CN115315518A - 重组aav的生产 - Google Patents
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Abstract
本申请公开产生缺乏原核序列的高滴度重组腺相关病毒(rAAV)的群体的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请请求依据35 U.S.C.§119(e)于2020年1月17日提交的美国临时申请第62/962,911号的权益,其整体内容通过引用并入本文中。
技术领域
本公开有关缺乏原核序列的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associatedvirus,rAAV)病毒粒子(virion)的生产。
背景技术
尽管经过多年的研究,目前生产rAAV的方法仍然很昂贵。目前常见为约105个基因组拷贝数(GC)/细胞的生产速率,结果为1014GC/L(mKotin RM.Large-scale recombinantadeno-associated virus production.Hum Mol Genet.2011;20(R1):R2–R6.doi:10.1093/hmg/ddr141)。虽然这已经证明足以支持早期临床试验,且可为小患者群体适应症提供上市产品,但此平台的可扩展性缺陷为一个重大限制(Clement N,GriegerJC.Manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors for clinicaltrials.Mol Ther Methods Clin Dev.2016;3:16002.doi:10.1038/mtm.2016.2;WrightJF.manufacturing and characterizing AAV-based vectors for use in clinicalstudies.Gene Ther.2008;15(11):840–848.doi:10.1038/gt.2008.65)。可推测的是,成功地将三个质粒递送至一个细胞为一个相对低效率的过程。对于更大规模的制造工作,质粒的瞬时递送需要过量的DNA,增加生产和纯化的总成本。此外,于辅助基因存在下瞬时传递rep/cap基因亦可能导致产品异质性,包括缺乏转基因的AAV载体。这些“空衣壳(emptycapsids)”代表瞬时转染试验中所产生的很大一部分病毒。因此,开发可靠的分析质量控制(QC)方法以确保生产批次之间的相似性至关重要。
发明内容
本发明的实施方案涉及缺乏原核序列的重组腺相关病毒(rAAV)载体的封闭线性大规模生产。
在一个方面,本文提供一种生产重组腺相关病毒(rAAV)的方法。一般而言,所述方法包括于培养基中以a)编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列;b)编码AAV rep和AAV cap基因的核酸序列,和c)包含至少一个反向末端重复(inverted terminal repeat,ITR)序列和可操作地连接到一个或多个调节元件的异源转基因的封闭末端线性双链体rAAV载体核酸转染宿主细胞系;例如,培育经转染的宿主细胞系足够长的时间以产生rAAV;任选地,裂解转染的宿主细胞;以及,从培养基中分离/纯化rAAV。所述方法适用于生产高滴度的rAAV。因此,通过所述方法产生的rAAV滴度可以高于使用以相应量的包含相同异源转基因的质粒DNA(plasmid DNA,pDNA)转染的宿主细胞系产生的rAAV滴度。在特定实施方案中,来自a)、b)和c)的核酸总量小于约2μg每1×106个宿主细胞。在特定实施方案中,使用包含a)、b)和c)以及聚阳离子聚合物的转染组合物转染宿主细胞,其中所述聚阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例为约1:1至约3:1(重量/重量)。在一些实施方案中,裂解所述经转染的宿主细胞。在一些其他实施方案中,不裂解所述经转染的细胞。
在特定实施方案中,通过本发明的方法产生的所述rAAV的滴度高于使用以相应量的包含异源转基因的质粒DNA转染的宿主细胞系所产生的rAAV的滴度。举例而言,相较于以相应量的质粒DNA获得的rAAV的滴度,通过本发明的方法产生的rAAV滴度为至少1.25倍,例如,1.5倍、1.75倍、2倍、2.25倍、2.5倍、2.75倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍或或更高。
在特定实施方案中,产生重组腺相关病毒(rAAV)的方法包括提供编码AAV核酸序列或封闭线性AAV核酸序列的载体;在悬浮液中培养人类胚胎细胞系;以所述编码AAV核酸序列的载体和转染组合物或以封闭线性AAV核酸序列和转染组合物转染人类细胞系;培育经转染的人类细胞系约40至400小时;任选地,裂解经转染的人类细胞系并纯化编码rAAV的核酸序列,从而产生rAAV。在实施方案的一些方面,裂解经转染的宿主细胞。在一些其他实施方案中,不裂解经转染的细胞。
在特定实施方案中,所述转染组合物包含:(i)编码腺病毒辅助蛋白的载体,(ii)包含AAV rep基因和AAV衣壳(cap)蛋白基因的载体,和(iii)包含AAV反向末端重复(ITR)序列的载体。在一些实施方案中,载体(i)至(iii)中的至少一种包含于封闭线性AAV核酸序列中。例如,载体(iii)包含在包括至少一个反向末端重复(ITR)序列和可操作地连接到一个或多个调节元件的异源转基因的封闭末端线性双链载体核酸中。
在特定实施方案中,所述编码腺病毒辅助蛋白的载体缺乏腺病毒结构和复制基因。在特定实施方案中,所述AAV rep和衣壳(cap)基因来自不同的血清型。在特定实施方案中,所述AAV rep和衣壳基因来自相同的血清型。AAV血清型的实例包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV13等。在特定实施方案中,所述AAVrep基因来自选自由AAV2、3、8、9和10所组成群组的血清型。在特定实施方案中,所述AAVcap基因来自选自由AAV2、3、8、9和10所组成群组的血清型。例如,所述AAV rep基因为AAV2rep基因,且所述AAV衣壳基因为AAV8衣壳基因。在特定实施方案中,所述AAV反向末端重复(ITR)序列为腺相关病毒2反向末端重复(ITR)序列。实际上可以使用任何其他组合的血清型。
在特定实施方案中,rAAV颗粒具有至少一个来自AAV血清型的AAV ITR,所述AAV血清型选自由AAV 1、2、3(例如,3a、3b)、4、5、6、7、8、9、10、11和13所组成群组。在特定实施方案中,AAV ITR来自选自由AAV2、3(例如,3a、3b)、8、9和10所组成群组的血清型。在特定实施方案中,AAV ITR和AAV cap基因来自不同的血清型。在特定实施方案中,AAV ITR和AAV cap基因来自相同的血清型。在一些实施方案中,AAV ITR是野生型、突变的或合成的。在特定实施方案中,所述突变的ITR包含一个或多个氨基酸的置换、添加和或缺失。在一些实施方案中,AAV ITR是来自美国专利7,790,154;美国专利8,361,457;美国专利8,784,799;美国专利9,447,433;美国专利9,169,494;或美国专利10,233,428的示例性ITR。
在特定实施方案中,人类胚胎细胞系是源自人类胚胎肾细胞系的悬浮适应无血清细胞系。
在特定实施方案中,人类胚胎细胞系的悬浮液在转染之前以逐渐增加的体积进行培养。在特定实施方案中,所述培养体积从约50ml体积逐渐增加到约100公升体积。在特定实施方案中,用于将人类胚胎细胞悬浮液从约50ml体积逐渐扩增至约10公升体积的培养基包含浓度为约1mM至约20mM的氨基酸。在特定实施方案中,具有约5公升体积的培养基包含约10mM浓度的氨基酸。在特定实施方案中,所述氨基酸是L-谷氨酰胺。在特定实施方案中,具有约50公升体积的培养基包含:至少约1mM至约20mM的L-谷氨酰胺,至少约0.01%至约1%的非离子表面活性剂多元醇或洗涤剂,以及至少,约0.001%至约1%的消泡剂。在特定实施方案中,所述非离子表面活性剂多元醇包含普流尼克酸(pluronic acid)。
所述宿主细胞的细胞密度可为从约3.0×106至约1×108个活细胞/ml的范围。例如,所述宿主细胞的细胞密度可为从约3.5×107到约8.5×107活细胞/ml的范围。在特定实施方案中,所述宿主细胞的细胞密度可为3×106至约6×106个活细胞/ml的范围内。例如,所述宿主细胞的细胞密度可为约4.0×106至约6×106个活细胞/ml。在特定实施方案中,所述宿主细胞的细胞密度可为约2.5×107个活细胞/ml。在一些其他实施方案中,细胞培养物中宿主细胞的细胞密度可为约3×107个活细胞/ml。
在特定实施方案中,所述培养的人类胚胎细胞系包含约3.0×106至约1×108个活细胞/ml的细胞密度。在一个实施方案中,所述培养的人类胚胎细胞系包含2.5×107个活细胞/ml。在另一个实施方案中,所述培养的人类胚胎细胞系包含3×107个活细胞/ml。在一些实施方案中,所述培养的人类胚胎细胞系包含约3.5×107至约8.5×107个活细胞/ml的细胞密度。在特定实施方案中,所述培养的人类胚胎细胞系包含约4.0×106至约6×106个活细胞/ml的细胞密度。在特定实施方案中,用编码AAV核酸序列和转染组合物的载体或用封闭线性AAV核酸序列和转染组合物以约3×106至约5×106个活细胞/ml的细胞密度转染所述人类胚胎细胞系。
在特定实施方案中,所述转染组合物包含至少约5%体积/体积(v/v)至约50%v/v的培养基。在特定实施方案中,所述转染组合物包含至少约5%体积/体积(v/v)至约20%v/v的培养基。在特定实施方案中,所述转染组合物包含至少约10%体积/体积(v/v)至约20%v/v的培养基。在一些实施方案中,所述转染组合物包含至少约5%体积/体积(v/v)至约10%v/v的培养基。在特定实施方案中,所述转染组合物包含约1公升至约5公升的培养基。在特定实施方案中,添加至所述转染组合物的核酸序列包含:约0.1μg至约1μg每0.5×106至约5×106个细胞的Ad辅助DNA、Rep/Cap DNA或转基因。
在特定实施方案中,所述方法还包括:(i)加入约1公升的培养基至所述经转染的细胞中;(ii)在约1至约5分钟的时间过程中以约1:1的聚合物与DNA和约3:1的聚合物与DNA之间的比例添加阳离子聚合物。在特定实施方案中,在约1分钟的时间过程中添加所述阳离子聚合物以聚合物与DNA的2.2:1的比例。在特定实施方案中,所述阳离子聚合物包含完全水解的线性聚乙烯亚胺(PEI)。
在特定实施方案中,包含宿主细胞的培养基的温度在转染前约12至36小时升高至37℃。举例而言,在转染前约12至36小时,将包含人类胚胎细胞悬液的培养基的温度提高到37℃。
在特定实施方案中,所述培养基经受约0.1LPM至约1.0LPM之间的流速的空气喷射。在特定实施方案中,所述培养基经受约0.5LPM的流速的空气喷射。在特定实施方案中,所述培养基经受约1.5LPM、2LPM、5LPM、7LPM、10LPM、15LPM、20LPM、30LPM、40LPM、50LPM、60LPM、70LPM、80LPM<90LPM或100LPM的流速的空气喷射。在特定实施方案中,所述培养基的pH值维持在至少约7.0。
在特定实施方案中,产生缺乏原核序列的高滴度重组腺相关病毒(rAAV)群体的方法包括以a)编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列;b)编码rep和cap基因的核酸序列,和c)包含至少一个ITR和可操作地连接到一个或多个调节元件的异源转基因的封闭末端线性双链rAAV载体核酸转染哺乳动物细胞,其中,从a)、b)和c)转染的核酸总量小于1μg每1×106个细胞;培养经转染的细胞至少24小时,例如至少40小时;任选地裂解经转染的细胞并纯化所产生的rAAV载体颗粒;其中,所述rAAV的滴度为至少9.3×1013个载体基因组/3.0×109个经转染的活细胞。在实施方案的一些方面,裂解经转染的宿主细胞。在一些其他实施方案中,不裂解经转染的细胞。
在特定实施方案中,所述rAAV载体颗粒的滴度为至少1×1010至至少1×1016个载体基因组/1.0×108至1×1011个经转染的活细胞。在特定实施方案中,所述rAAV载体颗粒的滴度为至少1×1011个载体基因组/1.0×109至2×1011个经转染的活细胞。在特定实施方案中,所述rAAV载体颗粒的滴度为至少1×1012个载体基因组/2.0×109至3×1011个经转染的活细胞。在特定实施方案中,所述rAAV载体颗粒的滴度为至少1×1013个载体基因组/2.0×109至2×1011个经转染的活细胞。在特定实施方案中,所述rAAV载体颗粒的滴度为至少1×1014个载体基因组/2.0×109至4×1011个经转染的活细胞。在特定实施方案中,所述rAAV载体颗粒的滴度为至少2×1014个载体基因组/3.0×109至5×1011个经转染的活细胞。在特定实施方案中,所述rAAV载体颗粒的滴度为至少3×1014个载体基因组/4.0×109至5×1011个经转染的活细胞。在特定实施方案中,所述rAAV载体颗粒的滴度为至少4×1014个载体基因组/5.0×109至5×1011个经转染的活细胞。在特定实施方案中,所述rAAV载体颗粒的滴度为至少5×1014个载体基因组/6.0×109至5×1011个经转染的活细胞。在特定实施方案中,所述rAAV载体颗粒的滴度为至少1.25×1014个载体基因组/4.0×109个经转染的活细胞。
在特定实施方案中,所述rAAV载体颗粒的滴度至少为2×1011vp/毫升。在特定实施方案中,所述rAAV载体颗粒的滴度至少为2.5×1011vp/毫升。在特定实施方案中,所述rAAV载体颗粒的滴度至少为3×1011vp/毫升。在特定实施方案中,所述rAAV载体颗粒的滴度至少为3.5×1011vp/毫升。在特定实施方案中,所述rAAV载体颗粒的滴度至少为4×1011vp/毫升。在特定实施方案中,所述rAAV载体颗粒的滴度至少为4.5×1011vp/毫升。在特定实施方案中,所述rAAV载体颗粒的滴度至少为5×1011vp/毫升。在特定实施方案中,所述rAAV载体颗粒的滴度至少为5.5×1011vp/毫升。在特定实施方案中,所述rAAV载体颗粒的滴度至少为6×1011vp/毫升。在特定实施方案中,所述rAAV载体颗粒的滴度至少为6.5×1011vp/毫升。在特定实施方案中,所述rAAV载体颗粒的滴度为至少7×1011vp/毫升。在特定实施方案中,所述rAAV载体颗粒的滴度至少为7.5×1011vp/毫升。在特定实施方案中,所述rAAV载体颗粒的滴度至少为8×1011vp/毫升。在特定实施方案中,所述rAAV载体颗粒的滴度至少为8.5×1011vp/毫升。在特定实施方案中,所述rAAV载体颗粒的滴度至少为9×1011vp/毫升。在特定实施方案中,所述rAAV载体颗粒的滴度至少为9.5×1011vp/毫升。在特定实施方案中,所述rAAV载体颗粒的滴度至少为1×1012vp/毫升。在特定实施方案中,所述rAAV载体颗粒的滴度至少为5×1012vp/ml。
在本发明的特定实施方案中,使用封闭线性(clDNA)获得的rAAV载体颗粒的滴度至少为1e11 vg/ml。在一些实施方案中,所述rAAV载体颗粒的滴度至少为2e11 vg/ml。在一些实施方案中,所述rAAV载体颗粒的滴度至少为3e11 vg/ml。在特定实施方案中,所述rAAV载体颗粒的滴度至少为4e11 vg/ml。在特定实施方案中,所述rAAV载体颗粒的滴度至少为5e11 vg/ml。在几个实施方案中,所述rAAV载体颗粒的滴度至少为6e11 vg/ml。在一些实施方案中,所述rAAV载体颗粒的滴度至少为7e11 vg/ml。在特定实施方案中,所述rAAV颗粒的滴度至少为8e11 vg/ml。在一些实施方案中,所述rAAV颗粒的滴度为至少8.5e11vg/ml。在其他实施方案中,所述rAAV颗粒的滴度为至少9e11 vg/ml。在又一个实施方案中,所述rAAV颗粒的滴度至少为9.5e11 vg/ml。在特定实施方案中,所述rAAV颗粒的滴度至少为1e12 vg/ml。
在一些实施方案中,使用封闭线性DNA(clDNA)所得到的rAAV载体颗粒相较于使用质粒DNA(pDNA)得到的rAAV载体颗粒高约2至约3倍。在另一个实施方案中,使用封闭线性DNA(clDNA)所得到的rAAV载体颗粒相较于使用质粒DNA(pDNA)得到的rAAV载体颗粒高约4至约5倍。在另一个实施方案中,使用封闭线性DNA(clDNA)所得到的rAAV载体颗粒相较于使用质粒DNA(pDNA)得到的rAAV载体颗粒高约6至约8倍。在各种实施方案中,使用封闭线性DNA(clDNA)所得到的rAAV载体颗粒相较于使用质粒DNA(pDNA)得到的rAAV载体颗粒高约9至约15倍。
本文所述方法的特定实施方案包括使用a)编码辅助蛋白的核酸序列,b)编码rep和cap基因的核酸序列,和c)包含至少一个ITR和可操作地连接到一个或多个调节元件的异源转基因的封闭末端线性双链rAAV载体核酸。a)编码辅助蛋白的核酸序列与b)编码rep和cap基因的核酸序列与c)包含至少一个ITR和可操作地连接到一个或多个调节元件的异源转基因的封闭末端线性双链rAAV载体核酸的比例[a):b):c)]可针对所使用的特定核酸进行优化。例如,a):b):c)的比例可为约0.5至1.75:约0.75至2.25:约0.5至1.75(重量:重量:重量)。在特定实施方案中,a):b):c)的比例为约0.75至1.5:约1至1.75:约0.75至1.25(重量:重量:重量)。
在特定实施方案中,a)编码辅助蛋白的核酸序列与b)编码rep和cap基因的核酸序列与c)包含至少一个ITR和可操作地连接到一个或多个调节元件的异源转基因的封闭末端线性双链rAAV载体核酸的比例[a):b):c)]约为1:约1至1.6:约1(重量:重量:重量)。在特定实施方案中,a):b):c)的比例为约0.5:1:1(重量:重量:重量)。在特定实施方案中,a):b):c)的比例为约0.5:1:0.5(重量:重量:重量)。在特定实施方案中,a):b):c)的比例为约0.75:1:0.75(重量:重量:重量)。在特定实施方案中,a):b):c)的比例为约0.5:1:1(重量:重量:重量)。在特定实施方案中,a):b):c)的比例为约0.5:1:0.75(重量:重量:重量)。在特定实施方案中,a):b):c)的比例为约0.5:1.5:1(重量:重量:重量)。在特定实施方案中,a):b):c)的比例为约1:1.5:1(重量:重量:重量)。在特定实施方案中,a):b):c)的比例为约1:1.6:1(重量:重量:重量)。在特定实施方案中,a):b):c)的比例为约1:1.75:1(重量:重量:重量)。在特定实施方案中,a):b):c)的比例为约1:1.8:1(重量:重量:重量)。在特定实施方案中,a):b):c)的比例为约1:1.85:1(重量:重量:重量)。在特定实施方案中,a):b):c)的比例为约1:1.90:1(重量:重量:重量)。在特定实施方案中,a):b):c)的比例为约1:1.95:1(重量:重量:重量)。在特定实施方案中,a):b):c)的比例为约1:2:1(重量:重量:重量)。在特定实施方案中,a):b):c)的比例为约1.4:约1.5:约1(重量:重量:重量)。
在特定实施方案中,使用转染组合物转染宿主细胞,所述转染组合物包含a)编码辅助蛋白的核酸序列,b)编码rep和cap基因的核酸序列,c)包含至少一个ITR和可操作地连接到一个或多个调节元件的异源转基因的封闭末端线性双链rAAV载体核酸,和d)聚阳离子聚合物。阳离子聚合物可为每个分子带有至少两个正电荷并具有足够的电荷密度和分子大小以在生理条件下与核酸结合的任何合成或天然聚合物。在特定实施方案中,所述聚阳离子聚合物包含一个或多个胺残基,例如聚乙烯亚胺(PEI)或如聚鸟氨酸、聚精氨酸和聚赖氨酸的聚氨基酸。在优选的实施方案中,所述聚阳离子聚合物是PEI。
所述聚阳离子聚合物可为任何合成的或天然的聚合物,每个分子带有至少两个正电荷且具有足够的电荷密度和分子大小以于转染条件下与核酸结合(即,在细胞培养物中遭遇的pH和盐(salt)条件)。所述阳离子聚合物包括例如聚乙烯亚胺(PEI)、聚烯丙胺、聚乙烯胺、聚乙烯基吡啶、氨基缩醛化聚(乙烯醇)、亚克力或甲基丙烯酸聚合物(例如,聚(N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯)),其具有一个或多个胺残基,如聚鸟氨酸、聚精氨酸和聚赖氨酸的聚氨基酸、精蛋白、如壳聚糖、DEAE-纤维素和DEAE-葡聚糖的阳离子多糖和聚乙二胺(polyamidoamine)树枝状大分子(阳离子树枝状大分子),以及其共聚物和混合物。
所述聚阳离子聚合物可为直链或支链的,可为均聚物或共聚物,当含有氨基酸时,所述聚阳离子聚合物可具有L或D构型,且可具有这些特征的任何混合。优选地,所述阳离子聚合物分子具有足够的柔性以允许其与一种或多种核酸分子形成紧密的复合物。
所述聚阳离子聚合物的分子量可以根据一种或多种核酸的特性而变化。因此,在一些实施方案中,所述聚阳离子聚合物具有约5,000至约100,000之间道尔顿、更优选约5,000至约50,000之间道尔顿、最优选约10,000至约35,000之间道尔顿的分子量。
在特定实施方案中,所述聚阳离子聚合物是聚乙烯亚胺(PEI)。例如,所述聚阳离子聚合物是线性聚乙烯亚胺。在特定实施方案中,所述聚阳离子聚合物是完全水解的聚乙烯亚胺。
在一些实施例中,所述聚阳离子聚合物是稳定的阳离子聚合物。
可以改变所述聚阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例以实现最佳转染。例如,所述聚阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例可为约1.5:1至约2.75:1。在特定实施方案中,所述聚阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例可为约1.9:1至约2.6:1。在特定实施方案中,所述聚阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例可为约1:1.5至约1:2.75。举例而言,所述聚阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例可为约1:1.9至约1:2.6。
所述聚阳离子聚合物以有效与来自a)、b)和c)的核酸复合以形成复合物的量存在于所述转染组合物中。在特定实施方案中,所述聚阳离子聚合物和来自a)、b)和c)的核酸的相对量可由所述聚阳离子聚合物中的氮原子数除以所述核酸中的磷原子数(N/P比)表示。在特定实施方案中,所述聚阳离子聚合物和来自a)、b)和c)的核酸以约2至约15、更优选约3至约12、最优选约4至约9的N/P比存在。
