JP7444521B2 - 臨床使用に適した無血清懸濁細胞培養システムにおいて組換えアデノ随伴ウイルス（ａａｖ）ベクターを産生するスケーラブルな方法 - Google Patents

Description

[0002]本発明は、核酸、例えばプラスミドを用いた細胞の形質導入（形質移入）の分野に関する。より詳細には、本発明は、形質導入細胞を産生するための組成物及び方法を提供し、前記細胞は、任意選択でアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを産生する。

［緒言］
[0003]本発明が属する技術の現状を説明するために、本明細書全体にわたりいくつかの刊行物及び特許文書が引用されている。これらの引用のそれぞれは、全部が明記されているかのように、参照により本明細書に組み込まれている。

[0004]本発明は、任意選択で細胞と組み合わせた、目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸などの核酸（プラスミド）と、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）との組成物を提供する。一実施形態では、組成物は、複数種の成分、すなわち（ａ）ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及び／又はヘルパータンパク質をコードする核酸を含む１種又は複数種のプラスミド；（ｂ）目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含むプラスミド；並びに（ｃ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）溶液を有する、プラスミド／ＰＥＩ混合物を含む。特定の態様では、プラスミドは、約１：０．０１～約１：１００のモル比範囲又は約１００：１～約１：０．０１のモル比範囲であり、成分（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の混合物は、任意選択で約１０秒～約４時間の期間インキュベートされたものである。

[0005]さらなる実施形態では、核酸（プラスミド）とポリエチレンイミン（ＰＥＩ）との組成物は、細胞をさらに含む。特定の態様では、細胞は、成分（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）のプラスミド／ＰＥＩ混合物と接触している。

[0006]追加的な実施形態では、任意選択で細胞と組み合わせた、核酸（プラスミド）とポリエチレンイミン（ＰＥＩ）との組成物は、遊離ＰＥＩをさらに含む。特定の態様では、細胞は、遊離ＰＥＩと接触している。

[0007]様々なさらなる実施形態では、細胞は、成分（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の混合物と少なくとも約４時間、又は約４時間～約１４０時間、又は約４時間～約９６時間接触していたものである。特定の態様では、細胞は、成分（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）並びに任意選択で遊離ＰＥＩの混合物と少なくとも約４時間接触していたものである。

[0008]本発明の組成物は、容器に存在し得る。特定の態様では、容器は、フラスコ、プレート、バッグ、若しくはバイオリアクターである、任意選択で無菌である、及び／又は容器は、任意選択で細胞の生存若しくは成長を維持するために適している。

[0009]本発明のプラスミド、組成物及び方法は、ＡＡＶカプシドタンパク質などのウイルスタンパク質をコードする核酸をとりわけ含む。そのようなプラスミド及び細胞は、遊離ＰＥＩと接触している場合がある。特定の態様では、プラスミド及び／又は細胞は、遊離ＰＥＩと少なくとも約４時間、又は約４時間～約１４０時間、又は約４時間～約９６時間接触していたものである。

[0010]プラスミドを用意するステップ；ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む溶液を用意するステップ；及び核酸（プラスミド）をＰＥＩ溶液と混合して、プラスミド／ＰＥＩ混合物を産生するステップを含む、形質移入細胞を産生する方法も提供されている。特定の態様では、そのような混合物は、約１０秒～約４時間の範囲の期間インキュベートされる。そのような方法では、次に、細胞をプラスミド／ＰＥＩ混合物と接触させて、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を産生し；次に、産生した核酸／ＰＥＩ細胞培養物に遊離ＰＥＩを添加して、遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を産生し；次に、産生した遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物が、少なくとも約４時間インキュベートされ、それにより、形質移入細胞を産生する。特定の態様では、プラスミドは、目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含む。

[0011]組換えＡＡＶベクターを産生する形質移入細胞を産生する方法であって、ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及び／又はヘルパータンパク質をコードする核酸を含む１種又は複数種のプラスミドを用意するステップ；目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含むプラスミドを用意するステップ；ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む溶液を用意するステップ；前記プラスミドをＰＥＩ溶液と混合して、プラスミド／ＰＥＩ混合物を産生する（及び任意選択でプラスミド／ＰＥＩ混合物を約１０秒～約４時間の範囲の期間インキュベートする）ステップであって、プラスミドが、約１：０．０１～約１：１００のモル比範囲又は約１００：１～約１：０．０１のモル比範囲であるステップ；細胞をプラスミド／ＰＥＩ混合物と接触させて、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を産生するステップ；産生したプラスミド／ＰＥＩ細胞培養物に遊離ＰＥＩを添加して、遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を産生するステップ；並びに遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を少なくとも約４時間インキュベートし、それにより、目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクターを産生する形質移入細胞を産生するステップを含む方法が、さらに提供される。

[0012]目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクターを産生する方法であって、ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及び／又はヘルパータンパク質をコードする核酸を含む１種又は複数種のプラスミドを用意するステップ；目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含むプラスミドを用意するステップ；ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む溶液を用意するステップ；前記プラスミドをＰＥＩ溶液と混合して、プラスミド／ＰＥＩ混合物を産生する（及び任意選択でプラスミド／ＰＥＩ混合物を約１０秒～約４時間の範囲の期間インキュベートする）ステップであって、プラスミドが、約１：０．０１～約１：１００のモル比範囲又は約１００：１～約１：０．０１のモル比範囲であるステップ；細胞を、記載されたように産生したプラスミド／ＰＥＩ混合物と接触させて、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を産生するステップ；記載されたように産生したプラスミド／ＰＥＩ細胞培養物に遊離ＰＥＩを添加して、遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を産生するステップ；産生したプラスミド／ＰＥＩ細胞培養物又は遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を少なくとも約４時間インキュベートして、形質移入細胞を産生するステップ；産生した形質移入細胞及び／又は産生した形質移入細胞からの培養培地を収集して、細胞及び／又は培養培地収集物を産生するステップ；並びに産生した細胞及び／又は培養培地収集物から組換えＡＡＶベクターを単離及び／又は精製し、それにより、目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクターを産生するステップを含む方法が、追加的に提供される。

[0013]目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を有する組換えＡＡＶベクターを産生する形質移入細胞を産生する方法が、なおさらに提供される。一実施形態では、方法は、成分（ｉ）ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及び／又はヘルパータンパク質をコードする核酸を含む１種又は複数種のプラスミド、（ｉｉ）目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含むプラスミド；並びに（ｉｉｉ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）溶液の混合物を用意するステップ；プラスミドが約１：０．０１～約１：１００のモル比範囲又は約１００：１～約１：０．０１のモル比範囲となるように、プラスミド（ｉ）及び（ｉｉ）をＰＥＩ溶液（ｉｉｉ）と混合して、プラスミド／ＰＥＩ混合物を産生するステップ（並びに任意選択でプラスミド／ＰＥＩ混合物を約１０秒～約４時間の範囲の期間インキュベートするステップ）；細胞を、産生したプラスミド／ＰＥＩ混合物と接触させて、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を産生するステップ；プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物に遊離ＰＥＩを添加して、遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を産生するステップ；並びにプラスミド／ＰＥＩ細胞培養物又は遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を少なくとも約４時間インキュベートして、目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクターを産生する形質移入細胞を産生するステップを含む。

[0014]本発明の方法及び組成物は、１つ又は複数のステップ又は特徴を含む可能性がある。例示的なステップ又は特徴は、限定されないが、細胞及び／又は培養培地収集物を産生するために、産生した形質移入細胞を収集する及び／又は産生した形質移入細胞から培養培地を収集するステップを含む。追加の例示的なステップ又は特徴は、限定されないが、細胞及び／又は培養培地収集物から組換えＡＡＶベクターを単離及び／又は精製し、それにより、目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクターを産生するステップを含む。

[0015]目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクターを産生する方法が、なおさらに提供される。一実施形態では、方法は、成分（ｉ）ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及び／又はヘルパータンパク質をコードする核酸を含む１種又は複数種のプラスミド、（ｉｉ）目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含むプラスミド；並びに（ｉｉｉ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）溶液の混合物を用意するステップ、プラスミドが、約１：０．０１～約１：１００のモル比範囲、又は約１００：１～約１：０．０１のモル比範囲となるように、プラスミド（ｉ）及び（ｉｉ）をＰＥＩ溶液（ｉｉｉ）と混合して、プラスミド／ＰＥＩ混合物を産生する（並びに任意選択でプラスミド／ＰＥＩ混合物を約１０秒～約４時間の期間インキュベートする）ステップ；細胞を産生したプラスミド／ＰＥＩ混合物と接触させて、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を産生するステップ；産生したプラスミド／ＰＥＩ細胞培養物に遊離ＰＥＩを添加して、遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を産生するステップ；プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物又は遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を少なくとも約４時間インキュベートして、形質移入細胞を産生するステップ；産生した形質移入細胞及び／又は産生した形質移入細胞からの培養培地を収集して、細胞及び／又は培養培地収集物を産生するステップ；並びに産生した細胞及び／又は培養培地収集物から組換えＡＡＶベクターを単離及び／又は精製し、それにより、目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクターを産生するステップを含む。

[0016]目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクターを産生する方法が、なお追加的に提供される。一実施形態では、方法は、成分（ｉ）ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及び／又はヘルパータンパク質をコードする核酸を含む１種又は複数種のプラスミド；（ｉｉ）目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含むプラスミド；並びに（ｉｉｉ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）溶液の混合物を用意するステップであって、プラスミド（ｉ）及び（ｉｉ）が、約１：０．０１～約１：１００のモル比範囲又は約１００：１～約１：０．０１のモル比範囲であり、成分（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の混合物が、任意選択で約１０秒～約４時間の期間インキュベートされたものである、ステップ；産生した混合物と細胞を接触させて、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を産生するステップ；産生したプラスミド／ＰＥＩ細胞培養物に遊離ＰＥＩを添加して、遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を産生するステップ；プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物又は遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を少なくとも約４時間インキュベートして、形質移入細胞を産生するステップ；産生した形質移入細胞及び／又は産生した形質移入細胞からの培養培地を収集して、細胞及び／又は培養培地収集物を産生するステップ；並びに産生した細胞及び／又は培養培養培地収集物から組換えＡＡＶベクターを単離及び／又は精製し、それにより、目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクターを産生するステップを含む。

[0017]組成物及び方法は、１つ又は複数の追加的なステップ又は特徴も含む場合がある。そのようなステップ又は特徴は、限定されないが、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物、又は遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物、又は核酸／ＰＥＩ細胞培養物が、約４時間～約１４０時間の範囲の期間又は約４時間～約９６時間の範囲の期間インキュベートされるものを含む。そのようなステップ又は特徴は、限定されないが、プラスミド／ＰＥＩ混合物が、約０．１：１～約５：１の範囲のＰＥＩ：プラスミド重量比若しくは約５：１～約０．１：１の範囲のＰＥＩ：プラスミド重量比を有する、又は遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物が、約０．１：１～約５：１の範囲のＰＥＩ：プラスミド重量比若しくは約５：１～約０．１：１の範囲のＰＥＩ：プラスミド重量比を有するものを含む。そのようなステップ又は特徴は、限定されないが、プラスミド／ＰＥＩ混合物が、約１：１～約５：１の範囲のＰＥＩ：プラスミド重量比若しくは約５：１～約１：１の範囲のＰＥＩ：プラスミド重量比を有する、又は遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物が、約１：１～約５：１の範囲のＰＥＩ：プラスミド重量比若しくは約５：１～約１：１の範囲のＰＥＩ：プラスミド重量比を有するものを含む。

[0018]本発明の組成物及び方法に適用可能なＰＥＩの形態（遊離ＰＥＩ、総ＰＥＩ、プラスミド／ＰＥＩ混合物、又はプラスミド／ＰＥＩ混合物と接触した細胞）は、加水分解直鎖状ポリエチレンイミンを含む。特定の態様では、ＰＥＩ（遊離ＰＥＩ、総ＰＥＩ、プラスミド／ＰＥＩ混合物、又はプラスミド／ＰＥＩ混合物と接触した細胞）は、約４，０００～約１６０，０００の範囲の分子量及び／若しくは遊離塩基形態で約２，５００～約２５０，０００の範囲の分子量を有する加水分解直鎖状ポリエチレンイミン、又は分子量約４０，０００及び／若しくは遊離塩基形態で分子量約２５，０００を有する加水分解型直鎖状ポリエチレンイミンを含む。

[0019]様々な実施形態では、総ＰＥＩ中の窒素（Ｎ）とプラスミド中のリン酸（Ｐ）とのモル比は、遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物において約１：１～約５０：１（Ｎ：Ｐ）の範囲である。他の実施形態では、総ＰＥＩ中の窒素（Ｎ）とプラスミド中のリン酸（Ｐ）とのモル比は、遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物において約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、又は１０：１（Ｎ：Ｐ）である。

[0020]本発明による組成物及び方法は、ある期間インキュベートされたプラスミド／ＰＥＩ混合物を有する可能性がある。特定の態様では、インキュベーションは、約３０秒～約４時間の範囲である。より特定の態様では、プラスミド／ＰＥＩ混合物のインキュベーションは、約１分～約３０分の範囲である。

[0021]本発明による組成物及び方法は、モル比又は重量（質量）のいずれかの様々なパーセント量でＰＥＩを有する可能性がある。特定の実施形態では、遊離ＰＥＩの量は、総ＰＥＩの約１０％～約９０％の範囲である、又は遊離ＰＥＩの量は、総ＰＥＩの約２５％～約７５％の範囲である、又は遊離ＰＥＩの量は、総ＰＥＩの約５０％である。

[0022]本発明による組成物及び方法は、ＰＥＩを様々な時点でプラスミド及び／又は細胞に添加させる可能性がある。特定の実施形態では、遊離ＰＥＩは、プラスミド／ＰＥＩ混合物が細胞と接触する前、同時、又は後に細胞に添加される。

[0023]本発明による組成物及び方法は、哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｅ又はＨＥＫ２９３Ｆ細胞）を含む。そのような細胞は、接着性又は懸濁培養中であり得る。特定の態様では、細胞は、無血清培養培地で成長又は維持される。

[0024]本発明による組成物及び方法は、特定の密度及び／又は細胞成長期及び／又は生存率の細胞を有し得る。特定の実施形態では、細胞は、プラスミド／ＰＥＩ混合物及び／又は遊離ＰＥＩと接触するときに、細胞約１×１０^５個／ｍＬ～約１×１０^８個／ｍＬの範囲の密度である。追加的な特定の実施形態では、プラスミド／ＰＥＩ混合物若しくは遊離ＰＥＩと接触するときに、細胞の生存率は約６０％若しくは６０％超であり、又はプラスミド／ＰＥＩ混合物と接触するときに、細胞は対数期成長中であり、又はプラスミド／ＰＥＩ混合物若しくは遊離ＰＥＩと接触するときに、細胞の生存率は、約９０％若しくは９０％超であり、又はプラスミド／ＰＥＩ混合物若しくは遊離ＰＥＩと接触するときに、細胞は対数期成長中である。

[0025]コードされるＡＡＶパッケージングタンパク質は、例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ及び／又はＡＡＶ ｃａｐを含む。そのようなＡＡＶパッケージングタンパク質は、例えば、任意のＡＡＶ血清型のＡＡＶ ｒｅｐ及び／又はＡＡＶ ｃａｐタンパク質を含む。

[0026]コードされるヘルパータンパク質は、例えば、アデノウイルスＥ２及び／若しくはＥ４、ＶＡＲＮＡタンパク質、並びに／又は非ＡＡＶヘルパータンパク質を含む。

[0027]本発明による組成物及び方法は、核酸（プラスミド）を特定の量又は比で有し得る。特定の実施形態では、目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含むプラスミドと、ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及び／又はヘルパータンパク質をコードする核酸を含む１種又は複数種のプラスミドとの合計量は、細胞１ｍＬあたり約０．１μｇ～約１５μｇの範囲である。追加的な特定の実施形態では、目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含むプラスミドと、ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及び／又はヘルパータンパク質をコードする核酸を含む１種又は複数種のプラスミドとのモル比は、約１：５～約１：１の範囲又は約１：１～約５：１の範囲である。

[0028]プラスミドは、異なる又は同じプラスミドに核酸を含み得る。一実施形態では、第１のプラスミドは、ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸を含み、第２のプラスミドは、ヘルパータンパク質をコードする核酸を含む。より特定の実施形態では、目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含むプラスミドと、ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸を含む第１のプラスミドと、ヘルパータンパク質をコードする核酸を含む第２のプラスミドとのモル比は、約１～５：１：１、又は１：１～５：１、又は１：１：１～５の範囲である。

