CN108866011A - 一种同步包装rAAV的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种同步包装rAAV的方法，其包括以下步骤：对293T细胞进行扩大培养；采用多聚赖氨酸对培养容器进行处理，然后将三个质粒与PEI置于已经处理过的培养容器中进行混合，并于室温下静止作用，所述三个质粒包括载体质粒、包装质粒和辅助质粒；消化293T细胞，得到293T细胞悬液；将293T细胞悬液加入到含有质粒的混合物中，然后进行培养；24小时后将旧液倾去，加入无血清DMEM；72小时收获并纯化浓缩。采用本发明的技术方案，无需提前24小时培养293T细胞，简化了实验步骤，缩短了时间，实现了快速包装，而且减少了血清使用量；该方法简单、易行且重复性高。

Description

一种同步包装rAAV的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种同步包装rAAV的方法。
背景技术
随着现代分子生物学技术的发展，基因治疗是近年来诞生的新的生物医学治疗技术。其基本原理是，将外源基因即治疗基因通过载体系统导入靶细胞后，与宿主细胞内的基因发生整合，成为其遗传物质的一部分，以纠正或补偿基因缺陷或缺失引起的疾病，从而达到治疗目的。
整个过程中，基因治疗载体在基因治疗过程中起着至关重要的作用。目前常用的基因治疗载体主要包括病毒类和非病毒类两种。病毒类载体是当今基因工程研究的热点之一，主要包括取代型的重组病毒载体和重组的病毒质粒载体，包括逆转录病毒、腺病毒及腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)。rAAV(recombinant adeno-associated virus，重组腺相关病毒)是一种缺陷性病毒，不能独立复制增殖，只有在辅助病毒如腺病毒(Ad)、单纯疱疹病毒(HSV)等存在的条件下，才能在感染的宿主细胞中复制合成装配蛋白，产生新的病毒颗粒。在辅助病毒存在情况下，这一应答依赖于早期基因E1A、E1B、E4和E2A的表达。当无辅助病毒存在时，野生型AAV只能被定点整合到宿主细胞第19号染色体长臂上，形成潜伏性感染，病毒DNA随宿主细胞染色体的复制而复制，无AAV颗粒产生，至今尚未发现野生型AAV与任何人类疾病相关， AAV以其安全性好、宿主范围广、免疫原性低、携带外源基因可长期表达等优点而备受关注，广泛应用于人类和动物相关疾病的基因治疗。
目前，大多数生产rAAV的方法需要于包装前24小时将细胞铺于培养器皿上，包装6小时后补加含FBS的培养液，存在步骤多、耗时长和血清用量大等问题。
发明内容
针对以上技术问题，本发明公开了一种同步包装rAAV的方法，能快速、简单地包装rAAV，而且能稳定在细胞中包装出带有目的基因的rAAV。
对此，本发明采用的技术方案为：
一种同步包装rAAV的方法，其包括以下步骤：
步骤S1，对293T细胞进行扩大培养；
步骤S2，先采用多聚赖氨酸对培养容器进行处理，然后将三个质粒与PEI置于已经处理过的培养容器中进行混合，并于室温下静止作用；其中，所述三个质粒包括载体质粒、包装质粒和辅助质粒；优选的，所述多聚赖氨酸为多聚-L-赖氨酸；
步骤S3，消化293T细胞，得到293T细胞悬液；该步骤可以采用常规方法消化 293T细胞。
步骤S4，将293T细胞悬液加入到步骤S2得到的混合物中；
步骤S5，将培养容器放入37℃含5％CO2培养箱内进行培养；
步骤S6，24小时后将旧液倾去，加入无血清DMEM；
步骤S7，72小时收获并纯化浓缩。
其中，用于病毒包装的293T细胞系由人肾上皮细胞系中的293细胞通过基因技术派生出的细胞系，是经过腺病毒E1A基因的转染，能表达SV40大T抗原，含有SV40 复制起始点与启动子区，本发明中的293T细胞系由河南大学王志民教授实验组惠赠。 ATCC(American Type Culture Collection)美国菌种保藏中心对于该细胞最适生长条件的描述为：生长温度在37℃，5％CO2的环境中，培养液为含10％FBS和2mM-谷氨酰胺的DMEM。
上述技术方案，将三个质粒共转染刚传代的293T细胞，就能在细胞裂解液中得到携带目的基因的rAAV。目前尚未发现野生型AAV与任何人类疾病相关，具有安全性高，宿主范围广，且介导外源基因长期表达的优点。采用此技术方案，无需提前24h 在培养皿上培养293T细胞，且包装后只需将培养基更换为无血清的DMEM即可，实现快速、简单地包装rAAV，并能稳定在细胞中包装出带有目的基因的rAAV。其中采用多聚-L-赖氨酸对培养容器进行处理，使得培养容器的表面进行包被处理，这样等 293T细胞和三个质量加入到培养容器后，细胞是悬浮培养，而不同于现有技术的贴壁生长。