在特定实施方案中,使用包含a)、b)和c)以及稳定的阳离子聚合物的转染组合物转染a)、b)和c)的步骤,其中,稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例为约1.5:1。在特定实施方案中,稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例为约0.5:1(重量:重量)。在特定实施方案中,稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例为约0.75:1(重量:重量)。在特定实施方案中,稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例为约1:1(重量:重量)。在特定实施方案中,稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例为约1.75:1(重量:重量)。在特定实施方案中,稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例为约2:1(重量:重量),为约2.2:1(重量:重量)。在特定实施方案中,稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例为约2.5:1(重量:重量)。在特定实施方案中,稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例为约3:1(重量:重量)。在特定实施方案中,稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例为约1:0.75(重量:重量)。在特定实施方案中,稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例为约1:0.5(重量:重量)。在特定实施方案中,稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例为约1:0.25(重量:重量)。
在特定实施方案中,a)、b)和c)各自均提供在一个或多个封闭末端线性双链核酸分子上。在特定实施方案中,经转染的核酸a)、b)和c)是合成核酸且没有DNA的原核细胞修饰。在特定实施方案中,经转染的a)、b)和c)是合成核酸且没有DNA的真核和原核细胞修饰。在特定实施方案中,纯化的重组AAV(rAAV)中的包装核酸缺乏原核和真核DNA序列。在一个实施方案中,非AAV载体DNA占rAAV颗粒中总DNA的不到10%。
在特定实施方案中,产生缺乏原核序列的纯化重组腺相关病毒(rAAV)群体的方法包括:用转染组合物转染悬浮在培养基中的哺乳动物细胞系;其中,所述转染组合物包含a)编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列;b)编码rep和cap基因的核酸序列,和c)包含至少一个ITR和可操作地连接到一个或多个调节元件的异源转基因的封闭末端线性双链rAAV载体核酸,和d)稳定的阳离子聚合物;其中,所述稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例为至少1.5:1;培养经转染的细胞系至少24小时,例如至少40小时;裂解步骤ii)的经转染的细胞系;纯化rAAV,其中,纯化的病毒具有小于2×104vg/TCID50的颗粒与感染性比例。在实施方案的一些方面,任选地裂解经转染的宿主细胞。在一些实施方案中,所产生的纯化重组AAV(rAAV)具有小于1.5×104vg/TCID50的颗粒与感染性比例。在一些实施方案中,纯化的重组AAV(rAAV)具有小于1×104vg/TCID50的颗粒与感染性比例。在一些实施方案中,纯化的重组AAV(rAAV)具有小于9×103vg/TCID50的颗粒与感染性比例。在一些实施方案中,纯化的重组AAV(rAAV)具有小于8×103vg/TCID50的颗粒与感染性比例。在一些实施方案中,纯化的重组AAV(rAAV)具有小于7×103vg/TCID50的颗粒与感染性比例。在一些实施方案中,纯化的重组AAV(rAAV)具有小于6×103vg/TCID50的颗粒与感染性比例。在一些实施方案中,纯化的重组AAV(rAAV)具有小于5×103vg/TCID50的颗粒与感染性比例。在一些实施方案中,纯化的重组AAV(rAAV)具有小于4×103vg/TCID50的颗粒与感染性比例。在一些实施方案中,纯化的重组AAV(rAAV)具有小于3×103vg/TCID50的颗粒与感染性比例。在一些实施方案中,纯化的重组AAV(rAAV)具有小于2×103vg/TCID50的颗粒与感染性比例。在一些实施方案中,纯化的重组AAV(rAAV)具有小于1×103vg/TCID50的颗粒与感染性比例。在一些实施方案中,纯化的重组AAV(rAAV)具有小于9×102vg/TCID50的颗粒与感染性比例。在一些实施方案中,纯化的重组AAV(rAAV)具有小于8×102vg/TCID50的颗粒与感染性比例。在一些实施方案中,纯化的重组AAV(rAAV)具有小于7×102vg/TCID50的颗粒与感染性比例。在一些实施方案中,纯化的重组AAV(rAAV)具有小于6×102vg/TCID50的颗粒与感染性比例。在一些实施方案中,纯化的重组AAV(rAAV)具有小于5×102vg/TCID50的颗粒与感染性比例。
在任一方面的特定实施方案中,感染性颗粒滴度为至少1×104vg/TCID50。在特定实施方案中,感染性颗粒滴度为至少1.5×104vg/TCID50。在特定实施方案中,感染性颗粒滴度为至少2×104vg/TCID50。在特定实施方案中,感染性颗粒滴度为至少2.5×104vg/TCID50。在特定实施方案中,感染性颗粒滴度为至少3×104vg/TCID50。在特定实施方案中,感染性颗粒滴度为至少3.5×104vg/TCID50。在特定实施方案中,感染性颗粒滴度为至少4×104vg/TCID50。在特定实施方案中,感染性颗粒滴度为至少4.5×104vg/TCID50。在特定实施方案中,纯化的病毒具有至少5×104vg/TCID50的颗粒与感染性比例。
在一些实施方案中,产生重组AAV的方法涉及瞬时转染法。在一些实施方案中,产生重组AAV的方法涉及稳定转染方法。在各种实施方案中,所述转染在悬浮液中进行。
本文所述方法的实施方案包括培育接种的细胞培养基,例如经转染的宿主细胞,一段时间以产生rAAV。例如,接种的细胞培养基,例如,可培育所述经转染的宿主细胞至少24小时的时间。例如,可培育所述经转染的宿主细胞至少30小时。在特定实施方案中,培育接种的细胞培养基,例如经转染的宿主细胞30至100小时、或30至150小时、或30至200小时、或40至100小时、或40至150小时、或40至200小时、或40至300小时、或40至350小时、或40至400小时、或40至450小时、或40至500小时、或40至550小时、或40至600小时、或40至650小时、或40至700小时、或40至750小时、或40至800小时、或40至850小时、或40至900小时、或40至950小时、或40到1000小时。在特定实施方案中,培养接种的细胞培养基,例如经转染的细胞约40至400小时。在特定实施方案中、培养接种的细胞培养基、例如经转染的宿主细胞约40至100小时、或约40至150小时、或约40至200小时、或约40至250小时、或约40至300小时、或约40至350小时、或约40至400小时、或约40至450小时、或约40至450小时、或约40至500小时、或约40至550小时、或约40小时至600小时、或约40至650小时、或约40至700小时、或约40至750小时、或约40至800小时、或约40至850小时、或约40至900小时、或约40至950小时、或约40至1000小时。在特定实施方案中,培育接种的细胞培养基,例如经转染的细胞至少24小时或至少30小时或至少40小时或至少45小时或至少50小时或至少55小时或至少60小时或至少65小时或至少70小时或至少72小时或至少75小时。在特定实施方案中、培养接种的细胞培养基、例如经转染的细胞不超过1000小时、或不超过950小时、或不超过900小时、或不超过850小时、或不超过800小时。小时、或不超过750小时、或不超过700小时、或不超过650小时、或不超过600小时、或不超过550小时、或不超过500小时、或不超过450小时、或不超过400小时、或不超过350小时、或不超过300小时、或不超过250小时、或不超过200小时、或不超过150小时、或不超过100小时。
在特定实施方案中,所述哺乳动物细胞系是悬浮细胞或细胞系,即非贴壁细胞或细胞系,且细胞在悬浮液中转染。在特定实施方案中,所述细胞系源自人类胚胎肾293细胞系(HEK 293)。在特定实施方案中,人类胚胎肾细胞缺乏SV40抗原或其他转化抗原。在特定实施方案中,所述哺乳动物细胞系为悬浮适应的无血清细胞系。在特定实施方案中,所述细胞系源自原代血细胞,例如淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、树突细胞、红细胞。在特定实施方案中,所述细胞系源自细胞活检并且包括例如淋巴结细胞、骨髓细胞、脐带血细胞。在特定实施方案中,所述细胞系源自循环肿瘤细胞。在特定实施方案中,所述细胞系源自血细胞系,例如Jurkat和Molt4 T细胞系、U937和THP前单核细胞系、B细胞杂交瘤。在特定实施方案中,所述细胞系源自干细胞。在特定实施方案中,用于生产重组AAV的细胞系是稳定的细胞系。
在特定实施方案中,在转染之前,所述哺乳动物细胞系的悬浮液于增加体积的培养基中逐渐培养。
本文公开的方法是可扩展的并且可以应用于rAAV的有效且可扩展的生产。换言之,本文描述的方法可以用于数毫升到数千公升的体积。因此,所描述的方法可用于治疗性rAAV组合物的工业规模生产。在特定实施方案中,包含宿主细胞的细胞培养物的体积可为至少约50公升。例如,所述细胞培养体积可为约50公升至约4000公升。在特定实施方案中,所述细胞培养体积可为约50公升至约2000公升。举例而言,所述细胞培养体积可以从约50公升到约250公升。在另一个非限制性实例中,所述细胞培养体积可为约50公升至约100公升。
可在转染之前增加包含宿主细胞的细胞培养物的体积。例如,所述细胞培养体积可从约10到20、30、40或50ml体积增加到约4000公升容积。在特定实施方案中,所述细胞培养体积可从约10至20、30、40或50ml体积增加到约2000公升。例如,所述细胞培养体积可从约10到20、30、40或50ml体积增加到约250公升。在另一个非限制性实例中,所述细胞培养体积可从约10至20、30、40或50ml体积增加到约50公升或约100公升。在特定实施方案中,所述细胞培养体积可从约100公升体积增加。在特定实施方案中,所述细胞培养体积可从约50毫升体积增加到约50公升体积。在特定实施方案中,所述细胞培养体积可从约50毫升体积增加到约10公升体积。
在特定实施方案中,所述培养体积从约50ml体积逐渐增加到约4000公升体积。在特定实施方案中,所述培养体积从约50ml体积逐渐增加至约2000公升体积。在特定实施方案中,所述培养体积逐渐从约10至20、30、40或50ml体积增加至约250公升体积。在特定实施方案中,所述培养体积从约10至20、30、40或50ml体积逐渐增加至约100公升体积。在特定实施方案中,培养体积从约10至20、30、40或50ml体积逐渐增加至约50公升体积。在特定实施方案中,用于将所述人类胚胎细胞悬浮液从约50ml体积逐渐扩增至约50公升体积的培养基包含浓度为约1mM至约20mM的氨基酸。在特定实施方案中,其中具有约5公升体积的所述培养基包含约10mM浓度的氨基酸。在特定实施方案中,所述氨基酸是L-谷氨酰胺。
在特定实施方案中,所述rAAV病毒粒子的包装核酸缺乏原核DNA序列。
特定实施方案包括编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列。足以用于rAAV复制的辅助蛋白已经广泛研究,且已知许多编码辅助蛋白功能的腺病毒基因。举例来说,认为由早期腺病毒基因区E1A(例如,存在于HEK 293细胞中)、E2A、E40rf6、VAI RNA和任选的VAII RNA,以及任选的E1B(也存在于HEK 293细胞中)编码的蛋白质参与rAAV复制过程。因此,在特定实施方案中,所述编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列包含编码腺病毒(Ad)辅助蛋白的核苷酸序列。例如,所述编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列包含编码腺病毒辅助蛋白E2A和/或E4的核苷酸序列。
在特定实施方案中,a)所述编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列为腺病毒(Ad)辅助蛋白,其包含编码腺病毒辅助蛋白E2A和E4的核酸。
在特定实施方案中,来自a)、b)和c)的DNA总量为约1至约50ug。在特定实施方案中,来自a)、b)和c)的DNA总量为约1至约20ug。在特定实施方案中,来自a)、b)和c)的DNA总量为约1至约10ug。在特定实施方案中,来自a)、b)和c)的DNA总量为约1至约8ug。在特定实施方案中,来自a)、b)和c)的DNA总量为约1至约6ug。在特定实施方案中,来自a)、b)和c)的DNA总量为约1至约3ug。在特定实施方案中,来自a)、b)和c)的DNA总量任选地为0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.2、1.4、1.6或1.8μg。在特定实施方案中,来自a)、b)和c)的DNA总量为0.75μg。
在特定实施方案中,来自a)编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列的核酸总量;b)编码AAV rep和AAV cap基因的核酸序列,和c)包含至少一个反向末端重复(ITR)序列和可操作地连接到所使用的用于接种所述细胞培养物(例如,转染所述宿主细胞)的一个或多个调节元件的异源转基因的封闭末端线性双链rAAV载体核酸小于约2μg每1×106个细胞。例如,来自a)、b)和c)的核酸总量小于约1.5μg每1×106个细胞。在特定实施方案中,来自a)、b)和c)的核酸总量小于约1μg每1×106个细胞,或小于约0.75μg每1×106个细胞。
在特定实施方案中,来自a)、b)和c)的核酸总量为至少0.25μg每1×106个细胞。例如,来自a)、b)和c)的核酸总量为至少0.5μg每1×106个细胞。在特定实施方案中,来自a)、b)和c)的核酸总量为约0.25μg每1×106个细胞至约2μg每1×106个细胞。例如,来自a)、b)和c)的核酸总量为约0.5μg每1×106个细胞至约1.5μg每1×106个细胞。在特定实施方案中,来自a)、b)和c)的核酸总量为约0.5μg每1×106个细胞至约0.75μg每1×106个细胞。
在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少3×109TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少1×105TCID50/ml(半数组织培养感染剂量)至约1×1011TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少2×105TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少5×105TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少7.5×105TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少8×105TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少8.5×105TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少9×105TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少9.5×105TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少9.9×105TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少1×106TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少1×106TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少2×106TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少5×106TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少7.5×106TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少8×106TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少8.5×106TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少9×106TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少9.5×106TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少9.9×106TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少1×107TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度至少为2×107TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少5×107TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度至少为7.5×107TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少8×107TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少9×107TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少9.9×107TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少1×108TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度至少为2.5×108TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少5×108TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少7.5×108TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少8×108TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少8.5×108TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度至少为9×108TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少9.5×108TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度至少为9.9×108TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度至少为0.5×109TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少1×109TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少1.5×109TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少2×109TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度至少为2.5×109TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少3×109TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少3.5×109TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少4×109TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度至少为4.5×109TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少5×109TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少5.5×109TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少6×109TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少6.5×109TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少7×109TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少7.5×109TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少8×109TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少8.5×109TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少9×109TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少9.5×109TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少9.9×109TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少1×1010TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少2×1010TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少5×1010TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少7.5×1010TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少8×1010TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少8.5×1010TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少9×1010TCID50/ml。在特定实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少9.5×1010TCID50/ml。在一些实施方案中,所述感染性滴度TCID50/ml优选标准化为vg/ml。在一些实施方案中,所述感染性颗粒滴度为至少1011TCID50/ml。