[0029]本発明による組成物及び方法は、任意の血清型のＡＡＶベクター又はそのバリアントを含む。一実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型１～１２、ＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３カプシドタンパク質、又は改変若しくはバリアントＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３カプシドタンパク質、又は野生型ＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３カプシドタンパク質のうちのいずれかを含む。追加的な特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型又はＡＡＶ偽型を含み、その際、ＡＡＶ偽型は、ＩＴＲ血清型と異なるＡＡＶカプシド血清型を含む。

[0030]ＡＡＶベクターを提供する又は含む本発明による組成物及び方法は、他のエレメントも含み得る。そのようなエレメントの例には、限定されないが、イントロン、発現制御エレメント、１つ若しくは複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）及び／又はフィラーポリヌクレオチド配列が含まれる。そのようなエレメントは、目的のタンパク質をコードする若しくは目的の転写物に転写される核酸の内部にある若しくはそれに隣接している可能性があり、又は発現制御エレメントは、目的のタンパク質をコードする若しくは目的の転写物に転写される核酸に作動可能に連結している可能性があり、又はＡＡＶ ＩＴＲ（複数可）は、目的のタンパク質をコードする若しくは目的の転写物に転写される核酸の５’若しくは３’末端に隣接している可能性があり、又はフィラーポリヌクレオチド配列は、目的のタンパク質をコードする若しくは目的の転写物に転写される核酸の５’若しくは３’末端に隣接している可能性がある。

[0031]発現制御エレメントは、組織特異的発現制御エレメント又はプロモーター（例えば肝臓で発現を実現する）などの構成的又は調節可能制御エレメントを含む。

[0032]ＩＴＲは、ＡＡＶ２若しくはＡＡＶ６血清型、又はその組合せのうちのいずれかであり得る。ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、若しくはＡＡＶ－２ｉ８のＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３カプシドタンパク質のうちのいずれかと７５％以上の配列同一性を有する任意のＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３カプシドタンパク質を含む可能性があり、又はＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、及びＡＡＶ－２ｉ８のＡＡＶ血清型のうちのいずれかから選択される改変若しくはバリアントＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３カプシドタンパク質を含む。

[0033]本発明の組成物及び方法では、細胞は、培養物からの細胞の希釈又は除去によって減少した細胞密度などに継代培養することができる。一実施形態では、細胞は、プラスミド／ＰＥＩ混合物と接触する前に、減少した細胞密度に継代培養される。

[0034]本発明の組成物及び方法では、細胞は、様々な密度で採用することができる。一実施形態では、細胞は、プラスミド／ＰＥＩ混合物と接触する前に、細胞約０．１×１０^６個／ｍｌ～約５．０×１０^６個／ｍｌの範囲の細胞密度に培養又は継代培養される。

[0035]本発明の組成物及び方法では、細胞は、ＰＥＩ（遊離ＰＥＩ、総ＰＥＩ、プラスミド／ＰＥＩ混合物）と短期間又は長期間接触している可能性がある。一実施形態では、細胞は、継代培養の後に、プラスミド／ＰＥＩ混合物と２日～５日の間の期間接触している。別の実施形態では、細胞は、継代培養の後に、３日～４日の間の期間プラスミド／ＰＥＩ混合物と接触している。

[0036]本発明の組成物及び方法は、高い細胞形質移入効率及び／又は細胞によるベクターの組換え産生を提供する。一実施形態では、形質移入細胞に導入されるプラスミドの量は、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物に遊離ＰＥＩを添加するステップのない状態と比較して、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物に遊離ＰＥＩを添加するステップのある状態で、少なくとも５０％大きい。別の実施形態では、産生した組換えＡＡＶベクターの量は、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物に遊離ＰＥＩを添加するステップのない状態と比較して、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物に遊離ＰＥＩと添加するステップのある状態で、少なくとも５０％以上である。さらなる実施形態では、産生した組換えＡＡＶベクターの量は、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物に遊離ＰＥＩを添加するステップのない状態と比較して、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物に遊離ＰＥＩと添加するステップのある状態で、１～５、５～１０又は１０～２０倍である。

プラスミドＤＮＡを２．８、５．６及び１１．２μｇ／ｍＬで使用した場合の、トリスＨＣ１又はＨ_２Ｏのいずれかに溶解したＰＥＩ「Ｍａｘ」４０ＫＤａ（Ａ）及びＰＥＩ ２５ＫＤａ（Ｂ）の形質移入効率を示す図である。ＰＥＩ「Ｍａｘ」４０ＫＤａは、ＰＥＩ ２５ＫＤａと比較して一貫して高い形質移入効率を示した。 １２ウェルプレートにおける形質移入効率及びｒＡＡＶベクター産生に及ぼす遊離ＰＥＩの効果を示す図である。Ａ）１２ウェルプレートにおける無血清懸濁培養物への３種のプラスミド（ｐＡＡＶ－ｅＧＦＰ－ＷＲＰＥ、ｐＡＡＶ－Ｒｅｐ２／Ｃａｐ２、ｐＡＤ２－Ｈｅｌｐｅｒ）を用いた２９３Ｆ細胞の形質移入。Ｂ）ｒＡＡＶ力価に及ぼす遊離ＰＥＩの効果。遊離ＰＥＩを添加する又は添加しない形質移入時のＰＥＩ／ＤＮＡ重量比は、２：１又は４：１であった。３種のプラスミドについてモル比１：１：１でＤＮＡ量２．８μｇ／ｍＬを使用した。希釈したＰＥＩを、希釈したＤＮＡと重量比１：１で最初に混合して、複合体を形成させた。過剰のＰＥＩを培養培地５０μＬ中に希釈し、次に細胞に直接添加した。 １２ウェルプレートにおける形質移入効率及びｒＡＡＶベクター産生に及ぼす遊離ＰＥＩの効果を示す図である。Ａ）１２ウェルプレートにおける無血清懸濁培養物への３種のプラスミド（ｐＡＡＶ－ｅＧＦＰ－ＷＲＰＥ、ｐＡＡＶ－Ｒｅｐ２／Ｃａｐ２、ｐＡＤ２－Ｈｅｌｐｅｒ）を用いた２９３Ｆ細胞の形質移入。Ｂ）ｒＡＡＶ力価に及ぼす遊離ＰＥＩの効果。遊離ＰＥＩを添加する又は添加しない形質移入時のＰＥＩ／ＤＮＡ重量比は、２：１又は４：１であった。３種のプラスミドについてモル比１：１：１でＤＮＡ量２．８μｇ／ｍＬを使用した。希釈したＰＥＩを、希釈したＤＮＡと重量比１：１で最初に混合して、複合体を形成させた。過剰のＰＥＩを培養培地５０μＬ中に希釈し、次に細胞に直接添加した。 形質移入効率及びスピナーフラスコにおけるｒＡＡＶ力価に及ぼす遊離ＰＥＩの効果を示す。遊離ＰＥＩを使用することによって形質移入効率が増加した。 形質移入効率及びスピナーフラスコにおけるｒＡＡＶ力価に及ぼす遊離ＰＥＩの効果を示す。ｒＡＡＶ力価に及ぼす遊離ＰＥＩの効果。ＰＥＩ／ＤＮＡ重量比は２：１であり、ＤＮＡ量は２．８μｇ／ｍＬであった。ＰＥＩ量の１／２及び１／３を遊離ＰＥＩとして形質移入時に使用した。 バイオリアクターにおける２９３Ｆ細胞の成長曲線及び生存率を示す図である。細胞を細胞０．２５×１０^６個／ｍＬ（ユニット１）、細胞０．３５×１０^６個／ｍＬ（ユニット２）及び細胞０．５×１０^６個／ｍＬ（ユニット３）で播種した。バイオリアクターで７日間細胞培養する間に細胞密度（Ｎ）及び生存率（Ｖ）を１２時間毎に記録した。 バイオリアクターでの細胞形質移入を示す図である。２９３Ｆ細胞に３種のプラスミドを最大７２時間形質移入した。ＧＦＰ陽性細胞を倒立蛍光顕微鏡で検出した。 バイオリアクターでの細胞形質移入を示す図である。形質移入効率をフローサイトメトリーで測定した。ＧＦＰ陽性細胞の５０％～６０％を形質移入の４８～７２時間後に検出した。形質移入効率は、３日目の形質移入と４日目の形質移入との間で類似していた。 ｒＡＡＶ力価及びベクター機能アッセイを示す図である。ベクター力価は、ｑＰＣＲによって評価した３日目よりも４日目の形質移入の方が有意に高かった。最高力価は、４日目の形質移入条件及び撹拌速度１５０ｒｐｍで１．３８Ｅ＋１１ｖｇ／ｍＬであった。 ｒＡＡＶ力価及びベクター機能アッセイを示す図である。形質導入アッセイによってベクター機能を測定した。同体積の細胞溶解物をＨＥＫ２９３細胞に添加した。倒立蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰ陽性細胞を検出した。形質導入の結果は、ｒＡＡＶの力価と矛盾しなかった。換言すれば、より高い力価は、より高い形質導入率と相関した。

[0043]細胞に核酸（例えばプラスミド）などの分子を高効率で形質導入する組成物及び方法が、本明細書において開示されている。そのような高効率で形質導入された細胞は、目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される配列を含む核酸が形質導入されると、タンパク質及び／又は転写物を高効率で産生することができる。追加的に、そのような細胞は、ウイルスパッケージングタンパク質及び／又はヘルパータンパク質をコードするプラスミドなどの配列が形質導入されると、目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される配列を含む核酸を含む組換えベクターを産生することができ、そして次に組換えウイルスベクターを高収率で産生する。

[0044]本発明は、現行の「業界標準」ウイルス（例えばＡＡＶ）ベクター産生工程と区別する特徴を含む細胞形質導入及び／又はウイルス（例えばＡＡＶ）ベクター産生プラットフォームを提供する。本発明の組成物及び方法は、ＰＥＩを核酸とある特定の条件で混合することによって特徴付けられる。ＰＥＩを核酸と混合する結果として、ＰＥＩが誘導する核酸の効率的な圧密が生じて、ポリプレックスと呼ばれる安定な複合体を形成させる。核酸を細胞に導入する方法は、ある特定の条件でＰＥＩと混合された核酸を提供するステップ、及び結果として生じた混合物を細胞に適用するステップを含む。さらに、本発明の組成物及び方法は、細胞にＰＥＩ／核酸混合物を適用するステップに対して特定の順序で、遊離ＰＥＩと接触した細胞、又は細胞を遊離ＰＥＩと接触させることによって特徴付けられる。本発明の組成物及び方法は、１）高効率の核酸の細胞形質導入／形質移入；３）ベクターの予想外の実質的な収率を付与する試薬と工程ステップとの独特な組合せ；及び４）異なるＡＡＶ血清型／カプシドバリアントの産生のために使用することができるモジュール式プラットフォームによって特徴付けられる。

[0045]用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含めた全ての形態の核酸、オリゴヌクレオチドを表すために本明細書において互換的に使用される。核酸及びポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びアンチセンスＤＮＡ、並びにスプライス又は非スプライスｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及び阻害性ＤＮＡ又はＲＮＡ（ＲＮＡｉ、例えば、低分子若しくは短鎖ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子若しくは短鎖干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡ）を含む。核酸及びポリヌクレオチドは、天然、合成、及び意図的に改変又は変更された配列（例えばバリアント核酸）を含む。

[0046]核酸又はプラスミドは、タンパク質をコードする配列を表すこともできる。そのようなタンパク質は、野生型又はバリアント、改変若しくはキメラタンパク質であり得る。「バリアントタンパク質」は、野生型タンパク質と比較してアミノ酸変更を有するような改変タンパク質を意味し得る。

[0047]核酸又はプラスミドによってコードされるタンパク質は、治療用タンパク質を含む。非限定的な例は、血液凝固因子（例えば、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、又はプロテインＣ）、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜貫通制御タンパク質）、抗体、網膜色素上皮特異６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）、エリスロポエチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β－グロビン、α－グロビン、スペクトリン、α－アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、金属輸送体（ＡＴＰ７Ａ又はＡＴＰ７）、スルファミダーゼ、ライソゾーム蓄積症に関係する酵素（ＡＲＳＡ）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β－２５グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼ、分枝鎖ケト酸脱水素酵素、ホルモン、成長因子（例えば、インスリン様成長因子１及び２、血小板由来成長因子、上皮成長因子、神経成長因子、神経栄養因子３及び４、脳由来神経栄養因子、グリア細胞由来成長因子、形質転換成長因子α及びβなど）、サイトカイン（例えば、α－インターフェロン、β－インターフェロン、インターフェロンγ、インターロイキン２、インターロイキン４、インターロイキン１２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシンなど）、自殺遺伝子産物（例えば、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、シトクロムＰ４５０、デオキシシチジンキナーゼ、腫瘍壊死因子など）、薬剤耐性タンパク質（例えば、がん治療に使用される薬物に対する耐性をもたらすもの）、腫瘍抑制タンパク質（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ－１、ＮＦ１、フォンヒッペル－リンダウ（ＶＨＬ）、腺腫性結腸ポリポーシス（ＡＰＣ））、免疫調節性を有するペプチド、寛容原性若しくは免疫原性ペプチド性若しくはタンパク質性Ｔレジトープ（Ｔｒｅｇｉｔｏｐｅ）、又はｈＣＤＲ１、インスリン、グルコキナーゼ、グアニル酸シクラーゼ２Ｄ（ＬＣＡ－ＧＵＣＹ２Ｄ）、Ｒａｂエスコートタンパク質１（コロイデレミア）、ＬＣＡ５（ＬＣＡ－レベルシリン（Ｌｅｂｅｒｃｉｌｉｎ））、オルニチンケト酸アミノトランスフェラーゼ（脳回転状萎縮症）、レチノスキシン１（Ｘ連鎖性網膜分離症）、ＵＳＨ１Ｃ（アッシャー症候群１Ｃ）、Ｘ連鎖性網膜色素変性ＧＴＰアーゼ（ＸＬＲＰ）、ＭＥＲＴＫ（ＡＲ型のＲＰ：網膜色素変性）、ＤＦＮＢ１（コネキシン２６難聴）、ＡＣＨＭ２、３及び４（色盲）、ＰＫＤ－１又はＰＫＤ－２（多発性嚢胞腎疾患）、ＴＰＰ１、ＣＬＮ２、ライソゾーム蓄積症の原因遺伝子欠損（例えば、スルファターゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－リン酸トランスフェラーゼ、カテプシンＡ、ＧＭ２－ＡＰ、ＮＰＣ１、ＶＰＣ２，スフィンゴ脂質活性化因子タンパク質など）、ゲノム編集のための１種若しくは複数種のジンクフィンガーヌクレアーゼ、又はゲノム編集のための修復鋳型として使用されるドナー配列を含む。

[0048]核酸又はプラスミドは、転写された場合に転写物を産生する配列も表すことができる。そのような転写物は、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ、例えば、低分子若しくは短鎖ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子若しくは短鎖干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡ）などのＲＮＡであり得る。