采用此技术方案，与现有培养技术的不同主要在于：此技术方案不需要提前24小时将细胞铺于培养皿中，再加质粒，而是采用多聚-L-赖氨酸对培养容器先进行处理，然后将细胞与质粒同时加入，操作方便，简单，打破了常规做法。此技术方案中血清的用量为5％，而且不需要补加；而常规方法中血清的用量为10％，而且后续还要补加 2～5％。此技术方案中细胞为悬浮培养，不同于现有技术的贴壁生长。此技术方案得到的细胞形态比常规方法好很多，而且整个正产周期从4天缩短到3天，大大提高了效率。
作为本发明的进一步改进，所述载体质粒含有目的基因表达盒，其两端是AAV的反向末端重复序列ITR；所述包装质粒反式提供具有AAV复制和包装功能的蛋白Rep 和Cap；所述辅助质粒包含辅助腺病毒Ad5的元件E1a、E1b、E2a和E4。
作为本发明的进一步改进，所述载体质粒pAAV-GFP，所述包装质粒为pHelper，所述辅助质粒为pRep-CapAAV2或pRep-CapAAV6，所述三种质粒的重量比为1:2:1；步骤S2中所述三个质粒与PEI的重量比为1:1.5～3。
作为本发明的进一步改进，步骤S1中，293T细胞在按照ATCC推荐的方法传代的情况下，于包装前一次传代中将FBS由10％降低至5％。采用此技术方案的293T细胞对于包装时血清减少有个适应过程，有利于转染时保持好的细胞状态，提高转染效率。
作为本发明的进一步改进，步骤S2包括以下子步骤：
子步骤S201：将0.05～0.5mg/ml的多聚-L-赖氨酸加入新的培养皿中，加入量为刚好覆盖平皿的底部，室温下作用10-15分钟，弃去多聚-L-赖氨酸，用无菌超纯水清洗；
子步骤S202：将载体质粒、包装质粒和辅助质粒三种质粒按照重量比加入于离心管中混合，再加入PEI，室温下静置；
子步骤S203：将PEI稀释液加入到步骤S202得到的质粒混合液中，用移液器吹打10次后涡旋1分钟，室温静置反应10～20min。
进一步的，步骤S2包括以下子步骤：
子步骤S201，将0.1mg/ml的多聚-L-赖氨酸加入新的15cm培养皿中，加入量为刚好覆盖平皿底部，室温下放置5-15分钟，弃去多聚-L-赖氨酸，用20ml无菌超纯水清洗三次；
子步骤S202，取1个15ml无菌离心管和1个50ml无菌离心管，每管加入1ml无血清DMEM，将pAAV-GFP、pHelper和pRep-CapAAV2(或pRep-CapAAV6)三种质粒按照重量比13μg：26μg：13μg加入50ml离心管中充分混合，将104μg PEI加入15ml 离心管，室温下静置5分钟；
子步骤S203，将PEI稀释液缓慢加入质粒混合液中，边加边摇动50ml离心管到全部PEI加完，用移液器用力吹打10次后涡旋1分钟，室温静置反应15min。
作为本发明的进一步改进，步骤S2中，每次清洗所用无菌超纯水的体积超过多聚-L-赖氨酸溶液的体积，清洗完后吸干。
作为本发明的进一步改进，步骤S3包括以下子步骤：
子步骤S301，用0.02％EDTA消化离心细胞，用3ml含10％FBS的DMEM重悬细胞，取10μl做10倍稀释后进行细胞计数，取1.2×107个细胞移入含5％FBS的 DMEM中至终体积为18ml，将细胞液移入15cm培养皿中。
子步骤S302，将PEI与DNA的混合液用移液器轻轻吹打三次，逐滴加入细胞液中，加完后左右轻轻摇晃平皿几次。
进一步的，若消化计数后细胞浓度较高，应补加10％FBS的DMEM调整至2ml 培养液中包含所需细胞量，若细胞浓度偏低则无需添加10％FBS的DMEM调整。
作为本发明的进一步改进，加入293T细胞的细胞量为培养容器的每平方厘米底面积加入6.8×104个细胞。
作为本发明的进一步改进，步骤S1包括如下子步骤：
子步骤S101：待293T细胞长至90％以上汇合度时，将原有培养液弃去；
子步骤S102：加入预热的EDTA使其覆盖全部细胞表面，室温下作用5～10分钟；
子步骤S103：将消化后的细胞悬液用移液管移入离心管中，离心5～10分钟，弃上清液；
子步骤S104：用含质量百分比浓度为5％的FBS的DMEM重悬，将细胞悬液移入培养瓶中，放入37℃含5％CO2培养箱内进行培养。
作为本发明的进一步改进，步骤S7包括以下子步骤：
子步骤S701：培养容器留约4-6mL上清液，其余上清液收集至无菌的离心管中，用移液管吸取上清液将细胞吹下，悬液移至装着上清液的离心管中，离心5-15分钟，将上清液转移；