在特定实施方案中,大规模生产重组腺相关病毒(rAAV)的方法包括提供编码AAV核酸序列或封闭线性AAV核酸序列的载体;于悬浮液中培养人类胚胎细胞系;以编码AAV核酸序列的载体和转染组合物或以封闭线性AAV核酸序列和转染组合物转染人类细胞系;培育经转染的人类细胞系约30至250小时;裂解经转染的人类细胞系并纯化核酸序列,编码所述rAAV,从而提供rAAV的大规模生产。在特定实施方案中,培育经转染的细胞30至100小时、或30至150小时、或30至200小时、或40至100小时、或40至150小时、或40至200小时、或40至300小时、或40至350小时、或40至400小时、或40至450小时、或40至500小时、或40至550小时、或40至600小时、或40至650小时、或40至700小时、或40至750小时、或40至800小时、或40至850小时、或40至900小时、或40至950小时、或40至1000小时。
在特定实施方案中,所述AAV Rep基因和AAV Cap基因来自相同的AAV血清型。在特定实施方案中,所述AAV Rep基因和AAV Cap基因来自不同的AAV血清型。
在特定实施方案中,所述人类胚胎细胞系为源自人类胚胎肾细胞系的悬浮适应无血清细胞系。在转染前以增加的体积逐渐培养所述人类胚胎细胞系的悬浮液。在某些方面,所述培养体积从约50ml体积逐渐增加到约100公升体积。在特定实施方案中,用于逐步扩增人类胚胎细胞悬浮液的的培养基包含于约50ml至约10公升体积的培养基体积中浓度为约1mM至约20mM的L-谷氨酰胺。在特定实施方案中,具有约5公升体积的培养基包含约10mM浓度的L-谷氨酰胺。在特定实施方案中,具有约50公升体积的培养基包含:至少约1mM至约20mM L-谷氨酰胺、至少约0.01%至约1%普流尼克酸和至少约0.001%至约1%的消泡剂。
在特定实施方案中,培养的人类胚胎细胞系包含约3.0×106至约1×108个活细胞/ml的细胞密度。在某些方面,培养的人类胚胎细胞系包含约4.0×106至约6×106个活细胞/ml的细胞密度。在特定实施方案中,以编码AAV核酸序列和转染组合物的载体或以封闭线性AAV核酸序列和转染组合物以约3×106至约5×106个活细胞/ml3的细胞密度转染所述人类胚胎细胞系。
在特定实施方案中,所述转染组合物包含:(i)编码腺病毒辅助蛋白的载体,(ii)包含AAV rep基因和AAV衣壳(cap)蛋白基因的载体,和(iii)包含AAV反向末端重复(ITR)序列的载体。在特定实施方案中,所述编码腺病毒辅助蛋白的载体缺乏腺病毒结构和复制基因。在某些方面,所述AAV rep和衣壳基因为不同的血清型或为相同的血清型。在某些方面,所述AAV rep基因为AAV2 rep基因且所述AAV衣壳基因为AAV8衣壳基因。在某些方面,所述AAV反向末端重复(ITR)序列为腺相关病毒2反向末端重复(ITR)序列。在特定实施方案中,添加至所述转染组合物的核酸序列包含:约0.1μg至约1μg每0.5×106至约5×106个细胞的Ad辅助DNA、Rep/Cap DNA或转基因。在一些实施方案中,所述转染于约10分钟至约60分钟的时间过程中进行。在特定实施方案中,所述转染于约10分钟至约120分钟的时间过程中进行。
在特定实施方案中,转染时的细胞密度为约2.0×104至约1.0×108活细胞/ml。在特定实施方案中,转染时的细胞密度为约5.0×104至约5.0×107个活细胞/ml。在特定实施方案中,转染时的细胞密度为约1.0×105至约1×107个活细胞/ml。在特定实施方案中,转染时的细胞密度为约5.0×105至约1×107个活细胞/ml。在特定实施方案中,转染时的细胞密度为约2.0×105至约9×106个活细胞/ml。在特定实施方案中,转染时的细胞密度为约1.0×106至约7.5×106个活细胞/ml。在特定实施方案中,转染时的细胞密度为约1.0×106至约7×106个活细胞/ml。在特定实施方案中,转染时的细胞密度为约1.0×106至约5×106个活细胞/ml。在特定实施方案中,转染时的细胞密度为约1.0×106至约4×106个活细胞/ml。
特定实施方案包括用于转染所述宿主细胞的转染组合物。一般而言,所述转染组合物包含a)编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列;b)编码AAV rep和AAV cap基因的核酸序列,c)包含至少一个反向末端重复(ITR)序列和可操作地连接到一个或多个调节元件的异源转基因的封闭末端线性双链rAAV载体核酸,和d)聚阳离子聚合物。除了核酸a)、b)和c)之外,所述转染组合物还可以包含细胞培养基,即用于宿主细胞的培养基。所述转染组合物的体积可为宿主细胞系培养物体积的约5%至约20%(体积/体积)。例如,以宿主细胞系培养物体积的约7.5%至约15%(体积/体积)的转染组合物体积转染所述宿主细胞系。
在特定实施方案中,所述转染组合物包含至少约5%体积/体积(v/v)至约20%v/v的培养基。在特定实施方案中,所述转染组合物包含约1公升至约5公升的培养基。一旦细胞经转染,向经转染的细胞中加入约1公升培养基。在特定实施方案中,在约1至约5分钟的时间过程中以约1:1(PEI:DNA)至约3:1(PEI:DNA)的比例添加完全水解的线性聚乙烯亚胺(PEI)。在特定实施方案中,在约1分钟的时间过程中以2.2:1(PEI:DNA)的比例添加完全水解的线性聚乙烯亚胺(PEI)。在特定方面,于转移至大体积生物反应器前,培育经转染的细胞悬浮液约1至20分钟。在特定实施方案中,培育经转染的细胞悬浮液约3小时,并通过10%(v/v)体积且补充有约10mM L-谷氨酰胺的化学性界定无血清培养基进行淬灭。在特定实施方案中,在转染前约12至36小时,将包含人类胚胎细胞悬浮液的培养基的温度升高至37℃。在特定实施方案中,所述培养基经受约0.1LPM至约1.0LPM的流速的空气喷射。在特定实施方案中,所述培养基经受约0.5LPM的流速的空气喷射。在特定实施方案中,所述培养基的pH值维持在至少约7.0。
在特定实施方案中,重组腺相关病毒(rAAV)包含蛋白端粒酶(protelomerase)靶序列。在特定方面,所述蛋白端粒酶靶序列包含长度至少为10个碱基对的双链回文序列。在特定实施方案中,所述rAAV包含转基因。
在特定实施方案中,一种药物组合物包含封闭线性重组腺相关病毒(rAAV)。在特定实施方案中,所述rAAV包含转基因。
在特定实施方案中,所述rAAV颗粒具有来自AAV血清型的AAV衣壳基因,所述AAV血清型包括AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-14、AAV-15和AAV-16。在特定实施方案中,所述rAAV颗粒包含来自AAV血清型的AAV rep基因,所述AAV血清型包含AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-14、AAV-15和AAV-16。在一些实施方案中,所述rAAV颗粒为来自美国专利10,550,405、国际公开号WO2018170310A1、美国专利7,892,809、美国专利6,491,907或美国专利7,172,893的例示性rAAV,但不以此为限。在特定实施方案中,所述rAAV为包含来自特定AAV血清型的ITR和来自不同AAV血清型的衣壳的杂合AAV。在一些实施方案中,所述rAAV可包含rAAV病毒粒子。在特定实施方案中,所述rAAV衣壳包含一个或多个氨基酸的取代、添加和/或缺失;例如,包含用于靶向的插入肽的衣壳。
附图说明
专利或申请文件包含至少一个彩色图式。专利局将根据请求和支付必要费用提供本专利或专利申请出版物的彩色图式副本。
图1为显示基于质粒(AskBio)系统(N=2)和使用clDNA系统(N=5)的有利转染条件下,以vg/mL产率表示的细胞裂解物中载体基因组滴度的比较的图表。这些图表代表平均值+/-一个标准偏差。
图2为显示μg clDNA/1E6细胞和PEI:DNA比例两者对Vg滴度具有统计学显著影响的预测分析图。p≤0.0066。
图3为显示clDNA和PEI:DNA比例对细胞裂解物中载体基因组滴度的影响的等高线图,以vg/mL表示。
图4为显示clDNA和PEI:DNA比例对病毒滴度的影响的图,以vp/mL表示。
图5为显示PEI:DNA比例而非clDNA的量对以vp/mL表示的AAHrh10 CYP滴度产率具有统计学显著影响的预测分析图。
图6为显示μg clDNA/1E6细胞和PEI:DNA比例两者对以vp/ml表示的AAV8 GAA滴度产率具有统计学显著影响的预测分析图。
具体实施方式
AAV为围绕并保护约4.8千碱基(kb)的小型单链DNA基因组的蛋白质外壳。AAV属于细小病毒家族,依赖于与其他病毒(主要为腺病毒)共感染才能复制。最初从血清学上区分,AAV基因的分子克隆已在众多物种中鉴定出数百种独特的AAV株。AAV的单链基因组包含三个基因,Rep(复制)、Cap(衣壳)和aap(组装)。这三个基因通过使用三个启动子、替代翻译起始位点和差异剪接产生至少九种基因产物。这些编码序列的两侧为基因组复制和包装所需的反向末端重复(ITR)。Rep基因编码病毒基因组复制和包装所需的四种蛋白质(Rep78、Rep68、Rep52和Rep40),而Cap表达产生病毒衣壳蛋白(VP;VP1/VP2/VP3),其形成保护病毒基因组的外壳,以及积极参与细胞结合和内化(Samulski RJ,Muzyczka N.AAV-mediatedgene therapy for research and therapeutic purposes.Annu Rev Virol.2014;1(1):427–451.doi:10.1146/annurev-virology-031413-085355)。据估计,病毒外壳由60种蛋白质组成,排列成二十面体结构,衣壳蛋白质的摩尔比为1:1:10(VP1:VP2:VP3)。aap基因在与cap基因重叠的交替阅读框中编码组装激活蛋白(AAP)。这种核蛋白被认为为衣壳装配提供支架功能(Naumer M等人,J Virol.2012;86(23):13038–13048.doi:10.1128/JVI.01675-12)。虽然AAP为VP蛋白的核仁定位和AAV2中的衣壳组装为必要的,但AAP的亚核定位在其他11种血清型中有所不同,且于AAV4、AAV5和AAV11中为非必要的(Earley LF等人,Adeno-associated Virus(AAV)assembly-activating protein is not an essentialrequirement for capsid assembly of AAV serotypes 4,5,and 11.J Virol.2017;91(3):1–21.doi:10.1128/jvi.01980-16)。
在后续的实施例部分中,详细描述用于大规模生产rAAV的组合物和方法。在特定实施方案中,重组腺相关病毒(rAAV)的大规模生产方法包括提供编码AAV核酸序列或封闭线性AAV核酸序列的载体;在悬浮液中培养人类胚胎细胞系;以编码AAV核酸序列的载体和转染组合物或以封闭线性AAV核酸序列和转染组合物转染人类细胞系;培育所述经转染的人类细胞系约50至100小时;收获经转染的人类细胞系并纯化rAAV载体,从而提供rAAV的大规模生产。在特定实施方案中,产生的rAAV为封闭线性rAAV。
因此,在特定实施方案中,产生缺乏原核序列的高滴度重组腺相关病毒(rAAV)群体的方法包括以a)编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列;b)编码rep和cap基因的核酸序列,和c)包含至少一个ITR和可操作地连接到一个或多个调节元件的异源转基因的封闭末端线性双链rAAV载体核酸转染哺乳动物细胞,其中,从a)、b)和c)转染的核酸总量小于1μg每1×106个细胞;培养经转染的细胞至少40小时;收获经转染的细胞并纯化产生的rAAV载体颗粒;其中,所述rAAV的滴度为至少9.3×1013个载体基因组/3.0×109个经转染的活细胞。
AAV序列可以从多种来源获得。例如,可如WO 2005/033321中所述或从例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)或各种学术载体核心设施的已知来源获得合适的AAV序列。或者,使用已知技术参考公开的序列合成产生合适的序列。
AAV cap和rep序列可以独立地选自不同的AAV亲本序列,并以本领域技术人员已知的合适方式引入宿主细胞。在特定实施方案中,所述rAAV颗粒具有来自包括AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13的AAV血清型的AAV衣壳基因。在特定实施方案中,所述rAAV颗粒具有来自选自由AAV2、3、8、9和10所组成群组的AAV血清型的AAV衣壳基因。
在特定实施方案中,所述rAAV颗粒包含来自包含AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13的AAV血清型的AAV rep基因。在特定实施方案中,所述rAAV颗粒具有来自选自由AAV2、3、8、9和10所组成群组的AAV血清型的AAV rep基因。
本公开亦提供一种产生缺乏原核序列的纯化重组腺相关病毒(rAAV)的群体的方法,包含以转染组合物转染悬浮于培养基中的哺乳动物细胞系;其中,所述转染组合物包含a)编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列;b)编码rep和cap基因的核酸序列,和c)包含至少一个ITR和可操作地连接到一个或多个调节元件的异源转基因的封闭末端线性双链rAAV载体核酸,和d)稳定的阳离子聚合物;其中,所述稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)核酸含量的总量的比例为至少1.5:1;培养经转染的细胞系至少40小时;收获步骤ii)的经转染的细胞系;纯化rAAV,其中,纯化的病毒具有小于2×104vg/TCID50的颗粒与感染性比例且缺乏原核DNA。
在本发明的实施方案中使用的哺乳动物细胞系包括悬浮细胞或细胞系,即,非贴壁(non-adherent)细胞或细胞系。在特定实施方案中,所述细胞系源自人类胚胎肾细胞系。在特定实施方案中,所述人类胚胎肾细胞缺乏SV40抗原或其他转化抗原。在特定实施方案中,所述哺乳动物细胞系为悬浮适应无血清细胞系。在特定实施方案中,所述细胞系源自原代血细胞,例如,淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、树突细胞、红细胞。在特定实施方案中,所述细胞系衍生自细胞活检且包括例如淋巴结细胞、骨髓细胞、脐带血细胞。在特定实施方案中,所述细胞系衍生自循环肿瘤细胞(circulating tumor cell)。在特定实施方案中,所述细胞系衍生自血细胞系,例如,Jurkat和Molt4 T细胞系、U937和THP前单核细胞系、B细胞杂交瘤细胞(hybridomas)。在特定实施方案中,所述细胞系源自干细胞。
病毒细胞培养物稳定或瞬时利用含有产生AAV颗粒所需的至少最少成分的细胞。所需的最少成分包括要包装到AAV衣壳、AAV cap和AAV rep中的表达盒或其功能片段以及辅助功能。
所述细胞还需要辅助功能以封装本发明的AAV。任选地,这些辅助功能可由疱疹病毒所提供。在另一个实施方案中,必需的辅助功能均由人类或非人类灵长类动物腺病毒来源提供,例如可从多种来源获得,包括美国典型培养物保藏中心(ATCC),Manassas,Va.(US)。已经描述了多种合适的腺病毒的序列。参见例如黑猩猩腺病毒C1和C68[美国专利6,083,716];Pan 5、Pan 6和Pan 7,[WO 02/33645],杂合腺病毒,例如[如,WO 05/001103]所描述者,和GenBank。
已经描述用于生产AAV的多种合适的细胞和细胞系。细胞本身可选自任何生物有机体,包括原核(例如细菌)细胞和真核细胞,包括昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。特别理想的宿主细胞选自任何哺乳动物物种,包括但不限于例如A549、WEHI、3T3、10T1/2、BHK、MDCK、COS 1、COS 7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO、WI38、HeLa、HEK 293细胞(表达功能性腺病毒E1)、Saos、C2C12、L细胞、HT1080、HepG2、Sf”c9、Sf-21、Tn368、BTI-Tn-5B1-4(High-Five)和源自包括人类、猴、小鼠、大鼠、兔和仓鼠的哺乳动物的原代成纤维细胞、肝细胞和成肌细胞的细胞。提供细胞的哺乳动物物种的选择并非本发明的限制;哺乳动物细胞的类型,即成纤维细胞、肝细胞、肿瘤细胞等也不是。
在本文所述的任一方面的特定实施方案中,宿主细胞系源自人类胚胎肾293细胞系(HEK 293)。
宿主细胞可含有表达E1A基因产物、E1B基因产物、E2A基因产物和/或E4 ORF6基因产物所需的至少最少腺病毒DNA序列。宿主细胞可能含有其他腺病毒基因,例如VAI RNA,但这些基因不是必需的。所述细胞不携带除E1、E2A和/或E4 ORF6以外的任何腺病毒基因;不含rAAV生产过程中可能导致感染病毒的同源重组的任何其他病毒基因;以及其能够感染或转染。
在任一方面的特定实施方案中,宿主细胞缺乏SV40抗原或其他转化抗原。例如,当例如HEK 293细胞的人类胚胎肾细胞作为宿主细胞时,此类细胞可能缺乏SV40抗原或其他转化抗原。
另一种宿主细胞是用编码rep和cap的序列稳定转化,并用腺病毒E1、E2A和E4ORF6DNA和携带上述表达盒的构建体转染的宿主细胞。稳定的rep和/或cap表达细胞系,例如B-50(国际专利申请公开第WO 99/15685号),或美国专利5,658,785中描述者也可以类似地使用。另一种理想的宿主细胞含有最少的腺病毒DNA,足以表达E4 ORF6。还可以使用本发明的新型修饰帽序列构建其他细胞系。
宿主细胞的制备涉及诸如组装选定的DNA序列的技术。这种组装可以利用常规技术来完成。此类技术包括cDNA和基因组克隆,其为众所周知且描述于Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold SpringHarbor,N.Y.中,包括聚合酶链式反应、合成方法和任何其他提供所需核苷酸序列的合适方法。
在特定实施方案中,宿主细胞是哺乳动物细胞,即宿主细胞系是哺乳动物细胞系。例如,宿主细胞,即宿主细胞系,是人类细胞,例如人类胚胎细胞系。在本文所述的任一方面的特定实施方案中,宿主细胞系是人类胚胎肾细胞系。
涉及rAAV生产的细胞培养工作,包括贴壁细胞的扩增、接种和转染,既繁琐又耗费资源。因此,由于其可扩展性和成本效益,使用悬浮在水性液体培养基中的细胞(“悬浮细胞”)进行rAAV载体生产是可取的。因此,在本文所述的任一方面的特定实施方案中,宿主细胞系可为悬浮适应的。例如,可用悬浮的核酸载体转染宿主细胞。
用于AAV生产的组分(例如,腺病毒E1a、E1b、E2a和/或E4ORF6基因产物、rep或其片段、帽、表达盒以及任何其他所需的辅助功能)可被递送至以任何遗传元件的形式单独或组合包装宿主细胞,所述遗传元件转移其上携带的序列。如本文所用,遗传元件(载体)包括例如裸DNA、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、游离体、非病毒递送载体中的蛋白质(例如,基于脂质的载体)、病毒等,所述遗传元件传输其上携带的序列。选择的载体可以通过任何合适的方法递送,包括转染、电穿孔、脂质体递送、膜融合技术、高速DNA包被的小球、病毒感染和原生质体融合。用于构建本发明任何实施方案的方法是核酸操作技术人员已知的且包括基因工程、重组工程和合成技术。参见,例如,Sambrook等人,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.。参见,例如,K.Fisher等人,J Virol.,70:520-532(1993)及美国专利5,478,745。
一种或多种腺病毒基因可以稳定地整合到宿主细胞的基因组中或稳定地表达为附加体。每个腺病毒基因的启动子可以独立地选自组成型启动子、诱导型启动子或天然腺病毒启动子。例如,启动子可以通过生物体或细胞的特定生理状态(即,通过分化状态或在复制或静止细胞中)或通过外源添加的因子进行调节。此类因子的实例包括但不限于抗生素、细胞因子、生长因子、激素等。
在一个实施方案中,稳定的或瞬时的宿主细胞将包含在诱导型或可调节启动子控制下的所需组分。然而,所需的组分可以在组成型启动子或合成启动子的控制下。
可调节的启动子允许通过外源提供的化合物、环境因素(例如温度)或特定生理状态的存在(例如急性期、细胞的特定分化状态或仅在复制细胞中)控制基因表达。可调节启动子和系统可从多种商业来源获得,包括但不限于Invitrogen、Clontech和Ariad。许多其他系统业已描述且可由本领域技术人员容易地选择。由外源提供的启动子调节的启动子的例子包括锌诱导型绵羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(Dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统[WO 98/10088];蜕皮激素昆虫(ecdysone insect)启动子[No等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA、93:3346-3351(1996)],四环素抑制系统[Gossen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89:5547-5551(1992)],四环素诱导系统[Gossen等人,Science,268:1766-1769(1995),亦参见Harvey等人,Curr.Opin.Chem.Biol.,2:512-518(1998)],RU486诱导系统[Wang等人,Nat.Biotech.,15:239-243(1997)及Wang等人,GeneTher.,4:432-441(1997)]和雷帕霉素(rapamycin)诱导系统[Magari等人,JClin.Invest.,100:2865-2872(1997)]。在本文中可能有用的其他类型的诱导型启动子是那些受特定生理状态调节的启动子,例如温度、急性期、细胞的特定分化状态,或仅在复制细胞中。