[0049]非限定的な例は、ハンチンチン（ＨＴＴ）遺伝子、歯状核赤核淡蒼球ルイ体委縮症関連遺伝子（例えばアトロフィン１、ＡＴＮ１）、球脊髄性筋萎縮症におけるＸ染色体のアンドロゲン受容体、ヒトアタキシン（Ａｔａｘｉｎ）１，２，３及び７、（ＣＡＣＮＡ１Ａ）によってコードされる電位依存性カルシウムチャネルＣａ_ｖ２．１ Ｐ／Ｑ、ＴＡＴＡ結合タンパク質、ＡＴＸＮ８ＯＳとしても公知のアタキシン８逆鎖、脊髄小脳失調（１、２、３、６、７、８、１２、１７型）におけるセリン－トレオニンタンパク質ホスファターゼ２Ａの５５ｋＤａ調節サブユニットＢベータアイソフォーム、脆弱性Ｘ症候群におけるＦＭＲ１（脆弱性Ｘ精神遅滞１）、脆弱Ｘ関連振戦／運動失調症候群におけるＦＭＲ１（脆弱性Ｘ精神遅滞１）、脆弱性ＸＥ精神遅滞におけるＦＭＲ１（脆弱性Ｘ精神遅滞２）若しくはＡＦ４／ＦＭＲ２ファミリーメンバー２；筋強直性ジストロフィー症におけるミオトニンタンパク質キナーゼ（ＭＴ－ＰＫ）；フリートライヒ運動失調症におけるフラタキシン；筋萎縮性側索硬化症におけるスーパーオキシドディスムターゼ１（ＳＯＤ１）遺伝子変異体；パーキンソン病及び／若しくはアルツハイマー病の病態形成に関与する遺伝子；アポリポタンパク質Ｂ（ＡＰＯＢ）及び前駆タンパク質変換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、高コレステロール血症；ＨＩＶ Ｔａｔ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染におけるＨＩＶ転写トランス活性化因子遺伝子；ＨＩＶ ＴＡＲ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染におけるＨＩＶトランス活性化因子応答エレメント遺伝子；ＨＩＶ感染におけるＣ－Ｃケモカイン受容体（ＣＣＲ５）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）感染におけるＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質、Ｃ型肝炎ウイルス感染における肝臓特異的マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－１２２）；ｐ５３、急性腎損傷若しくは腎移植における移植腎機能発現遅延若しくは腎損傷急性腎不全；進行した再発性若しくは転移性の固形悪性腫瘍におけるタンパク質キナーゼＮ３（ＰＫＮ３）；転移性黒色腫におけるプロテアソームサブユニットベータ９型（ＰＳＭＢ９）としても知られるＬＭＰ２；転移性黒色腫におけるプロテアソームサブユニットベータ８型（ＰＳＭＢ８）としても知られるＬＭＰ７；転移性黒色腫におけるプロテアソームサブユニットベータ１０型（ＰＳＭＢ１０）としても知られるＭＥＣＬ１；固形腫瘍における血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；固形腫瘍におけるキネシン紡錘体タンパク質、慢性骨髄性白血病におけるアポトーシス抑制Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫（ＢＣＬ－２）；固形腫瘍におけるリボヌクレオチド還元酵素Ｍ２（ＲＲＭ２）；固形腫瘍におけるフューリン（Ｆｕｒｉｎ）；肝臓腫瘍におけるポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ１）、Ｃ型肝炎感染におけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１（ＤＧＡＴ１）、家族性大腸腺腫症におけるベータ－カテニン、緑内障におけるベータ２アドレナリン受容体；糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）若しくは加齢性黄斑変性症におけるＤＮＡ損傷誘導性転写物４タンパク質としても知られるＲＴＰ８０１／Ｒｅｄｄ１；加齢性黄斑変性症若しくは脈絡膜血管新生における血管内皮成長因子受容体Ｉ（ＶＥＧＦＲ１）、非動脈炎性虚血性視神経症におけるカスパーゼ２；先天性爪肥厚症におけるケラチン６Ａ Ｎ１７Ｋ変異型タンパク質、インフルエンザ感染におけるＡ型インフルエンザウイルスのゲノム／遺伝子配列；重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）感染におけるＳＡＲＳコロナウイルスのゲノム／遺伝子配列；呼吸器合胞体ウイルス感染における呼吸器合胞体ウイルスのゲノム／遺伝子配列；エボラ感染におけるエボラフィロウイルスのゲノム／遺伝子配列；Ｂ型及びＣ型肝炎感染におけるＢ型及びＣ型肝炎ウイルスのゲノム／遺伝子配列；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染におけるＨＳＶウイルスのゲノム／遺伝子配列、コクサッキーウイルスＢ３感染におけるコクサッキーウイルスＢ３のゲノム／遺伝子配列；原発性筋失調症におけるトルシンＡ（ＴＯＲ１Ａ）様遺伝子の病原性対立遺伝子のサイレンシング（対立遺伝子特異的サイレンシング）、移植における汎クラスＩ及びＨＬＡ対立遺伝子特異的；常染色体優性遺伝性網膜色素変性症（ａｄＲＰ）における変異型ロドプシン遺伝子の発現を阻害する阻害性核酸；又は前記の遺伝子若しくは配列のうちのいずれかの転写物と結合する阻害性核酸を含む。

[0050]核酸（プラスミド）は、一、二、又は三重鎖、直鎖状又は環状であり得、任意の長さであり得る。核酸（プラスミド）を論じる上で、特定のポリヌクレオチドの配列又は構造が、本明細書において５’から３’の方向に配列を提供するという慣例により記載される場合がある。

[0051]「プラスミド」は、プラスミドの発現（例えば、転写、複製など）又は繁殖（複製）のための追加的なエレメントを概して有する、核酸又はポリヌクレオチドの一形態である。本明細書に使用されるプラスミドは、そのような核酸又はポリヌクレオチド配列を参照するために使用することもできる。したがって、全ての態様では、本発明の組成物及び方法は、例えば、核酸又はポリヌクレオチドを細胞に導入して、細胞に核酸又はポリヌクレオチドを形質導入（形質移入）して、核酸又はポリヌクレオチドを有する形質導入（形質移入）細胞を産生して、ウイルス（例えばＡＡＶ）ベクターを産生する細胞を産生するため、ウイルス（例えばＡＡＶ）ベクターを産生するため、ウイルス（例えばＡＡＶ）ベクターを有する細胞培養培地を産生するためなどに、核酸及びポリヌクレオチドに適用することができる。

[0052]本発明の組成物及び方法は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。ＰＥＩは、カチオンポリマーであり、ポリプレックスと呼ばれる核酸との安定な複合体を形成することができる。任意の理論に縛られることを望むわけではないが、ポリプレックスは、エンドサイトーシスを経て細胞に導入されると考えられている。

[0053]ＰＥＩは、直鎖状ＰＥＩ又は分岐ＰＥＩであり得る。ＰＥＩは、塩形態又は遊離塩基であり得る。特定の実施形態では、ＰＥＩは、任意選択で加水分解型直鎖状ＰＥＩなどの直鎖ＰＥＩである。加水分解型ＰＥＩは、完全加水分解型又は部分加水分解型の場合がある。加水分解型直鎖状ＰＥＩは、非加水分解型直鎖状ＰＥＩと比べて高い比率の遊離（プロトン化可能）窒素、典型的には非加水分解直鎖状ＰＥＩと比べて少なくとも１～５％多い遊離（プロトン化可能）窒素、より典型的には非加水分解直鎖状ＰＥＩと比べて５～１０％多い遊離（プロトン化可能）窒素、又は最も典型的には非加水分解直鎖状ＰＥＩと比べて１０～１５％多い遊離（プロトン化可能）窒素を有する。

[0054]特定の実施形態では、ＰＥＩは、約４，０００～約１６０，０００の範囲の分子量及び／又は遊離塩基形態で約２，５００～約２５０，０００の範囲の分子量を有し得る。さらに特定の実施形態では、ＰＥＩは、分子量約４０，０００及び／又は遊離塩基形態で分子量約２５，０００を有し得る。具体的には、分子量約４０，０００及び／又は遊離塩基形態で分子量約２５，０００を有する直鎖状ＰＥＩ。加えて、化学改変直鎖状ＰＥＩ又は分岐ＰＥＩも使用することができる。ＰＥＩは、市販されている（例えば、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ、ＵＳＡ）。

[0055]本発明の組成物及び方法において、プラスミドなどの核酸がＰＥＩと混合されて、ＰＥＩ混合物又は溶液を形成する。そのような混合物又は溶液は、「プラスミド／ＰＥＩ混合物」又は「核酸／ＰＥＩ混合物」と呼ぶことができる。したがって、用語「プラスミド／ＰＥＩ混合物」及び「核酸／ＰＥＩ混合物」は、ＰＥＩが核酸／プラスミドと混合されたことを意味する。したがって、本明細書に示されるＰＥＩは、形質導入のために細胞と接触する前又は実質的に同時に核酸（プラスミド）と混合される場合がある。

[0056]本明細書に使用される用語「遊離ＰＥＩ」は、核酸（プラスミド）を実質的に又は完全に有さないＰＥＩを意味する。したがって、本明細書に示されるＰＥＩは、遊離ＰＥＩの形態でもあり得る。したがって、「プラスミド／ＰＥＩ混合物」又は「核酸／ＰＥＩ混合物」は、遊離ＰＥＩとは異なる。遊離ＰＥＩが実質的に遊離であるならば、存在する核酸（プラスミド）配列の量は、分子量又は質量によって決定されたときに約５％以下である。当然、その量は、５％未満、例えば、約４．５％以下、約４％以下、約３．５％以下、約３％以下、約２．５％以下、約２％以下、約１．５％以下、約１％以下、又は約０．５％以下であり得る。

[0057]本明細書に使用される用語「総ＰＥＩ」は、ＰＥＩ／プラスミド混合物中に存在するＰＥＩと遊離ＰＥＩとの合計を意味する。したがって、総ＰＥＩは、プラスミドと混合されたＰＥＩ及びプラスミドなどの核酸配列を実質的に又は全く有さないＰＥＩを含む。

[0058]ＰＥＩの量、比、組成物、溶液、溶媒及び緩衝液、ｐＨ、塩、並びに細胞接触及びインキュベーションのタイミング及び持続期間の開示は、１）プラスミド／ＰＥＩ混合物又は核酸／ＰＥＩ混合物中のＰＥＩ；２）遊離ＰＥＩとしてのＰＥＩ（すなわち、プラスミドなどの核酸又はポリヌクレオチド配列を実質的に又は全く有さないＰＥＩ）；及び３）総ＰＥＩ（プラスミド／ＰＥＩ混合物又は核酸／ＰＥＩ混合物中のＰＥＩ＋遊離ＰＥＩ）のうちの任意の１つ、任意の２つ、又は３つ全てに適用される。

[0059]特定の実施形態では、ＰＥＩは、水性（例えば水）溶液などの溶液である。追加的な特定の実施形態では、ＰＥＩは、酸性化又は中和されたＰＥＩである。用語「酸性化されたＰＥＩ」は、酸性溶媒にＰＥＩを溶解させることによって調製されたＰＥＩ溶液を意味する。酸性化ＰＥＩ溶液の酸性度は、典型的には、ｐＨ約０～約３．０、より典型的にはｐＨ約０．５～約２．０である。用語「中和されたＰＥＩ」は、ＰＥＩを中性溶媒又は緩衝液中に溶解させることによって調製されたＰＥＩ溶液を意味する。中和されたＰＥＩ溶液は、約６．０～約８．０の範囲のｐＨ、典型的には約６．５～約７．５の範囲のｐＨ、より典型的には約６．８～約７．２の範囲のｐＨ、最も典型的には約７．０～約７．２の範囲のｐＨ、例えば約７．１を有し得る。

[0060]ＰＥＩの形質移入活性を破壊せずにＰＥＩ溶液のｐＨを前記範囲内に樹立又は維持するために、任意の溶媒又は緩衝液を使用することができる。酸性溶媒の例は、塩酸（ＨＣＩ）などの鉱酸及びグリシン－塩酸溶液のようにｐＨが酸性領域の有機酸を含む。中性溶媒／緩衝液の非限定的な例は、トリス（トリズマ（ｔｒｉｚｍａ）塩基）及びＨＥＰＥＳを含む。緩衝液は、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、より典型的には約２ｍＭ～約５０ｍＭ、最も典型的には約５ｍＭ～約２０ｍＭの範囲であり得る。

[0061]ＰＥＩ溶液は、任意選択で塩を含み得る。塩の非限定的な例は、ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）及びマグネシウム（Ｍｇ）塩を含む。特定の態様では、ＰＥＩ溶液の塩濃度は、約５０ｍＭ～約５００ｍＭ、より典型的には約１００ｍＭ～約２５０ｍＭ、最も典型的には約１２５ｍＭ～約１７５ｍＭの範囲である。

[0062]核酸（プラスミド）とＰＥＩとの混合は、溶液中で核酸（プラスミド）とＰＥＩとを混合することによって実施される。混合は、ＰＥＩに基づく細胞形質導入に適合する任意の溶液中で起こることができる。非限定的な例は、本明細書に示される通りである。混合の後、核酸（プラスミド）／ＰＥＩ混合物を約１分～約８時間；約１０秒～約４時間；約１分～約６０分；約１分～約３０分；約１０分～約４５分；約１０分～約３０分；及び／又は約２０分～約３０分の期間インキュベートすることができる。典型的な時間は、約１分、約５分、約１０分、約１５分、約２０分及び約３０分を含む。

[0063]ＰＥＩ及び核酸（プラスミド）は、限定されない比で混合される。プラスミド／ＰＥＩ混合物を産生するために典型的な比は、約１：０．０１～約１：１００のモル（若しくは重量）比範囲、又は約１００：１～約１：０．０１のモル（若しくは重量）比範囲のプラスミド混合物を含む。プラスミド／ＰＥＩ混合物を産生するためにより典型的なモル（若しくは重量）比は、約１：１～約１：５のモル（若しくは重量）比範囲、又は約１：２～約１：４のモル（若しくは重量）比範囲のプラスミド混合物を含む。追加的な実施形態では、ＰＥＩ：プラスミド重量比は、約０．１：１～約５：１の範囲又は約５：１～約０．１：１の範囲である。さらなる実施形態では、遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物は、約０．１：１～約５：１の範囲のＰＥＩ：プラスミド重量比又は約５：１～約０．１：１の範囲のＰＥＩ：プラスミド重量比を有する。特定の実施形態では、プラスミド／ＰＥＩ混合物は、約１：１～約５：１の範囲又は約５：１～約１：１の範囲のＰＥＩ：プラスミド重量比を有する。他の特定の実施形態では、遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物は、約１：１～約５：１の範囲又は約５：１～約１：１の範囲のＰＥＩ：プラスミド重量比を有する。

[0064]細胞形質導入の組成物及び方法を産生するために使用される核酸（プラスミド）の量は、様々である。特定の実施形態では、総ＰＥＩ中の窒素（Ｎ）とプラスミド中のリン酸（Ｐ）とのモル比は、遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物において約１：１～約５０：１（Ｎ：Ｐ）の範囲である、又は総ＰＥＩ中の窒素（Ｎ）とプラスミド中のリン酸（Ｐ）とのモル比は、遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物において約１：１～１０：１（Ｎ：Ｐ）である、又は総ＰＥＩ中の窒素（Ｎ）とプラスミド中のリン酸（Ｐ）とのモル比は、遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物において約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、若しくは１０：１（Ｎ：Ｐ）である。追加的な特定の実施形態では、目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含むプラスミドと、ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及び／又はヘルパータンパク質をコードする核酸を含む１種又は複数種のプラスミドとの合計量は、細胞１ｍＬあたり約０．１μｇ～約１５μｇの範囲である。

[0065]細胞に核酸（プラスミド）／ＰＥＩの混合物を適用することは、細胞に核酸（プラスミド）／ＰＥＩ混合物を添加することにより、核酸（プラスミド）／ＰＥＩの混合物が細胞と接触することによって実施される。核酸（プラスミド）／ＰＥＩ溶液の混合物が添加（接触）される細胞は、接着細胞又は懸濁細胞であり得る。そのような細胞は、他の細胞との共培養物を含む可能性がある。

[0066]細胞形質導入を達成するために、細胞は、限定されない核酸（プラスミド）／ＰＥＩ混合物とある期間接触している。細胞と遊離ＰＥＩとの接触は、細胞が核酸（プラスミド）／ＰＥＩ混合物と接触したのと同時（若しくは直後）又はその後に概して起こる。核酸（プラスミド）／ＰＥＩ混合物と細胞の接触と、遊離ＰＥＩと細胞の接触との間に時間間隔があるならば、この時間間隔は、約１秒～約１４０時間、典型的には約１秒～約９６時間、より典型的には約１秒～約４８又は約７２時間、最も典型的には約１秒～約２４時間以下、例えば約１６、約１２、約８、又は約６時間以下であり得る。

[0067]長期接触について、細胞は、死（非生存）細胞の量の増加を招くＰＥＩの細胞毒性によって影響され、それにより、形質移入効率が減少する場合がある。細胞が総ＰＥＩと接触した後のインキュベーション時間は、数秒から数日の範囲であり得る。具体的には、細胞を核酸（プラスミド）／ＰＥＩ又は総ＰＥＩと、例えば約１分～約４８時間；約１分～約２４時間；約１分～約１６時間；約１分～約８時間；約１分～約４時間；約１分～約１２０分；約５分～約６０分；約１０分～約４５分；又は約１０分～約３０分の期間接触させることができる。

[0068]ＰＥＩの細胞毒性を減少させるために、細胞を核酸（プラスミド）／ＰＥＩと接触させた後に、培養培地が新鮮培養培地と交換される場合がある。形質移入後の培養培地交換は、細胞形質移入効率を顕著に減少させずにＰＥＩの細胞毒性を最小化することができる。

[0069]プラスミド／ＰＥＩ混合物と接触するとき又は遊離ＰＥＩと接触するときに、形質移入用の細胞は、プラスミド／ＰＥＩ混合物又は遊離ＰＥＩとの接触前又は接触時のいずれかに、細胞約１×１０^５個／ｍＬ～約１×１０^８個／ｍＬの範囲の密度を有する。典型的には、細胞は、細胞約２×１０^５個／ｍＬ～約５×１０^６個／ｍＬの範囲の密度を有する。より典型的には、細胞は、細胞約３×１０^５個／ｍＬ～約３×１０^６個／ｍＬ、例えば、細胞約４×１０^５個／ｍＬ～約２×１０^６個／ｍＬ、又は細胞約３×１０^５個／ｍＬ～約１×１０^６個／ｍＬの範囲の密度を有する。

