于，所述细胞培养基是MediV-105或补加葡萄糖的MediV-105。
17.如权利要求13所述的方法，搅拌速率为90至100rpm。
18.如权利要求13所述的方法，所述流感病毒是冷适应的。
19.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述流感病毒是减毒的。
20.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述流感病毒是温敏的。
21.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述流感病毒包含流感毒株A/AnnArbor/6/60或B/AnnArbor/1/66的一个或多个基因区段。
22.如权利要求13所述的方法，步骤a的培养条件是分批培养条件。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，在步骤a中在细胞培养物中加入新鲜培养基或补充的培养基组分。
24.如权利要求23所述的方法，所述新鲜培养基或补充的培养基组分包含蛋白酶。
25.如权利要求24所述的方法，所述蛋白酶是胰蛋白酶。
26.如权利要求22所述的方法，其特征在于，在步骤b之前或期间不除去细胞培养基或除去一些细胞培养基并替换成新鲜培养基。
27.如权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤b中，感染复数介于0.00001至0.003荧光焦点单位/细胞。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，步骤b中，感染复数介于0.001至0.003荧光焦点单位/细胞。
29.如权利要求13所述的方法，在步骤b之前、同时或之后向所述单次使用生物反应器中加入蛋白酶。
30.如权利要求29所述的方法，所述蛋白酶是胰蛋白酶。
31.如权利要求13所述的方法，所述流感病毒复制达到每毫升以10为底的半数组织培养感染剂量的对数至少为7.8或者达到每毫升以10为底的荧光焦点单位的对数至少为7.8。
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