在某些情况下,使用天然启动子。当希望基因产物的表达应该模拟天然表达时,可以使用天然启动子。当所需转基因的表达必须在时间上或发育上,或以组织特异性方式,或响应特定的转录刺激时,可以使用天然启动子。其他天然表达控制元件,例如增强子元件、多聚腺苷酸化位点或Kozak共有序列也可用于模拟天然表达。
在包括转基因的情况下,转基因可操作地连接到组织特异性启动子。例如,如果需要在骨骼肌中表达,则应使用在肌肉中具有活性的启动子。这些包括来自编码骨骼β-肌动蛋白、肌球蛋白轻链2A、肌营养不良蛋白、肌肉肌酸激酶的基因的启动子,以及活性高于天然存在的启动子的合成肌肉启动子的非限制性实例(参见Li等人,Nat.Biotech.,17:241-245(1999))。已知组织特异性启动子的实例有肝脏(白蛋白,Miyatake等人,J.Virol.,71:5124-32(1997);乙型肝炎病毒核心启动子,Sandig等人,Gene Ther.,3:1002-9(1996);甲胎蛋白(AFP),Arbuthnot等人,Hum.Gene Ther.,7:1503-14(1996),骨骨钙素(Stein等人,Mol.Biol.Rep.,24:185-96(1997));骨唾液酸蛋白(Chen等人,J.Bone Miner.Res.,11:654-64(1996)),淋巴细胞(CD2,Hansal等人,J.Immunol.,161:1063-8(1998));免疫球蛋白重链;T细胞受体α链),如神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子的神经元(Andersen等人,Cell.Mol.Neurobiol.,13:503-15(1993)),神经丝轻链基因(Piccioli等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:5611-5(1991)),和神经元特异性vgf基因(Piccioli等人,Neuron,15:373-84(1995))等。关于肝脏特异性启动子,例子包括HLP,LP1,HCR-hAAT,ApoE-hAAT和LSP。这些启动子在以下参考文献中有更详细的描述:HLP:McIntosh J.等人,Blood2013Apr.25,121(17):3335-44;LP1:Nathwani等人,Blood.2006April 1,107(7):2653-2661;HCR-hAAT:Miao等人,Mol Ther.2000;1:522-532;ApoE-hAAT:Okuyama等人,HumanGene Therapy,7,637-645(1996);及LSP:Wang等人,Proc Natl Acad Sci USA.1999March30,96(7):3906-3910。亦参见Brown H.C.等人,Mol.Ther.:Meth.Clin.Dev.Vol.9,pp:57-91、June 2018。
合适的可激活和组成型启动子的例子是本领域技术人员已知的。在另一个备选方案中,选定的稳定宿主细胞可以包含在组成型启动子控制下的选定组分和在一个或多个诱导型启动子控制下的其他选定组分。例如,可以产生稳定的宿主细胞,其衍生自293细胞(其包含在组成型启动子控制下的E1辅助功能),但其包含在诱导型启动子控制下的rep和/或cap蛋白。本领域技术人员还可以产生其他稳定的宿主细胞。
闭端线性双链核酸
封闭线性DNA分子通常包含共价闭合末端,也称为发夹环,其中互补DNA链之间不存在碱基配对。发夹环连接互补DNA链的末端。这种类型的结构通常在染色体的端粒末端形成,以通过将末端核苷酸隔离在封闭结构中来防止染色体DNA的丢失或损坏。在本文所述的封闭线性DNA分子的实例中,发夹环位于互补碱基配对DNA链的两侧,形成封闭线性(cl)DNA形结构。封闭线性DNA分子包括杠铃形DNA。
一种或多种核酸a)至c),即:a)编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列;b)编码rep和cap基因的核酸序列,和c)包含至少一个ITR和可操作地连接到一个或多个调节元件的异源转基因的闭端线性双链rAAV载体核酸可以存在于封闭线性双链核酸上。此类核酸可通过多种已知方法产生,包括体外无细胞合成和体内方法。
在特定实施方案中,包含a)、b)或c)中的一种或多种的核酸序列是扩增的线性开放末端DNA,具有平端或突出端,并且合成的发夹分子连接到一端或两端以形成封闭末端线性DNA,其包含a)、b)或c)中的一种或多种核酸。使用本领域技术人员熟知的方法将未连接的发夹纯化掉。DNA可以通过PCR扩增并连接成双链形式。
产生共价封闭末端的线性双链核酸的一种方法是通过在前体分子中掺入蛋白端粒酶结合位点使得蛋白端粒酶结合位点位于感兴趣的核酸的侧翼。感兴趣的核酸可以包含a)、b和c)中的一种或多种,即a)、b)和c);a)、b)和c)的任意组合;或仅a)、仅b)、或仅c);以及将分子暴露于蛋白端粒酶,从而在所述位点切割和连接DNA。无细胞体外合成的非限制性实例描述于例如美国专利9,109,250;美国专利第6,451,563号;Nucleic AcidsRes.2015Oct 15;43(18):e120;43(18):e120;美国专利9499847;美国专利申请号15/508,766;PCT/GB2017/052413;和Antisense&nucleic acid dr ug development11:149–153(2001);通过引用以其整体并入本文。来自无细胞体外合成的DNA没有任何原核DNA修饰。
重组AAV载体基因组可以设计为具有野生型ITR、合成ITR或DD ITR或其组合中的至少一种,其侧翼为包含例如telRL的蛋白端粒酶位点的不完全回文结构。当被端粒酶切割以形成共价闭合末端时,所述模板用于产生封闭线性双链核酸载体。在一个实施方案中,所述载体包含两个DD ITR、一个表达盒,并且在DD ITR的每一侧的侧翼是端粒酶靶位点,其可以被端粒酶切割以形成共价闭合末端。闭合的线性DNA包含一半的蛋白端粒酶结合位点。
此外,可以使用原核系统。在溶原性细菌中,噬菌体N15作为具有共价闭合末端的线性染色体外DNA存在(参见Rybchin VN、Svarchevsky AN(1999)The plasmid prophageN15:a linear DNA with covalently closed ends.Mol Microbiol 33:895–903)。所述DNA由切割连接反应产生,所述反应由单一酶、蛋白端粒酶发挥作用,例如,TelN(蛋白端粒酶)[Deneke J、Ziegelin G、Lurz R、Lanka E(2000)The protelomerase of temperateEscherichia coli phage N15 has cleaving-joining activity.Proc Natl Acad Sci US A 97:7721–7726]。TelN等蛋白端粒酶识别双链DNA中的靶序列。目标位点是一个不完全的回文结构,称为telRL,其由两半telR和telL形成,对应于线性前噬菌体的共价闭合端。所述酶切割两条DNA链并连接产生的末端以形成共价闭合的发夹结构。得到的DNA分子有两个发夹环。TelN能够线性化含有telRL位点的重组质粒[Deneke J等人,(2000).Proc NatlAcad Sci U S A 97:7721–7726]。因此,人们可以在质粒DNA上使用这种酶,以表达于高等生物中。
在特定实施方案中,体内细胞系统用于产生封闭末端线性双链核酸。所述方法包括使用表达如TelN的蛋白端粒酶或其他蛋白端粒酶的细胞,其中蛋白端粒酶基因在可调节启动子的控制下。例如,诱导型启动子,例如小分子调节启动子或温度敏感启动子,例如热激启动子。在充分产生AAV模板DNA或其他感兴趣的核酸或其组合后,可以允许表达将切除感兴趣的核酸的蛋白端粒酶,例如包含来自模板的a)辅助物、b)rep/cap,或c)AAV基因组中的一种或多种的核酸。
在特定实施方案中,体内细胞系统用于产生非病毒DNA载体构建体,用于将预定核酸序列递送到靶细胞中以进行持续表达。非病毒DNA载体包含两个DD-ITR,各自包含:具有A、A'、B、B'、C、C'和D区的反向末端重复;D'区;以及其中,D和D'区为位于A和A'区附近及长度约5至20nt的互补回文序列;预定的核酸序列(例如用于表达的异源基因);其中,两个DD-ITR在共价闭合的非病毒DNA的情况下位于核酸的两侧,并且其中闭合的线性载体在每一端包含1/2蛋白端粒酶结合位点。
本文所述的TelN/telRL系统可用于通过线性化含有一个telRL位点的亲本质粒或通过切除rAAVDNA片段或非病毒载体片段(包括启动子、感兴趣的基因)以产生封闭线性DNA片段,来自亲本质粒的多腺苷酸化信号,具有两个侧翼的ITR,进一步具有两个侧翼各自片段的telRL位点。在一个实施例中,存在至少一个双“D”ITR。由此产生的线性共价闭合DNA分子在体内具有功能。
所述系统包含重组宿主细胞。适用于本生产系统的宿主细胞包括微生物细胞,例如如大肠杆菌细胞的细菌细胞和如酿酒酵母的酵母细胞。也可以使用哺乳动物宿主细胞,包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,例如K1谱系(ATCC CCL 61),包括Pro5变体(ATCC CRL1281);来自CV-1谱系(ATCC CCL 70)、COS-1谱系(ATCC CRL 1650)和COS-7谱系(ATCC CRL1651)的SV40转化的非洲绿猴肾的成纤维细胞样细胞;鼠L细胞、鼠3T3细胞(ATCC CRL1658)、鼠C127细胞、293谱系的人类胚胎肾细胞(ATCC CRL 1573)、包括HeLa谱系的人类癌细胞(ATCC CCL 2)和IMR-32系神经母细胞瘤细胞(ATCC CCL 127)、SK-N-MC(ATCC HTB 10)和SK-N-SH(ATCC HTB 11)。
宿主细胞被设计为编码至少一种重组酶。宿主细胞也可以设计为编码两种或多种重组酶。术语“重组酶”是指通过切除/插入、倒位、易位和交换在特定靶位点(例如回文序列)催化DNA交换的酶。用于本系统的合适重组酶的实例包括但不限于TelN、Tel、Tel(gp26K02噬菌体)Cre、Flp、phiC31、Int和其他人字形噬菌体整合酶,例如phi 80、HK022和HP1重组酶。这些重组酶中的每一个的靶序列分别是:
telRL位点:
TATCAGCACACAATTGCCCATTATACGCGCGTATAATGGACTATTGTGTGCTGA(SEQ ID NO:15);
pal位点:ACCTATTTCAGCATACTACGCGCGTAGTATGCTGAAATAGGT(SEQ ID NO:16);
φK02 telRL位点:CCATTATACGCGCGTATAATGG(SEQ ID NO:17);
loxP位点:TAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT(SEQ ID NO:18);
FRT位点:GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC(SEQ ID NO:19)
phiC31 attP位点:
CCCAGGTCAGAAGCGGTTTTCGGGAGTAGTGCCCCAACTGGGGTAACCTTTGAGTTCTCTCAGTT GGGGGCGTAGGGTCGCCGACAYGACACAAGGGGTT(SEQ ID NO:20);和
λattP位点:
TGATAGTGACCTGTTCGTTGCAACACATTGATGAGCAATGCTTTTTTATAATGCCAACTTTGTACAAAAAAGCTGAACGAGAAACGTAAAATGATATAAA(SEQ ID NO:21)。
重组酶的表达受任何调节或诱导型启动子的控制,即在特定物理或化学条件或刺激下被激活的启动子。合适的启动子的实例包括热调节的启动子,例如λpL启动子、IPTG调节的lac启动子、葡萄糖调节的ara启动子、T7聚合酶调节的启动子、冷激(cold-shock)诱导的cspA启动子、pH诱导的启动子,或其组合,例如tac(T7和lac)双重调节启动子。
产生缺乏细菌序列的共价封闭末端线性DNA的替代方法在本领域中是已知的,例如,通过从质粒形成小环DNA(例如,如美国专利8,828,726和美国专利7,897,380中所述,其各自的内容通过引用以整体并入)。例如,一种无细胞合成方法结合使用两种酶——Phi29DNA聚合酶和蛋白端粒酶,并产生高保真、共价闭合的线性DNA构建体。所述构建体不含抗生素抗性标记,因此消除了这些序列的包装。所述过程可以在2周的过程中以商业规模扩增AAV基因组DNA,并保持病毒生产所需的ITR序列。
Phi29 DNA聚合酶用于通过滚环扩增扩增双链DNA,蛋白端粒酶用于生成共价闭合的线性DNA,再加上简化的纯化过程,得到仅包含感兴趣序列的纯DNA产物。Phi29 DNA聚合酶具有高保真度(1×106至1×107)和高合成能力(约70kbp)。这些特性使这种聚合酶特别适用于大规模生产GMP DNA。蛋白端粒酶(也称为端粒分解酶)催化线性DNA上共价闭合的发夹末端的形成,并已在一些噬菌体、细菌质粒和细菌染色体中鉴定。一对蛋白端粒酶识别反向回文DNA识别序列并催化链断裂、链交换和DNA连接以产生闭合的线性发夹末端。这些封闭末端结构的形成使DNA对核酸外切酶活性具有抗性,从而可以进行简单的纯化,并可以提高表达的稳定性和持续时间。
蛋白端粒酶结合位点
在一个实施方案中,DNA构建体包含蛋白端粒酶结合位点且共价闭合末端由蛋白端粒酶活性(例如体外)形成。在美国专利9,499,847中提供用于本发明的蛋白端粒酶结合位点和相应的蛋白端粒酶,其内容通过引用整体并入本文。本发明中使用的蛋白端粒酶靶序列优选包含长度至少为14个碱基对的双链回文(完全反向重复)序列。优选的完全反向重复序列包括SEQ ID NO:1至6的序列及其变体。SEQ ID NO:1(NCATNNTANNCGNNTANNATGN)是22个碱基共有序列,用于中温噬菌体完全反向重复序列。完全反向重复的碱基对在不同噬菌体之间的某些位置上是保守的,而可能在其他位置上序列具有灵活性。因此,SEQ ID NO:1是用于本发明方法中的噬菌体蛋白端粒酶的完全反向重复序列的最小共有序列。
在由SEQ ID NO:1定义的共有序列中,SEQ ID NO:2(CCATTATACGCGCGTATAATGG)是一个完全的反向重复序列,可与大肠杆菌噬菌体N15和克雷伯氏菌噬菌体(Klebsiellaphage)Phi KO2蛋白端粒酶一起使用。同样在由SEQ ID NO:1定义的共有范围内,SEQ IDNOs:3至5:SEQ ID NO:3(GCATACTACGCGCGTAGTATGC)、SEQ ID NO:4(CCATACTATACGTATAGTATGG)、SEQ ID NO:5(GCATACTATACGTATAGTATGC)是分别与来自耶尔森氏菌噬菌体(Yersinia phage)PY54、嗜盐单胞菌噬菌体(Halomonas phage)phiHAP-1和弧菌噬菌体(Vibrio phage)VP882的蛋白端粒酶一起使用的特别优选的完美反向重复序列。SEQ ID NO:6(ATTATATATATAAT)是用于伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)蛋白端粒酶的特别优选的完全反向重复序列。这个完全反向重复序列来自于包含在伯氏疏螺旋体中的线性共价闭合质粒lpB31.16。所述14个碱基序列比噬菌体的22bp共有完全反向重复序列(SEQ ID NO:1)短,表明细菌蛋白端粒酶在特定靶序列要求上可能与噬菌体蛋白端粒酶不同。然而,所有蛋白端粒酶靶序列共享完全反向重复的共同结构基序。
完全反向重复序列的长度可以大于22bp,这取决于本发明方法中使用的特定蛋白端粒酶的要求。因此,在一些实施方案中,完全反向重复的长度可为至少30、至少40、至少60、至少80或至少100个碱基对。这种完全反向重复序列的实例包括SEQ ID NOs:7至9及其变体。SEQ ID NO:7(GGCATAC TATACGTATAGTATGCC);SEQ ID NO:8(ACCTATTTCAGCATACTACGCGCG-TAGTATGCTGAAATAGGT);SEQ ID NO:9(CCTATATTGGGCCACCTATGTATG-CACAGTTCGCCCATACTATACGTATAGTATGGGCGAACTGTGCATACATAGGTGGCCCAATATAGG)。SEQ ID NOs:7至9及其变体特别优选分别与来自弧菌噬菌体VP882、耶尔森氏菌噬菌体PY54和嗜盐单胞菌噬菌体phi HAP-1的蛋白端粒酶一起使用。
完全反向重复序列可以侧接额外的反向重复序列。侧翼反向重复可为完全的或不完全的重复,即可为完全对称的或部分对称的。侧翼的反向重复序列可以与中央回文连续或不连续。蛋白端粒酶靶序列可以包含不完全反向重复序列,所述不完全反向重复序列包含长度为至少14个碱基对的完全反向重复序列。一个例子是SEQ ID NO:14。不完全反向重复序列可以包含长度至少22个碱基对的完全反向重复序列。一个例子是SEQ ID NO:10。
在特定实施方案中,蛋白端粒酶靶序列包含SEQ ID NOs:10至14的序列或其变体。SEQ ID NO:10:(TATCAGCACACAATTGCCCATTATACG-CGCGTATAATGGACTATTGTGTGCTGATA);SEQID NO:11(ATGCGCGCATCCATTATACGCGCGTATAATGGCGATAATACA);SEQ ID NO:12(TAGTCACCTATTTCAGCATACTACGCGCGTAGTATGCTGAAATAGG TTACTG);SEQ ID NO:13:(GGGATCCCGTTCCATACATACATGTATCCATGTGGCATACTATACGTATAGTATGCCGATGTTACATATGGTATCATTCGGGATCCCGTT);SEQ ID NO:14(TACTAAATAAATATTATATATATAATTTTTTATTAGTA)。
SEQ ID NOs:10至14的序列包含如上所述的完全反向重复序列,并且另外包含来自相关生物的侧翼序列。包含SEQ ID NO:10的序列或其变体的蛋白端粒酶靶序列优选与大肠杆菌N15 TelN蛋白端粒酶及其变体组合使用。包含SEQ ID NO:11的序列或其变体的蛋白端粒酶靶序列优选与克雷伯氏菌噬菌体Phi K02蛋白端粒酶及其变体组合使用。包含SEQID NO:12的序列或其变体的蛋白端粒酶靶序列优选与耶尔森氏菌噬菌体PY54蛋白端粒酶及其变体组合使用。包含SEQ ID NO:13的序列或其变体的蛋白端粒酶靶序列优选用于与弧菌噬菌体VP882蛋白端粒酶及其变体组合使用。包含SEQ ID NO:14的序列或其变体的蛋白端粒酶靶序列优选用于与伯氏疏螺旋体蛋白端粒酶组合。
上述任何回文或蛋白端粒酶靶序列的变体包括其同源物或突变体。突变体包括相对于天然序列的截短、替换或缺失。变体序列是其存在于DNA模板中允许其通过蛋白端粒酶的酶活性转化为封闭线性DNA的任何序列。这可以很容易地通过使用适当的检测来确定封闭线性DNA的形成。可以使用本领域中描述的任何合适的测定。在Deneke等人,PNAS(2000)97,7721-7726中描述了合适测定的例示。在特定实施方案中,所述变体允许与用天然序列观察到的相比的蛋白端粒酶结合和活性。本文所述的回文序列的优选变体的实例包括截短的回文序列,其保留完全的重复结构,并且仍然能够允许形成封闭线性DNA。然而,只要能够充当蛋白端粒酶活性的底物,变体蛋白端粒酶靶序列可以经修饰以不再保持完全的回文。
应当理解,本领域技术人员将能够基于上述结构原理容易地鉴定用于本发明的合适的蛋白端粒酶靶序列。可以使用上述测定筛选候选蛋白端粒酶靶序列的促进封闭线性DNA形成的能力。
共价封闭线性DNA构建体的生成
本文所述的共价闭合载体可以在体外或体内产生。载体是能够在靶细胞中表达转基因的共价封闭线性双链载体。用于产生封闭的线性表达盒DNA(例如包含本文所述的ITR)的体外方法的一个实例包括a)在促进所述模板扩增的条件下,在存在一种或多种引物的情况下,将包含至少一个在任一侧侧接有蛋白端粒酶靶序列的表达盒的DNA模板与至少一种DNA聚合酶接触;b)在促进形成封闭线性表达盒DNA的条件下,使a)中产生的扩增DNA与至少一种蛋白端粒酶接触。封闭的线性表达盒DNA产物可包含、由或基本上由可操作地连接到感兴趣的编码序列的真核启动子和任选的真核转录终止序列组成。封闭的线性表达盒DNA产物可以另外缺少一种或多种细菌或载体序列,通常选自:(i)细菌复制起点;(ii)细菌选择标记(通常是抗生素抗性基因)和(iii)未甲基化的CpG基序。
如上所述,任何包含至少一个蛋白端粒酶靶序列的DNA模板都可以根据本发明的方法进行扩增。因此,尽管优选生产治疗性DNA分子,例如用于DNA疫苗或其他治疗性蛋白质和核酸,但本发明的方法可用于生产任何类型的封闭线性DNA。DNA模板可为双链(ds)或单链(ss)DNA。双链DNA模板可为开放环状双链DNA、闭合环状双链DNA、开放线性双链DNA或封闭线性双链DNA。优选地,模板是闭合环状双链DNA。闭环dsDNA模板特别优选与RCA(滚环扩增)DNA聚合酶一起使用。环状dsDNA模板可为质粒或其他载体的形式,通常用于容纳用于细菌繁殖的基因。因此,本发明的方法可用于扩增任何市售的质粒或其他载体,例如市售的DNA药物,接着将扩增的载体DNA转化为封闭线性DNA。
开环dsDNA可用作模板,其中DNA聚合酶是链置换聚合酶,可从有缺口的DNA链开始扩增。在所述实施方案中,模板可以预先与一种或多种酶一起培育,所述酶在模板中的一个或多个位点切割DNA链。封闭的线性dsDNA也可以用作模板。封闭线性dsDNA模板(起始材料)可能与封闭线性DNA产物相同。当封闭的线性DNA用作模板时,其可以在促进模板DNA扩增的条件之前或期间在变性条件下培育以形成单链环状DNA。在一个实施方案中,闭端线性双链体DNA在真核细胞例如昆虫细胞中产生,如PCT公开号WO 2019032102和WO 2019169233中所述。在一个实施方案中,DNA并非于真核细胞中产生且DNA缺乏真核序列。在一个实施方案中,封闭末端线性双链体DNA载体如PCT公开号WO 2019143885中所述产生。
如上所述,DNA模板通常包含如上所述的表达盒,即包含、由或基本上由可操作地连接到编码感兴趣蛋白质的序列的真核启动子和任选的真核转录终止序列组成。任选地,表达盒可为如上定义的最小表达盒,即缺少一种或多种细菌或载体序列,通常选自:(i)细菌复制起点;(i i)细菌选择标记(通常是抗生素抗性基因)和(iii)未甲基化的CpG基序。
细胞培养基
如本文所用,术语“细胞培养基”和“培养基”是指用于体外培养细胞的营养液,其通常提供来自以下一种或多种类别的至少一种成分:1)能量来源,通常为碳水化合物的形式,例如葡萄糖;2)一种或多种必需氨基酸,通常是二十种氨基酸的基本组合;3)低浓度的所需维生素和/或其他有机化合物;4)游离脂肪酸;5)微量元素,其中微量元素被定义为无机化合物或天然存在的元素,通常需要非常低的浓度,通常在微摩尔范围内。营养液可以任选地补充有额外的组分以优化细胞的生长和/或转染。