[0070]形質移入用の細胞は、プラスミド／ＰＥＩ混合物又は遊離ＰＥＩとの接触前又は接触時のいずれかに、任意選択で対数（指数）成長期であり得る。形質移入用の細胞は、プラスミド／ＰＥＩ混合物及び／又は遊離ＰＥＩとの接触前又は接触時のいずれかに、任意選択で６０％又は６０％超の生存率、例えば７０％、８０％、若しくは９０％又は９０％超の生存率を有する可能性がある。

[0071]本明細書記載のように接触し得る細胞は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞を含む。そのような細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成長する若しくは生存率を維持することが可能な、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ組織培養に適応された、初代細胞又は細胞株であり得る。細胞株の例は、ＨＥＫ２９３Ｆ（２９３Ｆ）細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ（２９３Ｔ）細胞などのＨＥＫ２９３細胞を含むＨＥＫ（ヒト胎児腎臓）細胞を含む。

[0072]より一般的には、本明細書記載のように接触した、そのような細胞を、「宿主細胞」と呼ぶことができる。「宿主細胞」は、ＡＡＶパッケージングタンパク質などのパッケージングタンパク質をコードする核酸（プラスミド）、ヘルパータンパク質をコードする核酸（プラスミド）、目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸（プラスミド）、又は他の移入核酸（プラスミド）のレシピエントとして使用することができる又は使用されてきた、例えば、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞を意味する。この用語は、形質導入又は形質移入された本来の細胞の子孫を含む。したがって、本明細書に使用される「宿主細胞」は、外因性核酸配列を形質導入又は形質移入されている細胞を一般的に表す。単一の親細胞の子孫は、自然変異、偶発変異、又は意図的変異が原因で、本来の親と形態又はゲノム核酸若しくは総核酸の相補体が必ずしも完全に同一でない場合があることが理解されている。

[0073]細胞の生存を持続させる又は細胞成長及び／若しくは増殖を実現するために適切な数多くの細胞成長培地が市販されている、又はそれを容易に製造することができる。そのような培地の例は、哺乳動物（例えばヒト）細胞の生存を持続させる又は成長を実現するための培地などの、無血清真核細胞成長培地を含む。非限定的な例は、ハムのＦ１２又はＦ１２Ｋ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（ＦＳ）Ｆ１７培地（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びその混合物を含む。そのような培地にビタミン及び／又は微量無機物及び／又は塩及び／又は哺乳動物（例えばヒト）細胞用の必須アミノ酸などのアミノ酸を補充することができる。

[0074]用語「形質導入する」及び「形質移入する」は、核酸（プラスミド）などの分子を宿主細胞に導入することを表す。細胞は、外因性核酸が細胞膜内部に導入されている場合に「形質導入」又は「形質移入」されている。したがって、「形質導入細胞」は、「核酸」若しくは「ポリヌクレオチド」が導入されている細胞、又は外因性核酸が導入されているその子孫である。特定の実施形態では、「形質導入」細胞（例えば、哺乳動物における細胞又は組織又は器官細胞など）は、外因性分子、例えば核酸（例えば導入遺伝子）の組込み後の細胞における遺伝的変化である。「形質導入」細胞（複数可）を繁殖させる、導入された核酸を転写させる、及び／又はタンパク質を発現させることができる。

[0075]「形質導入」又は「形質移入」細胞において、核酸（プラスミド）は、レシピエント細胞のゲノム核酸に組み込まれる場合又は組み込まれない場合がある。導入された核酸がレシピエント細胞又はレシピエント生物の核酸（ゲノムＤＮＡ）に組み込まれるようになるならば、導入された核酸は、細胞又は生物に安定的に維持され、レシピエント細胞又はレシピエント生物の子孫細胞又は子孫生物によってさらに受け継がれる又は遺伝することができる。最終的に、導入された核酸は、レシピエント細胞又は宿主生物に染色体外で又は単に一過性に存在し得る。いくつかの技法が公知である（例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓら（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、及びＣｈｕら（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照されたい）。そのような技法を使用して、１つ又は複数の外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞に導入することができる。

[0076]用語「ベクター」は、小型担体核酸分子、プラスミド、ウイルス（例えばＡＡＶベクター）、又は核酸の挿入若しくは組込みによって操作することができる他の媒体を表す。そのようなベクターを、遺伝子操作（すなわち「クローニングベクター」）のために使用して、細胞にポリヌクレオチドを導入／移入すること、及び挿入されたポリヌクレオチドを細胞において転写又は翻訳させることができる。「発現ベクター」は、宿主細胞における発現に必要とされる必要な調節領域を有する遺伝子配列又は核酸配列を含有する専門化されたベクターである。ベクター核酸配列は、少なくとも細胞における繁殖のための複製起点及び任意選択で異種ポリヌクレオチド配列、発現制御エレメント（例えばプロモーター、エンハンサー）、イントロン、ＩＴＲ（複数可）、選択マーカー（例えば抗生物質耐性）、ポリアデニル化シグナルなどの追加的なエレメントを一般的に含有する。本発明の目的のために、本明細書に示されるような「ベクター」は、本明細書に使用されるところの用語「プラスミド」の範囲内である。

[0077]ウイルスベクターは、ウイルスゲノムを含む１つ又は複数の核酸エレメントに由来する又はそれに基づく。特定のウイルスベクターは、レンチウイルス、偽型レンチウイルス及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのパルボウイルスベクターを含む。

[0078]組換えウイルス、例えばレンチウイルス又はパルボウイルス（例えばＡＡＶ）ベクターなどのベクターの修飾語並びに組換えポリヌクレオチド及びポリペプチドの配列の修飾語としての用語「組換え」は、組成物が自然界に一般的に存在しない方式で操られた（すなわち操作された）ことを意味する。ＡＡＶベクターなどの組換えベクターの特定の例は、野生型ウイルス（例えばＡＡＶ）ゲノムに通常は存在しないポリヌクレオチドがウイルスゲノムに挿入される場合、すなわち異種の場合である。用語「組換え」は、本明細書においてウイルスベクター及びＡＡＶベクターなどのベクターを参照して必ずしも使用されるわけではないものの、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含む組換え形態などの配列が、そのような省略にかかわらず明白に含まれる。

[0079]組換えウイルス「ベクター」又は「ＡＡＶベクター」は、分子的方法を使用して、ウイルス（例えばＡＡＶ）から野生型ゲノムを除去すること、及び転写物に転写される核酸又はタンパク質をコードする核酸などの非天然核酸により置換することによって、ＡＡＶなどのウイルスの野生型ゲノムから得られる。概して、ＡＡＶについて、ＡＡＶゲノムの一方又は両方の逆位末端反復（ＩＴＲ）配列がＡＡＶベクターに保持される。ウイルス（例えばＡＡＶ）ゲノム核酸に関して、ウイルスゲノムの全部又は一部が非天然（すなわち異種）配列により置換されているので、「組換え」ウイルス（例えばＡＡＶ）ベクターは、ウイルス（例えばＡＡＶ）ゲノムと区別される。したがって、非天然配列の組込みがウイルスベクター（例えばＡＡＶ）を「組換え」ベクターと規定し、ＡＡＶの場合、組換えベクターを「ｒＡＡＶベクター」と呼ぶことができる。

[0080]組換えベクター（例えば、レンチ－、パルボ－、ＡＡＶ）配列を、細胞の後続のｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ感染（形質導入）のために本明細書において呼ばれるところの「粒子」にパッケージングすることができる。組換えベクター配列がカプシドに被包される又はＡＡＶ粒子にパッケージングされる場合、粒子を「ｒＡＡＶ」とも呼ぶことができる。そのような粒子は、ベクターゲノムをカプシドに被包する又はパッケージングするタンパク質を含む。特定の例は、ウイルスエンベロープタンパク質、並びにＡＡＶの場合、ＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３などのカプシドタンパク質を含む。

[0081]ベクター「ゲノム」は、最終的にパッケージング又はカプシドに被包されて、ウイルス（例えばＡＡＶ）粒子を形成する組換えプラスミド配列の部分を表す。組換えプラスミドを使用して、組換えベクターが構築又は製造される場合、ベクターゲノムは、組換えプラスミドのベクターゲノム配列に対応しない「プラスミド」部分を含まない。組換えプラスミドのこの非ベクターゲノム部分は「プラスミド骨格」と呼ばれ、プラスミド骨格は、繁殖及び組換えウイルス産生に必要な工程であるプラスミドのクローニング及び増幅に重要であるが、それ自体はウイルス（例えばＡＡＶ）粒子にパッケージングもカプシドに被包もされない。したがって、ベクター「ゲノム」は、ウイルス（例えばＡＡＶ）によってパッケージング又はカプシドに被包される核酸を表す。

[0082]用語「空のカプシド」及び「空の粒子」は、ＡＡＶタンパク質外殻を含むＡＡＶビリオンであるが、目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される、ＡＡＶ ＩＴＲに隣接する核酸を全部又は一部欠如するＡＡＶビリオンを表す。したがって、空のカプシドは、目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を宿主細胞に移入するように機能しない。しかし、空のカプシド製剤は、ＥＬＩＳＡなどの他の適用に有用性を有する。

[0083]用語「パッケージングタンパク質」は、ＡＡＶがその複製を依存する非ＡＡＶ由来のウイルス機能及び／又は細胞機能を表す。したがって、この用語は、ＡＡＶ遺伝子の転写活性化、ＡＡＶ ｍＲＮＡの段階特異的スプライシング、ＡＡＶのＤＮＡ複製、Ｃａｐ発現産物の合成及びＡＡＶカプシドの集合に関与する部分を含む、ＡＡＶの複製に必要なタンパク質及びＲＮＡを捕捉する。ウイルスに基づく補助機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）及びワクシニアウイルスなどの公知のヘルパーウイルスのうちのいずれかに由来し得る。

[0084]本明細書に使用される「ＡＡＶパッケージングタンパク質」は、生産的なＡＡＶ複製のためにトランスで機能するＡＡＶ由来配列を表す。したがって、ＡＡＶパッケージングタンパク質は、ＡＡＶの主オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ｒｅｐ及びｃａｐによってコードされる。ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶのＤＮＡ複製起点の認識、結合及びニッキング；ＤＮＡヘリカーゼ活性；並びにＡＡＶ（又は他の異種）プロモーターからの転写のモジュレーションをとりわけ含む多数の機能を有することが示されている。ｃａｐ（カプシド）タンパク質は、必要なパッケージング機能を供給する。ＡＡＶパッケージングタンパク質は、ＡＡＶベクターから消えたＡＡＶ機能をトランスで相補するために本明細書において使用される。

[0085]「ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸」は、形質導入組換えＡＡＶベクターを産生するために使用されるべきＡＡＶベクターから欠失したＡＡＶ機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸分子を一般的に表す。ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸は、ＡＡＶの複製に必要な、消えたＡＡＶ機能を相補するためにＡＡＶのｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子の一過性発現を提供するために一般的に使用されるが、核酸構築物は、ＡＡＶ ＩＴＲを欠如し、それ自体を複製もパッケージングもできない。ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、又はビリオンの形態であり得る。Ｒｅｐ及びＣａｐ発現産物の両方をコードする、一般に使用されるプラスミドｐＡＡＶ／Ａｄ及びｐＩＭ２９＋４５などのいくつかの核酸構築物が、記載されている。例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２～３８２８；及びＭｃＣａｒｔｙら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２９３６～２９４５を参照されたい。Ｒｅｐ及び／又はＣａｐ発現産物をコードするいくつかのベクターが、記載されている（例えば、米国特許第５，１３９，９４１号及び同第６，３７６，２３７号）。

[0086]用語「ヘルパータンパク質をコードする核酸」は、ヘルパー機能（複数可）を提供するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子（複数可）を一般的に表す。ヘルパータンパク質（複数可）をコードする核酸（複数可）を有するベクターを適切な宿主細胞に形質移入することができ、その際、ベクターは、次に宿主細胞においてＡＡＶビリオンの産生を支援することができる。アデノウイルス、ヘルペスウイルス又はワクシニアウイルス粒子などの自然界に存在するような感染性ウイルス粒子は、この用語から明白に除外される。

[0087]したがって、ヘルパータンパク質ベクターは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン又はコスミドの形態であり得る。特に、アデノウイルス遺伝子の完全相補体はヘルパー機能に必要とされないことが実証されている。例えば、ＤＮＡ複製及び後期遺伝子合成ができないアデノウイルス変異体は、ＡＡＶ複製に許容性であることが示されている。Ｉｔｏら、（１９７０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９：２４３；Ｉｓｈｉｂａｓｈｉら、（１９７１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：３１７。

[0088]Ｅ２Ｂ領域及びＥ３領域内の変異体は、ＡＡＶの複製を支援することが示されており、これは、Ｅ２Ｂ領域及びＥ３領域がおそらくヘルパー機能の実現に関与しないことを示している。Ｃａｒｔｅｒら、（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２６：５０５。しかし、Ｅｌ領域を欠損している、又は欠失したＥ４領域を有するアデノウイルスは、ＡＡＶの複製を支援することができない。したがって、アデノウイルスヘルパータンパク質について、ＥＩＡ領域及びＥ４領域は、直接的又は間接的のいずれかでＡＡＶの複製に必要な可能性がある。Ｌａｕｇｈｌｉｎら、（１９８２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４１：８６８；Ｊａｎｉｋら、（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１９２５；Ｃａｒｔｅｒら、（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２６：５０５。他の特徴付けられたＡｄ変異体は、ＥＩＢ（Ｌａｕｇｈｌｉｎら（１９８２）、上記；Ｊａｎｉｋら（１９８１）、上記；Ｏｓｔｒｏｖｅら、（１９８０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １０４：５０２）；Ｅ２Ａ（Ｈａｎｄａら、（１９７５）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２９：２３９；Ｓｔｒａｕｓｓら、（１９７６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１７：１４０；Ｍｙｅｒｓら、（１９８０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３５：６６５；Ｊａｙら、（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２９２７；Ｍｙｅｒｓら、（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：５６７）；Ｅ２Ｂ（Ｃａｒｔｅｒ、Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ、Ｉ ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓより（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ編、１９９０））；Ｅ３（Ｃａｒｔｅｒら（１９８３）、上記）；及びＥ４（Ｃａｒｔｅｒら（１９８３）、上記；Ｃａｒｔｅｒ（１９９５））を含む。

[0089]Ｅ１Ｂに変異を有するアデノウイルスによって提供されるヘルパータンパク質の研究により、ＥｌＢ ５５ｋがＡＡＶビリオンの産生に必要であるが、Ｅ１Ｂ １９ｋは必要ないことが報告された。加えて、国際公開第９７／１７４５８号及びＭａｔｓｈｕｓｈｉｔａら、（１９９８）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：９３８～９４５は、様々なＡｄ遺伝子をコードするヘルパー機能ベクターを記載している。ヘルパーベクターの一例は、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡコード領域、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６コード領域、アデノウイルスＥ２Ａ ７２ｋＤコード領域、アデノウイルスＥ１Ａコード領域、及び無傷のＥＩＢ Ｓ５ｋコード領域を欠如するアデノウイルスＥ１Ｂ領域（例えば、国際公開第０１／８３７９７号参照）を含む。

[0090]「導入遺伝子」は、細胞又は生物に導入することが意図される又は導入された核酸を好都合に表すために本明細書において使用される。導入遺伝子は、転写物に転写される又はポリペプチド若しくはタンパク質をコードする遺伝子などの任意の核酸を含む。

[0091]「発現制御エレメント」は、作動可能に連結された核酸の発現に影響する核酸配列（複数可）を表す。制御エレメントは、プロモーター及びエンハンサーなどの、本明細書に示される発現制御エレメントを含む。ＡＡＶベクターを含むベクター配列は、１つ又は複数の「発現制御エレメント」を含む可能性がある。概して、そのようなエレメントは、適正な異種ポリヌクレオチドの転写及び適切ならば翻訳を促すために含まれる（例えばプロモーター、エンハンサー、イントロン、遺伝子の正しいリーディングフレームを維持してｍＲＮＡのフレーム内翻訳を許容するスプライシングシグナル及び停止コドンなど）。そのようなエレメントは、概してシスで作用し、「シス作用」エレメントと呼ばれるが、トランスでも作用し得る。

[0092]発現制御は、転写、翻訳、スプライシング、メッセージ安定性などのレベルであり得る。概して、転写をモジュレートする発現制御エレメントは、転写される核酸の５’末端近く（すなわち「上流」）に並べられる。発現制御エレメントは、転写される配列の３’末端（すなわち「下流」）又は転写物内（例えばイントロン）に位置する可能性もある。発現制御エレメントは、転写される配列に隣接して又はそれとかなりの間隔であっても間隔を空けて（例えば、ポリヌクレオチドから１～１０、１０～２５、２５～５０、５０～１００、１００～５００個、又はこれ超のヌクレオチド）位置する可能性がある。それにもかかわらず、ＡＡＶベクターなどのある特定のベクターの長さの制限のせいで、発現制御エレメントは、転写される核酸から概してヌクレオチド１～１０００個以内である。