子步骤S702：取预冷的裂解液加入到细胞上，将细胞吹下，细胞悬液与S701中的细胞沉淀混合在一起，冻融三次，加入benzonase，于37℃水浴中作用20-40分钟，然后加入脱氧胆酸钠继续作用20-40分钟；离心5-15分钟，将上清液转移；
子步骤S703：往步骤S2的上清液中加入PEG 8000和NaCl，4℃放置1小时，离心25-35分钟，弃上清液，按上清液体积的3％加入HEPES进行溶解沉淀；
子步骤S704：沉淀溶解后加入相同体积的氯仿室温下振摇1-3min，离心3-10min，将上清液移入无菌离心管中，离心管正立放置20-40min；
子步骤S705：往子步骤S704的离心管中加入PEG8000和(NH4)2SO4，用无菌水调整至终浓度分别为10％(W/W)和13.2％(W/W)，并调整pH至8；在室温条件下，依次旋涡振荡1-3分钟，放置15-30分钟后进行离心。
子步骤S706：用针头取出下层液体，使用超滤管离心四次除盐，然后进行贮存。
进一步的，使用超滤管(100K MWCO)离心四次除盐，并贮存在含有0.001％普朗尼克F68的PBS中﹣80℃保存。
具体而言，所述步骤S7包括以下子步骤：
子步骤S701，每个培养皿留约5mL上清，其余上清收集至一个无菌的离心管中，用移液管吸取上清并轻轻的将细胞吹下，悬液移至装着上清的离心管中，3000g离心 10分钟，上清移至另一无菌瓶中。
子步骤S702，取3ml预冷的裂解液加入平皿细胞上，将细胞吹下，与S701中的细胞悬液混合在一起，反复冻融三次，加入benzonase(终浓度50U/mL)，于37℃水浴中作用30分钟，然后加入0.5％脱氧胆酸钠继续作用30分钟。2500g(3861rpm)离心10分钟，将上清转移至一个无菌50ml离心管中。
子步骤S703，往上清液中加入40％PEG 8000至终浓度8％和2.5N的NaCl至终浓度0.5N，4℃放置1小时，2000g离心30分钟，弃上清，按上清液体积的3％加入HEPES 液溶解沉淀。
子步骤S704，沉淀溶解后加入相同体积的氯仿室温下剧烈振摇2分钟，370g离心 5分钟，于安全柜中将上清移入无菌离心管中，离心管正立放置30分钟。
子步骤S705，往离心管中加入室温状态下PEG8000(50％，W/W)，(NH4)2SO4(20％，W/W)，用无菌水调整至终浓度分别为10％(W/W)和13.2％(W/W)，测量并调整pH至8。在室温条件下，依次旋涡振荡2分钟，放置15-30分钟，3000g离心15分钟。
子步骤S706，用针头小心取出下层液体，使用超滤管(100K MWCO)离心四次除盐并贮存在含有0.001％普朗尼克F68的PBS中﹣80℃保存。
作为本发明的进一步改进，步骤S1～步骤S7在生物安全柜中进行，且操作前生物安全柜紫外消毒30分钟；步骤S1～步骤S7中所用的试剂和物品使用前于121℃高压灭菌或0.2μm滤网过滤除菌，用超纯水配置。
作为本发明的进一步改进，多聚-L-赖氨酸包板可以提前一天进行，每次清洗所用无菌水的体积应超过包补液体积，每次清洗液尽可能的弃去后再加入新的清洗液，三次清洗完后应尽可能的吸干，提前包被的培养皿可于4℃-37℃环境中放置。回收的多聚-L-赖氨酸在第一次使用后在4℃保存(不能反复冻融)一个月内重复使用均有效。
进一步的，细胞消化和多聚-L-赖氨酸包被同时进行。
进一步的，上述所有材料用量为一个15cm培养皿的用量，扩大生产时应相应的增加细胞量和用于包装的材料的用量。
作为本发明的进一步改进，若是包装如rAAV2主要存在于细胞中的rAAV，上清可不参与纯化；如果包装的rAAV为rAAV6，步骤S7中上清液参与纯化。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
采用本发明的技术方案，无需提前24小时培养293T细胞，而是将三个质粒与PEI形成复合物并与细胞悬液混合后铺板，从而包装rAAV；这样大大简化了实验步骤，实现了快速包装，而且减少了血清使用量。该方法简单、易行且重复性高，可稳定包装出含有目的基因的rAAV。而且本发明的技术方案，无需使用超高速离心机即可纯化出 rAAV，对实验室条件要求更低，操作简便。
附图说明
图1是本发明的实施例1的同步包装方法与常规的异步包装方法的病毒包装后的上清液对比照片。