本发明中的细胞培养物是在适合于被培养的特定宿主细胞的培养基中制备的。可用于培养特定细胞类型的合适细胞培养基对于本领域技术人员来说是显而易见的。例示性的市售培养基包括例如Ham's F 10(SIGMA)、Minimal Essential Medium(MEM、SIGMA)、RPMI-1640(SIGMA)、Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM、SIGMA);含有10%胎牛血清的Iscove modified Dulbecco medium(Gibco)(参见,Xiao等人,Production ofHigh-Titer Recombinant Adeno-Associated Virus Vectors in the Absence ofHelper Adenovirus、J Virol、72:2224-2232(1998))以及DMEM/F 12(LifeTechnologies)。任何这些或其他合适的培养基都可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(例如但不限于胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(例如HEPES)、核苷(如腺苷和胸苷)、抗生素(如嘌呤霉素(puromycin)、新霉素(neomycin)、潮霉素(hygromycin)、杀稻瘟菌素(blasticidin)或庆大霉素(GentamycinTM))、微量元素(定义为通常以微摩尔浓度存在的无机化合物范围)脂质(例如亚油酸或其他脂肪酸)及其合适的载体,以及葡萄糖或等效能源,和/或如本文所述进行修饰以促进具有低甘露糖含量的重组糖蛋白的产生。
根据所使用的特定细胞系或方法的要求,培养基可以包含血清添加剂,例如胎牛血清,或血清替代物。血清替代品(用于细胞无血清生长)的例子是TCHTM、TM-235TM和TCHTM;这些产品可从Celox(St.Paul、Minn.)和KOSR(knockout(KO)血清替代品;LifeTechnologies)商购获得。
在任一方面的特定实施方案中,宿主细胞可以在无血清、无蛋白质、无生长因子和/或无蛋白胨的培养基中生长。用于培养基的术语“无血清”通常包括任何不含血清的哺乳动物细胞培养基,例如胎牛血清(FBS)。应用于培养基的术语“无生长因子”包括未添加外源生长因子(例如,胰岛素、IGF-1)的任何培养基。应用于培养基的术语“无蛋白胨”包括未添加外源蛋白水解物的任何培养基,例如动物和/或植物蛋白水解物。
在任一方面的一些实施方案中,细胞培养基是无血清的。“无血清”应理解为培养基中血清的浓度优选小于0.1%(v/v)血清,更优选小于0.01%(v/v)血清。“基本上无血清”是指存在少于约2%(v/v)的血清,更优选少于约1%的血清,更优选少于约0.5%(v/v)的血清存在,还更优选存在少于约0.1%(v/v)的血清。当使用不含血清的确定培养基时,所述培养基通常富含特定的氨基酸、维生素和/或微量元素(参见,例如,Mather等人的美国专利5,122,469和Keen等人的美国专利5,633,162)。
“培养”或“培育”(在宿主细胞或宿主细胞系的生长、转化和/或维持方面可互换使用)是在无菌、温度、pH、大气气体含量(例如氧气、二氧化碳、二氮)、湿度、培养容器、培养体积、传代、运动和其他适合预期目的和哺乳动物细胞培养领域常规已知的参数。
在特定实施方案中,所述培养基包含浓度为约1mM至约100mM的氨基酸。例如,所述培养基包含浓度为约1mM至约20mM,例如约5mM至约15mM的氨基酸。在特定实施方案中,所述培养基包含浓度为约7.5mM至约12.5mM的氨基酸。例如,所述培养基包含浓度为约10mM的氨基酸。
在特定实施方案中,培养基包含L-谷氨酰胺或包含L-谷氨酰胺的二肽。包含L-谷氨酰胺的例示性二肽是L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(例如,GLUTAMAXTM)。一般而言,所述培养基包含浓度为约1mM至约100mM的L-谷氨酰胺或包含L-谷氨酰胺的二肽。例如,所述培养基包含L-谷氨酰胺或包含浓度为约1mM至约20mM,例如约5mM至约15mM的L-谷氨酰胺的二肽。在特定实施方案中,所述培养基包含浓度为约7.5mM至约12.5mM的L-谷氨酰胺或包含L-谷氨酰胺的二肽。例如,所述培养基包含L-谷氨酰胺或包含浓度为约10mM的L-谷氨酰胺的二肽。
在特定实施方案中,所述培养基还可以包含非离子表面活性剂多元醇或洗涤剂。例示性非离子洗涤剂包括但不限于聚山梨醇酯,例如聚山梨醇酯20(TWEEN 20)、聚山梨醇酯28、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯81和聚山梨醇酯85;泊洛沙姆,例如泊洛沙姆188、泊洛沙姆407;聚乙烯聚丙二醇;或聚乙二醇(PEG)。在任一方面的一些实施方案中,非离子表面活性剂多元醇或洗涤剂为泊洛沙姆。例示性泊洛沙姆包括但不限于泊洛沙姆188(P188)、F127、F38、F68、F87、F108、10R5、17R2、17R4、25R2、25R4、31R1、F108铸造实体(Cast Solid)表面活性剂、F108NF、F108 Pastille、F108NF Prill泊洛沙姆338、F127 NF、F127 NF 500BHT Prill、F127 NFPrill泊洛沙姆407、F38 Pastille、F68LF Pastille、F68 NF、F68 NF Prill、F68 Pastille、F77、F77 Micropastille、F87 NF、F87 NF Prill泊洛沙姆237、F88、F 88Pastille、F 98、FT L61、L10、L101、L121、L31、L35、L43、L61、L62、L62 LF、L62D、L64、L81、L92、L44 NF INH surfactant泊洛沙姆124、N3、P103、P104、P105、P123表面活性剂、P65、P84、P85等。
所述培养基中的非离子表面活性剂多元醇或洗涤剂的量可为至少约0.01%、0.015%、0.02%、0.025%、0.03%、0.035%、0.04%、0.045%、0.05%(w/w、w/v或v/v)或更多。举例而言,所述培养基中的非离子表面活性剂多元醇或洗涤剂的量可为约0.001%至约1%(重量/体积)的范围内。例如,培养基包含浓度为约0.01%至约0.5%、约0.015%至约0.45%、约0.02%至约0.4%或约0.025%至约0.35%、0.1%的非离子表面活性剂多元醇或洗涤剂。例如,所述培养基包含浓度为约0.01%、约0.015%、约0.02%、约0.025%、约0.03%、约0.035%、约0.04%、约0.045%或约0.05%的非离子表面活性剂多元醇或洗涤剂。
在特定实施方案中,所述培养基包含消泡剂。术语“消泡剂”是指当添加到流体中时可以显着降低流体的表面活性从而显着防止流体起泡的化学物质。适用于本发明的例示性消泡剂包括但不限于高分子量硅氧烷和本领域熟知的用于此类用途的其他材料。
所述培养基中消泡剂的量可为至少约0.01%、0.015%、0.02%、0.025%、0.03%、0.035%、0.04%、0.045%、0.05%(w/w、w/v或v/v)或更多。例如,所述培养基中消泡剂的量可以在约0.001%至约1%(重量/体积)的范围内。例如,所述培养基包含浓度为约0.01%至约0.5%、约0.015%至约0.45%、约0.02%至约0.4%、或约0.025%至约0.35%、0.1%。例如,所述培养基包含浓度为约0.01%、约0.015%、约0.02%、约0.025%、约0.03%、约0.035%、约0.04%、约0.045%或约0.05%。
如本文所用,术语“细胞系”是指能够在体外连续或延长生长和分裂的细胞群。通常,细胞系是源自单个祖细胞的克隆群体。本领域还已知,在这种克隆群体的储存或转移过程中,核型可以发生自发的或诱导的变化。因此,源自所提及的细胞系的细胞可能与祖细胞或培养物不完全相同,所提及的细胞系包括此类变体。
宿主细胞的裂解
在任一方面的特定实施方案中,所述方法包括裂解转染的宿主细胞。在细胞培养物中裂解宿主细胞的方法为本领域众所周知的。例如,可以将非离子表面活性剂添加到细胞培养物或细胞培养物上清液中。通常,将非离子表面活性剂添加到细胞培养物中至最终浓度为至少约0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%、0.5%、0.55%、0.6%、0.65%、0.7%、0.75%、0.8%、0.85%、0.9%、0.95%、1%(w/v、w/w或v/v)或更高。例如,将非离子表面活性剂添加到细胞培养物中至最终浓度为约0.05%至约1%、约0.1%至约0.95%、约0.15%至约0.9%、约0.2%约0.85%、约0.25%至约0.8%、约0.3%至约0.75%、约0.35%至约0.65%、约0.4%至约0.6%或0.45%至约0.55%。在一些实施方案中,将非离子表面活性剂添加到细胞培养物中至最终浓度为约0.05%、0.1%、约0.15%、约0.2%、约0.25%、约0.3%、约0.35%、约0.4%、约0.45%、约0.5%、约0.55%、约0.6%、约0.65%、约0.7%、约0.75%、约0.8%、约0.85%、约0.9%、约0.95%或约1%。例如,可以将非离子表面活性剂添加到细胞培养物中至最终浓度为约0.5%。
通常,允许非离子表面活性剂与细胞培养物混合足够长的时间以裂解存在于细胞培养物或细胞培养上清液中的宿主细胞。例如,非离子表面活性剂与细胞培养物混合约15分钟至约2小时。在一些实施方案中,将非离子表面活性剂与细胞培养物混合约30分钟至约60分钟的时间。
混合可以在环境温度或升高的温度下进行。例如,与非离子表面活性剂的混合可以在约15℃至约37℃的温度下进行。在一些实施例中,与非离子表面活性剂的混合可以在约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃或约37℃的温度下进行。
应注意,任何所需的非离子表面活性剂都可用于裂解转染的宿主细胞。用于裂解转染的宿主细胞的例示性非离子表面活性剂和非离子表面活性剂类别可以包括聚芳基苯酚聚乙氧基醚;聚烷基酚聚乙氧基醚;饱和脂肪酸的聚乙二醇醚衍生物;不饱和脂肪酸的聚乙二醇醚衍生物;脂肪醇的聚乙二醇醚衍生物;脂环族醇的聚乙二醇醚衍生物;聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯;烷氧基化植物油;烷氧基化乙炔二醛(acetylenic dial);聚烷氧基化烷基酚;脂肪酸烷氧基化物;山梨糖醇烷氧基化物;山梨醇酯;C8至C22烷基或链烯基多苷;聚烷氧基苯乙烯基芳基醚;烷基胺氧化物;嵌段共聚物醚;聚烷氧基化脂肪甘油酯;聚亚烷基二醇醚;线性脂肪族或芳香族聚酯;有机硅;多芳基酚;山梨醇酯烷氧基化物;和乙二醇的单酯和二酯及其混合物;乙氧基化三苯乙烯基苯酚;乙氧基化脂肪醇;乙氧基化月桂醇;乙氧基化蓖麻油;和乙氧基化壬基苯酚;烷氧基化的醇、胺或酸。在任一方面的一些实施方案中,用于裂解宿主细胞的非离子表面活性剂选自由聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、烷基葡糖苷、烷基酚聚氧乙烯醚,优选聚山梨醇酯,聚氧乙烯烷基苯基醚及其任何组合所组成的群组。
特定例示性非离子表面活性剂包括但不限于ECOSURF EH-9、聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20(TWEEN 20)、聚山梨醇酯28、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯81和聚山梨醇酯85)、ECOSURF EH-14、TWEEN 60非离子洗涤剂、PPG-PEG-PPG Pluronic 10R5、聚氧乙烯(18)十三烷基醚、聚氧乙烯(12)十三烷基醚、MERPOL SH表面活性剂、MERPOL OJ表面活性剂、MERPOL HCS表面活性剂、IGEPAL CO-720、IGEPAL CO-630、IGEPAL CA-720、Brij S20、Brij S10、Brij 010、Brij C10、BRIJ 020、TERGITOL 15-S-7、ECOSURF SA-15、TERGITOL15-S-9、TERGITOL 15-S-12、TERGITOL L-64、TERGITOLNP-7、TERGITOL NP-8、TERGITOL NP-9、TERGITOL NP-9.5,TERGITOL NP-10、TERGITOL NP-11、TERGITOL NP-12和TERGITOLNP-13及其任何组合。在一些实施方案中,用于裂解转染宿主细胞的非离子表面活性剂不是Triton X-100。
在一些实施方案中,可添加两性离子表面活性剂至细胞培养物中以裂解转染的宿主细胞。例示性的两性离子表面活性剂包括但不限于磺酸盐,例如CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐)、CHAPSO(3-{(3-胆酰胺丙基)二甲基铵}-2-羟基-l-丙烷磺酸盐)、3-(癸基二甲基铵)丙磺酸盐、3-(十二烷基二甲基铵)丙磺酸盐、3-(N,N-二甲基肉豆蔻基铵)丙磺酸盐、3-(N,N-二甲基十八烷基铵)丙磺酸盐、3-(N,N-二甲基辛基铵)丙磺酸盐和3-(N,N-二甲基棕榈基铵)丙磺酸盐;甜菜碱(sultaine),例如椰油酰胺丙基羟基甜菜碱(sultaine);甜菜碱(betaine),例如椰油酰胺丙基甜菜碱(betaine);和磷酸盐,例如卵磷脂。
在一些实施方案中,表面活性剂,例如两性离子表面活性剂可为氧化胺表面活性剂。例如,可以将氧化胺表面活性剂添加到细胞培养物中以裂解宿主细胞。可用于本文所述方法的氧化胺表面活性剂可为三烷基胺N-氧化物,例如式R1R2R3NO的氧化胺,其中R1是取代或未取代的烷基或烯基,含有约8至约30个碳原子;R2和R3独立地为取代或未取代的含有约1至约18个碳原子的烷基或烯基。使用的三烷基胺N-氧化物和三烷基胺N-氧化物表面活性剂的非限制性实例描述于WO1998055581中,其通过引用整体并入本文。
裂解物可包含杂质,例如宿主细胞DNA(hcDNA)。因此,所述方法可以包括在分离/纯化rAAV之前从裂解物中去除或减少杂质例如hcDNA的量的裂解后步骤。用于减少细胞培养物或细胞培养上清液中宿主细胞DNA量的方法和组合物在本领域中是众所周知的。例如,可以将阳离子胺或核酸酶添加到裂解物中。
在一些实施方案中,裂解后步骤包括添加选择性沉淀剂以从裂解物中减少或去除杂质例如hcDNA。如本文所用,“选择性沉淀剂”是指当添加到包含重组病毒颗粒群和污染性核酸分子的制剂中时,将影响至少大量的污染核酸分子远离重组病毒颗粒。用于在裂解后步骤中添加到裂解物中的例示性试剂包括但不限于十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基氯化吡啶鎓、苯扎氯铵(benzethonium chloride)、十四烷基三甲基氯化铵、聚乙烯亚胺及其组合。
在一些实施方案中,将例如核酸内切酶的核酸酶添加到裂解物中以减少或去除例如hcDNA的杂质。例示性核酸内切酶包括源自原核生物和真核生物的核酸内切酶。在一些实施方案中,核酸酶是或salt活性核酸酶(salt active nuclease,SAN)。
通常,将核酸酶添加到裂解物中至最终浓度为至少约0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%、0.5%、0.55%、0.6%、0.65%、0.7%、0.75%、0.8%、0.85%、0.9%、0.95%、1%(w/v、w/w或v/v)或更高。例如,将核酸酶添加到裂解物中至终浓度为约0.05%至约1%、约0.1%至约0.95%、约0.15%至约0.9%、约0.2%至约0.85%约0.25%至约0.8%、约0.3%至约0.75%、约0.35%至约0.65%、约0.4%至约0.6%、约0.45%至约0.55%、约0.05%至约0.4%,或约0.2%至约0.4%。在一些实施方案中,将核酸酶添加到裂解物中至终浓度为约0.05%、0.1%、约0.15%、约0.2%、约0.25%、约0.3%、约0.35%、约0.4%、约0.45%、约0.5%、约0.55%、约0.6%、约0.65%、约0.7%、约0.75%、约0.8%、约0.85%、约0.9%、约0.95%或约1%。例如,可以将核酸酶添加到裂解物中以达到约0.2%的最终浓度。在一些实施方案中,可以将核酸酶添加到裂解物中至约0.05%至约0.4%的最终浓度。
通常,允许试剂或核酸酶与裂解物混合约15、20、30、35、40、45、50、55分钟或更长的时间。在一些实施方案中,使试剂或核酸酶与裂解物混合约10分钟至约4小时的时间。例如,试剂或核酸酶与裂解物混合约15分钟至约3小时。在一些实施方案中,试剂或核酸酶与裂解物混合约30分钟至约120分钟的时间。举例而言,试剂或核酸酶与裂解物混合约30分钟。
在一些实施方案中,所述方法包括澄清裂解物的步骤。例如,所述方法包括通过深度过滤澄清裂解物以产生澄清组合物的步骤。
rAAV的分离/纯化
从宿主细胞系的裂解物中分离/纯化rAAV的几种方法是本领域已知的。这样的方法包括但不限于密度梯度、切向流过滤、亲和层析、尺寸排阻层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析、羟基磷灰石层析、疏水相互作用层析以及其等各种组合。用于从宿主细胞裂解物中分离/纯化rAAV的例示性方法描述于,例如,美国专利6,592,123;美国专利9,862,936;国机专利公开号WO2019/241535;国机专利公开号WO2005/035743;和国机专利公开号WO2019/212921,其全部内容以引用的方式并入本文。
通过以下编号的实施方案1至103描述本发明的态样:
实施方案1:一种产生缺乏原核序列的重组腺相关病毒(rAAV)的方法,包括:(i)任选地于悬浮液中培养人类胚胎细胞系;(ii)以a)编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列;b)编码AAV rep和AAV cap基因的核酸序列,及c)包含至少一个反向末端重复(ITR)序列和可操作地连接到一个或多个调节元件的异源转基因的封闭末端线性双链rAAV载体核酸,转染所述人类胚胎细胞系;(iii)培育所述经转染的人类胚胎细胞系约40至400小时;以及(iv)裂解所述经转染的人类胚胎细胞系且纯化编码所述rAAV的核酸序列,从而产生rAAV。
实施方案2:根据权利要求1所述的方法,其中,所述细胞系的细胞于悬浮液中转染。
实施方案3:根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述人类胚胎细胞系为源自人类胚胎肾细胞系的悬浮适应无血清细胞系。
实施方案4:权利要求1至3中任一项所述的方法,其中,所述AAV rep基因和AAVcap基因来自不同的血清型。
实施方案5:根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中,所述AAV rep基因和AAV cap基因来自相同的血清型。
实施方案6:根据权利要求1至5中任一项所述的方法,其中,所述AAV rep基因为AAV2 rep基因且所述AAV cap基因为AAV8 cap基因。
实施方案7:根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其中,所述AAV ITR和AAVcap基因来自不同的血清型。
实施方案8:根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其中,所述AAV ITR和AAVcap基因来自相同的血清型。
实施方案9:根据权利要求1至8中任一项所述的方法,其中,所述AAV反向末端重复(ITR)序列为腺相关病毒2反向末端重复(ITR)序列。
实施方案10:根据权利要求1至9中任一项所述的方法,其中,所述AAV ITR序列来自AAV 2血清型或选自由AAV 1、3a、3b、4、5、6、7、8、9、10、11和13所组成群组的血清型。
实施方案11:根据权利要求1至10中任一项所述的方法,其中,所述AAV ITR序列为合成的。
实施方案12:根据权利要求1至11中任一项所述的方法,其中,从a)、b)和c)转染的核酸总量小于2μg每1×106个细胞,任选地,从a)、b)和c)转染的核酸总量小于1μg每1×106个细胞。
实施方案13:根据权利要求1至12中任一项所述的方法,其中,a):b):c)的比例为约0.5至1.75:约0.75至2.25:约0.5至1.75(重量:重量:重量),任选地,a):b):c)的比例为约1:约1至1.6:约1(重量:重量:重量)。
实施方案14:根据权利要求1至13中任一项所述的方法,其中,a)、b)和c)使用包含a)、b)和c)以及稳定的阳离子聚合物的转染组合物进行转染,其中,所述稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例为约1:1至约3:1(重量/重量),任选地,所述稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例约为1.5:1。
实施方案15:根据权利要求1至14中任一项所述的方法,其中,各个a)、b)和c)于一个或多个封闭末端线性双链核酸分子上提供。
实施方案16:根据权利要求1至15中任一项所述的方法,其中,经转染的核酸a)、b)和c)为合成核酸且没有DNA的真核和原核细胞修饰。
实施方案17:根据权利要求1至16中任一项所述的方法,其中,所述编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列包含编码腺病毒辅助(Ad辅助)蛋白的核苷酸序列,任选地,所述编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列包含编码腺病毒辅助蛋白E2A和E4的核苷酸序列。
实施方案18:根据权利要求1至17中任一项所述的方法,其中,所述rAAV的滴度为至少9.3×1013个载体基因组/3.0×109个经转染的活细胞。
实施方案19:根据权利要求1至18中任一项所述的方法,其中,于转染之前,以增加的体积逐渐培养所述人类胚胎细胞系的悬浮液。
实施方案20:根据权利要求1至19中任一项所述的方法,其中,培养体积自约50ml体积逐渐增加至约2000公升体积。
实施方案21:根据权利要求1至20中任一项所述的方法,其中,所述培养体积包含浓度为约1mM至约20mM的氨基酸。
实施方案22:根据权利要求1至21中任一项所述的方法,其中,具有约5公升体积的培养基包含浓度为约10mM的氨基酸。
实施方案23:根据权利要求21或22所述的方法,其中,所述氨基酸为L-谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(GlutamaxTM)。