[0093]機能的に、作動的に連結された核酸の発現は、エレメントが核酸の転写及び必要に応じて転写物の翻訳をモジュレートするように、エレメント（例えばプロモーター）によって少なくとも部分的に制御可能である。発現制御エレメントの具体例は、転写される配列の５’に通常位置するプロモーターである。プロモーターは、プロモーターが存在しない場合に発現される量と比較して、作動的に連結された核酸から発現される量を概して増加させる。

[0094]本明細書に使用される「エンハンサー」は、異種ポリヌクレオチドに隣接して位置する配列を表すことができる。エンハンサーエレメントは、典型的にはプロモーターエレメントの上流に位置するが、核酸配列の下流又は核酸配列内でも機能を果たし、位置する可能性がある。したがって、エンハンサーエレメントは、核酸の１００塩基対、２００塩基対、又は３００以上の塩基対の上流又は下流に位置し得る。エンハンサーエレメントは、プロモーターエレメントによって与えられる発現を超えて作動的に連結された核酸の発現を概して増加させる。

[0095]発現構築物は、特定の細胞又は組織型において発現を推進するように役立つ調節エレメントを含む場合がある。発現制御エレメント（例えばプロモーター）は、本明細書において「組織特異的発現制御エレメント／プロモーター」と呼ばれる特定の組織又は細胞型において活性なものを含む。組織特異的発現制御エレメントは、特異的細胞又は組織（例えば肝臓）において概して活性である。発現制御エレメントは、特異的細胞、組織又は器官型に独特な転写活性化因子タンパク質又は他の転写調節因子によって認識されるので、特定の細胞、組織又は器官において概して活性である。そのような調節エレメントは、当業者に公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌら（１９９２）参照）。

[0096]本発明のプラスミドへの組織特異的調節エレメントの組込みは、核酸の発現のための部分的な組織向性を少なくとも提供する。肝臓において活性なプロモーターの例は、とりわけ、ＴＴＲプロモーター、ヒトアルファ１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター；アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７１：５１２４～３２（１９９７）；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１００２～９（１９９６）；アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．、７：１５０３～１４（１９９６）］である。肝臓において活性なエンハンサーの例は、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）ＨＣＲ－１及びＨＣＲ－２（Ａｌｌａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２：２９１１３～１９（１９９７））である。

[0097]発現制御エレメントは、多数の異なる細胞型におけるポリヌクレオチドの発現を推進することができる遍在性の又は雑多なプロモーター／エンハンサーも含む。そのようなエレメントは、限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター／エンハンサー配列、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター／エンハンサー配列及び多様な哺乳動物細胞型に活性な他のウイルスプロモーター／エンハンサー、又は自然界に存在しない合成エレメント（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ、４１：５２１～５３０（１９８５）参照）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、細胞質β－アクチンプロモーター及びホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを含む。

[0098]発現制御エレメントは、調節可能な方法で発現を付与することもでき、すなわち、シグナル又は刺激が、作動的に連結される異種ポリヌクレオチドの発現を増加又は減少させる。シグナル又は刺激に応答して作動的に連結されるポリヌクレオチドの発現を増加させる調節可能なエレメントは、「誘導性エレメント」とも呼ばれる（すなわちシグナルによって誘導される）。特定の例は、限定されないが、ホルモン（例えばステロイド）誘導性プロモーターを含む。典型的には、そのようなエレメントによって付与される増加又は減少の量は、存在するシグナル又は刺激の量と比例し；シグナル又は刺激の量が大きいほど、発現における増加又は減少は大きい。特定の非限定的な例は、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）（ＭＴ）プロモーター；ステロイドホルモン誘導性マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター；Ｔ７ポリメラーゼプロモーターシステム（国際公開第９８／１００８８号）；テトラサイクリン抑制システム（Ｇｏｓｓｅｎら．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７～５５５１（１９９２））；テトラサイクリン誘導性システム（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６８：１７６６～１７６９（１９９５）；Ｈａｒｖｅｙら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：５１２～５１８（１９９８）も参照されたい）；ＲＵ４８６誘導システム（Ｗａｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２３９～２４３（１９９７）及びＷａｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：４３２～４４１（１９９７）］；並びにラパマイシン誘導システム（Ｍａｇａｒｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：２８６５～２８７２（１９９７）；Ｒｉｖｅｒａら、Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２：１０２８～１０３２（１９９６））を含む。これに関連して有用であり得る他の調節可能な制御エレメントは、特異的生理状態、例えば、温度、急性期、発生によって調節される制御エレメントである。

[0099]発現制御エレメントは、核酸用の天然エレメント（複数可）も含む。異種ポリヌクレオチドの発現が自然の発現を模倣することが望まれる場合、天然制御エレメント（例えばプロモーター）が使用される場合がある。異種ポリヌクレオチドの発現が時間的に又は発生的に、又は組織特異的に又は特異的転写刺激に応答して調節されるべき場合、天然エレメントが使用され得る。イントロン、ポリアデニル化部位又はコザックコンセンサス配列などの他の天然発現制御エレメントが使用される場合もある。

[0100]用語「作動的に連結された」は、コード配列の発現をもたらすように、コード配列の発現に必要な調節配列が、コード配列に対して適切な位置にされることを意味する。まさにこの定義は、発現ベクターへのコード配列及び転写制御エレメント（例えばプロモーター、エンハンサー、及び終止エレメント）の配置に適用されるときがある。この定義は、雑種核酸分子が生成する第１及び第２の核酸分子の核酸配列の配置に適用されるときもある。

[0101]核酸と作動的に連結されている発現制御エレメントの例では、関係は、制御エレメントが核酸の発現をモジュレートするような関係である。より具体的には、例えば、作動的に連結された２つのＤＮＡ配列は、２つのＤＮＡが、ＤＮＡ配列の少なくとも一方が他方の配列に生理学的効果を発揮することができる関係で（シス又はトランスに）配置されていることを意味する。

[0102]したがって、ベクター用の追加的なエレメントは、限定することなく、発現制御（例えばプロモーター／エンハンサー）エレメント、転写終結シグナル又は終止コドン、ＡＡＶ ＩＴＲ配列の１つ又は複数のコピーなどの配列に隣接する５’若しくは３’非翻訳領域（例えば、ポリアデニル化（ポリＡ）配列）、又はイントロンを含む。

[0103]例えば、さらなるエレメントは、例えばパッケージングを向上させ、混入している核酸の存在を減らすためのフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列を含む。ＡＡＶベクターは、一般的に約４ｋｂ～約５．２ｋｂ、又はわずかにそれよりも大きいサイズ範囲を有するＤＮＡ挿入物を概して許容する。したがって、より短い配列について、ウイルス粒子へのＡＡＶベクターのパッケージングに許容されるウイルスゲノム配列の正常サイズ近く又は正常サイズに長さを調整するために、スタッファー又はフィラーの包含。様々な実施形態では、フィラー／スタッファー核酸配列は、核酸の非翻訳（タンパク質をコードしない）セグメントである。４．７Ｋｂ未満の核酸配列について、フィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列は、配列と組み合わせた（例えばベクターに挿入した）場合に約３．０～５．５Ｋｂの間、又は約４．０～５．０Ｋｂの間、又は約４．３～４．８Ｋｂの間の合計長を有する長さを有する。

[0104]イントロンは、ウイルス粒子へのＡＡＶベクターのパッケージングのための長さを実現するためにフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列としても機能することができる。フィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列として機能するイントロン及びイントロン断片も発現を増強することができる。

[0105]「核酸」又は「プラスミド」によってコードされる「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」は、天然野生型タンパク質のような完全長天然配列、並びに機能的部分配列、改変形態又は配列バリアントが天然完全長タンパク質の機能性をある程度保持するかぎり、部分配列、改変形態又はバリアントを含む。例えば、タンパク質は、欠失、置換又は付加を有する可能性及び部分的な機能又は活性を少なくとも保持する可能性がある。

[0106]用語「改変する」又は「バリアント」及びその文法的変形は、核酸又はポリペプチドが参照配列から逸脱していることを意味する。したがって、改変配列及びバリアント配列は、参照配列と実質的に同じ、より大きい又はより少ない発現、活性又は機能を有する場合があるが、参照配列の部分的な活性又は機能を少なくとも保持する。

[0107]改変の非限定的な例は、１つ又は複数のヌクレオチド又はアミノ酸置換（例えば、１～３、３～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～４０、４０～５０、５０～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～５００、５００～７５０、７５０～８５０個又はこれ超のヌクレオチド又は残基）を含む。

[0108]アミノ酸改変の例は、参照配列の保存的アミノ酸置換又は欠失（例えば部分配列又は断片）である。特定の実施形態では、改変配列又はバリアント配列は、未改変の配列の機能又は活性の少なくとも一部を保持する。

[0109]転写される核酸及びタンパク質をコードする核酸の全ての哺乳動物形態及び非哺乳動物形態が含まれる。したがって、本発明は、遺伝子及びタンパク質がヒトの遺伝子及びタンパク質と実質的に類似の方法で機能する、非哺乳動物、ヒト以外の哺乳動物、及びヒト由来の遺伝子及びタンパク質を含む。

[0110]本明細書に示される組換えウイルス（例えばＡＡＶ）ベクターの産生後、所望により、多様な従来方法を用いて宿主細胞からウイルス（例えばｒＡＡＶ）ビリオンを精製及び／又は単離することができる。そのような方法は、カラムクロマトグラフィー、ＣｓＣＩ勾配などを含む。例えば、陰イオン交換カラム、アフィニティーカラム及び／又は陽イオン交換カラムによる精製などの、複数のカラム精製ステップを用いることができる。（例えば、国際公開第０２／１２４５５号及び米国特許出願公開第２００３０２０７４３９号参照）。代替的又は追加的に、ＣｓＣｌ勾配ステップを用いることができる。（例えば、米国特許出願公開第２０１２０１３５５１５号；及び同第２０１３００７２５４８号参照）。さらに、感染性ウイルスを利用して、パッケージングタンパク質及び／又はヘルパータンパク質を発現させる場合、様々な方法を用いて残留ウイルスを不活性化させることができる。例えば、温度約６０℃に、例えば２０分以上加熱することによってアデノウイルスを不活性化することができる。ＡＡＶが熱に安定である一方で、ヘルパーアデノウイルスが熱に不安定であることから、この処理は、ヘルパーウイルスを効果的に不活性化する。

[0111]組成物の修飾語として使用される場合の用語「単離された」は、組成物がヒトの手で作られた、又は天然ｉｎ ｖｉｖｏ環境から完全に又は少なくとも部分的に分離されたことを意味する。一般的に、単離された組成物は、組成物が自然界で通常関連する１種又は複数種の物質、例えば、タンパク質、核酸、脂質、糖質、細胞膜などの１種又は複数種の混入物を実質的に含まない。

[0112]ＲＮＡ分子に関して、用語「単離された」は、上に定義されたような単離されたＤＮＡ分子によってコードされるＲＮＡ分子を主として表す。或いは、この用語は、自然な状態で（すなわち、細胞又は組織において）関連するＲＮＡ分子と十分に分離されていることにより、「実質的に純粋な」形態で存在するＲＮＡ分子を表し得る（用語「実質的に純粋な」は、下に定義される）。

[0113]タンパク質に関して、用語「単離されたタンパク質」又は「単離及び精製されたタンパク質」が、本明細書に使用されるときがある。この用語は、単離された核酸分子の発現によって産生されるタンパク質を主として表す。或いは、この用語は、「実質的に純粋な」形態で存在するように、自然に関連する他のタンパク質から十分に分離されているタンパク質を表し得る。

[0114]用語「単離された」は、ヒトの手によって産生された組合せ、例えば組換えベクター（例えばｒＡＡＶ）配列、又はベクターゲノムをパッケージング若しくはカプシドで被包するウイルス粒子及び医薬品製剤を排除しない。用語「単離された」は、雑種／キメラ、マルチマー／オリゴマー、改変（例えばリン酸化、グリコシル化、脂質化）若しくは誘導体化形態、又はヒトの手によって産生された宿主細胞において発現された形態などの、組成物の代替物理形態も排除しない。

[0115]用語「実質的に純粋な」は、目的の化合物（例えば核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質など）を少なくとも５０～６０重量％含む調製物を表す。調製物は、目的の化合物を少なくとも７５重量％又は約９０～９９重量％含む可能性がある。純度は、目的の化合物に適切な方法（例えば、クロマトグラフィー法、アガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析など）によって測定される。

[0116]核酸分子、発現ベクター（例えば、ベクターゲノム）、プラスミドは、組換えＤＮＡ技法を用いて調製される場合がある。ヌクレオチド配列情報を利用できることは、単離された核酸分子の調製を多様な手段によって可能にする。例えば、多様な標準的なクローニング、組換えＤＮＡ技法を用いて、細胞発現又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳及び化学合成技法により核酸（例えばプラスミド）を製造することができる。配列決定、ゲル電気泳動などにより純度を決定することができる。例えば、ハイブリダイゼーション技法又はコンピューターベースのデータベーススクリーニング技法を用いて核酸を単離することができる。そのような技法は、限定されないが、（１）相同ヌクレオチド配列を検出するための、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーとプローブとのハイブリダイゼーション；（２）例えば発現ライブラリーを用いて共通の構造特徴を有するポリペプチドを検出するための抗体スクリーニング；（３）目的の核酸配列とアニーリングすることができるプライマーを用いた、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；（４）関連配列に関する配列データベースのコンピューター検索；及び（５）サブトラクション核酸ライブラリーのディファレンシャルスクリーニングを含む。

[0117]核酸は、任意の好都合なクローニングベクターにＤＮＡとして維持される場合がある。一実施形態では、核酸は、プラスミドに維持される。或いは、核酸は、哺乳動物細胞における発現に適したベクターに維持される場合がある。

[0118]本発明の核酸、ベクター、発現ベクター（例えばｒＡＡＶ）、及び組換えウイルス粒子、方法及び使用は、遺伝疾患の治療を可能にする。欠乏状態の疾患に関して、遺伝子導入を用いて、代償療法のために正常な遺伝子を罹患組織にもたらす他に、アンチセンス変異を用いた、疾患の動物モデルを生み出すことができる。不均衡な疾患状態に関して、遺伝子導入を用いてモデルシステムで疾患状態を生み出すことができ、次に、疾患状態と対抗しようとして、モデルシステムを使用することができる。欠損を修正するために核酸配列の部位特異的組込みを使用することも可能である。

[0119]レンチウイルスベクター並びにＡＡＶ血清型及びそのバリアントを含むパルボウイルスベクターなどのウイルスベクターは、タンパク質をコードする核酸をｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで細胞に送達することにより、コードされるタンパク質を細胞が発現する手段をもたらす。ＡＡＶは、細胞に浸透し、核酸／遺伝物質が細胞に安定的に維持され得るように核酸／遺伝物質を導入することができるので、ＡＡＶは、遺伝子療法ベクターとして有用なウイルスである。加えて、これらのウイルスは、核酸／遺伝物質を例えば特定の部位に導入することができる。ＡＡＶは、ヒトにおける病原性疾患と関連しないので、ＡＡＶベクターは、実質的なＡＡＶの病理発生又は疾患を引き起こさずにヒト患者に異種ポリヌクレオチド配列（例えば、治療用タンパク質及び作用物質）を送達することができる。

[0120]使用され得るウイルスベクターは、限定されないが、複数の血清型（例えばＡＡＶ－１～ＡＡＶ－１２及びその他）のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター及び雑種／キメラＡＡＶベクター、レンチウイルスベクター及び偽型レンチウイルスベクター（例えばエボラウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、及びネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ））、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター（組織特異的プロモーター／エンハンサーを有する又は有さない）、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、非ウイルス性ベクター及びその他を含む。

[0121]ＡＡＶ粒子及びレンチウイルス粒子は、効果的な遺伝子送達用の媒体として有利に使用される場合がある。そのようなビリオンは、分裂細胞及び非分裂細胞に対する向性を含む、そのような適用のために望ましいいくつかの特徴を有する。これらのベクターを用いた初期の臨床実験により、持続しない毒性も実証され、免疫応答は最小限又は検出不能であった。ＡＡＶは、受容体介在性エンドサイトーシス又はトランスサイトーシスによってｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏで多種多様な細胞型に感染することが知られている。これらのベクターシステムは、ヒトにおいて網膜上皮、肝臓、骨格筋、気道、脳、関節及び造血幹細胞を標的化して試験されてきた。例えばプラスミドＤＮＡ又はミニサークルに基づく非ウイルス性ベクターも、適切な遺伝子導入ベクターである。