图2是本发明的实施例1的方法与常规方法的细胞荧光对比图。其中，2a是实施例1中将pRep-CapAAV2、pHelper、pEGFP与PEI按1：2质量比共转入293T细胞， 24h后的荧光图片；2b是实施例1中将pRep-CapAAV2、pHelper、pEGFP与PEI按1： 2质量比共转入293T细胞，72h后的荧光图片；2c是按常规方法将细胞提前24h铺板后，将pRep-CapAAV2、pHelper、pEGFP与PEI按1：2质量比共转入293T细胞，24h 后的荧光图片；2d是按常规方法将细胞提前24h铺板后，将pRep-CapAAV2、pHelper、 pEGFP与PEI按1：2质量比共转入293T细胞，72h后的荧光图片。
图3是本发明的实施例1的方法与常规方法24h和72h后得到的细胞放大200X对比图。其中，3a是实施例1中将pRep-CapAAV2、pHelper、pEGFP与PEI按1：2质量比共转入293T细胞，24h后放大200X的细胞荧光图片；3b是实施例1中将pRep-CapAAV2、pHelper、pEGFP与PEI按1：2质量比共转入293T细胞，72h后放大200X的细胞图片；3c是按常规方法将细胞提前24h铺板后，将pRep-CapAAV2、 pHelper、pEGFP与PEI按1：2质量比共转入293T细胞，24h后放大200X的细胞图片；d是按常规方法将细胞提前24h铺板后，将pRep-CapAAV2、pHelper、pEGFP与 PEI按1：2质量比共转入293T细胞，72h后放大200X的细胞图片。
图4是是本发明的实施例1的方法与常规方法72h后细胞放大对比图。其中，4a 是按常规方法将细胞提前24h铺板后，将pRep-CapAAV2、pHelper、pEGFP与PEI按 1：2质量比共转入293T细胞，72h后放大200X的细胞图片；4b是实施例1中将 pRep-CapAAV2、pHelper、pEGFP与PEI按1：2质量比共转入293T细胞，72h后放大200X的细胞荧光图片；4c是按常规方法将细胞提前24h铺板后，将pRep-CapAAV2、 pHelper、pEGFP与PEI按1：2质量比共转入293T细胞，72h后放大400X的细胞图片；4d是实施例1中将pRep-CapAAV2、pHelper、pEGFP与PEI按1：2质量比共转入293T细胞，72h后放大400X的细胞荧光图片。
图5是本发明的实施例2的方法与常规方法得到的细胞荧光对比图片。其中，5a 是本发明中阴性对照超过100％汇合的荧光照片；5b是本发明中阴性对照超过100％汇合的细胞照片；5c是实施例2中将pRep-CapAAV6、pHelper、pEGFP与PEI按1：2 质量比共转入293T细胞，24h后荧光图片；5d是实施例2中将pRep-CapAAV6、pHelper、 pEGFP与PEI按1：2质量比共转入293T细胞，72h后荧光图片；5e是实施例2中将 pRep-CapAAV8、pHelper、pEGFP与PEI按1：2质量比共转入293T细胞，24h后荧光图片；5f是实施例2中将pRep-CapAAV8、pHelper、pEGFP与PEI按1：2质量比共转入293T细胞，72h后荧光图片。
图6是本发明实施例2中将pRep-CapAAV2、pHelper、pEGFP与PEI按1：2质量比共转入293T细胞，在培养于包被以及未包被多聚-L-赖氨酸的培养皿中72h后荧光对比图片。其中，6a是实施例2中将pRep-CapAAV2、pHelper、pEGFP与PEI按1： 2质量比共转入293T细胞，在培养于未包被多聚-L-赖氨酸的培养皿中72h后荧光图片； 6b是实施例2中将pRep-CapAAV2、pHelper、pEGFP与PEI按1：2质量比共转入293T 细胞，在培养于未包被多聚-L-赖氨酸的培养皿中72h后细胞图片；6c是实施例2中将 pRep-CapAAV2、pHelper、pEGFP与PEI按1：2质量比共转入293T细胞，在培养于包被多聚-L-赖氨酸的培养皿中72h后荧光图片；6d是实施例2中将pRep-CapAAV2、pHelper、pEGFP与PEI按1：2质量比共转入293T细胞，在培养于包被多聚-L-赖氨酸的培养皿中72h后细胞图片。
图7是本发明的实施例2中包装时培养液含2％FBS、10％FBS，72h后细胞对比图片。其中，7a是实施例2中将pRep-CapAAV2、pHelper、pEGFP与PEI按1：2质量比共转入293T细胞，包装时培养液含2％FBS，72h后荧光图片；7b是实施例2中将 pRep-CapAAV2、pHelper、pEGFP与PEI按1：2质量比共转入293T细胞，包装时培养液含5％FBS，72h后细胞图片；7c是实施例2中将pRep-CapAAV2、pHelper、pEGFP 与PEI按1：2质量比共转入293T细胞，包装时培养液含10％FBS，72h后细胞图片。