实施方案24:根据权利要求1至23中任一项所述的方法,其中,具有约50公升体积的培养基包含:至少约1mM至约20mM的L-谷氨酰胺、至少约0.01%至约1%的非离子表面活性剂多元醇或洗涤剂以及至少约0.001%至约1%的消泡剂。
实施方案25:根据权利要求24所述的方法,其中,所述非离子表面活性剂多元醇包括普流尼克酸。
实施方案26:根据权利要求1至25中任一项所述的方法,其中,所述培养的人类胚胎细胞系包含约3.0×106至约1×108个活细胞/ml的细胞密度。
实施方案27:根据权利要求1至26中任一项所述的方法,其中,所述培养的人类胚胎细胞系包含约4.0×106至约6×106个活细胞/ml,或任选地至约2.5×107个活细胞/ml的细胞密度。
实施方案28:根据权利要求1至27中任一项所述的方法,还包括:(i)加入约1公升的培养基至所述经转染的细胞中;以及(ii)于约10分钟至约60分钟的时间过程中,以聚合物与DNA为约1:1至聚合物与DNA为约3:1之间的比例添加阳离子聚合物。
实施方案29:根据权利要求28所述的方法,其中,于约1分钟至约10分钟的时间过程中,以聚合物与DNA的比例为2.2:1的比例添加所述阳离子聚合物。
实施方案30:根据权利要求14至29中任一项所述的方法,其中,所述阳离子聚合物包括完全水解的线性聚乙烯亚胺(PEI)。
实施方案31:根据权利要求1至30中任一项所述的方法,其中,在转染前约12至36小时,将包含人类胚胎细胞悬浮液的培养基的温度升高至37℃。
实施方案32:根据权利要求27所述的方法,其中,所述培养基经受约0.1LPM至约1.0LPM之间的流速的空气喷射。
实施方案33:根据权利要求27所述的方法,其中,所述培养基经受约0.5LPM的流速的空气喷射。
实施方案34:一种产生缺乏原核序列的高滴度重组腺相关病毒(rAAV)的群体的方法,包括:(i)以a)编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列;b)编码rep和cap基因的核酸序列,和c)包含至少一个ITR和可操作地连接到一个或多个调节元件的异源转基因的封闭末端线性双链rAAV载体核酸转染哺乳动物细胞系,其中,从a)、b)和c)转染的核酸总量小于2μg每1×106个细胞,例如小于1μg;(ii)培养所述经转染的细胞至少24小时;以及(iii)收获所述经转染的细胞并纯化所产生的所述rAAV载体颗粒;其中,所述rAAV的滴度为至少9.3×1013个载体基因组/3.0×109个经转染的活细胞。
实施方案35:根据权利要求34所述的方法,其中,所述哺乳动物细胞系为悬浮细胞系,且所述细胞于悬浮液中转染。
实施方案36:根据权利要求34或35所述的方法,其中,所述细胞系源自人类胚胎肾细胞系。
实施方案37:根据权利要求34至36中任一项所述的方法,其中,所述哺乳动物细胞系为悬浮适应无血清细胞系。
实施方案38:根据权利要求34至37中任一项所述的方法,其中,a):b):c)的比例为约0.5至1.75:约0.75至2.25:约0.5至1.75(重量:重量:重量),例如,a):b):c)的比例为约1:约1至1.6:约1(重量:重量:重量)。
实施方案39:根据权利要求34至38中任一项所述的方法,其中,使用包含a)、b)和c)以及稳定的阳离子聚合物的转染组合物转染a)、b)和c),其中,稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例为约1:1至约3:1(重量/重量),例如,稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例为约1.5:1。
实施方案40:根据权利要求34至39中任一项所述的方法,其中,各个a)、b)和c)于一个或多个封闭末端线性双链核酸分子上提供。
实施方案41:根据权利要求34至40中任一项所述的方法,其中,经转染的核酸a)、b)和c)为合成核酸且没有DNA的真核和原核细胞修饰。
实施方案42:根据权利要求34至41中任一项所述的方法,其中,a)编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列包含编码Ad辅助蛋白的核苷酸序列,任选地,编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列包含编码腺病毒辅助蛋白的核苷酸序列E2A和E4。
实施方案43:根据权利要求34至42中任一项所述的方法,其中,来自a)、b)和c)的DNA总量任选地为0.6、0.7、0.75、0.8、0.9、1、1.2、1.4、1.6或1.8μg。
实施方案44:根据权利要求34至43中任一项所述的方法,其中,在转染之前,以增加的体积的培养基中逐渐培养所述哺乳动物细胞系的悬浮液。
实施方案45:根据权利要求34至44中任一项所述的方法,其中,培养体积从约50ml体积逐渐增加至约2000公升体积。
实施方案46:根据权利要求34至45中任一项所述的方法,其中,培养体积包含浓度为约1mM至约20mM的氨基酸。
实施方案47:根据权利要求34至46中任一项所述的方法,其中,具有约5公升体积的培养基包含浓度为约10mM的氨基酸。
实施方案48:根据权利要求34至47中任一项所述的方法,其中,所述氨基酸是L-谷氨酰胺。
实施方案49:根据权利要求34至48中任一项所述的方法,其中,所述细胞于50至100公升的培养体积中。
实施方案50:根据权利要求34至49中任一项所述的方法,其中,所述感染性颗粒滴度为至少3×109TCID50/ml。
实施方案51:根据权利要求34至50中任一项所述的方法,其中,所述AAV Rep和AAVCap基因来自相同的AAV血清型。
实施方案52:根据权利要求34至50中任一项所述的方法,其中,所述AAV Rep和AAVCap基因来自不同的AAV血清型。
实施方案53:根据权利要求34至52中任一项所述的方法,其中,所述AAV ITR和AAVCap基因来自相同的AAV血清型。
实施方案54:根据权利要求34至52中任一项所述的方法,其中,所述AAV ITR和AAVCap基因来自不同的AAV血清型。
实施方案55:根据权利要求34至54中任一项所述的方法,其中,所述AAV ITR序列来自AAV2或来自选自由AAV 1、3a、3b、4、5、6、7、8、9、10、11和13所组成群组的血清型。
实施方案56:根据权利要求34至55中任一项所述的方法,其中,所述AAV ITR序列为合成的。
实施方案57:一种产生缺乏原核序列的纯化重组腺相关病毒(rAAV)的群体的方法,包括:(i)以转染组合物转染悬浮于培养基中的哺乳动物细胞系;其中,所述转染组合物包含a)编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列;b)编码rep和cap基因的核酸序列,c)包含至少一个ITR和可操作地连接到一个或多个调节元件的异源转基因的封闭末端线性双链rAAV载体核酸,和d)稳定的阳离子聚合物;以及其中,所述稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸含量的总量的比例为至少1:1,例如,所述稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸含量的总量的比例为至少1.5:1;(ii)培养经转染的细胞系至少24小时;(iii)收获步骤ii)的经转染的细胞系;以及(iv)纯化rAAV,其中,纯化的病毒具有小于2×104vg/TCID50的颗粒与感染性比例。
实施方案58:根据权利要求57所述的方法,其中,所述哺乳动物细胞系为悬浮细胞系,且所述细胞于悬浮液中转染。
实施方案59:根据权利要求57或58所述的方法,其中,所述哺乳动物细胞系源自人类胚胎肾细胞系。
实施方案60:根据权利要求57至59中任一项所述的方法,其中,所述人类胚胎细胞系为源自人类胚胎肾细胞系的悬浮适应无血清细胞系。
实施方案61:根据权利要求57至60中任一项所述的方法,其中,所述稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸含量的总量的比例为约1.75:1至约2.75:1,例如,所述稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸含量的总量的比例为约2:1。
实施方案62:根据权利要求57至61中任一项所述的方法,其中,所述稳定的阳离子聚合物包括完全水解的线性聚乙烯亚胺(PEI)。
实施方案63:根据权利要求57至62中任一项所述的方法,其中,PEI与核酸的比例选自由1.2:1、1.4:1、1.6:1、1.8:1、2:1、2.5:1、2.8:1和2.2:1所组成的群组。
实施方案64:根据权利要求57至63中任一项所述的方法,其中,于转染前约12至36小时,将包含所述细胞悬浮液的培养基的温度升高至37℃。
实施方案65:根据权利要求57至64中任一项所述的方法,其中,所述培养基经受约0.1LPM至约1.0LPM之间的流速的空气喷射。
实施方案66:根据权利要求65至65中任一项所述的方法,其中,所述培养基经受约0.5LPM的流速的空气喷射。
实施方案67:根据权利要求57至66中任一项所述的方法,其中,所述转染组合物于约10分钟至约60分钟的时间过程中添加到所述悬浮细胞中。
实施方案68:根据权利要求57至67中任一项所述的方法,其中,于步骤i)之后和步骤ii)之前添加所述培养基。
实施方案69:根据权利要求57至68中任一项所述的方法,其中,来自a)、b)和c)的核酸(DNA)的总量为约1μg至约20μg。
实施方案70:根据权利要求57至69中任一项所述的方法,其中,来自a)、b)和c)的DNA总量为约1μg至约10μg。
实施方案71:根据权利要求57至70中任一项所述的方法,其中,a):b):c)的比例为约0.5至1.75:约0.75至2.25:约0.5至1.75(重量:重量:重量)。
实施方案72:根据权利要求57至71中任一项所述的方法,其中,各个a)、b)和c)于一个或多个封闭末端线性双链核酸分子上提供。
实施方案73:根据权利要求57至72中任一项所述的方法,其中,经转染的核酸a)、b)和c)为合成的且没有DNA的真核和原核细胞修饰。
实施方案74:根据权利要求57至73中任一项所述的方法,其中,a):b):c)的比例为约1:约1至1.6:约1(重量:重量:重量)。
实施方案75:根据权利要求57至74中任一项所述的方法,其中,a)编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列包含编码Ad辅助蛋白的核苷酸序列,任选地,编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列包含编码腺病毒辅助蛋白E2A和E4的核苷酸序列。
实施方案76:根据权利要求57至75中任一项所述的方法,其中,来自a)、b)和c)的DNA的总量为0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.2、1.4、1.6或1.8μg。
实施方案77:根据权利要求57至76中任一项所述的方法,其中,来自a)、b)和c)的DNA的总量约为0.75μg。
实施方案78:根据权利要求57至77中任一项所述的方法,其中,于转染之前,以逐渐增加的体积培养所述哺乳动物细胞系的悬浮液。
实施方案79:根据权利要求57至78中任一项所述的方法,其中,培养体积自约50ml体积逐渐增加至约2000公升体积。
实施方案80:根据权利要求57至79中任一项所述的方法,其中,培养体积自约50ml体积逐渐增加到约100公升体积。
实施方案81:根据权利要求57至80中任一项所述的方法,其中,所述培养体积包含浓度为约1mM至约20mM的氨基酸。
实施方案82:根据权利要求57至81中任一项所述的方法,其中,具有约5公升体积的培养基包含约10mM浓度的氨基酸。
实施方案83:根据权利要求81或82所述的方法,其中,所述氨基酸是L-谷氨酰胺。
实施方案84:根据权利要求57至83中任一项所述的方法,其中,所述细胞于50公升至100公升的培养体积中。
实施方案85:根据权利要求57至84中任一项所述的方法,其中,具有约50公升体积的培养基包含:至少约1mM至约20mM的L-谷氨酰胺、至少约0.01%至约1%的非离子表面活性剂多元醇或洗涤剂以及至少约0.001%至约1%的消泡剂。
实施方案86:根据权利要求85所述的方法,其中,所述非离子表面活性剂多元醇包括普流尼克酸。
实施方案87:根据权利要求57至86中任一项所述的方法,其中,所述转染组合物包含至少约5%体积/体积(v/v)至约20%v/v的培养基。
实施方案88:根据权利要求57至87中任一项所述的方法,其中,所述转染组合物包含约1公升至约5公升的培养基。
实施方案89:根据权利要求57至88中任一项所述的方法,其中,所述转染组合物包含5至50%(体积/体积)的培养基。
实施方案90:根据权利要求57至89中任一项所述的方法,其中,添加至转染的核酸序列包含:约0.1μg至约1μg每0.5×106至约5×106个细胞的Ad辅助DNA、Rep/Cap DNA或转基因。
实施方案91:根据权利要求57至90中任一项所述的方法,其中,AAV Rep和AAV Cap基因来自相同的AAV血清型。
实施方案92:根据权利要求57至90中任一项所述的方法,其中,所述AAV Rep和AAVCap基因来自不同的AAV血清型。
实施方案93:根据权利要求57至92中任一项所述的方法,其中,所述AAV ITR和AAVCap基因来自相同的AAV血清型。
实施方案94:根据权利要求57至92中任一项所述的方法,其中,所述AAV ITR和AAVCap基因来自不同的AAV血清型。
实施方案95:根据权利要求57至94中任一项所述的方法,其中,所述AAV ITR序列来自AAV2或来自选自由AAV 1、3a、3b、4、5、6、7、8、9、10、11和13所组成群组的血清型。
实施方案96:根据权利要求1至95中任一项所述的方法,其中,所述Cap基因来自AAV8血清型。
实施方案97:根据权利要求1至96中任一项所述的方法,其中,所述rAAV的经包装的核酸还缺乏真核DNA序列。
实施方案98:根据权利要求1至97中任一项所述的方法,其中,所述封闭末端线性双链核酸包含1/2的蛋白端粒酶结合位点。
实施方案99:根据权利要求1至98中任一项所述的方法,其中,所述封闭末端线性双链核酸包含1/2的蛋白端粒酶结合位点,以及其中,通过包含长度至少为10个碱基对的双链回文序列的靶结合位点的蛋白端粒酶消化形成所述1/2的蛋白端粒酶结合位点。
实施方案100:一种通过根据权利要求1至99中任一项所述的方法所产生的缺乏原核DNA的rAAV病毒粒子的群体。
实施方案101:一种包含蛋白端粒酶靶序列的重组腺相关病毒(rAAV)。
实施方案102:根据权利要求101所述的rAAV,其中,所述蛋白端粒酶靶序列包含长度为至少10个碱基对的双链回文序列。
实施方案103:根据权利要求101或102所述的rAAV,还包含转基因。
通过以下编号实施方式1至74描述本发明的例示性额外态样:
实施方式1:一种生产缺乏原核序列的高滴度重组腺相关病毒(rAAV)的群体的方法,所述方法包括:(i)以a)编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列;b)编码AAV rep和AAV cap基因的核酸序列,c)包含至少一个反向末端重复(ITR)序列和可操作地连接到一个或多个调节元件的异源转基因的封闭末端线性双链rAAV载体核酸,和d)任选地,聚阳离子聚合物接种细胞培养基,任选地包含宿主细胞系的细胞,其中,稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例为约1:1至约3:1(重量/重量),且任选地,来自a)、b)和c)的核酸总量小于约2μg每1×106个宿主细胞;(ii)培育接种的细胞培养基足够的时间以产生rAAV;(iii)纯化所述rAAV,以及任选地,所产生的rAAV的滴度高于由接种相应量的包含异源转基因的质粒DNA(pDNA)的细胞培养基产生的rAAV的滴度。
实施方式2:一种产生缺乏原核序列的高滴度重组腺相关病毒(rAAV)的群体的方法,所述方法包括:(i)在培养基中以a)编码足够用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列;b)编码AAV rep和AAV cap基因的核酸序列,和c)包含至少一个反向末端重复(ITR)序列和可操作地连接到一个或多个调节元件的异源转基因的封闭末端线性双链rAAV载体核酸转染宿主细胞系的细胞,其中:(i)来自a)、b)和c)的核酸总量小于约2μg每1×106个宿主细胞;或者(i i)使用包含a)、b)和c)以及聚阳离子聚合物的转染组合物转染宿主细胞,其中聚阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例为约1:1至约3:1(重量/重量);(ii)培育经转染的宿主细胞系足够长的时间以产生rAAV;(ii i)任选地,裂解所述经转染的宿主细胞;以及(iv)纯化rAAV,并且任选地,产生的rAAV滴度高于使用转染相应量的包含异源转基因的pDNA的宿主细胞系产生的rAAV滴度。
实施方式3:根据实施方式1或2所述的方法,其中,所述rAAV的病毒滴度为至少9.3×1013个载体基因组/3.0×109个经转染的活细胞。
实施方式4:根据实施方式1至3中任一项所述的方法,其中,所述rAAV的病毒滴度为至少3.5×1011vp/ml。
实施方式5:根据实施方式1至4中任一项所述的方法,其中,纯化的rAAV具有小于2×104vg/TCID50的颗粒与感染性比例。
实施方式6:根据实施方式1至5中任一项所述的方法,其中,所述经转染的宿主细胞系的所述培育为至少约24小时。
实施方式7:根据实施方式1至6中任一项所述的方法,其中,所述经转染的宿主细胞系的所述培育为持续约40小时至约400小时之间。
实施方式8:根据实施方式1至7中任一项所述的方法,其中,所述宿主细胞系于至少约50公升的细胞培养体积中
实施方式9:根据实施方式1至8中任一项所述的方法,其中,所述宿主细胞系于约50公升至约100公升的细胞培养体积中。
实施方式10:根据实施方式1至9中任一项所述的方法,其中,从a)、b)和c)转染的核酸总量小于约1.5μg每1×106个细胞。
实施方式11:根据实施方式1至10中任一项所述的方法,其中,从a)、b)和c)转染的核酸总量小于约1μg每1×106个细胞。
实施方式12:根据实施方式1至11中任一项所述的方法,其中,从a)、b)和c)转染的核酸总量小于约0.75μg每1×106个细胞。
实施方式13:根据实施方式1至12中任一项所述的方法,其中,从a)、b)和c)转染的核酸总量小于至少约0.25μg每1×106个细胞。
实施方式14:根据实施方式1至13中任一项所述的方法,其中,从a)、b)和c)转染的核酸总量小于至少约0.5μg每1×106个细胞。
实施方式15:根据实施方式1至14中任一项所述的方法,其中,a):b):c)的核酸比例为约0.5至1.75:约0.75至2.25:约0.5至1.75(重量:重量:重量)。
实施方式16:根据实施方式1至15中任一项所述的方法,其中,a):b):c)的核酸比例为约0.75至1.5:约1至1.75:约0.75至1.25(重量:重量:重量)。
实施方式17:根据实施方式1至16中任一项所述的方法,其中,a):b):c)的核酸比例为约1.4:约1.5:约1(重量:重量:重量)。
实施方式18:根据实施方式1至17中任一项所述的方法,其中,所述聚阳离子聚合物是聚乙烯亚胺(PEI)。
实施方式19:根据实施方式1至18中任一项所述的方法,其中,所述聚阳离子聚合物是线性聚乙烯亚胺。
实施方式20:根据实施方式1至19中任一项所述的方法,其中,所述稳定的阳离子聚合物是完全水解的聚乙烯亚胺。
实施方式21:根据实施方式1至20中任一项所述的方法,其中,稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例为约1.5:1至约2.75:1。
实施方式22:根据实施方式1至21中任一项所述的方法,其中,所述稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例为约1.9:1至约2.6:1。
实施方式23:根据实施方式1至22中任一项所述的方法,其中,来自a)、b)和c)的核酸总量为约0.55μg至约0.75μg每1×106个细胞,以及所述稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例为约2:1至约2.5:1。
实施方式24:根据实施方式1至23中任一项所述的方法,其中,所述宿主细胞系以宿主细胞系培养物体积的约5%至约20%(体积/体积)的转染组合物体积进行感染。
实施方式25:根据实施方式1至24中任一项所述的方法,其中,所述宿主细胞系以宿主细胞系培养物体积的约7.5%至约15%(体积/体积)的转染组合物体积进行感染。
实施方式26:根据实施方式1至25中任一项所述的方法,其中,在约10分钟至约60分钟的时间过程中添加所述转染组合物至宿主细胞。
实施方式27:根据实施方式1至26中任一项所述的方法,其中,所述方法还包括于转染宿主细胞系之前培养宿主细胞系一段时间的步骤。
实施方式28:根据实施方式27所述的方法,其中,所述培养宿主细胞系包括将培养体积从约50ml增加到约2000公升。
实施方式29:根据实施方式27或28所述的方法,其中,所述培养宿主细胞系包括将培养体积从约50ml增加到约100公升。
实施方式30:根据实施方式1至29中任一项所述的方法,其中,在转染前约12小时至36小时将包含宿主细胞系的培养基的温度升高至37℃。
实施方式31:根据实施方式1至30中任一项所述的方法,其中,所述培养基包含浓度为约1mM至约20mM的氨基酸。
实施方式32:根据实施方式1至31中任一项所述的方法,其中,所述培养基包含浓度为约5mM至约15mM的氨基酸。
实施方式33:根据实施方式1至32中任一项所述的方法,其中,所述培养基包含浓度为约7.5mM至约12.5mM的氨基酸
实施方式34:根据实施方式31至33中任一项所述的方法,其中,所述氨基酸是L-谷氨酰胺或包含L-谷氨酰胺的二肽。
实施方式35:根据实施方式34所述的方法,其中,所述包含L-谷氨酰胺的二肽为L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
实施方式36:根据实施方式1至35中任一项所述的方法,其中,所述培养基包含浓度为约0.01%至约1%(重量/体积)的非离子表面活性剂多元醇或洗涤剂。
实施方式37:根据实施方式36所述的方法,其中,所述非离子表面活性剂多元醇包含普罗洛酸。
实施方式38:根据实施方式1至37中任一项所述的方法,其中,所述培养基包含浓度为约0.001%至约1%(重量/体积)的消泡剂。
实施方式39:根据实施方式1至38中任一项所述的方法,其中,所述培养基经受以约0.1LPM至约1.0LPM之间的流速的空气喷射。
实施方式40:根据实施方式1至39中任一项所述的方法,其中,所述培养基经受以约0.25LPM至约0.75LPM之间的流速的空气喷射。
实施方式41:根据实施方式1至40中任一项所述的方法,其中,所述宿主细胞系是哺乳动物细胞系。