[0122]したがって、本発明の様々な実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクターなどのレンチウイルスベクター又はパルボウイルスベクターを含む。特定の実施形態では、組換えベクターは、パルボウイルスベクターである。パルボウイルスは、１本鎖ＤＮＡゲノムを有する小型ウイルスである。「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科である。

[0123]ＡＡＶベクター及びレンチウイルスベクターは、病理発生と関連するウイルス遺伝子を概して含まない。そのようなベクターは、野生型ＡＡＶ遺伝子のうちの１つ又は複数、例えばｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子を、概して全体的又は部分的に欠失しているが、必要に応じて組換えベクターの救出、複製、及びＡＡＶベクター粒子へのパッケージングのために少なくとも１つの機能的隣接ＩＴＲ配列を保持する。例えば、ベクターの必須の部分のみ、例えばそれぞれＩＴＲエレメント及びＬＴＲエレメントが含まれる。したがって、ＡＡＶベクターゲノムは、複製及びパッケージングのためにシスで必要とされる配列（例えば機能的ＩＴＲ配列）を含む。

[0124]組換えＡＡＶベクター、並びにその方法及び使用は、任意のウイルス株又は血清型を含む。非限定的な例として、組換えＡＡＶベクターは、例えばＡＡＶ－１、－２、－３、－４、－５、－６、－７、－８、－９、－１０、－１１、－１２、又はＡＡＶ－２ｉ８などの任意のＡＡＶゲノムに基づく可能性がある。そのようなベクターは、同じ株若しくは血清型（又は亜群若しくはバリアント）に基づく又は相互に異なる可能性がある。非限定的な例として、１つの血清型ゲノムに基づく組換えＡＡＶベクターは、ベクターをパッケージングするカプシドタンパク質のうちの１種又は複数種と同一であり得る。加えて、組換えＡＡＶベクターゲノムは、ベクターをパッケージングするＡＡＶカプシドタンパク質のうちの１種又は複数種と異なるＡＡＶ（例えばＡＡＶ２）血清型ゲノムに基づき得る。例えば、ＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶ２に基づき得るのに対して、３種のカプシドタンパク質のうちの少なくとも１種は、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、若しくはＡＡＶ－２ｉ８又はそのバリアントであり得る。ＡＡＶバリアントは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２及びＡＡＶ－２ｉ８カプシドのバリアント及びキメラを含む。

[0125]特定の実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、例えば、国際公開第２０１３／１５８８７９号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３７１７０）、国際公開第２０１５／０１３３１３号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４７６７０）及び米国特許出願公開第２０１３／００５９７３２号（米国特許出願第１３／５９４，７７３号、ＬＫ０１、ＬＫ０２、ＬＫ０３などを開示している）に示されるようなＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、及びＡＡＶ－２ｉ８、並びにそのバリアント（例えば、アミノ酸挿入、付加、置換及び欠失などのカプシドバリアント）を含む。

[0126]ＡＡＶ及びＡＡＶバリアント（例えばカプシドバリアント）の血清型（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列）は、例えばＡＡＶ１～ＡＡＶ１２を含む他のＡＡＶ血清型と異なる場合又は異ならない場合がある（例えば、ＡＡＶ１～ＡＡＶ１２血清型のうちのいずれかのＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列と異なる）。

[0127]本明細書に使用される用語「血清型」は、他のＡＡＶ血清型と血清学的に異なるカプシドを有するＡＡＶを表すために使用される特質である。血清学的特質性は、別のＡＡＶと比較した、抗体と１つのＡＡＶとの間の交差反応性の欠如に基づき決定される。そのような交差反応性の差は、通常、カプシドタンパク質配列／抗原決定基における差による（例えば、ＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列の差による）。カプシドバリアントを含むＡＡＶバリアントが、参照ＡＡＶ血清型又は他のＡＡＶ血清型と血清学的に異ならない場合があるにもかかわらず、ＡＡＶバリアントは、参照ＡＡＶ血清型又は他のＡＡＶ血清型と比較して少なくとも１つのヌクレオチド又はアミノ酸残基が異なる。

[0128]伝統的な定義では、血清型は、目的のウイルスが既存の及び特徴付けられた全ての血清型に特異的な血清に対して中和活性が試験され、目的のウイルスを中和する抗体が見出されなかったことを意味する。より多くの天然ウイルス単離株が発見され、及び／又はカプシド変異体が作製されるので、現在存在する血清型のうちのいずれかと血清学的な差がある場合又はない場合がある。したがって、新しいウイルス（例えばＡＡＶ）が血清学的な差を有さない場合、この新しいウイルス（例えばＡＡＶ）は、対応する血清型の亜群又はバリアントである。多くの場合、カプシド配列の改変を有する変異体ウイルスが、血清型の従来の定義により別の血清型であるかどうかを判定するために、変異体ウイルスに中和活性の血清学的試験をまだ行わなければならない。したがって、便宜上及び繰り返しを避けるために、用語「血清型」は、血清学的に異なるウイルス（例えばＡＡＶ）と、所与の血清型の亜群又はバリアントに入り得る、血清学的に異ならないウイルス（例えばＡＡＶ）との両方を広く表す。

[0129]様々な例示的な実施形態では、参照血清型に関係するＡＡＶベクターは、１つ又は複数のＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、又はＡＡＶ－２ｉ８（例えば、ＩＴＲ、又はＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列など）と少なくとも８０％以上（例えば８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％など）同一の配列を含む又はそれからなる、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、又はその部分配列を有する。

[0130]本発明の組成物、方法及び使用は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、又はＡＡＶ－２ｉ８などの参照ＡＡＶ血清型と１００％未満の配列同一性を示すが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、又はＡＡＶ－２ｉ８の遺伝子又はタンパク質などのような公知のＡＡＶ遺伝子又はタンパク質と異なる及び同一でないＡＡＶ配列（ポリペプチド及びヌクレオチド）及びその部分配列を含む。一実施形態では、ＡＡＶポリペプチド又はその部分配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、又はＡＡＶ－２ｉ８（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３カプシド又はＩＴＲ）などの任意の参照ＡＡＶ配列又はその部分配列と少なくとも７５％以上、例えば８０％、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％など同一、最大１００％同一の配列を含む又はそれからなる。特定の態様では、ＡＡＶバリアントは、１、２、３、４、５、５～１０、１０～１５、１５～２０個又はこれ超のアミノ酸置換を有する。

[0131]ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２又はＡＡＶ－２ｉ８並びにバリアント配列、関連配列、雑種配列及びキメラ配列を含む組換えＡＡＶベクターは、当業者に公知の組換え技法を用いて、１つ又は複数の機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する１つ又は複数の核酸配列（導入遺伝子）を含むように構築することができる。

[0132]核酸（プラスミド）、ベクター、組換えベクター（例えばｒＡＡＶ）、及び組換えウイルス粒子は、医薬組成物に組み込むことができる。そのような医薬組成物は、対象へのｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ投与及び送達にとりわけ有用である。特定の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体又は賦形剤を含有する。そのような賦形剤は、組成物の投与を受けている個体に有害な免疫応答をそれ自体で誘導しない任意の医薬品であって、過度の毒性なしに投与され得る医薬品を含む。

[0133]本明細書に使用される用語「薬学的に許容される」及び「生理学的に許容される」は、１つ又は複数の投与経路、ｉｎ ｖｉｖｏ送達又は接触に適した、生物学的に許容される気体、液体若しくは固体の製剤、又はその混合物を意味する。「薬学的に許容される」又は「生理学的に許容される」組成物は、生物学的に又はその他の点で望ましくないわけではない物質であり、例えば、この物質は、実質的な望ましくない生物学的作用を引き起こさずに対象に投与され得る。したがって、そのような医薬組成物は、例えば核酸、ベクター、ウイルス粒子又はタンパク質を対象に投与することに使用される場合がある。

[0134]薬学的に許容される賦形剤は、限定されないが、水、食塩水、グリセロール、糖及びエタノールなどの液体を含む。薬学的に許容される塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの無機酸塩及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸塩もその中に含まれる可能性がある。追加的に、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質がそのような溶剤中に存在する場合がある。

[0135]医薬組成物は、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などを含むがそれらに限定されない多数の酸と形成することができる塩として提供され得る。塩は、対応する遊離塩基形態よりも水溶媒又は他のプロトン溶媒の方に多く溶解する傾向がある。他の場合、調製物は、以下、すなわち１～５０ｍＭヒスチジン、０．１％～２％スクロース、及び２～７％マンニトールのうちのいずれか又は全てを、４．５～５．５のｐＨ範囲で含有し得る凍結乾燥粉末であって、使用前に緩衝液と混合される凍結乾燥粉末の場合がある。

[0136]医薬組成物は、医薬品の投与又はｉｎ ｖｉｖｏ接触若しくは送達に適合性の溶媒（水性又は非水性）、溶液（水性又は非水性）、乳剤（例えば、水中油型又は油中水型）、懸濁液、シロップ剤、エリキシル剤、分散媒及び懸濁媒、コーティング剤、等張化剤及び吸収促進又は吸収遅延剤を含む。水性及び非水性の溶媒、溶液及び懸濁液は、懸濁化剤及び増粘剤を含む場合がある。そのような薬学的に許容される担体は、錠剤（コーティング又は非コーティング）、カプセル（硬又は軟）、マイクロビーズ、粉末、顆粒及び結晶を含む。補助的な活性化合物（例えば、保存剤、抗細菌剤、抗ウイルス剤及び抗真菌剤）も組成物に組み入れることができる。

[0137]医薬組成物は、特定の投与経路又は送達経路と適合するように製剤化することができる。したがって、医薬組成物は、様々な経路による投与に適した担体、希釈剤、又は賦形剤を含む。

[0138]組成物及び方法は、無菌であり得る。そのような工程に適した容器の中で組成物が製造される場合及び方法が行われる場合がある。そのような容器は、皿、フラスコ、ローラーボトル、バッグ、バイオリアクター、器（ｖｅｓｓｅｌ）、チューブ、バイアルなどを含む。容器は、限定されないが、ガラス、プラスチック及びポリスチレン、ポリブチレン、ポリプロピレンなどのポリマーを含む材料からできている場合がある。

[0139]組成物及び方法のステップは、計画された順序又は再配列された順序で行われ得る。方法のステップは、段階的に又は介在期間を置いて間隔を空けて行うことができる。言い換えると、方法のステップを行うことができ、それから次のステップとの間に時間間隔が存在する可能性があり、そのような間隔は、例えば約１秒～約６０秒；約１分～約６０分；約１時間～約２４時間；約１日～約７日；又は約１週間～約４８週間の範囲である。

[0140]アデノウイルスベクターの作製のためのプロトコールは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，９９８，２０５号；同第６，２２８，６４６号；同第６，０９３，６９９号；及び同第６，１００，２４２号；並びに国際公開第９４／１７８１０号及び同第９４／２３７４４号に記載されている。

[0141]本発明は、ヒトの医学適用及び獣医学適用のための細胞及びベクターを産生するのに有用である。したがって、適切な対象は、ヒトなどの哺乳動物及び非ヒト哺乳動物を含む。用語「対象」は、動物、概してヒト、非ヒト霊長類（類人猿、テナガザル、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、マカク）などの哺乳動物、家畜（イヌ及びネコ）、農用動物（ニワトリ及びアヒルなどの家禽、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）、及び実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット）を表す。ヒト対象は、胎児、新生児、乳児、若年及び成人対象を含む。対象は、動物疾患モデル、例えばＨｅｍＡ及び当業者に公知のその他などの血液凝固疾患のマウス及び他の動物モデルを含む。

[0142]本明細書に使用される「単位投薬形態」は、処置されるべき対象に単位投薬量として適合する物理的に別個の単位であって、各単位が、１つ又は複数の用量で投与された場合に、所望の効果（例えば予防効果又は治療効果）を生じると計算される予め決定された量を、任意選択で医薬担体（賦形剤、希釈剤、溶剤又は増量剤）と関連して含有する単位を表す。単位投薬形態は、液体組成物、又はフリーズドライ若しくは凍結乾燥された状態の組成物を含み得る例えばアンプル及びバイアル内にあることがあり；例えば無菌液体担体をｉｎ ｖｉｖｏ投与又は送達の前に添加することができる。個別の単位投薬形態は、多回投与用キット又は容器に含まれる可能性がある。組換えベクター（例えばｒＡＡＶ）配列、組換えウイルス粒子、及びその医薬組成物は、投与を簡単にし、投薬量を均一にするために単回又は多回投薬形態としてパッケージすることができる。

[0143]本発明は、パッケージング材料及びその中の１つ又は複数の成分を有するキットを提供する。キットは、その中の成分の説明又は成分の使用説明書を含むラベル又は添付文書を概して含む。キットは、そのような成分、例えば核酸（プラスミド）、ＰＥＩ、細胞の集合を含有する可能性がある。

[0144]キットは、キットの１つ又は複数の成分を収容する物理構造を表す。パッケージング材料は、成分を無菌に維持することができ、そのような目的に通例使用される材料（例えば紙、段ボール、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプル、バイアル、チューブなど）でできている可能性がある。

[0145]ラベル又は添付文書は、その中の１つ又は複数の成分の識別情報を含み得る。ラベル又は添付文書は、製造業者、ロット番号、製造場所及び製造日、有効期限を識別する情報を含み得る。ラベル又は添付文書は、製造業者の情報、ロット番号、製造業者の所在地及び製造日を識別する情報を含みうる。ラベル又は添付文書は、方法、使用、又は製造プロトコールにキットの成分のうちの１つ又は複数を使用するための説明書を含み得る。説明書は、組成物を生産させるため又は本明細書記載の方法のうちのいずれかを実施するための説明書を含み得る。

[0146]ラベル又は添付文書は、成分、キット若しくは梱包材（例えば箱）と別の若しくはそれに添付した、又はキットの成分を含有するアンプル、チューブ若しくはバイアルに付属した、「印刷物」、例えば紙又はボール紙を含む。ラベル又は添付文書は、コンピューター可読媒体、例えばバーコードが印刷されたラベル、ディスク、ＣＤ－若しくはＤＶＤ－ＲＯＭ／ＲＡＭ、ＤＶＤなどの光ディスク、ＭＰ３、磁気テープ、又はＲＡＭ及びＲＯＭなどの電気的記憶媒体又は磁気／光記憶媒体などのこれらのハイブリッド、ＦＬＡＳＨ媒体又はメモリー型カードを追加的に含み得る。

[0147]特に定義しないかぎり、本明細書に使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の専門家によって通例理解されるものと同じ意味を有する。本明細書記載の方法と類似又は等価の方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるものの、適切な方法及び材料が、本明細書に記載されている。

[0148]本明細書に引用される全ての特許、特許出願、刊行物、及び他の参考文献、ＧｅｎＢａｎｋの引用及びＡＴＣＣの引用は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先される。

[0149]本発明の生体分子に関する様々な用語は、本明細書上記だけでなく、明細書及び特許請求の範囲の全体にわたっても使用される。

[0150]本明細書開示の特徴のうちの全てを任意の組合せで組み合わせることができる。本明細書に開示される各特徴が、同一、等価、又は類似の目的を果たす代替的な特徴によって置き換えられる場合がある。したがって、特に明白に述べないかぎり、開示された特徴（例えばＰＥＩ、プラスミド、ベクター（例えばｒＡＡＶ、又は組換えウイルス粒子）は、等価又は類似の特徴の属の一例である。

[0151]本明細書に使用される単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さないかぎり、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「プラスミド」又は「核酸」への参照は、複数のそのようなプラスミド又は核酸を含み、「ベクター」への参照は、複数のそのようなベクターを含み、「ウイルス」又は「粒子」への参照は、複数のそのようなウイルス／粒子を含む。

[0152]本明細書に使用される全ての数値又は数値域は、文脈が明らかに他のことを示さないかぎり、そのような範囲内の整数及び範囲内の値又は整数の分数を含む。したがって、例えば８０％以上の同一性への参照は、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％などに加えて、８１．１％、８１．２％、８１．３％、８１．４％、８１．５％など、８２．１％、８２．２％、８２．３％、８２．４％、８２．５％など及びその他を含む。

[0153]超（より大きい）又は未満を伴う整数への参照は、それぞれ参照値を超える又は参照値未満の任意の数を含む。したがって、例えば、１００未満への参照は、９９、９８、９７などから、ずっと下に数１までを含み、１０未満は、９、８、７などから、ずっと下に数１までを含む。

[0154]本明細書に使用される全ての数値又は範囲は、文脈が明らかに他のことを示さないかぎり、そのような範囲内の値及び整数の分数並びにそのような範囲内の整数の分数を含む。したがって、例えば１～１０などの数値範囲への参照は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０に加えて、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５など、及びその他を含む。したがって、範囲１～５０への参照は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０などから最大で５０まで、及び１．１、１．２、１．３、１．４、１．５など、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５など、及びその他を含む。