图8是QPCR检测标准质粒曲线图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的方法进行进一步的描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
建立一种同步包装rAAV的方法，包括以下步骤：
步骤S1：293T细胞的扩大培养，并根据所要包装的病毒量来进行预算所需准备的细胞量：
通过预算，包装5个15cm培养皿需要准备3个15cm培养皿的细胞。细胞扩大培养包括以下步骤：
(1)待T75方瓶中293T细胞长至90％以上汇合度时，将原有培养液弃去；
(2)加入5ml预热的0.02％EDTA使其全部覆盖细胞表面，室温下作用10分钟；
(3)将消化后细胞悬液用移液管移入离心管中，用3ml的0.01M PBS再次清洗 T75方瓶后将液体一起移入离心管中，1000rpm离心5分钟，弃上清；
(4)用含10％FBS的DMEM重悬，将细胞悬液移入3个T75培养瓶中。将培养皿放入37℃含5％CO2培养箱内，待细胞长至90％以上汇合时可进行下一步操作。
(5)每个T75培养瓶重复1-3步，用含5％FBS的DMEM重悬，将细胞悬液等分移入3个15cm培养皿中，将培养皿放入37℃含5％CO2培养箱内，待细胞长至90％以上汇合时可进行下一步操作。
步骤S2：三质粒与PEI按1：2混合，室温下静置作用15分钟，包括以下步骤：
(1)取5个15cm培养皿，加入0.1mg/ml的多聚-L-赖氨酸，加入量为刚好覆盖平皿底部，室温下放置5-15分钟。
(2)将培养细胞的培养皿从培养箱取出，弃去上清液，加入10ml预热的0.02％EDTA使其全部覆盖细胞表面，室温下作用10-15分钟；
(3)弃去多聚-L-赖氨酸，用20ml无菌超纯水清洗三次，尽可能的吸掉清洗液，放置一旁待用；
(4)取1个15ml无菌离心管和1个50ml无菌离心管，每管加入5ml无血清的 DMEM，将pAAV-GFP、pHelper和pRep-CapAAV2三种质粒按照重量比65μg：130 μg：65μg加入于50ml离心管中充分混合，将520μg PEI加入15ml离心管，室温下静置5分钟；
(5)将PEI稀释液缓慢加入质粒混合液中，边加边摇动50ml离心管到全部PEI 加完，用移液器用力吹打10次后涡旋1分钟，室温静置反应15min。
步骤S3-S5：使用0.02％EDTA消化293T细胞，将DNA与PEI复合物与293T细胞悬液混合，移入15cm细胞培养皿，包括以下步聚：
(1)轻轻晃动15cm培养皿，使细胞悬浮于消化液中，将细胞悬液移至50ml离心管中，取3ml消化液再次清洗平皿表面，将液体一起移入离心管中，1000rpm离心5 分钟，弃上清。
(2)用无水乙醇擦净计数板和盖玻片，把盖玻片覆盖在计数板上。
(3)用15ml含10％FBS的DMEM重悬细胞，取10μl细胞稀释10倍后加入相同体积的0.4％台盼蓝溶液，混匀，取10μl混合液从计数板边缘缓缓滴入，使之充满计数板和盖片之间的空隙中。于显微镜下计数。计算计数板的四角大方格(每个大方格又分16个小方格)内的细胞数。计数时，只计数完整的细胞，若聚成一团的细胞则按一个细胞进行计数。在一个大方格中，如果有细胞位于线上，一般计下线细胞不计上线细胞，计左线细胞不计右线细胞。二次重复计数误差不应超过±5％。镜下观察，凡折光性强而不着色者为活细胞，染上蓝色者为死细胞。将每一大方格内细胞数×稀释倍数×10000×体积＝细胞总数。5个15cm培养皿共需6×107个细胞。
(4)将所需的细胞悬液移入一无菌瓶中，用含5％FBS的DMEM调整至总体积为65ml，制成均匀的悬液，平均分配入包被好多聚-L-赖氨酸的培养皿中。
(5)用移液器轻轻吹打质粒与PEI的混合液，逐滴加入细胞悬液中，全部加入完后，轻轻摇晃培养皿。将培养皿于37℃含5％CO2培养箱内水平放置。
步骤S6，24小时观察荧光并记录。将旧液倾去，加入无血清DMEM，包括以下步骤：
(1)荧光倒置显微镜下观察细胞的分散生长情况，并记录保存，同时保存相应视野的荧光图片。
(2)用移液管尽可能的移走旧的培养液，每个15cm培养皿补充20ml预热的无血清DMEM。无论是吸液还是补液都要避开细胞面，动作应轻柔。
(3)将培养皿于37℃含5％CO2培养箱内水平放置至包装后72h结束。