实施方式42:根据实施方式1至41中任一项所述的方法,其中,所述宿主细胞系是人类细胞系。
实施方式43:根据实施方式1至42中任一项所述的方法,其中,所述宿主细胞系是人类胚胎细胞系。
实施方式44:根据实施方式1至43中任一项所述的方法,其中,所述宿主细胞系是人类胚胎肾细胞系。
实施方式45:根据实施方式1至44中任一项所述的方法,其中,所述宿主细胞系是无血清细胞系。
实施方式46:根据实施方式1至45中任一项所述的方法,其中,宿主细胞系为悬浮适应的。
实施方式47:根据实施方式1至46中任一项所述的方法,其中,所述宿主细胞系悬浮在培养基中。
实施方式48:根据实施方式1至47中任一项所述的方法,其中,所述宿主细胞系的细胞在悬浮液中转染。
实施方式49:根据实施方式1至48中任一项所述的方法,其中,所述宿主细胞系包含约3.0×106至约1×108个活细胞/ml的细胞密度。
实施方式50:根据实施方式1至49中任一项所述的方法,其中,所述宿主细胞系包含约4.0×106至约6×106个活细胞/ml的细胞密度。
实施方式51:根据实施方式1至50中任一项所述的方法,其中,所述宿主细胞系包含约2.5×107个活细胞/ml的细胞密度。
实施方式52:根据实施方式1至51中任一项所述的方法,其中,核酸a)和b)中的至少一种包含在封闭末端线性双链核酸分子中。
实施方式53:根据实施方式1至52中任一项所述的方法,其中,核酸a)和b)各自独立地包含在封闭末端线性双链核酸分子中。
实施方式54:根据实施方式1至53中任一项所述的方法,其中,封闭末端线性双链核酸包含1/2的蛋白端粒酶结合位点。
实施方式55:根据实施方式1至54中任一项所述的方法,其中,所述封闭末端的线性双链核酸包含1/2的蛋白端粒酶结合位点,以及其中,通过包含长度至少为10个碱基对的双链回文序列的靶结合位点的蛋白端粒酶消化形成所述1/2的蛋白端粒酶结合位点。
实施方式56:根据实施方式1至55中任一项所述的方法,其中,AAV rep和AAV cap基因来自相同的血清型。
实施方式57:根据实施方式1至56中任一项所述的方法,其中,AAV rep和AAV cap基因来自不同的血清型。
实施方式58:根据实施方式1至57中任一项所述的方法,其中,AAV ITR序列和AAVcap基因来自相同的血清型。
实施方式59:根据实施方式1至58中任一项所述的方法,其中,AAV ITR序列和AAVcap基因来自不同的血清型。
实施方式60:根据实施方式1至59中任一项所述的方法,其中,AAV ITR序列和AAVrep基因来自相同的血清型。
实施方式61:根据实施方式1至60中任一项所述的方法,其中,AAV ITR序列和AAVrep基因来自不同的血清型。
实施方式62:根据实施方式1至61中任一项所述的方法,其中,所述AAV rep基因来自选自由AAV1、2、3a、3b、4、5、6、7、8、9、10、11和13所组成群组的血清型。
实施方式63:根据实施方式1至62中任一项所述的方法,其中,所述AAV rep基因来自选自由AAV2、3a、3b、8、9和10所组成群组的血清型。
实施方式64:如实施方式1至63中任一项所述的方法,其中,所述AAV cap基因来自选自由AAV1、2、3a、3b、4、5、6、7、8、9、10、11和13所组成群组的血清型。
实施方式65:根据实施方式1至64中任一项所述的方法,其中,所述AAV cap基因来自选自由AAV2、3a、3b、8、9和10所组成群组的血清型。
实施方式66:根据实施方式1至65中任一项所述的方法,其中,所述AAV ITR序列来自独立地选自AAV1、2、3a、3b、4、5、6、7、8、9、10、11和13的血清型。
实施方式67:根据实施方式1至66中任一项所述的方法,其中,所述AAV ITR序列来自独立地选自AAV2、3a、3b、8、9和10的血清型。
实施方式68:根据实施方式1至67中任一项所述的方法,其中,所述AAV ITR序列是合成序列。
实施方式69:根据实施方式1至68中任一项所述的方法,其中,所述编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列包含编码腺病毒辅助蛋白的核苷酸序列。
实施方式70:根据实施方式1至69中任一项所述的方法,其中,所述编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列包含编码腺病毒辅助蛋白E2A和E4的核苷酸序列。
实施方式71:根据实施方式1至70中任一项所述的方法,其中,至少一种经转染的核酸为合成核酸且没有DNA的真核和原核细胞修饰。
实施方式72:根据实施方式1至71中任一项所述的方法,其中,所述rAAV还缺乏真核DNA序列。
实施方式73:根据实施方式1至72中任一项所述的方法,其中,所述培育足够长的时间以产生rAAV是至少24小时的时间。
实施方式74:一种通过实施方式1至73中任一项所述的方法所产生的rAAV病毒粒子的群体。
应理解,可以组合本文描述的各种实施例的一个、一些或所有的特性以形成本发明的其他实施例。尽管以上已描述本发明的各种实施方案,惟应该理解其等仅作为实例而非以限制的方式呈现。在不背离本发明的精神或范围的情况下,可根据本文的公开对所公开的实施例进行许多改变。因此,本发明的广度和范围不应受任何上述实施方案的限制。
定义
为了本说明书和所附权利要求的目的,除非另有说明,所有表示量、尺寸、大小、比例、形状、配方、参数、百分比、参数、数量、特性和说明书和权利要求书中所用其他数值的数字,应理解为在所有情况下经术语“约”所修饰,即使术语“约”可能并未明确地与值、量或范围一起出现。因此,除非有相反的说明,以下说明书和所附权利要求书中提出的数值参数不是且不须为精确的,而是可为近似的和/或根据需要,反映公差、转换因子、四舍五入、测量误差等,以及本领域技术人员已知的其他因素而更大或更小,取决于目前公开的主题所欲得到的期望特性。举例而言,当提及值时,术语“约”可以意指包括自指定量于一些实施例中±100%,于一些实施例中±50%,于一些实施例中±20%,于一些实施例中±10%,于一些实施例中±5%,于一些实施例中±1%,于一些实施例中±0.5%,以及于一些实施例中±0.1%的变化,因为这样的变化适合于执行所公开的方法或应用所公开的组合物。
此外,当与一个或多个数字或数值范围结合使用时,术语“约”应理解为指所有此类数字,包括一个范围内的所有数字,并通过在数值以上和以下扩展边界修改所述范围。通过端点引用的数值范围包括包含在所述范围内的所有数字,例如整数,包括其分数(例如,1到5的记载包括1、2、3、4和5,以及其分数,例如1.5、2.25、3.75、4.1等)和所述范围内的任何范围。
如本文所用,单数形式“一个”、“一种”和“所述”旨在亦包括复数形式,除非上下文另外明确指明。此外,详细描述和/或权利要求中使用的术语“包含”、“含有”、“具有”、“含”、“具”或其变体旨在以类似于“包括”一词的方式具有包括性。须注意的是,如本文和所附权利要求中使用的,单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数引用,除非上下文另有明确规定。因此,例如,提及“蛋白质”是对一种或多种蛋白质的提及,且包括本领域技术人员已知的其等价物。
如本文所用,定义或描述的元素时提及物件、组合物、设备、方法、过程、系统等的术语“包括”、“包含”或“所包含”及其变体为允许附加元素的包括性或开放式,从而表明定义或描述的物件、组合物、设备、方法、过程、系统等包括那些指定的元素——或适当时,其等效物——并且其他元素可为包括但仍属于已定义物件、组合物、设备、方法、过程、系统等的范围/定义。
如本文所用,术语“辅助病毒”或“感染性辅助病毒”是指在产生辅助病毒依赖性病毒载体的拷贝时使用的病毒,例如腺相关病毒,其不具有自身复制的能力。辅助病毒用于与病毒载体一起共感染细胞,并为病毒载体基因组的复制提供必要的蛋白质。所述术语包括完整的病毒颗粒、空衣壳、病毒DNA等。通常用于产生rAAV颗粒的辅助病毒包括腺病毒、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)、巨细胞病毒(cytomegalovirus)、EB病毒(Epstein-Barr virus)和牛痘病毒(vaccinia virus)。
辅助病毒包括腺病毒(AV)和单纯疱疹病毒(HSV),并且存在使用杆状病毒在昆虫细胞中产生AAV的系统。乳头瘤病毒(papilloma viruses)也经提出亦可为AAV提供辅助功能(参见例如,Hermonat等人,Molecular Therapy 9,S289-S290(2004))。辅助病毒包括任何能够建立允许AAV复制的病毒。AV是一种无包膜核DNA病毒,具有约36kb的双链DNA基因组。通过提供E1a、E1b55K、E2a、E4orf6和VA基因,AV能拯救细胞中潜伏的AAV前病毒,从而允许AAV复制和封装。HSV为具有相对较大的包裹在二十面体衣壳中的双链线性DNA基因组的病毒家族,其包裹在脂质双层包膜中。HSV具有感染性和高度传播性。以下HSV-1复制蛋白经鉴定为AAV复制所必需的:解旋酶/引物复合物(UL5、UL8和UL52)和由UL29基因编码的DNA结合蛋白ICP8,以及其他增强辅助功能的蛋白质。
如本文所用,术语“非贴壁细胞系”或“悬浮细胞系”是指能够在悬浮培养中存活而不附着于表面(例如组织培养塑料载体或微载体)的细胞系)。对非贴壁细胞系的适应是一个延长的过程,需要通过减少血清量进行传代,从而选择不可逆修饰的细胞群。细胞系可以生长到比贴壁条件允许的更高的密度,因此更适合于工业规模的培养,例如在生物反应器环境中或在搅拌培养中。
如在本说明书和所附权利要求中使用的,术语“或”通常以其包括“和/或”的含义使用,除非内容另有明确规定。
如本文所用,术语“启动子”定义为由细胞的合成机器或引入的合成机器所识别的DNA序列,需要启动多核苷酸序列的特异性转录。“组成型”启动子是一种当其与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时,导致基因产物在大多数细胞或所有生理条件下在细胞中产生核苷酸序列。“诱导型”启动子是一种核苷酸序列,当其与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时,基本上仅当对应于启动子的诱导物存在于细胞中时,才会使基因产物在细胞中产生。“组织特异性”启动子是一种核苷酸序列,当与编码基因或由基因指定的多核苷酸可操作地连接时,基本上仅当细胞是对应于启动子组织类型的细胞时,才会在细胞中产生基因产物。
“蛋白端粒酶”靶序列是任何DNA序列,其存在于DNA模板中允许其通过蛋白端粒酶的酶活性转化为封闭线性DNA。换言之,蛋白端粒酶靶序列是蛋白端粒酶切割和重新连接双链DNA以形成共价封闭线性DNA所必需的。通常,蛋白端粒酶靶序列包含任何完全回文序列,即具有双重旋转对称性的任何双链DNA序列,在本文中也描述为完全反向重复。完全反向重复的长度因特定生物体而异。在伯氏疏螺旋体中,完全的反向重复序列长度为14个碱基对。在各种嗜温噬菌体中,完全的反向重复长度为22个碱基对或更长。此外,在某些情况下,例如大肠杆菌N15,中央完全反向回文序列的两侧是反向重复序列,即形成较大的不完全反向回文序列的一部分。
如本文所用,术语“重组AAV(rAAV)载体”或“基因递送载体”是指起核酸递送载体作用的病毒颗粒,其包含包装在AAV衣壳内的载体基因组(例如病毒DNA[vDNA])。或者,在某些情况下,术语“载体”可用于单独指代载体基因组/vDNA。
“rAAV载体基因组”或“rAAV基因组”是包含一个或多个异源核苷酸序列的AAV基因组(即,vDNA)。rAAV载体通常只需要顺式的145个碱基末端重复(TR(s))即可产生病毒。所有其他病毒序列都是可有可无的并且可以反式提供(Muzyczka,(1992)Curr.TopicsMicrobiol.Immunol.158:97)。通常,rAAV载体基因组将仅保留最少的TR序列,以最大化载体可有效包装的转基因大小。编码序列的结构和非结构蛋白质可以反式提供(例如,来自载体,例如质粒,或通过将序列稳定整合到包装细胞中)。rAAV载体基因组包含至少一个TR序列(例如,AAV TR序列、合成的或其他细小病毒TR序列),任选地两个TR(例如,两个AAV TR),其通常位于载体的5'和3'端异源核苷酸序列,但不必与其相邻。TR可以彼此相同或不同。
术语“末端重复”或“TR”包括形成发夹结构并作为反向末端重复(ITR)发挥作用的任何病毒末端重复和合成序列,例如Samulski等人,美国专利5,478,745中描述的“双D序列”。BERNARD N.FIELDS等人,VIROLOGY,第2卷,第69和70章(第4版,Lippincott-RavenPublishers)中更详细地描述自主细小病毒和AAV的衣壳结构。另见,AAV2(Xie等人,(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.99:10405-10),AAV4(Padron等人,(2005)I.Virol.79:5047-58)、AAV5(Walters等人,(2004)I.Virol.78:3361-71)和CPV(Xie等人,(1996)I.Mol.Biol.6:497-520和Tsao等人,(1991)Science 251:1456-64)晶体结构的描述。
“AAV末端重复”或“AAV TR”可以来自任何AAV,包括但不限于血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13或任何其他现在已知或以后发现的AAV。AAV末端重复不需要具有野生型末端重复序列(例如,可以通过插入、缺失、截短或错义突变改变野生型序列),只要至少一个末端重复介导所需功能、功能性TR,例如复制、病毒包装、整合和/或前病毒拯救等。本领域技术人员理解选择对功能性TR的复制具有功能性的Rep蛋白。
“转基因”在本文中用于方便地指旨在或已经被引入细胞或生物体的多核苷酸或核酸。转基因包括任何核酸,例如编码多肽或蛋白质的基因。举例而言,本领域技术人员熟知用于基因治疗的合适转基因。例如,本文所述的载体可以递送转基因和用途,包括但不限于美国专利6,547,099;6,506,559;4,766,072;美国专利公开20020006664;20030153519;20030139363;以及PCT公开号WO 01/68836和WO 03/010180中描述者,以及例如WO2017/152149的miRNA和其他转基因;其各自通过引用整体并入本文。
如本文所用,术语“向性(tropism)”是指病毒优先进入某些细胞或组织,任选地随后表达(例如,转录和任选地,翻译)细胞中病毒基因组携带的序列,例如,对于重组病毒,目的异源核酸的表达。
当在多核苷酸序列的上下文中使用时,术语“变体”可以涵盖与野生型基因相关的多核苷酸序列。此定义还可以包括例如“等位基因(allelic)”、“剪接(splice)”、“异种(species)”或“多态性(polymorphic)”变体。剪接变体可能与参考分子具有显着的同一性,但由于在mRNA加工过程中外显子的交替剪接,因此通常具有更多或更少数量的多核苷酸。相应的多肽可以具有额外的功能结构域或不存在结构域。异种变体是从一个物种到另一个物种的多核苷酸序列。在本发明中特别有用的是野生型基因产物的变体。变体可能由核酸序列中的至少一个突变引起,且可能导致改变的mRNA或结构或可能改变或不改变功能的多肽。任何给定的天然或重组基因可能没有、一种或多种等位基因形式。产生变异的常见突变变化通常归因于核苷酸的自然缺失、添加或替换。这些类型的变化中的每一种都可以单独发生,或者与其他变化结合,以给定的顺序发生一次或多次。
范围:在整个本公开中,本发明的各个太样可以以范围格式呈现。应当理解,范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁,不应理解为对本发明范围的不灵活限制。因此,范围的描述应视为已经具体公开所有可能的子范围以及所述范围内的各个数值。例如,对例如1到6的范围的描述应视为具有具体公开的子范围,例如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等,以及所述范围内的单个数字,例如,1、2、2.1、2.2、2.7、3、4、5、5.5、5.75、5.8、5.85、5.9、5.95、5.99和6。无论范围的广度如何都适用于此。
本文提及的所有文件均通过引用并入本文。在本申请全文引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容,以及附图和序列表,出于所有目的,如同每个单独的出版物或专利文件被如此单独地表示一样通过引用并入本文。通过在本文件中引用各种参考文献,申请人不承认任何特定参考文献是其发明的“现有技术”。本发明组合物和方法的实施方案在以下实施例中进行说明。
实施例
以下非限制性实施例用于说明本发明的所选实施方案,不限制权利要求书中描述的本发明的范围。应理解,所示部分的比例变化和元件的替代对于本领域技术人员而言将为显而易见且于本发明的实施例的范围内。
实施例1:使用封闭线性(cl)DNA的AAV生产
本研究的目的为评估rAAV的大规模生产。
材料和方法
TCID50测定:使用感染滴度(TCID50)方法评估药物产品于HeLa RC32细胞中的体外AAV感染性。于此测定中,以5型腺病毒辅助病毒和药物产品的连续稀释(serialdilution)转导HeLa RC32细胞。感染三天后,以蛋白酶K处理细胞以消化蛋白质,并用qPCR技术定量复制的AAV载体DNA。此方法使用DNA引物和基于荧光染料的检测系统。从质粒所制备的标准曲线内插来自载体DNA的ITR靶序列的绝对数量。将含有ITR的样品作为测试样品且用作测定对照。结果表示为每毫公升感染单位(IU/mL)。应注意,为了比较不同制剂之间的TCID50/ml,TCID50/ml优选标准化为vg/ml。
表1:50L规模载体产品所需完成的分析测试和规格说明。
用于制备重组腺相关病毒载体(rAAV)的PRO10TM细胞系(AskBio,NC,USA)为源自人类胚胎肾细胞系293(HEK293)的悬浮适应无血清细胞系。PRO10TM病毒载体的制备为中高范围的细胞密度下进行的批次处理过程,并采用三重转染方法,通过于生产培养基混合物中将必需的质粒(pDNA)或封闭线性(cl)DNA底物与线性聚乙烯亚胺MAX缩合。细胞生长和生产培养基均经过化学定义,不含动物源性成分。每个DNA分子都为重组AAV的生产提供一个关键要素。第一个提供用于载体的有效复制和包装的腺病毒辅助(Ad helper)蛋白,但缺乏产生腺病毒所必需的腺病毒结构和复制基因。第二种是含有AAV2 rep基因和AAV8或AAVrh10衣壳(cap)蛋白基因的AAV8或AAVrh10反式构建体(包装构建体)。第三个构建体为治疗性转基因编码的AAV载体构建体,且含有腺相关病毒2侧翼(5'至3')感兴趣基因的反向末端重复(ITR)序列。所有实验用的构建体为双重GFP和荧光素酶(Luciferase)报告基因。此外,后续研究使用包括CYP和GAA转基因的两种治疗性转基因盒。
采用实验设计(DoE)方法于传统的非封闭(non-block)方法中小规模(31.25mL至2L)进行初始实验,通过同时检查clDNA浓度、clDNA与转染试剂的比例要素以识别和优化有关生产的关键参数。所有小规模实验均通过使用优化的三质粒转染系统的并行(side-by-side)载体生产来控制。将评估的其他因素包括但不限于培养基、细胞密度、转染时间、转染体积、温度和其他细胞依赖性或细胞非依赖性因素。
小规模转染培养物在转染后(hpt)培育约72小时,接着通过机械细胞裂解收获。使用病毒ITR特有的基于内部qPCR的DNase耐受颗粒(DNase Resistant Particle,DRP)方法通过载体基因组(vg)量化评估总载体产量。如qPCR所示,产率通常为4至6×1011vg/mL。通过ELISA观察转基因靶向qPCR以及每毫公升的总病毒颗粒(衣壳)(vp/mL)进一步评估产率。亦可通过SEC-HPLC观察亲和纯化裂解物收获时的A260/280比例模拟相对包装效率。
小规模筛选实验的主要目的为确定实验计划的50L比例部分的接近最佳的转染条件。为pDNA和clDNA运行,细胞都被解冻、培养并逐渐扩增直到接种至50L生产生物反应器中。于进行瞬时转染之前,在生产生物反应器中继续进行细胞培养物的扩增过程。经转染的细胞培养物在生产生物反应器中培育约72-hpt。在收获时,裂解经转染的细胞培养物且通过深度和膜过滤进行澄清,接着进行纯化。纯化由捕获色谱法、梯度超速离心法、离子交换色谱法、超滤/透析过滤(ultrafiltration/diafiltration,UF/DF)和0.2μm过滤步骤所组成。表3提供pDNA和clDNA所分别产生的rAAV载体的表征测试。
50L SUB上游操作详细流程说明
为了产生50L的批次,细胞被解冻、培养并逐渐扩增,直到接种到50L的生产生物反应器中。细胞培养物扩增过程于瞬时转染之前在生产生物反应器中继续进行。目前,种子培养(seed train)培养基添加有L-谷氨酰胺,最终浓度为10mM,所述培养基用于回收冷冻细胞原液以及使用10L WAVE袋式生物反应器扩增接种物至5L悬浮液。补充0.2%PLURONICTM酸至WAVE悬浮液中使用的培养基。ThermoFisher50L一次性搅拌釜式生物反应器(SUB,STR)接种后使用的生长培养基由添加有约1至100mM GLUTAMAXTM、约0.01%至10%PLURONICTM酸(ThermoFisher,Waltham,MA)和约0.001%至1%FOAMAWAYTM(Gibco,Waltham,MA)所组成。GLUTAMAXTM为一种稳定的L-谷氨酰胺二肽来源,其设计为防止降解和减少过量氨的毒性积聚。
通过三个clDNA和线性聚乙烯亚胺MAX(Polysciences Inc.,Warrington,PA)(PEIMax)的缩合(condensation),在3.25至4.25×106个活细胞/mL3之间的细胞密度下进行瞬时转染以产生AAV。转染混合物占培养体积(5L)的10%(v/v)。于一个定制的配备有与50L SUB配套的管道的10L WAVE摇袋(rocket bag)中进行缩合。转染混合物的制备方法首先于25℃下添加4L培养基至所述摇袋中,并轻轻摇动(角度8°,25RPM)。为防止袋子放气,以0.2LPM施加空气覆盖。接着添加质粒(表2),之后以培养基进行1L的追踪(chase)。
表2:使用的每个clDNA的比例,以转染时的细胞密度标准化。
构建体 | 比例 |
Ad辅助 | 0.15至0.32μg DNA/1×10<sup>6</sup>个细胞 |
Rep/Cap | 0.15至0.32μg DNA/1×10<sup>6</sup>个细胞 |
转基因 | 0.15至0.32μg DNA/1×10<sup>6</sup>个细胞 |
在培养基追踪之后,于1分钟内添加PEI并以1L培养基进行追踪。培育混合物培育7分钟,接着转移至SUB。培育转染细胞悬浮液3小时,接着用10%(v/v)体积的化学成分确定的、添加有10mM的L-谷氨酰胺的无血清HEK293培养基淬灭。
SUB控制参数