[0155]一連の範囲への参照は、その一続きの中の異なる範囲の境界値を組み合わせる範囲を含む。したがって、例えば一連の範囲、例えば１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７５、７５～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～４００、４００～５００、５００～７５０、７５０～８５０への参照は、１～２０、１～３０、１～４０、１～５０、１～６０、１０～３０、１０～４０、１０～５０、１０～６０、１０～７０、１０～８０、２０～４０、２０～５０、２０～６０、２０～７０、２０～８０、２０～９０、５０～７５、５０～１００、５０～１５０、５０～２００、５０～２５０、１００～２００、１００～２５０、１００～３００、１００～３５０、１００～４００、１００～５００、１５０～２５０、１５０～３００、１５０～３５０、１５０～４００、１５０～４５０、１５０～５００などの範囲を含む。

[0156]本発明は、数多くの実施形態及び態様を説明するために肯定的な言い回しを使用して本明細書に一般的に開示される。本発明は、物質若しくは材料、方法のステップ及び条件、プロトコール、又は手順などの特定の主題が全体的又は部分的に除外される実施形態も具体的に含む。例えば、本発明のある特定の実施形態又は態様では、材料及び／又は方法のステップが排除される。したがって、本発明は、本発明が含まないものに関して本明細書において全般的に表現されないにもかかわらず、それでもなお本発明において明白には除外されない態様が、本明細書に開示される。

[0157]本発明のいくつかの実施形態が記載されている。それでもなお、当業者は、本発明の精神及び範囲から逸脱せずに、本発明を様々な使用法及び条件に適応させるために本発明の様々な変更及び改変を行うことができる。したがって、以下の実施例は、請求された発明の範囲を何らかの方法で限定するのでなく、例示することが意図される。

実施例１
[0158]本実施例は、様々な材料及び方法の説明を含む。

[0159]細胞培養物：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによるインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（商標）、Ｒ７９０－０７）から購入したフリースタイル（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ）（商標）２９３Ｆ（２９３Ｆ）細胞を、４ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３５０５０－０６１）を補充したフリースタイル（商標）Ｆ１７（Ｆ１７）発現培地（Ｇｉｂｃｏカタログ番号Ａ１３８３５－０１）又はフリースタイル（商標）２９３（ＦＳ）発現培地（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１２３３８－０１８）に入れて培養した。スピナーフラスコ及びバイオリアクターを含む様々な細胞培養物装置に入れて細胞を培養した。スピナーフラスコ培養（Ｂｅｌｌｃｏ Ｇｌａｓｓ、カタログ１９６５－８３１００又はＣｏｒｎｉｎｇ、カタログ３１５２）について、撹拌７０ｒｐｍ及び８％ＣＯ２の加湿雰囲気で細胞を３７℃のインキュベーターで培養した；バイオリアクター（（ＤＡＳＧＩＰ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）について、プログラムされたパラメーター（ＤＯ ３０％、ｐＨ７．２、１７０又は１５０ｒｐｍ）によって細胞培養を制御した。概して、細胞を０．２５～０．５×１０^６／ｍＬで播種し、細胞密度が約１．６～２×１０^６／ｍＬに達したときに新鮮細胞培養培地を添加することによって２～３日毎に継代培養した。トリパンブルー染色後に血球計を使用して細胞密度及び生存率を決定した。

[0160]プラスミド：組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）を産生するために３種のプラスミド、すなわち１）ＩＴＲに隣接するｅＧＦＰを含む導入遺伝子プラスミド；２）ＡＡＶ血清型２のｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含むパッケージングプラスミド；並びに３）アデノウイルスＥ２、Ｅ４及びＶＡＲＮＡ遺伝子を含むアデノウイルスヘルパープラスミドを使用した。全てのプラスミドをＡｌｄｅｖｒｏｎ．Ｐから購入し、Ａｌｄｅｖｒｏｎ．Ｐが製造した。

[0161]ＰＥＩ溶液の調製：直鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）２５ＫＤａ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号２３９６６－２）、ＰＥＩ「Ｍａｘ」４０ＫＤａ（（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号２４７６５－２、２５ＫＤａ直鎖状ＰＥＩの塩酸塩）及びＰＥＩｐｒｏ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ、カタログ１１５－０１０）を形質移入試薬として使用した。大部分の形質移入試験について、ＰＥＩ「Ｍａｘ」を５ｍＭトリスに溶解して、０．５ｍｇ／ｍＬ溶液を作り、ｐＨを７．１０に調整した。ＰＥＩ ２５ＫＤａを最初に８０℃の熱水に溶解し、冷却後、トリス緩衝液を添加して、５ｍＭトリス緩衝溶液（ｐＨ７．１０）中にＰＥＩが０．５ｍｇ／ｍＬになるようにした。形質移入に関してＰＥＩ「Ｍａｘ」４０ＫＤａをＰＥＩ ２５ＫＤａと比較したいくつかの研究について、ＰＥＩ ４０ＫＤａ及び２５ＫＤａを、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む若しくは含まない５ｍＭトリス緩衝液又は１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む若しくは含まない水のいずれかに溶解させ、ｐＨ７．１０に調整した。

[0162]形質移入：２９３Ｆ細胞をスピナーフラスコの中で４ｍＭグルタマックス（ＧｌｕｔａＭＡＸ）（商標）補充物を加えたＦＳ培地又はＦ１７培地のいずれかに入れて成長させた。形質移入の１日前に新鮮培地を添加することによって細胞を継代培養し、形質移入の日に、血球計を使用して細胞密度を決定し、新鮮ＦＳ培地又はＦ１７培地で細胞の最終密度０．３５～１×１０^６個／ｍＬにさらに希釈し、懸濁細胞培養ウェル又はスピナーフラスコのいずれかで形質移入を行った。

[0163]上記３種のプラスミドをモル比１：１：１で形質移入に使用した。形質移入のために使用した総ＤＮＡ量は、０．７～１１．２μｇ／ｍｌの細胞培養物であった。ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体を異なる比のＰＥＩ及びＤＮＡで調製し、室温で１分～最大３０分インキュベートし、次にＤＮＡ／ＰＥＩ複合体を細胞培養物に滴下した。形質移入効率及びｒＡＡＶの生産性に及ぼす遊離ＰＥＩの効果を調べるために、ＤＮＡと共にインキュベーションせずに上記と同じ方法でＰＥＩ分子を調製し、ＤＮＡ／ＰＥＩ複合体を添加した直後にこれを細胞培養物に添加した。形質移入効率及び他のアッセイのために、細胞及び細胞培養培地を含む試料を形質移入の２４、４８及び７２時間後に採取し、形質移入の７２時間後に細胞培養物を収集した。

[0164]倒立蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）又はフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のいずれかを用いて形質移入効率を評価した。蛍光顕微鏡を用いてｅＧＦＰ陽性細胞を検出した。ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏフローサイトメーターを用いてＧＦＰ陽性細胞の率を評価した。

[0165]バイオリアクターにおけるｒＡＡＶベクターの産生：２つの傾斜翼インペラーを備える２Ｌ型ＤＡＳＧＩＰ Ｐａｒａｌｌｅｌバイオリアクターシステム（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて、ベクター生産工程の規模を拡大した。研究では、最終運転容量を４００ｍＬに調整した。撹拌を１５０ｒｐｍ又は１７０ｒｐｍに設定し、細胞培養の間に温度３７℃及びｐＨ７．２に維持した。酸素、二酸化炭素及び空気の混合気体を補充することによって溶存酸素を３０％に維持した。ＤＡＳＧＩＰ Ｃｏｎｔｒｏｌ ４．０ソフトウェアを備えるＤＡＳＧＩＰ制御システムによってこれらのパラメーター全てを監視及び制御した。Ｆ１７培地中で培養した２９３Ｆ細胞を細胞０．４×１０^６個／ｍＬの細胞密度及び９５％超の生存率で播種した。播種後の２又は３日目に新鮮培地を添加することによって細胞を継代し、継代培養後に細胞密度は、細胞約０．４～０．７×１０^６個／ｍＬであった。継代培養の２４時間後に、凡例に記載したように細胞にＰＥＩ／ＤＮＡ複合体を形質移入したが、細胞密度は、形質移入時に細胞約１×１０^６個／ｍＬである。形質移入時に、ＰＥＩ／ＤＮＡの重量比は２：１であり、ＰＥＩの１／２は遊離ＰＥＩであった。試料を２４時間毎に最大７２時間集めた。

[0166]ｒＡＡＶベクターの定量：形質移入された２９３Ｆ細胞収集物から凍結／融解を３サイクル又はマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（商標）（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を３回通過させることによってｒＡＡＶベクターを放出させた。遠心分離によって細胞の残骸をペレットにし、リアルタイムＰＣＲ及び形質導入アッセイのために上清を集めた。

[0167]ＴａｑＭａｎマスターミックス（カタログ４３０４４３７、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ－ＰＣＲ）（ＱｕａｎＳｔｕｄｉｏ ７、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＡＡＶベクターゲノムのコピー数を決定した。ＤＮアーゼＩ（カタログ＃７９２５４、Ｑｉａｇｅｎ）７．６Ｕで細胞溶解物１０μＬを処理して、混入している未パッケージングＤＮＡを消化させ、次に０．２％ ＳＤＳ／５ｍＭ ＥＤＴＡ／０．２Ｍ ＮａＣｌを用いて９５℃で１０分処理して、ＤＮアーゼＩを不活性化し、ベクターＤＮＡを放出させた。プライマー及びプローブは、導入遺伝子のｅＧＦＰ配列を検出した。フォワードプライマー：５’－ＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡ－３’、リバースプライマー５’－ＴＧＴＴＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＴＴＧＡＡ－３’及びプローブ５’－／５６－ＦＡＭ／ＡＧＣＡＧＡＡＧＡ／ＺＥＮ／ＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡ／３ＩＡＢｋＦＱ／－３’。標準曲線を作製するために、ＨｉｎｄＩＩＩ－ＨＦ消化によりｐＡＡＶ－ｅＧＦＰ－ＷＲＰＥプラスミドを直鎖化し、１×１０^８から１．２８×１０^３遺伝子コピーへ１：５系列希釈するのに使用した。全ての試料を３つ組で行った。

[0168]４８ウェルプレートに播種したＨＥＫ２９３細胞に細胞溶解物５０μＬを添加することによって形質導入アッセイを行った。形質導入時に各ウェルにエトポシドを終濃度３ｕＭになるように添加した。４８時間インキュベーション後に、倒立蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰ陽性細胞を評価した。

実施例２
[0169]本実施例は、様々な結果の説明を含む。

[0170]形質移入効率及びｒＡＡＶ産生に及ぼす形質移入培地の効果：ｒＡＡＶベクターを大規模生産するためのスケーラブルな無血清懸濁培養システムを開発するために、２９３Ｆ細胞を成長させるためにＦＳ培地、Ｆ１７培地、ＳＦＭ４Ｔｒａｎｓｆｘ－２９３及びその他を含む懸濁細胞培養に適したいくつかの培地を調べた。研究により、ＦＳ２９３培地及びＦ１７培地が良好な細胞成長を支援し、スピナーフラスコで細胞密度が細胞２．５～３×１０^６個／ｍＬに達したことが明らかとなっている。これらの２種の培地は、２９３Ｆ細胞への効率的な遺伝子形質移入も支援する。

[0171]形質移入効率及びｒＡＡＶ産生に及ぼす遊離ＰＥＩの効果：高い形質移入効率は、高いｒＡＡＶ産生を達成することに向けたステップである。形質移入試薬としてポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を採用して、懸濁培養で２９３Ｆ細胞に形質移入した。

[0172]調べた数多くのパラメーターのうち、ＰＥＩ分子の窒素（Ｎ）とＤＮＡのリン酸（Ｐ）とのモル比（Ｎ：Ｐ比）は、形質移入効率に劇的に影響し、低いＮ：Ｐ比から高いＮ：Ｐ比に変化させた場合、非常に低い形質移入から高度に効率的な形質移入になった。形質移入のために使用した場合、Ｎ：Ｐ比が３０などの高いＮ：Ｐ比では、細胞毒性も見出された。

[0173]ＰＥＩ「Ｍａｘ」４０ＫＤａ、ＰＥＩ ２５ＫＤａ、ＰＥＩＰｒｏ及びその他を含む、いくつかの異なるＰＥＩ分子を検討した。１５０ｍＭ ＮａＣｌを有する又は有さないｐＨ７．１のトリス緩衝液又はＤＩ水のいずれかを用いてＰＥＩ分子を調製した。適切な量のプラスミドＤＮＡを一定のＮ：Ｐ比でＰＥＩ分子と混合し、室温で１分、５分、１０分、１５分、２０分及び最大３０分などの異なる期間インキュベートし、次にこれを使用して細胞に形質移入した。

[0174]データは、ＰＥＩ「Ｍａｘ」４０ＫＤａ及びＰＥＩ ２５ＫＤａの両方が高い効率の細胞形質移入を実現し、ＰＥＩ「Ｍａｘ」４０ＫＤａが一貫して高い形質移入効率を実現したことを示している（図１）。したがって、形質移入試薬としてＰＥＩ「Ｍａｘ」４０ＫＤａを用いて大部分のデータを生成させた。

[0175]材料及び方法に記載した３種のプラスミドを使用する２９３Ｆ細胞の形質移入によってｒＡＡＶベクターを産生した。１２ウェルプレート、細胞培養用スピナーフラスコ及びバイオリアクターを含む異なる細胞培養装置を使用して、２９３Ｆ細胞を培養し、ｒＡＡＶベクターを産生した。ＰＥＩ／ＤＮＡ混合物を重量比２：１及び４：１で調製して、細胞に形質移入した。形質移入効率のために細胞培養物１ｍｌあたり異なるＤＮＡ量を試験し、３種のプラスミドの間のモル比１：１：１を形質移入のために概して使用した。ＦＳ培地及びＦ１７培地を使用する無血清懸濁培養で２９３Ｆ細胞を培養した。

[0176]ＰＥＩ介在性遺伝子導入は、細胞受容体への結合を伴う非常に複雑な細胞生物学的工程であり、エンドサイトーシス、細胞内輸送、核移行及び遺伝子発現は、主要なステップのうちのほんの少数である。いかなる理論に縛られることを望むわけでなく、遊離ＰＥＩ分子の適切な量は、形質移入効率を高め、今度はｒＡＡＶ産生を増加させる場合がある。

[0177]図２Ａに示すように、細胞培養物にＤＮＡ／ＰＥＩ複合体を添加した直後に、細胞培養物に遊離ＰＥＩ分子を添加したとき、細胞形質移入の効率は、ＤＮＡ／ＰＥＩ複合体のみの場合の形質移入効率と比べて有意に改善した。遊離ＰＥＩがＰＥＩ形質移入効率を押し上げたというこの現象は、１２ウェル細胞培養プレート（図２Ａ）、細胞培養スピナーフラスコ及びバイオリアクターにおいて観察された。加えて、形質移入において遊離ＰＥＩ分子が添加された場合に、ｒＡＡＶベクターの産生が相応して増加し、２～３倍のｒＡＡＶベクターが産生された（図２Ｂ）。

[0178]遊離ＰＥＩが形質移入効率及びｒＡＡＶ産生を高めるという発見を、より大きな細胞培養の規模、スピナーフラスコ及びバイオリアクターでさらに試験した。遊離ＰＥＩを有する又は有さないスピナーフラスコにおける形質移入の結果（図３）は、１２ウェルプレートで見出されたものと一致し、すなわち、遊離ＰＥＩが形質移入に使用された場合、形質移入効率が有意に増大し、ｒＡＡＶの生産性は、遊離ＰＥＩを有さないで細胞溶解物１ｍｌあたり１．３Ｅ＋１０ベクターゲノム（ＶＧ）から遊離ＰＥＩを有して約２．４Ｅ＋１０ＶＧ／ｍＬまで２～３倍に増加した。

[0179]形質移入での細胞の成長状態も、バイオリアクターにおけるｒＡＡＶベクター産生に有意な影響を有した。ｒＡＡＶ産生を改善するための方法をさらに調べるために、細胞の成長状態を試験して、ｒＡＡＶベクターの収率に及ぼす影響を判定した。懸濁細胞培養において、細胞を細胞０．２５×１０^６個／ｍＬ、細胞０．３５×１０^６個／ｍＬ及び細胞０．５×１０^６個／ｍＬで播種し、２Ｌバイオリアクターの７日にわたる細胞培養（図４）で細胞成長曲線を確定した。細胞成長期を大まかに規定し、指数成長期は４８ｈ～８４ｈの間と決定された。細胞密度のピークは、６日目に細胞４．８～５．８×１０^６個／ｍＬであり、それから細胞密度は減少し始めた。培養の間の細胞の生存率は、９０％超であった。