如图2对比可见，很明显可以看出2a比2c中发荧光的细胞更多，荧光更亮；同样的2b比2d中发荧光的细胞更多，荧光强度更强。从而也证明了该发明中的方法比传统方法使用效果更好。
步骤S7，72小时收获并纯化浓缩。包括以下步骤了：
(1)每个培养皿留约5mL上清，其余上清收集至一个无菌的离心管中，用移液管吸取上清轻轻的将细胞吹下，悬液移至装着上清的离心管中，3000g离心10分钟，上清移至另一无菌瓶中。
(2)取3ml预冷的裂解液再次清洗培养皿后，将悬液与离心后的沉淀混合在一起并重悬。在﹣80℃和常温反复冻融三次，加入benzonase(终浓度50U/mL)，于37℃水浴中作用30分钟，然后加入0.5％脱氧胆酸钠继续作用30分钟。2500g离心10分钟，将上清转移至一无菌50ml离心管中；
(3)往上清液中加入40％PEG8000至终浓度8％和2.5N的NaCl至终浓度0.5N， 4℃放置1小时，2000g离心30分钟，弃上清，按上清液体积的3％加入HEPES液溶解沉淀。
(4)沉淀溶解后加入相同体积的氯仿室温下剧烈振摇2分钟，370g离心5分钟，于安全柜中将上清移入无菌离心管中，离心管正立放置30分钟。
(5)往离心管中加入室温状态下PEG8000(50％，W/W)，(NH4)2SO4(20％，W/W)，用无菌水调整至终浓度分别为10％(W/W)和13.2％(W/W)，测量并调整pH至8。在室温条件下，依次旋涡振荡2分钟，放置15-30分钟，3000g离心15分钟。
(6)用针头小心取出下层液体，使用超滤管(100K MWCO)离心四次除盐贮存在含有0.001％普朗尼克F68的PBS中﹣80℃保存。
如图1所示，采用本实施例1同步包装收获时病毒包装后的上清液与常规异步方法包装得到的上清液对比照片可见，用本发明的方法在收获时，上清液澄清，用传统的常规异步方法收获时，病毒包装后的上清液呈浑浊状态，这说明用该发明的方法进行病毒包装收获时产生的杂质少。这样，尤其对于AAV6等需要上清一起进行纯化的病毒，因为AAV6在包装后会有30％的病毒分泌到上清液中，采用本发明的包装方法将具有更大的实际意义。
如图3和图4所示，按常规方法操作，收获时，细胞失去立体感，边缘模糊，细胞融合在一起，细胞状态比较差，在显微镜下观察可以看到上清中有成团死细胞；按本发明的方法可以看到细胞形态饱满，细胞状态明显比通用常规方法中的要好。
步骤S8，QPCR检测。包括以下步骤：
(1)配制50μl待检体系：5μl待检样品，5μl 10×DNase缓冲液，2μl DNaseI， 5μl1％pluronic F-68，33μl水，37℃作用1小时。
(2)配制50μl proteinase K体系：10μl 10×proteinase K buffer，5μl 1％pluronic F-68，1μl proteinase K(20mg/ml)和34μl水。
(3)将50μl proteinase K溶液加入50μl待检溶液中。55℃作用30分钟，95℃灭活15分钟，室温放置。
(4)待测样品做系列稀释。配制稀释buffer 5ml：500μl 10×PCR buffer，4.5ml水，1μl sss-DNA(sheared salmon sperm DNA)。将处理完的样品按1：10倍比稀释至 1：1000，样品做三个稀释点。
(5)将pEGFP酶切，跑胶回收测浓度。按照1M≈6.0221415×10^23copies，以 10^1copies→10^8copies共8个点做标准曲线。
(6)配制20μl QPCR反应体系：2×SuperReal Color PreMix 10μl，Primer F 0.6μl，Primer R 0.6μl，样品1μl，无菌水7.8μl。
(7)QPCR反应程序为：第1循环为一个循环，95℃15分钟；第二循环共40个循环，95℃10s，57℃20s，72℃30s；第3循环为一个循环，94℃10s，60℃20s，94℃ 30s。
(8)根据标准曲线的Ct值与样品的Ct值，乘以稀释倍数计算出样品每mL的copies，如图8所示的质粒曲线。同步包装法收获的基因的copies如表1-表3所示。
表1样品QPCR检测结果
表2样品QPCR检测结果
表3样品QPCR检测结果
组别 Copies(vg/ml)
pAAV2-同步 1.51E+10
pAAV2-异步 1.09E+10
pAAV8 3.20E+10
pAAV6 5.89E+09
negative 2.045
通过图8并结合表1～表3可见看出，与常规的提前包被细胞的方法相比，采用本实施例1的同步包装法在转染效率、荧光表达量和细胞状态等方面结果均比常规方法的好。