目前的大型制造平台使用配备有ThermoFisher夹套50L SUB的Finesse G3Pro通用控制器。一次性容器配备3叶片、45°螺距、轴向叶轮、双分布器(Frit-Drilled-Hole)设计,以及初级Finesse TruFluor pH/DO一次性探头护套和用于可重复使用的pH/DO探针插件的二级Pall Kleenpak连接。培养基充电(charge)前一天,安装袋子并以10LPM的空气覆盖充气。连接光学/可重复使用的DO探头至发送器。在充电当天,使用2-pt斜率校准对DO探头进行校准。添加培养基后,一次性和可重复使用的pH探针均使用校准后的血气分析仪上的离线样本进行标准化。
SUB温度在接种前一天升高到37℃。接着通过以流速为0.5LPM(0.025VVM)的连续钻孔空气注入法(air sparge)使培养基饱和以进行调节。在接种之前,使用1pt校准将一次性和可重复使用的DO探头标准化为100%空气饱和度。
接种后,控制器设置为以0.5LPM的速率进行连续钻孔空气注入法,顶部空间以1LPM的空气覆盖清扫。DO通过由O2气体级联控制,且设计为通过将O2流量从0.00增加到5.00LPM(0至100%DO输出/0-100%MFC-3输出)以保持设定点。通过将流向玻料喷气器(frit sparger)的CO2气体流量从0.00增加到2.00LPM(0至(-100)%)输出/0至100%MFC-4输出),将pH值控制在高端(7.0至14);然而,碱源并非用以控制pH值于低端,而是让其自然漂移。
结果每1×106个活细胞的总clDNA(μg)和PEI:DNA比例的DoE评估。
于DoE设置中,每1×106个活细胞的μg DNA和PEI:DNA比例分别在0.5至2μg和1至3之间的范围内进行研究。所述设计是一个自定义响应曲面模型(response surface model,RSM),每个因子具有三个水平,可以解释线性和二次效应。设计空间中的重复中心点用于估计每个效应的显着性。
通过ITR-qPCR评估收获时的总载体产量(图1)。数据表明,相较于使用pDNA作为起始材料,使用clDNA作为起始材料的比生产力(vg/细胞)提高2至2.5倍。
排除质粒值,使用拟合模型以模拟响应以识别重要和相互作用的因素以及辨别转染的最佳clDNA条件。JMP分析的结果总结如下:
表3:拟合总结
R平方 | 0.941275 |
调整R平方 | 0.911913 |
均方根误差 | 4.87e+10 |
响应平均值 | 2.59e+11 |
观测值(或加权总和,Sum Wgts) | 16 |
表4:方差分析
来源 | DF | 平方和 | 均方 | F比例 |
模型 | 5 | 3.8018×10<sup>23</sup> | 7.604×10<sup>22</sup> | 32.0572 |
错误 | 10 | 2.3719×10<sup>22</sup> | 2.372×10<sup>21</sup> | 概率>F |
C.总计 | 15 | 4.039×10<sup>23</sup> | <0.0001* |
分析μg clDNA/1×106个细胞(总clDNA)和PEI:DNA比例的因素的拟合总结和方差分析(图2)。回归模型解释实验中观察到的大部分变化。R2为0.941,表明小于6%的vg滴度变化无法用总clDNA或PEI:DNA的因素进行解释。等高线图显示clDNA和PEI:DNA比例对细胞裂解物中载体基因组滴度的影响,以vg/mL表示(图3)。如图4所示,用于产生重组AAVrh10CYP的clDNA表明获得高滴度AAV所需的DNA少于1ug,例如,0.6至0.7ug之间。此外,图5和图6分别显示以2.2和2.5的PEI:DNA产生重组AAVrh10CYP和AAV8GAA,考量总产量和包装效率,最佳clDNA为0.6ug。
表5:参数估计
50L SUB运行
对于每个50L的批次,对制程中样品、纯化的散装产品和最终产品以及产品的放行测试进行QC分析。进行以下QC测定及其结果:
表6:衍生自pDNA和clDNA的载体的分析测试、规格和结果。
表7:衍生自pDNA和clDNA的载体的TCID50/ml和颗粒与感染性(vg/TCID50)比例的结果。
如表7所示,在DoE实验和50L运行中,相较于pDNA对照,衍生自clDNA的载体显示出更高的感染性,如同相较于pDNA,clDNA的vg/TCID50比例较低所示。
结论
已证明clDNA系统可用于生产AAV,但是,与质粒DNA一样,其他血清型和转基因构建体的一致批次间小规模生产运行以及线性规模的载体生产仍有待证明。在用于优化pDNA转染过程的类似实验中,也观察到上述实验中对总clDNA的二次效应。进一步的实验公开与总clDNA和PEI相关的产品特异性关系的潜力,仍有待进一步评估。为了解决小规模和大规模生产变化,将进行额外的研究。这些研究将集中于确定clDNA起始材料的稳定性、转染前clDNA的处理、评估PEI:clDNA比例、clDNA比例和PEI:clDNA络合动力学。
除了产率和强度之外,按比例运行的50L运行的分析测试结果彼此一致。无论起始材料如何,纯度、安全性、质量和特性的测定结果都非常相似。
未来的研究计划了解规模化载体制备中产量、包装效率以及纯度和效力方面的差距,以及进一步的优化工作。
尽管本发明已参照其优选实施例进行具体展示和描述,但本领域技术人员将理解,可在不背离所附权利要求书所涵盖的本发明范围下对其中的形式和细节进行各种改变。
虽然本发明已经具体展示及描述其优选实施态样,惟本领域技术人员将理解,于不脱离所附的权利要求书所涵盖的本发明的范围下,可以于形式及细节进行各种改变。
Claims (103)
1.一种产生缺乏原核序列的重组腺相关病毒(rAAV)的方法,包括:
于悬浮液中培养人类胚胎细胞系;
以a)编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列;b)编码AAV rep和AAV cap基因的核酸序列,及c)包含至少一个反向末端重复(ITR)序列和可操作地连接到一个或多个调节元件的异源转基因的封闭末端线性双链rAAV载体核酸,转染所述人类胚胎细胞系;
培育所述经转染的人类胚胎细胞系约40至400小时;以及
任选地,裂解所述经转染的人类胚胎细胞系且纯化编码所述rAAV的核酸序列,从而
产生rAAV。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述细胞系的细胞于悬浮液中转染。
3.根据权利要求1所述的方法,其中,所述人类胚胎细胞系为源自人类胚胎肾细胞系的悬浮适应无血清细胞系。
4.权利要求1所述的方法,其中,所述AAV rep基因和AAV cap基因来自不同的血清型。
5.根据权利要求1所述的方法,其中,所述AAV rep基因和AAV cap基因来自相同的血清型。
6.根据权利要求1所述的方法,其中,所述AAV rep基因为AAV2 rep基因且所述AAV cap基因为AAV8 cap基因。
7.根据权利要求1所述的方法,其中,所述AAV ITR和AAV cap基因来自不同的血清型。
8.根据权利要求1所述的方法,其中,所述AAV ITR和AAV cap基因来自相同的血清型。
9.根据权利要求1所述的方法,其中,所述AAV反向末端重复(ITR)序列为腺相关病毒2反向末端重复(ITR)序列。
10.根据权利要求1所述的方法,其中,所述AAV ITR序列来自AAV2血清型或选自由AAV1、3a、3b、4、5、6、7、8、9、10、11和13所组成群组的血清型。
11.根据权利要求1所述的方法,其中,所述AAV ITR序列为合成的。
12.根据权利要求1所述的方法,其中,从a)、b)和c)转染的核酸总量小于2μg每1×106个细胞,任选地,从a)、b)和c)转染的核酸总量小于1μg每1×106个细胞。
13.根据权利要求1所述的方法,其中,a):b):c)的比例为约0.5至1.75:约0.75至2.25:约0.5至1.75(重量:重量:重量),任选地,a):b):c)的比例为约1:约1至1.6:约1(重量:重量:重量)。
14.根据权利要求1所述的方法,其中,a)、b)和c)使用包含a)、b)和c)以及稳定的阳离子聚合物的转染组合物进行转染,其中,所述稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例为约1:1至约3:1(重量/重量),任选地,所述稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例约为1.5:1。
15.根据权利要求1所述的方法,其中,各个a)、b)和c)于一个或多个封闭末端线性双链核酸分子上提供。
16.根据权利要求1所述的方法,其中,经转染的核酸a)、b)和c)为合成核酸且没有DNA的真核和原核细胞修饰。
17.根据权利要求1所述的方法,其中,所述编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列包含编码腺病毒辅助(Ad辅助)蛋白的核苷酸序列,任选地,所述编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列包含编码腺病毒辅助蛋白E2A和E4的核苷酸序列。
18.根据权利要求1所述的方法,其中,所述rAAV的滴度为至少9.3×1013个载体基因组/3.0×109个经转染的活细胞。
19.根据权利要求1所述的方法,其中,于转染之前,以增加的体积逐渐培养所述人类胚胎细胞系的悬浮液。
20.根据权利要求19所述的方法,其中,培养体积自约50ml体积逐渐增加至约2000公升体积。
21.根据权利要求20所述的方法,其中,所述培养体积包含浓度为约1mM至约20mM的氨基酸。
22.根据权利要求21所述的方法,其中,具有约5公升体积的培养基包含浓度为约10mM的氨基酸。
23.根据权利要求21所述的方法,其中,所述氨基酸为L-谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(GlutamaxTM)。
24.根据权利要求20所述的方法,其中,具有约50公升体积的培养基包含:至少约1mM至约20mM的L-谷氨酰胺、至少约0.01%至约1%的非离子表面活性剂多元醇或洗涤剂以及至少约0.001%至约1%的消泡剂。
25.根据权利要求24所述的方法,其中,所述非离子表面活性剂多元醇包括普流尼克酸。
26.根据权利要求1所述的方法,其中,所述培养的人类胚胎细胞系包含约3.0×106至约1×108个活细胞/ml的细胞密度。
27.根据权利要求26所述的方法,其中,所述培养的人类胚胎细胞系包含约4.0×106至约6×106个活细胞/ml,或任选地至约2.5×107个活细胞/ml的细胞密度。
28.根据权利要求1所述的方法,还包括:(i)加入约1公升的培养基至所述经转染的细胞中;以及(ii)于约10分钟至约60分钟的时间过程中,以聚合物与DNA为约1:1至聚合物与DNA为约3:1之间的比例添加阳离子聚合物。
29.根据权利要求28所述的方法,其中,于约1分钟至约10分钟的时间过程中,以聚合物与DNA的比例为2.2:1的比例添加所述阳离子聚合物。
30.根据权利要求28所述的方法,其中,所述阳离子聚合物包括完全水解的线性聚乙烯亚胺(PEI)。
31.根据权利要求1所述的方法,其中,在转染前约12至36小时,将包含人类胚胎细胞悬浮液的培养基的温度升高至37℃。
32.根据权利要求27所述的方法,其中,所述培养基经受约0.1LPM至约1.0LPM之间的流速的空气喷射。
33.根据权利要求27所述的方法,其中,所述培养基经受约0.5LPM的流速的空气喷射。
34.一种产生缺乏原核序列的高滴度重组腺相关病毒(rAAV)的群体的方法,包括:
i)以a)编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列;b)编码rep和cap基因的核酸序列,和c)包含至少一个ITR和可操作地连接到一个或多个调节元件的异源转基因的封闭末端线性双链rAAV载体核酸转染哺乳动物细胞系,其中,从a)、b)和c)转染的核酸总量小于1μg每1×106个细胞;
ii)培养所述经转染的细胞至少24小时;
iii)收获所述经转染的细胞并纯化所产生的所述rAAV载体颗粒;
其中,rAAV的滴度为至少9.3×1013个载体基因组/3.0×109个经转染的活细胞。
35.根据权利要求34所述的方法,其中,所述哺乳动物细胞系为悬浮细胞系,且所述细胞于悬浮液中转染。
36.根据权利要求34所述的方法,其中,所述细胞系源自人类胚胎肾细胞系。
37.根据权利要求34至36中任一项所述的方法,其中,所述哺乳动物细胞系为悬浮适应无血清细胞系。
38.根据权利要求34所述的方法,其中,a):b):c)的比例为约0.5至1.75:约0.75至2.25:约0.5至1.75(重量:重量:重量),任选地,a):b):c)的比例为约1:约1至1.6:约1(重量:重量:重量)。
39.根据权利要求34所述的方法,其中,使用包含a)、b)和c)以及稳定的阳离子聚合物的转染组合物转染a)、b)和c),其中,稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例为约1:1至约3:1(重量/重量),任选地,稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例为约1.5:1。
40.根据权利要求34所述的方法,其中,各个a)、b)和c)于一个或多个封闭末端线性双链核酸分子上提供。
41.根据权利要求34所述的方法,其中,经转染的核酸a)、b)和c)为合成核酸且没有DNA的真核和原核细胞修饰。
42.根据权利要求34所述的方法,其中,a)编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列包含编码Ad辅助蛋白的核苷酸序列,任选地,编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列包含编码腺病毒辅助蛋白的核苷酸序列E2A和E4。
43.根据权利要求34至42中任一项所述的方法,其中,来自a)、b)和c)的DNA总量任选地为0.6、0.7、0.75、0.8、0.9、1、1.2、1.4、1.6或1.8μg。
44.根据权利要求34至43中任一项所述的方法,其中,在转染之前,以增加的体积的培养基中逐渐培养所述哺乳动物细胞系的悬浮液。
45.根据权利要求44所述的方法,其中,培养体积从约50ml体积逐渐增加至约2000公升体积。
46.根据权利要求45所述的方法,其中,培养体积包含浓度为约1mM至约20mM的氨基酸。
47.根据权利要求46所述的方法,其中,具有约5公升体积的培养基包含浓度为约10mM的氨基酸。
48.根据权利要求47所述的方法,其中,所述氨基酸是L-谷氨酰胺。
49.根据权利要求48所述的方法,其中,所述细胞于50至100公升的培养体积中。
50.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述感染性颗粒滴度为至少3×109TCID50/ml。
51.根据权利要求34所述的方法,其中,所述AAV Rep和AAV Cap基因来自相同的AAV血清型。
52.根据权利要求34所述的方法,其中,所述AAV Rep和AAV Cap基因来自不同的AAV血清型。
53.根据权利要求34所述的方法,其中,所述AAV ITR和AAV Cap基因来自相同的AAV血清型。
54.根据权利要求34所述的方法,其中,所述AAV ITR和AAV Cap基因来自不同的AAV血清型。
55.根据权利要求34所述的方法,其中,所述AAV ITR序列来自AAV2或来自选自由AAV1、3a、3b、4、5、6、7、8、9、10、11和13所组成群组的血清型。
56.根据权利要求34所述的方法,其中,所述AAV ITR序列为合成的。
57.一种产生缺乏原核序列的纯化重组腺相关病毒(rAAV)的群体的方法,包括:
i)以转染组合物转染悬浮于培养基中的哺乳动物细胞系;其中,所述转染组合物包含a)编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列;b)编码rep和cap基因的核酸序列,c)包含至少一个ITR和可操作地连接到一个或多个调节元件的异源转基因的封闭末端线性双链rAAV载体核酸,和d)稳定的阳离子聚合物;以及其中,
所述稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸含量的总量的比例为至少1:1,任选地,所述稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸含量的总量的比例为至少1.5:1;
ii)培养经转染的细胞系至少24小时;
iii)收获步骤ii)的经转染的细胞系;
iv)纯化rAAV,
其中,纯化的病毒具有小于2×104vg/TCID50的颗粒与感染性比例。
58.根据权利要求57所述的方法,其中,所述哺乳动物细胞系为悬浮细胞系,且所述细胞于悬浮液中转染。
59.根据权利要求57所述的方法,其中,所述哺乳动物细胞系源自人类胚胎肾细胞系。
60.根据权利要求57至59中任一项所述的方法,其中,所述人类胚胎细胞系为源自人类胚胎肾细胞系的悬浮适应无血清细胞系。
61.根据权利要求57所述的方法,其中,所述稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸含量的总量的比例为约1.75:1至约2.75:1,任选地,所述稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸含量的总量的比例为约2:1。
62.根据权利要求57至61中任一项所述的方法,其中,所述稳定的阳离子聚合物包括完全水解的线性聚乙烯亚胺(PEI)。
63.根据权利要求62所述的方法,其中,PEI与核酸的比例选自由1.2:1、1.4:1、1.6:1、1.8:1、2:1、2.5:1、2.8:1和2.2:1所组成的群组。
64.根据权利要求57所述的方法,其中,于转染前约12至36小时,将包含所述细胞悬浮液的培养基的温度升高至37℃。
65.根据权利要求57所述的方法,其中,所述培养基经受约0.1LPM至约1.0LPM之间的流速的空气喷射。
66.根据权利要求65所述的方法,其中,所述培养基经受约0.5LPM的流速的空气喷射。
67.根据权利要求57所述的方法,其中,所述转染组合物于约10分钟至约60分钟的时间过程中添加到所述悬浮细胞中。
68.根据权利要求57所述的方法,其中,于步骤i)之后和步骤ii)之前添加所述培养基。
69.根据权利要求57所述的方法,其中,来自a)、b)和c)的核酸(DNA)的总量为约1μg至约20μg。
70.根据权利要求57所述的方法,其中,来自a)、b)和c)的DNA总量为约1μg至约10μg。
71.根据权利要求57所述的方法,其中,a):b):c)的比例为约0.5至1.75:约0.75至2.25:约0.5至1.75(重量:重量:重量)。
72.根据权利要求57所述的方法,其中,各个a)、b)和c)于一个或多个封闭末端线性双链核酸分子上提供。
73.根据权利要求57所述的方法,其中,经转染的核酸a)、b)和c)为合成的且没有DNA的真核和原核细胞修饰。
74.根据权利要求57所述的方法,其中,a):b):c)的比例为约1:约1至1.6:约1(重量:重量:重量)。
75.根据权利要求57所述的方法,其中,a)编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列包含编码Ad辅助蛋白的核苷酸序列,任选地,编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列包含编码腺病毒辅助蛋白E2A和E4的核苷酸序列。
76.根据权利要求57所述的方法,其中,来自a)、b)和c)的DNA的总量为0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.2、1.4、1.6或1.8μg。
77.根据权利要求76所述的方法,其中,来自a)、b)和c)的DNA的总量约为0.75μg。
78.根据权利要求57所述的方法,其中,于转染之前,以逐渐增加的体积培养所述哺乳动物细胞系的悬浮液。
79.根据权利要求57所述的方法,其中,培养体积自约50ml体积逐渐增加至约2000公升体积。
80.根据权利要求57所述的方法,其中,培养体积自约50ml体积逐渐增加到约100公升体积。
81.根据权利要求79所述的方法,其中,所述培养体积包含浓度为约1mM至约20mM的氨基酸。
82.根据权利要求79或80所述的方法,其中,具有约5公升体积的培养基包含约10mM浓度的氨基酸。
83.根据权利要求81或82所述的方法,其中,所述氨基酸是L-谷氨酰胺。
84.根据权利要求83所述的方法,其中,所述细胞于50公升至100公升的培养体积中。
85.根据权利要求57所述的方法,其中,具有约50公升体积的培养基包含:至少约1mM至约20mM的L-谷氨酰胺、至少约0.01%至约1%的非离子表面活性剂多元醇或洗涤剂以及至少约0.001%至约1%的消泡剂。
86.根据权利要求85所述的方法,其中,所述非离子表面活性剂多元醇包括普流尼克酸。
87.根据权利要求57所述的方法,其中,所述转染组合物包含至少约5%体积/体积(v/v)至约20%v/v的培养基。
88.根据权利要求57所述的方法,其中,所述转染组合物包含约1公升至约5公升的培养基。
89.根据权利要求57所述的方法,其中,所述转染组合物包含5至50%(体积/体积)的培养基。
90.根据权利要求57所述的方法,其中,添加至转染的核酸序列包含:约0.1μg至约1μg每0.5×106至约5×106个细胞的Ad辅助DNA、Rep/Cap DNA或转基因。
91.根据权利要求1、34或57中任一项所述的方法,其中,所述rAAV的经包装的核酸还缺乏真核DNA序列。
92.根据权利要求57所述的方法,其中,AAV Rep和AAV Cap基因来自相同的AAV血清型。
93.根据权利要求57所述的方法,其中,所述AAV Rep和AAV Cap基因来自不同的AAV血清型。
94.根据权利要求57所述的方法,其中,所述AAV ITR和AAV Cap基因来自相同的AAV血清型。
95.根据权利要求57所述的方法,其中,所述AAV ITR和AAV Cap基因来自不同的AAV血清型。
96.根据权利要求57所述的方法,其中,所述AAV ITR序列来自AAV2或来自选自由AAV1、3a、3b、4、5、6、7、8、9、10、11和13所组成群组的血清型。
97.根据权利要求57所述的方法,其中,所述Cap基因来自AAV8血清型。
98.根据权利要求57所述的方法,其中,所述封闭末端线性双链核酸包含1/2的蛋白端粒酶结合位点。
99.根据权利要求98所述的方法,其中,通过包含长度至少为10个碱基对的双链回文序列的靶结合位点的蛋白端粒酶消化形成所述1/2的蛋白端粒酶结合位点。
100.一种通过根据权利要求1、34或57中任一项所述的方法所产生的缺乏原核DNA的rAAV病毒粒子的群体。
101.一种包含蛋白端粒酶靶序列的重组腺相关病毒(rAAV)。
102.根据权利要求101所述的rAAV,其中,所述蛋白端粒酶靶序列包含长度为至少10个碱基对的双链回文序列。
103.根据权利要求101所述的rAAV,还包含转基因。
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