[0180]形質移入及びｒＡＡＶ産生のために、運転容量約４００ｍｌの２Ｌバイオリアクターに生存率９５％超の２９３Ｆ細胞を細胞密度０．４×１０^６個／ｍＬで接種した。プラスミド形質移入及びｒＡＡＶ産生に最良の細胞培養域（複数可）を特定しようとするうち、異なる細胞培養状態の細胞の形質移入がｒＡＡＶの収率にも有意な効果を有することが発見された。

[0181]次に、細胞播種の２又は３日後のいずれかに、新鮮細胞培養培地を添加することによって細胞を継代培養して、細胞密度を減らした。細胞密度は、細胞０．４～０．７×１０^６個／ｍＬの範囲である。次に、継代培養の２４時間後に、記載したようなＰＥＩ介在性形質移入方法を用いて細胞に形質移入した。概して、形質移入時の細胞密度は、培地１ｍｌあたり細胞７Ｅ＋０５個～１．３Ｅ＋０６個に達する。２つの独立した実験の条件及び対応する結果を表１に示す。

[0182]播種の３日後に細胞を継代培養し、播種の４日後に細胞に形質移入することは、播種の２日後に継代培養し、播種の３日後に形質移入された細胞と比べて有意に高いｒＡＡＶ産生を招いたように見える。

[0183]図５のデータに示されるように、比較されたこれらの２つの条件の間で形質移入効率は異ならないように見えることに注目すると興味深い。ｅＧＦＰの遺伝子発現によって示される形質移入効率の比較を図５Ａに示し、図５Ｂは、試験された全ての条件で約５０％の細胞が形質移入されたことを示唆する、より定量的なＦＡＣＳデータである。しかし、ｑＰＣＲによって評価したベクター力価は、３日目の形質移入と比較して４日目の形質移入の方が有意に高く（図６Ａ）、４日目の形質移入条件では、２倍、５倍、７～８倍高いときさえあった。４日目の形質移入及び撹拌速度１５０ｒｐｍの条件で最高力価は、１．３８Ｅ＋１１ｖｇ／ｍＬであった。

[0184]ｑＰＣＲ分析と一致するＨＥＫ２９３細胞の形質導入によってこれらの実験からのｒＡＡＶ－ＧＦＰの形質導入機能を評価した。各産生条件から同体積の細胞溶解物をＨＥＫ２９３細胞に添加した場合、３日目の形質移入の試料と比較して４日目の形質移入の試料からより高い形質導入が観察された（図６Ｂ）。これらのデータは、細胞成長段階及び代謝状態がｒＡＡＶの産生に重要な役割を果たす場合があること並びに形質移入効率に加えてｒＡＡＶの生合成により透過性の高い細胞代謝域があり得ることを示している。

[0185]新たに開発されたＰＥＩ媒介ｒＡＡＶ産生システムは、十分にスケーラブルで、ｃＧＭＰに準拠し、多用途のｒＡＡＶ産生プラットフォームであって、無血清懸濁細胞培養において任意の血清型のｒＡＡＶベクターを産生するために使用することができるプラットフォームである。高効率ＰＥＩ「Ｍａｘ」４０ＫＤａ分子のような形質移入試薬としてのＰＥＩ、形質移入工程への遊離ＰＥＩの添加、及び形質移入のための発見された準備刺激済み（ｐｒｉｍｅｄ）細胞成長段階と組み合わせて、懸濁細胞培養条件でｒＡＡＶの非常に高い生産性が達成されたが、この生産性は、文献で報告されている類似の無血清懸濁培養システムの約１０倍である（表２に要約）。

[0186]本発明の実施形態のうちのいくつかを説明し、上に具体的に例示したものの、本発明がそのような実施形態に限定されることは意図されない。本発明の範囲及び精神から逸脱せずに、以下の特許請求の範囲に示されるように実施形態に様々な改変が加えられる場合がある。

［関連出願］
[0001]本特許出願は、その全体が参照により本明細書に明白に組み込まれている、２０１５年１２月１日に出願された米国特許出願第６２／２６１，８１５号の利益を主張する。

Claims (37)

1. 目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクターを生産する形質移入細胞を生産する方法であって、
   （ａ）ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及びヘルパー機能をコードする核酸を含む複数種のプラスミドを用意するステップ；
   （ｂ）目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含むプラスミドを用意するステップ；
   （ｃ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む溶液を用意するステップ；
   （ｄ）ステップ（ａ）及び（ｂ）のプラスミドをステップ（ｃ）のＰＥＩ溶液と混合して、プラスミド／ＰＥＩ混合物を生産し、任意選択で前記プラスミド／ＰＥＩ混合物を１０秒～４時間の範囲の期間インキュベートするステップであって、前記ステップ（ａ）及び（ｂ）のプラスミドが、１：０．０１～１：１００のモル比範囲である、ステップ；
   （ｅ）細胞をステップ（ｄ）の前記プラスミド／ＰＥＩ混合物と接触させて、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を生産するステップ；
   （ｆ）ステップ（ｅ）で生産した前記プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物に遊離ＰＥＩを添加して、遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を生産するステップ；並びに
   （ｇ）ステップ（ｆ）の前記遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を少なくとも４時間インキュベートし、それにより、目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクターを生産する形質移入細胞を生産するステップ
   を含む、方法。
2. ステップ（ｇ）で生産した前記形質移入細胞及び／又はステップ（ｇ）で生産した前記形質移入細胞からの培養培地を収集して、細胞及び／又は培養培地収集物を生産するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. ステップ（ｇ）から前記形質移入細胞及び／又は培養培地収集物から組換えＡＡＶベクターを単離及び／又は精製し、それにより、目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクターを生産するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
4. 目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクターを生産する方法であって、
   （ａ）ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及びヘルパー機能をコードする核酸を含む複数種のプラスミドを用意するステップ；
   （ｂ）目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含むプラスミドを用意するステップ；
   （ｃ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む溶液を用意するステップ；
   （ｄ）ステップ（ａ）及び（ｂ）の前記プラスミドをステップ（ｃ）の前記ＰＥＩ溶液と混合して、プラスミド／ＰＥＩ混合物を生産し、任意選択でプラスミド／ＰＥＩ混合物を１０秒～４時間の範囲の期間インキュベートするステップであって、前記ステップ（ａ）及び（ｂ）のプラスミドが、１：０．０１～１：１００のモル比範囲である、ステップ；
   （ｅ）細胞をステップ（ｄ）で生産した前記プラスミド／ＰＥＩ混合物と接触させて、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を生産するステップ；
   （ｆ）ステップ（ｅ）で生産した前記プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物に遊離ＰＥＩを添加して、遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を生産するステップ；
   （ｇ）ステップ（ｆ）の前記遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を少なくとも４時間インキュベートして、形質移入細胞を生産するステップ；
   （ｈ）ステップ（ｇ）で生産した前記形質移入細胞及び／又はステップ（ｇ）で生産した形質移入細胞からの培養培地を収集して、細胞及び／又は培養培地収集物を生産するステップ；並びに
   （ｉ）ステップ（ｈ）で生産した前記細胞及び／又は培養培地収集物から組換えＡＡＶベクターを単離及び／又は精製し、それにより、目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクターを生産するステップ
   を含む、方法。
5. 目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクターを生産する形質移入細胞を生産する方法であって、
   （ａ）成分（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）：
   （ｉ）ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及びヘルパー機能をコードする核酸を含む複数種のプラスミド；
   （ｉｉ）目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含むプラスミド；並びに
   （ｉｉｉ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）溶液
   の混合物を用意するステップ、
   （ｂ）前記プラスミド（ｉ）及び（ｉｉ）が、１：０．０１～１：１００のモル比範囲となるように、前記プラスミドを前記ＰＥＩ溶液（ｉｉｉ）と混合して、プラスミド／ＰＥＩ混合物を生産し、任意選択で前記プラスミド／ＰＥＩ混合物を１０秒～４時間の範囲の期間インキュベートするステップ；
   （ｃ）細胞をステップ（ｂ）で生産した前記プラスミド／ＰＥＩ混合物と接触させて、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を生産するステップ；
   （ｄ）ステップ（ｃ）で生産した前記プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物に遊離ＰＥＩを添加して、遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を生産するステップ；
   （ｅ）ステップ（ｃ）の前記プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物又はステップ（ｄ）の前記遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を少なくとも４時間インキュベートして、目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクターを生産する形質移入細胞を生産するステップ
   を含む、方法。
6. ステップ（ｈ）で生産した前記形質移入細胞から組換えＡＡＶベクターを精製し、それにより、目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含む精製された組換えＡＡＶベクターを生産することを含む、請求項４に記載の方法。
7. ステップ（ｅ）で生産した形質移入細胞を収集して、細胞及び／若しくは培養培地収集物を生産するステップ；並びに／又はステップ（ｅ）で生産した形質移入細胞から組換えＡＡＶベクターを単離及び／若しくは精製し、それにより、目的のタンパク質をコードする若しくは目的の転写物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクターを生産するステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
8. 目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクターを生産する方法であって、
   （ａ）成分（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）：
   （ｉ）ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及びヘルパー機能をコードする核酸を含む複数種のプラスミド；
   （ｉｉ）目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含むプラスミド；並びに
   （ｉｉｉ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）溶液
   の混合物を用意するステップ、
   （ｂ）前記プラスミド（ｉ）及び（ｉｉ）が、１：０．０１～１：１００のモル比範囲となるように、前記プラスミドを前記ＰＥＩ溶液（ｉｉｉ）と混合して、プラスミド／ＰＥＩ混合物を生産し、任意選択で前記プラスミド／ＰＥＩ混合物を１０秒～４時間の期間インキュベートするステップ；
   （ｃ）細胞をステップ（ｂ）で生産した前記プラスミド／ＰＥＩ混合物と接触させて、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を生産するステップ；
   （ｄ）ステップ（ｃ）で生産した前記プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物に遊離ＰＥＩを添加して、遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を生産するステップ；
   （ｅ）ステップ（ｃ）の前記プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物又はステップ（ｄ）の前記遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を少なくとも４時間インキュベートして、形質移入細胞を生産するステップ；
   （ｆ）ステップ（ｅ）で生産した前記形質移入細胞及び／又はステップ（ｅ）で生産した形質移入細胞からの培養培地を収集して、細胞及び／又は培養培地収集物を生産するステップ；並びに
   （ｇ）ステップ（ｆ）で生産した細胞及び／又は培養培地収集物から組換えＡＡＶベクターを単離及び／又は精製し、それにより、目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクターを生産するステップ
   を含む、方法。
9. 目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクターを生産する方法であって、
   （ａ）成分（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）：
   （ｉ）ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及びヘルパー機能をコードする核酸を含む複数種のプラスミド；
   （ｉｉ）目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含むプラスミド；並びに
   （ｉｉｉ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）溶液
   の混合物を用意するステップであって、
   前記プラスミド（ｉ）及び（ｉｉ）が、１：０．０１～１：１００のモル比範囲であり、成分（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の混合物が、任意選択で１０秒～４時間の期間インキュベートされたものである、ステップ；
   （ｂ）細胞を、ステップ（ａ）で生産した混合物と接触させて、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を生産するステップ；
   （ｃ）ステップ（ｂ）で生産した前記プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物に遊離ＰＥＩを添加して、遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を生産するステップ；
   （ｄ）ステップ（ｂ）の前記プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物又はステップ（ｃ）の前記遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物を少なくとも４時間インキュベートして、形質移入細胞を生産するステップ；
   （ｅ）ステップ（ｄ）で生産した前記形質移入細胞及び／又はステップ（ｄ）で生産した形質移入細胞からの培養培地を収集して、細胞及び／又は培養培地収集物を生産するステップ；並びに
   （ｆ）ステップ（ｅ）で生産した細胞及び／又は培養培地収集物から組換えＡＡＶベクターを単離及び／又は精製し、それにより、目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含む組換えＡＡＶベクターを生産するステップ
   を含む、方法。
10. 前記プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物、又は前記遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物が、４時間～１４０時間の範囲の期間インキュベートされる、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記プラスミド／ＰＥＩ混合物が、０．１：１～５：１の範囲のＰＥＩ：プラスミド重量比を有するか、前記遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物が、０．１：１～５：１の範囲のＰＥＩ：プラスミド重量比を有する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記プラスミド／ＰＥＩ混合物及び／又は遊離ＰＥＩのＰＥＩが、加水分解直鎖状ポリエチレンイミンを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記プラスミド／ＰＥＩ混合物及び／又は前記遊離ＰＥＩのＰＥＩが、４，０００～１６０，０００の範囲の分子量及び／又は遊離塩基形態で２，５００～２５０，０００の範囲の分子量を有する加水分解直鎖状ポリエチレンイミンを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 総ＰＥＩ中の窒素（Ｎ）とプラスミド中のリン酸（Ｐ）とのモル比が、前記遊離ＰＥＩ／プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物において１：１～５０：１（Ｎ：Ｐ）の範囲である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記プラスミド／ＰＥＩ混合物が、３０秒～４時間の範囲の期間インキュベートされる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 遊離ＰＥＩの量が、総ＰＥＩの１０％～９０％の範囲である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記プラスミド／ＰＥＩ混合物が前記細胞と接触した後に、前記遊離ＰＥＩが、前記細胞に添加される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記細胞が、懸濁培養中にある、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記細胞が、無血清培養培地中で成長又は維持される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記プラスミド／ＰＥＩ混合物及び／又は前記遊離ＰＥＩと接触するときに、前記細胞が、細胞１×１０^５個／ｍＬ～１×１０^８個／ｍＬの範囲の密度である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記プラスミド／ＰＥＩ混合物若しくは前記遊離ＰＥＩと接触するときに、前記細胞の生存率が、６０％若しくは６０％超であるか、前記プラスミド／ＰＥＩ混合物と接触するときに、前記細胞が、対数期成長中である、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. コードされるＡＡＶパッケージングタンパク質が、ＡＡＶ ｒｅｐ及び／又はＡＡＶ ｃａｐを含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. コードされるヘルパー機能が、アデノウイルスＥ２及び／若しくはＥ４タンパク質、ＶＡ ＲＮＡ、並びに／又は非ＡＡＶヘルパータンパク質を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記細胞が、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞又はＨＥＫ２９３Ｆ細胞である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
26. 目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含むプラスミドと、ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及びヘルパー機能をコードする核酸を含む複数種のプラスミドとの合計量が、細胞１ｍＬあたり０．１μｇ～１５μｇの範囲である、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含むプラスミドと、ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸及びヘルパー機能をコードする核酸を含む複数種のプラスミドとのモル比が、１：５～１：１の範囲又は１：１～５：１の範囲である、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記複数種のプラスミドが、ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸を含む第１のプラスミド及びヘルパー機能をコードする核酸を含む第２のプラスミドを含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 目的のタンパク質をコードする又は目的の転写物に転写される核酸を含むプラスミドと、ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸を含む第１のプラスミドと、ヘルパー機能をコードする核酸を含む第２のプラスミドとのモル比が、１～５：１：１、又は１：１～５：１、又は１：１：１～５の範囲である、請求項２８に記載の方法。
30. ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ血清型又はＡＡＶ偽型を含み、前記ＡＡＶ偽型が、ＩＴＲ血清型と異なるＡＡＶカプシド血清型を含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
31. ＡＡＶベクターが、イントロン、発現制御エレメント、１つ若しくは複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）及び／又はフィラーポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 発現制御エレメントが、構成的若しくは調節可能制御エレメント、又は組織特異的発現制御エレメント若しくはプロモーターを含む、請求項３１に記載の方法。
33. 発現制御エレメントが、肝臓における発現を付与するエレメントを含む、請求項３１に記載の方法。
34. ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、若しくはＡＡＶ－２ｉ８のＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３カプシドタンパク質のうちのいずれかと９０％以上の配列同一性を有するＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３カプシドタンパク質を含むか、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、及びＡＡＶ－２ｉ８のＡＡＶ血清型のうちのいずれかから選択される改変若しくはバリアントＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３カプシドタンパク質を含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 細胞が、前記プラスミド／ＰＥＩ混合物と接触する前に、細胞０．１×１０^６個／ｍｌ～５．０×１０^６個／ｍｌの範囲の細胞密度に継代培養される、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 細胞が、継代培養の後に、前記プラスミド／ＰＥＩ混合物と２日～５日の間の期間接触する、請求項３５に記載の方法。
37. 生産した組換えＡＡＶベクターの量が、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物に遊離ＰＥＩを添加するステップのない状態と比較して、プラスミド／ＰＥＩ細胞培養物に遊離ＰＥＩを添加するステップのある状態で、少なくとも５０％以上である、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。

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