实施例2
下面进行同步包装rAAV的方法在rAAV包装生产中的应用：
(1)同步包装rAAV对目的基因表达量的影响。
包装前24h，按照同步包装rAAV的方法中S3方法消化细胞，用10％FBS DMEM 培养液将5×107个293T细胞制成悬液并平均分入5个包被好多聚-L-赖氨酸的15cm 平皿中，将培养皿放入37℃含5％CO2培养箱内水平放置。包装当天，按照同步包装 rAAV的方法中S3方法消化细胞，用10％FBS DMEM培养液将6×107个293T细胞制成悬液。计算好10个15cm培养皿包装所需的各质粒用量，同步包装rAAV的方法中S2方法操作，将质粒与DNA的混合物分成体积相等的两份，一份加入DMEM，平均分入24h前培养已长成90％汇合的293T细胞，另一份与消化好的细胞悬液混合，按照同步包装rAAV的方法中S4方法，将混合液平均分入5个包被好多聚-L-赖氨酸的 15cm平皿中，轻轻晃动培养皿，将10个培养皿水平放置在37℃含5％的CO2培养箱内。于包装24h和72h后观察结果。荧光结果表明，两种方法荧光表达量无明显差别，如图5所示，证明了该发明中的方法比传统方法使用效果更好。
(2)同步包装rAAV对病毒包装结果的影响。
包装后72h，按照同步装rAAV的方法中S7和S8所示，将按本发明中所示同步包装5个15cm平皿的病毒液合成一份进行纯化和检测，将按常规方法包装的5个15cm 平皿的病毒液合成一份进行纯化和检测。QPCR结果表明，同步包装rAAV与常规方法包装收获量无差异，如表1-表3所示，而且操作更简单，节约了时间。
(3)同步包装rAAV对包装后细胞状态的影响。
分别于包装后24h和72h观察293T细胞状态。结果表明，按常规方法包装的细胞密度会高于同步包装的细胞密度，但是同步包装的细胞状态优于常规包装的细胞状态，如图2～图5所示，通过对比可以明显看出，按常规方法操作，收获时，细胞失去立体感，边缘模糊，细胞融合在一起，细胞状态比较差，在显微镜下观察可以看到上清中有成团死细胞。从图5中可以明显看出，按常规方法操作，收获时，细胞失去立体感，边缘模糊，细胞融合在一起，细胞状态比较差，在显微镜下观察可以看到上清中有成团死细胞；按本发明的方法可以看到细胞形态饱满，细胞状态明显比常规方法中的要好。
(4)多聚-L-赖氨酸对rAAV包装的影响。
计算2个15cm培养皿包装所需质粒和细胞用量，按照本发明中同步包装rAAV中S2-S4所述方法操作，将质粒与细胞的混合液平均分成相同的两份，一份加入包被好多聚-L-赖氨酸的培养皿中，另一份加入未经任何处理的培养皿中，轻轻晃动培养皿后，水平放置于37℃含5％CO2培养箱中。于包装后72h观察结果。如图6中所示，结果表明，使用多聚-L-赖氨酸能够提高细胞生长速度，细胞的贴壁分散均匀，有利于包装，细胞在没有进行包被处理的培养皿上聚集成团和死亡。
(5)同步包装rAAV时不同血清量对rAAV包装的影响。
计算3个15cm培养皿包装所需质粒和细胞用量，按照本发明中同步包装rAAV中S2-S4所述方法操作，将质粒与细胞的混合液平均分成相同的三份，加入包被好多聚-L- 赖氨酸的培养皿中，往培养皿中加入FBS将培养液调整为含2％FBS、5％FBS和10％ FBS的DMEM，轻轻晃动培养皿后，水平放置于37℃含5％CO2培养箱中。于包装后 72h观察结果。结果表明，包装时FBS为2％荧光表达低于FBS 5％，FBS 5％与FBS 10％荧光表达无差异。如图6对比可以看出，在没有包被多聚-L-赖氨酸的平皿上进行病毒包装，细胞会结团、上浮，最后收获的病毒颗粒的产量会明显下降；在包被多聚-L-赖氨酸的平皿上进行病毒包装，细胞分散均匀，能很好的附着在平皿上，能提高收获的病毒颗粒的产量。
(6)同步包装rAAV方法用于rAAV6和rAAV8包装。
计算包装rAAV6和rAAV8所需各质粒量，各包装5个15cm培养皿，按照本发明中同步包装rAAV中S2-S8所述方法操作。如图5、图7和表1-3所示，本发明中的方法同样适用于AAV6和AAV8这两种类型的病毒包装；不局限一种AAV血清型的病毒包装。
如图7可见，综合考虑本发明方法进行病毒包装时的血清用量和包装后荧光表达量，可以看出使用5％的血清最合适。使用2％的FBS时发荧光的细胞数量最少，使用 5％的FBS和10％的FBS时发荧光的细胞数量差不多，因此5％的FBS最合适。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种同步包装rAAV的方法，其特征在于：其包括以下步骤：
步骤S1，对293T细胞进行扩大培养；
步骤S2，先采用多聚赖氨酸对培养容器进行处理，然后将三个质粒与PEI置于已经处理过的培养容器中进行混合，并于室温下静止作用；其中，所述三个质粒包括载体质粒、包装质粒和辅助质粒；
步骤S3，消化293T细胞，得到293T细胞悬液；
步骤S4，将293T细胞悬液加入到步骤S2得到的混合物中；
步骤S5，将培养容器放入37℃含5% CO2培养箱内进行培养；
步骤S6，24小时后将旧液倾去，加入无血清DMEM；
步骤S7，72小时收获并纯化浓缩。
2.根据权利要求1所述的同步包装rAAV的方法，其特征在于：所述多聚懒氨酸为多聚-L-赖氨酸，所述载体质粒含有目的基因表达盒，其两端是AAV的反向末端重复序列ITR；所述包装质粒反式提供具有AAV复制和包装功能的蛋白Rep和Cap；所述辅助质粒包含辅助腺病毒Ad5的元件E1a、E1b、E2a和E4。
3.根据权利要求2所述的同步包装rAAV的方法，其特征在于：所述载体质粒pAAV-GFP，所述包装质粒为pHelper，所述辅助质粒为pRep-CapAAV2或pRep-CapAAV6，所述三种质粒的重量比为1:2:1；步骤S2中所述三个质粒与PEI的重量比为1:1.5~3。
4.根据权利要求3所述的同步包装rAAV的方法，其特征在于：步骤S2包括以下子步骤：
子步骤S201：将0.05~0.5mg/ml的多聚-L-赖氨酸加入新的培养皿中，加入量为刚好覆盖平皿的底部，室温下作用10-15分钟，弃去多聚-L-赖氨酸，用无菌超纯水清洗；
子步骤S202：将载体质粒、包装质粒和辅助质粒三种质粒按照重量比加入于离心管中混合，再加入PEI，室温下静置；
子步骤S203：将PEI稀释液加入到步骤S202得到的质粒混合液中，用移液器吹打10次后涡旋1分钟，室温静置反应10~20min。
5.根据权利要求4所述的同步包装rAAV的方法，其特征在于：步骤S2中，每次清洗所用无菌超纯水的体积超过多聚-L-赖氨酸溶液的体积，清洗完后吸干。
6.根据权利要求4所述的同步包装rAAV的方法，其特征在于：加入293T细胞的细胞量为培养容器的每平方厘米底面积加入6.8×104个细胞。
7.根据权利要求1所述的同步包装rAAV的方法，其特征在于：步骤S1包括如下子步骤：
子步骤S101：待293T细胞长至90%以上汇合度时，将原有培养液弃去；
子步骤S102：加入预热的EDTA使其覆盖全部细胞表面，室温下作用5~10分钟；
子步骤S103：将消化后的细胞悬液用移液管移入离心管中，离心5~10分钟，弃上清液；
子步骤S104：用含质量百分比浓度为5%的 FBS的DMEM重悬，将细胞悬液移入培养瓶中，放入37℃含5% CO2培养箱内进行培养。
8.根据权利要求1所述的同步包装rAAV的方法，其特征在于：步骤S7包括以下子步骤：
子步骤S701：培养容器留约4-6mL上清液，其余上清液收集至无菌的离心管中，用移液管吸取上清液将细胞吹下，悬液移至装着上清液的离心管中，离心5-15分钟，将上清液转移；
子步骤S702：取预冷的裂解液加入到细胞上，将细胞吹下，细胞悬液与S701中的细胞沉淀混合在一起，冻融三次，加入benzonase，于37℃水浴中作用20-40分钟，然后加入脱氧胆酸钠继续作用20-40分钟；离心5-15分钟，将上清液转移；
子步骤S703：往步骤S2的上清液中加入PEG 8000和NaCl，4℃放置1小时，离心25-35分钟，弃上清液，按上清液体积的3%加入HEPES进行溶解沉淀；
子步骤S704：沉淀溶解后加入相同体积的氯仿室温下振摇1-3min，离心3-10min，将上清液移入无菌离心管中，离心管正立放置20-40min；
子步骤S705：往子步骤S704的离心管中加入PEG8000和(NH4)2SO4，用无菌水调整至终浓度分别为10%（W/W）和13.2%（W/W），并调整pH至8；在室温条件下，依次旋涡振荡1-3分钟，放置15-30分钟后进行离心；
子步骤S706：用针头取出下层液体，使用超滤管离心四次除盐，然后进行贮存。
9.根据权利要求1~8任意一项所述的同步包装rAAV的方法，其特征在于：步骤S1~步骤S7在生物安全柜中进行，且操作前生物安全柜紫外消毒30分钟；步骤S1~步骤S7中所用的试剂和物品使用前于121℃高压灭菌或0.2μm滤网过滤除菌，用超纯水配置。
10.根据权利要求1~8任意一项所述的同步包装rAAV的方法，其特征在于：如果包装的rAAV为rAAV6，步骤S7中上清液参与纯化。
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